專利名稱：作為細(xì)胞粘附抑制劑的唾液基Le的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及抑制細(xì)胞粘附的化合物，更具體地，涉及抑制由選擇素(selectin)介導(dǎo)的細(xì)胞粘附的唾液基路易斯x(sialyl Lewisx，sialylLex或SLex)的類似化合物、含有該類似物的組合物及其用途、和制備該類似物的方法。
背景技術(shù)：
血管內(nèi)皮細(xì)胞和血小板在許多生物應(yīng)答中，通過選擇性地與某些細(xì)胞如血液中的吞噬細(xì)胞的白細(xì)胞結(jié)合而發(fā)揮重要作用。例如，在炎癥反應(yīng)中，內(nèi)皮細(xì)胞優(yōu)先與單細(xì)胞和粒細(xì)胞結(jié)合，然后，它們才遷移通過血管壁并進(jìn)入周圍組織。
已知某些由發(fā)炎所引發(fā)的化合物是直接作用于血管內(nèi)皮的，從而促進(jìn)白細(xì)胞粘附于血管壁。然后，細(xì)胞穿過血管壁并進(jìn)入受傷或感染的區(qū)域。
細(xì)胞對(duì)血管內(nèi)皮的粘附還被認(rèn)為與腫瘤的遷移有關(guān)。
循環(huán)的腫瘤細(xì)胞明顯利用了身體的正常的發(fā)炎機(jī)制，從而結(jié)合于內(nèi)皮被激活的地方的血管壁區(qū)域。
血小板也參與類似的應(yīng)答反應(yīng)。已知血小板在止血的引發(fā)過程中被激活，發(fā)生形態(tài)上、生物化學(xué)上、和功能上的變化(如快速的胞外分泌顆粒、或脫?；?，其中，血小板的α粒面膜與外部的細(xì)胞質(zhì)膜相融合。結(jié)果，新的細(xì)胞表面蛋白質(zhì)被表達(dá)，從而賦予活化的血小板新的功能，如與其他活化的血小板及其他細(xì)胞結(jié)合的能力?；罨难“灞谎a(bǔ)充入正在生長的血栓，或者被快速地從血液循環(huán)中清除掉。已知活化的血小板可與吞噬細(xì)胞的白細(xì)胞，包括單細(xì)胞和嗜中性白血球，結(jié)合。被認(rèn)為是由該過程介導(dǎo)的病理過程和其他的生物過程的例子包括動(dòng)脈粥樣硬化，凝血和發(fā)炎。
最近的研究揭示，位于內(nèi)皮細(xì)胞和血小板上的表面受體參與內(nèi)皮和血小板對(duì)各種循環(huán)細(xì)胞的識(shí)別過程，這些受體分別被稱為E—選擇素(內(nèi)皮白細(xì)胞粘附分子—1；ELAM—1)和P—選擇素(粒面膜蛋白質(zhì)—140；GMP—140)。例如，業(yè)已表明，E—選擇素介導(dǎo)內(nèi)皮和白細(xì)胞的粘附，這是許多發(fā)炎反應(yīng)中的第一個(gè)步驟。具體地，E—選擇素與人的嗜中性白血球、單細(xì)胞、嗜曙紅細(xì)胞、某些T—淋巴細(xì)胞[Graber et al.，J.Immunol.，145819(1990)]、NK細(xì)胞和前髓細(xì)胞系HL—60相結(jié)合。
E—選擇素可以在血管內(nèi)皮細(xì)胞上通過誘導(dǎo)而表達(dá)[Bevilacquaet al.，Science，2431160—1165(1989)and Hession et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.，871673—1677(1990)]。已表明該受體可以被發(fā)炎的細(xì)胞因子如白細(xì)胞介素Iβ(IL—Iβ)和腫瘤壞死因子α(TNFα)，以及細(xì)菌外毒素(脂多糖)所誘導(dǎo)[Bevilacqua et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.，849238—9242(1987)]。這些化合物可增加分葉核白細(xì)胞(嗜中性白血球)和單細(xì)胞的粘附作用[Bevilacqua et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.，849238—9242(1987)]。
P—選擇素(又稱GMP—140和PADGEM)位于血小板和內(nèi)皮細(xì)胞的表面，它在該處介導(dǎo)血小板—白細(xì)胞以及內(nèi)皮—白細(xì)胞的相互作用[Geng et al.，Nature，343757—760(1990)]。因此，例如，已知活化的在表面表達(dá)P—選擇素的血小板與單細(xì)胞和嗜中性白血球結(jié)合[Jungi et al.，Blood，67629—636(1986)]，而且還與類單細(xì)胞的細(xì)胞系如HL—60和U937結(jié)合[Jungi et al.，Blood，67629—636(1986)；Silverstein et al.，J.Clin.Invest.，79867—874(1987)]。
P—選擇素是α粒面膜蛋白質(zhì)，分子量為140,000，一旦血小板激活和分泌粒則P—選擇素在活化的血小板的表面表達(dá)。[Hsu—Lin et al.，J.Clin.Chem.，2599121—9126(1984)；Stenberg etal.，J.Cell Biol.101880—886(1985)；Berman et al.，J.Clin.In-vest.78130—137(1986)]。P—選擇素還在巨核細(xì)胞(Beckstead etal.，Blood，67285—293(1986))、內(nèi)皮細(xì)胞(McEver et al.，Blood，70335a(1987))Weibel—Palade體中(Bonfanti et al.，Blood，731109—1112(1989))被發(fā)現(xiàn)。Furie等人的美國專利4,783,330描述了針對(duì)P—選擇素的單克隆抗體。
第三種受體是淋巴細(xì)胞導(dǎo)向受體(homing receptor)，MEL—14抗原或其對(duì)應(yīng)的人的LAM—1(L—選擇素)(Gallatin et al.，Na-ture，30430—34(1983)；Siegellman et al.，Science，2431165—1172(1989)Rosen，Cell Biology，1913—919(1989)；和Lasky etal.，Cell，561045—1055(1989))。除有淋巴細(xì)胞的導(dǎo)向作用外，據(jù)信MEL—14抗原/LAM—1在嗜中性白血球結(jié)合于內(nèi)皮的早期過程中發(fā)揮作用。
術(shù)語“選擇素”指一大類受體，其中包括E—選擇素(ELAM—1)、P—選擇素(GMP—140)和L—選擇素(MEL—14)，因?yàn)樗鼈兙哂蓄愃仆庠茨氐慕Y(jié)構(gòu)域以及粘附功能的選擇性。選擇素受體的結(jié)構(gòu)和功能已經(jīng)通過對(duì)編碼各種上述受體的全長cDNA進(jìn)行克隆和表達(dá)而得以闡明(Bevilacqua et al.，Science 2431160—1165(1989)，(ELAM—1)；Geng et al.，Nature，343757—760(1990)，(GMP—140)；和Lasky et al.，Cell，561045—1055(1989)，(MEL—14抗原))。
按與以前已知的蛋白質(zhì)的同源性，可以將選擇素的胞外部分分成三個(gè)片段。N—末端區(qū)域(約l20個(gè)氨基酸)，與Drickamer在J.Biol.Chem.，2639557—9560(1988)中所述的誘導(dǎo)低親和力IgE受體CD23的C型哺乳動(dòng)物外源凝集素蛋白質(zhì)家族有關(guān)。隨后為多肽片段，它含有與含有表皮生長因子(EGF)模式(motif)的蛋白質(zhì)相關(guān)的序列。最后，在EGF結(jié)構(gòu)域后是一個(gè)或多個(gè)串聯(lián)的各約60個(gè)氨基酸的重復(fù)模式，與在補(bǔ)體調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)家族中發(fā)現(xiàn)的相關(guān)。
美國專利5,079,353及其分案專利5,29 6,594講授了唾液基Lex和唾液基Lex抗原的合成及使用，它們存在于腫瘤組織并且是前述的選擇素受體的配位體。美國專利5,143,712講授了各種受體如ELAM—1(E—選擇素)與配位體如唾液基Lex和在末端唾液基上含有多個(gè)N—乙酰乳糖胺(LacNAc)單元并含有一個(gè)或多個(gè)連接于LacNAc單元的LacNAc部分的巖藻糖基(fucosyl)的配位體之間的結(jié)合。
已出版的國際申請(qǐng)WO91/19501和WO91/19502公開了含有下列五聚和六聚結(jié)構(gòu)的寡糖能抑制含有配位體(見下)的細(xì)胞和含有選擇素受體的細(xì)胞之間的選擇性的細(xì)胞結(jié)合，而且被測(cè)定的五糖和六糖能提供優(yōu)于SLex的抑制作用。NeuAcα2→3Galβ1→4(Fucα1→3)GlcNAcβ1，3Galβ1，NeuAcα2→3Galβ1→4(Fucα1→3)GlcNAcβ1，3Galβ1，4Glc-，NeuAcα2→3Galβ1→4(Fucα1→3)GlcNAc＝SLex.發(fā)明概述本發(fā)明提供了一種唾液基Lex(Slex)類似化合物，它抑制在表面表達(dá)Slex的細(xì)胞粘附于選擇素受體，在合成抑制劑中的中間體，以及制備中間體的方法和含有該抑制劑的組合物。
一種提供的化合物具有式 其中Z是氫，C1—C6?；?Y選自C(O)，SO2，HNC(O)，OC(O)和SC(O)；R1選自下組芳基、取代芳基、和苯基C1—C3亞烷基，其中芳基具有五員或六員芳香環(huán)、稠合的五員/六員芳香環(huán)、或者兩個(gè)稠合六員芳香環(huán)，這些環(huán)選自烴基、單氧代烴基、單硫代烴基、單氮代烴基和二氮代烴基環(huán)，而取代芳基是前述的芳基，它并且具有選自下組的取代基鹵素、三氟代甲基、硝基、C1—C18烷基、C1—C18烷氧基、氨基、單C1—C18烷基氨基、二C1—C18烷基氨基、芐氨基、C1—C18烷基芐氨基、C1—C18硫代烷基和C1—C18烷基氧酰胺基，或者R1Y為烯丙氧基羰基或氯代乙?；?；R2選自下組氫，C1—C18直鏈、支鏈或環(huán)狀烴基，C1—C5亞烷基ω-羧酸C1—C6烷基酯(C1—C6alkyl C1—C5alkyleneω-carboxylate)，ω-三(C1—C4烷基/苯基)甲硅烷基C2—C4亞烷基，單糖和二糖，或者OR2合起來形成氨基甲酸C1—C18直鏈、支鏈或環(huán)狀烴基酯；
R3是氫或C1—C6?；?；R4是氫、C1—C6烷基或芐基；R5選自氫、芐基、甲氧基芐基、二甲氧基芐基和C1—C6?；籖7是甲基(CH3)或羥甲基(CH2OH)和X選自C1—C6酰氧基、C2—C6羥基酰氧基、羥基、鹵素和疊氮基。
Y最好為羰基[C(O)]。
對(duì)于一組抑制劑，R2優(yōu)選的是單糖，更佳的為單糖的C1—C18烷基苷，R7是甲基，Z是未保護(hù)的巖藻糖基(fuco group)，X是羥基，而R1Y不是烯丙氧基羰基或氯代乙?；?。抑制劑的前體可以具有任一所述的“R”基團(tuán)，且R3，R4和R5最好不是氫。
一種特別優(yōu)選的抑制劑相應(yīng)于下式 其中，R1如上所述，和R1Y不是烯丙氧基羰基或氯代乙?；?，X如上所述且最好不是C1—C6酰氧基、C1—C6羥基酰氧基，R2和R7如上所述。在一個(gè)例子中，R2最好不是單糖或二糖。芐基R2基團(tuán)在此是特別優(yōu)選的。
另一組特別優(yōu)選的抑制劑相當(dāng)于下式 其中，R1如上所述除了R1Y不是烯丙氧基羰基或氯代乙?；?，X如上所述且最好不是C1—C6酰氧基、C1—C6羥基酰氧基，R7如上所述，而且R2是單糖或二糖。
還提供了一種藥物組合物。該藥物組合物含有藥用的稀釋劑或載體，以及溶解或分散于其中的細(xì)胞粘附抑制量的下式化合物 Y選自C(O)，SO2，HNC(O)，OC(O)和SC(O)；R1如上所述，而且最好選自下組芳基、取代芳基、和苯基C1—C3亞烷基，其中芳基基團(tuán)選自下組呋喃基、噻吩基、苯基、萘基、吡啶基、吡嗪基、苯并呋喃基、異苯并呋喃基、苯并[b或c]噻吩基、嘧啶基、噠嗪基、喹啉基、異喹啉基、喹噁啉基、1，5-二氮雜萘基、酞嗪基和喹唑啉基，而取代芳基是前述的芳基，它具有選自下組的取代基鹵素、三氟代甲基、硝基、C1—C18烷基、C1—C18烷氧基、氨基、單C1—C18烷基氨基、二C1—C18烷基氨基、芐氨基和C1—C18烷基芐氨基；R2選自下組氫，C1—C18直鏈、支鏈或環(huán)狀烴基，C1—C5亞烷基ω-羧酸C1—C6烷基酯，ω-三(C1—C4烷基/苯基)甲硅烷基C2—C4亞烷基，單糖和二糖，或者OR2合起來形成氨基甲酸C1—C18直鏈、支鏈或環(huán)狀烴基酯；R7是甲基(CH3)或羥甲基(CH2OH)和X選自C1—C6酰氧基、C2—C6羥基酰氧基、羥基、鹵素或疊氮基。
上述的對(duì)于抑制劑的優(yōu)選內(nèi)容同樣適用于藥物組合物。
還提供了制備乳糖銨鹽的方法。該方法包括步驟(a)將半乳糖基果糖(4-O-β-D-半乳糖基-D-果糖與伯胺混合以形成反應(yīng)混合物，該伯胺是單取代的氨衍生物，它的氮原子連于可還原去除的保護(hù)基團(tuán)如芐基胺。伯胺可以作為反應(yīng)劑和溶劑或主要溶劑，而且其用量為乳果糖的摩爾量的約2—10倍，更佳為約4—8倍過量。
(b)反應(yīng)混合物在約1O—60℃，更佳為室溫至約50℃，維持一段足夠形成相應(yīng)的半乳糖基果糖N-配糖物的時(shí)間。該維持時(shí)間可以為約2—7天，以獲得最大的產(chǎn)量。
(c)形成的半乳糖基果糖N-配糖物與等當(dāng)量之內(nèi)的pKa值為約2.5—5.0的羧酸在C1—C3醇溶劑如甲醇中，于約10—30℃反應(yīng)，從而將半乳糖基果糖N-配糖物重排成胺保護(hù)住的乳糖銨鹽，該鹽具有連于胺的可還原去除的保護(hù)基團(tuán)。半乳糖基果糖N-配糖物可以以約0.1M至飽和濃度存在；和(d)通過氫解將保護(hù)基團(tuán)從該被胺保護(hù)住的乳糖銨鹽上還原去除，形成乳糖銨鹽。該鹽最好回收。
用于描述本發(fā)明的寡糖部分的術(shù)語沿用是常規(guī)的術(shù)語。對(duì)各種單糖使用標(biāo)準(zhǔn)的縮寫。例如，2-N-乙?；咸前酚肎lcNAc表示，2-N-乙?；肴樘前酚肎alNAc表示，巖藻糖用Fuc表示，果糖用Fru表示，半乳糖用Gal表示，葡萄糖用Glc表示，和甘露糖用Man表示。除非另外說明，所有的糖除了巖藻糖(L-異構(gòu)體)之外的環(huán)構(gòu)型都是D-異構(gòu)體(如吡喃糖或呋喃糖)。環(huán)形式的兩種異頭物用α和β表示。
單糖一般通過配糖鍵連接以形成寡糖和多糖。鍵相對(duì)于環(huán)平面的取向用α和β表示。在兩個(gè)單糖之間形成鍵的具體的碳原子也被注明。因此，在半乳糖的C—1和葡萄糖的C—4之間的β配糖鍵用Galβ1→4Glc表示。對(duì)于D型糖(如D-GlcNAc，D-Gal，D-NeuAc和D-Man)，α表示連于C—1(在NeuAc中為C—2)的羥基是在環(huán)平面的下方，而β表示在環(huán)的上方。對(duì)于L-巖藻糖，α表示羥基在環(huán)的上方，而β表示在環(huán)的下方。發(fā)明詳述A.化合物本發(fā)明提供了一種具有下列結(jié)構(gòu)式A的Slex的類似化合物，該結(jié)構(gòu)式包括式I的作為唾液基Lex的類似物的戊糖化合物，及其式II和III五糖和四糖前體。結(jié)構(gòu)式I的化合物能抑制由選擇素細(xì)胞表面受體所介導(dǎo)的細(xì)胞粘附。 Z是氫(H)或C1—C6?；?，當(dāng)是式III化合物時(shí)；或者是α-巖藻糖基(其羥基是無保護(hù)的或被保護(hù)基團(tuán)(芐基或C1—C6?；?所保護(hù))，當(dāng)是式I或III化合物時(shí)，這取決于R3，R4和R5(R3-5)基團(tuán)的特性；Y選自C(O)，SO2，HNC(O)，OC(O)和SC(O)；R1選自下組芳基、取代芳基、和苯基C1—C3亞烷基，其中芳基具有五員或六員芳香環(huán)、稠合的五員/六員芳香環(huán)、或者兩個(gè)稠合六員芳香環(huán)，這些環(huán)選自烴基、單氧代烴基、單硫代烴基、單氮代烴基和二氮代烴基環(huán)，而取代芳基是前述的芳基，它具有選自下組的取代基鹵素、三氟代甲基、硝基、C1—C18烷基、C1—C18烷氧基、氨基、單C1—C18烷基氨基、二C1—C18烷基氨基、芐氨基、C1—C18烷基芐氨基、C1—C18硫代烷基和C1—C18烷基氧酰胺基，或者R1Y為烯丙氧基羰基或氯代乙?；籖2選自下組氫，C1—C18直鏈、支鏈或環(huán)狀烴基，C1—C5亞烷基ω-羧酸C1—C6烷基酯(C1—C6alkyl C1—C5alkylene ω-carboxylate)，ω-三(C1—C4烷基/苯基)甲硅烷基C2—C4亞烷基，單糖和二糖，或者OR2合起來形成氨基甲酸C1—C18直鏈、支鏈或環(huán)狀烴基酯；R3是氫或C1—C6酰基；R4是氫、C1—C6烷基或芐基；R5選自氫、芐基、甲氧基芐基、二甲氧基芐基和C1—C6?；?；R7是甲基(CH3)或羥甲基(CH2OH)和X選自C1—C6酰氧基、C2—C6羥基酰氧基、羥基、鹵素和疊氮基。
如上所述，Y可以是多種基團(tuán)之一。當(dāng)Y是C(O)時(shí)，R1Y是?；〈瑥亩c糖胺的氮原子形成酰胺。當(dāng)Y是SO2時(shí)，R1Y是磺?；〈?，從而與糖胺的氮原子形成磺酰胺。當(dāng)Y是HNC(O)時(shí)，R1Y是氨基羰基取代基，從而與糖胺的氮原子形成脲取代基。當(dāng)Y是氧羰基OC(O)時(shí)，與糖胺的氮原子形成尿烷取代基，而當(dāng)Y是硫羰基SC(O)時(shí)，與糖胺的氮原子形成硫代尿烷。Y基團(tuán)優(yōu)選為羰基(C(O))。
R1Y可以是烯丙氧基羰基或氯代乙?；?duì)于式III化合物，特別優(yōu)選烯丙氧基羰基R1Y基團(tuán)，因?yàn)榭梢蕴峁┓奖愀鼡Q的R1基團(tuán)。烯丙氧基羰基或氯代乙酰基的R1Y基團(tuán)僅存在于式III化合物中，但是不存在于式I，II，A，B或C(式B和C在下面描述)中任一式的化合物中。
如上所述，R1基團(tuán)可以是芳基或取代芳基。芳基可以是含有一個(gè)五員或六員芳環(huán)的，稠合的五員和六員(五/六一)環(huán)的，或者兩個(gè)稠合六員芳香環(huán)的芳基，并且包括烴基如苯基和萘基，以及具有置換環(huán)上的碳原子的氧或硫或者一個(gè)或二個(gè)氮原子(單氮代烴基或二氮代烴基)的烴基。代表性的芳基包括呋喃基、噻吩基、吡啶基、吡嗪基、苯并呋喃基(苯并[b]呋喃基)、異苯并呋喃基(苯并[c]呋喃基)、苯并噻吩基(苯并[b]噻吩基)、異苯并噻吩基(苯并[c]噻吩基)、嘧啶基、噠嗪基、喹啉基、異喹啉基、喹噁啉基、1，5-二氮雜萘基、酞嗪基和喹唑啉基。這些芳基中的每一個(gè)都可以是未取代的，或者具有選自下組的取代基鹵素、三氟代甲基、硝基、C1—C18烷基、C1—C18烷氧基、氨基、單C1—C18烷基氨基、二C1—C18烷基氨基、C1—C18烷基芐氨基和C1—C18烷氧酰胺基。
上述的未取代的和取代的芳基R1基團(tuán)是本領(lǐng)域眾所周知的，而且每一種都可以用眾所周知的化學(xué)方法連接到糖化物的氮原子上。因此，下面的描述將集中于作為代表性基團(tuán)的芳基烴基、苯基和萘基，因?yàn)榭梢杂没绢愃频幕瘜W(xué)方法使用其他不勝枚舉的芳基和取代芳基R1基團(tuán)。
當(dāng)R1是苯基時(shí)，可以使用苯甲酰氯或苯甲酸酐以形成優(yōu)選的酰胺鍵。當(dāng)Y是SO2時(shí)，類似地可以使用苯磺酰鹵如苯磺酰氯。當(dāng)Y是HNC(O)時(shí)，可以使用異氰酸苯酯。當(dāng)Y是OC(O)時(shí)，可以使用氯甲酸苯酯。當(dāng)Y是SC(O)時(shí)，可以使用氯硫代甲酸苯酯。
特別可行的取代苯基R1基團(tuán)包括取代基可以在環(huán)的任何位置進(jìn)行取代的苯基，其中優(yōu)選在間位和對(duì)位發(fā)生取代。單取代的R1苯基優(yōu)于二取代的苯基。
可行的鹵素取代基包括氟、氯、溴和碘，代表性的有對(duì)氟苯基、間氯苯基、間碘苯基、對(duì)溴苯基和鄰氟苯基。二鹵代苯基R1也是可行的，如3，4-二氯苯基，3，5-二氯苯基，2-氯-4-氟苯基和3-溴-4-氟苯基。
位于R1苯基上作為取代基的代表性的C1—C18基團(tuán)包括直鏈和支鏈烷基如甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、異丁基、叔丁基、戊基、己基、辛基、壬基、癸基、十二烷基、十四烷基、十六烷基和十八烷基。優(yōu)選C1—C12烷基，更佳為C1—C6烷基、最佳為甲基。代表性的、優(yōu)選的R1包括鄰、間、對(duì)甲苯基和對(duì)叔丁基苯基以及3，4-二甲基苯基和3，5-二甲基苯基。
代表性的C1—C18烷氧基或者是含有C1—C18烷基的醚、或者是含有特別優(yōu)選的C1—C6烷基的醚。此處優(yōu)選甲氧基。代表性的、優(yōu)選的R1包括鄰、間、對(duì)甲氧苯基以及3，4-二甲氧基苯基和3，5-二甲氧基苯基。
硝基苯基R1基團(tuán)可以方便地用3-或4-硝基苯甲酰氯通過酰基化而制得。用3，4-和3，5-二硝基苯甲酰氯進(jìn)行酰基化可以制得相應(yīng)的3，4-和3，5-二硝基苯基R1基團(tuán)。用3-或4-三氟代甲基苯甲酰氯類似地可以制得3-或4-三氟代甲基苯基R1基團(tuán)。
取代苯基R1基團(tuán)還可以含有氨基、單C1—C18烷基氨基、二C1—C18烷基氨基、芐氨基、C1—C18烷基芐氨基或C1—C18烷基羧基酰胺基等取代基，其中C1—C18烷基取代基如上所述。
氨基苯基R1基團(tuán)可以最方便地從相應(yīng)的上述硝基苯基R1基團(tuán)，在如上形成酰胺鍵后通過催化還原硝基而制得。因此，例如，使用3-或4-硝基苯甲酰氯形成酰胺鍵，用碳上的鈀進(jìn)行還原，從而形成相應(yīng)的3-或4-氨基苯基R1基團(tuán)。用3，4-和3，5-二硝基苯甲酰氯，在還原后可以制得相應(yīng)的3，4-和3，5-二氨基苯基R1基團(tuán)。
數(shù)種二-C1—C6烷基氨基苯甲酸如4-二乙基氨基苯甲酸和3-和4-二甲基氨基苯甲酸可以購得，并用于形成合適的苯甲酰鹵或酸酐以供形成含有R1的酰胺。余下的二-C1—C18烷基氨基苯甲酸和那些具有兩個(gè)二烷基氨基基團(tuán)的化合物可以用眾所周知的烷基化技術(shù)，從相應(yīng)的可購得的氨基苯甲酸或二氨基苯甲酸制得。
單-C1—C18烷基氨基苯基R1基團(tuán)可以從相應(yīng)的單-C1—C18烷基氨基苯甲酰鹵制得，其余下的氮化合價(jià)被可方便地去除的保護(hù)基團(tuán)如可被酸去除的叔—Boc或者可通過氫化(如果需要，用碳上的鈀)而去除的芐基所保護(hù)。因此，用N-芐基-N-丙基氨基苯甲酰氯進(jìn)行?；?，然后用催化氫化去除N-芐基從而制得單C1—C18烷基氨基苯基R1基團(tuán)。當(dāng)然，芐基基團(tuán)也可不必去除，從而提供C1—C18烷基芐基氨基基團(tuán)。
任一種上述的苯基或取代苯基的取代基可以用眾所周知的形成酰胺的反應(yīng)制備。代表性的反應(yīng)是將合適的苯甲酰鹵或酸酐如對(duì)氟代苯甲酰鹵或酸酐與其他基團(tuán)受保護(hù)的糖化物的未保護(hù)的胺基團(tuán)反應(yīng)，如下面詳細(xì)描述的那樣。
1-萘基和2-萘基R1基團(tuán)都是考慮對(duì)象，其中特別優(yōu)選2-萘基。這些化合物也可以用上述的標(biāo)準(zhǔn)的形成酰胺的技術(shù)制備，例如將2-萘甲酰氯與上述的適當(dāng)?shù)奶腔锏陌贩磻?yīng)。
應(yīng)理解，類似的取代基可以存在于氧代-、硫代-、氮代-和二氮代烴基芳基基團(tuán)上。例如，人們可以用兩種糠酸酰氯，兩種噻吩甲酰氯，三種吡啶甲酰氯、喹哪啶甲酰氯，3-喹啉甲酰氯，2-喹噁啉甲酰氯等進(jìn)行?；磻?yīng)。
類似地，當(dāng)Y是SO2時(shí)，可以使用相應(yīng)的磺酰鹵。例如，人們可以使用苯磺酰氯、甲苯磺酰氯、8-喹啉磺酰氯、1-或2-萘磺酰氯等形成磺酰胺。
當(dāng)Y是HNC(O)時(shí)，對(duì)應(yīng)于上述的羧酸的異氰酸苯酯是方便的試劑。這些衍生物的制備可以方便地用酰基鹵，通過與疊氮化物反應(yīng)形成?；B氮化物，后者在加熱時(shí)會(huì)發(fā)生Curtius重排而形成異氰酸酯。
當(dāng)Y是OC(O)或SC(O)時(shí)，被羥基或巰基取代的芳基R1基團(tuán)可以和光氣反應(yīng)，形成氯甲酸酯或氯硫代甲酸酯，后者可以與糖胺反應(yīng)形成連接于R1的尿烷或硫代尿烷鍵。
苯基C1—C3亞烷基基團(tuán)是本身被苯基取代(最好取代在末端的烴基碳原子上)的C1—C3亞烷基。該R1C(O)基團(tuán)因此含有連接于2—4個(gè)碳原子鏈的苯基。代表性的C(O)R1亞烷基包括2-苯基乙?；?-苯基丙?；?-苯基丁?；?分別為φCH2C(O)，φCH2CH2C(O)和φ(CH2)3C(O)，其中φ＝苯基)。這些化合物可以如上用合適的酰基鹵或酸酐與糖胺反應(yīng)而制得?？梢酝ㄟ^使用氫和碳上的鈀進(jìn)行催化還原而從不飽和的烴基鏈形成飽和的亞烷基；優(yōu)選飽和的烴基鏈。
R2基團(tuán)和糖環(huán)體系形成β-配糖物。該配糖鍵的形成可以用簡單的C1—C18烴基醇，ω-羥基羧酸酯，ω-羥基化的甲硅烷基化的烷基，或單糖或二糖制得，或者OR2一起是從C1—C18直鏈、支鏈或環(huán)狀烴基甲氨酸酯制備。C1—C6烴基如乙基、芐基或單糖如3-半乳糖基是特別優(yōu)選的。R2還可以是氫。
代表性的從簡單的前體醇制得的R2基團(tuán)包括C1—C18直鏈、支鏈或環(huán)狀烴基。這種基團(tuán)的例子有上述的優(yōu)選使用的C1—C6基團(tuán)，及其不飽和的對(duì)應(yīng)基團(tuán)，如烯丙基、3-丁烯基、2-丁-3-烯基(2-but-3-enyl)、和丁-3-炔基，以及更長的烴基基團(tuán)如芐基、4-甲基環(huán)己基、十氫化萘基、壬基、癸基、十二烷基(月桂基)、十二-7-烯基、十四烷基、十六烷基、十八烷基、油烯基(oleyl)、亞油烯基(linoleyl)、亞麻烯基(linolenyl)和蓖麻油烯基(ricinoleyl)。
C1—C18烴基氨基甲酸酯是通過對(duì)應(yīng)于上述的C1—C18烴基的異氰酸酯與末端還原糖的羥基的反應(yīng)而制備的。例如，末端葡糖基單元的1-羥基可以與異氰酸乙酯反應(yīng)而形成相應(yīng)的氨基甲酸乙酯。氨基甲酸酯中的羰基并不包括在烴基的碳原子的數(shù)目中。
C1—C5亞烷基ω-羧酸C1—C6烷基酯R2基團(tuán)是C2—C6ω-羧酸的C1—C6烷基酯。這種酯是通過前體ω-羥基羧酸酯(其羥基被用于形成配糖鍵)而制備的。代表性的ω-羥基羧酸酯包括2-羥基乙酸甲基酯、3-羥基丙酸乙酯、4-羥基丁酸叔丁基酯、5-羥基戊酸己基酯和6-羥基己酸己基酯。因此，羥基和羧基基團(tuán)都在鏈的末端，而且被1—5個(gè)亞甲基所隔開。優(yōu)選6-羥基己酸甲基酯。
ω-三(C1—C4烷基/苯基)甲硅烷基C2—C4烷基R2基團(tuán)是從相應(yīng)的前體醇(其取代的甲硅烷基位于相對(duì)于羥基的鏈的另一末端(ω-位置))制備的。如本領(lǐng)域中眾所周知的那樣，取代的甲硅烷基可以包括多種C1—C4烷基和苯基的組合如三-C1—C6烷基、二-C1—C4烷基苯基、C1—C4烷基二苯基和三苯基。代表性的取代的甲硅烷基包括三甲基甲硅烷基、二甲基苯基甲硅烷基、二-叔丁基甲基甲硅烷基、二甲基苯基甲硅烷基、叔丁基二苯基甲硅烷基等。
代表性的單糖和二糖包括3-和4-葡糖基(3/4Glc)，3-和4-半乳糖基(3/4Gal)，其中特別優(yōu)選3-半乳糖基，3-和4-N-乙酰葡糖基(3/4GlcNAc)，2-，3-，4-，和6-甘露糖基(2/3/4/6Man)，以及3-和6-N-乙酰半乳糖基(3/6GalNAc)和Galβ1→4GlcNAc。單糖本身可以和基團(tuán)，R6，形成配糖鍵，R6包括除了屬于R2基團(tuán)的糖之外的所有基團(tuán)。因此，R6是除了單糖和二糖之外的R2基團(tuán)。
對(duì)于式A的特別優(yōu)選的、具有還原性末端3GalβOR6基團(tuán)的化合物的結(jié)構(gòu)式示于下面的結(jié)構(gòu)式B中，其中X，Y，Z和R1-4，R6，和R7的定義如上。 特別優(yōu)選的式B化合物是具有式C結(jié)構(gòu)的細(xì)胞粘附的抑制劑，其中X，Y，R1，R6，和R7的定義如上。 與R2或R6基團(tuán)形成的β-糖基鍵可以通過眾所周知的與糖化物和其他R2(R6)基團(tuán)的前體的有機(jī)反應(yīng)而制得，如在碳酸銀或三氟甲磺酸銀存在下以及通過酶促手段如用針對(duì)糖化物的糖基轉(zhuǎn)移酶，將1-鹵代糖化物和所需的R2(R6)基團(tuán)的前體醇的羥基進(jìn)行反應(yīng)。
所構(gòu)想的R3基團(tuán)是氫或C1—C6?；荂1—C6?；人狨サ乃岵糠?。C1—C6?；鞘絀I化合物所優(yōu)選的。代表性的C1—C6酰基包括甲?；⒁阴；⒈；?、丁?；惗□；?、戊酰基和己?；?yōu)選乙?；Ｌ堑牧u基的?；磻?yīng)是眾所周知的，可以用適當(dāng)?shù)孽；u或酸酐進(jìn)行?；磻?yīng)。
式A的所構(gòu)想的R4基團(tuán)包括氫、C1—C6烷基(與上述的這種烷基相同)、或芐基。R4基團(tuán)與其所結(jié)合的氧原子一起構(gòu)成了酯的醇部分。R4酯可以在加入唾液酸基團(tuán)之前，在形成唾液基化的糖化物之后用如重氮甲烷之類的試劑通過標(biāo)準(zhǔn)方法而形成，或者如在下面的流程2中所述的那樣通過內(nèi)酯和適當(dāng)?shù)拇嫉姆磻?yīng)而形成。
式III化合物的R4基團(tuán)可以是質(zhì)子，C1—C6烷基或芐基，其中優(yōu)選C1—C6烷基。當(dāng)R4以質(zhì)子形式存在時(shí)，應(yīng)理解，該質(zhì)子可以被藥學(xué)上可接受的陽離子(M)如銨、鈉、鉀、鈣、鎂等所置換。R4質(zhì)子或前體陽離子通常在此處的結(jié)構(gòu)如式I和C中并不標(biāo)出，因?yàn)樵谑┯檬絀或C的抑制劑所處的生理pH值為約7.2—7.4，而此時(shí)唾液基羧酸通常是離子化的。因此，此處唾液基羧基通常以羧酸酯形式表示。
R5基團(tuán)是氫、芐基、甲氧基芐基(優(yōu)選3-或4-甲氧基芐基)、二甲氧基芐基如3，4-或3，5-二甲氧基芐基，或如上所述的C1—C6?；?。當(dāng)通過有機(jī)化學(xué)合成加入巖藻糖基時(shí)，通常使用芐基。
在中間體如上述的式B，II和III化合物的合成過程中，除了氫之外的R3，R4和R5基團(tuán)是保護(hù)基團(tuán)。當(dāng)R3＝R4＝R5＝H(氫)時(shí)，式II化合物變成式I化合物，而式B化合物變成式C化合物，當(dāng)Z為巖藻糖基時(shí)。類似地，當(dāng)Z是巖藻糖基且R3＝R4＝R5＝氫時(shí)，式A化合物變成式I化合物。
X取代基可以是C1—C6酰氧基(即在該位置上的前體羥基的C1—C6?；?，C2—C6羥基酰氧基，羥基，如上所述的鹵素基團(tuán)，或疊氮基。代表性的C1—C6酰基已經(jīng)在上面描述過，而C1—C6酰氧基是額外含有一個(gè)連接于酰基的羰基碳原子上的氧原子的C1—C6?；?。C2—C6羥基酰氧基是如上所述的酰氧基并且還含有羥基取代基。代表性的C2—C6羥基酰氧基包括羥基乙酸酯、乳酸酯、3-羥基丁酸酯、2-羥基異戊酸酯和2-羥基己酸酯。X取代基通常是除C1—C6酰氧基或C2—C6羥基酰氧基之外的基團(tuán)，除非如下所述用酶促方法對(duì)兩者進(jìn)行唾液基化和巖藻糖基化。
含有X取代基的唾液酸衍生物的合成方法公開于1992年10月1日出版的國際申請(qǐng)WO92/16640中。用于將糖唾液基化的將那些化合物也公開于該申請(qǐng)中。
R7基團(tuán)是甲基或羥甲基，從而與所述的羰基(C(O))R7一起形成N-乙?；騈-羥基乙?；?。含有R7基團(tuán)的唾液酸衍生物可以用于此處描述的酶促唾液基化反應(yīng)。
特別優(yōu)選的結(jié)構(gòu)式I和C的抑制劑化合物加同化合物的編號(hào)列示于下；即化合物17，30—38和43—51。
B.化合物的合成上述的Slex類似物可以用多種方法制備。通常，可以使用完全酶促的合成，可以使用僅涉及有機(jī)化學(xué)的技術(shù)的合成，和混合使用有機(jī)和酶促的合成，如此處被舉例說明者。
一種將有機(jī)合成和酶促合成區(qū)分開的方法是，若在水基反應(yīng)介質(zhì)中存在一種或多種酶便是酶促合成，而不存在偶連于反應(yīng)介質(zhì)的酶，而且該介質(zhì)基本上不含水并且是采用如乙腈、甲醇、乙醇、二甲基甲酰胺(DMF)、二甲基亞砜(DMSO)、苯、丙酮、二氯甲烷、四氫呋喃(THF)等有機(jī)溶劑的便是有機(jī)合成。
不論采用那種方法，含有乳糖胺，半乳糖胺和葡糖胺的糖必須在合成中在某些位點(diǎn)連接在一起。有些令人驚奇的是，乳糖胺的Galβ1→GlcN鍵在構(gòu)想的化合物的合成中是較難形成的鍵之一。
乳糖胺是在文獻(xiàn)中報(bào)道過的化合物，但是不能輕易得到。然而，乳糖胺或其衍生物對(duì)于合成構(gòu)想的化合物是一種優(yōu)良的原料。
盡管乳糖胺不易得到，半乳糖基果糖是可以購得的。半乳糖基果糖是一種不含有胺基但是含有與乳糖和乳糖胺相關(guān)的Galβ1→Fru鍵的酮糖。因?yàn)榘肴樘腔窃缫研纬闪薌alβ1→4鍵，所以是用于構(gòu)想的乳糖胺的合成的一種原料。作為酸加成鹽的乳糖胺(化合物3)的合成分別在下面的流程1和1A中一般性地和具體地加以闡述，即全乙酰基N-苯二(甲)酰亞氨基乳糖胺(化合物5)和全乙?；鵑-苯二(甲)酰亞氨基乳糖胺β氯化物(化合物6的合成)。在兩個(gè)流程中的編號(hào)相同者是相同的化合物。
流程1 流程1A
因此，半乳糖基果糖可以凈相與作為反應(yīng)劑和溶劑的伯胺反應(yīng)，從而形成相應(yīng)的N-配糖物，半乳糖基果糖N-芐基配糖物(Bn＝芐基；化合物1)。該伯胺是氮原子連于可還原去除的保護(hù)基團(tuán)(芐胺基)的氨的衍生物。在甲醇中化合物1與約等化學(xué)計(jì)量的、pKa值為約2.5—5.0的有機(jī)羧酸(冰醋酸)的反應(yīng)，可以以50—55％的產(chǎn)率產(chǎn)生乙酸N-芐基乳糖銨(化合物2)。乙酸乳糖銨(化合物3)是通過用碳上的鈀對(duì)上述的甲醇溶液進(jìn)行氫解反應(yīng)而制備的。
應(yīng)注意，也可以使用其他可還原去除的被保護(hù)的胺以替換芐基胺。例如，單-和二-甲氧基芐基胺可以視作是可還原去除的被保護(hù)的氨的衍生物，因?yàn)榕c糖化物反應(yīng)之后，單-和二-甲氧基芐基也可以通過氫解而去除。類似地，可以使用烯丙基胺，并在作為溶劑的THF中與聚甲基氫硅氧烷(PMSH)及四個(gè)(三苯膦)合鈀(Pd(PPh3)4)反應(yīng)而去除烯丙基保護(hù)基團(tuán)。
因此，盡管在流程1中將芐基(流程1A)用作RA，但是應(yīng)理解，單甲氧基芐基、二甲氧基芐基或烯丙基可以被用作RA。
上面的討論和在流程1和1A中所示的反應(yīng)闡述了從半乳糖基果糖制備乳糖胺或乳糖銨鹽的方法。根據(jù)該方法，半乳糖基果糖與伯胺(它是單取代的氨衍生物，其氮原子連于可還原去除的保護(hù)基團(tuán))混合從而形成反應(yīng)混合物。在該方法中被保護(hù)的氨衍生物作為反應(yīng)劑和溶劑。
被保護(hù)的氨衍生物(或伯胺)比所用的半乳糖基果糖的摩爾量約過量2—10倍摩爾。伯胺最好是約4—8倍摩爾過量。
如上所述，含有其他可還原去除的保護(hù)基團(tuán)的伯胺也是被構(gòu)想到的。因此，烯丙基胺和對(duì)甲氧基芐基胺已經(jīng)被成功地使用以產(chǎn)生半乳糖基果糖N-配糖物，并且重排得到相應(yīng)的N-取代的乳糖胺。
這樣形成的反應(yīng)混合物在約10-60℃維持一段時(shí)間，使之足以形成相應(yīng)的半乳糖基果糖N-配糖物；即用伯胺替換半乳糖基果糖2-羥基基團(tuán)。優(yōu)選室溫(約20℃)至約50℃。
維持時(shí)間是多種變量如伯胺的摩爾過量程度、維持的溫度和所需的半乳糖基果糖N-配糖物的數(shù)量等的函數(shù)，而且在用低溫和少量伯胺的情況下，可以從約8小時(shí)(需要少量產(chǎn)物時(shí))到長達(dá)兩周。例如，在使用4—7.5摩爾過量的伯胺(此處為芐基胺)時(shí)，反應(yīng)在室溫下維持七天后便完成了，但是在同樣條件下使用2倍過量的芐基胺時(shí)，在同樣時(shí)間內(nèi)僅完成不到50％。當(dāng)維持溫度升至50℃時(shí)，使用4倍過量胺的反應(yīng)二天(48小時(shí))后便完成了。但70℃的反應(yīng)溫度會(huì)導(dǎo)致分解。
在反應(yīng)介質(zhì)中存在路易斯酸催化劑如氯化鋅、三氟甲磺酸鋅或三氟甲磺酸鎂時(shí)，會(huì)增加反應(yīng)速度，從而使用7.5倍過量的芐基胺的反應(yīng)可以在二天內(nèi)(48小時(shí))完成，而在室溫下需7天才能完成反應(yīng)。用優(yōu)選的三氟乙酸作為催化劑時(shí)，可以獲得類似的結(jié)果。
半乳糖基果糖在醇溶劑包括甲醇中是不溶的。半乳糖基果糖可以溶解在熱的DMF中并且在冷卻后留在溶液中。當(dāng)有上述催化劑存在時(shí)，甲醇和DMF都可以和伯胺一起作為共溶劑。例如，當(dāng)甲醇被用作共溶劑時(shí)，在室溫或50℃時(shí)不發(fā)生反應(yīng)。然而，使用氯化鋅催化劑并且使用4倍過量的芐基胺和甲醇作為共溶劑時(shí)，在室溫下反應(yīng)會(huì)在48小時(shí)后完成。
如上制備的半乳糖基果糖N-配糖物是吸濕的，因此在制備后應(yīng)盡快使用。該N-配糖物與約0.1當(dāng)量至等當(dāng)量的(產(chǎn)率最好)、pKa值為約2.5—5.0的羧酸，在C1—C3醇溶劑中，于約10—30℃反應(yīng)，從而將乳果糖N-配糖物重排成胺基被上述的可還原去除的保護(hù)基團(tuán)所保護(hù)的乳糖銨鹽；即具有連于胺的氮原子上的可還原去除的保護(hù)基團(tuán)的、胺被保護(hù)的乳糖銨鹽。
使用的羧酸可以是本領(lǐng)域中眾所周知的眾多的酸中的任何一種，如乙酸(pKa＝4.76)，丙酸(pKa＝4.88)，丁酸(pK1＝4.82)，氯乙酸(pKa＝2.80)，甲氧基乙酸(pK1＝3.52)等。代表性的C1—C3醇包括甲醇、乙醇、丙醇和異丙醇。優(yōu)選的反應(yīng)溫度為室溫。
半乳糖基果糖N-配糖物的濃度為約0.1M至基本飽和。采用的典型濃度在溶劑中為約0.5—1.5M。
然后去除可還原去除的保護(hù)基團(tuán)。對(duì)于這種去除，優(yōu)選的方法是使用鈀催化劑的氫解反應(yīng)，尤其當(dāng)使用芐基胺或甲氧基芐基胺時(shí)。當(dāng)烯丙胺被用作伯胺時(shí)，使用PMHS和Pd(PPh3)4。
上述的反應(yīng)可以在任何對(duì)乳糖銨衍生物合適的溶劑中進(jìn)行。例如，氫解可以在酸性水溶液或上述的醇中進(jìn)行。PMHS和Pd(PPh3)4典型地是在THF或類似溶劑中使用。
這樣產(chǎn)生的乳糖銨鹽通常在制備后回收，盡管隨著所用的溶劑和化合物的用途不同可能不必進(jìn)行回收。當(dāng)需要回收乳糖銨鹽時(shí)，其陰離子是還原反應(yīng)中所用的酸的陰離子，可以用眾所周知的色譜法或沉淀法而獲得該銨鹽。游離乳糖胺可以通過離子交換色譜法或中和法從鹽制備，然后將游離的堿(乳糖胺)萃取入合適的有機(jī)溶劑中。
接著將由氫解反應(yīng)產(chǎn)生的含有化合物3的甲醇溶液，或其他合適的溶液與鄰苯二甲酸酐(PhthO)，在堿催化劑如Na2CO3存在下反應(yīng)，從而形成鄰苯二酰胺半酸，化合物4。形成合適的酰胺半酸如化合物4后，可以去除反應(yīng)溶劑如甲醇。二糖的羥基接著被全?；彵蕉柞啺翻h(huán)被閉合以形成全?；?Ac)的苯二(甲)酰亞氨基化合物5，從原料計(jì)算產(chǎn)率為大于10％。
此外從半乳糖基果糖合成乳糖銨鹽也是被構(gòu)想到的。
此處，半乳糖基果糖與等摩爾的乙酸銨和作為溶劑的液態(tài)氨在不銹鋼高壓釜中反應(yīng)，其中液態(tài)氨被加入冷卻至-78℃的高壓釜中。產(chǎn)生的反應(yīng)混合物被升溫至0—80℃的溫度，并維持約5小時(shí)—5天，取決于所用的溫度和所需的轉(zhuǎn)化率。該反應(yīng)形成了半乳糖基果糖氨基配糖物。
在去除氨和乙酸銨后(后者典型地是在真空下去除的)，得到的不含氨的材料用如上的羧酸處理以形成乳糖銨鹽，如化合物3。還可如上處理該乳糖銨鹽以形成化合物5?；衔?的β-異頭物在第一次結(jié)晶中以3.8％的總產(chǎn)率回收，其中在第一反應(yīng)步驟中反應(yīng)溫度為35℃，反應(yīng)時(shí)間為24小時(shí)。
盡管化合物5在此方法中的產(chǎn)率比前述的方法中的產(chǎn)率低，但是該方法中不必使用前述方法中所用的還原去除胺的保護(hù)基團(tuán)。在那個(gè)方法中使用的含鈀的催化劑是這些合成中所用的最昂貴的試劑。還應(yīng)注意，甲醇氨可以用作溶劑以替代液態(tài)氨，從而避免使用高壓釜。
在流程1中，化合物5的胺是連于RB和RB的，而RB基團(tuán)與所述的氮原子一起形成C4—C8環(huán)狀酰亞胺，如在化合物5中的鄰苯二甲酰亞胺(Phth)。應(yīng)注意，琥珀酸酐，馬來酸酐，單和二甲基琥珀酸酐和檸康酸酐等也可以使用以形成類似的酰亞胺，這樣RB和RB與氮原子一起形成相應(yīng)的酰亞胺。由-NRBRB基團(tuán)形成的環(huán)狀酰亞胺提供一個(gè)胺保護(hù)基團(tuán)。該保護(hù)基團(tuán)在去除如乙酸酯等的O-?；臈l件下是穩(wěn)定的，但是可以方便地用肼去除。還應(yīng)注意，可以不必使用酸酐，而代之以C1—C6烷基半酯鹵化物如甲基鄰苯二甲酰氯。
所示的化合物5是β-異頭物。α-乙酸酯也會(huì)形成。通過將所得化合物5的母液濃縮至泡沫體，然后再溶于DMF中，接著與乙酸肼鎓反應(yīng)，該反應(yīng)將乙酸基團(tuán)切下，從而形成β-OH異頭物，這樣所需的β-乙酸酯的產(chǎn)率幾乎可以加倍。用常規(guī)的萃取技術(shù)將反應(yīng)產(chǎn)物分離出和干燥，將干的材料溶解在吡啶中，用過量的乙酸酐處理吡啶溶液，反應(yīng)，再次萃取后，可以獲得總產(chǎn)率為8.3％的化合物5。按起始原料計(jì)算，化合物5的最終產(chǎn)率為18.7％。
化合物5與AlCl3在二氯甲烷中，于室溫下反應(yīng)可以產(chǎn)生基本定量產(chǎn)率的化合物6。
下面的流程2闡述化合物6全乙酰基N-苯二(甲)酰亞氨基乳糖胺β-氯化物轉(zhuǎn)化成完全被保護(hù)的唾液基化的四糖，即化合物13。這樣，在步驟a中，化合物6與化合物9(其合成在實(shí)施例中闡述)在室溫下，在分子篩、可力丁和三氟代甲磺酸銀存在下，用二氯甲烷作為溶劑，反應(yīng)2小時(shí)以制備相應(yīng)的三糖。該全保護(hù)的三糖在步驟b中先用80％的乙酸水溶液在80℃處理2小時(shí)以去除位于末端Gal單元的4-位和6-位的亞芐基保護(hù)基團(tuán)。接著在步驟c中，水合肼與回收的、部分去保護(hù)的三糖在回流下反應(yīng)17小時(shí)以去除苯二(甲)酰亞氨基和乙?；⑿纬赏耆ケＷo(hù)的三糖。在步驟d中，于甲醇∶水(5∶1)中的去保護(hù)的三糖與二烯丙基焦碳酸(diallylpyrocarbonate)的反應(yīng)產(chǎn)生化合物10，其中AL為烯丙基氨基甲酰。
當(dāng)R2不是在流程2的合成中所述的配糖物，而是優(yōu)選的C1—C18烴基如芐基時(shí)，可以省略糖基化步驟a和b，并提供式A，I或II的四糖，其中R2不是單糖或二糖。
然后在步驟e中，化合物10在水性緩沖液中用α-(2，3)-唾液基轉(zhuǎn)移酶(EC2.4.99.6)和大量其他的酶通過酶促法進(jìn)行唾液基化。反應(yīng)后，在室溫下進(jìn)行TLC10—12天，在該時(shí)間內(nèi)超過95％的化合物10被消耗，并制得化合物11。
化合物11以稠漿的形式回收，它與吡啶共蒸發(fā)兩次，然后在真空中保持20小時(shí)。將這樣脫水過的物質(zhì)再溶解在吡啶中，并和乙酸酐一起加入催化量的4-二甲基氨基吡啶(DMAP)。在步驟f中，在隨后的44小時(shí)中再加入兩次乙酸酐從而完成乙酰基化反應(yīng)并形成具有唾液基羧基和糖羥基的內(nèi)酯。在步驟g中，然后向回收的材料中加入甲醇以形成唾液酸甲酯，隨后再加入乙酸酐以使游離羥基乙?；瑥亩纬赏耆Ｗo(hù)的化合物12。
很明顯，化合物11和12是結(jié)構(gòu)式為A和III的化合物。以化合物12為代表，Z是C1—C6?；?乙?；?，X是C1—C6酰氧基(乙酰氧基)，R2是3GalβO-乙基，R3是乙?；琑4是甲基，以及R1是烯丙氧基。同樣明顯的是，上述的對(duì)于任一結(jié)構(gòu)式的化合物的其他X基團(tuán)可以在唾液基化步驟中方便地引入。如果需要存在于結(jié)構(gòu)式I或C抑制劑上的唾液基單元的X取代基是C1—C6酰氧基或C1—C6羥基酰氧基，那么最好將化合物10(或沒有3GalβOR2基團(tuán)的二糖)全乙?；诓襟Eh中將化合物10的烯丙氧基氨基甲?；鶊F(tuán)(AL)去除，并用含有苯環(huán)的R1?；械哪骋粋€(gè)替換，如流程3中的步驟c所述。然后對(duì)分子進(jìn)行去保護(hù)和通過酶促進(jìn)行法唾液基化和巖藻糖基化，如下文所述。對(duì)于其他的R1-4基團(tuán)或結(jié)構(gòu)式A，B或III的類似的化合物，人們可以替換化合物9的3Galβ配糖物R2，步驟f和g中的?；噭?，以及步驟f中的酯化用的醇。
在步驟h中，用無水THF中的聚甲基氫硅氧烷(PMHS)，在室溫下處理回收的、干燥的化合物12，然后用四個(gè)(三苯膦)合鈀(Pd(PPh3)4)處理18小時(shí)，產(chǎn)生化合物13，產(chǎn)率為87％。
流程2
下面的流程3介紹了余下的一種合成方法，用于闡述式I和C的化合物17抑制劑?；衔?3與1當(dāng)量冰醋酸在甲醇水溶液中，于50℃反應(yīng)48小時(shí)，從而選擇性地使Glc3-羥基脫?；?，并得到化合物14，產(chǎn)率65％(步驟a)。
然后，化合物14與苯甲酰氯在二氯甲烷中和固體碳酸氫鈉，在室溫下反應(yīng)24小時(shí)，從而選擇性地苯甲酰基化(產(chǎn)率83％)，形成化合物15(步驟b)。當(dāng)R2不是糖單元時(shí)，結(jié)構(gòu)式A，I，II和III化合物的的別的R1基團(tuán)在該步驟或類似的步驟中加入。
在流程3的步驟c中進(jìn)行有機(jī)化學(xué)的巖藻糖基化反應(yīng)。將化合物15在二氯乙烷中與三-O-芐基巖藻糖基氟、分子篩和四甲基脲混合，然后冷卻至-20℃，加入氯化亞錫和高氯酸銀。然后緩慢地回升至室溫并攪拌24小時(shí)，從而制得化合物16，產(chǎn)率為77％。
這樣，化合物16是結(jié)構(gòu)式A和B的化合物(其中Z為被保護(hù)住的巖藻糖基)和式II的化合物。與前述的X和R1-4基團(tuán)進(jìn)行組合時(shí)，使用別的的R5基團(tuán)可以制得這些結(jié)構(gòu)式的其余化合物。
巖藻糖基糖單元的O-芐基保護(hù)基團(tuán)R5在步驟b中，在作為溶解的甲醇中，通過碳上的氫氧化鈀(Pd(OH)2/C)進(jìn)行氫化反應(yīng)而被去除。在室溫下反應(yīng)1小時(shí)可以完全去除O-芐基。對(duì)脫去芐基的化合物進(jìn)行過濾和濃縮，得到一種油狀物，將其再溶解于甲醇∶水(4∶1)中，并加入甲醇鈉粉末(步驟e)。在室溫下反應(yīng)16小時(shí)，獲得抑制劑化合物17(產(chǎn)率72％)。
當(dāng)R5為C1—C6酰基時(shí)，不必使用氫化步驟，并且R5C1—C6?；cR3和R4基團(tuán)一起去除。使用R5C1—C6?；捅苊鈿浠襟E，同樣提供了一種合成含有硝基的R1基團(tuán)的路徑。
流程3
當(dāng)R2基團(tuán)是單糖或二糖時(shí)，使用被適當(dāng)?shù)丶右员Ｗo(hù)的單糖或二糖，如流程2中的化合物9。例如，乳糖、乳糖C1—C18配糖物或蜜二糖可被制成被保護(hù)住的亞芐基(benzylidine)衍生物，與化合物9類似，然后用于流程2的偶合步驟a，并將產(chǎn)生的產(chǎn)物用于流程2和3的隨后步驟。
應(yīng)理解，用本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的其他方法可以制備乳糖胺及其衍生物。還應(yīng)理解，三糖化合物10可以用酶法制備，如用乙基3-O-(2-N-烯丙氧基羰基-2-氨基-2-脫氧-β-D-吡喃葡糖基)-β-D-半乳糖苷與UDP-Gal在尿苷-5′-二磷酸-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶催化下反應(yīng)，或者按照已知的方法用其他合適的酶。類似地，化合物11可以用酶法進(jìn)行巖藻糖基化用巖藻糖基轉(zhuǎn)移醚(FT)，如巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶V，以及核苷酸糖供體GDP-巖藻糖，和其他的用于GDP-巖藻糖再生的酶按照已知的方法進(jìn)行。當(dāng)然，因合成的變化會(huì)導(dǎo)致反應(yīng)流程的稍許變化，但是這些變化是一般熟練的技術(shù)人員所能做到的。
另一種有用的合成程序示于下面的流程4中。此處，原料是流程3的化合物14的游離堿，化合物14a.
流程4 在步驟a中化合物14a與稍過量的苯甲氧甲酰氯(CBZ—Cl)在二氯甲烷中，在碳酸氫鈉存在下進(jìn)行反應(yīng)，然后在約18小時(shí)后再加入等量的CBZ—Cl，從而形成胺被保護(hù)的化合物39(產(chǎn)率65％)。流程4的步驟b與流程3的步驟c中所示的糖基化步驟基本相同，其中形成了化合物40，產(chǎn)率為73％，并回收17％的原料化合物39。
隨后在步驟c中與10％Pd—C和在乙醇中的甲酸銨于回流條件下反應(yīng)，從而形成巖藻糖基化的游離胺，化合物41，產(chǎn)率為96％。步驟d中，該游離胺化合物41接著與酰氯(YR1)，在二氯甲烷中，于碳酸氫鈉存在下反應(yīng)，從而高產(chǎn)率地形成相同的羥基被保護(hù)的N-乙?；幕衔?，此處為3，5-二氯苯甲酰胺衍生物，化合物42。通過在28％醇基鈉的甲醇溶液中的反應(yīng)，可以基本定量地使羥基去保護(hù)。
數(shù)種特別優(yōu)選的抑制劑，化合物17，30—38和43—51的結(jié)構(gòu)已予列出?；衔?0—33是從它們相應(yīng)的前體化合物26—29，用流程3中將化合物16轉(zhuǎn)變成化合物17相同的方法制備的?；衔?4—38和51用類似流程3的方法制得?；衔?3—49用流程4中所示的通用程序類似地制得?；衔?0是用流程3，并用流程4的還原步驟c而制得。這些化合物是結(jié)構(gòu)式I以及式A的化合物。C.細(xì)胞粘附抑制的測(cè)定方法對(duì)本專業(yè)熟練技術(shù)人員來說有許多已知和可用的配體-受體相互作用的抑制劑的直接和間接體外篩選法。例如，可以測(cè)定抑制SLex攜帶細(xì)胞與表達(dá)某種特定的選擇素的細(xì)胞間的粘附。
如過去所討論的，已經(jīng)克隆了幾種選擇素受體基因，這樣，這些基因可在如COS細(xì)胞，CHO細(xì)胞，此處所用的人腺病毒轉(zhuǎn)化腎細(xì)胞等大量細(xì)胞中插入并表達(dá)，由此，如下文所述，在分析中使用rELAM(重組的ELAM-1)等重組的選擇素受體。而且，通常不表達(dá)SLex的細(xì)胞能夠被一個(gè)或一個(gè)以上糖基轉(zhuǎn)移酶基因所轉(zhuǎn)化，該基因賦與轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞以合成配體的能力[參見例如Lowe等，Cell，63475—484(1990)]。在有些測(cè)定中，將抑制劑化合物與固定在固體表面上的標(biāo)記過的SLex攜帶細(xì)胞和表達(dá)細(xì)胞表面選擇素或重組的選擇素的活性細(xì)胞一起進(jìn)行培養(yǎng)。然后在適當(dāng)清洗之后，通過檢測(cè)連接在表面上的標(biāo)記來測(cè)定細(xì)胞間粘附的抑制情況。
通常，SLex類似物的體外測(cè)定法是檢測(cè)待測(cè)化合物競(jìng)爭(zhēng)性地抑制選擇素與含SLex的細(xì)胞的粘附能力的競(jìng)爭(zhēng)性測(cè)定。含選擇素的細(xì)胞通常是帶有有用的重組選擇素的激活的血小板細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞，而SLex-攜帶細(xì)胞通常是嗜中性白細(xì)胞和HL-60細(xì)胞。
其它測(cè)定方法涉及檢測(cè)反應(yīng)后的SLex配體-攜帶細(xì)胞或選擇素-攜帶細(xì)胞有無各種生理變化。合適的測(cè)定的實(shí)例有測(cè)定由結(jié)合引起的轉(zhuǎn)錄活性的變化(參見例如PCT公開號(hào)3712820)，檢測(cè)各種細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞外效應(yīng)(參見例如PCT公開號(hào)90/00503)和測(cè)定各別細(xì)胞的膜電位變化(參見例如美國專利4,343,782)，兩者均在此被引用以資參考?；蛘?，可以檢測(cè)分離后的受體或配體的構(gòu)象變化，參見例如在此引作參考的美國專利4,859,609。還有，可以將SLex表達(dá)細(xì)胞與連于固體載體上的選擇素結(jié)合，再將結(jié)合后的細(xì)胞裂解，測(cè)定只存在于結(jié)合的細(xì)胞內(nèi)的某種蛋白質(zhì)。
所有測(cè)定用組分，包括配體，選擇素受體，或SLex化合物都可以連結(jié)在固體表面上。在本技術(shù)領(lǐng)域，已知有許多將生物分子固定在固體表面上的方法。例如，固體表面可以是膜(如硝化纖維素膜)，微型效價(jià)平皿(如PVC或聚苯乙烯)或珠子。所需組分可通過共價(jià)鍵或通過非特異的方式與之作非共價(jià)的結(jié)合。
大量天然和合成的有機(jī)、無機(jī)聚合物均可用作固體表面材料，其例如包括聚乙烯，聚丙烯，聚(4-甲基丁烯)，聚苯乙烯，聚甲基丙烯酸酯，聚對(duì)苯二甲酸乙二醇，人造絲，尼龍，聚(丁酸乙烯酯)，聚硅氧烷，聚甲醛，纖維素，乙酸纖維素酯，硝化纖維素等。其它可用的材料有紙，玻璃，陶瓷，金屬，準(zhǔn)金屬，半導(dǎo)體材料，金屬陶瓷等。還包括可形成凝膠的物質(zhì)如明膠等蛋白質(zhì)，脂多糖，硅酸鹽，瓊脂糖和聚丙烯酰胺，或形成幾種水相的聚合物如葡聚糖，聚二醇(其中的亞烷基具有2—3個(gè)碳原子)，或表面活性劑如兩性化合物，如磷脂，長鏈(12—24個(gè)C原子)烷基銨鹽等。如果固體表面是多孔性的，可根據(jù)反應(yīng)系統(tǒng)的特點(diǎn)選用不同的孔徑。
制備表面時(shí)，可使用多種不同的材料，尤其如薄片材料，以獲得不同的特性。例如，可使用明膠之類的蛋白質(zhì)涂層以避免非特性結(jié)合，以簡化共價(jià)結(jié)合，以改善信號(hào)的檢測(cè)等。
如果需要化合物與表面作共價(jià)結(jié)合，表面通常是多官能的或是可多官能化的?？纱嬖谟诒砻嫔喜⒖捎糜谶B接的官能團(tuán)有羧酸，醛，氨基，氰基，烯基，羥基，巰基等。各種化合物與不同表面的連接方式已是眾所周知的而且在文獻(xiàn)中已有充分說明。其例可參見Imobilized Enzymes，Inchiro Chibata，Haolsted，Press，NewYork(1978)和在此引作參考的Cuatrvecasas，J.Bid.Chem.245；3059(1970)。
除共價(jià)結(jié)合外，還可以用不同的方法對(duì)待測(cè)組分進(jìn)行非共價(jià)結(jié)合。典型的非共價(jià)結(jié)合是表面對(duì)化合物的非特異性吸附。通常，再用另一種化合物將表面封閉以防與標(biāo)記過的組分的非特定的連結(jié)。或者，將表面制成只可與一種組分進(jìn)行非特定的結(jié)合而基本不結(jié)合另一種。例如，帶有伴刀豆球蛋白A之類的外源凝集素和表面可結(jié)合含糖的化合物而不結(jié)合標(biāo)記過的未糖基化的蛋白質(zhì)。美國專利4，447,576和4,254,082中綜述了各種可用于對(duì)測(cè)定組分進(jìn)行非共價(jià)結(jié)合的固體表面。
前述標(biāo)記可用已熟知的方法直接或間接與測(cè)定組分偶合，或可以是被結(jié)合的細(xì)胞的內(nèi)源蛋白質(zhì)?？梢允褂玫臉?biāo)記有許多種。測(cè)定組分可用多種方法之一加以標(biāo)記。最常用的檢測(cè)方法是使用放射自顯影術(shù)檢測(cè)用3H，125I，35S，14C或32P標(biāo)記的化合物等。放射性同位素的選用取決于由合成的方便性、變動(dòng)穩(wěn)定性和所選同位素的半衰期所導(dǎo)致的研究上的偏愛。其它非放射性標(biāo)記包括與被標(biāo)記的抗體結(jié)合的配體，熒光團(tuán)，化學(xué)發(fā)光劑，酶，和抗體，后者可充當(dāng)與已標(biāo)記過的配體進(jìn)行特異結(jié)合的配偶。標(biāo)記的選擇取決于靈敏度要求，與化合物結(jié)合的容易性，穩(wěn)定性要求，和使用的檢測(cè)儀器。
非放射性標(biāo)記常以間接方式結(jié)合。通常，配體(如生物素)與分子是以共價(jià)結(jié)合的。然后配體與抗配體(如抗生蛋白鏈菌素)結(jié)合，后者本身或是可測(cè)的，或是再與信號(hào)系統(tǒng)，如可檢測(cè)的酶，熒光化合物，或化學(xué)發(fā)光化合物結(jié)合。有多種配體和抗配體。如果一個(gè)配體有天然的抗配體，例如生物素，甲狀腺素和皮質(zhì)醇，它就可以與標(biāo)記過的天然存在的抗配體結(jié)合使用?；蛘?，任何半抗原或抗原化合物可與抗體結(jié)合使用。
前述標(biāo)記還可以是存在于細(xì)胞中的、其粘附作用有待抑制的酶或其它蛋白質(zhì)。由此，可以將這種酶的量作為標(biāo)記，以測(cè)定連結(jié)量。髓過氧化酶就是存在于HL-60細(xì)胞上的這樣的一種酶，它可用作下文將要敘述的連結(jié)抑制研究中的標(biāo)記。
SLex分子也可直接與信號(hào)發(fā)生化合物結(jié)合，例如，與酶或與熒江團(tuán)結(jié)合?？捎米鳂?biāo)記的酶主要是水解酶，尤其是磷酸酶，酯酶和糖苷酶，或氧化還原酶，尤其是過氧物酶。熒光化合物包括熒光素及其衍生物，若丹明及其衍生物，丹酰，7-羥基香豆素等?；瘜W(xué)發(fā)光化合物包括熒光素，和2，3-二氫-2，3-二氮雜萘二酮類，如魯米諾。各種可能用到的信號(hào)發(fā)生系統(tǒng)的綜述可見在此被引作參考的美國專利4,391,904。D.藥用組合物還研究了一種含有溶于或分散于藥學(xué)上認(rèn)可的載體或稀釋劑中的等測(cè)SLex類似物的藥用組合物。這種組合物中含有抑制細(xì)胞粘附有效量的前文討論過的，研究過的SLex類似物。
一種被研究過的藥用組合物可用于阻斷或抑制與許多機(jī)能紊亂有關(guān)的細(xì)胞粘附。例如，許多發(fā)炎病癥與表達(dá)在血管內(nèi)皮細(xì)胞和血小板細(xì)胞上的選擇素有關(guān)?！鞍l(fā)炎”在此指特異性和非特異性防卸系統(tǒng)的反應(yīng)。特異性防卸系統(tǒng)的反應(yīng)是對(duì)某一抗原的特異性的免疫系統(tǒng)反應(yīng)。特異性防卸反應(yīng)的實(shí)例包括抗體對(duì)抗原的反應(yīng)，例如病毒，和遲發(fā)型過敏。非特異性防卸反應(yīng)是由通常來具有免疫記憶的白細(xì)胞介導(dǎo)的炎性反應(yīng)。這樣的細(xì)胞有巨噬細(xì)胞，嗜薯紅細(xì)胞和嗜中性白細(xì)胞。非特異性反應(yīng)的實(shí)例有被蜜蜂螯傷后即發(fā)性腫脹，和細(xì)菌感染部位的PMN白細(xì)胞聚集(如病菌性肺炎中的肺部浸潤液和膿腫中的化膿)。
其它可治的病變有，例如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，局部缺血后白細(xì)胞介導(dǎo)的組織損傷(再灌注損傷(reperfusion injury))，凍傷或凍傷休克，急性白細(xì)胞介導(dǎo)的肺損傷(如成人呼吸困難綜合癥)，氣喘，外傷休克，敗血休克，腎炎，包括特應(yīng)性皮炎，牛皮癬，腸炎在內(nèi)的急性慢性炎癥。諸如動(dòng)脈粥樣硬化和血凝結(jié)等各種血小板介導(dǎo)的病癥也是可治的。而且，通過抑制循環(huán)癌細(xì)胞的粘連可以抑制或防止癌轉(zhuǎn)移。其例包括結(jié)腸癌和黑色素瘤。
作為例子，再灌注損傷尤其適于用被研究的藥用組合物進(jìn)行治療?？梢种芇-選擇素-配體反應(yīng)的組合物尤其適用于治療或預(yù)防再灌注損傷。在心臟手術(shù)前預(yù)防性使用被研究的藥用組合物，可加速術(shù)后恢復(fù)。
因?yàn)镻-選擇素藏在血小板細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的Weibdcl-Palade體中，被凝血素激活后釋放出來，從而介導(dǎo)血細(xì)胞與單核白細(xì)胞的粘附。所以P-選擇素-配體反應(yīng)的抑制劑特別利于最大程度減少伴隨血栓類病變的組織損傷。例如，這種抑制劑對(duì)剛經(jīng)歷過中風(fēng)，心肌梗塞，嚴(yán)重動(dòng)脈檢塞，肺栓塞等的病人特別有療效。這種化合物特別適用于栓塞前的治療。
發(fā)現(xiàn)有一種被研究化合物特別是適用于治療敗血休克或傳播性血管內(nèi)血凝因(DIC)的斷發(fā)癥。敗血休克或DIC滲入組織的白細(xì)胞常會(huì)導(dǎo)致病理性組織損傷。而且，這類病人還會(huì)發(fā)生擴(kuò)散性微循環(huán)栓塞和擴(kuò)散性炎癥。在此提供的一種治療劑組合物可以抑制這些部位的血細(xì)胞滲出和通過解組織損傷。
選擇素-細(xì)胞SLex配位體反應(yīng)的抑制劑了可用于治療與之有關(guān)的外傷休克和急性組織損傷。因?yàn)檫x擇素在向損傷部位補(bǔ)充血細(xì)胞中起一定作用，特別是急性損傷和炎癥中的E-選擇素，所以它們的抑制劑可通過局部或全身性吸收來防止與這些損傷有關(guān)有組織損傷。而且，由于這些抑制劑對(duì)炎癥部位的專一性，例如，在有ELAM-1受體時(shí)，與常規(guī)抗炎劑相比，這些組合物將更有療效而不會(huì)導(dǎo)致并發(fā)癥。
所以，本發(fā)明還提供了一種治療上述病癥的藥用組合物。被研究的藥用組合物含有前述可抑制細(xì)胞SLex配位體和選擇素受體之間反應(yīng)的SLex類似物，該類似物溶解或分散在某藥學(xué)認(rèn)可的稀釋劑中。該工用組合物適用于各種給藥途徑。各種現(xiàn)有的給藥方式的簡要綜述可參見Langer，Science，2491527—1533(1990)。
根據(jù)哺乳動(dòng)物炎性反應(yīng)的復(fù)雜性，熟練技術(shù)人員很容易認(rèn)識(shí)到藥用組合物中還可以包括已知的能干擾其它細(xì)胞粘附分子的其它化合物。例如，已知粘附分子的1-[2-(5，6-二甲氧基-2-甲基-3-吲哚基)乙基]-4-苯基哌嗪鹽酸鹽這一族中的成員在感染部位白細(xì)胞外滲中起一定作用。包括選擇素受體在內(nèi)的細(xì)胞間粘附受體和它們的免疫功能的綜述可參見Springer Nature，346425—434(1990)。而且，使用本研究中的一種藥用組合物的成功治療還取決于被治療病癥的發(fā)展情況。因?yàn)樵诓∽冞^程中不同的粘附分子會(huì)根據(jù)各種因素而被增多或減少，熟練技術(shù)人員應(yīng)認(rèn)識(shí)到治療不同情況的炎證可能需用不同的藥用組合物。
對(duì)于含可與選擇素受體結(jié)合的，并通過含SLex配位體的細(xì)胞抑制與受體結(jié)合的SLex類似物的藥用組合物來說，化合物的劑量取決于具體的化合物種類，劑型，具體的適應(yīng)癥及其嚴(yán)重性，病人的整體健康狀況，和開方醫(yī)生的判斷。例如，治療再灌注損傷，對(duì)70公斤的病人來說，試用SLex類似物的劑量約為50μg—10,000mg/每天。最好在心肌梗塞或其它損傷后盡快開始服藥。藥用組合物可以通過腸吸收，表面用藥，口用或局部用藥，如噴劑或內(nèi)服藥，用于預(yù)防和/或治療。藥用組合物可以根據(jù)服用方法制成不同的劑量來服用。例如，適于口服的單元式劑量有粉劑，片劑，丸劑，膠囊和糖衣藥丸。
藥用組合物最好通過靜脈注射給藥。所以，本發(fā)明提供了一種用于靜脈注射用的藥用組合物，它含有所研究的SLex類似物溶解或分散在藥學(xué)認(rèn)可的稀釋劑(載體)(最好是水性載體)中形成的溶液?？捎玫乃暂d體有許多，如水，緩沖水溶液，0.4％的生理鹽水等。這些組合物可用熟知的常規(guī)滅菌法滅菌，也可以過濾滅菌。所得的水溶液可以就此包裝待用，也可以進(jìn)行凍干，凍干制劑在使用前需與滅菌水溶液混合。組合物中可以含有用于接近生理狀況的助劑，例如pH調(diào)節(jié)和緩沖劑，肌肉張力調(diào)節(jié)劑，濕潤劑等，例如醋酸鈉，乳酸鈉，氯化鈉，氯化鉀，氯化鈣，單月桂酸山梨醇酯，油酸三乙醇胺等。SLex類似物的重量百分濃度一般為1％至10—30％，主要由液體體積，粘度等加以選擇，根據(jù)具體用藥方式而定。如上所述，組合物組分可通過脂性制劑傳輸。
所以，典型的靜脈注射藥用組合物可由250ml無菌的Ringer′s溶液，25mg SLex類似物組成?？勺髯⑸溆玫幕衔锏膶?shí)際制備方法是熟練專業(yè)人士所已知的，其更詳盡的描述可見于在此引為參考的Remington′s Pharmaceutical Sciences，第17版，Mack PublishingCompany，Easton，PA(1985)。
若是固體組合物，可使用常規(guī)的無毒固體稀釋劑(載體)，其中包括藥用級(jí)的甘露糖醇，乳糖，淀粉，硬脂酸鎂，糖精鈉，滑石粉，纖維素，葡萄糖，蔗糖，碳酸鎂等。用于口服時(shí)，藥學(xué)認(rèn)可的無毒組合物可含有以前面列出過的載體為例如的任何常用賦形劑，10—95％的活性組分，即前述SLex類似物，以20％為佳(參見前文Remington’s)。
用作噴霧劑時(shí)，最好使用SLex類似物的細(xì)粉，并加入表面活性劑和推進(jìn)劑。SLex類似物的典型重量含量0.5％—30％，以1％—10％為佳。表面活性劑必須無毒而且可溶于推進(jìn)劑中。其代表是6—22碳脂肪酸的酯或局部酯，由脂肪酸和脂肪酸反應(yīng)而生成，其中的酸的代表有己酸，辛酸，月桂酸，棕櫚酸，硬脂酸，亞油酸，亞麻酸，十八烯酸和油酸，其中的醇的代表有乙二醇，丙三醇，季戊四醇，阿糖醇，甘露糖醇，山梨醇，衍生自山梨醇的脫水己糖醇等脂族多元醇或其脫水環(huán)化產(chǎn)物，以及這些酯的聚氧乙烯和聚氧丙烯衍生物。也可使用如混合或天然的甘油酯等混合酯。表面活性劑的重量含量約為0.1％—20％，以0.25％—5％為佳組合物的其余組分通常為推進(jìn)劑。推進(jìn)劑一般在大氧壓下呈氣態(tài)而在壓縮時(shí)被液化。適用的液態(tài)推進(jìn)劑有5碳以內(nèi)的低給烷烴，例如丁烷和丙烷；最好是氟代或氟氯代烷烴。也可是上述物質(zhì)的混合物。制備噴霧劑時(shí)，在帶有合適的閥門的容器中裝入含有化合物細(xì)粉和表面活性劑的合適的推進(jìn)劑。組分被保持于較高壓力之下直至由閥門開啟而釋放。
含SLex類似物的藥用組合物可用于預(yù)防和/或治療。用于治療，病人已經(jīng)表現(xiàn)出前述病癥，組合物用量應(yīng)足以抑制選擇素表達(dá)細(xì)胞與嗜中性白細(xì)胞之間的粘附；即，治愈工至少部分阻止疾病癥狀及其發(fā)展。此用量稱為“治療有效劑量”或“細(xì)胞粘附抑制量”。此有效量取決于病癥的嚴(yán)重性和病人的體重等綜合情況，通常對(duì)一個(gè)70公斤的病人來說，每天用0.5mg—10,000mgSLex類似物，更常用的劑量是每天5mg—2,000mg。
用于預(yù)防時(shí)，含本研究的化合物的組合物被用于被懷疑或有可能患有某種疾病的病人。此時(shí)的用量稱為“預(yù)防有效劑量”，同樣足以抑制含SLex細(xì)胞與選擇素的粘附(連結(jié))。此時(shí)的準(zhǔn)確劑量仍取決于病人的健康狀況和體重，但對(duì)一個(gè)70公斤的病人來說，通常為每天0.5mg—5,000mg，更常用的是每70公斤體重5mg—2,000mg。
另一種估算本研究的SLex類似物的粘附抑制量的方法是將由類似物顯示的粘附抑制與由SLex本身產(chǎn)生的相比較。一種簡便的比較方法是，利用兩種物質(zhì)的IC50(抑制50％粘附所需的濃度)，將SLex的量作為所用的量的基礎(chǔ)，而SLex類似物的量則是該化合物的IC50的倍數(shù)。
通常，IC50值為SLex本身的該值的十分之一的化合物，當(dāng)其用量的摩爾數(shù)是SLex本身的10倍時(shí)，被認(rèn)為是有效的粘附抑制量。較好的是，該量約為SLex量的4倍。更好的是相等。最好的是，大多數(shù)在此描述的SLex類似物中，該量小于SLex的量，如SLex本身摩爾的二分之一至十分之一。
根據(jù)治療醫(yī)生所選的劑量和用藥方式，組合物的使用可以是單劑型或多劑型的。但無論如何，藥用配制劑必須能提供可有效治療病人的足量的SLex類似物。
這些化合物還可以用作診斷劑。例如，標(biāo)記過的化合物可用于被懷疑患有炎癥病人進(jìn)行炎癥和腫瘤轉(zhuǎn)移區(qū)域的定位。為此，化合物可用125I，14C，或氚標(biāo)記。實(shí)施例1N-芐基乳果糖(半乳糖基果糖)苷(化合物1)將一個(gè)500ml三頸圓底燒瓶浸在冰浴中，并加乳果糖(23.9mg，69.8mmol)和芐基胺(109ml，526mmol，7.5當(dāng)量)。然后將燒瓶加蓋，并用磁棒攪拌。令冰浴融化并使反應(yīng)緩慢升溫至常溫。幾小時(shí)內(nèi)固體物質(zhì)溶解，反應(yīng)液呈黃色?？捎靡?0∶50∶15CHCl3∶MeOH∶15mMCaCl2展開的薄層層析(TLC)監(jiān)控反應(yīng)進(jìn)展(乳果糖Rf＝0.45，產(chǎn)物Rf＝0.75，地衣酚可見)。
反應(yīng)十分緩慢，約在5—7天后反應(yīng)完全。判斷反應(yīng)完全后，從反應(yīng)中去除攪拌棒，在瓶的頂部裝上一個(gè)機(jī)械攪拌器，將裝置浸在冰浴中。然后向瓶中加入己烷(250ml)，劇烈攪拌混合物約60秒。然后停止攪拌使混合物明顯分成兩層(分層需15分鐘—1小時(shí))。此時(shí)，用吸管吸去上層己烷/芐胺。用己烷(每次250ml)重復(fù)抽提芐基胺2次以上，然后用250ml乙醚抽提3次以上(所有抽提均在冰上進(jìn)行)。
經(jīng)過這些抽提后，留下淺黃色的殘留物。將該物質(zhì)溶于乙醇(300ml)并轉(zhuǎn)入一個(gè)2L的單頸圓底燒瓶中。用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器將黃色溶液濃縮成稠漿。用一根磁棒在0℃快速攪拌試劑級(jí)丙酮(1000ml)，然后緩慢加入含乙醇的漿狀物。隨著稠漿的緩慢加入，開始形成乳白色沉淀。加完后，燒瓶加蓋，在-20℃冰箱中保存過夜(約18小時(shí))。從冰箱中取出后，燒瓶底可見一白色固體塊，上清液為透明的黃色。然后用傾析法去除溶液，高真空去除粗固體化合物1中的殘留丙酮。產(chǎn)物(化合物1)非常不穩(wěn)定，應(yīng)立即用于下一步反應(yīng)。實(shí)施例2乙酸N-芐基乳糖胺(化合物2)以上制得的粗產(chǎn)品(化合物1)(30.1gm，69.8mmol，理論值)溶于1000ml試劑級(jí)甲醇并在常溫下攪拌。然后加入冰醋酸(4ml，70mmol)，將燒瓶加蓋。常溫下攪拌該淺黃色反應(yīng)混合物，并以前述相同的溶液系統(tǒng)進(jìn)行TLC監(jiān)控。產(chǎn)物2出現(xiàn)在Rf＝0.65處(從反應(yīng)開始時(shí)即可用TCL測(cè)到殘留乳果糖，但其量隨反應(yīng)進(jìn)展無明顯增加)。當(dāng)由TCL看到化合物1幾乎完全用盡時(shí)(24—48小時(shí))，從反應(yīng)混合物中抽出100μL，在氬氣流下加以蒸發(fā)。將黃色殘?jiān)苡贑D3OD中，并再次蒸干成黃色殘留物。然后將該物質(zhì)溶于D2O中并作1H-NMR分析。
然后將粗化合物2的溶液用于以下的反應(yīng)。為了計(jì)算產(chǎn)率，從反應(yīng)混合物中取出較少的已知體積的一份樣品，濃縮至干，溶于H2O，調(diào)節(jié)至pH＞10，進(jìn)行反相硅膠快速層析，先用H2O然后用2∶1的H2O∶MeOH洗脫。從乳果糖至此產(chǎn)物的產(chǎn)率通常為50％—55％。1H-NMR(300MHz，δ(ppm)相對(duì)于HOD)7.44(m，5H)，5.49(d，J＝3Hz，1H)，5.05(d，J＝8Hz，1H)，4.39(d，J＝7Hz，1H)，4.38(d，J＝8Hz，2H)，4.35(d，J＝7Hz，1H)，4.10-3.5(m，11H)，3.24(dd，J＝3Hz，J＝10Hz，1H)，3.00(dd，J＝8Hz，J＝10Hz，1H)，2.87(s，3H)。實(shí)施例3乙酸乳糖胺(化合物3)在一個(gè)裝有得自前步反應(yīng)的粗化合物2的酸性甲醇溶液的2L燒瓶上裝一個(gè)三通活塞，并使用一個(gè)氬氣環(huán)和一條真空管道進(jìn)行氬氣/真空/清洗循環(huán)三次。打開燒瓶，加入10％披于碳上的鈀(7.4gm，6.98mmol)。然后重新裝上三通活塞，用氫氣進(jìn)行3次真空/清洗循環(huán)。然后使用一個(gè)氣環(huán)在氫氣環(huán)境下進(jìn)行反應(yīng)。
以TLC嚴(yán)密監(jiān)控反應(yīng)的進(jìn)行(產(chǎn)品Rf＝0.2)。當(dāng)起始物耗盡時(shí)，抽取100μL，放入微型離心管(eppendorf tube)中，在微離心機(jī)中離心，如上一反應(yīng)一樣取出上清液并制成NMR樣品。當(dāng)NMR顯示化合物2已完全消失時(shí)，用乙醇將漿料通過一個(gè)中等孔度的燒結(jié)玻璃漏斗上的硅藻土塞進(jìn)行過濾。在500ml圓底燒瓶中將澄清的黃色溶液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至140ml，即以此粗產(chǎn)品用于以下反應(yīng)中。
Compound 31H-NMR(300MHz，δ(ppm)相對(duì)于HOD)5.40(d，J＝3Hz，1H)，4.90(d，J＝8Hz，1H)，4.41(d，J＝8Hz，1H)，4.00-3.5(m，11H)，3.28(dd，J＝3Hz，J＝8Hz，1H)，2.98(dd，J＝7Hz，J＝8Hz，1H)。實(shí)施例42-脫氧-2-(2′-羧基)-苯甲酰氨基-4-O--β-D-吡喃半乳糖基-β-D-吡喃葡糖苷(化合物4)和1，3，6-三-O-乙?；?2-脫氧-2-苯二酰亞氨基-4-O-(2，3，4，6-四-O-乙?；?β-D-吡喃半乳糖基)-β-D-吡喃葡萄糖苷(化合物5)以14ml H2O稀釋粗化合物3的酸性甲醇溶液，依次以碳酸鈉(29.7gm，280mmol)和鄰苯二酸酐(20.7gm，140mmol)處理。必須留意反應(yīng)開始形成的泡沫。4小時(shí)后，反應(yīng)完全，用燒結(jié)玻璃漏斗過濾稀漿狀物以除去殘留的碳酸鈉和以鄰苯二酸鹽為基的物質(zhì)。依次進(jìn)行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)和高真空蒸發(fā)，將濾液濃縮成糊狀物，得到化合物4。為避免在下步用乙酸酐進(jìn)行乙?；姆磻?yīng)中發(fā)生副反應(yīng)，必須盡量去除所有殘留的微量甲醇和水，此點(diǎn)至為重要。
判定該物料已足夠干后，依次加入吡啶(212ml)和乙酸酐(106ml，1.12mol)。光用手振搖混合物促進(jìn)其溶解，一旦開始發(fā)熱升溫時(shí)，即會(huì)進(jìn)行溶解，然后用磁棒攪拌。攪拌過夜后(約18小時(shí))，以20∶1的CHCl3∶MeOH為展開劑的TCL顯示出一個(gè)與化合物5的可信樣品的斑點(diǎn)位重迭的一個(gè)UV顯色的主要斑點(diǎn)。將溶液冷卻至0℃，以32ml H2O處理，攪拌15分鐘以水解過量的乙酸酐。然后用二氯甲烷稀釋溶液至1000ml并用2N HCl(3×1000ml)，飽和NaCHO3(3×1000ml)和飽和NaCl(1×1000ml)洗滌。然后用MgSO4干燥有機(jī)溶液，過濾，并濃縮成粗產(chǎn)物。以CDCl3為溶劑，進(jìn)行1H-NMR測(cè)定，顯示為α-和β-異構(gòu)體的約1∶1的混合物。將粗產(chǎn)物溶于最低量的甲醇中(約30ml)并在幾分鐘內(nèi)使其結(jié)晶。常溫放置幾小時(shí)，過濾收集固體，以冰冷的甲醇淋洗。產(chǎn)物經(jīng)風(fēng)干后，收集純化合物5，為白粉末(5.6gm，10.4％)。
1H-NMR(300MHz，δ(ppm)相對(duì)于CHCl3)7.90-7.70(m，4H)，6.50(d，J＝8Hz，1H)，5.83(dd，J＝10.5Hz，J＝8Hz，1H)，5.36(d，J＝3.5Hz，1H)，5.15(dd，J＝8Hz，J＝10.5Hz，1H)，4.97(dd，J＝10Hz，J＝3.5Hz，1H)，4.56-3.83(m，9H)，2.20-1.90(7s，21H)。實(shí)施例51，3，6-三-O-乙酰基-2-脫氧-2-苯二酰五亞氨基-4-O-(2，3，4，6-四-O-乙酰基-β-D-吡喃半乳糖基)-β-D-吡喃葡糖苷的轉(zhuǎn)化成化合物5將上述化合物5的結(jié)晶操作中的含α-乙酸酯的母液濃縮成泡沫體后溶于二甲基甲酰胺(DMF)(110ml)中。在氬氣氛中于55℃攪拌溶液。然后加入乙酸_(9.5gm，104mmol)。15分鐘后，以20∶1的CH3Cl3∶MeOH展開的TLC顯示起始物已完全消失并出現(xiàn)一個(gè)Rf值略低的斑點(diǎn)。將反應(yīng)物冷卻至常溫并用乙酸乙酯稀釋至1000ml。然后用H2O(2×1000ml)和飽和NaCl(1×1000ml)洗滌溶液。用MgSO4干燥，過濾并濃縮。
將濃縮后的粗產(chǎn)物溶于50ml吡啶并用乙酸酐(25ml)處理。攪拌過夜(約18小時(shí))后，以20∶1的CHCl3∶MeOH為展開劑的TLC顯示一個(gè)與化合物5的可信樣品位置重疊的UV顯色的主要斑點(diǎn)。將溶液冷卻至0℃，加7.5ml H2O處理，攪拌15分鐘以水解過量乙酸酐。用二氯甲烷將溶液稀釋至250ml，并用2NHCl(3×250ml)，飽和NaHCO3(3×250ml)，飽和NaCl(1×250ml)洗滌。用MgSO4干燥此有機(jī)溶液然后過濾，濃縮成粗產(chǎn)物。再將粗產(chǎn)物溶于最小量的甲醇中，再次發(fā)生結(jié)晶。幾小時(shí)后，按前所述分離固體化合物5，得另一批白色粉末狀產(chǎn)物(4.4gm，8.3％)。兩批化合物5的總計(jì)產(chǎn)率為18.7％，10gm。實(shí)施例5A由乳果糖制備化合物5的另一種方法A.氨基乳果糖苷(化合物1A)將帶攪拌棒，乳果糖(17.1g，50mmol)，乙酸銨(3.85g，50mmol)的300ml不銹鋼高壓釜冷卻至-78℃，并加入80ml液氨。將高壓釜密封并邊攪拌邊溫?zé)嶂脸亍５竭_(dá)常溫后，將它放在油浴中加熱至35℃24小時(shí)。然后再冷卻至常溫，小心放空至大氣壓。氨氣全部驅(qū)除后，約需2小時(shí)，將整個(gè)高壓釜放在抽成真空的五氧化二磷干燥器中，注意保持高真空。真空下放置過夜后，釜內(nèi)物質(zhì)已成為淺黃色泡沫體。該化合物易潮解，所以迅速取出并置于密封缸中。即以此粗產(chǎn)物用于以下反應(yīng)中。
B.乙酸乳糖胺(化合物2A)將氨基乳果糖苷(化合物10)(3.41gm，10mmol)溶于100ml無水甲醇中并在氬氣氛中常溫?cái)嚢?。然后加入冰醋?572μl，10mmol)。24小時(shí)后，將黃色溶液濃縮成泡沫體，它顯示為1∶1的α和β異構(gòu)體的混合物，顯然，另有兩種產(chǎn)物，被認(rèn)為是吡喃半乳糖基甘露糖胺的α和β異構(gòu)體。該粗產(chǎn)物用于后繼反應(yīng)。
按照實(shí)施例4中的操作步驟，規(guī)模縮至1/7—1/10，利用以上步驟B中制得的粗產(chǎn)物，由化合物2A制備化合物5。用于形成鄰苯二酰胺半酸的溶劑中三分之來丙酮。以乳果糖為基，最后制得的全乙?；蕉啺?化合物5)的產(chǎn)率為3.8％，未探究第二批晶體。實(shí)施例61-氯-3，6-二-O-乙?；?2-脫氧-2-苯二酰亞胺基-4-O-(2，3，4，6-四-O-乙酰基-β-D-吡喃半乳糖基)-β-D-吡喃葡糖苷(化合物6)常溫下，氬氣氛中在43ml無水CH2Cl中攪拌異頭體乙酸酯。然后加入三氯化鋁固體(2.9gm，21.5mmol)。40分鐘后，將混合物沖洗入分液漏斗中，體積達(dá)400ml，CH2Cl2∶H2O為1∶1。振搖混合物，去除水相，用2×200ml的H2O和3×200ml的飽和NaHCO3溶液洗滌有機(jī)溶液。然后用MgSO4干燥此淺黃色溶液，過濾，并濃縮成淺黃色粉末(3.2gm，100％)。然后將此物質(zhì)用于實(shí)施例7的縮合反應(yīng)。實(shí)施例7乙基β-D吡喃半乳糖苷(化合物7)向加有碳酸銀(3.13kg，11.4mol)，4_分子篩(2.37kg)，二氯甲烷(16L)和無水乙醇(4.0L)的反應(yīng)器中以20—25ml/分鐘的速度加入2，3，4，6-四-O-乙?；肴樘腔?2.5kg)在二氯甲烷(4L)中的溶液。劇烈攪拌混合的反應(yīng)物。加完溴化物溶液后2小時(shí)，以己烷∶乙酸乙酯為1∶1的展開劑所作的硅膠TLC顯示無溴化物存在。此時(shí)，通過硅藻土墊(1kg)過濾反應(yīng)混合物，濾液在30—35℃真空蒸發(fā)成褐色油狀物(1.95kg)。將油狀物真空干燥17小時(shí)。
1H-NMR(CDCL3)δ5.36(1H，d，J3，4＝3.7Hz，H-4)，5.17(1H，dd，J2.3＝11.0Hz，H-2)，4.99(1H，dd，H-3)，4.46(1H，d，J1.2＝8.3Hz，H-1)，2.15，2.05，2.04，1.95(12H，4s，OAc)，1.21(3H，t，OCH2CH3)。
將粗的乙基四乙?；拎肴樘擒?1.95kg)溶于無水甲醇(11.7L)，并滴加25％的甲醇鈉甲醇溶液(90ml)。攪拌溶液1小時(shí)，此時(shí)以乙酸乙酯∶甲醇為2∶1的展開液所作的硅膠TLC顯示不再有起始物存在。產(chǎn)物的Rf＝0.6。加入離子交換樹脂(Amberlite IR—120CH+)(0.6kg)并攪拌以中和溶液。當(dāng)溶液pH為6—7小時(shí)，過濾去除樹脂，真空蒸發(fā)濾液，得淺黃色固體。將固體溶于沸騰的乙醇(11L)。讓溶液冷卻至25℃再將其冷至0℃，得白色沉淀。過濾后得乙基β-D-吡喃半乳糖苷，化合物7，(0.851kg)。1H-NMR(D2O)δ4.38(1H，d，J1.2＝8.0Hz，H-1)，3.89(1H，bd，J3.4＝3.7Hz，H-4)，1.2(3H，t，OCH2CH3)。實(shí)施例8乙基4，6-O-亞芐基-β-O-吡喃半乳糖苷(化合物8)將乙基β-D-吡喃半乳糖苷，化合物7，(0.851kg，4.09mol)與甲苯磺酸1.5g，7.9mmol)一起加入20L旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)燒瓶。將蒸發(fā)燒瓶固定于蒸發(fā)器上并吸入本甲醛縮二甲醇(1.23L，8.18mol)。將混合物轉(zhuǎn)動(dòng)4小時(shí)。加入縮醛后的30—40分鐘間，可得近乎全溶的溶液，然后很快出現(xiàn)大量沉淀。繼續(xù)轉(zhuǎn)動(dòng)4小時(shí)后加入三乙胺(1.5ml)中和反應(yīng)混合物。真空抽去溶劑后得一固體物質(zhì)。向燒瓶中加入己烷(6L)并轉(zhuǎn)動(dòng)0.5小時(shí)。過濾所得固體并用1∶1的己烷∶乙醚(2L)洗滌。真空干燥所得的白色固體17小時(shí)，得純的乙基4，6-O-亞芐基-β-D-吡喃半乳糖苷，化合物8，(1.0kg，3.38mol)，產(chǎn)率83％。
1H-NMR(CDCl3)δ7.53(2H，m，芳族化合物)，7.37(3H，m，芳族化合物)，5.57(1H，s，CHPh)，4.29(1H，d，J1.2＝7.0Hz，H-1)，4.21(1H，d，J3，4＝3.27Hz，H-4)，1.29(3H，t，OCH2CH3)。實(shí)施例9乙基-2-O-苯甲?；?4，6-O-亞芐基-β-D-吡喃半乳糖苷(化合物9)在備有冷卻槽且裝有空氣驅(qū)動(dòng)器，帶進(jìn)氣管的等壓加液漏斗，和出氣管的反應(yīng)器中加入乙基4，6-O-亞芐基-β-D-吡喃半乳糖苷，化合物8，(0.924kg，3.12mol)。在將燒瓶密封前，加入二氯甲烷(9.3L)和吡啶(2L)形成均勻溶液。在加液漏斗中加入60％氯乙酰氯的二氯甲烷溶液(0.388kg，3.43mol，273ml)。密閉燒瓶并開始低速通氮?dú)?。將冷卻槽冷卻至-65℃±5℃并攪拌反應(yīng)混合物30分鐘。此時(shí)，開始以3—4ml/分鐘的速度滴加酰氯溶液。此液滴加完畢后，將混合物再在-65℃±5℃維持1小時(shí)。然后以8—1 2ml/分鐘的速度向混合物中加苯甲酰氯(0.614kg，4.37mol，0.507L)。讓反應(yīng)物溫?zé)嶂潦覝夭⑷纹浞胖?7小時(shí)。從反應(yīng)混合物中濾除沉淀的鹽，真空濃縮濾液以去除極大部分的二氯甲烷。留出少量樣品作1H-NMR。
1H-NMR，(CDCl3)δ5.75(1H，dd，J2.3＝10.6Hz，H-2)，5.56(1H，s，CHPh)，5.25(1H，dd，J3.4＝3.44Hz，H-3)，4.69(1H，d，J1.2＝8.48Hz，H-1)，4.48(1H，bd，H-4)，1.15(3H，t，OCH2H3).
向濃縮物中加入水(180ml)，40℃攪拌此所得混合物2小時(shí)。然后，再濃縮混合物，得黃色殘留物，將其溶于二氯甲烷(11L)中并轉(zhuǎn)入50L抽提器。依次以冰冷的0.5NHCl水溶液(11L)，飽和碳酸氫鈉水溶液(11L)，冷水(11L)抽提有機(jī)溶液。用無水硫酸鈉(1.0kg)干燥有機(jī)層，過濾，蒸發(fā)濾液至得到黃色固體，并用高真空干燥。此反應(yīng)用1∶1的己烷∶乙酸乙酯為展開劑的硅膠TLC跟蹤。將該固體溶于熱的乙醇(9.5L)，經(jīng)冷卻和過濾后，得乙基-2-O-苯甲酰-4，6-O-亞芐基-β-D-吡喃半乳糖苷，化合物9，(0.737kg，1.85mol)，產(chǎn)率59％。1H-NMR(CDCl3)δ5.59(1H，s，CHPh)，5.36(1H，dd，J2.3＝10.07Hz，H-2)，4.64(1H，d，J1.2＝8.21Hz，H-1)，1.15(3H，t，OCH2CH3)。
為確證苯甲酸酯位于C-2位的C-3位帶游離羥基，在核磁共振樣品中加入一滴異氰酸三氯乙酰(Cl3CCONCO)并重新測(cè)譜。該譜圖含有在δ＝5.27處的一個(gè)半乳糖的典型的H-3低場(chǎng)dd峰，它在C-2被酯化。由此反應(yīng)混合物得到的原濾液中還含有一部分產(chǎn)物。實(shí)施例10乙基(β-D-吡喃半乳糖基)-(1-4)-O-(2-N-烯丙氧基羰基-2-脫氧-β-D-吡喃葡糖基)-(1-3)-O-β-D-吡喃半乳糖苷(化合物10)向冷卻至-25℃的乙基2-O-苯甲?；?4，6-O-亞芐基-β-D-吡喃半乳糖苷(化合物9)(0.76g，1.9mmol)，4_分子篩(2g)，二氯甲烷(10ml)可力丁(0.278ml，2.1mmol)和三氟甲磺酸銀的混合物中滴加4-O-(2，3，4，6-四-O-乙?；?β-D-吡喃半乳糖基)-3，4，6-三-O-乙?；?2-脫氧-2-苯二酰亞胺基-β-D-吡喃葡糖基氯(化合物6；1.484g，2mmol)溶于二氯甲烷(5ml)的溶液。氯化物加完后，攪拌混合物并溫?zé)嶂脸?。兩小時(shí)后，以二氯甲烷稀釋混合物并過濾。濾液依次以亞硫酸氫鈉水溶液，鹽酸水溶液，碳酸氫鈉水溶液，水洗滌。以無水硫酸鈉干燥有機(jī)層，過濾，蒸發(fā)，得固體物質(zhì)，將該固體在二氯甲烷/己烷中進(jìn)行重結(jié)晶。
以80％的乙酸水溶液(5ml)在80℃對(duì)所得的全保護(hù)住的三糖處理2小時(shí)，然后蒸去溶劑。將殘留物與甲苯/乙酸乙酯共蒸發(fā)兩次，得到溶于乙醇(10ml)的殘留物。加入水合肼(0.3ml)，將混合物回流17小時(shí)得到沉淀，過濾并干燥后得一固體(0.45g)。將該固體溶于5∶1的甲醇∶水，并以二碳酸二烯丙酯(0.166ml)處理1小時(shí)。蒸發(fā)混合物，使其在二氯甲烷與水之間進(jìn)行分配。分出水層并加以濃縮，殘留物為化合物10，其在用2∶1的乙酸∶丙酮研磨時(shí)會(huì)固化。
由此制得標(biāo)題所指的三糖(化合物10)，用酶可使之唾液酸化，轉(zhuǎn)化成乙基[(5-乙?；?3，5-二脫氧-α-D-甘油基-D-半乳糖-N-乙?；拎窠?jīng)氨酸)鈉]-(2-3)-O-(β-D-吡喃半乳糖)-(1-4)-O-(2-N-烯丙氧基羰基-2-脫氧-β-D-吡喃葡糖基)-(1-3)-O-β-D吡喃半乳糖苷(化合物11)，它與由以下反應(yīng)制得的產(chǎn)物相同。實(shí)施例11乙基[(5-乙酰氨基-3，5-二脫氧-α-D-甘油基-D-半乳糖N-乙?；拎窠?jīng)氨酸)鈉]-(2-3)-O-(β-D-吡喃半乳糖基)-(1-4)-O-(2-N-烯丙氧基羰基-2-脫氧-β-D-吡喃葡萄糖基)-(1-3)-O-β-D-吡喃半乳糖苷(化合物11)以下所述為利用半乳糖基轉(zhuǎn)移酶和唾液酸轉(zhuǎn)移酶將二糖(化合物9)酶法轉(zhuǎn)化為標(biāo)題化合物(化合物11)。
向水(12L)中加入N-[2-羥乙基]哌嗪-N′-[2-乙磺酸](0.410kg)，將溶液的pH調(diào)至7.5。加入牛清白蛋白(17g)，攪拌混合物直至完全溶解。加入乙基3-O-(2-N-烯丙氧基羰基-2-氨基-2-脫氧-β-D-吡喃葡萄糖基)-β-D-吡喃半乳糖苷(化合物9)(0.3kg)，葡糖-1-磷酸酯(0.271kg)，磷酸烯酸醇丙酮酸(0.177kg)，氯化鉀(0.087kg)，疊氮化鈉(8.4g)，和尿苷-5′-二磷酸(8.76g)，攪拌至全溶。然后加入氯化錳(1M 506ml)和氯化鎂(1M，168ml)。然后加入丙酮酸激酶(42,000U)，尿苷-5′-二磷酸-葡糖焦磷酸化酶(2,000U)，無機(jī)焦磷酸酶(8,400U)，尿苷-5′-二磷酸-半乳糖差向異構(gòu)酶(91,000U)和尿苷-5′-二磷酸-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶(8.850U)。用水將反應(yīng)混合物的最后體積調(diào)節(jié)至17L。48小時(shí)后加入氯化鎂(1M，340ml)。用4∶1的異丙醇∶1M的乙酸銨作展開劑，用硅膠TLC跟蹤反應(yīng)的進(jìn)行。8—9天后，TLC顯示反應(yīng)完成95％以上，此時(shí)配制以下溶液。
將N-[2-羥乙基]哌嗪-N′-[2-乙磺酸](0.528kg)熔于水(15L)中，將該溶液的pH調(diào)至7.5。加入牛血清白蛋白(22g)，疊氮化鈉(11.5g)，唾液酸(0.242kg)，磷酸烯醇丙酮酸(0.395kg)，5′-單磷酸胞苷(25g)，5′-三磷酸腺苷(4.7g)，氯化錳(1M，780ml)。向此溶液中加入丙酮酸激酶(207,000U)，肌激酶(125,000U)，胞苷-5′-單磷酸-N-乙?；窠?jīng)氨酸合成酶(3245U)，無機(jī)磷酸酶(9400U)，和α-2，3-唾液酸基轉(zhuǎn)移酶(1640U)。將此溶液的體積調(diào)節(jié)至22L后，將溶液加入半乳糖基轉(zhuǎn)移酶反應(yīng)中。以4∶1的異丙醇∶1M乙酸銨作展開劑，用硅膠TLC監(jiān)控反應(yīng)。10—12天后，TLC顯示反應(yīng)進(jìn)行至已得到95％的標(biāo)題化合物，即化合物11。實(shí)施例12乙基[(5-乙酰氨基-3，5-二脫氧-4，7，8，9-四-O-乙?；?α-D-甘油基-D-半乳糖基-N-乙酰基吡喃神經(jīng)氨酸)甲酯]-(2-3)-O-(2，4，6-三-O-乙酰基-β-D-吡喃半乳糖基)-(1-4)-O-(3，6-二-O-乙酰基-2-N-烯丙氧基羰基-2-脫氧-β-D-吡喃葡糖基)-(1-3)-O-2，4，6-三-O-己酰基-β-D-吡喃半乳糖苷(化合物1 2)用濾紙過濾化合物1l的溶液(40L)。在一個(gè)50L的旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中將濾液蒸發(fā)成粘稠物。將粘稠物與吡啶(2×2L)共蒸發(fā)兩次，然后在真空下放置20小時(shí)。在蒸發(fā)燒瓶中加入N，N-二甲基氨基吡啶(20g)在吡啶(12L)中的溶液。在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器的水浴中加入冰-水混合物，在1小時(shí)中加旋轉(zhuǎn)邊加入乙酸酐(6L)。加完后2小時(shí)，再加入2L乙酸酐，并將形成的混合物在室溫下緩慢轉(zhuǎn)動(dòng)20小時(shí)。為確保競(jìng)爭(zhēng)乙酰化，再加入1L乙酸酐并且再轉(zhuǎn)動(dòng)24小時(shí)。用TLC檢測(cè)反應(yīng)(乙酸乙酯∶己烷∶乙醇為10∶10∶3)。
反應(yīng)完成后即抽真空并收集14L餾份。在生成的殘留物中，用1小時(shí)的時(shí)間加入甲醇(15L)然后在室溫下將混合物轉(zhuǎn)動(dòng)20小時(shí)。此時(shí)，硅膠TLC(乙酸乙酯∶己烷∶乙醇為10∶10∶3和二氯甲烷∶丙酮為3∶2)顯示內(nèi)酯已完全轉(zhuǎn)化為代表甲基酯單羥基化合物的移動(dòng)較慢的斑點(diǎn)。然后將混合物濃縮(蒸去18L溶劑)并在冰水冷卻下的同時(shí)用30分鐘的時(shí)間加入3L乙酸酐。將混合物放置20小時(shí)。硅膠TLC(二氯甲烷∶丙酮為3∶2)以移動(dòng)略快的產(chǎn)物顯示乙?；淹瓿伞?br> 加入甲醇(1L)以破壞過量乙酸酐，此時(shí)可察覺到伴有輕微放熱。1小時(shí)后，將混合物濃縮成粘稠物，借助于乙酸乙酯-水混合物(13/13L)將其轉(zhuǎn)入50L抽提器中。劇烈攪拌混合物。分層后，放出底部的水相層，用濾紙過濾留下的有機(jī)相。洗滌，先用5％的鹽酸水溶液(15L，洗后的水層應(yīng)對(duì)pH試紙仍顯強(qiáng)酸性)，再用1M碳酸氫鈉水溶液(15L，用pH試紙測(cè)洗后的水層，應(yīng)仍顯堿性)。然后將有機(jī)相轉(zhuǎn)入20L的容器中，用無水硫酸鈉干燥后過濾。
將濾液濃縮成半固體，再將此殘留物溶于二氯甲烷(3L)，然后施加于硅膠柱(10kg)，該柱用二氯甲烷裝柱。先用二氯甲烷(25L)洗脫，再用3∶1的二氯甲烷∶丙酮(25L)，最后用1∶1的二氯甲烷∶丙酮(50L)洗脫，得到含有產(chǎn)物的流出流。可以做到與二糖物質(zhì)有基線分離，但幾乎無法與微量的移動(dòng)略快的物質(zhì)分開。將含產(chǎn)物的流出液蒸發(fā)，然后重溶于二氯甲烷(1.5L)。將該溶液緩慢加入被劇烈攪拌的乙醚(7.5L)和己烷(10L)的混合物中。過濾由此生成的沉淀，用2∶1的乙醚∶己烷洗滌，風(fēng)干過夜，高度真空干燥48小時(shí)。該沉淀由1H-NMR表明為標(biāo)題化合物12，并含少量殘留溶劑(重量百分比1—5％)。1H-NMR(CDCl3)δ4.67(d，1H，H—1″)，4.49(d，1H，H—1′)，4.33(d，1H，H—1)。實(shí)施例13乙基[(5-乙酰氨基-3，5-二脫氧-4，7，8，9-四-O-乙?；?α-D-甘油基-D-半乳糖-2-N-乙?；拎窠?jīng)氨酸甲酯]-(2，3)-O-(2，4，6-三-O-乙?；?β-D-吡喃半乳糖基)-(1，4)-O-(2-氨基-2-脫氧-3，6-二-O-乙?；?β-D-吡喃葡糖基)-(1，3)-O-2，4，6-三-O-乙酰基-β-D-吡喃半乳糖苷(化合物13)常溫下，在氬氣氛下攪拌化合物12(5.10gm，3.80mmol)的無水四氫呋喃溶液，向其中加入聚甲基氫硅氧烷(420μl)。用氬氣對(duì)溶液進(jìn)行抽真空/清洗循環(huán)三次，使溶液脫氣。在燒瓶外包以鋁箔避光，并用四三苯膦合鈀[Pd(PPh3)3；158mg，O.14mmol]處理溶液。室溫?cái)嚢?8小時(shí)后，以10∶1有CHCl3∶MeOH展開劑的TLC顯示化合物12已全部耗盡同時(shí)有Rf較低的產(chǎn)物生成。用600ml乙酸乙酯(EtoAC)稀釋反應(yīng)混合物，并用1×200ml水和1×200ml飽和氯化鈉溶液洗滌。將該有機(jī)溶液干燥(MgSO4)，過濾，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，在65mm×10″的硅膠柱上作快速層析，以3∶1的EtoAC丙酮為洗脫液。收集含產(chǎn)物的流出液(由TLC判斷)并濃縮，得褐色固體，即化合物13(4.42gm，87％)。
1H-NMR(300MHz，δ(ppm)相對(duì)于CHCl3)5.50(m，1H)，5.44(dd，J＝6Hz，J＝2Hz，1H)，5.35-5.01(m)，4.89(m，2H)，4.63(d，J＝6Hz，1H)，4.59-4.35(m)，4.22-3.38(m)，3.81(s，3H)，2.69(m，1H)，2.57(dd，J＝3Hz，J＝10Hz，1H)，2.27-1.85(12s，36H)，1.77(dd，J＝10Hz，J＝10Hz，1H)，1.21(t，J＝5Hz，3H)。實(shí)施例14乙基[(5-乙酰氨基-3，5-二脫氧-4，7，8，9-四-O-乙酰基-α-D-甘油基-D-半乳糖-2-N-乙?；拎窠?jīng)氨酸甲酯]-(2，3)-O-(2，4，6-三-O-乙?；?β-D-吡喃半乳糖基)-(1，4)-O-(2-氨基-2-脫氧-6-O-乙?；?β-D-吡喃葡糖基)-(1，3)-O-2，4，6-三-O-乙?；?β-D-吡喃半乳糖苷(化合物14)在加蓋的燒瓶中，室溫下攪拌化合物13(4.42gm，3.29mmol)在366ml4∶1的MeOH∶H2O中形成的溶液，加入冰醋酸(188μl，3.29mmol)。將淺黃色溶液加熱至50℃。48小時(shí)后l0∶1的CHCl3∶MeOH的TLC顯示化合物13已基本消失，并出現(xiàn)一個(gè)Rf較高的主產(chǎn)物。將反應(yīng)物冷卻至室溫，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)成油狀物，在65mm×10″的硅膠柱上作快速層析，以10∶10∶4的EtoAC∶己烷∶MeOH為洗脫液。收集含產(chǎn)物的流出液(由TLC判斷)并濃縮成泡沫體，即化合物14(2.78gm，65％)。
1H-NMR(300MHz，δ(ppm)相對(duì)于CHCl3)5.50(m，1H)，5.40(d，J＝2Hz，1H)，5.25(d，J＝7Hz，1H)，5.17(dd，J＝6Hz，J＝7Hz，1H)，5.04(dd，J＝6Hz，J＝7Hz，1H)，4.89(d，J＝3Hz，1H)，4.63(d，J＝6Hz，1H)，4.59(dd，J＝3Hz，J＝7Hz，1H)，4.42-3.40(m)，3.81(s，3H)，2.69(m，1H)，2.57(dd，J＝3Hz，J＝10Hz，1H)，2.27-1.85(12s，36H)，1.77(dd，J＝10Hz，J＝10Hz，1H)，1.21(t，J＝5Hz，3H).實(shí)施例15乙基[(5-乙酰氨基-3，5-二脫氧-4，7，8，9-四-O-乙酰基-α-D-甘油基-D-半乳糖-2-N-乙?；拎窠?jīng)氨酸甲酯]-(2，3)-O-(2，4，6-三-O-乙?；?β-D-吡喃半乳糖基)-(1，4)-O-(2-苯甲酰氨基-2-脫氧-6-二-O-乙酰基-β-D-吡喃葡糖基)-(1，3)-O-2，4，6-三-O-乙?；?β-D-吡喃半乳糖苷(化合物15)氬氣氛下，于室溫下攪拌化合物14(150mg，0.12mmol)在2ml二氯甲烷中形成的溶液，同時(shí)加入無水NaHCO3(40mg，0.48mmol)和苯甲酰氯(34mg，0.24mmol，28μl)。攪拌24小時(shí)后，以80∶20的EtOAC丙酮作展開劑的TLC顯示起始物已完全耗盡同時(shí)有Rf略高的物質(zhì)生成。以150ml乙酸乙酯稀釋反應(yīng)混合物并用1×50mlH2O洗滌。將有機(jī)溶液干燥(MgSO4)，過濾，濃縮，并進(jìn)行快速硅膠柱層析，以90∶10的EtOAC∶丙酮為洗脫液。收集含產(chǎn)物的流出液(由TLC判斷)，依次以旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)和高真空濃縮，得乳白色蠟狀固體，即化合物15(140mg，83％)。
1H-NMR(300MHz，δ(ppm)相對(duì)于CHCl3)7.75(d，J＝7Hz，2H)，7.45(d，J＝7Hz，1H)，7.39(dd，J＝7Hz，J＝7Hz，2H)，6.45(d，J＝5Hz，1H)，5.50(m，1H)，5.40(d，J＝2Hz，1H)，5.37(d，J＝2Hz，1H)，5.27(m，1H)，5.09(m，1H)，4.82(d，J＝3Hz，1H)，4.63(d，J＝6Hz，1H)，4.59(dd，J＝3Hz，J＝7Hz，1H)，4.39-3.40(m)，3.81(s，3H)，3.19(m，1H)，2.57(dd，J＝3Hz，J＝10Hz，1H)，2.27-1.85(12s，36H)，1.77(dd，J＝10Hz，J＝10Hz，1H)，1.15(t，J＝5Hz，3H)。實(shí)施例16乙基[(5-乙酰氨基-3，5-二脫氧-4，7，8，9-四-O-乙酰基-α-D-甘油基-D-半乳糖基-2-N-乙?；拎窠?jīng)氨酸甲酯]-(2，3)-O-(2，4，6-三-O-乙酰基-β-D-吡喃半乳糖基)-(1，4)-O-[(2，3，4-三-O-芐基-α-L-巖藻糖基)-(1，3)]-O-(2-苯甲酰氨基-2-脫氧-3，6-二-O-乙?；?β-D-吡喃葡糖基)-(1，3)-O-2，4，6-三-O-乙酰基-β-D-吡喃半乳糖苷(化合物16)氬氣氛下，在室溫下攪拌化合物15(140mg，0.1mmol)在1ml二氯甲烷中形成的溶液，同時(shí)加入粉狀的，火焰灼燒干燥過的4_分子篩(100mg)，四甲基尿(120μl，1mmol)，和三-O-芐基巖藻糖基氟(218mg，0.5mmol)。室溫?cái)嚢?小時(shí)后，將反應(yīng)物冷卻至-20℃并用SnCl2(95mg，0.5mmol)和AgClO4(126mg，0.5mmol)處理。然后將其緩慢溫?zé)嶂潦覝?。攪?4小時(shí)后，以10∶1的CHCl3∶MeOH為展開劑的TLC顯示起始反應(yīng)物基本耗盡，同時(shí)有Rf略低的產(chǎn)物生成。
用50ml二氯甲烷將反應(yīng)混合物從硅藻土塞上濾過，用2×50mlH2O洗滌濾液。將有機(jī)溶液干燥(MgSO4)，過濾，濃縮，產(chǎn)在20mm×6″硅膠柱中快速層析，以10∶10∶3的EtOAC∶己烷∶MeOH為洗脫液。收集含產(chǎn)物的流出液(由TLC判斷)，依次用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)和高真空將其濃縮成白色膜狀物，即化合物16(140mg，77％)1H-NMR(300MHz，δ(ppm)相對(duì)于CHCl3)7.46(d，J＝7Hz，2H)，7.35-7.12(m，18H)，6.45(d，J＝6Hz，1H)，3.82(s，3H)，3.20(m，1H)，2.55(dd，J＝4Hz，J＝12Hz，1H)，1.18(d，J＝6Hz，3H)，1.10(t，J＝6Hz，3H)。實(shí)施例17乙基(5-乙酰氨基-3，5-二脫氧-α-D-甘油基-D-半乳糖基-2-N-乙?；拎窠?jīng)氨酸根]-(2，3)-O-(β-D-吡喃半乳糖基)-(1，4)-O-[(α-L-吡喃巖藻糖基)-(1，3)]-O-(2-苯甲酰氨基-2-脫氧-β-D-吡喃葡糖基)-(1，3)-O-β-D-吡喃半乳糖苷(化合物17)攪拌化合物16(140mg，77mmol)在4ml甲醇中形成的溶液，同時(shí)加入吸附于碳上的氫氧化鈀(140mg，鈀重百分比20％)。利用氫氣對(duì)漿狀物進(jìn)行三次真空/吹洗循環(huán)，然后室溫下放置在一個(gè)大氣壓的氫氣中。1小時(shí)后，以5∶1的EtOAC∶MeOH作展開劑的TLC顯示化合物16已耗盡，并有一Rf較低的產(chǎn)物生成。用50ml甲醇將漿液從硅藻土塞上濾過，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濾液成為油狀物。
將此油狀物溶于5ml4∶1的MeOH∶H2O中，在加蓋的燒瓶中室溫下加以攪拌。向攪拌下的溶液中加入甲醇鈉粉末(140mg，2.6mmol)。16小時(shí)后，以60∶50∶15的CHCl3∶MeOH∶15mMCaCl2作展開劑的TLC顯示起始物質(zhì)已耗盡，有一Rf略低的產(chǎn)物生成。
用1g Dowex 50×8-400陽離子交換樹脂(氫型，剛用甲醇洗滌過)處理混合物并攪拌1分鐘。用熔結(jié)玻璃漏斗過濾混合物，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮濾液至成為一油狀物。在40mm×8″的Bio—Rad Bio—GelP2凝膠過濾介質(zhì)(篩目尺寸細(xì)目)柱上層析該物質(zhì)，以0.1M的碳酸氫鈉為洗脫液。收集含產(chǎn)物的流出液(由TLC判斷)，將其冷凍干燥成白色粉末，即化合物17(60mg，72％)。
1H-NMR(300MHz，δ(ppm)相對(duì)于HOD)7.70(d，J＝7Hz，2H)，7.55(d，J＝7Hz，1H)，7.47(dd，J＝7Hz，J＝7Hz，2H)，5.08(d，J＝4Hz，1H)，4.50(d，J＝8Hz，1H)，4.27(d，J＝8Hz，1H)，4.10(d，J＝3Hz，1H)，4.05-3.40(m)，2.70(dd，J＝4.6Hz，J＝12.4Hz，1H)，1.97(s，3H)，1.74(dd，J＝12.4Hz，J＝12.4Hz，1H)，1.10(t，J＝7Hz，3H)，1.07(d，J＝7Hz，3H)。實(shí)施例18乙基[(5-乙酰氨基-3，5-二脫氧-4，7，8，9-四-O-乙?；?α-D-甘油基-D-半乳糖基-2-N-乙?；拎窠?jīng)氨酸)甲酯-(2，3)-O-(2，4，6-三-O-乙?；?β-D-吡喃半乳糖基)-(1，4)-O-[(α-L-吡喃巖藻糖基)-(1，3)]-O-(2-2′-萘甲酰氨基-2-脫氧-3，6-二-O-乙?；?β-D-吡喃葡糖基)-(1，3)-O-2，4，6-三-O-乙酰基-β-D-吡喃半乳糖苷(化合物29)攪拌化合物25(制備方法與化合物16相似；90mg，48μmol)在5ml甲醇中形成的溶液，同時(shí)加入吸附于炭上的氫氧化鈀(40mg，鈀百分重量40％)。用氫氣對(duì)漿液進(jìn)行三次真空/吹洗循環(huán)，并在一個(gè)大氣壓的氫氣中室溫放置。24小時(shí)后，以90∶10的CH2Cl2∶MeOH作展開劑TLC顯示化合物25完全耗盡，并有一個(gè)Rf較低的產(chǎn)物生成。用50ml甲醇將漿液從硅藻土塞上濾過，并旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮成乳白色蠟狀固體。將產(chǎn)物在硅膠柱上作快速層析。以90∶10的CH2Cl2∶MeOH為洗脫液。收集含產(chǎn)物的流出液(由TLC判斷)，并濃縮至得到白色蠟狀固體，即化合物29(55mg，72％)1H-NMR(300MHz，δ(ppm)相對(duì)于CHCl3)8.39(s，1H)，7.94(d，J＝7Hz，1H)，7.82(m，2H)，7.57(m，2H)，7.37(m，1H)，5.57-5.41(m，3H)，5.22(d，J＝7Hz，1H)，5.15(m，1H)，4.97-4.39(m)，4.35(d，J＝4Hz，2H)，4.19-3.42(m)，3.81(s，3H)，3.23(m，1H)，2.75(bs，1H)，2.57(dd，J＝3Hz，J＝10Hz，1H)，2.27-1.85(12s，36H)，1.77(dd，J＝10Hz，J＝10Hz，1H)，1.23(d，J＝5Hz，3H)，1.05(t，J＝5Hz，3H)。
以下制備步驟與以上所述基本相同，并參見流程3，將化合物14轉(zhuǎn)化成化合物15，16，17。還制得化合物18—38。以下的表1，2，3，列出的是相當(dāng)于化合物15，16或17的一群化合物的概括性結(jié)構(gòu)，并列出每個(gè)這類化合物的其它相關(guān)數(shù)據(jù)。表1所示為用于制備R1基團(tuán)的乙?；瘎１?—3附有其中幾個(gè)化合物和抑制制劑化合物30—38的NMR和包括最終一步產(chǎn)率在內(nèi)的其它數(shù)據(jù)。
表1 R1基團(tuán)化合物#乙?；瘎┊a(chǎn)率 R1(溶劑)148mg，87％ 0.4(90∶10EtOAc∶丙酮)136mg，78％ 0.43(90∶10EtOAc∶丙酮)133mg，78％ 0.40(90∶10EtOAc∶丙酮) 143mg，82％ 0.45(90∶10EtOAc∶丙酮)
表2 化合物#糖基受體產(chǎn)率 R1(溶劑)22 18 135mg，74％ 0.35(92∶8EtOAc∶丙酮)23 19 100mg，58％ 0.39(92∶8EtOAc∶丙酮)24 20 105mg，65％ 0.37(92∶8EtOAc∶丙酮)25 21 100mg，58％ 0.37(92∶8EtOAc∶丙酮)
表3 化合物#芐基化的五糖產(chǎn)率 R1(溶劑)262262mg，60％0.32(90∶10CH2Cl2∶MeOH)272335mg，50％0.39(90∶10CH2Cl2∶MeOH)282473mg，65％0.31(90∶10CH2Cl2∶MeOH)實(shí)施例19乙基[(5-乙酰氨基-3，5-二脫氧-4，7，8，9-四-O-乙?；?α-D-甘油基-D-半乳糖基-2-N-乙?；拎窠?jīng)氨酸)甲酯]-(2，3)-O-(2，4，6-三-O-乙?；?β-D-吡喃半乳糖基)-(1，4)-O-[(2-芐氧基羰基氨基-2-脫氧-6-O-乙?；?β-D-吡喃葡糖基)-(1，3)-O-2，4，6-三-O-乙酰基-β-D-吡喃半乳糖苷(化合物39)將芐氧基羰基氯(CBZ-Cl)(2.1ml，8.4mmol)在CH2Cl2(2.0ml)中形成的溶液滴加入化合物14a(10.8g，8.3mmol)和NaHCO3(1.4g，16.6mmol)在CH2Cl2(100ml)中形成的混合物中，將此反應(yīng)物攪拌過夜(約18小時(shí))。向該混合物中加入NaHCO3(1.4g，16.6mmol)和CBZ-Cl(1.2ml，8.4mmol)，將形成的混合物再攪拌4小時(shí)。用AcOEt稀釋形成的混合物，用H2O洗滌，MgSO4干燥，過濾，濃縮。殘留物作硅膠層析，得白色固體化合物39(7.75g，產(chǎn)率65％)。實(shí)施例20乙基[(5-乙酰氨基-3，5-二脫氧-4，7，8，9-四-O-乙?；?α-D-甘油基-D-半乳糖-2-N-乙酰基吡喃神經(jīng)氨酸甲酯]-(2，3)-O-(2，4，6-三-O-乙?；?β-D-吡喃半乳糖基)-(1，4)-O-[(2，3，4-三-O-芐基-α-L-巖藻糖基)-(1，3)]-O-(2-芐氧基羰基氨基-2-脫氧-6-O-乙?；?β-D-吡喃葡糖基)-(1，3)-O-2，4，6-三-O-乙?；?β-D-吡喃半乳糖苷(化合物40)攪拌化合物39(3.90g，2.72mmol)在100mlClCH2CH2Cl中形成的溶液，同時(shí)加入粉末狀分子篩(MS4A)(12g)，四甲基尿(THU)(3.25ml，27.2mmol)和2，3，4-三-O-芐基-L-巖藻糖基氟(CMH-048，5.94g，13.6mmol)。室溫?cái)嚢?0分鐘后，將混合物避光保存，冷卻至-20℃，并用SnCl2(2.59g，13.6mmol)和AgClO4(98％，2.88g，13.6mmol)處理。用90分鐘的時(shí)間使混合物溫?zé)嶂潦覝?，攪?4小時(shí)。為使反應(yīng)完全，再在0℃加入TMU(1.95ml，16.3mmol)，CMH-048(3.56g，8.16mmol)，SnCl2(1.55g，8.17mmol)和AgClO4(1.73g，8.17mmol)，然后再讓其緩慢溫?zé)嶂潦覝亍?8小時(shí)后，將形成的混合物從硅藻土墊塞中濾過，用H2O洗滌濾液。用MgSO4干燥有機(jī)相，過濾，濃縮，硅膠層析(己烷/AcOEt/MeOH＝10/10/2)，得混合物40(3.65g，產(chǎn)率73％)并回收起始物39(672mg，得率17％)。實(shí)施例21乙基[(5-乙酰氨基-3，5-二脫氧-4，7，8，9-四-O-乙?；?α-D-甘油基-D-半乳糖基-2-N-乙?；拎窠?jīng)氨酸甲酯]-(2，3)-O-(2，4，6-三-O-乙酰基-β-D-吡喃半乳糖基)-(1，4)-O-[(α-L-吡喃巖藻糖基)-(1，3)]-O-(2-氨基-2-脫氧-3，6-二-O-乙?；?β-D-吡喃葡糖基)-(1，3)-O-2，4，6-三-O-乙?；?β-D-吡喃半乳糖苷(化合物41)將由化合物40(3.06g，1.66mmol)，HCOONH4(1.05g，16.6mmol)和10％Pd-C(濕，3.0g)乙醇(EtOH)(80ml)中形成的混合物攪拌回流9.5小時(shí)。向此混合物中再加入HCOONH4(1.05g，16.6mmol)和10％Pd-C(3.0g)，再將反應(yīng)混合物回流11小時(shí)。將生成的混合物從硅藻土墊塞中濾過，濃縮濾液，得白色固體化合物41(2.30g，96％)。實(shí)施例22
乙基[(5-乙酰氨基-3，5-二脫氧-4，7，8，9-四-O-乙?；?α-D-甘油基-D-半乳糖基-2-N-乙酰基吡喃神經(jīng)氨酸)甲酯]-(2，3)-O-(2，4，6-三-O-乙酰基-β-D-吡喃半乳糖基)-(1，4)-O-[(α-L-吡喃巖藻糖基)-(1，3)]-O-[2-(3，5-二氯苯甲酰氨基-2-脫氧-3，6-二-O-乙?；?β-D-吡喃葡糖基]-(1，3)-O-2，4，6-三-O-乙?；?β-D-吡喃半乳糖苷(化合物42)攪拌化合物41(40mg，0.028mmol)在CH2Cl2(8.9ml)中形成的溶液，加入NaHCO3(46mg，0.54mmol)和3，5-二氯苯甲酰氯(58.6mg，0.28mmol)。室溫下12小時(shí)后，用EtOAC稀釋反應(yīng)物并用H2O洗滌。用MgSO4干燥有機(jī)相，過濾，蒸發(fā)溶劑，得淺黃色油狀粗產(chǎn)物化合物42(98.4mg)。實(shí)施例23乙基[(5-乙酰氨基-3，5-二脫氧-4，7，8，9-四-O-乙?；?α-D-甘油基-D-半乳糖基-2-N-乙?；拎窠?jīng)氨酸)甲酯]-(2，3)-O-(2，4，6-三-O-乙?；?β-D-吡喃半乳糖基)-(1，4)-O-[(α-L-吡喃巖藻糖基)-(1，3)]-O-[2-(3，5-二氯苯甲酰氨基-2-脫氧-3，6-二-O-乙?；?β-D-吡喃葡糖基]-(1，3)-O-2，4，6-三-O-乙酰基-β-D-吡喃半乳糖苷(化合物43)攪拌粗化合物42(98.4mg)在甲醇(MeOH)(8.9ml)中形成的溶液，同時(shí)加入28％甲醇鈉(NaOMe)-MeOH(300μl)。室溫下48小時(shí)后用DOWEX 50W-X8(H+型)中和混合物并過濾。濃縮濾液，以EtOAC稀釋，用H2O抽提。蒸發(fā)水相，得相應(yīng)的酯。在H2O(5.0ml)中以1N-NaOH(200μL)處理該酯。將混合物在室溫?cái)嚢?2小時(shí)，用DOWEX 50W-X8(H+型)中和過濾。濃縮濾液，以凝膠(P-2)過濾純化(H2O作洗脫液)，然后凍干成白色粉狀化合物43(31.6mg，定量產(chǎn)率)。
1H-NMR(270MHz，δ(ppm)相對(duì)于H2O)7.61(s，3H)，5.00(d，J＝3.96Hz，1H)，4.47(d，J＝7.59Hz，1H)，4.26(d，J＝7.92Hz，1H)，4.09(d，J＝2.97Hz，1H)，4.04-3.30(m)，2.67(m，1H)，1.94(s，3H)，1.72(t，J＝11.88Hz，1H)，1.09(m，6H)。
化合物l8—28的NMR數(shù)據(jù)乙基[(5-乙酰氨基-3，5-二脫氧-4，7，8，9-四-O-乙?；?α-D-甘油基-D-半乳糖基-2-N-乙?；拎窠?jīng)氨酸)甲酯]-(2，3)-O-(2，4，6-三-O-乙酰基-β-D-吡喃半乳糖基)-(1，4)-O-(α-對(duì)氟苯甲酰氨基-2-脫氧-6-O-乙?；?β-D-吡喃葡糖基]-(1，3)-O-2，4，6-三-O-乙?；?β-D-吡喃半乳糖苷(化合物18)1H-NMR(300MHz，δ(ppm)相對(duì)于 CHCl3)7.79(m，2H)，7.15(m，2H)，6.41(d，J＝5Hz，1H)，5.53(m，1H)，5.42(m，1H)，5.23(d，J＝7Hz，1H)，5.17(m，2H)，4.8 9(d，J＝3Hz，1H)，4.63(d，J＝6Hz，1H)，4.59(dd，J＝3Hz，J＝7Hz，1H)，4.4 2-3.40(m)，3.81(s，3H)，3.19(m，1H)，2.57(dd，J＝3Hz，J＝10Hz，1H)，2.27-1.85(12s，36H)，1.77(dd，J＝10Hz，J＝10Hz，1H)，1.15(t，J＝5Hz，3H)
乙基[(5-乙酰氨基-3，5-二脫氧-4，7，8，9-四-O-乙?；?α-D-甘油基-D-半乳糖基-2-N-乙酰基吡喃神經(jīng)氨酸)甲酯]-(2，3)-O-(2，4，6-三-O-乙?；?β-D-吡喃半乳糖基)-(1，4)-O-(α-對(duì)硝基苯甲酰氨基-2-脫氧-6-O-乙酰基-β-D-吡喃葡糖基)-(1，3)-O-2，4，6-三-O-乙?；?β-D-吡喃半乳糖苷(化合物19)1H-NMR(300MHz，δ(ppm)相對(duì)于CHCl3)8.22(d，J＝8Hz，2H)，7.95(d，J＝8Hz，2H)，6.81(d，J＝5Hz，1H)，5.59-5.37(m，2H)，5.21(d，J＝4Hz，1H)，5.11(m，2H)，4.89(d，J＝2Hz，1H)，4.63(d，J＝5Hz，1H)，4.59(dd，J＝1Hz，J＝7Hz，1H)，4.42-3.40(m)，3.79(s，3H)，3.19(m，1H)，2.57(dd，J＝3Hz，J＝10Hz，1H)，2.27-1.85(12s，36H)，1.77(dd，J＝10Hz，J＝10Hz，1H)，1.15(t，J＝5Hz，3H)。
乙基[(5-乙酰氨基-3，5-二脫氧-4，7，8，9-四-O-乙?；?α-D-甘油基-D-半乳糖-2-N-乙酰基吡喃神經(jīng)氨酸)甲酯]-(2，3)-O-(2，4，6-三-O-乙?；?β-D-吡喃半乳糖基)-(1，4)-O-[2-(E-1-氧代-3-苯基丙-2-烯基)氨基-2-脫氧-6-O-乙?；?β-D-吡喃葡糖基]-(1，3)-O-2，4，6-三-O-乙?；?β-D-吡喃半乳糖苷(化合物20)
1H-NMR(300MHz，δ(ppm)相對(duì)于CHCl3)7.57(d，J＝11Hz，1H)，7.45-7.25(m，5H)，6.39(d，J＝11Hz，1H)，5.87(d，J＝4Hz，1H)，5.45(m，1H)，5.39(m，2H)，5.21(t，J＝7Hz，1H)，5.17-4.97(m，2H)，4.89(d，J＝2Hz，1H)，4.63(d，J＝5Hz，1H)，4.59(dd，J＝1Hz，J＝7Hz，1H)，4.42-3.40(m)，3.79(s，3H)，3.05(m，1H)，2.57(dd，J＝3Hz，J＝10Hz，1H)，2.27-1.85(12s，36H)，1.77(dd，J＝10Hz，J＝10Hz，1H)，1.15(t，J＝5Hz，3H)。
乙基[(5-乙酰氨基-3，5-二脫氧-4，7，8，9-四-O-乙酰基-α-D-甘油基-D-半乳糖基-2-N-乙?；拎窠?jīng)氨酸)甲酯]-(2，3)-O-(2，4，6-三-O-乙?；?β-D-吡喃半乳糖基)-(1，4)-O-(2-2′-萘甲酰氨基-2-脫氧-6-O-乙酰基-β-D-吡喃葡糖基)-(1，3)-O-2，4，6-三-O-乙?；?β-D-吡喃半乳糖苷(化合物21)1H-NMR(300MHz，δ(ppm)相對(duì)于CHCl3)8.25(s，1H)，7.95-7.42(m，6H)，6.58(d，J＝5Hz，1H)，5.53(m，1H)，5.44(d，J＝2Hz，1H)，5.41-5.23(m)，5.17-5.01(m)，4.8 9(d，J＝3Hz，1H)，4.63(d，J＝6Hz，1H)，4.59(dd，J＝3Hz，J＝7Hz，1H)，4.42-3.40(m)，3.81(s，3H)，3.27(m，1H)，2.57(dd，J＝3Hz，J＝10Hz，1H)，2.27-1.85(12s，36H)，1.77(dd，J＝10Hz，J＝10Hz，1H)，1.15(t，J＝5Hz，3H)。
乙基[(5-乙酰氨基-3，5-二脫氧-4，7，8，9-四-O-乙?；?α-D-甘油基-D-半乳糖基-2-N-乙酰基比喃神經(jīng)氨酸甲酯]-(2，3)-O-(2，4，6-三-O-乙酰基-β-D-吡喃半乳糖基)-(1，4)-O-[(2，3，4-三-O-芐基-α-L-吡喃巖藻糖基)-(1，3)]-O-(2-對(duì)氟苯甲酰氨基-2-脫氧-3，6-二-O-乙?；?β-D-吡喃葡糖基]-(1，3)-O-2，4，6-三-O-乙?；?b-D-吡喃半乳糖苷(化合物22)1H-NMR(300MHz，δ(ppm)相對(duì)于CHCl3)7.42(m，2H)，7.39-7.17(m，15H)，6.95(t，J＝7Hz，2H)，6.45(d，J＝5Hz，1H)，5.57-5.37(m，3H)，5.27(d，J＝7Hz，1H)，5.17-4.45(m)，4.39(d，J＝7Hz，1H)，4.25-3.41(m)，3.81(s，3H)，3.21(m，1H)，2.57(dd，J＝3Hz，J＝10Hz，1H)，2.27-1.85(12s，36H)，1.77(dd，J＝10Hz，J＝10Hz，1H)，1.19(d，J＝5Hz，3H)，1.15(t，J＝5Hz，3H)。
乙基[(5-乙酰氨基-3，5-二脫氧-4，7，8，9-四-O-乙?；?α-D-甘油基-D-半乳糖基-2-N-乙?；拎窠?jīng)氨酸)甲酯]-(2，3)-O-(2，4，6-三-O-乙?；?β-D-吡喃半乳糖基)-(1，4)-O-[(2，3，4-三-O-芐基α-L-吡喃巖藻糖基)-(1，3)]-O-(2-對(duì)硝基苯甲酰氨基-2-脫氧-3，6-二-O-乙酰基-β-D-吡喃葡糖基]-(1，3)-O-2，4，6-三-O-乙?；?β-D-吡喃半乳糖苷(化合物23)
1H-NMR(300MHz，δ(ppm)相對(duì)于CHCl3)8.15(d，J＝8Hz，2H)，7.55(d，J＝8Hz，2H)，7.41-7.15(m，15H)，6.63(d，J＝5Hz，1H)，5.48(m，1H)，5.43(dd，J＝6Hz，J＝2Hz，1H)，5.37(d，J＝6Hz，1H)，5.19(d，J＝8Hz，1H)，5.15-4.45(m)，4.42(t，J＝4Hz，1H)，4.25(m，2H)，4.18-3.40(m)，3.82(s，3H)，3.25(m，1H)，2.59(dd，J＝3Hz，J＝10Hz，1H)，2.27-1.85(12s，36H)，1.77(dd，J＝10Hz，J＝10Hz，1H)，1.19(d，J＝5Hz，3H)，1.15(t，J＝5Hz，3H)。
乙基[(5-乙酰氨基-3，5-二脫氧-4，7，8，9-四-O-乙酰基-α-D-甘油基-D-半乳糖基-2-N-乙?；拎窠?jīng)氨酸)甲酯]-(2，3)-O-(2，4，6-三-O-乙?；?β-D-吡喃半乳糖基)-(1，4)-O-[(2，3，4-三-O-芐基α-L-吡喃巖藻糖基)-(1，3)]-O-[2-(E-1-氧代-3-苯基丙-2-烯基)氨基-2-脫氧-3，6-二-O-乙?；?β-D-吡喃葡糖基]-(1，3)-O-2，4，6-三-O-乙?；?β-D-吡喃半乳糖苷(化合物24)1H-NMR(300MHz，δ(ppm)相對(duì)于CHCl3)7.42(d，J＝11Hz，1H)，7.39-7.15(m，20H)，5.94(d，J＝11Hz，1H)，5.85(d，J＝4Hz，1H)，5.55-5.29(m，4H)，5.17-4.42(m)，4.25(m，2H)，4.17-3.40(m)，3.79(s，3H)，3.05(m，1H)，2.57(dd，J＝3Hz，J＝10Hz，1H)，2.27-1.85(12s，36H)，1.77(dd，J＝10Hz，J＝10Hz，1H)，1.19(d，J＝5Hz，3H)，1.15(t，J＝5Hz，3H)。
乙基[(5-乙酰氨基-3，5-二脫氧-4，7，8，9-四-O-乙?；?α-D-甘油基-D-半乳糖基-2-N-乙?；拎窠?jīng)氨酸)甲酯]-(2，3)-O-(2，4，6-三-O-乙?；?β-D-吡喃半乳糖基)-(1，4)-O-[(2，3，4-三-O-芐基α-L-吡喃巖藻糖基)-(1，3)]-O-(2-2′-萘甲酰氨基-2-脫氧-3，6-二-O-乙酰基-β-D-吡喃葡糖基]-(1，3)-O-2，4，6-三-O-乙?；?β-D-吡喃半乳糖苷(化合物25)1H-NMR(300MHz，δ(ppm)相對(duì)于CHCl3)8.13(s，1H)，7.84(d，J＝7Hz，1H)，7.78(d，J＝7Hz.1H)，7.57(m，2H)，7.37-7.11(m，16H)，6.98(d，J＝7Hz，1H)，6.65(d，J＝5Hz，1H)，5.57-5.35(m，2H)，5.22(d，J＝7Hz，1H)，5.15-5.01(m，3H)，4.97-4.45(m)，4.25(m，2H)，4.19-3.42(m)，3.81(s，3H)，3.23(m，1H)，2.57(dd，J＝3Hz，J＝10Hz，1H)，2.27-1.85(12s，36H)，1.77(dd，J＝10Hz，J＝10Hz，1H)，1.19(d，J＝5Hz，3H)，1.05(t，J＝5Hz，3H)。
乙基[(5-乙酰氨基-3，5-二脫氧-4，7，8，9-四-O-乙?；?α-D-甘油基-D-半乳糖基-2-N-乙?；拎窠?jīng)氨酸)甲酯]-(2，3)-O-(2，4，6-三-O-乙?；?β-D-吡喃半乳糖基)-(1，4)-O-[(α-L-吡喃巖藻糖基)-(1，3)]-O-(2-對(duì)氟苯甲酰氨基-2-脫氧-3，6-二-O-乙酰基-β-D-吡喃葡糖基)-(1，3)-O-2，4，6-三-O-乙酰基-β-D-吡喃半乳糖苷(化合物26)
1H-NMR(300MHz，δ(ppm)相對(duì)于CHCl3)7.83(m，2H)，7.17(m，2H)，5.45(m，1H)，6.40(m，2H)，5.23(d，J＝5Hz，1H)，5.17-4.75(m，3H)，4.77-4.45(m，4H)，4.36(m，2H)，4.19-3.41(m)，3.81(s，3H)，3.09(bs，1H)，2.62(m，1H)，2.57(dd，J＝3Hz，J＝10Hz，1H)，2.27-1.85(12s，36H)，1.77(dd，J＝10Hz，J＝10Hz，1H)，1.24(d，J＝5Hz，3H)，1.15(t，J＝5Hz，3H)。
乙基[(5-乙酰氨基-3，5-二脫氧-4，7，8，9-四-O-乙?；?α-D-甘油基-D-半乳糖-2-N-乙酰基吡喃神經(jīng)氨酸甲酯]-(2，3)-O-(2，4，6-三-O-乙?；?β-D-吡喃半乳糖基)-(1，4)-O-[(α-L-吡喃巖藻糖基)-(1，3)]-O-(2-對(duì)氨基苯甲酰氨基-2-脫氧-3，6-二-O-乙?；?β-D-吡喃葡糖基]-(1，3)-O-2，4，6-三-O-乙酰基-β-D-吡喃半乳糖苷(化合物27)1H-NMR(300MHz，δ(ppm)相對(duì)于CHCl3)7.61(d，J＝8Hz，2H)，2H)，6.75(d，J＝5Hz，1H)，6.57(d，J＝8Hz，2H)，5.57(m，1H)，5.43(dd，J＝6Hz，J＝2Hz，1H)，5.27(d，J＝2Hz，1H)，5.19(d，J＝8Hz，1H)，5.09(m，1H)，4.95(m，2H)，4.77-4.63(m)，4.55(dd，J＝7Hz，J＝1Hz，1H)，4.42(t，J＝4Hz，1H)，4.35(m，2H)，4.21-3.38(m)，3.82(s，3H)，3.17(m，1H)，2.95(bs，1H)，2.59(dd，J＝3Hz，J＝10Hz，1H)，2.42(bs，1H)，2.27-1.85(12s，36H)，1.77(dd，J＝10Hz，J＝10Hz，1H)，1.22(d，J＝5Hz，3H)，1.15(t，J＝5Hz，3H)。
乙基[(5-乙酰氨基-3，5-二脫氧-4，7，8，9-四-O-乙?；?α-D-甘油基-D-半乳糖-2-N-乙酰基吡喃神經(jīng)氨酸甲酯]-(2，3)-O-(2，4，6-三-O-乙?；?β-D-吡喃半乳糖基)-(1，4)-O-[(α-L-吡喃巖藻糖基)-(1，3)]-O-[2-(3′-苯基)-丙酰氨基-2-脫氧-3，6-二-O-乙?；?β-D-吡喃葡糖基]-(1，3)-O-2，4，6-三-O-乙?；?β-D-吡喃半乳糖苷(化合物28)1H-NMR(300MHz，δ(ppm)相對(duì)于CHCl3)7.29(m，5H)，6.39(d，J＝2Hz，1H)，5.85(d，J＝4Hz，1H)，5.55-5.19(m，5H)，5.11(t，J＝5Hz，1H)，4.95(m，4H)，4.71-4.35(m)，4.17-3.22(m)，3.79(s，3H)，2.95(t，J＝3H，2H)，2.57(dd，J＝3Hz，J＝10Hz，1H)，2.47(t，J＝3Hz，2H)，2.27-1.85(12s，36H)，1.77(dd，J＝10Hz，J＝10Hz，1H)，1.24(d，J＝5Hz，3H)，1.15(t，J＝5Hz，3H)。
化合物30—38的數(shù)據(jù)乙基[(5-乙酰氨基-3，5-二脫氧-α-D-甘油基-D-半乳糖-2-N-乙?；拎窠?jīng)氨酸基]-(2，3)-O-(β-D-吡喃半乳糖基)-(1，4)-O-[(α-L-吡喃巖藻糖基)-(1，3)]-O-(2-對(duì)氟苯甲酰氨基-2-脫氧-β-D-吡喃葡糖基]-(1，3)-O-β-D-吡喃半乳糖苷(化合物30)Rf＝0.62(3∶1異丙酸(i-PrOH)∶乙酸銨(NH4OAc)，白色固體，41mg，96％
1H-NMR(300MHz，δ(ppm)相對(duì)于H2O)7.83(m，2H，芳族化合物)，7.25(m，2H，芳族化合物)，5.18(d，J＝5Hz，H-1(fuc)，1H)，4.95(m)，4.56(d，J＝8Hz，1H)，4.37(d，J＝8Hz，1H)，4.19(d，J＝3.5Hz，1H)，4.15-3.42(m)，2.77(dd，J＝3Hz，J＝10Hz，1H)，2.05(s，3H，NAc)，1.79(dd，J＝10Hz，J＝10Hz，1H)，1.19(m，3H)。
乙基[(5-乙酰氨基-3，5-二脫氧-α-D-甘油基-D-半乳糖-2-N-乙?；拎窠?jīng)氨酸基]-(2，3)-O-(β-D-吡喃半乳糖基)-(1，4)-O-[(α-L-吡喃巖藻糖基)-(1，3)]-O-(2-對(duì)氨基苯甲酰氨基-2-脫氧-β-D-吡喃葡糖基)-(1，3)-O-β-D-吡喃半乳糖苷(化合物31)Rf＝0.52(3∶1i-PrOH∶NH4OAc)，白色固體，26mg，96％
1H-NMR(300MHz，δ(ppm)相對(duì)于H2O)7.65(d，J＝9Hz，2H，芳族化合物)，6.82(d，J＝9Hz，2H)，5.19(d，J＝3Hz，H-1-fuc，1H)，4.95(m)，4.59(d，J＝8Hz，1H)，4.38(d，J＝8Hz，1H)，4.19(d，J＝2Hz，1H)，4.15-3.42(m)，3.19(q，J＝6Hz，2H，CH2CH3)，2.79(dd，J＝3Hz，J＝11Hz，Hcq-3(唾液酸)，1H)，2.05(s，3H，NAc)，1.77(dd，J＝10Hz，J＝10Hz，Hax-3(唾液酸)，1H)，1.19(d，J＝6Hz，3H，H-6-fuc)，1.17(t，J＝6Hz，3H)。
乙基[(5-乙酰氨基-3，5-二脫氧-α-D-甘油基-D-半乳糖基-2-N-乙?；拎窠?jīng)氨酸基]-(2，3)-O-(β-D-吡喃半乳糖基)-(1，4)-O-[(α-L-吡喃巖藻糖基)-(1，3)]-O-[2-(3′-苯基)-丙酰氨基-2-脫氧-β-D-吡喃葡糖基]-(1，3)-O-β-D-吡喃半乳糖苷(化合物32)Rf＝0.62(3∶1i-PrOH∶NH4OAc)，白色固體，47mg，98％
1H-NMR(300MHz，δ(ppm)相對(duì)于H2O)7.42-7.25(m，5H)，5.19(d，J＝4Hz，H-1-fuc，1H)，4.95(m)，4.57(d，J＝8Hz，1H)，4.38(d，J＝8Hz，1H)，4.13(d，J＝2Hz，1H)，4.11-3.42(m)，2.95(t，J＝5Hz，2H，a-CH2)，2.75(dd，J＝3Hz，J＝10Hz，Hcq-3(唾液酸)，1H)，2.63(t，J＝5Hz，2H，CH2Ph)，2.05(s，3H，NAc)，1.80(dd，J＝10Hz，J＝10Hz，H2x-3(唾液酸)，1H)，1.24(t，J＝5Hz，3H)，1.18(d，J＝5Hz，3H)。
乙基[(5-乙酰氨基-3，5-二脫氧-α-D-甘油基-D-半乳糖基-2-N-乙酰基吡喃神經(jīng)氨酸基]-(2，3)-O-(β-D-吡喃半乳糖基)-(1，4)-O-[(α-L-吡喃巖藻糖基)-(1，3)]-O-(2，2′-萘甲酰氨基-2-脫氧-β-D-吡喃葡糖基]-(1，3)-O-β-D-吡喃半乳糖苷(化合物33)Rf＝0.52(3∶1i-PrOH∶NH4OAc)，白色固體，35mg，96％
1H-NMR(300MHz，δ(ppm)相對(duì)于H2O)8.39(s，芳族化合物，1H)，8.02(m，芳族化合物，2H)，7.82(d，J＝7Hz，芳族化合物，1H)，7.63(m，芳族化合物，3H)，5.19(d，J＝4Hz，H-1(fuc)，1H)，4.95(m)，4.57(d，J＝8Hz，1H)，4.35(d，J＝8Hz，1H)，4.19(d，J＝2Hz，1H)，4.15-3.42(m)，2.77(dd，J＝3Hz，J＝11Hz，Hcq-3(唾液酸)，1H)，2.05(s，3H，NAc)，1.77(dd，J＝10Hz，J＝10Hz，Hax-3(唾液酸)，1H)，1.19(d，J＝6Hz，3H，H-6-fuc)，1.05(t，J＝6Hz，3H).
乙基[(5-乙酰氨基-3，5-二脫氧-α-D-甘油基-D-半乳糖基-2-N-乙酰基吡喃神經(jīng)氨酸基]-(2，3)-O-(β-D-吡喃半乳糖基)-(1，4)-O-[(α-L-吡喃巖藻糖基)-(1，3)]-O-[2，2′-苯基乙酰氨基-2-脫氧-β-D-吡喃葡糖基]-(1，3)-O-β-D-吡喃半乳糖苷(化合物34)Rf＝0.62(4.5∶1i-PrOH∶NH4OAc)，白色固體，24mg，68％
1H-NMR(300MHz，δ(ppm)相對(duì)于H2O)7.45-7.27(m，5H)，4.85(d，J＝3Hz，H-1-fuc，1H)，4.75(m)，4.55(d，J＝8Hz，1H)，4.38(d，J＝8Hz，1H)，4.13(d，J＝2Hz，1H)，4.09-3.42(m)，2.78(dd，J＝3Hz，J＝10Hz，Hcq-3(唾液酸)，1H)，2.05(2s，5H，NAc，PhCH2)，1.80(dd，J＝10Hz，J＝10Hz，Hax-3(唾液酸)，1H)，1.24(t，J＝5Hz，3H)，1.18(d，J＝5Hz，3H)。
乙基[(5-乙酰氨基-3，5-二脫氧-α-D-甘油基-D-半乳糖基-2-N-乙酰基吡喃神經(jīng)氨酸基]-(2，3)-O-(β-D-吡喃半乳糖基)-(1，4)-O-[(α-L-吡喃巖藻糖基)-(1，3)]-O-[2-對(duì)-甲氧基苯甲酰氨基-2-脫氧-β-D-吡喃葡糖基]-(1，3)-O-β-D-吡喃半乳糖苷(化合物35)Rf＝0.52(3∶1i-PrOH∶NH4OAc)，白色固體，46mg，90％
1H-NMR(300MHz，δ(ppm)相對(duì)于H2O)7.75(d，J＝9Hz，2H，芳族化合物)，7.05(d，J＝9Hz，2H)，5.11(d，J＝3Hz，H-1-fuc，1H)，4.95(m)，4.52(d，J＝8Hz，1H)，4.25(d，J＝8Hz，1H)，4.19(d，J＝2Hz，1H)，4.15-3.39(m)，3.82(s，3H，OCH3)，2.75(dd，J＝3Hz，J＝11Hz，Heq-3(s唾液酸1)，1H)，1.99(s，3H，NAc)，1.77(dd，J＝10Hz，J＝10Hz，Hax-3(1唾液酸2)，1H)，1.17(m，5H，H-6-fuc，CH2CH3).
乙基[(5-乙酰氨基-3，5-二脫氧-α-D-甘油基-D-半乳糖基-2-N-乙酰基吡喃神經(jīng)氨酸基]-(2，3)-O-(β-D-吡喃半乳糖基)-(1，4)-O-[(α-L-吡喃巖藻糖基)-(1，3)]-O-(2-對(duì)叔丁基苯甲酰氨基-2-脫氧-β-D-吡喃葡糖基]-(1，3)-O-β-D-吡喃半乳糖苷(化合物36)Rf＝0.52(3∶1i-PrOH∶NH4OAc)，白色固體，46mg，90％
1H-NMR(300MHz，δ(ppm)相對(duì)于H2O)7.65(d，J＝9Hz，2H，芳族化合物)，7.58(d，J＝9Hz，2H)，5.19(d，J＝4Hz，H-1(fuc)，1H)，4.95(m)，4.57(d，J＝8Hz，1H)，4.38(d，J＝8Hz，1H)，4.19(d，J＝2Hz，1H)，4.15-3.39(m)，2.73(dd，J＝3Hz，J＝11Hz，Hcq-3(唾液酸)，1H)，2.05(s，3H，NAc)，1.77(dd，J＝10Hz，J＝10Hz，Hax-3(唾液酸)，1H)，1.24(s，9H，-Bu)，1.17(m，5H，H-6-fuc，CH2CH3).
(5-乙酰氨基-3，5-二脫氧-α-D-甘油基-D-半乳糖基-2-N-乙酰基吡喃神經(jīng)氨酸基]-(2，3)-O-(β-D-吡喃半乳糖基)-(1，4)-O-[(α-L-吡喃巖藻糖基)-(1，3)]-O-(2-苯甲酰氨基-2-脫氧-β-D-吡喃葡糖基]-(1，3)-O-β-D-吡喃半乳糖苷(化合物37)1H NMR，(300MHz，δ(ppm)相對(duì)于H2O)1.15(3H，d，J＝6.5Hz，CH3of Fuc)，1.81(1H，t，J＝10.4Hz，H-3″a of NAA)，2.02(3H，s，CH3CONH)，2.78(1H，dd，J＝10.4Hz，3.2Hz，H-3″e(cuò) of NANA)，3.5-4.2(m)，4.4-4.8(m)，5.09，5.16(d，d，H-1 of FUC，α，β)，5.2(d，J＝3.4Hz，H-1α)，7.5-7.8(5H，芳族化合物)
芐基(5-乙酰氨基-3，5-二脫氧-α-D-甘油基-D-半乳糖基-2-N-乙酰基吡喃神經(jīng)氨酸基]-(2，3)-O-(β-D-吡喃半乳糖基)-(1，4)-O-[(α-L-吡喃巖藻糖基)-(1，3)]-O-(2-苯甲酰氨基-2-脫氧-β-D-吡喃葡糖基)-(1，3)-O-β-D-吡喃半乳糖苷(化合物38)1H NMR，(300MHz，δ(ppm)相對(duì)于H2O)1.08(3H，d，J＝6.4Hz，CH3of Fuc)，1.76(1H，t，J＝10.4Hz，H-3″a of NANA)，1.97(3H，s，CH3CONH)，2.7(1H，dd，J＝10.4Hz，3.2Hz，H-3″e(cuò) of NANA)，3.4-.42(m)，4.5(1H，d，J＝7.7Hz)，4.6(1H，d，J＝8.0Hz)，5.02(d，J＝3.8Hz，H-1 of FUC)，7.1-7.8(10H，芳族化合物)。
化合物44—49的數(shù)據(jù)乙基(5-乙酰氨基-3，5-二脫氧-α-D-甘油基-D-半乳糖基-2-N-乙?；拎窠?jīng)氨酸基]-(2，3)-O-(β-D-吡喃半乳糖基)-(1，4)-O-[((α-L-吡喃巖藻糖基)-(1，3)]-O-[2-(3，4-二氯苯甲酰氨基-2-脫氧-β-D-吡喃葡糖基]-(1，3)-O-β-D-吡喃半乳糖苷(化合物44)1H-NMR(270MHz，δ(ppm)相對(duì)于H2O)7.82(s，1H)，7.56(m，2H)，5.99(d，J＝3.96Hz，1H)，4.47(d，J＝7.59HZ，1H)，4.25(d，J＝7.91Hz，1H)，4.15-3.22(m)，2.66(dd，J＝12.54Hz，J＝3.96Hz，1H)，1.94(s，3H)，1.76(t，J＝12.54Hz，1H)，1.10(m，6H)。
乙基(5-乙酰氨基-3，5-二脫氧-α-D-甘油基-D-半乳糖基-2-N-乙?；拎窠?jīng)氨酸基]-(2，3)-O-(β-D-吡喃半乳糖基)-(1，4)-O-[(α-L-吡喃巖藻糖基)-(1，3)]-O-(2-呋喃氨基-2-脫氧-β-D-吡喃葡糖基)-(1，3)-O-β-D-吡喃半乳糖苷(化合物45)1H-NMR(270MHz，δ(ppm)相對(duì)于H2O)7.59(d，J＝1.98Hz，1H)，7.10(d，J＝3.63Hz，1H)，6.54(dd，J＝3.36Hz，J＝1.98Hz，1H)，5.05(d，J＝4.29Hz，1H)，4.46(d，J＝7.59Hz，1H)，4.23(d，J＝7.92Hz，1H)，4.06(d，J＝2.97Hz，1H)，4.02-3.32(m)，2.68(dd，J＝12.87Hz，J＝3.96Hz，1H)，1.95(s，3H)，1.77(t，J＝12.87Hz，1H)，1.08(m，6H).
乙基[(5-乙酰氨基-3，5-二脫氧-α-D-甘油基-D-半乳糖基-2-N-乙?；拎窠?jīng)氨酸基]-(2，3)-O-(β-D-吡喃半乳糖基)-(1，4)-O-[(α-L-吡喃巖藻糖基)-(1，3)]-O-[2-噻吩氨基-2-脫氧-β-D-吡喃葡糖基]-(1，3)-O-β-D-吡喃半乳糖苷(化合物46)1H-NMR(270MHz，δ(ppm)相對(duì)于H2O)7.63(m，2H)，7.10(m，1H)，5.06(d，J＝3.63Hz，1H)，4.46(d，J＝7.92Hz，1H)，4.23(d，J＝7.92Hz，1H)， 4.06(d，J＝3.30Hz，1H)，4.04-3.30(m)，2.67(dd，J＝12.21Hz，J＝3.96Hz，1H)，1.94(s，3H)，1.73(t，J＝12.21Hz，1H)，1.07(m，6H)。
乙基[(5-乙酰氨基-3，5-二脫氧-α-D-甘油基-D-半乳糖基-2-N-乙酰基吡喃神經(jīng)氨酸基]-(2，3)-O-(β-D-吡喃半乳糖基)-(1，4)-O-[(α-L-吡喃巖藻糖基)-(1，3)]-O-[2-(2-硫甲基)煙酰氨基-2-脫氧-β-D-吡喃葡糖基]-(1，3)-O-β-D-吡喃半乳糖苷(化合物48)1H-NMR(270MHz，δ(ppm)相對(duì)于H2O)7.62(m，2H)，7.06(m，1H)，5.04(d，J＝3.96Hz，1H)，4.43(d，J＝7.59Hz，1H)，4.23(d，J＝7.92Hz，1H)，4.10-3.20(m)，2.68(m，1H)，2.14(s，3H)，2.09(s，3H)，1.70(m，1H)，1.05(m，6H)。
乙基(5-乙酰氨基-3，5-二脫氧-α-D-甘油基-D-半乳糖基-2-N-乙?；拎窠?jīng)氨酸基]-(2，3)-O-(β-D-吡喃半乳糖基)-(1，4)-O-[(α-L-吡喃巖藻糖基)-(1，3)]-O-[2-(6-十二烷氧基-2-萘甲酰氨基-2-脫氧-β-D-吡喃葡糖基]-(1，3)-O-β-D-吡喃半乳糖苷(化合物47)1H-NMR(270MHz，δ(ppm)相對(duì)于CH3OH)8.32(s，1H)，7.90-7.78(m，3H)，7.26-7.16(m，2H)，5.17-5.13(m，1H)，4.48-4.40(m，1H)，4.22-3.32(m)，2.88-2.82(m，1H)，2.01(s，3H)，1.85-1.19(m)，0.91-0.85(m，3H)。
乙基[(5-乙酰氨基-3，5-二脫氧-α-D-甘油基-D-半乳糖基-2-N-乙?；拎窠?jīng)氨酸基]-(2，3)-O-(β-D-吡喃半乳糖基)-(1，4)-O-[(α-L-吡喃巖藻糖基)-(1，3)]-O-[2-間丁氧基苯甲酰氨基-2-脫氧-β-D-吡喃葡糖基]-(1，3)-O-β-D-吡喃半乳糖苷(化合物49)1H-NMR(270MHz，δ(ppm)相對(duì)于H2O)7.39-7.22(m，3H)，7.13-7.09(m，1H)，5.03(d，J＝3.96Hz，1H)，4.46(d，J＝7.92Hz，1H)，4.23(d，J＝7.92Hz，1H)，4.07-3.34(m)，2.68-2.64(m，1H)，1.93(s，3H)，1.74-1.62(m，3H)，1.30-1.44(m，2H)，1.07(t，J＝7.25Hz，3H)，1.06(d，J＝5.60Hz，3H)，0.84(t，J＝7.58Hz，3H)。
化合物50和51的數(shù)據(jù)乙基[(5-乙酰氨基-3，5-二脫氧-α-D-甘油基-D-半乳糖基-2-N-乙?；拎窠?jīng)氨酸基]-(2，3)-O-(β-D-吡喃半乳糖基)-(1，4)-O-[(α-L-吡喃巖藻糖基)-(1，3)]-O-[2-煙酰氨基-2-脫氧-β-D-吡喃葡糖基]-(1，3)-O-β-D-吡喃半乳糖苷(化合物50)Rf＝0.22(二氧化硅i-PrOH/1M NH4OAc)
1HNMR(300MHz，D2O)δ 1.13(d，3H，J＝6.6Hz，CH3Fuc)，1.15(t，3H，J＝6.7Hz，OCH2CH3)，1.78(t，1H，J＝11.9Hz，H-3a NANA)，2.01(s，3H，COCH3)，2.74(dd，1H，J＝4.4，11.9，H-3e NANA)，3.41-4.33(多峰，34H)，4.31(d，1H，J＝8.1Hz，β-異構(gòu)體Gal)，4.53(d，1H，J＝8.0Hz，β-異構(gòu)體-Gal)，5.10(d，1H，J＝3.7Hz，α-異構(gòu)體Fuc)，7.56(m，1H，H-5吡啶基)，8.16(dd，1H，J＝1.3，8.1Hz，H-4吡啶基)，8.68(m，1H，H-6吡啶基)，8.85(s，1H，H-2吡啶基)。
乙基[(5-乙酰氨基-3，5-二脫氧-α-D-甘油基-D-半乳糖基-2-N-乙?；拎窠?jīng)氨酸)鈉]-(2，3-O-(β-D-吡喃半乳糖基)-(1，4)-O-[α-L-吡喃巖藻糖基-(1，3)-O-]-(2-苯磺酰氨基-2-脫氧-β-D-吡喃葡糖基)-β-D-吡喃半乳糖苷(化合物51)Rf＝0.28(二氧化硅，20％1M NH4OAc/異丙醇)
1H NNR(300MHz，D2O，(ppm)相對(duì)于H2O)δ7.92(d，J＝7.4Hz，2H)，7.69(d，J＝7.2Hz，1H)，7.60(t，J＝7.2Hz，2H)，5.47(d，J＝4.0Hz，1H)，4.62(d，J＝8.1Hz，1H)，4.51(d，J＝7.6Hz，1H)，4.24(d，J＝8.0Hz，1H)，4.07(dd，J＝3.1，9.6Hz，1H)，3.99(d，J＝3.1Hz，1H)，3.96＝3.46(m，29H)，2.75(dd，J＝4.6，12.5Hz，1H)，2.68(dd，J＝8.1，8.1Hz，1H)，2.02(s，3H)，1.78(t，J＝12.1Hz，1H)，1.20(t，3H)，1.16(d，J＝6.5Hz.3H)。細(xì)胞粘附測(cè)定已開發(fā)出一種改良的重組型可溶性E-選擇素/HL-60細(xì)胞的粘附測(cè)定法，它較為簡便且具有高度的重復(fù)性，用它來比較唾液酰Lewis X的低聚糖類似物的E-選擇素阻斷能力。在此測(cè)定中，將重組型可溶性E-選擇素(rELAM)固定于96井型ELISA盤的塑料表面。將待測(cè)定的SLex類似物的稀釋物加入井內(nèi)，隨后加HL-60細(xì)胞，它們帶有E-選擇素的配位體。令細(xì)胞粘附于涂有E-選擇素的測(cè)試盤上，用自動(dòng)洗盤器洗去未吸附的細(xì)胞。通過測(cè)定細(xì)胞髓過氧化物酶來對(duì)結(jié)合的細(xì)胞進(jìn)行定量。利用產(chǎn)生50％的相照粘附抑制作用所需的被測(cè)低聚糖的濃度來比較低聚物的作用能力。Lobb等在J.Im-munol.，147124～129(1991)報(bào)導(dǎo)了利用重組ELAM-1的相似的固定了的可溶性部分作為底物來粘附可與含ELAM-1(E-選擇素)受體的細(xì)胞結(jié)合的HL-60和其它細(xì)胞的效率。材料與方法材料
ELISA盤，Immulon2(Dynatec實(shí)驗(yàn)室)(Fisher14-245-61)0.2m過濾器(Nalgene#150～0020)按下法制備和親和純化rELAM(重組修飾ELAM-1)。對(duì)每一批rELAM進(jìn)行功能測(cè)試以決定用于分析的合適濃度。有一批在1～5μg/ml范圍內(nèi)加以滴定，使用化合物Z抑制的抑制作用(敘述于下文)為標(biāo)準(zhǔn)。然后分成幾份等分試樣，在干冰丙酮浴中快速冷凍并保存于-70℃。每一等分試樣僅開啟一次，然后丟棄或留存以供其它類型的測(cè)定之用。
借助基因工程去除cDNA的橫跨膜功能區(qū)來獲得E-選擇素的可溶形式(rELAM或可溶性-E-選擇素)。將此重組的cDNA克隆入哺乳類表達(dá)載體pCDNAl[pCDM8的變體；參見，Nature，329840(1987)]，它含有雜交的細(xì)胞肥大病毒/人免疫缺限病毒啟動(dòng)子。當(dāng)將它導(dǎo)入腺病毒轉(zhuǎn)化的人腎細(xì)胞系293時(shí)，通過迄今尚未明了的機(jī)制，E1基因產(chǎn)物可高效地促進(jìn)CMV啟動(dòng)子的表達(dá)。通過磷酸鈣-介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移，pCDNAl-可溶性-E-選擇素結(jié)構(gòu)被導(dǎo)入293細(xì)胞，由此產(chǎn)生高效表達(dá)可溶性-E-選擇素的穩(wěn)定細(xì)胞系。由這些細(xì)胞產(chǎn)生的可溶性-E-選擇來通過抗-E-選擇素單克隆抗體蛋白質(zhì)-A瓊脂糖(Protein-A Sepharose)免疫親和柱層析加以純化。
更具體地，腺病毒轉(zhuǎn)化的人腎細(xì)胞293得自ATCC(CRL-1573)。293細(xì)胞在DMEM中以粘附培育形式生長，DMEM得自Whittaker Bioproducts(Wlkersville，MD)，再補(bǔ)充10％的胎牛血清(FBS)者可得自JRH Biochemical(Lenaxa，KS)。
質(zhì)粒pCDNAl，pCDM8的一種衍生物[參見Nature，339840(1987)]，得自Ivitrogen(San Diego，CA)。質(zhì)粒pBluescript II得自Stratagene(San Diego，CA)。質(zhì)粒pSV2-ne[Southern等，J.Mol.Appl.Gen.1327(1982)]含有編碼氨基糖苷3′-磷酸轉(zhuǎn)移酶基因的E.coli基因。當(dāng)pSV2-neo被導(dǎo)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞后，被轉(zhuǎn)染細(xì)胞能表達(dá)出對(duì)抗生素G418的抗性。
從IL-1-激活的人內(nèi)皮細(xì)胞中分離信使RNA，由信使RNA反轉(zhuǎn)錄得cDNA，用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增此cDNA，由此分離出一個(gè)編碼平頭E-選擇素結(jié)構(gòu)基因的1.67kbp長的DNA片段。5′-端插入E-選擇素起始密碼子上游28個(gè)核苷酸的單一Clal限制性切點(diǎn)。3′-端插入在成熟E-選擇素第527個(gè)氨基酸后的終止密碼子TGA，其后為單一的Xhol限制性切點(diǎn)。可溶性-E-選擇素的羧端位于第六個(gè)保守重復(fù)序列的羧端位置，由此去除了透膜區(qū)。用Clal和Xhol限制性核酸內(nèi)切酶一起切下1.67kbp的PCR片段，將其次級(jí)克隆入克隆載體的Clal和Xho限制性切點(diǎn)之間，由此形成pBSII-可溶性-E-選擇素載體。可溶性-E-選擇素長為527個(gè)氨基酸，有11個(gè)N-糖基化位點(diǎn)。
從pBSII-可溶性-E-選擇素上分離含有可溶性-E-選擇素cD-NA的1.67kbp DNA片段，將其次級(jí)克隆入表達(dá)載體pCDNAl的Eco RV和Xhol位點(diǎn)間，由此形成載體pCDNAl-可溶性-E-選擇素。
用磷酸鈣技術(shù)[kriegler，Gene Transfer and ErpressionAlaboratory manual，W.H.Freeman，New York，N.Y.(1991)]，將pCDNAl-可溶性-E-選擇素和pSV2-neo一同轉(zhuǎn)染入293細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后48小時(shí)，將轉(zhuǎn)染后的293細(xì)胞以胰蛋白酶處理并平面接種入DMEN，10％FBS和600mg/ml G418(Geneticin，Sigma)。每3天換一次選擇性培養(yǎng)基，直到得到穩(wěn)定的G418抗性種群。
用克隆筒分離出G418-抗性單克隆。用酶連接的免疫吸附測(cè)定(ELISA)篩選分離的克隆供可溶性-E-選擇素的合成，其中的抗-E-選擇素單克隆抗體，定名為CY1787，作為原抗體。接種陽性克隆，濃度為106個(gè)細(xì)胞/100mm培養(yǎng)皿。24小時(shí)后以[35S]-甲硫氨酸對(duì)基代謝標(biāo)記5小時(shí)。標(biāo)記后的可溶性-E-選擇素與抗-E-選擇素單克隆抗體一起免疫沉淀出來，將沉淀在10％的PAGE凝膠中電泳，將凝膠干燥后進(jìn)行輻射自顯影?？寺?93#3被選定為可產(chǎn)生最多的110-kd可溶性-E-選擇素蛋白/細(xì)胞的穩(wěn)定細(xì)胞系。
使用10腔Nuc Cell Factory(總表面積6250cm2，Nunc)，將2.78×108細(xì)胞(克隆293#3)接種在補(bǔ)以5％FBS的850ml DMEM中，并在37℃培養(yǎng)72小時(shí)。然后收獲得培養(yǎng)基并換以850ml的含5％FBS的DMEM。37℃培養(yǎng)48小時(shí)，進(jìn)行第二次收獲并替換以850ml含5％FBS的DMEM。37℃培養(yǎng)48小時(shí)后，進(jìn)行第三次(最后一次)收獲并替換以850ml含5％FBS的DMEM。
每次收獲培養(yǎng)基后，向其中加入0.02％的疊氮化鈉。離心(5000xg)使培養(yǎng)基澄清，以0.2mm的過濾器過濾，保存于4℃至進(jìn)一步純化。
如Schneider等J.Biol.Chem.，25710766(1982)中所述，單克隆抗體CY1787與蛋白質(zhì)-A瓊脂糖自發(fā)結(jié)合。簡而言之，室溫下將28mg單克隆抗體CY1787的PBS溶液(5mg/ml)與5ml蛋白質(zhì)-A瓊脂糖混合30分鐘。用25mlpH8.2的0.2M硼酸緩沖液離心洗滌微珠四次，然后再用10mlpH8.2的0.02M三乙醇胺洗滌2次。然后將樹脂懸浮于40mlpH8.2的0.2M三乙醇胺緩沖液中，其中含0.02M的庚二亞氨酸二甲酸(dimethylpimelimidate)。在反應(yīng)器中于室溫下反應(yīng)45分鐘后，用pH8.2的0.02M乙醇胺洗滌樹脂兩次，再用10ml pH8.2的0.2M硼酸緩沖液洗三次。用pH4.5的0.1M乙酸鈉緩沖液洗去未結(jié)合抗體。所有抗體的89％與蛋白質(zhì)-A瓊脂糖結(jié)合。
組織培養(yǎng)上清液(2550ml)以20ml/hr的流速依次通過0.7cm×1.5cm的蛋白質(zhì)-A瓊脂糖預(yù)層析柱和與之相連的1.5cm×3cm的CY1787-蛋白質(zhì)-A瓊脂糖親和層析柱。然后將兩柱分開，含CY1787的親和柱以含150mM NaCl和2mM CaCl2的pH7.5的20mMTris緩沖液洗滌，直至洗出液在280nm處的吸收值為0。用含有1mM CaCl2，pH3.5的0.1M乙酸鈉緩沖液用重力流動(dòng)法洗脫被結(jié)合的E-選擇素。將各組份(1mL)收集入300ml 2M Tris緩沖液中，pH10。收集含蛋白的各個(gè)組分并以DPBS透析。使用Amicon Cen-triprep30至蛋白質(zhì)濃度約為1mg/ml后，將純化的E-選擇素分裝保存于-80℃。由SDS-PAGE測(cè)得純度大于90％。由2550ml細(xì)胞培養(yǎng)物共可純化得10mg E-選擇素。
Dulbecco’s PBS(DPBS)(whittaker，17—513B)HL-60(ATCC，CCL 240)培養(yǎng)大量HL-60細(xì)胞，對(duì)其在測(cè)定中的功能進(jìn)行測(cè)試，保證無支原體。在2ml的耐低溫指管中，-180℃，將細(xì)胞冷凍于10％DMSO，10％胎牛血清，80％RPMI1640(Whit-taker)中，15×106個(gè)細(xì)胞/管。用一可控的冷藏箱進(jìn)行凍結(jié)。
化合物Z標(biāo)準(zhǔn)SLex五糖-OEtNeuAcα2→3Galβ1→4[Fucα1→3]GlcNAcβ1→3GalβOEt將化合物Z標(biāo)準(zhǔn)制成10mM的DPBS溶液。-20℃保存。
嗜中性白細(xì)胞洗滌緩沖液(NWB)10X HBSS(Gibco，310-4065)20mL1M HEPES(Gibco，380-5630)2mL超純水 178mLD-葡萄糖(Sigma，G7021) 0.4g200mL每天配制新鮮溶液或?qū)⑷芤簻缇蟊４嬗?℃。
pH調(diào)至7.2～7.4，過濾滅菌(0.2μ)。
100mM CaCl2儲(chǔ)存液無水CaCl2(Baker，1308) 1.11g超純水 100mL過濾滅菌(0.2m) 100mL嗜中性白細(xì)胞洗滌緩沖液＋1mMCaCl2＋0.1％牛血清白蛋白(BSA)(NWB/Ca/BSA)牛血清白蛋白(BSA)(Sigma，A-6918)10g100mM CaCl2儲(chǔ)存液 100mL用NWB定溶至 1000mL調(diào)pH至7.2-7.4，過濾滅菌(0.2μ)，保存于4℃。
阻斷緩沖液DPBS(whittaker，17—513B) 100mL牛血清白蛋白(Sigma，A—6918)1g100ml調(diào)pH至7.2至7.4過濾滅菌(0.2μ)，保存于4℃。
檸檬酸溶液，0.1M無水游離檸檬酸(Sigma，C-0759) 10.5g超純水定容 500mL在量筒或刻度試管中配制。常溫保存。
磷酸鈉溶液，0.2M無水Na2HPO4(Sigma，S—0876) 14.2g超純水定容 500mL在量筒或刻度試管中配制。常溫保存。檸檬酸/磷酸緩沖液檸檬酸溶液(0.1M) 24.3mLNa3PO4溶液(0.2M) 25.7mL超純水 50mL100mL常溫保存。細(xì)胞裂解緩沖液Nonidet P40(NP-40)(Sigma，N6507) 0.1g0.1M檸檬酸鹽 24.3mL0.2M Na2HPO325.7mL超純水 50.0mL100.0mL常溫保存。DPDA(鄰苯二胺)檸檬酸鹽—磷酸鹽緩沖液 10mL二鹽酸鄰苯二胺(Sigma，P8287) 10mgH2O2(Sigma，H1009) 10μL10ml即配即用。H2O2避光保存于10℃。
H2SO4終止緩沖液，4NH2SO4，18M(Fisher，A300s—212) 111mL超純水定容至 500mL方法1.將一批rELAM(可溶性E-選擇素)稀釋至適當(dāng)濃度。試驗(yàn)中，rELAM的使用濃度為在DPBS中的2.5μg/ml溶液。用多道移液管，向一個(gè)ELISA盤的下述井型格中每格加50ulE1～E6，F(xiàn)1～F6和G1～G6。在H1，H2，H3中加DPBS(50μl)用作對(duì)照。此盤稱為預(yù)測(cè)盤。
另取盤，每盤涂以三種已知待測(cè)樣品之一。再次使用多道移液管，在每盤的以下格中加入50μl稀釋后的rELAMB1～B12，C1～C12，D1～D12，E1～E12，F(xiàn)1～F12，G1～G12。在H1，H2，H3格中加入50μlDPBS用作對(duì)照。這些盤為樣品盤。將這些盤蓋上箔片在常溫下培養(yǎng)3小時(shí)。
2.用200μL阻斷緩沖液將盤洗滌三次。再在各格中加入200μL阻斷緩沖液，蓋以箔片，常溫培養(yǎng)1小時(shí)。
3.將3小瓶冷凍的HL-60細(xì)胞化凍，供制好的每2個(gè)樣品盤使用。細(xì)胞在37℃水浴中快速解凍。將細(xì)胞移入含10ml冰冷的NWB＋1％BSA的離心試管中。4℃，1200rpm，離心7分鐘，用NWB/BSA洗滌細(xì)胞2次以上。用血球計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)細(xì)胞，并將其重懸于NWB＋1％BSA＋1mMCaCl2中，至107/ml。
4.在洗滌細(xì)胞時(shí)，制備標(biāo)準(zhǔn)物和待測(cè)化合物溶液。稱取適量低聚糖化合物加入1.5ml eppendort管中，并根據(jù)各自分子量，加入足量的DPBS，使之各成為10mM的溶液。從每一樣品中取出6μL，將2μl點(diǎn)在pH試紙上。如果樣品的pH不在7-7.4，將pH調(diào)至此范圍，否則不要進(jìn)行測(cè)試。試驗(yàn)中，每一樣品需用其10mM溶液180μl，包括測(cè)試盤在內(nèi)的每一盤需要用10mM的標(biāo)準(zhǔn)化合物Z溶液180μl。
5.顛倒并用手指輕彈阻斷后的ELISA盤，并在紙巾上用力接拍以吸干格中的所有液體。然后用多道移液管向各格加入40μlNWB＋1％BSA＋1mMCa+2液。
6.除盡預(yù)測(cè)盤E6和G6中的所有液體。向這兩個(gè)空格和E5，G5中分別加入40μL一份的10mM的化合物Z儲(chǔ)備溶液。用一支調(diào)節(jié)至40μl的P200 pipetteman吸放10次以混合E5中的溶液。從中吸取40μl溶液，依次在E4，E3和E2稀釋，每次混合10次。從最后一格中吸取40μl并丟棄。對(duì)G4至G2列重復(fù)以上步驟。
7.用多道移液管向每格(H1除外)加入20μlHL-60細(xì)胞(2×105)。將盤放在振蕩器上振蕩5秒種，再任其在常溫靜止15分鐘。
8.調(diào)節(jié)Molecular Devices微盤洗滌器至緩慢流速檔，用它清洗盤，用NWB＋1％BSA＋1mM CaCl2清洗液每格洗3次。
9.加入細(xì)胞裂解緩沖液(50μl/格)，并在振蕩器上常溫振蕩5分鐘。
10.每格加入50μl OPDA溶液，在振蕩器上常溫振蕩10分鐘。
11.每格加入40μl H2SO4終止緩沖液以終止這一顯色反應(yīng)，在492nm處讀取每格的光密度值(O.D.)，減去由H1測(cè)得的空白值。
12.取H2和H3O.D.值的平均值作為負(fù)控制。此為“非-E-選擇素負(fù)粘附控制”?！罢掣娇刂啤比∽訣1，F(xiàn)1，F(xiàn)2，F(xiàn)3，F(xiàn)4，F(xiàn)5，F(xiàn)6和G1的平均值，并用于作標(biāo)準(zhǔn)曲線。如果“非-E-選擇素負(fù)粘附控制”大于平均“正粘附控制”10％，終止試驗(yàn)。如果前者小于后者10％，取裝有重復(fù)的樣品的(E6，G6)，(E5，G5)，(E4，G4)，(E3，G3)和(E2，G2)的平均值。每一個(gè)平均值除以平均“正粘附控制”得到待測(cè)化合物每一濃度的正粘附百分比。將“正粘附控制”百分比對(duì)抑制劑濃度的對(duì)數(shù)值(log)作圖。由圖上測(cè)得50％抑制點(diǎn)。該點(diǎn)應(yīng)對(duì)應(yīng)于濃度0.5～1.5mM之間，否則，終止試驗(yàn)。
13.如果預(yù)測(cè)盤的標(biāo)準(zhǔn)曲線在認(rèn)可范圍內(nèi)，則進(jìn)行其余盤的試驗(yàn)。按步驟6所述，在每一盤上稀釋標(biāo)準(zhǔn)物Z。以相同方法稀釋待測(cè)化合物。根據(jù)以下模板，在盤上進(jìn)行SLex類似物的測(cè)定濃度 測(cè)定#1測(cè)定#2測(cè)定#36.6mM或 稀釋液1B6，D6B7，D7E7，G73.3mM 稀釋液2B5，D5B8，D8E8，G81.65mM稀釋液3B4，D4B9，D9E9，G90.82mM稀釋液4B3，D3B10，D10 E10，G100.412mM 稀釋液5B2，D2B11，D11 E11，G1114.在盤上稀釋完所有樣品后，如步驟7所述加入HL-60細(xì)胞，并進(jìn)行至步驟11。
15.由B2，C1～6和D2計(jì)算測(cè)定#1的“正粘附控制”平均值；由B12，C7～12和D12計(jì)算測(cè)定#2的；E12，F(xiàn)7～12，G12計(jì)算測(cè)定#3的。在圖上表示了每一測(cè)定的每一稀釋液的正粘附，并在圖上測(cè)得50％抑制點(diǎn)。以標(biāo)準(zhǔn)物Z50％粘附值除以被測(cè)SLex樣品的50％粘附值的所得比值表示每一種被測(cè)SLex類似物的活性。SLex本身的活性以相同方法測(cè)定。
SLex本身及其幾個(gè)研究的類似物的該比值列于下表4中。
表4E-選擇素細(xì)胞粘附測(cè)定化合物化合物No.
表4(續(xù))E-選擇素細(xì)胞粘附測(cè)定化合物化合物No.
表4(續(xù))E-選擇素細(xì)胞粘附測(cè)定化合物 化合物No.
以上所述為對(duì)本發(fā)明的舉例說明而非限定。在不背離本發(fā)明的原本的精神與范圍下，可有多種改動(dòng)與改進(jìn)。
權(quán)利要求
1.一種下式化合物， 其中Z是氫，C1—C6?；?Y選自C(O)，SO2，HNC(O)，OC(O)和SC(O)；R1選自下組芳基、取代芳基、和苯基C1—C3亞烷基，其中芳基具有五員或六員芳香環(huán)、稠合的五員/六員芳香環(huán)、或者兩個(gè)稠合的六員芳香環(huán)，這些環(huán)選自烴基、單氧代烴基、單硫代烴基、單氮代烴基和二氮代烴基環(huán)，而取代芳基是所述的芳基之帶有選自下組的取代基者鹵素、三氟代甲基、硝基、C1—C18烷基、C1—C18烷氧基、氨基、單C1—C18烷基氨基、二C1—C18烷基氨基、芐氨基、C1—C18烷基芐氨基、C1—C18硫代烷基和C1—C18烷氧酰胺基或者R1Y為烯丙氧基羰基或氯代乙?；?；R2選自下組氫，C1—C18直鏈、支鏈或環(huán)狀烴基，C1—C5亞烷基ω-羧酸C1—C6烷基酯，ω-三(C1—C4烷基/苯基)甲硅烷基C2—C4亞烷基，單糖和二糖，或者OR2合起來形成C1—C18直鏈、支鏈或環(huán)狀烴基氨基甲酸酯；R3是氫或C1—C6?；?；R4是氫、C1—C6烷基或芐基；R5選自氫、芐基、甲氧基芐基、二甲氧基芐基和C1—C6酰基；R7是甲基或羥甲基和X選自C1—C6酰氧基、C2—C6羥基酰氧基、羥基、鹵素和疊氮基。
2.如權(quán)利要求1所述的化合物，其特征在于，R2是單糖。
3.如權(quán)利要求1所述的化合物，其特征在于，X是羥基。
4.如權(quán)利要求1所述的化合物，其特征在于，Z是氫。
5.如權(quán)利要求1所述的化合物，其特征在于，Z是
6.一種下式化合物， Y選自C(O)，SO2，HNC(O)，OC(O)和SC(O)；R1選自下組芳基、取代芳基、和苯基C1—C3亞烷基，其中芳基具有五員芳香環(huán)、六員芳香環(huán)、或者兩個(gè)稠合的六員芳香環(huán)，這些環(huán)選自烴基、單氧代烴基、單硫代烴基、單氮代烴基和二氮代烴基環(huán)，而取代芳基是所述的芳基之帶有選自下組的取代基者鹵素、三氟代甲基、硝基、C1—C12烷基、C1—C12烷氧基、氨基、單C1—C12烷基氨基、二C1—C12烷基氨基、芐氨基、C1—C12烷基芐氨基、C1—C12硫代烷基和C1—C12烷氧酰胺基，或者R2選自下組氫，C1—C18直鏈、支鏈或環(huán)狀烴基，C1—C5亞烷基ω-羧酸C1—C6烷基酯，ω-三(C1—C4烷基/苯基)甲硅烷基C2—C4亞烷基，單糖和二糖，或者OR2合起來形成C1—C18直鏈、支鏈或環(huán)狀烴基甲氨酸酯；R3是氫或C1—C6酰基；R4是氫、C1—C6烷基或芐基；R5選自氫、芐基、甲氧基芐基、二甲氧基芐基和C1—C6酰基；R7是甲基或羥甲基和X選自C1—C6酰氧基、C2—C6羥基酰氧基、羥基、鹵素和疊氮基。
7.如權(quán)利要求6所述的化合物，其特征在于，X為羥基，R2不是單糖或二糖，以及R7為甲基。
8.如權(quán)利要求7所述的化合物，其特征在于，R3＝R4＝R5＝氫。
9.如權(quán)利要求8所述的化合物，其特征在于，R1是苯基。
10.如權(quán)利要求6所述的化合物，其特征在于，R2是單糖。
11.一種下式化合物， 其中Z是氫，C1—C6酰基或 Y選自C(O)，SO2，HNC(O)，OC(O)和SC(O)；R1選自下組芳基、取代芳基、和苯基C1—C3亞烷基，其中芳基具有五員或六員芳香環(huán)、稠合的五員/六員芳香環(huán)、或者兩個(gè)稠合和六員芳香環(huán)，這些環(huán)選自烴基、單氧代烴基、單硫代烴基、單氮代烴基和二氮代烴基環(huán)，而取代芳基是所述的芳基之帶有選自下組的取代基者鹵素、三氟代甲基、硝基、C1—C18烷基、C1—C18烷氧基、氨基、單C1—C18烷基氨基、二C1—C18烷基氨基、芐氨基、C1—C18烷基芐氨基、C1—C18硫代烷基和C1—C18烷氧酰胺基，或者R1Y為烯丙氧基羰基或氯代乙芳基；R3是氫或C1—C6酰基；R4是氫、C1—C6烷基或芐基；R6選自氫、芐基、甲氧基芐基、二甲氧基芐基和C1—C6?；?；R2選自下組氫，C1—C18直鏈、支鏈或環(huán)狀烴基，C1—C5亞烷基ω-羧酸C1—C6烷基酯和ω-三(C1—C4烷基/苯基)甲硅烷基C2—C4亞烷基；或者OR6合起來形成C1—C18直鏈、支鏈或環(huán)狀烴基氨基甲酸酯；R7是甲基或羥甲基和X選自C1—C6酰氧基、C2—C6羥基酰氧基、羥基、鹵素和疊氮基。
12.如權(quán)利要求11所述的化合物，其特征在于，Y是羰基。
13.如權(quán)利要求12所述的化合物，其特征在于，Z是
14.一種下式化合物， Y選自C(O)，SO2，HNC(O)，OC(O)和SC(O)；R1選自下組芳基、取代芳基、和苯基C1—C3亞烷基，其中芳基具有五員或六員芳香環(huán)、稠合的五員/六員芳香環(huán)、或者兩個(gè)稠合的六員芳香環(huán)，這些環(huán)選自烴基、單氧代烴基、單硫代烴基、單氮代烴基和二氮代烴基環(huán)，而取代芳基是所述的芳基之帶有選自下組的取代基者鹵素、三氟代甲基、硝基、C1—C18烷基、C1—C18烷氧基、氨基、單C1—C18烷基氨基、二C1—C18烷基氨基、芐氨基、C1—C18烷基芐氨基、C1—C18硫代烷基和C1—C18烷氧酰胺基，或者R2選自下組氫，C1—C18直鏈、支鏈或環(huán)狀烴基，C1—C5亞烷基ω-羧酸C1—C6烷基酯，ω-三(C1—C4烷基/苯基)甲硅烷基C2—C4亞烷基，單糖和二糖，或者OR2合起來形成C1—C18直鏈、支鏈或環(huán)狀烴基氨基甲酸酯；R7是甲基或羥甲基和X選自C1—C6酰氧基、C2—C6羥基酰氧基、羥基、鹵素和疊氮基。
15.如權(quán)利要求14所述的化合物，其特征在于，X是羥基。
16.如權(quán)利要求14所述的化合物，其特征在于，R2不是單糖或二糖。
17.如權(quán)利要求16所述的化合物，其特征在于，Y是羰基。
18.如權(quán)利要求17所述的化合物，其特征在于，其結(jié)構(gòu)式為
19.如權(quán)利要求17所述的化合物，其特征在于，其結(jié)構(gòu)式為
20.如權(quán)利要求14所述的化合物，其特征在于，R2是單糖。
21.如權(quán)利要求20所述的化合物，其特征在于，Y是羰基。
22.如權(quán)利要求21所述的化合物，其特征在于，其結(jié)構(gòu)式為
23.如權(quán)利要求21所述的化合物，其特征在于，其結(jié)構(gòu)式為
24.如權(quán)利要求21所述的化合物，其特征在于，其結(jié)構(gòu)式為
25.如權(quán)利要求21所述的化合物，其特征在于，其結(jié)構(gòu)式為
26.如權(quán)利要求21所述的化合物，其特征在于，其結(jié)構(gòu)式為
27.如權(quán)利要求21所述的化合物，其特征在于，其結(jié)構(gòu)式為
28.如權(quán)利要求21所述的化合物，其特征在于，其結(jié)構(gòu)式為
29.如權(quán)利要求21所述的化合物，其特征在于，其結(jié)構(gòu)式為
30.如權(quán)利要求21所述的化合物，其特征在于，其結(jié)構(gòu)式為
31.如權(quán)利要求21所述的化合物，其特征在于，其結(jié)構(gòu)式為
32.如權(quán)利要求21所述的化合物，其特征在于，其結(jié)構(gòu)式為
33.如權(quán)利要求21所述的化合物，其特征在于，其結(jié)構(gòu)式為
34.如權(quán)利要求21所述的化合物，其特征在于，其結(jié)構(gòu)式為
35.如權(quán)利要求21所述的化合物，其特征在于，其結(jié)構(gòu)式為
36.如權(quán)利要求21所述的化合物，其特征在于，其結(jié)構(gòu)式為
37.如權(quán)利要求21所述的化合物，其特征在于，其結(jié)構(gòu)式為
38.如權(quán)利要求21所述的化合物，其特征在于，其結(jié)構(gòu)式為
39.一種藥物組合物，其特征在于，該藥物組合物含有藥用的稀釋劑，以及溶解或分散于其中的細(xì)胞粘附抑制量的下式化合物 Y選自C(O)，SO2，HNC(O)，OC(O)和SC(O)；R1選自下組芳基、取代芳基、和苯基C1—C3亞烷基，其中芳基具有五員或六員芳香環(huán)、稠合的五員/六員芳香環(huán)、或者兩個(gè)稠合的六員芳香環(huán)，這些環(huán)選自烴基、單氧代烴基、單硫代烴基、單氮代烴基和二氮代烴基環(huán)，而取代芳基是所述的芳基之帶有選自下組的取代基鹵素、三氟代甲基、硝基、C1—C18烷基、C1—C18烷氧基、氨基、單C1—C18烷基氨基、二C1—C18烷基氨基、芐氨基、C1—C18烷基芐氨基、C1—C18硫代烷基和C1—C18烷氧酰胺基；R2選自下組氫，C1—C18直鏈、支鏈或環(huán)狀烴基，C1—C5亞烷基ω-羧酸C1—C6烷基酯，ω-三(C1—C4烷基/苯基)甲硅烷基C2—C4亞烷基，單糖和二糖，或者OR2合起來形成C1—C18直鏈、支鏈或環(huán)狀烴基氨基甲酸酯；R7是甲基或羥甲基和X選自C1—C6酰氧基、C2—C6羥基酰氧基、羥基、鹵素和疊氮基。
40.如權(quán)利要求39所述的藥物組合物，其特征在于，Y是羰基。
41.如權(quán)利要求40所述的藥物組合物，其特征在于，X是羥基。
42.如權(quán)利要求41所述的藥物組合物，其特征在于，R2是單糖。
43.如權(quán)利要求42所述的藥物組合物，其特征在于，該單糖為3galβOET。
44.如權(quán)利要求41所述的藥物組合物，其特征在于，R2是芐基。
45.一種制備乳糖銨鹽的方法，其特征在于，該方法包括步驟(a)將半乳糖基果糖與伯胺混合以形成反應(yīng)混合物，該伯胺是單取代的氨衍生物，它的氮原子連于可還原去除的保護(hù)基團(tuán)，伯胺既作為反應(yīng)劑又作為溶劑，而且其用量為半乳糖基果糖的摩爾量的約2—10倍；(b)將反應(yīng)混合物在約10—60℃維持一段足夠形成相應(yīng)的半乳糖基果糖N-配糖物的時(shí)間；(c)形成的半乳糖基果糖N-配糖物與等當(dāng)量之內(nèi)的pKa值為約2.5—5.0的羧酸在C1—C3醇溶劑中，于約10—30℃反應(yīng)，從而將半乳糖基果糖N-配糖物重排成胺被保護(hù)住的乳糖銨鹽，該鹽具有連于胺的可還原去除的保護(hù)基團(tuán)；和(d)將保護(hù)基團(tuán)從該胺被保護(hù)住的半乳糖基糖銨鹽上還原去除，形成所述乳糖銨鹽。
46.如權(quán)利要求45所述的方法，其特征在于，還包括回收該乳糖銨鹽的步驟。
47.如權(quán)利要求45所述的方法，其特征在于，該伯胺為芐基胺。
48.如權(quán)利要求45所述的方法，其特征在于，步驟(a)中的反應(yīng)混合物還包括催化量的選自下組的催化劑氯化鋅、三氟甲烷磺酸鋅或三氟甲磺酸鎂和三氟乙酸。
49.如權(quán)利要求45所述的方法，其特征在于，步驟(c)中的C1—C3醇溶劑為甲醇。
50.如權(quán)利要求45所述的方法，其特征在于，步驟(d)中的還原去除是通過氫解而進(jìn)行的。
全文摘要
本發(fā)明涉及抑制選擇素受體和在其表面表達(dá)唾液基Lx
文檔編號(hào)A61K38/00GK1125449SQ9419228
公開日1996年6月26日 申請(qǐng)日期1994年5月13日 優(yōu)先權(quán)日1993年5月14日
發(fā)明者S·A·德弗里斯, F·C·A·加埃塔, J·J·高迪諾, 鄭忠理, 林正治 申請(qǐng)人:薩依特爾有限公司