專利名稱：細胞基質刺激細胞附著及半橋粒裝配的制作方法
背景技術：
機體的器官形成時，其生長是整齊有序的。通常，一個種類的細胞群與另一個種類的細胞之間由一層稱為基底膜的扁平條帶狀結締組織分隔。例如皮膚，其表層的上皮細胞粘附于其下的基底膜上。這層皮膚基底膜在位于外面的表皮細胞和下面的真皮細胞之間起屏障的作用。類似的細胞排列可見于腸道內(nèi)層。
基底膜影響其上的細胞群的生長、附著、移行、修復和分化?；啄し譃槿龑觓)透明層，是緊帖其上細胞的一層電鏡透明層；b)致密層，是一層寬20-300nm的電子致密層；以及c)層下致密區(qū)，含有固定纖維、微原纖維束和膠原纖維。
很多不同類型的化合物已被定位在基底膜上。其中一些化合物是層粘連蛋白(laminin)、IV型膠原和硫酸肝素蛋白多糖(Verrandoet al.Exp.Cell Res.(1987)，170116-128)。此外，特殊的基底膜含有其它生物活性組份，如nidogen和內(nèi)動素。
表皮細胞用來同基底膜相連接的主要細胞粘附受體稱為α6β4。這種跨膜受體由α6和β4兩個蛋白質部分結合而成。α6和β4蛋白質來源于不同的基因，已發(fā)現(xiàn)這些基因是整合素(integrin)家族中的一部分。
整合素是一族多用的細胞粘附受體。迄今整合素家族中已發(fā)現(xiàn)近20個成員。這些分子與體內(nèi)多種細胞粘附現(xiàn)象有關。整合素是信號分子，可將環(huán)境的信息翻譯為細胞指令。更進一步，整合素也可從細胞內(nèi)向細胞外反向傳遞信號。這一點在非粘附細胞，如淋巴細胞中已被闡明。
T細胞抗原受體或CD3復合物的刺激可增加某些整合素對其相應配體的親合性。使人遺憾的是，在粘附細胞中一直較難證實整合素親合力的改變。盡管如此，Adams等人(Cell，63425-435，1990)描述了一種整合素在分化中的表皮角質細胞中的親合力調節(jié)。因此，由其它受體激活或分化發(fā)動的細胞狀態(tài)改變可影響整合素親合力，并最終影響細胞的粘附行為。更進一步，作為粘附于表面的結果，整合素對于改變細胞形狀或移動可起積極的作用。
很多上皮細胞通過稱為半橋粒的連接方式與其下的細胞外基質相互作用(Staehelin，(1974)Int.Rev.Cytol.，39191-278).近幾年關于此種連接的生物化學特征已有相當可觀的進展(Schwetz，等人，(1990)Annu.Rev.Cell Bio].，6461-491)半橋粒，以及與其相關的結構如中間絲(intermediate filaments)和固定纖維(anchoring fibrils)，形成粘附復合體。上皮-結締組織聯(lián)結的破壞常伴有半橋粒復合體的破壞。例如，在某些皰性皮膚病如大皰性表皮松懈。此處上皮細胞-結締組織間相互作用是異常的，推測其半橋粒的一種基底膜區(qū)相關組分有生化改變或丟失。
利用抗血清已從患大皰性類天皰瘡病的病人中鑒定了半橋粒的兩種高分子量細胞外成分。導致這種自身免疫疾病的是上皮細胞和結締組織之間相互作用的破壞，同時，伴有半橋粒完整性的喪失。(hapmanet al.，(1990)British.J.Dermatol.，123137-144)，相應地，已發(fā)現(xiàn)大皰性類天皰瘡病人產(chǎn)生抗半橋粒組分抗體。兩種半橋粒相關大皰性類天皰瘡抗原(BP)在以前已被描述過(Klatte，et al.，1989)。
BP抗原是一條230kD的多肽，可在半橋粒斑中作為細胞骨架成分的支撐點(Jones and Green，1991)。第二種BP抗原為-II型膜蛋白，含有一個膠原樣細胞外結構域(Giudice，等人。1991；Hopkinson，等人。1992)。此外，已證實半橋粒與其下的結締組織的相互作用與α6β4整合素異二聚體有關(Stepp，et al.，(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，878970-8974Jones，et al.，(1991)Cell Regul.，2427-438；Sonnenberg，etal.，(1991)J.Cell Biol.，113907-917；Kurpakus，etal.，(1991)J.Cell Biol.，1151737-1750)。該α6β4異二聚體已被定位于鼠膀胱癌細胞系804G沿基底表面的半橋粒上(Jones，等人，Cell Regulation(1991)，2427-438)，這些結果提示整合素(例如α6β4)在半橋粒裝配和粘附功能中可能具有重要作用。
本領域已做了多方努力集中精力提純基底膜上的粘附易化蛋白。例如Burgeson，et al.，專利合作條約申請No.WO92/17498，公開了一種他們稱之為Kalinin的蛋白質。據(jù)稱Kalinin可使細胞粘附于底物；不過，顯然這種物質在半橋粒形成方面無活性。參見，Marinkovich，et al.，J.Cell.Biol.(1992)，119695-703(k-laminin)；Rouselle，et al.，J.Cell Biol.(1991)，114567-576(kalanin)；and Marinkovich，et al.，J.Biol.Chem.(1992)，26717900-17906(kalinin)。
與此相似，一種由93.5kD至150kD范圍的多肽構成的約600kD的基底膜糖蛋白已被鑒定，并已知為GB3或nicein，參見，Verrando等人，Biochim.Biophys.Acta(1988)；94245-56和Hsi，等人，Placenta(1987)，8209-217。這些物質中尚無能有效產(chǎn)生半橋粒形成者，無論是在體外還是在體內(nèi)。
絕大多數(shù)上皮細胞在體外培養(yǎng)于組織培養(yǎng)塑料制品上時不能裝配真正的半橋粒，盡管實際上這些細胞顯示能表達所有上述半橋粒斑和跨膜組份。事實上，只是最近才發(fā)現(xiàn)如804G的細胞系在體外常規(guī)培養(yǎng)條件下具有容易地裝配半橋粒的能力(Riddelle等人，(1991)J.Cell Biol.，112159-168；Hieda等人，(1992)J.CellBiol.，1161497-1506)。這些細胞最終可供對半橋粒裝配的動力學作詳盡的細胞和生化分析。
例如，已有報道在體外進入損害部位的804G培養(yǎng)細胞，由抗半橋粒抗體對相關底物的染色明顯減少(Riddelle等人，(1992)J.Cell Sci.，103475-490)。但是，隨著創(chuàng)傷完全閉合，細胞中沿底物附著表面的抗半橋粒染色變得明顯。
然而，許多上皮細胞不按正常的方式附著在組織培養(yǎng)板上，即使使用各種生長因子處理后也是如此。這些細胞不能產(chǎn)生正常的半橋?；蛏L以裝配成其在體內(nèi)的表現(xiàn)型。產(chǎn)生一個在體外能維持上皮細胞生長同時細胞又保持正常表現(xiàn)型的系統(tǒng)具有巨大的優(yōu)越性。
在美國近2百萬人患I型(胰島素依賴型)糖尿病，由于自身免疫異常胰腺的胰島細胞中分泌胰島素的β細胞被破壞，致使胰腺喪失分泌胰島素的功能。雖然胰島素注射可補償β細胞破壞，但血糖水平仍顯著波動。對血中葡萄糖攝取能力的損害導致毒性產(chǎn)物累積的副反應，引起包括失明、腎臟疾病、神經(jīng)損害等并發(fā)癥，以及最終昏迷和死亡。
研究者們試圖用較小劑量，次數(shù)更頻繁的胰島素和機械泵模仿胰腺的功能，但結果遠不夠理想。另一個選擇，胰腺移植，須行大手術且伴有許多并發(fā)癥。而且，供體胰腺數(shù)量有限，使大量糖尿病患者無移植的希望。
迄今最有前途的選擇是利用從尸體或人胎兒來源的組織進行胰島細胞移植。這種方法取得了一定的成功。在全世界利用尸體進行的移植中，約20％的接受者其移植組織存活滿1年。其中10例接受者現(xiàn)在不依賴胰島素，其它接受者胰島素需要量大幅度減少。與胰島細胞移植相關的主要問題包括免疫系統(tǒng)的排異以及在先前位置引起疾病的自身免疫異常如果未被控制，也會破壞移植的胰島細胞。
類胰島細胞簇(ICCs )由一群異種細胞組成。除分化后形成內(nèi)分泌、外分泌和導管組織的上皮細胞外，該細胞簇還包括許多間質細胞，原成纖維細胞和內(nèi)皮細胞。間質細胞的大量存在使問題復雜化，因為這使分化的重要指標，如每細胞胰島素含量的定量變得困難(Beattie等人，(1991)J.Clin.Endocrinol.Metab.，7393-98)。而且.，生長和分化因子對ICCs中的內(nèi)分泌前體細胞的作用效果也因間質細胞的存在而復雜化。
作為胰島細胞的來源，胎兒胰腺組織比成人胰腺有一些優(yōu)越性，包括與其自身體積相比胰島含量高，成熟的內(nèi)分泌細胞較少和增殖能力強(Voss等人.，(1989)Transplantation Proc.，212751-2756)。人們希望胎兒胰島細胞移植能使多數(shù)糖尿病病人在控制血糖水平方面大大減小或去除胰島素依賴性，從而減少最嚴重的糖尿病并發(fā)癥。
早先胰腺細胞培養(yǎng)的嘗試因成纖維細胞的污染而變得復雜化(Leach等人，(1973)J.Endocrinol.，5965-79)。雖然已使用部分消化的胎兒胰腺產(chǎn)生ICCs，但由于每個胰腺僅能得到100-200個細胞簇，其臨床應用受到限制(Sandler等人，(1985)Diabetes，341113-1119；Otonkoski等人，(1988)Acta，Endocrinol.，11868-76)。Kover和Moore(Diabetes，38917-924，1989)從一個17周齡的胎兒胰腺得到200-300個胰島，仍然不夠臨床應用。最后，Simpson等人(Diabetes，40800-808，1991)在牛角膜基質上培養(yǎng)得到能分泌胰島素的無成纖維細胞單層人胎兒胰腺細胞，然而仍末得到可供臨床移植的足夠數(shù)量的細胞。盡管細胞簇中只有少量細胞對不同的胰腺激素染色呈陽性，但這些細胞在移植到裸鼠體內(nèi)后能有效地分化為成熟的內(nèi)分泌細胞(Sandler等人，(1985)Diabetes，341113-1119)。
由于現(xiàn)有的技術不能產(chǎn)生足夠的細胞供常規(guī)移植，因此急需擴展可供移植的胰島細胞庫。
本發(fā)明的概要本發(fā)明的一個實施方案是一種制造的物品，它包括適于在哺乳類體內(nèi)應用的一種制成一定形狀的生物相容性物品和該一定形狀物品上的一種半橋粒形成易化蛋白組合物。有利的是，所述物品上的這種蛋白質組合物是由上皮細胞來源的腫瘤細胞系沉積產(chǎn)生的。這個細胞系優(yōu)選大鼠癌細胞系804G或NBTII。這一優(yōu)選實施方案的另一方面，蛋白質組合物至少含有細胞系804G產(chǎn)生的細胞外基質中大約100kD、135kD、140kD、150kD或400kD蛋白質中的一種。這一物品由膠原、再生膠原或聚乳酸包被可能是有利的，還可由生物相容的金屬包被或制造。這種金屬優(yōu)選為不昏銹鋼或鈦。另外，這一物品還可由陶瓷材料制造或包被。這種材料優(yōu)選為羥磷灰石。這一優(yōu)選實施方案的另一方面，這種物品由合成多聚體制成或包被。這種多聚體優(yōu)選為聚酯或尼龍。
本發(fā)明的另一實施方案是一種用于培養(yǎng)哺乳動物細胞的組合物。這種組合物在可藥用的載體中含有哺乳動物細胞的細胞外基質蛋白質，其中這種蛋白質有促進與其接觸的細胞半橋粒形成的特性。
本發(fā)明的一項附加實施方案是實際上以分離形式存在的由細胞系804G產(chǎn)生的蛋白質性的細胞外基質蛋白質。
本發(fā)明還有另一實施方案是一種基本上由150kD 804G基質蛋白質構成的具有促進半橋粒活性的已分離的多肽。所述150kD 804G基質蛋白質包含序列SEQ ID NO1。
另一優(yōu)選的實施方案提供產(chǎn)生供同種移植用的皮膚的方法，該方法包括在制成一定形狀的物品上培養(yǎng)表皮細胞和在促進皮膚生長條件下使細胞生長。
本發(fā)明的一項進一步實施方案是一種促進表皮細胞粘附于目標表面的方法，該方法包括用804G基質包被該表面。該細胞優(yōu)選牙周細胞。本優(yōu)選實施方案的另一方面，細胞粘附發(fā)生在體外。另外，細胞粘附也可在體內(nèi)發(fā)生。
本發(fā)明的另一方面，提供了一種通過將細胞在有一種或多種發(fā)現(xiàn)于804G基質的蛋白質存在的條件下培養(yǎng)，促進內(nèi)分泌前體細胞生長的方法。內(nèi)分泌前體細胞優(yōu)選為胰腺胰島細胞前體。本實施方案進一步提供，在開始培養(yǎng)步驟之前，用酶消化胎兒胰腺并將消化的組織在培養(yǎng)基中溫育直至類胰島細胞聚集形成。胰腺優(yōu)選為哺乳動物的。最優(yōu)選胰腺是人的并且804G基質蛋白質是附著在一種底物上的固相蛋白質。本發(fā)明的另一方面提供804G基質來源于804G大鼠膀胱癌細胞。
本發(fā)明的另一項實施方案是一種方法，通過生產(chǎn)擴展的內(nèi)分泌前體細胞并將這些細胞移植入哺乳動物，產(chǎn)生產(chǎn)激素細胞。優(yōu)選這些細胞為胰腺胰島細胞，激素為胰島素并且移植部位為腎臟、肺或肝。
本發(fā)明也提供了擴展的內(nèi)分泌前體細胞，優(yōu)選胎兒胰腺胰島前體細胞。
詳細描述本發(fā)明包括一項發(fā)現(xiàn)即某些細胞系能產(chǎn)生細胞外基質，此種基質可刺激隨后在此基質上生長的其它細胞的細胞粘附和半橋粒裝配。一種這樣的細胞系是膀胱癌細胞系804G，這一細胞系已被Izumi等人(Cancer Res.，41405-409，1981)描述過并在發(fā)明人JonathanC.R.Jones的實驗室永久保存，可隨時從他那兒得到。這一細胞系也可從Ryoichi Oyasu，伊利諾斯芝加哥西北大學醫(yī)學院病理學系(Department of Pathology，Northwestern University MedicalSchool，Chicago，Illinois)得到。804G細胞系還作為一項布達佩斯條約(Budapest Treaty)專利保藏在美國典型培養(yǎng)物保藏中心，Rockville，Maryland，USA，登記號為ATCC CRL 11555，1994年2月24日保藏。
一種特別有用的804G基質蛋白質(150kD蛋白質)的一部分已被測序，這一部分序列在本文列為SEQ ID NO1。本發(fā)明包括含有序列SEQ ID NO1的150kD的半橋粒形成易化蛋白質。
超微結構方面的研究數(shù)據(jù)證明804G基質可誘導許多細胞產(chǎn)生成熟的半橋粒并粘附于其生長底物。進一步，還發(fā)現(xiàn)804G基質含有一種摻予半橋粒裝配的新的類整合素分子(與本領域以前提純的整合素和相關分子不同)。
現(xiàn)在一種由細胞，例如804G細胞產(chǎn)生的新的基質可被制備，這種基質能調節(jié)在其上生長的無關細胞的半橋?？乖慕M織。這種作用顯示對半橋粒成份具有特異性，因為本發(fā)明的維持在基質上生長的細胞粘附斑(adhesion plaque)成份的位置沒有明顯的變化。
為論證這一新的發(fā)現(xiàn)，本文提供了鼠804G基質能夠誘導人上皮癌(SCC12)細胞裝配“成熟”半橋粒的證據(jù)。應該意識到，鼠細胞中發(fā)現(xiàn)的化合物能對人的組織產(chǎn)生如此深的影響這一點是不同尋常的。在這些下文將更詳細描述的試驗中，發(fā)現(xiàn)在804G基質上培養(yǎng)的SCC12細胞比在大鼠尾膠原上培養(yǎng)的對照試驗SCC12細胞半橋粒樣結構的數(shù)量增加。而且，在804G基質上生長的細胞半橋粒樣結構絕大多數(shù)與細胞基質接觸并且具有基底致密板(basal dense plates)?；字旅馨褰?jīng)常被用作半橋粒成熟或已形成的指標(Krawczyk和Wilgram，J.Ultrastruct，Res.，4593-101，1973)。
雖然具體公開了與產(chǎn)生和分離804G細胞基質相關的方法，應該意識到任何有能力支持細胞粘附和半橋粒裝配的細胞基質均在本發(fā)明的范圍內(nèi)。其它細胞類型(如鼠膀胱癌細胞系NBTII(ATCC CRL 1655))的基質亦顯示能夠在體外誘導附著和半橋粒裝配。NBTII細胞系也作為布達佩斯條約專利保藏在美國典型培養(yǎng)物保藏中心，Rockville，Maryland，USA，登記號為ATCC CRL11556，1994年2月24日保藏。應該指明，“804G基質”一詞用來泛指任何能刺激細胞附著和半橋粒形成的任何細胞基質。
本發(fā)明的基質的活性成份的一項主要用途是用于細胞生長和附著。用此種基質或由其提純的半橋粒促進成份包被細胞在其上生長的底物。然后將要培養(yǎng)的細胞鋪板或接種在底物上，使細胞在基質上生長。這些細胞，包括體外的和體內(nèi)的人類細胞將有序地在底物上生長并形成半橋粒。形成半橋粒有重大的優(yōu)越性，因為它大大增加了細胞對底物的附著。更進一步，與在不含本發(fā)明的基質上生長的細胞相比，在此基質上生長的細胞明顯更有序，更與組織相似。
本文使用的底物可為壓何希望使用的底物。作為實驗室應用，底物可以簡單到是玻璃或塑料。作為體內(nèi)應用，底物可為任何細胞能在其上生長的生物相容材料。合適的底物材料包括由下述材料制成或包被的一定形狀的物品，如膠原；再生膠原；聚乳酸；生物相容金屬如不銹鋼或鈦；包括如羥磷灰石修復材料的陶制材料；合成多聚體，包括聚酯和尼龍；實際上包括任何生物分子能夠易于粘附的其它材料。
本發(fā)明的一項特殊用途是產(chǎn)生供同種移植用的皮膚。例如，將表皮細胞種植于本發(fā)明的底物上。使用常規(guī)的皮膚生長條件，包括營養(yǎng)和生長因子，在底物上培養(yǎng)這些細胞。本發(fā)明的改進在于在底物上使用半橋粒促進基質，促進皮膚的體外生長，優(yōu)于本領域不使用這些基質的先有技術。
本發(fā)明的一項具體應用是增加表皮細胞對目標表面的粘附。例如，可用804G基質處理牙移植假體以刺激牙周細胞附著。類似地，也可用此種基質包被現(xiàn)存的牙齒作為對牙齦(結合上皮)疾病，例如齦炎的治療。若底物由天然材料或合成的生物學可侵蝕材料例如交織的或鍵合的膠原或聚乳酸，制成片狀或纖維狀，可將基質材料加在其表面或混入其組份。然后可使細胞(如表皮細胞)在體外在基質上生長，形成可移植或植入材料；另外，也可將材料植入而細胞可在體內(nèi)附著。
在本發(fā)明的一項具體實施例中，通過直接培養(yǎng)基質分泌細胞或將基質包被在具體物品上應用基質。構成本發(fā)明具體實施方案的這些物品包括與上皮細胞接觸或穿過上皮細胞放置的任何可供植入的物品。具體包括，例如，從個體的內(nèi)部延伸穿出皮膚到體外的物品。這些物品包括電極，其它傳感器，針、插管，導管，osteum裝置，縫線，骨固定針，螺釘，板，小棍，牙移植物，用于口腔或作其它用途的鈦螺釘和牙槽，塑料外科器具包括組織擴張器，以及整容移植用的天然的或人工頭發(fā)。所有這些物品均可用一種或多種本發(fā)明的半橋粒易化蛋白質包被或在其結構中摻入。
眼科移植物包括由任何合適的材料，如硅、天然或合成膠原及類似物制成的可移植的晶狀體也包括在本發(fā)明的范圍中。還有，膠原接觸透鏡或其它永久接觸透鏡也可包被或在其中加入本發(fā)明的蛋白質或基質使透鏡永久附著在角膜上。
本發(fā)明的另一優(yōu)選實施方案是培養(yǎng)更多數(shù)量的內(nèi)分泌前體細胞。特別令人感興趣的是胰腺的胰島細胞前體。例如，可在一種或多種804G基質類型蛋白質存在的條件下體外培養(yǎng)胎兒胰腺的類胰島細胞簇，供移植于糖尿病患者。這些基質蛋白質會增加供移植的胎兒ICCs的產(chǎn)量從而解決已存在的大量需求這些細胞的問題。由于NBTII大鼠膀胱癌細胞系的基質也可促使表皮細胞生長增加，可以預想也可將其用于培養(yǎng)胎兒胰腺的ICCs，如同任何這樣的“804G”基質蛋白質。804G基質包括所有這些由細胞系分泌的能夠促進表皮細胞半橋粒形成的蛋白質。另外，在ICCs培養(yǎng)基中加入生長因子將進一步增加胎兒胰腺ICCs的產(chǎn)量。
在移植入哺乳動物，優(yōu)選人類體內(nèi)后，所得的細胞簇將分化為有功能的胰腺內(nèi)分泌細胞，從而減少或消除對胰島素注射的需要。令人有興趣的是，804G基質蛋白質具有跨物種的活性；甚至大鼠膀胱癌來源的基質有促進人組織生長和半橋粒形成的能力。
804G基質蛋白質也有助于研究半橋粒形態(tài)發(fā)生，α6β4整合素與細胞外基質的相互作用，并有助于新的基質成份如下面描述的層粘連蛋白(laninin)R2t樣大鼠分子的功能與結構的分析。事實上，804G基質可能會被證明為一種在分子水平確定上皮細胞與其下的結締組織間半橋粒介導的相互作用的工具。
本發(fā)明的804G基質包括4種約為135kD，140kD，150kD，和400kD的伴刀豆球蛋白結合的糖基化蛋白質和一種約100kD的非糖基化、無伴刀豆球蛋白的蛋白質，這幾種蛋白質均被針對804G基質產(chǎn)生的多克隆抗體識別。本發(fā)明可由804G細胞產(chǎn)生的完全的活性基質或其它細胞產(chǎn)生的功能相同的基質實現(xiàn)，也可由任何一種促進半橋粒形成的基質的單一蛋白質成份實現(xiàn)。(這些成分可通過分離每一種成份并按照本文描述的方法檢測之來經(jīng)驗地確定)。
除活性基質及其活性成份外，本發(fā)明也包括包被有那些物質的制成一定形狀的物品。優(yōu)選地，那些制成一定形狀的物品由玻璃以外的材料制成，包括這樣的形式如薄片，纖維，假體，金屬物品，生物可鋟蝕物品，和可移植物品。
更進一步，考慮由活性基質或其活性成分制作藥物制劑。這些制劑可制成任何適當?shù)男问剑⑶乙话惆钚猿煞忠约芭c之結合的任何公知的可藥用的載體。這些基質材料可從適當?shù)幕|沉積細胞(matrix-depositing cells)的生長表面收獲(通過刮，擦，或用低濃度的SDS處理)。或者，也可用合成方法或通過重組DNA技術，或通過提純沉積的基質材料制備基質材料。載體包括注射用載體，局部用載體，經(jīng)皮的載體及其類似物。制劑優(yōu)選局部給藥形式，如軟膏劑，凝膠劑，霜劑，噴霧劑，膠體分散劑，懸浮液劑，或糊劑。制劑更優(yōu)選包括常規(guī)組成和數(shù)量的防腐劑、抗菌素、抗真菌劑、抗氧化劑、滲透劑，以及類似物質。本發(fā)明組合物的配方，參閱Remington′sPharmaceutical Sciences，15th Ed.，Mack Publishing Co.，Easton PA(1975)可得幫助。
最后一點，各種類型的上皮細胞可在本文預期的底物上或在具有本文預期的組合物的條件下生長。
實施例1制備804G細胞基質我們按照Gospodarowicz(1984)的步驟開始研究804G細胞分泌的基質的生物化學特性。簡單地說，大鼠膀胱癌804G細胞(AmericanType Culture Collection，Rockville，MD；ATCC CRL 11555)在37℃具有Earle′s鹽(salts)的MEM中培養(yǎng)，MEM中加入50μg/ml青霉素，50μg/ml鏈霉素和10％胎牛血清(Gibco，GrandIsland，NY)。培養(yǎng)液中含有約1.9mM Ca2+。
804G細胞在陪替氏培養(yǎng)皿(Petri dishes)或蓋玻片上培養(yǎng)至融合。棄去培養(yǎng)液并用滅菌的PBS洗滌細胞。用滅菌的20mM NH4OH處理5分鐘，然后用滅菌的蒸餾水快速洗滌3次；將細胞從基質上洗脫。
用pH6.8，含8M尿素，1％十二烷基磺酸鈉(SDS)的10mMTris溶解將基質從底物上分離。使用本領域技術人員公知的常規(guī)實驗方法，通過十二烷基磺酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分析804G基質多肽全貌。
將約20μg的溶解的804G細胞基質制劑置上樣于丙烯酰胺凝膠上予以電泳。作為對照，洗脫的804G細胞的提取物也上樣于丙烯酰胺凝膠上，每泳道約20μg。經(jīng)凝膠電泳，我們發(fā)現(xiàn)基質制劑里有3種主要多肽，分子量范圍在150-135kD?；|制劑還存在一種100kD的次要多肽。經(jīng)過聚丙烯酰胺凝膠電泳后，用標準的公知的方法將分離的多肽轉移至硝化纖維素上。將經(jīng)染色的蛋白質樣本的酰胺氨基黑染色斑轉移至硝化纖維素(濾膜)標志著成功地完成了Western印跡步驟。
實施例2伴刀豆球蛋白結合于804G基質將含有分離的基質蛋白的一條Western印跡硝化纖維素(濾膜)與伴刀豆球蛋白A溫育。先用含2％(w/v)聚乙烯吡咯烷酮的PBS在室溫下溫育此條帶30分鐘，阻斷基質分子的非特異性蛋白的結合。將伴刀豆球蛋白A加入阻斷緩沖液，然后將該濾膜在室溫下輕輕搖蕩溫育。加入馬紅羅卜過氧化物酶(Harse radish pero xidase)(HRP)使伴刀豆球蛋白A的結合可見。
伴刀豆球蛋白識別135，140，150和400kD的4種基質多肽。如同在本領域公知的，伴刀豆球蛋白A結合表示這些基質組分為糖基化的。為鑒定(identify)Western印跡上基質特異的蛋白，我們制備了多克隆和單克隆抗體。
實施例3抗804G基質多克隆抗體的生產(chǎn)將上面描述的尿素/SDS溶解的804G細胞基質用標準方法注射入家兔制備抗血清。簡而言之，將溶解的804G基質與弗氏佐劑混合，注射入家兔。按照Harlow和Lane(AntibodiesA LaboratoryManual，pp.116-117 and pp.222-223，Cold SpringHarbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY)詳述的方法，一次加強劑量注射后間隔3周收集血清。
分離的多克隆抗血清(J18)含有抗體，既可識別結合伴刀豆球蛋白A的4種135-400kD的多肽又可識別100kD的多肽。因此，看來基質中除有4種糖基化多肽外還有一種非糖基化的100kD的多肽。
繼我們的多克隆抗體的實驗后，我們用下述方面生產(chǎn)了對804G基質特異的單克隆抗體。
實施例4生產(chǎn)抗804G基質的單克隆抗體用溶解的804G細胞基質注射入數(shù)只小鼠制備抗804G細胞基質的小鼠單克隆IgG(5C5)。在首次注射后2和3周，對小鼠進行804G基質加強注射。最后一次加強后5天取其脾，而后使用標準方法(Galfre和Milstein，(1981)Meth.Eyzymol.733-46)將分離的脾細胞與骨髓瘤細胞系Sp2進行融合產(chǎn)生雜交瘤。雜交瘤細胞產(chǎn)生的抗基質成份抗體按照其對基質樣本的免疫印跡和免疫熒光反應加以選擇。被選擇的雜交瘤細胞按照Harlow和Lane(1988)描述的方法經(jīng)有限的細胞稀釋進行兩次克隆。
一種小鼠單克隆IgG抗體(5C5)的Western印跡只識別基質制劑中的150kD和140kD多肽。隨后將抗體5C5和J18血清用于免疫沉淀研究，以研究基質中潛在的蛋白質-蛋白質相互作用。
實施例5對基質的免疫沉淀研究使用常規(guī)方法對804G細胞進行免疫沉淀。簡而言之，將804G基質用RIPA緩沖液(0.1M Tris-HCl，pH7.2，含有0.15M NaCl，1％Triton X100，0.1％SDS，1％脫氧膽酸鈉，10mM EDTA，1mM苯甲基磺酰氟)處理，離心澄清，然后與兔血清J18或單克隆抗體5C5溫育。用本領域技術人員公知的方法，采用金黃色葡萄球菌蛋白質A對所形成的抗原-抗體復合物進行免疫沉淀。
免疫沉淀的分子用SDS-PAGE分離并轉至Western印跡，所用方法上文已較詳細地描述。凝膠上的泳道1和泳道2用羊抗兔或羊抗小鼠抗體予以免疫印跡，用HRP結合使之可見。
多克隆抗體J18識別基質和5C5免疫沉淀物兩者中相似的多肽組。兩種樣本中所見的主要蛋白質帶均在150，140和135kD。這一結果表明J18血清含有抗基質所有主要蛋白的抗體。
5C5抗體主要識別804G基質和J18免疫沉淀物中的150kD和135kD多肽。5C5抗體顯然可沉淀基質中被J18血清抗體識別的所有分子種類。與此形成對照的是5C5抗體只識別基質(制劑和J18血清免疫沉淀物兩者中150和135kD多肽。由于5C5抗體能沉淀大部分基質蛋白質，然而只鑒定出變性膠上的兩種蛋白質，我們相信這些主要蛋白質在正常狀態(tài)下彼此互相作用和互相聯(lián)系。因此，認為這兩種主要804G基質蛋白質由含有上面鑒定的各種蛋白質的亞單位構成。
為研究804G基質的蛋白質組份，我們用抗Engelbreth-Holm-Swarm(EHS)層粘連蛋白400kD和200kD鏈的多克隆抗血清探測溶解的基質蛋白質的Western印跡。
實施例6用抗層粘連蛋白抗體探測基質蛋白質的Western印跡抗EHS層粘連蛋白400kD和200kD鏈的多克隆抗體購自Collaborative Recearch Incorporated(Bedford，MA)將層粘連蛋白制劑(約每泳道10μg)和溶解的804G細胞基質制劑(約每泳道20μg)變性后在SDS膠上電泳，然后轉至硝化纖維素(濾膜)。我們注意到用于1泳道和2泳道電泳的蛋白質的酰胺氨基黑染色斑(amido black stain)被轉至硝化纖維素濾膜，表明Western印跡是成功的。
層粘連蛋白泳道與HRP結合的抗層粘連蛋白多克隆抗體保溫引起了強反應，但在層粘連蛋白多克隆抗體和804G細胞基質制劑之間幾乎沒有可檢測的反應。在一個相關的實驗中，Westem印跡分別被免抗804G多克隆抗血清J18或單克隆抗體5C5的標記樣品免疫印跡。正如上面描述的在先的實驗所預期的，這些抗體不能識別任何層粘連蛋白多肽，但確能識別基質制劑中的多肽。
看來在層粘連蛋白和804G基質間幾乎沒有抗體交叉反應。因此，我們試嘗分離表達與J18抗804G抗體反應的多肽的基因。
實施例7對應基質多肽的克隆的分離人角質細胞lamda gt.11表達庫(expression library)購自Clontech Labs.，Inc.，Palo Alto，CA并用804G基質多克隆抗血清J18按Huynh等人的方法(DNA CloningA PracticalApproach，VolumeI，D.Glover，ed.，IRL Press，Oxford，1985)篩選。被兩個克隆的融合蛋白質產(chǎn)物吸收的抗體顯示對804G基質制劑和SCC12細胞全細胞提取物中140kD和100kD分子量種類有活性。J18血清也用于對大鼠804G表達庫的篩選。從兩個獨立的克隆來源的抗140/100kD多肽成分的抗體被表位選擇，這兩個獨立的克隆顯示與最近被鑒定的被稱為層粘連蛋白B2t(Kallunki等人，(1992)J.Cell Biol.，119679-695)的層粘連蛋白B 2鏈變體的IV結構域的94個殘基和I/II結構域的86個殘基有大于85％的一致性。在EHS層粘連蛋白中不包含B2t變體，因此B2t變體代表一種新的亞單位。另外，從5個克隆的抗大鼠150kD組分的抗體被表位選擇，這5個克隆已被分離。
為進一步確定陽性克隆的特性，應用硝化纖維素結合的融合蛋白的噬菌斑lifts表位選擇抗體(Sambrook等人，(1989)MolecularCloningA.Laboratory Manual，2nd ed.，Cold SpringHarbor Press，Cold Spring Harbor，NY)。插入的cDNA被亞克隆(subclone)到M13載體上并用Sanger雙脫氧鏈終止法(Sanger，等人，(1977)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，745463-5467)測序。使用GCG序列分析軟件包(University ofWisconsin Biotechnology Center，Madison，WI)進行序列分析。
140kD克隆的核苷酸序列顯示它編碼人類層粘連蛋白B2tI/II結構域跨越550-810氨基酸的一個區(qū)段(region)。這一實驗說明基質相關多肽與層粘連蛋白B2t變體的交叉反應。150kD克隆編碼區(qū)段呈現(xiàn)與果蠅層粘連蛋白A鏈相似的序列(Garrison等人，(1991)J.Biol.Chem.，26622899-22904)。大鼠150kD序列(SEQID NO1)的294個氨基酸與果蠅層粘連蛋白A鏈(SEQ ID NO2)的氨基酸殘基2365-2724之間總的序列一致性為25％，將大鼠與果蠅進化上的差異考慮在內(nèi)，這是顯著的重疊。SEQ ID NO1與人類merosin(SEQ ID NO3)，一種層粘連蛋白A異構型，的氨基酸1634-1970也呈現(xiàn)21％的一致性。
在這項實驗之后我們試圖確定在完整組織樣品中804G基質多肽的位置。
實施例8在完整的組織中804G基質抗原的免疫熒光定位用5C5單克隆抗體和J18多克隆抗體處理804G細胞，以進行免疫熒光。首先，在抗體溫育前，804G細胞用丙酮在20℃固定并抽提2-3分鐘。雙標記按下述方式進行。
首先將蓋片上的細胞在第一抗體的混合物中在37℃溫育1小時。將蓋片在PBS中進行充分的洗滌，然后用公知的方法在蓋片上鋪涂堿性蕊香紅和熒光素結合的第二抗體的適當?shù)幕旌衔?。?jīng)處理的組織用裝配有表面熒光鏡的ZeissIII顯微照相機觀察，而培養(yǎng)的細胞則用裝備有氬和氦氖激光用以雙重熒光聚焦成像的Zeiss激光掃描顯微鏡來觀察(LSM10)(Carl Zeiss，Thornwood，NY)。作為免疫熒光分析的對照組，細胞單獨和正常小鼠、大鼠或兔IgG溫育，也單獨和第二抗體溫育以估計由非特異抗體結合引起的染色。
通過免疫熒光顯微鏡觀察J18血清，5C5抗體和用層粘連蛋白B2t融合蛋白質從J18血清中選出的抗體均定位于大鼠上皮組織的冷區(qū)(cryo-sections)。所有這些抗體制劑都沿上皮-結締組織相互作用區(qū)顯示強烈染色。
所有上述實驗均與804G基質的結構與功能有關。至此，我們已確定免疫學上804G基質肽與B2t層粘連蛋白變體有關，并且發(fā)現(xiàn)抗基質蛋白質的抗體位于上皮-結締組織交界處。
本發(fā)明的一個重要的方面是，我們發(fā)現(xiàn)上面詳述的804G基質可意外地提供能刺激上皮細胞在體外生長的底物。我們發(fā)現(xiàn)在804G基質上生長的上皮細胞可產(chǎn)生半橋粒，形態(tài)學上與正常細胞在體內(nèi)的表現(xiàn)相同。為闡明本發(fā)明的這一方面，我們進行了下述實驗。開始，我們在804G基質上培養(yǎng)SCC12人類腫瘤細胞系以確定它的對體外正常生長的潛在作用。
實施例9對在804G基質上生長的上皮細胞的功能分析抗半橋粒230kD空斑組份的抗體在以前已被詳細描述過(Klatte等人，1989)。Hopkinson等人(1992)和Riddelle等人(1992)已描述過抗半橋粒180kDII型膜成份胞漿結構域(Cytoplasmic domain)(N-末端)的單克隆和多克隆抗體。抗β4整合素亞單位的抗體購自Telios(San Diego，CA)。
SCC12細胞在804G細胞基質上維持培養(yǎng)24小時以評估在腫瘤細胞系中該基質對半橋粒蛋白質定位的影響。在正常情況下，腫瘤細胞系在體外不裝配真正的半橋粒。我們選擇在24小時內(nèi)結束實驗以減少基質降解和/或由所增加的細胞引起的基質改變，這種可能性Carter等人(1990)已予討論。每一實驗至少重復4次，包括分析500多個細胞。作為對照，SCC12細胞鋪板于其它基質上，如玻璃和大鼠尾膠原。24小時后將細胞用抗半橋粒230kD、180kD和α6β4整合素組份的抗體處理，用抗804G細胞基質的抗體雙標記，進行間接免疫熒光分析。
蓋片上的細胞先在第一抗體的混合物中在37℃溫育1小時。將蓋片在PBS中充分洗滌，然后用堿性蕊香紅和熒光素結合的第二抗體的適當混合物覆蓋。經(jīng)處理的組織用裝配有表面熒光鏡的III型Zeiss顯微照相機觀察。作為對照組，細胞單獨同正常小鼠、大鼠或兔IgG溫育，也單獨同第二抗體溫育以估計由于非特異性背景引起的染色。
在培養(yǎng)于玻璃和大鼠尾膠原上24小時的SCC12細胞中230kD，180kD，α6β4整合素亞單位沿基質附著表面定位于細胞外圍。有時染色象環(huán)繞細胞外圍的一條模糊的帶，或接近細胞邊緣的線狀條帶(參見Hopkinson等人，1991)。在培養(yǎng)于大鼠尾膠原上的細胞中，J18血清中的抗基質抗體沿細胞-底物相互作用(Cell-substrateinteraction)區(qū)產(chǎn)生彌漫的染色，與由半橋?？贵w探針產(chǎn)生的染色無明顯相關。J18抗體與SCC12細胞的免疫熒光反應，與使用用人層粘連蛋白B2t融合蛋白從J18血清中選擇的抗體引起的陽性免疫印跡反應是一致的。由于單獨用J18血清中的抗體不能識別大鼠尾膠原，我們的結果提供與SCC12細胞自身分泌的基質有關的一些特征(indication)。
在804G細胞基質上維持培養(yǎng)的SCC12細胞，與在大鼠尾膠原或玻璃上維持培養(yǎng)的細胞相比，230kD，180kD和α6β4整合素表現(xiàn)出分布型的顯著不同。這些半橋?？贵w產(chǎn)生的分布型類似于如上所述用同樣的抗體處理后進行免疫熒光的804G細胞中所見者。而且，在大多數(shù)情況下，這些染色顯示與全J18血清中的抗體所產(chǎn)生的分布型一致。
此外，5C5抗體或由整合素B2t融合蛋白質(表位)選擇的那些J18抗體也集中于在804G基質上維持培養(yǎng)的SCC12細胞。這些抗體的分布與230kD半橋粒斑成份的分布做了比較。應該指出SCC12細胞中230kD抗原的分布反映由5C5和表位選擇的抗體產(chǎn)生的染色的分布。
進行免疫印跡分析以檢測在804G細胞基質上維持培養(yǎng)24小時與在其它基質上維持培養(yǎng)同樣長時間相比，SCC12細胞中230kD和180kD兩種半橋粒組分的總量是否有改變。按本方法估測，在不同基質上培養(yǎng)的SCC12細胞中230kD和180kD兩種多肽的總量無明顯不同。
與半橋粒成分形成對照，α5β1整合素復合體，一種微絲相關粘附斑成分(Burridge等人，1988)，主要定位在SCC12細胞底物相關表面的外圍(peripheral cell-substratum associatedsurface)，不管細胞是在大鼠尾膠原上還是在804G細胞基質上維持培養(yǎng)。
我們對在804G基質上的上皮細胞的生長的研究不僅限于SCC12細胞。與上面討論的SCC12細胞相比，正常人角質細胞(從人類包皮衍生)，HaCaT(永存(immortalized)細胞)，和SCC13細胞在804G基質上生長時也表現(xiàn)幾乎一致的反應。在這些類型細胞的每一種中，在804G基質上的生長導致整合素的再分布和成熟的半橋粒的形成。
此外，類似上面所述的實驗也已在NBTII細胞系(American TypeCulture Collection，Rockville，MD；ATCC CRL 11556)產(chǎn)生的基質上進行了。這些實驗的結果與804G基質上進行的實驗的結果實質上是一致的。在NBTII基質上生長的細胞被刺激形成成熟的半橋粒，并使細胞內(nèi)整合素重新分布。
為進一步研究在804G基質上培養(yǎng)上皮細胞的效果，我們在電鏡下觀察了SCC12細胞。
實施例10804G細胞基質對SCC12細胞半橋粒裝配的影響的電鏡檢查用已有人描述的方法(Riddelle等人，1991)固定并加工SCC12細胞供電鏡檢查。垂直于底物作細胞的薄切片，將切片放在300網(wǎng)眼電鏡方格網(wǎng)上(Tousimis Corp，Rockville MD)，染色，然后用JEOL 100 CX電鏡在60千伏下觀察。
不論是在大鼠尾膠原上還是在804G基質上維持培養(yǎng)的SCC12細胞，均做常規(guī)電鏡檢查。這一步驟涉及貫穿一群細胞，垂直于底物的間隔10微米所切的SCC12細胞薄切片的分析。通過分析相隔這樣距離的切片可避免觀察同一個半橋粒超過一次的可能性。
在維持培養(yǎng)于大鼠尾膠原上24小時的SCC12細胞，觀察到半橋粒樣結構指向細胞外圍。在17個在大鼠尾膠原上培養(yǎng)的SCC12細胞中，我們觀察到9個半橋粒樣結構，其中沒有一個具有基底致密板。這一計數(shù)在308微米的距離上作出(也就是，1個半橋粒樣結構/34微米SCC12細胞腹側表面)。只在一線顯微照片中見到3個半橋粒樣結構緊密并置，但是，這是極其少見的。在培養(yǎng)于大鼠尾膠原的SCC12細胞的很多基底剖面觀察不到半橋粒。
與此相對照，在培養(yǎng)于804G基質上的SCC12細胞的縱切面上，觀察到103個半橋粒樣結構，其中92個具有基底致密板。這一觀察是在504微米的距離上作出的(即，1個半橋粒樣結構/4.9微米SCC12細胞腹側表面)。與在培養(yǎng)于大鼠尾膠原上的細胞中所見的“發(fā)展不完全的”半橋粒不同，這些半橋粒樣結構不限于細胞的外圍，而且在細胞核的下面也見到。這些SCC12細胞還顯示具有與胞漿面相聯(lián)的中間絲叢。
除對SCC12細胞進行電鏡觀察外，我們還觀察了人角質細胞，HaCaT細胞，和SCC13細胞中的半橋粒裝配。如上面免疫熒光實驗所報告的。這些其它哺乳類上皮細胞的每一種都開始整合素重新分布和形成成熟的半橋粒。我們的電鏡研究揭示804G基質對SCC12細胞，人角質細胞，HaCaT細胞和SCC13細胞的作用具有顯著的相似性。
為了證實804G細胞基質在溶解后能保持誘導上皮細胞內(nèi)部變化的能力，我們用溶解的基質成分包被玻璃蓋片。
實施例11使用804G基質成分的照相平板印刷術為確定分離的基質樣本是否保持其誘導半橋粒和整合素位置改變的活性，按上面描述的方法培養(yǎng)804G細胞并將其從其基質上除去。使用緩和的SDS緩沖液(RIPA)將基質溶解并將基質從生長底物中除去?；|成分溶解于RIPA緩沖液后，用磷酸鹽緩沖溶液充分透析，然后應用由Hockberger等人(J.Neurosci.(1988)8(11)4098-4120)描述的照相平板印刷技術將其以顯微鏡型包被在玻璃蓋片上。
簡言之，首先用光致抗蝕劑旋轉包被一張清潔的蓋片。在光致抗蝕層上面放置遮蓋物，然后用紫外線照射。在所有未被遮蓋物覆蓋的點上，光致抗蝕劑由于紫外線的照射與玻璃蓋片交聯(lián)。然后經(jīng)透析的804G基質成分被加在蓋片上并沿整個蓋片表面結合。用丙酮處理，將光致抗蝕劑和與其結合的基質成分從蓋片的非紫外線交聯(lián)區(qū)除去。與遮蓋物形狀相反的，構成特定形狀的804G基質成分被保留下來供進一步實驗。
在用我們的基質多克隆抗血清進行免疫熒光研究中，我們證實在這些蓋片上培養(yǎng)的SCC12細胞按照沉積的804G成分的形狀形成半橋粒。值得注意的是在這些蓋片上生長的SCC12細胞上的β4整合素的位置也與沉積的基質的形狀一致。這表明基質在經(jīng)溫和的SDS變性和沉積在固體底物上后保持其功能。按此方案(protocal)，其它固體底物也可用804G基質包被以刺激上皮細胞半橋粒形成。
從而，我們證明了804G細胞基質能在許多類型的哺乳類細胞中誘導附著和半橋粒裝配。
實施例12體外擴展胎兒胰腺的胰島細胞人胎兒胰腺在冷的Hank′s平衡鹽溶解(HBSS)中切成1mm大小的醉塊，在37℃水浴中強有力的搖蕩下用膠原酶P消化15分鐘。在4℃用HBSS洗數(shù)次后，將經(jīng)消化的組織用冷的HBSS洗滌并放置于含RPMI-1640培養(yǎng)液的陪替氏培養(yǎng)皿中培養(yǎng)3天。RPMI-1640培養(yǎng)液中包含10％混合的人血清和抗菌素。選擇地，在這一步驟中加入一種生長因子。
近50個大小一致的(50-75μm直徑)外形均質半透明的ICCs用手工挑取并鋪板于包被有804G基質或牛角膜基質的組織培養(yǎng)皿上。培養(yǎng)液為RPMI-1640，含有15％馬血清，5％胎牛血清，抗菌素和，選擇地，一種生長因子。ICCs過夜貼壁生長，通常24小時形成單層細胞。與不加基質或培養(yǎng)于牛角膜基質上者相比，培養(yǎng)于804G基質上的ICCs數(shù)量明顯增加。
為確定這些胎兒內(nèi)分泌細胞能否在體內(nèi)分化為產(chǎn)胰島素細胞，將ICCs按下述方法進行移植。
實施例13ICCs移植于裸鼠將實施例12中培養(yǎng)于804G基質上的ICCs移植于無胸腺裸鼠的腎包膜下(每只小鼠約500個ICCs)，3個月后對移植物進行分析。在腹膜內(nèi)葡萄糖激發(fā)后，用放射免疫分析方法可測到被移植動物血中的人類C肽水平增加，C肽是胰島素前體分子經(jīng)加工后釋放入血中的。這一結果說明被移植的細胞能產(chǎn)生胰島素。另外，用抗胰島素抗體對移植細胞進行的免疫細胞化學分析表明前體細胞分化為產(chǎn)胰島素細胞。
實施例14ICCs移植于糖尿病病人在臨床研究中，對糖尿病病人給藥大量的胎兒ICCs以使病人得最佳治療。推測起來，這一數(shù)目應接近于用于成人產(chǎn)生細胞的數(shù)目，約2-8×105，可移植于腎包膜下或直接注射入肝臟。另外，也考慮了其他異位器官位置的移植。監(jiān)測C肽產(chǎn)生和血糖水平幾個月以確定移植的內(nèi)分泌前體細胞是否分化為產(chǎn)胰島素細胞。在監(jiān)測階段，仍對病人給藥胰島素。
應該指出本發(fā)明不僅限于在“詳細描述”中描述的那些實施方案。保持本發(fā)明精神實質的任何實施方案應認為也在本發(fā)明范圍內(nèi)。盡管如此，本發(fā)明僅限于下列權利要求的范圍。
序列表(1)一般信息(i)申請人DESMOS，Inc.，7720-B E1 Camino Real，Carlsbad，California，USA(ii)發(fā)明名稱細胞基質刺激附著和半橋粒裝配(iii)序列數(shù)目3(iv)通訊地址(A)地址Knobbe，Martens，Olson & Bear(B)街道620 Newport Center Drive，16th Floor(C)城市Newport Beach(D)州 CA(E)國家USA(F)郵編92660(v)計算機可讀形式(A)介質類型軟盤(B)計算機IBM PC compatible(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件PatentIn Release #1.0，Version #1.25(vii)在先申請資料(A)申請?zhí)?8/042，727(B)申請日5 April 1993(A)申請?zhí)?8/152，460(B)申請日12 November 1993(ix)電信信息
(G)電話(619)235-8550(H)電傳(619)235-0176(2)SEQ ID NO1的信息(i)序列特征(A)長度295個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線性(ii)分子類型肽(iii)假設無(iv)反義無(v)片段類型internal(vii)直接來源(B)克隆150kD(xi)序列描述SEQ ID NO1Glu Phe Glu Thr Leu Gln Glu Lys Ala Gln Val Asn Ser Arg Lys Ala1 5 10 15Gln Thr Leu Tyr Asn Asn Ile Asp Thr Thr Ile Gln Asn Ala Lys Glu20 25 30Leu Asp Met Lys Ile Lys Asn Ile Leu Thr Asn Val His Ile Leu Leu35 40 45Lys Gln Ile Ala Arg Pro Gly Gly Glu Gly Met Asp Leu Pro Val Gly50 55 60Asp Trp Ser Arg Glu Sar Ala Glu Arg His Gly His Val Ala Glu Ser65 70 75 80Arg Gly Arg Asp Phe Lys Lys His Leu Gln Glu Ala Glu Ala Gln Lys85 90 95Met Glu Ala Gln Leu Leu Leu Asn Arg Ile Arg Thr Trp Leu Glu Ser100 105 110His Gln Val Glu Asn Asn Gly Leu Leu Lys Asn Ile Arg Asp Ser Leu115 120 125Asn Asp Tyr Glu Ala Lys Leu Gln Asp Leu Arg Ser Val Leu Gln Glu130 135 140Ala Ala Ala Gln Gly Lys Gln Ala Thr Gly Leu Asn His Glu Asn Glu145 150 155 160Gly Val Leu Gly Ala Ile Gln Arg Gln Met Lys Glu Met Asp Ser Leu165 170 175Lys Lys Tyr Leu Thr Glu His Leu Ala Thr Ala Asp Ala Ser Leu Leu180 185 190Gln Thr Asn Ser Leu Leu Gln Arg Met Asp Thr Ser Gln Lys Glu Tyr195 200 205Glu Ala Trp Gln Ile Asp Ile Ser Leu Glu Gln His Pro Val His Asn210 215 220Cys Leu Leu Arg Leu Thr Leu Arg Gln Asp Leu Ile Asp Leu Asn Phe225 230 235 240Ser Phe Ser Val Pro Gln Val Val Asp Thr Arg Gln Leu Ala Ile Tyr245 250 255Asn Arg His Ala Tyr Val Val Leu Gly Gly Ile Leu Val Ser Lys Val260 265 270His Tyr Lys His Cys Pro Thr Cys Leu His Ser Leu Leu Ser Leu Val275 280 285Phe Gly Gly Thr Lys Thr Tyr290 295(2)SEQ ID NO2的信息(i)序列特征(A)長度360個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線性(ii)分子類型肽(iii)假設無(iv)反義無(v)片段類型internal(vii)直接來源(B)克隆laminin A(xi)序列描述SEQ ID NO2Lys Phe Asp Thr Val Ser Glu Gln Lys Leu Gln Ala Glu Lys Asn Ile1 5 10 15Lys Asp Ala Gly Asn Phe Leu Ile Asn Gly Asp Leu Thr Leu Asn Gln20 25 30Ile Asn Gln Lys Leu Asp Asn Leu Arg Asp Ala Leu Asn Glu Leu Asn35 40 45Ser Phe Asn Lys Asn Val Asp Glu Glu Leu Pro Val Arg Glu Asp Gln50 55 60His Lys Glu Ala Asp Ala Leu Thr Asp Gln Ala Glu Gln Lys Ala Ala65 70 75 80Glu Leu Ala Ile Lys Ala Gln Asp Leu Ala Ala Gln Tyr Thr Asp Met85 90 95Thr Ala Ser Ala Glu Pro Ala Ile Lys Ala Ala Thr Ala Tyr Ser Gly100 105 110Ile Val Glu Ala Val Glu Ala Ala Gln Lys Leu Ser Gln Asp Ala Ile115 120 125Ser Ala Ala Gly Asn Ala Thr Asp Lys Thr Asp Gly Ile Glu Glu Arg130 135 140Ala His Leu Ala Asp Thr Gly Ser Thr Asp Leu Leu Gln Arg Ala Arg145 150 155 160Gln Ser Leu Gln Lys Val Gln Asp Asp Leu Glu Pro Arg Leu Asn Ala165 170 175Ser Ala Gly Lys Val Gln Lys Ile Ser Ala Val Asn Asn Ala Thr Glu180 185 190His Gln Leu Lys Asp Ile Asn Lys Leu Ile Asp Gln Leu Pro Ala Glu195 200 205Ser Gln Arg Asp Met Trp Lys Asn Ser Asn Ala Asn Ala Ser Asp Ala210 215 220Leu Glu Ile Leu Lys Asn Val Leu Glu Ile Leu Glu Pro Val Ser Val225 230 235 240Gln Thr Pro Lys Glu Leu Glu Lys Ala His Gly Ile Asn Arg Asp Leu245 250 255Asp Leu Thr Asn Lys Asp Val Ser Gln Ala Asn Lys Gln Leu Asp Asp260 265 270Val Glu Gly Ser Val Ser Lys Leu Asn Glu Leu Ala Glu Asp Ile Glu275 280 285Glu 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Gln Lys Glu Ile Ala Glu Asp Glu Leu Val115 120 125Ala Ala Glu Ala Leu Leu Lys Lys Val Lys Lys Leu Phe Gly Glu Ser130 135 140Arg Gly Glu Asn Glu Glu Met Glu Lys Asp Leu Arg Glu Lys Leu Ala145 150 155 160Asp Tyr Lys Asn Lys Val Asp Asp Ala Trp Asp Leu Leu Arg Glu Ala165 170 175Thr Asp Lys Ile Arg Glu Ala Asn Arg Leu Phe Ala Val Asn Gln Lys180 185 190Asn Met Thr Ala Leu Glu Lys Lys Lys Glu Ala Val Glu Ser Gly Lys195 200 205Arg Gln Ile Glu Asn Thr Leu Lys Glu Gly Asn Asp Ile Leu Asp Glu210 215 220Ala Asn Arg Leu Ala Asp Glu Ile Asn Ser Ile Ile Asp Tyr Val Glu225 230 235 240Asp Ile Gln Thr Lys Leu Pro Pro Met Ser Glu Glu Leu Asn Asp Lys245 250 255Ile Asp Asp Leu Ser Gln Glu Ile Lys Asp Arg Lys Leu Ala Glu Lys260 265 270Val Ser Gln Ala Glu Ser His Ala Ala Gln Leu Asn Asp Ser Ser Ala275 280 285Val Leu Asp Gly Ile Leu Asp Glu Ala Lys Asn Ile Ser Phe Asn Ala290 295 300Thr Ala Ala Phe Lys Ala Tyr Ser Asn Ile Lys Asp Tyr Ile Asp Glu305 310 315 320Ala Glu Lys Val Ala Lys Glu Ala Lys Asp Leu Ala His Glu Ala Thr325 330 335Lys
根據(jù)PCT第19條的聲明Tsilibary等人(US5,007,925)公開了用具有IV型膠原蛋白活性之多肽包被的取代性裝置，所述活性有利于細胞粘附到底物上。Tsilibary等人并未教導這些多肽會誘導半橋粒的形成。
Riddelle等人(J.Cell Biol.，112159-168，1991)教導了當鋪在底物上時，804G細胞形成半橋粒。但他們既未教導也未說明由這些細胞分泌的基質在鋪在基質上的其他細胞中誘導半橋粒的形成。Riddelle等人(Mol.Biol.Cell，370a，1992)，Langhofer等人(Mol.Biol.Cell，70a，1992)和Jones等人(J.Cell Biochem.，142suppl 16F，1992)公開描述并確定了804G細胞中半橋粒噬菌斑組分的位置。并且本發(fā)明涉及在鋪在由804G大鼠膀胱癌細胞分泌的基質上的細胞中形成半橋粒。沒有任何教義或建議將引述的文獻組合起來，指導本領域的普通技術人員在由804G細胞分泌的基質上培養(yǎng)不能形成半橋粒的細胞，以便在所培養(yǎng)的細胞中刺激半橋粒的形成。
Simpson等人(Diabetes，40800-808，1991)教導了在牛角膜基質上，從部分消化的胰腺生產(chǎn)胰ICCs。本發(fā)明涉及在804G基質上培養(yǎng)ICCs。在第24頁，17-18行，說明書說明與牛角膜基質相比，當在804G基質上培養(yǎng)細胞時會得到更好的結果。由于本領域未公開804G基質可使內(nèi)分泌細胞前體更好地生長，因此Simpson的文獻沒有理由鼓動本領域技術人員在804G基質上培養(yǎng)ICCs。
因此，本領域專業(yè)人員未能結合引述的文獻從而完成本發(fā)明。從上述理由看，本申請人認為權利要求在專利性上超出了現(xiàn)有技術的范圍。
11.權利要求10所述的物品，其中所述的陶制材料是羥磷灰石。
12.權利要求1所述的物品，其中所述的物品由合成聚合物制成或包被。
13.權利要求12所述的物品，其中所述的聚合物是聚酯或尼龍。
14.一種用于培養(yǎng)哺乳動物細胞的組合物，所述組合物在可藥用的載體中含有一種哺乳動物細胞的細胞外基質蛋白質，這種蛋白質具有促進與所述蛋白質接觸的細胞的半橋粒形成的特性。
15. 804G細胞系沉積產(chǎn)生的一或多種基本上以分離的形式存在的蛋白質性的細胞外基質蛋白質。
16.一種分離的多肽，主要由150kD蛋白質組成，所述蛋白質含有SEQ ID NO1序列并具有易化在其上培養(yǎng)的上皮細胞半橋粒形成的能力。
17.一種產(chǎn)生同種移植用皮膚的方法，該方法包括在權利要求1所述的物品上培養(yǎng)表皮細胞；和在促皮膚生長條件下使所述細胞生長。
18.一種增加表皮細胞對靶表面粘附的方法，該方法包括用至少一種由細胞系804G沉積產(chǎn)生的細胞外基質的約100kD，135kD，140kD，150kD或400kD的蛋白質包被所述表面。
19.權利要求18所述的方法，其中所述的細胞為牙周細胞。
20.權利要求18所述的方法，其中所述的細胞粘附發(fā)生于體外。
21.權利要求18所述的方法，其中所述的細胞粘附發(fā)生于體內(nèi)。
22.一種使胰腺的胰島細胞前體生長的方法，它包括在804G細胞分泌的基質蛋白質上培養(yǎng)所述細胞前體的步驟。
23.權利要求22所述的方法，還包括培養(yǎng)步驟前的步驟，即酶促消化胎兒胰腺；在細胞培養(yǎng)基中溫育消化的胰腺直至胰島樣細胞聚集體形成。
24.權利要求23所述的方法，其中所述的胰腺來源于哺乳類。
25.權利要求24所述的方法，其中所述的胰腺是人的。
26.權利要求22所述的方法，其中所述的804G基質蛋白質附著于一種底物上。
27.權利要求22所述的方法，其中所述的基質由804G大鼠膀胱癌細胞產(chǎn)生。
28.一種生產(chǎn)產(chǎn)激素細胞的方法，包括下述步驟按照權利要求1的方法提供擴增的內(nèi)分泌前體細胞和將所述的擴增的內(nèi)分泌前體細胞移植入哺乳動物體內(nèi)。
29.權利要求28所述的方法，其中所述的細胞為胰腺的胰島細胞。
30.權利要求28所述的方法，其中所述的激素為胰島素。
31.權利要求29所述的方法，其中所述的細胞移植于腎、肺或肝內(nèi)或其附近。
32.按照權利要求22制備的胰腺的胰島細胞前體。
權利要求
1.一種制造的物品，它包含一種適于哺乳類體內(nèi)使用的生物相容的制成一定形狀的物品；和在所述物品上的一種半橋粒形成易化蛋白質組合物。
2.權利要求1所述的物品，其中所述的蛋白質組合物由一種上皮細胞起源的腫瘤細胞系沉積產(chǎn)生。
3.權利要求2所述的物品，其中所述的腫瘤細胞系是大鼠癌細胞系804G。
4.權利要求2所述的物品，其中所述的腫瘤細胞系是大鼠膀胱癌細胞系NBTII。
5.權利要求1所述的物品，其中所述的蛋白質組合物含有至少一種由細胞系804G沉積產(chǎn)生的細胞外基質的約100kD，135kD，140kD，150kD，或400kD的蛋白質。
6.制成薄片形狀的權利要求5所述的物品，還包括在所述基質上培養(yǎng)的表皮細胞。
7.權利要求1所述的物品，還包括以膠原、再生膠原或聚乳酸包被所述物品。
8.權利要求1所述的物品，其中所述的物品用生物相容的金屬制成或包被。
9.權利要求8所述的物品，其中所述的金屬是不銹鋼或鈦。
10.權利要求1所述的物品，其中所述的物品由陶瓷材料制成或包被。
11.權利要求10所述的物品，其中所述的陶制材料是羥磷灰石。
12.權利要求1所述的物品，其中所述的物品由合成聚合物制成或包被。
13.權利要求12所述的物品，其中所述的聚合物是聚酯或尼龍。
14.一種用于培養(yǎng)哺乳動物細胞的組合物，所述組合物在可藥用的載體中含有一種哺乳動物細胞的細胞外基質蛋白質，這種蛋白質具有促進與所述蛋白質接觸的細胞的半橋粒形成的特性。
15. 804G細胞系沉積產(chǎn)生的一或多種基本上以分離的形式存在的蛋白質性的細胞外基質蛋白質。
16.一種分離的多肽，主要由150kD蛋白質組成，所述蛋白質含有SEQ ID NO1序列并具有易化在其上培養(yǎng)的上皮細胞半橋粒形成的能力。
17.一種產(chǎn)生同種移植用皮膚的方法，該方法包括在權利要求1所述的物品上培養(yǎng)表皮細胞；和在促皮膚生長條件下使所述細胞生長。
18.一種增加表皮細胞對靶表面粘附的方法，該方法包括用至少一種由細胞系804G沉積產(chǎn)生的細胞外基質的約100kD，135kD，140kD，150kD或400kD的蛋白質包被所述表面。
19.權利要求18所述的方法，其中所述的細胞為牙周細胞。
20.權利要求18所述的方法.其中所述的細胞粘附發(fā)生于體外。
21.權利要求18所述的方法，其中所述的細胞粘附發(fā)生于體內(nèi)。
22.一種使內(nèi)分泌前體細胞生長的方法，它包括在能夠促進所述細胞增強生長的804G基質蛋白質存在的條件下培養(yǎng)內(nèi)分泌前體細胞的步驟。
23.權利要求22所述的方法，其中所述的內(nèi)分泌細胞為胰腺的胰島細胞前體。
24.權利要求23所述的方法，還包括培養(yǎng)步驟前的步驟，即酶促消化胎兒胰腺；在細胞培養(yǎng)基中溫育消化的胰腺直至胰島樣細胞聚集體形成。
25.權利要求24所述的方法，其中所述的胰腺來源于哺乳類。
26.權利要求25所述的方法，其中所述的胰腺是人的。
27.權利要求22所述的方法，其中所述的804G基質蛋白質為附著于底物的固相蛋白質。
28.權利要求22所述的方法，其中所述的基質由804G大鼠膀胱癌細胞產(chǎn)生。
29.一種生產(chǎn)產(chǎn)激素細胞的方法，包括下述步驟按照權利要求1的方法提供擴增的內(nèi)分泌前體細胞；和將所述的擴增的內(nèi)分泌前體細胞移植入哺乳動物體內(nèi)。
30.權利要求28所述的方法，其中所述的細胞為胰腺的胰島細胞。
31.權利要求28所述的方法，其中所述的激素為胰島素。
32.權利要求31所述的方法，其中所述的細胞移植于腎、肺或肝內(nèi)或其附近。
33.按照權利要求22制備的內(nèi)分泌前體細胞。
34.權利要求33所述的細胞，該細胞為胎兒胰腺的胰島前體細胞。
全文摘要
本發(fā)明公開了特殊的細胞外基質蛋白質，以及使用這些蛋白質的方法，和由這些蛋白質包被的制成一定形狀的物品。這些蛋白質刺激生長于其上的細胞的細胞粘附和半橋粒形成。在該基質上生長的內(nèi)分泌細胞前體，包括胎兒胰腺的胰島細胞前體，保持生物功能和分化。
文檔編號A61K39/395GK1124978SQ94192305
公開日1996年6月19日 申請日期1994年4月5日 優(yōu)先權日1993年4月5日
發(fā)明者J·C·R·瓊斯, V·夸蘭塔 申請人:迪斯莫斯公司