專利名稱：針對寄生蟲的保護性抗原的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及抗體探針及其在檢測和純化來自寄生蟲和細菌的許多保護性和診斷性抗原中的應(yīng)用。特別是本發(fā)明涉及鑒定和純化普通奧斯脫(線蟲)、游行毛圓線蟲和肝片形吸蟲等寄生蟲中的抗原，制備含有上述抗原的疫苗以及將這些抗原應(yīng)用于診斷分析中。
在以前的技術(shù)中人們已付出了大量努力來產(chǎn)生疫苗以便控制包括家畜在內(nèi)的動物所遭受的寄生性的、細菌性的和其它類型的感染；然而，在最近五年內(nèi)最終幾乎未曾取得進展，盡管在真核生物和原核生物中大量產(chǎn)生外源產(chǎn)物的相關(guān)技術(shù)取得了飛速進展。例如，對動物的重要病原體感染中的保護性抗原的鑒定仍然是疫苗生產(chǎn)中的主要障礙。
在澳大利亞專利No.640364(本文引用其全部說明書以供參考中描述了一種用來制備與病原體相關(guān)的抗原的方法，這種方法包括在認(rèn)為病原體最易受到攻擊期間的病原體發(fā)育階段獲取病原體樣品、抗體探針含有至少一種抗病原體抗體、用抗體探針探測病原體樣品和分離檢測的抗原。
盡管這種方法在本領(lǐng)域中提供了有意義的進展，但研究局限于少數(shù)寄生蟲性和細菌性感染。如果這種方法能夠成功地應(yīng)用于其它感染并進一步用來鑒定保護性抗原，那將是本領(lǐng)域內(nèi)意義重大的進步。
普通奧斯脫(Osfertagia Circumcincfa)是一種寄生于羊皺胃(第四胃)的腸道寄生性線蟲。O.circumcincfa最近已被重新分類定為Teladorsagia circumcincfa，盡管后一名稱還不太常用，皺胃中成熟寄生蟲產(chǎn)生的卵隨感染的羊的糞便排放到牧場上。
孵化后，幼蟲在牧場上發(fā)育至第三階段(L3)。L3幼蟲被吃草的羊咽下并在皺胃中進一步發(fā)育。L4階段的發(fā)育在皺胃小囊中進行，發(fā)育可能減慢或被控制，這依賴于羊的免疫狀態(tài)，也依賴于季節(jié)。在春季發(fā)育成能產(chǎn)生成熟卵的成蟲之前，幼蟲可以在整個冬天在皺胃小囊中處于休眠狀態(tài)。寄生蟲數(shù)目的突然同步增長會導(dǎo)致明顯的羊病態(tài)。由于粘膜上的晚期幼蟲和成蟲的攝食而造成的組織損傷會引起血清滲漏和皺胃內(nèi)膜肥大，隨后干擾皺胃的功能并導(dǎo)致動物的生長不良。相關(guān)的寄生蟲O.ostertagii在牛中引起相似的病理癥狀。
盡管奧斯脫屬的種類是造成澳大利亞和其它國家的牛、羊工業(yè)大量經(jīng)濟損失的重要原因，但背景技術(shù)還沒有形成成功的疫苗來抵抗這種寄生蟲。
肝片吸蟲(Fasciola hepafica)肝吸蟲是一種屬于吸蟲科的寄生蟲，它能感染大量的野生和家養(yǎng)動物種類并且在牛羊工業(yè)中具有特別的經(jīng)濟重要性。在研究的種類中，大鼠是唯一能對重新感染產(chǎn)生強大免疫力的宿主(參見Haroun，ETM和GV.Hillyer，Vet Parasifol2063-93，1986)。因此大鼠免疫系統(tǒng)有力識別的抗原在疫苗生產(chǎn)方案中具有特別重要意義并在本申請中進行了描述。澳大利亞專利640364描述了一種針對肝片吸蟲感染的保護性抗原，它具有大約120至125千道爾頓的分子量。這種抗原能在牛羊中有區(qū)別地被識別，與本申請所述的抗原完全不同。
毛圓線蟲屬寄生蟲的感染發(fā)生于羊小腸的前3～4米部位并導(dǎo)致羊毛減產(chǎn)、生長減慢、不健壯以及腹瀉。嚴(yán)重感染會導(dǎo)致死亡。它也是一種具有經(jīng)濟意義的疾病，但在背景技術(shù)中也沒有形成成功的疫苗來抵抗這種寄生蟲。
因此，本發(fā)明的目的是為了克服或至少減輕與背景技術(shù)有關(guān)的一種或多種困難和缺陷。
因此，首先，本發(fā)明提供了一種抗普通奧斯脫或相關(guān)感染的推定的保護性抗原或其片段，選自下文所述的具有近似分子量范圍為26～36和95～105千道爾頓的抗原。此抗原也可能出現(xiàn)于寄生蟲的其它種類或品系中。
26～36kD的普通奧斯脫抗原范圍，可以包括在32～36位置的駢聯(lián)體抗原。這種駢聯(lián)體抗原可能是一種類似植物凝血素的結(jié)合β-半乳糖苷的蛋白質(zhì)。該32～36kD駢聯(lián)體抗原可以包含一個或多個如下肽段序列1)SAHGPPGQ2)FpHGPSYQHGYA3)IVTHPNR在26～36kD的普通奧斯脫抗原區(qū)域的低帶部位含有與原肌球蛋白和谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(glutathionine S-transferase)同源的蛋白質(zhì)。
普通奧斯脫的序列與下列序列同源(A)原肌球蛋白的1.N-末端序列MKAEEVRQALK2.中間序列VEADLERAEERAEAAGENKVVVL
(B)與谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶同源的是N-末端序列VQYKLYYFDGRXAAEV本發(fā)明另一優(yōu)選的方面是提供了一種抗游行毛圓線蟲或相關(guān)感染的推定的保護性抗原或其片段，它具有如下文所述的32-35千道爾頓的近似分子量。該保護性抗原可以是駢聯(lián)體。
游行毛圓線蟲抗原在SDS-PAGE電泳中與上述普通奧斯脫駢聯(lián)體抗原處于相同位置，因此，有可能它們是基本相似但具有種特異性抗原決定基的分子，這些抗原決定基最強地被同源的上清抗體探針?biāo)R別。
本發(fā)明更進一步的方面是提供了一種抗肝片形吸蟲或相關(guān)感染的推定的保護性抗原或其片段，選自具有近似分子量范圍為28kD、32kD、37kD、42～100kD、54至55kD和大于200kD的抗原，這正如上文所述。類似的抗原可以出現(xiàn)在其它吸蟲屬物種，如大片形吸蟲和其它寄生吸蟲如血吸蟲中。
大于200kD的肝片吸蟲抗原可以是一種駢聯(lián)體抗原。肝片吸蟲抗原只能專一地被來自免疫、攻擊的大鼠腸系膜淋巴結(jié)(MLN)細胞的上清所識別。
32kD抗原可以包含如下N-末端肽鏈序列KPNYKRQFEPFS-DELIHYINLE。
54～55kD抗原可以包含如下N-末端肽序列LEDNGRTH-WAVLVA。
要明白的是，重組蛋白抗原可以用來替代從寄生蟲中提取的天然抗原。
在疫苗和診斷檢測中含有保護性抗原決定基的抗原片段和人工合成的含保護性抗原決定基的多肽可以用來替代整個天然的或重組分子。
該抗原可以出現(xiàn)在寄生蟲的其它種類中，因此在指定的病原體引起疾病之外的其它疾病的接種和診斷中也起作用。
還要明白的是，產(chǎn)生的抗這些抗原的抗體也可用于診斷試驗或用作單克隆或多克隆的免疫預(yù)防試劑。
根據(jù)發(fā)明的保護性抗原可以使用上述澳大利亞專利640364中所描述的方法來生產(chǎn)。因此本發(fā)明的另一個方面提供了一種制備與選自上文所述的片形吸蟲屬、奧斯脫屬和毛圓線蟲屬的種類及其相近種的病原體相聯(lián)系的抗原的方法，該方法包括提供選自片形吸蟲屬、奧斯脫屬和毛圓線蟲屬種類和其相近種的病原體的樣品；包含至少一種抗各自病原體的抗體的相應(yīng)的抗體探針，其生產(chǎn)方法包括用選自片形吸蟲屬、奧斯脫屬和毛圓線蟲屬種類及其相近種的一種病原體或病原體提取物攻擊免疫動物一段短時間后從免疫動物中制備一種生物樣品；從該生物樣品中分離細胞；在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基中體外培養(yǎng)細胞以及收獲所說的細胞產(chǎn)生的抗體；用相應(yīng)的抗體探針探測病原體樣品以便檢測出至少一種抗原；分離被檢測的抗原。
因此，病原體樣品優(yōu)選一種寄生蟲、寄生蟲提取物或其寄生蟲切片。奧斯脫屬病原體可以是普通奧斯脫(線蟲)或奧氏奧斯脫。毛圓線蟲屬病原體可以是游行毛圓線蟲或Trichostronylus axei。片形吸蟲屬種類可以是肝片形吸蟲或大片形吸蟲。
在一個優(yōu)選的方面，病原體樣品可以在被認(rèn)為是最易受到攻擊的發(fā)育階段提取。
據(jù)認(rèn)為，病原體樣品取樣的時間是重要的，因為寄生蟲僅在進入宿主后的短時間內(nèi)是脆弱的，在此之后它可以改變結(jié)構(gòu)并不再易受免疫攻擊且可能不再表達保護性抗原。
例如，在病原體肝片形吸蟲、普通奧斯脫和游行毛圓線蟲的例子中，在幼蟲階段取樣可能是合適的。
從中提取生物樣品的動物可以是任何合適的類型。從中提取生物樣品的動物可以是免疫動物。生物樣品可以是在用病原體感染攻擊免疫動物后短時間內(nèi)取樣。該動物可以是諸如羊或牛的動物。
動物的生物樣品可以是任何合適的類型。該生物樣品可以來自動物組織、器官、血液、淋巴或淋巴結(jié)、它也可以從感染動物的任何部位提取。然而，優(yōu)選的樣品取自感染的位點或者在某些疾病可能形成的病灶區(qū)域或者接近或通過該感染的位點或病灶區(qū)域如淋巴結(jié)。優(yōu)選樣品可以從肝淋巴結(jié)、皺胃淋巴結(jié)、或腸系膜淋巴結(jié)中提取。血清/血漿樣品不適于作為生物樣品。已發(fā)現(xiàn)，在血清/血漿樣品中發(fā)現(xiàn)的大部分抗體要么與病原體的保護或特異性診斷無關(guān)，要么與病原體無關(guān)。
與此相反，本發(fā)明使用的探針高度富含病原體特異性抗體，并能選來限對保護性免疫特別重要的病原體階段。
從生物樣品中分離的細胞可包括B細胞。細胞可在包括分泌和或生產(chǎn)抗體期間的時間同樣地進行分離。作為選擇，該細胞可包括記憶細胞，它可在某些疾病的后期產(chǎn)生。
因此，細胞優(yōu)選在體內(nèi)刺激后的短時間內(nèi)提取，優(yōu)選在其后約2至13天內(nèi)，例如導(dǎo)致形成抗體的細胞體內(nèi)誘導(dǎo)的相關(guān)寄生階段，這些形成抗體的細胞經(jīng)體外培養(yǎng)后會將特異性的抗體分泌到培養(yǎng)基中。不經(jīng)過預(yù)先體內(nèi)刺激休眠淋巴細胞就沒有或幾乎沒有抗體分泌到培養(yǎng)基中。
經(jīng)過向培養(yǎng)基中加入輔助因子(helper facfor)可以增強培養(yǎng)基中剛激活的B細胞的體外抗體分泌。輔助因子可以是單獨使用或結(jié)合使用的細胞因子，包括白細胞介素1、2、3、4、5、6、7和8、集群激活因子、干擾素和任何其它表明對B細胞的特異性抗體分泌具有增強效應(yīng)的因子。
生產(chǎn)抗體探針的方法可以包括激活被分離出來進行繁殖并且分泌和/或釋放抗體的細胞的進一步步驟。
細胞激活步驟可以包括在培養(yǎng)基內(nèi)加入一種細胞激活劑。細胞激活劑可以是來源于寄生蟲的或者選自是白細胞產(chǎn)生的分裂素和輔助因子，或是其人工合成的等價物或其組合。
分裂素可以選自來源于商陸(Phytolacca americana)的產(chǎn)物也稱作商陸分裂素(PWM)、phorbolmyrisfic acid(PMA)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、多聚腺苷酸-多聚尿苷酸(poly(A-u))、純化的蛋白提取物、多聚肌苷酸多聚胞井酸(poly(I-c))、脂多糖(LPS)、葡萄球菌或其產(chǎn)物、Bacfo-sfrepfolysin O reagenf(SLO)、葡萄球菌噬菌體溶胞產(chǎn)物(SPL)、Epsfein-Barr病毒(EBV)、Nocardia水溶分裂素(NWEM)、植物血細胞凝體素(pHA)、伴刀豆球蛋白A(ConA)和硫酸葡聚糖及其混合物。細胞繁殖劑可以是任何間接或直接導(dǎo)致B細胞繁殖和或抗體分泌的試劑如固相抗免疫球蛋白。輔助因子可以是包括白細胞介素1、2、3、4、5、6、7和8、集群激活因子、干擾素的細胞因子和任何其它在單獨或與其它因子或試劑結(jié)合加入時顯示對B細胞繁殖和/或抗體分泌具有增強效應(yīng)的輔助因子。這并不意味著已列完了所有包括輔助因子的分裂素和細胞激活試劑。
細胞的體外培養(yǎng)可以是在有或沒有預(yù)先分離細胞亞群的情況下進行?？赏ㄟ^收集培養(yǎng)基上清來收獲抗體。該上清含有體外培養(yǎng)的這些細胞分泌的抗體也含有人工從B細胞釋放的(如經(jīng)過B細胞溶胞)抗體。已驚奇地發(fā)現(xiàn)，含有抗體的上清可直接用來檢驗病原體的抗原。
在一個優(yōu)選的方面中，病原體樣品可以與標(biāo)準(zhǔn)緩沖液混合并放置在諸如SDS-聚丙烯酰胺凝膠的標(biāo)準(zhǔn)支持物上以分離其中所含的蛋白。然后分離的蛋白質(zhì)可以轉(zhuǎn)移動硝化纖維素、尼龍膜或其它膜上。
如上所述產(chǎn)生的相應(yīng)的抗體探針可以簡單地以從培養(yǎng)基收獲的上清形式使用。作為選擇抗體或被分離和純化。
培養(yǎng)基中所含的抗體可被用來純化抗原?？墒褂糜H和純化，優(yōu)選免疫親和純化。
如上所述確定的抗原可利用任何合適的分析技術(shù)來檢測。
因此，抗體探測步驟可進一步包括將由此產(chǎn)生的產(chǎn)物用于檢測分析。
檢測分析可包括Western印跡技術(shù)。檢測分析也可以是免疫沉淀分析、放射免疫分析、酶聯(lián)免疫分析或者免疫熒光分析。
因此，抗原可經(jīng)過包含如下步驟的方法來純化制備粗制抗原混合物和針對選自片形吸蟲、奧斯脫和毛圓線蟲及其相近種的病原體的固定在合適支持物上的抗體；利用被固定的抗體將粗制抗原混合物進行親和層析；分離由此純化的抗原。
利用傳統(tǒng)方法可從上述培養(yǎng)上清探針中獲取抗體。例如可使用常用來從血清或血漿中純化免疫球蛋白的方法，如硫酸銨沉淀、辛酸分級分離、離子交換層析、或經(jīng)結(jié)合并從固定的G蛋白或A蛋白中洗脫。
然后，如此獲得的抗體可偶聯(lián)到合適的支持物上，如CNBr-活化的Sepharose 4B(Pharmacia)、AAi-凝膠(Bio-Rad)或其它能結(jié)合蛋白質(zhì)的親和層析支持物。
固定的抗體可用來從復(fù)雜的寄生蟲提取物中經(jīng)親和層析對特異性抗原進行分級分離和純化。抗原與固定的抗體結(jié)合后，用諸如含有1.5M NaCl的緩沖液可將未結(jié)合的大分子種類從固體支持物中洗去。隨后，用諸如低pH或高pH值的緩沖液或含離液序列高的離子，如0.5～3.0M硫氰酸鈉的緩沖液可將該抗原從親和柱中洗脫下來。
分離或確定的抗原用于單克隆抗體的制備。
因此，本發(fā)明進而提供了一種用來生產(chǎn)抗上述病原體抗原的單克隆抗體的方法，該方法包括(1)提供一種能產(chǎn)生抗所說保護性抗原或其片段的抗體的B細胞，并且該細胞從用針對上述病原體的保護性抗原免疫過的動物中獲?。灰环N骨髓瘤細胞；(2)將B細胞與骨髓瘤細胞融合；(3)繁殖由此形成的雜交瘤細胞(4)收獲由所說的雜交瘤細胞產(chǎn)生的抗體。
單克隆抗體可形成上述疾病的被動治療的基礎(chǔ)。
該抗原優(yōu)選肝片形吸蟲抗原。
由此形成的單克隆抗體可選自由下文所述的FY4-7-12、FY3-3-1、FY3-3-2、FY3-5、FY4-7-6和FY1-6組成的組中。
在鑒定抗原后，可使用分子生物學(xué)技術(shù)或化學(xué)技術(shù)(如克隆技術(shù))來生產(chǎn)大量的該抗原作為選擇人工合成的對應(yīng)于鑒定抗原的不同片段的多肽可用作生產(chǎn)疫菌的工具。
因此，本發(fā)明的一個優(yōu)選的方面是，它提供了一種制備針對選自片形吸蟲屬、奧斯脫屬和毛圓線蟲屬種類和其相近種的病原體的合成的抗原性多肽，該方法包括(1)提供一種來源于選自片形吸蟲屬、奧斯脫屬和毛圓線蟲屬種類及其相近種病原體的樣品的cDNA文庫或基因組文庫；一種相應(yīng)的抗體探針，該探針包括至少一種抗各自病原體的，以包括提供一種用選自片形吸蟲屬、奧斯脫屬和毛圓線蟲屬種類及其相近種的病原體或病原體提取物攻擊感染免疫動物之后短時間內(nèi)從免疫動物中提取的生物樣品，或者一種由此而來的相應(yīng)的單克隆抗體、或者一種在注射純化抗原后產(chǎn)生的多克隆或單克隆抗體的方法生產(chǎn)的抗體；(2)從cDNA文庫或基因組文庫產(chǎn)生合成的多肽；(3)用抗體探針探測合成的多肽；(4)分離由此檢測的合成的抗原多肽。
可使用cDNA文庫或基因組文庫。cDNA或基因組文庫可組裝成適當(dāng)?shù)谋磉_載體，該載體能在原核宿主(如細菌)或真核宿主(如哺乳動物細胞)中轉(zhuǎn)錄并隨后表達DNA克隆。用于篩選文庫的探針優(yōu)選選自(i)以上述已鑒定并純化的抗原的氨基酸序列為基礎(chǔ)的合成寡聚核苷酸探針；(ii)從合成的寡聚核苷酸探針產(chǎn)生的PCR產(chǎn)物；(iii)以來自已鑒定的抗原的氨基酸序列資料的合成多肽為基礎(chǔ)的抗體；(iv)從上述生產(chǎn)的培養(yǎng)基中獲得的抗體；
(v)產(chǎn)生的抗上述鑒定和純化的抗原的單克隆或多克隆抗體；(vi)對該抗原具有特異性的重組或人工合成的單克隆抗體或多肽，例如在Ward ef al 1989，Nafure 241，第544至546中所描述的。
cDNA文庫優(yōu)選來源于普通奧斯脫的樣品；相應(yīng)的抗體探針是產(chǎn)生的抗32～36kD駢聯(lián)體抗原的單克隆抗體。
還有一個方面是提供了一種上述制備的人工合成的抗原多肽。
人工合成的抗原多肽可選自克隆3～2和5-2b，它具有如下氨基酸序列M.A.FETNYP IPYRSKLTEP FEPGQTLTVK GKTGEDSVRF TINLHNSSADFSGNDVPLHV SVRFDEGKIV CNSFAKGEWGKEERKSNPYKKGDDIDIRIRAHDSKFQIFV DQKELKEYEH RLPLSSITHF SIDGDVLITH IHWGGKYYPVPYESGLAGEG LSPGKSLYLY GMPEKKGKRF HINILKKNGD IALHFNPRFDEKAWRNSLI SNEWGNEERE GKMPFEKAVG FDLEIKNEDY PFQIMVNGERFASYSHRLEP HELNGLQIGG DVEITGIQLH這正如下文所描述的。
因此，本發(fā)明的另一方面是，它提供了針對選自片形吸蟲屬、奧斯脫屬和毛圓線蟲屬種類及其相近種的病原體的被推定的保護性抗原，制備它的方法包括提供一種選自片形吸蟲屬、奧斯脫屬和毛圓線蟲屬種類及其相近種的的病原體樣品；(2)一種抗體探針，該探針包括至少一種以上述方法產(chǎn)生的抗選自奧斯脫屬和毛圓線蟲屬種類及其相近種的病原體的抗體；用相應(yīng)的抗體探針探測病原體樣品；分離檢測到的保護性抗原。
保護性抗原可作為如下所討論的疫苗和或診斷試劑。
本發(fā)明的另一方面是提供了一種抗針對選自片形吸蟲屬、奧斯脫屬和毛圓線蟲屬種類及其相近種病原體的保護性抗原或其片段的單克隆或多克隆抗體。
另一方面本發(fā)明提供了抗針對片形吸蟲種類及其相近種的上文所述的保護性抗原或其片段的單克隆或多克隆抗體。
另一方面本發(fā)明提供了一種防止由選自片形吸蟲屬、奧斯脫屬和毛圓線蟲屬種類及其相近種的病原體所引起的動物感染的方法，該方法包括給動物服用有效劑量的至少一種上述保護性抗原。
保護性抗原優(yōu)選來自本文所述的肝片形吸蟲或游行毛圓線蟲的抗原。
本發(fā)明的另一方面是提供了一種治療由選自片形吸蟲屬、奧斯脫屬和毛圓線蟲屬種類及其相近種引起的動物感染的方法，該方法包括給動物服用治療上有效量的抗上述保護性抗原的單克隆或多克隆抗體。
本發(fā)明還提供了一種疫苗或獸藥組合物，它包括上述預(yù)防上有效量的至少一種針對選自片形吸蟲屬、奧斯脫屬和毛圓線蟲屬種類及其相近種的病原體的抗原。疫苗組合物優(yōu)選包含多種針對許多病原體的保護性抗原。
本發(fā)明還提供了一種疫苗或獸藥組合物，它包括治療上有效量的至少一種抗上述保護性抗原的單克隆或多克隆抗體。該疫苗組合物優(yōu)選含有多種單克隆或多克隆抗體。
在優(yōu)選的形式，通過單一處理給動物提供多重保護。
根據(jù)本發(fā)明的疫苗或獸藥組合物可經(jīng)口服用藥也可徑非腸道用藥(如肌肉注射、皮下注射、皮內(nèi)注射和靜脈內(nèi)注射)。
所需劑量將隨著活性成分的抗原性而變化，且所需的量僅足以誘導(dǎo)對存在疫苗的曲型免疫應(yīng)答。
反應(yīng)性實驗容易形成所需的劑量。疫苗或獸藥組合物的典型初始劑量可以是大約0.001～1毫克活性組分/千克體重。根據(jù)需要可提高劑量頻率或者使用多重劑量以便提供滿意的保護水平。
根據(jù)本發(fā)明的疫苗或獸藥組合物還可包括獸藥上可接受的載體，稀釋劑或其賦形劑?；钚猿煞謨?yōu)選懸浮或溶解于載體中。載體可以是任何對動物無毒且與活性組分相配伍的固體或溶劑。合適的載體包括液體載體，如生理鹽水或其它等于或接近生理濃度的無毒鹽，和固體載體，如滑石(falc)或蔗糖。如果需要的話，可加入佐劑(如Freund完全的或不完全的佐劑)或免疫調(diào)節(jié)劑(如細胞因子)以增加抗原的抗原性。當(dāng)通過支氣管用藥時，疫苗應(yīng)適于以氣溶膠的形式提供。
根據(jù)本發(fā)明的疫苗或獸藥組合物可摻入到活性載體中(如牛痘病毒、沙門氏菌)或以DNA或RNA形式藥，正如Tang et al.，Nafure356152，1992中所述。
本發(fā)明還有一個方面是提供了一種含有針對上述鑒定和純化的病原體的診斷性抗原及其片段的診斷分析試劑盒。
該診斷試劑盒可用于檢測由選自普通奧斯脫、肝片形吸蟲、游行毛圓線蟲或其相近寄生蟲的病原體所引起的動物感染。
診斷分析試劑盒的使用可接合診斷分析。診斷分析可包括West-ern印跡技術(shù)，也可以是診斷性免疫分析。免疫分析可以是免疫沉淀分析、放射免疫分析、酶聯(lián)免疫分析、免疫熒光分析或者化學(xué)發(fā)光分析。
參考下面的實施例，本發(fā)明會得到更全面的描述。然而應(yīng)明白的是下面的描述僅是解釋性的，不應(yīng)以任何方式理解為對上述發(fā)明普通性的限制。
在附圖中

圖1a普通奧斯脫用以實驗免疫的Suffolk小羊中的淋巴(稀釋1/1000)探測普通奧斯脫L3幼蟲提取物的SDS-PAGE(12.5％凝膠)和Western)印跡分析。檢測到了兩簇具有表觀分子量為26～36kD和95～105kD的免疫反應(yīng)種類。用以攻擊感染過的綿羊的皺胃淋巴結(jié)培養(yǎng)物上清也鑒定到了同樣范圍的種類。
圖1b至1e通過斑點免疫分析用抗-駢聯(lián)體mAb或羊血清進行的克隆反應(yīng)將取自各克隆平板的IPTG濾紙切成碎片并與抗體反應(yīng)。用結(jié)合抗小鼠IgM＋IgG或抗綿羊IgG的堿性磷酸酶進行檢測。濾紙與如下物質(zhì)進行反應(yīng)抗-駢聯(lián)體mAb(圖1b)、陰性對照的IgM mAb(圖1c)、用純化的駢聯(lián)體抗原產(chǎn)生的羊血清(圖1d)、陰性對照羊血清(圖1e)。所示的克隆是7-1、7-2、5-2b(2個分離物)、3-2、8-2(2個不同的稀釋度)或陰性對照斑。圖1f用從克隆中親和純化的抗體探測普通奧斯脫L3提取物的West-em印跡L3幼蟲的液體提取物樣品在12.5％SDS-聚丙烯酰胺凝膠上電泳，然后電印跡。與如下物質(zhì)進行Western印跡反應(yīng)從斑點免疫分析中洗脫的親和純化抗體、mAb、羊血清或來自重復(fù)感染免疫的羊的皺胃淋巴，并用結(jié)合抗小鼠IgM＋IgG或抗羊IgG的堿性磷酸酶進行檢測反應(yīng)。泳道1陰性對照mAb；2抗駢聯(lián)體mAb，從3洗脫的親和純化抗體克隆7-1；4克隆7-2；5和6克隆5-2b(2種分離物)；7克隆3-2；8克隆8-2；9陰性對照斑；10苯抗駢聯(lián)體血清；11陰性對照血清；12免疫羊的淋巴；M預(yù)先標(biāo)記的分子量標(biāo)記物(Biorad)。駢聯(lián)體的位置用箭頭指示。圖1g克隆3-2和5-2b的核苷酸序列及其預(yù)測的氨基酸序列氨基酸以三字母代碼形式表示。圖1h普通奧斯脫克隆3-2和5-2b預(yù)測的氨基酸序列與旋盤屬絲蟲和C.elegans的GBP的序列對比。
利用ANGIS從數(shù)據(jù)庫中把GBP的氨基酸序列調(diào)出來(旋盤屬絲蟲來自GenPep數(shù)據(jù)庫，登記號UO 4046-1，C.elegans來自PIR數(shù)據(jù)庫，登記號S27798)。氨基酸以單字母代碼表示。圖1i證實駢聯(lián)體抗原是類似植物凝血素的GBP用緩沖液提取普通奧斯脫L3幼蟲，樣品通過asialofetuin-Af-figel 15柱。洗滌后，用100mM乳糖洗脫結(jié)合的蛋白質(zhì)。泳道M分子量標(biāo)記；1L3提取物；2來自柱的分級分離的最后沖洗液。3-7乳糖洗脫的餾分(fraction)。駢聯(lián)體抗原的位置用箭頭標(biāo)示。(12.5％SDS-PAGE，考馬斯蘭染色)。圖1j和1k
重組抗原在大腸桿菌中的表達圖1j和1kCTAB可溶性內(nèi)含體在13％凝膠中電泳，然后電印跡。一半Western印跡與抗駢聯(lián)體mAb進行反應(yīng)并用結(jié)合抗鼠IgG＋IgM(圖1j)的堿性磷酸酶檢測，另一半與純化駢聯(lián)體的羊抗血清反應(yīng)并用結(jié)合抗羊IgG(圖1k)的堿性磷酸酶檢測。泳道1克隆7-1；2克隆7-2；3克隆3-2，4克隆8-2；5克隆5-2b，6pMOSELOX對照。圖2a-2c普通奧斯脫(線蟲)三次不同試驗中感染L3幼蟲后接種過的羊(·-·)和對照羊(。-。)的每克糞便平均卵數(shù)(epg)。圖2d在第三次奧斯脫屬接種試驗中用捻轉(zhuǎn)血矛進行異源感染后對照羊和接種過的羊的平均糞便卵數(shù)。圖3游行毛圓線蟲用感染了游行毛圓線蟲的羊MLN上清探測三種L3線蟲幼蟲抗原的Western印跡。泳道1Bio-Rad預(yù)染的分子量標(biāo)記；泳道2普通奧斯脫L3抗原；泳道3捻轉(zhuǎn)血矛L3抗原；泳道4游行毛圓線蟲L3抗原。括號＝游行毛圓線蟲的抗原。圖4肝片形吸蟲用200Mc口服攻擊預(yù)先受過感染并已治愈的大鼠7天后分別用來自肝淋巴結(jié)(1)、腸系膜淋巴結(jié)(2)和脾(3)的上清探測NEF吸蟲抗原的Western印跡。泳道4Bio-Rad預(yù)染的分子量標(biāo)記。箭頭表示僅被MLN上清識別的大于200kD的抗原位置。圖5肝片形吸蟲用經(jīng)400Mc攻擊感染的二次免疫并治愈的大鼠肝淋巴結(jié)(5)、腸系膜淋巴結(jié)(6)和脾(7)上清探測NEJ抗原的Western印跡。泳道4Bio-Rad預(yù)染的分子量標(biāo)記箭頭表示僅被MLN上清識別的抗原的位置。圖6a-6d肝片形吸蟲用抗羊MHC II類(陰性對照)×40的mcAb38.27(圖6a)對NEJ吸蟲的間接過氧化物酶免疫染色。用mcAb FY3-5和FY1-6、mcAb FY3-3-2，×40(圖6b)，mcAb FY3-3-2，×100(圖6c)和mcAb FY3-3-1，×100(圖6d)觀察到類似的陰性染色。注意將圖6b和6c中的高度網(wǎng)狀型染色與圖6d中的更限定的斑點型染色進行比較。箭頭指向NEJ吸蟲的口吸盤。
實施例1普通奧斯脫寄生蟲和實驗動物普通奧斯脫的第三階段幼蟲(L3)從實驗感染寄生蟲的供體羊糞便培養(yǎng)物中收集。用普通奧斯脫幼蟲重復(fù)感染羊并隨后監(jiān)測糞便中蟲卵的排放情況來獲得免疫動物。當(dāng)攻擊感染劑量在糞便中很少或不產(chǎn)生蟲卵時，我們就說該動物已被免疫。羊一旦被免疫，就要灌用IVERMECTIN，之后要間隔至少四周方能用60000L3幼蟲攻擊感染，攻擊后五至八天處死動物。培養(yǎng)上清的制備按上述澳大利亞專利No.640364的描述取出皺胃淋巴結(jié)(ALN)并制備細胞懸液。在DME＋10％胎牛血清中以0.5～1.0×107個細胞/毫升的濃度在培養(yǎng)瓶中建立10～50ml的批量培養(yǎng)物。初始實驗表明培養(yǎng)上清的大多數(shù)抗體是由體內(nèi)刺激的淋巴結(jié)中的抗體分泌細胞產(chǎn)生，并且用商陸分裂素(PWM)刺激不再增加其分泌量。因此PWM沒有加到后續(xù)培養(yǎng)物中，在含5％CO2的空氣中37℃下培養(yǎng)細胞五天后收獲培養(yǎng)上清，然后在-20℃下儲存直至使用。皺胃淋巴結(jié)的插管和淋巴的收集如上所述讓羊(Suffolk羊)轉(zhuǎn)變成免疫狀態(tài)，用60000 L3幼蟲攻擊感染，攻擊后第四天給皺胃總淋巴導(dǎo)管插管。插管幾天后收集淋巴，將無細胞的淋巴儲存于-20℃?zhèn)溆?。供SDS-PAGE和Western印跡使用的抗原制備在含有約0.5％NaHOCl的富含CO2的空氣中37℃下處理普通奧斯脫的第三階段幼蟲20分鐘以除去其第二階段的鞘。然后反復(fù)沖洗幼蟲，并在磷酸鹽緩沖的鹽水(PBS)pH7.4中3000g離心1 0分鐘。第六次沖洗后，將它們轉(zhuǎn)移到含有200U/ml青霉素和0.2μg/ml鏈霉素的500ml DME培養(yǎng)基(pH6.8)中，并在含20％CO2空氣中39℃下培養(yǎng)3天。將培養(yǎng)液在20℃下以3000g離心15分鐘，將沉淀的體外轉(zhuǎn)變的L4幼蟲貯于-70℃。
通過冷凍解凍三次。然后用多用勻漿器(Kinematica GmbH，瑞士)勻漿，在50mM Tris-HCl pH 8.0、150mM NaCl中過夜提取，并在50,000xg下離心30分鐘從去鞘的L3幼蟲、體外變成的L4幼蟲、體內(nèi)的L4幼蟲和成蟲中提取抗原。含已溶解抗原的上清在-70℃下保存。
提取的抗原在非還原條件下在12.5％(W/V)SDS-聚丙烯酰胺凝膠上電泳，并Western印跡到PVDF膜(Immobilon，Millipore)或硝化纖維膜上。用于接種試驗的抗原制備。
在富含CO2的空氣中37℃下處理普通奧斯脫第三階段幼蟲2至3小時以除去其第二階段鞘。去鞘的L3幼蟲冷凍解凍三次，然后用基底玻璃勻漿器勻漿，接著在含有2％(W/V)十六烷基三甲基溴化銨(CTAB，Sigma)的150mM NaCl、50mM Tris pH8.0的溶液中過夜提取。在300g下離心30分鐘以除去其它物質(zhì)。再將上清在15，000xg下離心30分鐘，將溶解的提取物貯存于-20℃。
已提取的抗原在非還原條件下(沒有煮沸)在10％CTAB-丙烯酰胺凝膠上電泳。Western印跡凝膠兩端的2條帶并將這些帶與陽性淋巴反應(yīng)來鑒定凝膠的合適區(qū)域。將相應(yīng)于免疫反應(yīng)區(qū)域的凝膠區(qū)切下、搗碎并在2％CTAB溶液中培養(yǎng)過夜以被動洗脫抗原。用Dowex樹脂在2M尿素pH10中培養(yǎng)15分鐘以除去CTAB，然后在PBS中透析過夜以除去尿素。在Centriprep濃縮器(Amicon)中濃縮抗原，用BCA分析法(Pierce)確定蛋白質(zhì)濃度并用于免疫羊。當(dāng)在SDS-PAGE凝膠上電泳時該抗原制品表明含有26～36kD的免疫反應(yīng)區(qū)段。抗原鑒定用從感染的羊的ALN體外培養(yǎng)上清和從插管皺胃淋巴結(jié)中收集的淋巴來檢測Western印跡過的抗原制品。培養(yǎng)上清和淋巴都集中顯示分子量為26～36kD和95～105kD的兩區(qū)段(見圖1)。
印跡的抗原與植物凝血素連接物的培養(yǎng)表明該抗原能結(jié)合一些植物凝血素。這表明一些抗原是糖基化的。用Western印跡鑒定26～36kD抗原的蛋白質(zhì)序列用SDS-PAGE分離蛋白質(zhì)并接著用CAPS緩沖液電轉(zhuǎn)移到ProBlott測序膜上后，測定該區(qū)段內(nèi)抗原的N-末端氨基酸序列。用考馬斯亮藍染色確定轉(zhuǎn)移蛋白質(zhì)在膜上的位置并將其切下。在裝有印跡膠片的Applied Biosystems 476A蛋白質(zhì)測序儀中測定其序列。經(jīng)過用澳化氰消化CTAB純化的抗原，用SDS-PAGE分離其片段，印跡到ProBlot上并測序(如上)獲取進一步的中間序列資料。蛋白質(zhì)測序結(jié)果歸納如下。位于26～36kD區(qū)段的上端部分的兩條帶沒有給出任何序列并假定其N-末端被封閉。32～36kD區(qū)段的上端兩條帶進一步稱為“駢聯(lián)體(doublet)”，因為產(chǎn)生的抗該區(qū)段的單克隆抗體同時識別這兩條帶(見圖1f)，這表明它們是相似的分子。
使用FASTA程序，在澳大利亞國家基因組信息服務(wù)中心可得到的序列數(shù)據(jù)庫中篩選26-36kD區(qū)段下端帶獲得的序列。結(jié)果如下所示。根據(jù)它們與數(shù)據(jù)庫中的序列有高度同源性的特征可鑒定其中的兩個分子。同源序列是原肌球蛋白和谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶。
普通奧斯脫序列與它們的同源情況是(A)與原肌球蛋白1.N-末端序列MKAEEVRQALK2.中間序列VEADLERAEERAEAAGENKVVVL(B)與谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶
N-末端VQYKLYYFDGRXAAEV為了獲知含有駢聯(lián)體帶的區(qū)段序列，制備了勻漿的普通奧斯脫第3階段幼蟲的含水提取物，并在還原條件下經(jīng)SDS-PAGE分離提取物中的蛋白質(zhì)。從考馬斯亮藍染色的凝膠上切下駢聯(lián)體帶，然后經(jīng)電洗脫從切下的膠段上擺取蛋白質(zhì)。分離的蛋白質(zhì)用胰蛋白酶消化，因此產(chǎn)生的多肽經(jīng)高效反向液相色譜(HPLC)分離。利用Ed-man降解法在Applied Biosystems 476A蛋白質(zhì)測序儀中測序純化的多肽。確定了如下多肽序列1)SAHGPPGQ2)FpHGPSYQHGYA3)IVTHPNR編碼駢聯(lián)體抗原的cDNA克隆文庫制備從新鮮收獲的L3幼蟲中提取RNA，該幼蟲已在液氮中驟然冷凍過(Chomczynski 80 Sacchi，1987，Anal.Biochem.，162，156-159)。在mAP紙(Amershan Australian)上用寡聚dT親和層析分離信使RNA(mRNA)使用cDNA Synthesis System Plus盒(AmershamAustralian)用帶有寡聚dT或者隨機引物的2μg mRNA制備雙鏈互補DNA(cDNA)。匯集寡聚dT和隨機引物產(chǎn)生的cDNA并加入EcoR1連接物(cDNA快速連接物連接元件，Amersham Australia)，將銜接的cDNA連接到EcoR1剪切的、脫磷酸化的噬菌表達載體λMOSELOX臂(Amersham Australia)上并用λ-DNA體外包裝元件(AmershamAastralia)將其包裝上。獲得了一個1.4×106噬菌斑形成單位(pfu)/ml的初始文庫，其中9％以上是重組體。該文庫在使用前在大腸桿菌ER1647細胞中擴增。文庫篩選5×105pfu的擴增的cDNA文庫以5×104pfu/板涂布于大腸桿菌BL21(DE3)pLys E細胞上。當(dāng)針刺大小的噬菌斑出現(xiàn)(在37℃培養(yǎng)4-6小時)后，在平板上鋪上硝化纖維素濾紙(該濾紙應(yīng)已用10mM異丙基硫代-β-半乳糖(IPTG)浸泡過)并在37℃下再培養(yǎng)6小時。然后平板在4℃下保存過夜。從平板上取出濾紙，在TNT(10mM tris-HCl，pH8，150mM NaCl，0.05％Tween 20)中沖洗，在BLOTTO(5％W/V低脂肪奶粉的TNT)中封閉，并與產(chǎn)生的抗駢聯(lián)體抗原的IgM小鼠單克隆抗體(mAb)(未釋稀的培養(yǎng)上清于室溫下培養(yǎng)2小時。在TNT中洗過后，將濾紙與結(jié)合有免抗-小鼠IgG＋IgM(Jackson Immunoresearch)的以15000在BLOTTO中稀釋的堿性磷酸酶在室溫培養(yǎng)1小時。再次在TNT中洗過后，用0.165mg/ml的5-澳-3-氯-4-碘磷酸鹽(BCIP)和0.33mg/ml的氮藍四唑(NBT)在堿性磷酸酶緩沖液(0.1M tris-HCl，pH9.5，0.1MNaCl，5mM MgCl2)中顯色。選出了15個被推定的陽性噬菌斑(其中一些是很不明顯的)，再用如上所述的單克隆抗體重新篩選之后5個噬菌斑仍呈陽性。這些噬菌斑經(jīng)第三次篩選后，涂布在ER1647細胞上以制備其擴增的種子?？寺》治鰹榱舜_定克隆對駢聯(lián)體抗原的特異性，進行了噬菌斑免疫分析。噬菌斑純化的克隆在BL21(DE3)pLys E大腸桿菌細胞上涂布并如上所述用IPTG濾紙誘導(dǎo)。然后濾紙與如下物質(zhì)反應(yīng)抗駢聯(lián)體mAb、無關(guān)IgM小鼠mAb、在羊中產(chǎn)生的用于抗純化的駢聯(lián)體抗原的羊抗血清或者陰性對照羊血清(兩種羊血清都在BLOTTO中以1∶50稀釋，第二抗體是結(jié)合了以1∶5000稀釋的來自Jackson Immunore-search的免抗羊IgG的堿性磷酸酶。如上所述檢測陽性反應(yīng)。所有克隆都對抗-駢聯(lián)體mAb呈陽性，而對無關(guān)mAb和陰性羊血清呈陰性。兩個克隆(命名為3-2和5-2b)對羊產(chǎn)生的抗駢聯(lián)體血清呈強烈陽性(圖1b～1e)。
以每80mM平板2000噬菌斑將克隆，或入MOSELOX對照噬菌斑涂布開來以達到匯合融菌。一旦針刺噬菌斑出現(xiàn)，就加入IPTG濾紙并繼續(xù)培養(yǎng)過夜。用TNT充分沖洗濾紙，在BLOTTO中封閉1小時，并用抗駢聯(lián)體羊抗血清(BLOTTO中1∶50稀釋)室溫培養(yǎng)4小時。(在使用前，將該血清與來自含野生型入MOSELOX噬菌斑的平板的濾紙一起培養(yǎng)以除盡其中的抗一大腸桿菌抗體)。然后在TNT中將濾紙洗五次，在硼酸洗滌緩沖液(0.1M硼酸、0.5M NaCl、0.05％Tween 20，pH8)中洗一次并在PBS(140mM NaCl、2.7mM KCl、8mM Na2HPO4、0.0015mM KH2PO4)中洗一次。將每張濾紙在5ml0.1M甘油、0.15M NaCl，pH2.6的溶液中洗脫一分鐘以洗脫下對各克隆特異性的已結(jié)合的親和純化抗體，立即加到含300μl 1Mfris-HCl，pH8溶液的試管中進行中和。在4℃下將該抗體在TNT中透析1至2小時，加入低脂防奶粉以達到5％W/V并儲存于-20℃。L3幼蟲液體提取物在12.5％變性SDS-聚丙烯酰胺凝膠上電泳，用電印跡法將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到Immobilon膜(Millipore)上。將膜在TNT中沖洗，在BLOTTO中封閉并切成條塊。將條塊與如下物質(zhì)一起于4℃過夜培養(yǎng)來自克隆的親和純化抗體、抗駢聯(lián)體的mAb或陰性對照mAb、或者羊抗駢聯(lián)體抗血清或陰性對照羊血清。用結(jié)合抗一種類抗體的堿性磷酸酶進行檢測，隨后用BCIP和NBT顯色。在對羊抗-駢聯(lián)體抗血清呈陽性的2個克隆(即3-2和5-2b)中親和純化的抗體在Western印跡特異性地識別來自普通奧斯脫幼蟲的駢聯(lián)體帶。
按照載體制造商的建議(Amersham Australia)在存在羧芐青霉素的條件下將克隆涂布于大腸桿菌BM25.8細胞上使其轉(zhuǎn)為質(zhì)粒形式(在pMOSELOX中)。按照《Molecular cloning，A Laboratory Manual，第二版》(Sambrook，J.，F(xiàn)ritsch，E.F. & Maniatis，T.，1989，ColdSpring Harbor Laboratory Press)中所述的堿性溶菌和CsCl密度梯度離心制備質(zhì)粒DNA。用EcoRl消化質(zhì)粒DNA，并在含有50μg/ml溴化乙錠的TAE緩沖液(40mM fris-乙酸，pH8，1mM EDTA)中于1％瓊脂糖凝膠上分析質(zhì)粒DNA?？寺?-2含有大約為1000，400和200個堿基對的三個EcoR1片段，而克隆5-2b含有1000和400堿基對的兩個片段。DNA測序使用測序酶試劑盒根據(jù)制造商的說明書(United Sfafes Biochemi-cal Corporafion)以雙脫氧法進行DNA測序。測序反應(yīng)在α-35S-dATP存在的條件下進行并對凝膠進行放射自顯影。起初使用以插入片段兩邊的載體為基礎(chǔ)的引物(T7基團10和SP6引物)。隨后用來測序整段插入序列的引物根據(jù)所獲的序列來設(shè)計。除了克隆3-2含有一個相當(dāng)長的3非翻譯區(qū)(包括mRNA的poly(A)尾巴)外，克隆3-2和5-2b含有相同的DNA序列。該DNA序列及其預(yù)測的氨基酸序列在圖1g中顯示。預(yù)測的氨基酸序列用來通過BLAST程序(Altschul，S.F.，Gish，W.，Miller，1W.Myers，E.W.80 Lipman，D.J.，1990，J.Mol.Biol.215，403-410)對綜合蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫進行搜尋，該搜尋以ANGIS作為界面在國家生物技術(shù)信息中心的計算機上進行。發(fā)現(xiàn)該序列與來自Caenorhabditis elegans和旋盤屬絲蟲的32kD類植物凝血素β-半乳糖苷-結(jié)合蛋白質(zhì)(GBP)具有高度同源性。普通奧斯脫序列與C.elegans序列有69％相同并與旋盤屬絲蟲序列有78％相同。氨基酸序列的對比如圖1h所示。通過與這些同源序列的類比，兩個克隆都含有起始序列ATG。該駢聯(lián)體是一種類植物凝血素β-半乳糖苷結(jié)合蛋白質(zhì)的證據(jù)駢聯(lián)體抗原與C.elegans 32k GBP所共有的特征包括在SDS-PAGE上的大小、缺乏糖基化和封閉的N-末端(見Hirabayashi，J.，Satoh，M.和Kasai，K.，1992，J.Biol.Chem.267，15485-15490)。C.elegans GBP的一個特征是它能夠通過結(jié)合到asialofetuin柱上而被親和純化(Hirabayashi，J.，Satoh，m.，Ohyama，Y.& Kasai，K.，1992，J.Biochem.Tokyo 111，553-555)在含水緩沖液(150mM NaCl、2mM EDTA、50mM tris-HCl，pH8)中提取普通奧斯脫的L3幼蟲，將提取物用于過asialofefuin-af-figel 15柱用含有100mM乳糖的上述緩沖液洗脫結(jié)合的蛋白質(zhì)。SDS-PAGE分析表明該駢聯(lián)體結(jié)合到asialofefuin柱上(圖表1i)。這證實該駢聯(lián)體確實是一種類植物凝血素β-半乳糖苷結(jié)合蛋白質(zhì)。由于駢聯(lián)體的兩條帶都結(jié)合到糖柱上，因此，它們都是類植物凝血素GBP。還不知道為什么該GBP在普通奧斯脫中顯示兩條帶而在C.el-egans中只顯示一條帶。也許普通奧斯脫的蛋白質(zhì)經(jīng)歷了某種程度的翻譯后裂解。
線蟲中的這些GBP的功能還不清楚，但是對C.elegans而言，據(jù)推測，它們涉及形態(tài)發(fā)生的調(diào)節(jié)，如表皮的形成。重組抗原的表達使用D.Hanahan的簡單轉(zhuǎn)化方法〔在《DNA克隆實用方法》第一卷，1985(D.M.Glover編輯)，IRL出版社，牛津，第115頁〕將來自克隆或pMOSELIX對照的質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)pLysE細胞中。有必要將該質(zhì)粒從BM25.8轉(zhuǎn)移到該菌株上，因為重組抗原在T7啟動子控制下表達而且BL21(DE3)pLysE細胞是在Lac啟動子控制下攜帶編碼T7聚合酶的基因。挑選菌落并在37℃生長過夜。將過夜培養(yǎng)物以1∶100稀釋，取10ml培養(yǎng)物接種并生長5小時。加入IPTG到0.1mM以誘導(dǎo)重組蛋白質(zhì)的合成并繼續(xù)培養(yǎng)過夜。將大腸桿菌細胞沉淀在含有0.1％Triton x-100的PBS中重新懸浮并用聲處理將其擊碎。沉淀不溶性物質(zhì)(包括內(nèi)含體)并在1％CTAB中用聲處理重新懸浮。樣品用SDS-PAGE和Western印跡進行分析(圖1j和1k)。用抗駢聯(lián)體mAb或用抗駢聯(lián)體抗原的羊抗血清檢測在Western印跡中呈陽性的克隆3-2和5-2b產(chǎn)生的融合蛋白質(zhì)。與此相反，克隆7-1、7-2和8-2產(chǎn)生的融合蛋白質(zhì)對駢聯(lián)體mAb呈陽性但對羊抗血清不呈陽性，這證實了前面所述的斑點免疫分析的結(jié)果(圖1b～1e)。pMOSELOX對照蛋白質(zhì)不與兩種抗體反應(yīng)。所有重組融合蛋白質(zhì)和pMOSELOX對照蛋白質(zhì)都全部定位于CTAB-溶融的細胞沉淀中，這表明它們在內(nèi)含體中表達。接種試驗用含有26～36kD免疫反應(yīng)性區(qū)段的天然普通奧斯脫抗原的CTAB提取物進行了三個接種試驗。
接種過的羊免疫三次，每次間隔2至3周，每次免疫使用50～100μg蛋白質(zhì)(在quil A中)。對照羊只接受quil A。所有免疫都以皮內(nèi)給藥。在最后一次免疫2至3周后用20,000L3幼蟲攻擊感染所有的羊并監(jiān)測其糞便蟲卵數(shù)。三個不同的接種試驗的結(jié)果如圖2a～2c所示，與對照相比，接種組的糞便蟲卵數(shù)明顯減少。
第一個試驗由5只接種羊和3只對照羊組成。第二個試驗有10只接種羊和8只對照羊。第三個試驗由7只接種羊和7只對照羊組成。物種的交叉反應(yīng)當(dāng)用以普通奧斯脫26～36kD抗原接種的羊的血清檢測時，在奧氏奧斯脫抗原制品中也鑒定到了一個26～36kD抗原區(qū)段(未顯示)。這表明相似的抗原也存在于該物種中，也可能存在于其它線蟲種類中。
用粗制可溶性捻轉(zhuǎn)血矛的L3提取物在第三次奧斯脫接種試驗的最后進行了周圍血液淋巴細胞增生試驗。與對照羊(平均值為6122cpm)相比，在接種羊(平均值為24003cpm)中觀察到了由捻轉(zhuǎn)血矛抗原引起的極顯著(p＜0.02)的刺激，這表明在26～36kD抗原區(qū)段兩種寄生蟲間存在交叉反應(yīng)。為了評估交叉保護，第三試驗中的所有羊都喂用ivermecfin以去除殘留的奧斯脫蟲，并用10,000捻轉(zhuǎn)血矛幼蟲感染。如圖2d中所示，與對照組相比，接種的羊的糞便蟲卵數(shù)始終較低，這表明發(fā)生了交叉保護。因為對照組的糞便蟲卵數(shù)存在很大差異，日蟲卵數(shù)得不到統(tǒng)計顯著性，但是兩組間的方差(F-檢驗)存在顯著差異。這兩個結(jié)果表明在血矛屬和奧斯脫屬的物種間存在顯著的異源性刺激和保護，也可能存在類似的保護性分子。95～105kD抗原的特征制備的抗澳大利亞專利640,364所述的捻轉(zhuǎn)血矛的60～90kD表面抗原的特異性抗血清也與同樣95～105kD區(qū)段的普通奧斯脫L3幼蟲抽提物發(fā)生反應(yīng)。這表明它是一種與捻轉(zhuǎn)血矛中所述的類似的抗原。
實施例2游行毛圓線蟲實驗設(shè)計經(jīng)過用游行毛圓線蟲感染幾次來免疫羊然后保持至少4個月不受感染。用50,000游行毛圓線蟲L3幼蟲攻擊感染，10天后將羊殺死并取下第一腸系膜淋巴結(jié)(MLN)。按對普通奧斯脫所述的方法加工和培養(yǎng)淋巴結(jié)細胞，其上清用來探測寄生蟲抗原的Western印跡。如前面對普通奧斯脫所述的方法制備普通奧斯脫、捻轉(zhuǎn)血矛和游行毛圓線蟲的L3幼蟲抗原提取物。
提取的抗原在還原條件下于12.5％(W/V)SDS-PAGE上電泳并Western印跡到PVDE膜(Immobilon，Millipore)上。用MLN-上清探測Western印跡并用結(jié)合抗一羊Ig(DAKO)的過氧化物酶顯色。結(jié)果和討論觀察到了與分子量為32～35kD間孤游行毛圓線蟲抗原提取物的強烈反應(yīng)，顯然它由駢聯(lián)體構(gòu)成(圖3)。與普通奧斯脫和捻轉(zhuǎn)血矛抗原沒有或只有較弱反應(yīng)。然而，在SDS-PAGE上，游行毛圓線蟲駢聯(lián)體抗原與上述普通奧斯脫抗原具有相同的位置，因此有可能兩者是基本相似的分子但具有能最強地被同源上清抗體探針識別的種特異性的抗原決定基。
實施例3肝片形吸蟲我們已經(jīng)使用Western印跡技術(shù)用按澳大利亞專利No.640364所述方法獲取的抗體探針鑒定了推定的肝片形吸蟲保護性抗原。類似的抗原也可存在于其它片形吸蟲屬種類(如大片形吸蟲)和其它寄生線蟲(如Schistosoma spp.)中。
寄生蟲和抗原提取從Ciba-Geigy(N.S.W.，澳大利亞)獲取肝片形吸蟲后囊蚴蟲(Mc)。通過如前所述的體外脫囊法(澳大利亞專利No.640364)獲取剛脫囊的幼蟲(NEJ)。口服感染17天后從小鼠肝中回收幼年肝吸蟲。不同階段的吸蟲在含有蛋白酶抑制劑的PBS中聲處理，在SDS非還原性樣品緩沖液中煮沸，然后在10％SDS-PAGE凝膠上電泳并轉(zhuǎn)移到PVDF膜(immobilon-P Millipore，MA)上以供進行如前所述的Western印跡(專利號640364)。培養(yǎng)上清的制備基本上如前所述(專利號640364)，以每毫升培養(yǎng)基(含有10％胎牛血清、2mM谷氨酰胺、100μ/ml青霉素、100μg/ml鏈霉素和2.5×10-52—巰基乙醇的DME培養(yǎng)基)3×106個細胞體外培養(yǎng)脾、肝淋巴結(jié)(HLN)和腸系膜淋巴結(jié)(MLN)細胞培養(yǎng)4至5天后收獲上清并貯存于—20℃直至使用。實施設(shè)計用100肝片形吸蟲Mc感染8至9周齡的PVC大鼠，10天后用殺吸蟲劑Fasinex 120(Ciba-Geigy)以75μg/克劑量處理。6周后用200Mc經(jīng)口服攻擊感染大鼠，攻擊7-10天后殺死大鼠以收集HLN、MLN和脾細胞。結(jié)果當(dāng)不存在“爆發(fā)性”感染(即用殺吸蟲劑完全治愈和根除初始感染)時，第二次攻擊感染后不同淋巴器官之間的局部抗體反應(yīng)存在顯著差異。當(dāng)脾或HLN上清用來探測NEJ抗原的Western印跡時沒有觀察到反應(yīng)，然而一個明顯的抗原駢聯(lián)體被來自MLN細胞的上清所識別。該抗原位于110kD分子量標(biāo)記之上(圖4)，并在隨后的實驗中(未顯示)見到它遷移到200kD分子量標(biāo)記之上，進而稱為大于200kD的抗原。
當(dāng)檢測到“爆發(fā)性”感染的信號時(即肝臟肉芽瘤或膽導(dǎo)管中的成蟲吸蟲)，用HLN上清觀察到了一種NEJ抗原識別的多變而復(fù)雜的類型，但是第二次攻擊感染之后大于200kD抗原又僅僅而且唯一地只被MLN細胞上清識別(未顯示)。
以缺乏肉眼可見的肝小管和在搗碎的全部肝臟制品中完全缺乏幼年吸蟲判定所有大鼠都對口服攻擊感染產(chǎn)生免疫。
當(dāng)用17日齡肝吸蟲抗原與跟上述相同的MLN上清在Western印跡上進行反應(yīng)時，沒有觀察到這種大于200kD駢聯(lián)體反應(yīng)(未顯示)，這表明該抗原對NEJ階段具有特異性。結(jié)論已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在非還原SDS-PAGE凝膠上分子量大于200kD的駢聯(lián)體抗原，該抗原存在于NEJ階段并且能在給免疫大鼠口服攻擊感染后的早期次級應(yīng)答期間被MLN細胞培養(yǎng)上清專一性地識別。由于在大鼠中形成的抗口服攻擊感染的免疫已表明發(fā)生于消化道水平(查閱Vet.Parasitol.1986，20，63～93)，因此該抗原是一種很有希望的候選疫苗。大于200kD的抗原似乎對NEJ吸蟲具有階段特異性，因為在相似條件下在從肝組織收集到的吸蟲中沒有檢測到該抗原，因此它可能只對NEJ階段有效。
實施例4肝片形吸蟲以實施例2中報道的方式進行寄生蟲和抗原提取以及培養(yǎng)上清的制備。實驗設(shè)計用50個肝片形吸蟲Mc口服感染8至9周齡的PVC大鼠，14天后用150μg Triclabendazole/克將其治愈。3天后再次用150個Mc口服感染，4天后跟上次那樣將其治愈。第一次感染1-2個月后經(jīng)口服攻擊感染用400Me大鼠，7天后將其殺死以收集HLN、MLN和脾細胞。單克隆抗體(mcAb)的產(chǎn)生如上面那樣對大鼠進行免疫和攻擊感染，并在攻擊感染5天后將其殺死。制備MLN細胞懸液，并與由英國牛津MRC Cellubr Im-munology Unit提供的Y3大鼠骨髓瘤細胞融合。針對NEJ和17日肝階段抗原在Western印跡上篩選融合上清。以鼠胸腺細胞作為飼養(yǎng)細胞將陽性融合體重新克隆至少二次。利用mcAb的表面染色用含有0.05％迭氮化鈉的mcAb上清液在冰上培養(yǎng)體外脫皮的NEJ30分鐘。在冷的PBS-迭氮化合物中洗滌三次，然后象前面那樣用結(jié)合了兔抗-大鼠免疫球蛋白(DAKO-Denmark)并且以1∶20在PBS中稀釋的過氧化物酶進行培養(yǎng)。在PBS中洗三次，之后用Di-amino聯(lián)苯胺底物顯色數(shù)分鐘，再稀釋以中止顯色。在PBS中再洗兩次后，NEJ在含有1％甲醛和2％葡萄糖的PBS中固定并在光學(xué)顯微鏡下評價其染色情況。結(jié)果實施例3的結(jié)論部分所述的大于200kD的抗原也出現(xiàn)在免疫過兩次的大鼠的MLN上清液中。另外，這種高度免疫的MLN上清液也識別約32kD的抗原和分子量的在42kD和100kD之間的彌散性抗原(圖5)。這兩種額外的抗原也僅能在NEJ抗原的印跡上檢測到而在17日齡肝階段抗原的印跡上檢測不到。單克隆抗體(mcAb)從二次免疫和攻擊感染后的MLN細胞的融合體中獲得了一些單克隆抗體。其中的三個mcAb(F.h.1-3)似乎識別用MLN上清液檢測到的三種抗原。從感染的大鼠肝淋巴結(jié)中產(chǎn)生了一個mcAb(FY 1-6)并且該mcAb識別也被NEJ和肝階段吸蟲的感染血清所強烈識別的抗原。所有產(chǎn)生的mcAb和它們各自的分子量抗原都歸納在表1中。
后繼實驗(未顯示)表明mcAb FY4-7-12、FY3-3-1和FY3-3-2還與感染未處理過的小鼠2天后(而不是4天)收集的腹腔吸蟲發(fā)生反應(yīng)。
ND＝未做過*＝在活NEJ上進行表面染色的檢測當(dāng)與活NEJ反應(yīng)時，2個mcAb(FY3-3-1和FY3-3-2)與NEJ吸蟲的表面發(fā)生反應(yīng)，且各自具有獨特的染色表現(xiàn)(圖6)。生化特征將2-巰基乙醇(終濃度為5％V/V)加到NEJ蛋白質(zhì)提取物中以檢測被mcAb識別的分子的還原敏感性。還原后抗原F.h.2有顯著的上移現(xiàn)象，這表明該抗原含有許多二硫鍵。還原后被mcAb FY3-3-2識別的頂部帶在凝膠上下移而抗原F.h.6未移動。
為了確定該mcAb是否識別碳水化合物抗原決定基，將NEJ抗原提取物的SDS-PAGE凝膠印跡到PVDF膜上并且按Woodward，MP等(J.Immunol.Methods，78143，1985)所述方法用高磺酸進行處理。高碘酸處理后mcAbFY3-3-2和FY1-6的反應(yīng)性分別喪失或者劇烈降低，這表明這些mcAb與碳水化合物抗原決定基發(fā)生反應(yīng)。印跡的高碘酸處理沒有改變mcAbFY3-3-1和FY4-7的反應(yīng)性。mcAbFY3-3-2對碳水化合物抗原決定基的識別解釋了它在Western印跡上的彌散識別方式，因為碳水化合物抗原決定基存在于許多糖蛋白中。氨基酸序列資料NFJ抗原制品在SDS-PAGE上電泳，印跡到ProBlot膜(AppliedBiosystems)上并用考馬斯亮藍染色。相應(yīng)于抗原號F.h.2和F.h.6的位置的帶被切下來并直接在ABI型476A蛋白質(zhì)測序儀中測序。獲得的N-末端序列是F.h.6LEDNGRTHWAVLVAF.h.2KPNYKRQFEPFSDELIHYINLEF.h.2的序列與孟氏血吸蟲的組織蛋白酶B(Sm31)mRNA〔Mol.Biochem.Parasitol.33113-122(1989)〕在14個氨基酸的重疊區(qū)有64.3％是相同的。
對于F.h.6沒有發(fā)現(xiàn)有明顯的同源性。結(jié)論本發(fā)明包括了那些被免疫攻擊感染的大鼠的MLN上清所識別的抗原和所有在表1中所述的抗原及其各自的抗體。因為在大鼠中針對口服攻擊感染而形成的免疫性表明出現(xiàn)在抗早期吸蟲階段的消化道和腹腔水平上(查閱Vet.Parasitol.1986，2063～93)，所以這些抗原是候選疫苗。其中四種抗原對NEJ和2日齡吸蟲表現(xiàn)出具有階段專一性，因為在類似的條件(Western印跡)下在感染的晚期收集的吸蟲中檢測不到它們，因此它們可能參與保護作用。階段專一性抗原以前在肝片吸蟲中沒有鑒定出來，而且僅僅在本發(fā)明中通過使用分泌新抗體的細胞探針才被檢測出來。
最后，要明白的是，在沒有背離本文概括的本發(fā)明實質(zhì)的情況下可進行各種其它的修飾和/或改變。
權(quán)利要求
1.一種抗普通奧斯脫線蟲或有關(guān)感染的推定的保護性抗原或其片段，選自具有前文所述的近似分子量范圍為26～36和95～105千道爾頓的抗原。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的推定的保護性抗原，其中26～36kD抗原包括在32～36kD位置上的駢聯(lián)體抗原。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的推定的保護性抗原，其中駢聯(lián)體抗原是類植物凝血素β-半乳糖苷結(jié)合蛋白質(zhì)，并且可包含下列多肽序列中的一個或多個SAHGPPGQFPHGPSYQHGYAIVTHPNR
4.根據(jù)權(quán)利要求1的推定的保護性抗原，其中在26～36kD范圍的抗原與普通奧斯脫含有N-末端序列MKAEEVRQALK和中間序列VEADLERAEERAEAAGEN-KVVVL的原肌球蛋白同源。
5.根據(jù)權(quán)利要求1的推定的保護性抗原，其中26～36kD范圍的抗原是普通奧斯脫中的含有N-末端序列VQYKLYYFDGRX-AAEV的谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶的同源物。
6.一種抗游行毛圓線蟲或有關(guān)感染的推定的保護性抗原或其片段，具有前文所述的32-35千道爾頓的近似分子量。
7.根據(jù)權(quán)利要求6的推定的保護性抗原，其中該抗原是駢聯(lián)體抗原。
8.一種選自前文所述的具有近似分子量為28千道爾頓、32千道爾頓、37千道爾頓、42至100千道爾頓、54至55千道爾頓和大于200千道爾頓的抗原的抗肝片形吸蟲或其相關(guān)感染的推定的保護性抗原或其片段。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的推定的保護性抗原，其中大于200kD的抗原是駢聯(lián)體抗原。
10.根據(jù)權(quán)利要求8的推定的保護性抗原，其中32kD抗原包括N-末端序列KPNYKRQFEPFSDELIHYINLE。
11.根據(jù)權(quán)利要求8的推定的保護性抗原，其中54～55kD抗原含有N-末端肽序列LEDNGRTHWAVLVA。
12.根據(jù)權(quán)利要求8的推斷的保護性抗原，其中肝片吸蟲抗原專一性地被免疫、攻擊感染的大鼠腸系膜淋巴結(jié)(MLN)細胞上清識別。
13.根據(jù)權(quán)利要求1至12任意一項的，與選自片形吸蟲屬、奧斯脫屬和毛圓線蟲屬的種類及其相近物種病原體相聯(lián)系的抗原的制備方法，該方法包括(1)提供一種選自片形吸蟲屬、奧斯脫屬和毛圓線蟲屬種類及其相近物種的病原體樣品；一種相應(yīng)的抗體探針，包括至少一種抗各自病原體的抗體，其生產(chǎn)方法包括提供一種用選自片形吸蟲屬、奧斯脫屬和毛圓線蟲屬的種類及其相近物種的病原體或病原體提取物攻擊感染免疫動物后短時間內(nèi)從免疫動物中提取的生物樣品，從生物樣品中分離細胞，在合適的培養(yǎng)基中體外培養(yǎng)細胞并且收獲所說的細胞產(chǎn)生的抗體；(2)用相應(yīng)的抗體探針探測病原體樣品以檢測出至少一種抗原；(3)分離被檢測的抗原。
14.根據(jù)權(quán)利要求13的方法，其中病原體樣品是在其最易受攻擊的發(fā)育階段提取的。
15.根據(jù)權(quán)利要求14的方法，其中樣品是在幼蟲階段提取的。
16.根據(jù)權(quán)利要求13的方法，其中相應(yīng)的抗體探針以從培養(yǎng)基中收獲的上清形式存在。
17.根據(jù)權(quán)利要求16的方法，其中上清是來自免疫攻擊感染的大鼠的腸系膜淋巴結(jié)(MLN)細胞。
18.一種生產(chǎn)抗根據(jù)權(quán)利要求1至12中任何一個的，選自片形吸早屬、奧斯脫屬和毛圓線蟲屬物種病原體的抗原的單克隆抗體的方法，該方法包括(1)提供一種從用針對上述病原體的保護性抗原免疫的動物中獲得的并且能產(chǎn)生抗所說的保護性抗原或其片段的抗體的B細胞；一種骨髓瘤細胞；(2)將骨髓瘤細胞與B細胞融合；(3)繁殖由此形成的雜交瘤；(4)收獲所說的雜交瘤產(chǎn)生的抗體。
19.根據(jù)權(quán)利要求18的方法，其中抗原是肝片形吸蟲抗原。
20.一種抗根據(jù)權(quán)利要求18或19的方法產(chǎn)生的保護性抗原的單克隆抗體。
21.一種抗前文所述的選自由FY 4-7-12、FY3-3、FY3-3-2、FY3-5、FY4-7-6和FY1-6組成的組中的肝片吸蟲抗原的單克隆抗體。
22.一種針對根據(jù)權(quán)利要求1至12中任何一個的，選自片形吸蟲屬、奧斯脫屬和毛圓線蟲屬物種及其相近物種的病原體的人工合成的抗原性多肽的制備方法，該方法包括(1)提供一種從選自片形吸蟲屬、奧斯脫屬和毛圓線蟲屬物種及其相近物種病原體的樣品產(chǎn)生的cDNA文庫或基因組文庫；一種相應(yīng)的抗體探針，它含有至少一種由如下方法產(chǎn)生的抗各自病原體的抗體，該方法包括提供一種用選自片形吸蟲屬、奧斯脫屬和毛圓線蟲屬物種及相近物種的病原體或病原體提取物攻擊感染免疫動物后短時間內(nèi)從免疫動物中制備的生物樣品，或者一種由此而得的相應(yīng)單克隆抗體，或者一種注射純化抗原后產(chǎn)生的多克隆或單克隆抗體；(2)由cDNA文庫或基因組文庫產(chǎn)生人工合成的多肽；(3)用抗體探針探測合成的多肽；，(4)分離由此檢測到的合成多肽。
23.根據(jù)權(quán)利要求22的方法，其中cDNA文庫是源于普通奧斯脫樣品，相應(yīng)的抗體探針是產(chǎn)生的抗32～36kD駢聯(lián)體抗原的單克隆抗體。
24.一種用根據(jù)權(quán)利要求22或23的方法生產(chǎn)的人工合成的抗原多肽。
25.具有如下文所述的如下氨基酸序列的合成抗原多肽、克隆3-2和5-2bM.A.FETNYP IPYRSKLTEP FEPGQTLTVK GKTGEDSVRF TINLHNSSADFSGNDVPLHV SVRFDEGKIV CNSFAKGEWGKEERKSNPYK KGDDIDIRIRAHDSKFQIFV DQKELKEYEH RLPLSSITHF SIDGDVLITH IHWGGKYYPVPYESGLAGEG LSPGKSLYLY GMPEKKGKRF HINILKKNGD IALHFNPRFDEKAWRNSLI SNEWGNEERE GKMPFEKAVG FDLEIKNEDY PFQIMVNGERFASYSHRLEP HELNGLQIGG DVEITGIQLH
26.一種含有權(quán)利要求1至12中任意一個的診斷性抗原或其片段的診斷試劑盒。
27.一種預(yù)防動物疾病的方法，該方法包括給動物服用預(yù)防有效量的至少一種根據(jù)權(quán)利要求1至12中任意一個的保護性抗原。
28.一種治療動物疾病的方法，該方法包括給動物服用治療有效量的根據(jù)權(quán)利要求20或21的抗保護性抗原的單克隆抗體。
29.一種疫苗或獸藥組合物，包括預(yù)防有效量的至少一種保護性抗原，該保護性抗原是根據(jù)權(quán)利要求1至12中任意一個的針對至少一種選自片形吸蟲屬、奧斯脫屬和毛圓線蟲屬的病原體的抗原。
30.根據(jù)權(quán)利要求29的疫苗或獸藥組合物，包括針對多種病原體的復(fù)合保護性抗原。
31.一種疫苗或獸藥組合物包括治療有效量的至少一種根據(jù)權(quán)利要求20或21的單克隆抗體。
32.一種根據(jù)權(quán)利要求31的疫苗或獸藥組合物，包括多種單克隆抗體。
33.參考任一實施例的基本上如上文所述的一種推斷的保護性抗原，或單克隆抗體。
全文摘要
針對選自由普通奧斯脫線蟲、游行毛圓線蟲和肝片形吸蟲組成的組中的感染或相關(guān)感染的推定的保護性抗原或其片段，作為抗原，它們選自具有近似分子量范圍為26～36和91～105千道爾頓的抗原、具有近似分子量為32～35千道爾頓的抗原和具有近似分子量范圍分別為28千道爾頓、32千道爾頓、37千道爾頓、42至100千道爾頓、54至55千道爾頓和大于200千道爾頓的抗原。
文檔編號A61P33/00GK1132514SQ94193571
公開日1996年10月2日 申請日期1994年9月27日 優(yōu)先權(quán)日1993年9月28日
發(fā)明者E·N·T·米森, J·瓦爾克, K·阿思曼, S·E·紐頓 申請人:墨爾本大學(xué), 肉類研究公司