專利名稱：得自膽汁的免疫調(diào)節(jié)組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及免疫調(diào)節(jié)組合物，含所述組合物的藥劑及所述組合物和藥劑在治療動物方面的應(yīng)用。發(fā)明背景有關(guān)癌癥和感染性疾病，如獲得性免疫缺陷綜合癥(AIDS)的預(yù)防和治療的療法正在不斷地發(fā)展。其中的一些療法試圖治療性地利用免疫系統(tǒng)。有一種方法就是以免疫系統(tǒng)的抗原特異性成分即抗體和T細(xì)胞為基礎(chǔ)的。例如，相關(guān)研究的目標(biāo)集中在開發(fā)抗外源物質(zhì)或抗某些內(nèi)源性化學(xué)信使(如白細(xì)胞介素)的疫苗以抑制抗體反應(yīng)。第二種方法是基于對免疫系統(tǒng)非抗原特異性部分之多肽和蛋白質(zhì)的分離、克隆、表達(dá)和生產(chǎn)。例如，所述的蛋白質(zhì)為所述的治療提供了可能性，所述的蛋白質(zhì)如包括由白細(xì)胞產(chǎn)生的白細(xì)胞介素和能刺激淋巴細(xì)胞及消化外源抗體之清道夫細(xì)胞的干擾素的細(xì)胞因子。
如果抗腫瘤的早期免疫應(yīng)答能被增加以使所述腫瘤的大小不致于達(dá)到致命的大小，那么對于腫瘤的治療則可大大增強(qiáng)。已提出的增大抗腫瘤之免疫應(yīng)答的策略包括對腫瘤相關(guān)性抗原有特異性的疫苗；利用抗腫瘤細(xì)胞表面上的抗原(如IL-2受體)的單克隆抗體；含有抗腫瘤抗體和超抗原之雙特異性分子的應(yīng)用。
最近，已經(jīng)研究了被稱為腫瘤壞死因子(TNF)的生理活性多肽的作用，尤其是研究了其能夠誘導(dǎo)腫瘤壞死而對活體的正常組織不產(chǎn)生影響的特性。美國專利4,879,226已公開了TNF的氨基酸序列和編碼TNF之DNA的堿基序列。
因?yàn)橐呀?jīng)證明了TNF在誘導(dǎo)腫瘤壞死中的作用，所以任何能夠在體內(nèi)刺激TNF產(chǎn)生或其生物有效性的因子都具有用于治療各種腫瘤疾病的潛力。此外，任何能在體外刺激人單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞產(chǎn)生TNF的因子都可用作提供治療性施用TNF來源的工具以及用于分析和診斷目的。
膽汁由肝臟分泌并貯存于膽囊中。出于種種目的，人們對膽汁進(jìn)行了研究，包括利用膽汁提取物增強(qiáng)易于由正常肝功能合成的藥物之生物有效性(參見WO 90/12583)和抑制哺乳動物中白細(xì)胞增多的促進(jìn)作用(參見Shinoda et al.，Chem.Pharm.Bull.，30，4429-4434(1982))。然而，膽汁從未被考慮用作治療腫瘤或感染性疾病的有用組合物。令人感興趣的是，根據(jù)英國專利337,797的建議，膽囊本身可作為抗腫瘤劑的來源，但這僅僅在膽汁被從膽囊中取出且該膽囊被徹底清洗之后。發(fā)明概述已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，膽汁是提供能夠在體外和體內(nèi)刺激TNF產(chǎn)生并能有效地治療各種癌癥，尤其是胰腺癌之組合物的重要來源。
所用的膽汁組合物可經(jīng)用水溶性或可混性溶劑抽提膽汁而得。如此所得的提取物經(jīng)進(jìn)一步處理以除去不必要或不希望的成分。
已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過在下文將進(jìn)一步公開的抽提膽汁法所獲得的產(chǎn)物具有TNF刺激活性，且據(jù)信具有抗癌活性，尤其是抗胰腺癌或其它種類的癌癥。很顯然，如此所得的完整組合物并非是得到上述活性所必需的。因此，有可能對所得的產(chǎn)物進(jìn)行分離、分級分離或其它處理，并仍然保留所需的TNF刺激性和抗癌活性。而且可以設(shè)想，有可能通過合成方法得到具有相同或相似的TNF刺激性和抗癌活性的產(chǎn)物。因此，可以想象可以以產(chǎn)生所期望活性的各成分或其組合分析產(chǎn)物的各成分，并基于這些分析，得到合成的產(chǎn)物。
本發(fā)明的一方面是涉及一種用作免疫調(diào)節(jié)劑的組合物，包括分子量小于3000Da的成分且具有一種或多種下列特性a.可從動物的膽汁中提?。籦.能夠在體外刺激單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞；c.能夠調(diào)節(jié)腫瘤壞死因子的產(chǎn)生；d.含有不可測水平的IL-1α、IL-1β、TNF、IL-6、IL-8、IL-4、GN-CSF或TNF-γ；e.在惡性小鼠雜交瘤細(xì)胞系中有抗增生作用；f.對人外周血單核細(xì)胞無細(xì)胞毒性；及g.不是內(nèi)毒素。
根據(jù)優(yōu)選的實(shí)施方案，所說的組合物是自牛膽汁中提取，能夠刺激腫瘤壞死因子的釋放。
本發(fā)明的組合物可由下列步驟制備(a)將得自動物(優(yōu)選牛)的膽汁與一種水溶性或可與水混溶的溶劑(優(yōu)選的是醇，而且優(yōu)選的是等體積醇)混合，得到膽汁/醇溶液；(b)分離最好是醇溶性部分的所說溶液，通過除去大部分的醇(例如應(yīng)用加熱)而分離基本不含醇的溶液；(c)從該溶液中除去膽汁色素，得到無色液體；(d)可任意選擇地處理所得的無色溶液以除去任何殘留的醇；(e)除去有機(jī)脂物質(zhì)如通過用醚抽提無色液體，并分離水相和(f)可任意選擇地從水相中除去殘余醚。
所述組合物可在經(jīng)簡單地包裝入瓶和高壓滅菌后使用，勿需進(jìn)行進(jìn)一步的處理。該組合物也可以濃縮形式使用。優(yōu)選的濃縮形式是按如下所述制備的在步驟(e)之前無色液體可被任意選擇地濃縮至膽汁/醇溶液體積的約1/8，在步驟(f)之后，可以濃縮水相以使其體積為膽汁/醇溶液的1/10。
本發(fā)明還涉及含有本發(fā)明新組合物的藥劑。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及治療病人的方法，包括給所述病人施用有效量的本發(fā)明組合物。本發(fā)明還涉及本發(fā)明組合物在預(yù)防和治療需要調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答的疾病及病理狀態(tài)中的應(yīng)用，尤其是在感染性疾病和腫瘤中的應(yīng)用。
本發(fā)明的上述及其它方面在參考下文的詳細(xì)描述及附圖后即可成為顯而易見的。此外，本文參考了各種文獻(xiàn)，這些文獻(xiàn)全文引入本文作為參考。附圖的簡要說明本發(fā)明更詳細(xì)的內(nèi)容將借助下文在附圖中得以圖示說明的實(shí)施例進(jìn)行描述，所述的附圖中

圖1為本發(fā)明的一個濃縮組合物的HPLC圖；圖2為本發(fā)明的一個濃縮組合物的HPLC圖；圖3為本發(fā)明的一個濃縮組合物的HPLC圖；圖4為本發(fā)明的一個組合物的HPLC圖；圖5為本發(fā)明的一個組合物的HPLC圖；圖6為本發(fā)明的一個組合物的HPLC圖；圖7為本發(fā)明的一個組合物的HPLC圖；圖8圖示說明本發(fā)明的組合物對LPS誘導(dǎo)的PBMN釋放TNF的影響；圖9是表明本發(fā)明組合物對LPS誘導(dǎo)的PBMN釋放TNF之影響的條圖；圖10表示本發(fā)明的一個組合物的C18RP-HPLC圖；圖11表示對本發(fā)明組合物的沉淀部分進(jìn)行RP-HPLC分析；
圖12表示對本發(fā)明組合物的可溶性部分進(jìn)行RP-HPLC分析；圖13表示胰腺癌的病人用本發(fā)明的組合物治療后自診斷起的存活情況；圖14表示胰腺癌的病人在用本發(fā)明的組合物治療后自治療時起的存活情況；圖15表示用本發(fā)明的組合物治療后所有黑瘤病人的存活情況；圖16表示有兩個或更多腫瘤部位的黑瘤病人在用本發(fā)明的組合物治療后的存活情況；圖17表示有三個或更多腫瘤部位的黑瘤病人在用本發(fā)明的組合物治療后的存活情況；圖18表示本發(fā)明的完整組合物的RP-HPLC圖；圖19表示本發(fā)明組合物沉淀物的RP-HPLC圖；圖20表示本發(fā)明組合物之上清液的RP-HPLC圖；圖21為本發(fā)明組合物的SDS凝膠分析；圖22表示在親水性HPLC上洗脫本發(fā)明組合物的條件和時間(a)以及本發(fā)明組合物之上清的洗脫圖(b)；圖23表示在親水性HPLC上洗脫本發(fā)明組合物的沉淀物；圖24表示本發(fā)明組合物在刺激外周血單核細(xì)胞功能中的劑量反應(yīng)；圖25是惡性黑瘤在用本發(fā)明組合物治療前(25a)和治療后的照片。本發(fā)明的詳細(xì)描述如上所述，本發(fā)明涉及用作免疫調(diào)節(jié)劑的組合物，包括分子量小于3000Da的成分，并且具有下列特性a.可從動物的膽汁中提取；
b.能夠在體外刺激單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞；c.能夠調(diào)節(jié)腫瘤壞死因子的產(chǎn)生；d.含有不可測水平的IL-1α、IL-1β、TNF、IL-6、IL-8、IL-4、GN-CSF或TNF-γ；e.在惡性小鼠雜交瘤細(xì)胞系中有抗增生作用；f.對人外周血單核細(xì)胞無細(xì)胞毒性；及g.不是內(nèi)毒素。
更確切地說，研究人員已經(jīng)證實(shí)，至少有一些本發(fā)明的組合物可刺激正常的單核細(xì)胞以影響針對Chang肝癌細(xì)胞系的細(xì)胞毒性，后者通常用于檢測單核細(xì)胞的毒性。也已經(jīng)報道了癌癥病人(宮頸和卵巢癌)的單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞在受到本發(fā)明組合物的刺激后，攻擊和破壞其自身的特定腫瘤細(xì)胞。
本發(fā)明的組合物能夠調(diào)節(jié)腫瘤壞死因子(TNF)的產(chǎn)生。得自牛膽汁的本發(fā)明優(yōu)選組合物能夠促進(jìn)人外周血單核細(xì)胞中生理量TNF的釋放。因?yàn)橐阎猅NF可以啟動炎癥的級聯(lián)反應(yīng)和抗腫瘤的細(xì)胞活素作用，所以優(yōu)選的組合物可以通過刺激人白細(xì)胞釋放TNF(以及可能釋放其它的細(xì)胞因子)來發(fā)揮其抗腫瘤作用。因此，本發(fā)明也可以增強(qiáng)淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒性。
還發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的組合物能夠抑制小鼠雜交瘤細(xì)胞系#6-1之細(xì)胞生長。組合物在小鼠雜交瘤細(xì)胞中的抑制作用提示其有抗增生活性。
本發(fā)明組合物對人外周血單核細(xì)胞(PBMN)之存活的影響也被檢查，發(fā)現(xiàn)該組合物對人PBMN無細(xì)胞毒性。
如下文將進(jìn)一步舉證說明，本發(fā)明組合物除了其它特性外還具有下列特性1.負(fù)責(zé)TNF從PBMN中釋放的一種或多種成分較早地從C18RP-HPLC柱中洗脫出來。
2.釋放TNF的成分被80％乙腈部分沉淀。
3.未被80％乙腈沉淀的物質(zhì)仍保留一些釋放的TNF活性。
4.80％乙腈的沉淀物及上清液部分的TNF釋放活性都在同一較早時間從RP-HPLC中洗脫出。該結(jié)果表明，組合物中的活性TNF-釋放成分屬于相同的分子族，該分子族可能存在一些細(xì)微的分子差別因而引起溶解性的不同。
5.本發(fā)明組合物導(dǎo)致IL-1β的釋放，并且負(fù)責(zé)IL-1β釋放的成分也是從RP-HPLC中較早地洗脫出，這表明釋放TNF的可能是相同的物質(zhì)。
6.本發(fā)明組合物還引起釋放小量的IL-2。
7.本發(fā)明組合物還引起粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)的釋放；80％乙腈的沉淀物部分比上清液部分更具活性。
8.TNF與GM-CSF釋放的比例約為2∶1。
9.80％乙腈沉淀物部分所含的成分比上清液部分中的成分能引起釋放約3倍以上的TNF和GM-CSF。
10.對用RP-HPLC分離的上述沉淀物部分和上清液部分分析表明，兩者中TNF、IL-1β和GM-CSF的釋放活性都是較早地被洗脫出。然而，上清液中的一些IL-1β活性洗脫出來的時間較遲。
11.有可能是由組合物中相同的分子(即成分)負(fù)責(zé)釋放TNF、IL-1β和GM-CSF。該組合物的作用可能是同時刺激多種不同的細(xì)胞因子釋放，或者也可以是所述組合物引發(fā)了一種細(xì)胞因子的產(chǎn)生和釋放，該因子反過來又刺激其它細(xì)胞因子的產(chǎn)生和釋放。
12.借助凝膠電泳和分子篩HPLC對組合物(包括其沉淀物及上清液)理化分析表明，主要成分分子量小于2500Da。
13.用親水性(聚羥乙基)分子篩HPLC進(jìn)行進(jìn)一步的理化分離研究證實(shí)了組合物中的小分子量成分。
14.酸解前后的氨基酸分析表明存在肽鍵，這說明有肽存在。
15.對RP-HPLC中的活性級分之氨基酸成分分析顯示有高水平的谷氨酸/谷氨酰胺和甘氨酸。此外，還檢測到精氨酸、蘇氨酸、絲氨酸和丙氨酸殘基。
16.存在一些未確定的茚三酮陽性殘基，推測為游離氨基酸。
如上所述，本發(fā)明組合物可由下列步驟制備(a)將動物(優(yōu)選牛)膽汁與等體積的醇混合形成膽汁/醇溶液；(b)分離出醇溶性部分，并離析基本上不含醇的溶液；(c)從溶液中去除膽汁色素，得到無色液體；(d)處理無色液體以基本除去任何殘留的醇；(e)用醚抽提無色液體并分離水相和(f)從水相除去殘留醚。
本發(fā)明的組合物可從產(chǎn)生膽汁的任何動物的膽汁中獲得，優(yōu)選的是非人動物。然而由不同種屬動物膽汁得到的組合物對某一特殊疾病可能有不同的活性，甚至可能相反，所以一般適宜的膽汁來源是得自牛、綿羊和豬。在大多數(shù)情況下，從被屠宰的健康食用動物如牛、綿羊和豬處獲取膽汁用于制備本發(fā)明組合物是實(shí)際可行的。膽汁應(yīng)直接來自屠宰動物的膽囊且應(yīng)是基本清亮的，由此提示膽汁制備物粘液含量低并基本上無膿液或血液。
在本方法的一項優(yōu)選實(shí)施方案中，應(yīng)用了牛的膽汁。牛膽汁豐富，因?yàn)樵谀撤N程度上可從每只動物上獲得相對較多的膽汁。而且，牛是按健康方面的有關(guān)法規(guī)進(jìn)行常規(guī)屠宰和檢驗(yàn)的，因而這樣的動物為制備本發(fā)明組合物提供了可靠的來源。更進(jìn)一步地說，人對牛來源的物質(zhì)較少可能產(chǎn)生致敏反應(yīng)。
將膽汁與等量的醇混合以制備膽汁/醇溶液，其中醇是50％的醇。醇可以是脂族醇，優(yōu)選甲醇、乙醇或丙醇，最優(yōu)選乙醇。
將基本上無50％醇不溶性物質(zhì)的溶液通過離心分離出。優(yōu)選地將膽汁/醇混合物以3000-5000rpm，最優(yōu)選4200rpm，在約15-25℃離心至少2小時。然后通過利用醇與水不同揮發(fā)性去除膽汁/醇可溶組分中的醇，所用的揮發(fā)方法為常規(guī)方法，即將級分加熱至適宜的溫度如80-85℃，保持適宜的時間如可至約10小時。
用活性炭、聚酰胺微?；蜻^濾可以將膽汁色素從溶液中去除獲得無色液體。優(yōu)選用活性炭處理。重復(fù)此過程以使溶液滿足光密度和傳導(dǎo)性標(biāo)準(zhǔn)。
以常規(guī)方法處理無色液體以基本去除任何殘留醇。優(yōu)選用可濾除約1.0-3.5μm物質(zhì)的濾器，最優(yōu)選濾除約2.5μm物質(zhì)的濾器過濾無色液體。
用醚提取無色液體并分離出水相。此步驟中所用醚優(yōu)選二甲醚、乙醚、正-丙基醚、異丙基醚、或正-丁基醚，最優(yōu)選乙醚。
用下列方法可從水相中去除殘余醚，例如將溶液加熱至55℃，優(yōu)選至約40℃約5-15小時，最優(yōu)選加熱約10小時。
將組合物簡單包入管形瓶中并消毒后不需進(jìn)一步處理即可加以使用。組合物也可以濃縮的形式應(yīng)用。優(yōu)選的濃縮形式按下述方法制備。在前文描述的(e)步驟之前，可選擇性地通過例如加熱至低于約85℃，優(yōu)選約60-70℃將無色液體濃縮至膽汁/醇溶液體積的約1/8。(f)步驟后，可以濃縮水相，方法是例如加熱至約80-85℃使其體積為膽汁/乙醇溶液的1/10。
在制備本發(fā)明組合物的優(yōu)選方法中，將收集的膽汁與等體積乙醇混合。然后將膽汁/醇混合物在約20±2℃以約4200rpm離心至少2 小時。傾出上清液并測其pH和乙醇含量。用活性炭去除膽汁色素。檢測處理后的膽汁/乙醇溶液的光密度(O.D.)和傳導(dǎo)性。如O.D.值或傳導(dǎo)性超出可接受的范圍，則需要對膽汁/乙醇溶液進(jìn)行進(jìn)一步處理以去除膽汁色素，例如再次用活性炭處理以使讀數(shù)在限制范圍內(nèi)。
活性炭處理后，用可濾除2.5μm物質(zhì)的濾器過濾溶液，通過加熱至低于85℃的溫度蒸發(fā)掉醇，溶液被濃縮至原膽汁/乙醇溶液體積的約1/8。冷卻濃縮液至約20-25℃之間。然后將該溶液與乙醚混合，棄去醚相。優(yōu)選地，用相對較少體積的醚，如0.1-1體積，優(yōu)選0.2-0.5體積，并劇烈攪動。將水相加熱至約55℃10小時除去殘余醚，再通過加熱至約80-85℃進(jìn)一步將其體積減少至僅為原膽汁/乙醇溶液的1/10。然后檢測溶液的外觀、生物活性、乙醇及醚的含量。
用鹽酸(1％)和氫氧化鈉(1％溶液)將組合物pH調(diào)節(jié)到生理pH，即7.4-7.5，用常規(guī)方法配制以一代和二代磷酸鈉鹽作為緩沖劑的緩沖液。
將組合物簡單包入管形瓶并消毒后不需進(jìn)一步處理即可使用。優(yōu)選的消毒方法是將組合物進(jìn)行三次由高壓滅菌和溫育組成的消毒循環(huán)。
組合物可以濃縮形式應(yīng)用。上文已描述了濃縮形式組合物的制備。組合物也可被凍干。
組合物和濃縮組合物為基本不含外來物質(zhì)的清亮淡黃色溶液，它含有不多于10ppm的乙醇和不多于5ppm醚。在實(shí)施例4描述的生物測定中，已顯示組合物引起約18單位/ml非增殖性生長。
用上文大致描述的方法可以以一致地可再現(xiàn)形式(已顯示了各批的特性、效力和純度)制得本發(fā)明組合物。用反相高效液相層析測定其特性和純度(見實(shí)施例1)。本發(fā)明組合物在反相HPLC上具有一致地可再現(xiàn)性，其中峰在約27分鐘和32分鐘的早期排除的級分中可見。在高峰之前，之間和之后，有程度不同的較小峰。圖1-3中顯示了三份本發(fā)明濃縮組合物的HPLC讀數(shù)。批號B0211(圖4)、B0209(圖5)、B29/3006(圖6)和B15/1606(圖7)的RP-HPLC圖也顯示重現(xiàn)程度非常高的圖樣。在實(shí)施例4中描述的生物測定中組合物也顯示出約18單位/ml的非增殖性生長。通過上文提到的特性如其體外刺激單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的能力等表征組合物。
本組合物中可能存在的化合物，考慮到其來源，包括磺化膽汁酸、氧化膽汁酸、其它天然產(chǎn)生的膽汁酸、以及其氨基酸(特別是甘氨酸、?；撬?連接物和甾醇。因此，據(jù)信本組合物包括至少一種具有下列通式的化合物 其中分子可以或可以不是飽和，如A與B、B與C或C與D間的鍵可以是單鍵或雙鍵，且其中X為H、OH、＝O或OSO3H；Y是 其中R是氨基酸殘基，如甘氨?；?、谷氨?；蚺；酋；虼藰?gòu)成了甘氨酸或?；撬徇B接物。
特別地是，已分析了本發(fā)明組合物的成分化合物，包括有機(jī)和無機(jī)成分。用分析化學(xué)的標(biāo)準(zhǔn)方法(包括質(zhì)譜(MS))獲得這些信息。研究的結(jié)果包括例如鑒定認(rèn)為可能存在的特殊膽汁酸化合物，這些化合物包括膽酸、甘氨膽酸、脫氧甘氨膽酸、烏索脫氧膽酸、硫酸膽甾醇、脫氧膽酸、鵝脫氧膽酸和?；悄懰?。
如果某些化合物在MS中失去OH和H2或開始時就存在這些化合物的脫氧、二脫氧和不飽和類似物，則MS就不能加以區(qū)分。這些化合物可以都以銨鹽、烷基銨鹽和無機(jī)陽離子鹽的形式存在。
MS分析也支持對本發(fā)明組合物磷脂類、鞘脂類和能形成微團(tuán)(miscellos)的相關(guān)物的鑒定結(jié)果。認(rèn)為可存在的特殊化合物包括硬脂酸 CH3(CH2)16COOH棕櫚酸 CH3(CH2)14COOH油酸Z-9十八烷酸CH3(CH2)2CH2CH＝CHCH2(CH2)6COOH氧化或羥基化/不飽和短鏈脂肪酸C6H8O3(如CH3CH＝CHCOCH2COOH或含2個雙鍵和一個氫氧化物的C6酸)乙酸硬脂酸甘油二酯棕櫚酸甘油二酯硬脂酸、棕櫚酸甘油二酯硬脂酸-單甘油酯-膽堿磷酸(溶血卵磷脂)
硬脂酸單甘油酯硬脂酸三甘油酯棕櫚酸單甘油酯膽堿磷酸磷酸絲氨酸磷酸鞘氨醇硬脂酸-鞘氨醇鞘氨醇硬脂酰胺硬脂酸甲酰胺(stearic acid methylamide)棕櫚酰胺卵磷脂唾液酸-甘油二聚物另外，已獲得預(yù)HPLC和滴定證據(jù)，顯示也含更短鏈的脂肪酸。
鑒于來源和由MS及HPLC分析所得的信息，可能存在的磷脂、鞘脂和相關(guān)的水解產(chǎn)物化合物包括至少一種具有下列通式的化合物 其中R1、R2、R3可相同或不同，且為H、COR4、CH＝CH-R5、X、-P(O)(OH)O-或-S(O)2O-；X選自膽堿、乙醇胺、N-烷基化乙醇胺、絲氨酸、肌醇、含游離羥基的糖、氨基糖、磺化糖和唾液酸；R4為飽和或不飽和，氧化或羥基化的C1-C30烷基；R3為烷基或其氧化和/或羥基化類似物。
脂肪酸及其連接物可以鹽形式存在于前述的水性提取物中。這些化合物的溶解性也可以被混合物的其它成分增強(qiáng)。所包括的羧酸酰胺，RCONR1R2也被認(rèn)為存在，R1和R2可以相同或不同且為H或烷基。
考慮到組合物來源和其前述的MS分析結(jié)果，第三類化合物即粘蛋白和蛋白多糖水解產(chǎn)物也可能存在。這些化合物包括膽汁和膽囊壁粘蛋白的水解產(chǎn)物，如軟骨素4-和6-硫酸鹽、硫酸皮膚素、肝素、硫酸肝素、透明質(zhì)酸及粘蛋白的水解產(chǎn)物(單體、二聚物、寡聚物和多聚物)。殼多糖及其它粘蛋白也可類似地水解，水解產(chǎn)物包括N-乙?；?D-葡糖胺、N-乙?；?D-半乳糖胺-4-硫酸鹽、半乳糖-6-硫酸鹽、N-乙?；?D-葡糖胺-6-硫酸鹽、葡糖胺-6-硫酸鹽、D-葡糖胺2-硫酸鹽、D-葡糖胺2，3-二硫酸鹽、D-半乳糖-6-硫酸鹽、葡糖醛酸2-硫酸鹽、N-乙酰神經(jīng)氨酸、唾液酸、N-乙酰軟骨生、軟骨素4-硫酸鹽、軟骨素6-硫酸鹽、D-葡糖胺、D-半乳糖胺、葡糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、甘露糖、巖藻糖、艾杜糖醛酸、己糖、己糖胺、硫酸酯、葡糖醛酸、軟骨糖胺、2-氨基-2-脫氧-D-半乳糖、絲氨酸、脯氨酸、蘇氨酸、氨基丙酸、甘氨酸、?；撬?、谷氨酸、天冬氨酸、組氨酸和小肽。
通過水解粘蛋白可得到相似產(chǎn)物，如角蛋白硫酸鹽、硫酸皮膚素、二聚體、寡聚體和多聚體中天然糖-糖連接可被糖單體或相鄰糖鏈間的-O-Si(OH)2-O-橋取代。
特別地是，認(rèn)為存在的特殊粘蛋白和蛋白多糖水解產(chǎn)物化合物包括唾液酸及其單或二乙酰化和乙醇酰單體；N-乙酰神經(jīng)氨酸；
己糖胺；L-巖藻糖；己糖胺-己糖醛酸(二聚體)二硫酸鹽；葡糖醛酸或艾杜糖醛酸二硫酸鹽，單乙酰基化的；唾液酸-甘油(二聚體)；和乙?；土蛩峄纳鲜鰡误w的二聚體、三聚體、寡聚體和多聚體。
考慮到來源和前述的MS分析，第四類化合物即脂溶性維生素包括例如維生素A、D和K(即D1、D3、D4、K1、K2、K5、K6、K7、K-S(II)、)和維生素E乙酸酯。
特別地是，認(rèn)為存在的特殊脂溶性維生素化合物至少包括下述物質(zhì)中的一種維生素A2、維生素D1、光甾醇(來自其維生素D1復(fù)合物)、維生素E、維生素K1氧化物和維生素K5。
考慮到來源和前述的MS分析，各種混雜的有機(jī)化合物可能存在。這些化合物包括膽紅素，及其葡萄糖醛酸化物(gluconuride)軛合物；膽綠素，及其葡萄糖醛酸化物軛合物；痕量甾族化合物；其它漿液溶解物，如糖、嘌呤和嘧啶；混雜的飲食脂類；和谷胱甘肽和其水解產(chǎn)物。
特別是，相信在組合物中存在的特殊的混雜有機(jī)化合物至少包括下列中的一種尿素、甲胺、二甲胺、乙胺、甲基乙基胺、二乙胺、二丙胺、丁基乙基胺、氨、膽堿、?；撬?、谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸、p-ser、p-eu、p-ea、asp-thr ser sar、a-aba、cit、val、ile、len、B-ala、G-aba、OH-lys、orn、lys丁基化羥甲苯(BHT)和聚乙二醇。
本發(fā)明組合物中存在的胺類，尤其是仲胺，可以包括空氣中的氧化氮，從而形成亞硝基化合物。也可包括N-氧化物和N-氨基甲酸酯副產(chǎn)品。上述列舉的一系列胺應(yīng)擴(kuò)展包括所有伯、仲和叔烷基胺。
已對某些無機(jī)元素進(jìn)行了鑒別和定量(mg/l)如下鎢0.07鋅0.666磷378鎘0.01鈷0.08鎳0.022鋇0.032鐵0.022錳0.039鉻0.060鎂7.46鋁0.136鈣5.97銅0.087鈦0.01鍶0.060鈉9600鉀483氯15400氨218
釩1ppm本發(fā)明的組合物具有有價值的藥理學(xué)特性。特別地，本發(fā)明的組合物具有抗增殖作用，作用于新生物的生長并作用于腫瘤壞死因子的釋放。已表明所述組合物不引起顯著的毒性，且只有短暫的不良副作用(例如，輕度發(fā)熱、煩渴、注射部位疼痛)。也發(fā)現(xiàn)其含有不能被檢出的高分子量物質(zhì)成分(即大于約5,000Da)，該物質(zhì)可以導(dǎo)致有害的免疫反應(yīng)。所述組合物可以用作預(yù)防和治療需調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)的疾病的物質(zhì)，這些疾病特別是感染性疾病，腫瘤形成及自身免疫性疾病。在治療不同類型的腫瘤形成(如白血病、淋巴瘤、黑色素瘤、腺瘤、肉瘤和癌)中所述組合物特別有用。特別地，所述組合物可用于治療惡性黑色素瘤、胰腺癌、宮頸癌和腎、胃、肺、直腸、乳腺、腸、胃、肝、甲狀腺、頸部、子宮頸、唾液腺、腿、舌、唇、膽管、骨盆、縱膈、尿道、支氣管原的、膀胱、食道和結(jié)腸等部位癌，以及卡波氏(Kaposi′s)肉瘤(一種與患獲得性免疫缺陷癥(AIDS)的HIV感染病人相關(guān)的癌癥)。所述組合物也可用于其它抗增殖性疾病如關(guān)節(jié)硬化和病毒感染，特別是獲得性免疫性缺陷綜合癥(AIDS)。所述組合物也可用于治療自身免疫性疾病。包括多發(fā)硬化癥、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、I型糖尿病、重癥肌無力、Addison′s病、自身免疫性溶血性貧血、克隆氏病、Goodpasture′s綜合癥、Grave′s病、Hashimoto′s甲狀腺炎、自發(fā)的血小板減少性紫瘢、惡性貧血、鏈球菌感染后腎小球腎炎、牛皮癬、硬皮病、Sjogren′s綜合癥、自發(fā)性不育癥和尋常天皰瘡。
本發(fā)明的組合物可用通常的方法轉(zhuǎn)換成藥劑。該藥劑或單獨(dú)含有本發(fā)明組合物或同時含有其它活性物質(zhì)。這種藥劑可以經(jīng)口、局部、直腸、腸外、局部、吸入或腦內(nèi)給藥。因此它們可以為固體或半固體形式，如丸劑、片劑、霜劑、明膠膠囊、膠囊、栓劑、軟明膠膠囊、凝膠、膜片和小管。對于腸外及腦內(nèi)應(yīng)用，那些用于肌內(nèi)或皮下應(yīng)用的劑型也可以加以應(yīng)用，或?qū)⒂糜谳斪⒒蜢o脈內(nèi)或腦內(nèi)注射的劑型進(jìn)行應(yīng)用，并且因此劑型可制成組合物溶液或制成與一種或多種制藥學(xué)上可接受的賦形劑或稀釋劑混合的活性組合物粉劑，可適用于前述的用途且其滲透壓與生理液相容。對于局部應(yīng)用，以霜劑或油膏劑型或噴霧劑型的制備物可以考慮；對于吸入應(yīng)用，以噴霧劑型(如鼻噴霧)的制備物可以考慮。優(yōu)選地，組合物以肌內(nèi)的方法應(yīng)用。
藥物組合物可以以本身已知的藥物學(xué)上可接受的組合物制備方法進(jìn)行制備，這種藥物組合物可以用于病人，并且有效數(shù)量的此活性物質(zhì)與藥物可接受的載體形成混合物。適宜的載體已得到描述，例如，在Remington′s Pharmaceutical Science(Nack PublishingCompany，Easton，Pa.，USA 1985)中。
以此為基礎(chǔ)，藥劑包括，盡管不排除，與一種或多種藥物可接受的載體或稀釋劑相結(jié)合的本發(fā)明組合物，并且含于具有適宜的pH且與生理液等滲透壓的緩沖液中。
所述組合物適于作為治療劑單獨(dú)或與其它治療藥劑或其它形式的治療方法聯(lián)合應(yīng)用。例如，在惡性腫瘤情況下，本治療方法可以使以前不能進(jìn)行手術(shù)的腫瘤能夠經(jīng)外科手術(shù)切除。本發(fā)明的組合物和藥劑目的是用于人和動物。
一般來講，本發(fā)明組合物作為人用藥應(yīng)用的劑量范圍設(shè)想為約0.01-20mg/kg/天，優(yōu)選為約0.1-10mg/kg/天，最優(yōu)選為0.1-1mg/kg體重/天。如果靜脈內(nèi)應(yīng)用，每天劑量約為0.1-5mg/公斤體重，如果口服，每天劑量約為1-5mg/公斤體重。如果應(yīng)用濃縮的組合物，可以用約半量于上述劑量的量。例如，肌內(nèi)應(yīng)用，每天劑量約為0.2-1.0mg/公斤體重，優(yōu)選每天0.275-0.75mg/公斤體重。
醫(yī)生將意識到偏離前述的劑量且特別是根據(jù)體重的情況和進(jìn)行治療動物的狀況，所治的特殊疾病，用藥途徑的特點(diǎn)及所期望的治療方法來調(diào)整劑量是必要的。另外，根據(jù)動物類型和其對藥物的不同行為反應(yīng)或藥物的劑型及用藥的時間或間隔也可使用不同于上述劑量的藥量。因此，在某些情況下用少于前述的最小量進(jìn)行治療已足夠，而在另一些情況下必須用超過前述上限的量。如果應(yīng)用較大量，建議將這些量分成一天數(shù)次進(jìn)行應(yīng)用。
因此，本發(fā)明包括制備免疫調(diào)節(jié)劑組合物的方法，它包括(a)將動物膽汁與水溶性溶劑混合，制成膽汁/溶劑溶液；(b)從膽汁/溶劑溶液中分離出基本不含溶劑的水溶液；(c)從基本不含溶劑的溶液中去除膽汁色素，得到無色液體，優(yōu)選水溶性溶劑為乙醇，且動物膽汁與等體積的乙醇混合。前述方法的優(yōu)選方面也包括進(jìn)一步濃縮無色液體至原膽汁/溶劑溶液體積的1/8或1/10。很明顯，通過上述方法產(chǎn)生的組合物構(gòu)成了本發(fā)明的優(yōu)選方面。
本發(fā)明也包括用作免疫調(diào)節(jié)劑的組合物，它包含至少一種分子量小于約3000Da的成分，該成分對人外周血單核細(xì)胞未顯示出細(xì)胞毒性，且具有至少下述特性之一(a)可以于體外或體內(nèi)刺激單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞產(chǎn)生一種或多種細(xì)胞因子；(b)可以刺激單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞于體外或體內(nèi)產(chǎn)生腫瘤壞死因子；或(c)對惡性小鼠雜交瘤細(xì)胞系具有抗增殖作用；且所說的成分不是內(nèi)毒素、IL-1α、IL-1β、TNF、IL-4、IL-6、IL-8、GM-CSF或IFN-γ。所述組合物可以從動物優(yōu)選為牛的膽汁中獲得，或從其它來源獲得。在組合物的一個優(yōu)選實(shí)施方案中，組合物于體外或體內(nèi)(最優(yōu)選為人)在無外源性IL-1α、IL-1β、TNF、IL-4、IL-6、IL-8、GM-CSF和IFN-γ的情況下刺激腫瘤壞死因子產(chǎn)生。
本發(fā)明組合物也含有能被柱層析表征的成分，方法是將所說組合物干燥得到固體殘余物，將2g該殘余物溶于20ml以甲醇溶解的10％濃縮氫氧化銨中，在去除不溶物后，將其進(jìn)行柱層析，所用柱為5cm×12.5cm大小的甲醇柱并含有102g 60A閃硅膠，于10磅/英吋2壓力和11ml/min的流速下，用溶于甲醇溶劑中的10％濃縮氫氧化銨溶液進(jìn)行層析，所說的成分在總柱洗脫液約180ml至約220ml、約220ml至約260ml、約260ml至約300ml的級分中洗脫出來。
也可用離子交換層析法表征各成分，方法是將10ml所說組合物進(jìn)行離子交換層析，所用層析柱含足以基本上結(jié)合10ml所說組合物中所有陰離子量的Bio-Rad AG-1氫氧化物形式樹脂，用階梯梯度的碳酸氫銨緩沖液將所說成分自柱中洗脫出來，緩沖液濃度約0.5M至約1.5M，優(yōu)選約1.0M至約1.5M，最優(yōu)選約1.5M。
也可用反相(C18)HPLC表征各成分，方法是將所說組合物凍干并再配制于溶于水的0.1％TFA中，然后在Phenomenex WP60009-C18柱中進(jìn)行反相(C18)HPLC，該柱大小為250×4.6mm，用溶于水的0.1％TFA作為第一緩沖液過柱約10分鐘，然后用溶于乙腈的0.1％TFA作為第二緩沖液從0至80％的線性梯度過柱約55分鐘，再用第二緩沖液80％溶液過柱約5分鐘，然后用第二緩沖液80％-0％梯度過柱約5分鐘，流速為1ml/min，不超過柱和緩沖液的容量，所說的成分在將再配制組合物上柱后約2.4～約3.4分鐘時自柱中洗脫出來。組合物各成分的特征也可用另一種反相HPLC法確定，方法是將所說組合物透析或溶解于0.1％TFA水溶液第一緩沖液中，然后進(jìn)行反相(C18)HPLC，所用柱為Bio-Rad Hi-Pore RP 318(C18)柱，尺寸250×4.6mm，將第一緩沖液過柱約10分鐘，然后用0.1％TFA的乙腈溶液作為第二緩沖液以0-80％線性梯度過柱約55分鐘，再用第二緩沖液80％溶液過柱約5分鐘，然后用第二緩沖液80％-0％梯度過柱約5分鐘，流速為1ml/min，不超過柱及緩沖液容量，所說的成分在將透析的組合物上柱后約2分鐘至21.4分鐘，或約21.4分鐘至25.6分鐘時自柱中洗脫出來。
本發(fā)明組合物也可用TLC表征，方法是將所說組合物加樣至溶于10％濃縮氫氧化銨甲醇溶液中的硅膠板上進(jìn)行薄層層析，用茚三酮噴霧識出，與茚三酮的陽性反應(yīng)發(fā)生在約0.80至約0.90Rf值處。
本發(fā)明也包含于人體中刺激TNF生產(chǎn)的方法，它包括施用有效量的，含有至少下列化合物之一的組合物。
(a)具有下式化合物 其中A-B、B-C和C-D之間的鍵可以是單鍵或雙鍵，且X＝H、OH、＝O、或OSO3H；Y＝ 其中R為-氨基酸殘基；(b)具有下式化合物(R1O)CH2CH(OR2)CH2(OR3-x)或 的化合物其中R1、R2和R3為H、COR4、CH＝CH-R5、X、P(O)(OH)O-、或-S(O)2O-；X為膽堿、乙醇胺、N-烷基化乙醇胺、絲氨酸、肌醇、含游離羥基的糖、氨基糖、磺化糖或唾液酸；和R4為具有約C1-C30碳鏈的飽和或不飽和烷基，或其氧化和羥基化類似物；和R5為烷基或其氧化和羥基化類似物；(c)粘蛋白水解產(chǎn)物或蛋白多糖水解產(chǎn)物；或(d)脂溶性維生素。
優(yōu)選地，本發(fā)明方法的組合物至少含有選自下列化合物之一的化合物?；悄懰峒捌浠腔苌?；甘氨膽酸及其磺化衍生物鞘氨醇；二?；视?、卵磷脂；少于10個糖單位的寡糖(所說的寡糖包括唾液酸、巖藻糖、己糖胺或磺化己糖胺)；維生素A；視黃酸衍生物；視黃醇衍生物；?；撬幔缓凸劝彼峒捌滠椇衔?。組合物也可另外至少含有選自下列化合物之一的化合物氨；伯烷基胺；仲烷基胺；叔烷基胺；和羧酸R6CO2H，其中R6為飽和或不飽和的C1-C30烷基，和其氧化和/或羥基化衍生物。
本發(fā)明的方法也包括通過施用至少含有選自下列化合物之一的化合物的組合物刺激TNF生成?；悄懰峒捌浠腔苌?；甘氨膽酸及其磺化衍生物；鞘氨醇；二?；视?；卵磷脂；長度少于10個糖單位的寡糖(所說寡糖包括唾液酸、巖藻糖、己糖胺或磺化己糖胺)；維生素A；視黃酸衍生物；視黃醇衍生物；?；撬幔缓凸劝彼峒捌滠椇衔?。
本發(fā)明也提供了一種治療胰腺癌的方法，它包括給患所說癌癥的病人施用治療有效劑量的本發(fā)明組合物。
也構(gòu)成本發(fā)明一部分是這樣的組合物，它包括(1)鞘氨醇或與鹽配合的鞘氨醇分子團(tuán)，或(2)視黃酸或其衍生物的分子團(tuán)，它至少具有下述特性之一(a)可在體外刺激單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞產(chǎn)生一種或多種細(xì)胞因子；(b)能夠刺激單核細(xì)胞或巨噬細(xì)胞于體外或體內(nèi)產(chǎn)生腫瘤壞死因子；或(c)對惡性小鼠雜交瘤細(xì)胞系具有抗增殖作用。
分子團(tuán)也可含有二?；视王セ蚵蚜字?，并可進(jìn)一步含有膽汁酸鹽和銨或烷基銨離子源。
最后，本發(fā)明也注意到這樣的組合物含有(1)鞘氨醇、一種膽汁酸鹽和銨或烷基銨離子源，(2)一種膽汁酸鹽、鞘氨醇、二?；视汀@或烷基銨離子源，和視黃醇衍生物，(3)二?；视王ァ⒙蚜字鸵环N膽汁酸鹽、或(4)(a)二?；视王ィ?b)卵磷脂，和(c)粘蛋白水解產(chǎn)物或蛋白多糖水解產(chǎn)物，它至少具有下列特性之一(a)能夠在體外刺激單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞產(chǎn)生一種或多種細(xì)胞因子；(b)能夠刺激單核細(xì)胞或巨噬細(xì)胞于體外或體內(nèi)產(chǎn)生腫瘤壞死因子；或(c)對惡性小鼠雜交瘤細(xì)胞系具有抗增殖作用。
下列非限制性實(shí)施例用于說明本發(fā)明實(shí)施例1本發(fā)明組合物的制備從有執(zhí)照并已檢查的屠宰場屠宰的、用于食用的、至少一歲半的健康牛身上收集膽汁。自己檢驗(yàn)的被屠宰的動物身上收集膽囊，將膽囊與肝臟分離并經(jīng)獸醫(yī)檢驗(yàn)證實(shí)膽囊不含寄生蟲并無感染跡象，因此該膽囊適于用作膽汁的來源。
將通過檢驗(yàn)的膽囊用70％乙醇擦干凈其外表，并用注射器抽出膽汁。抽出的在注射器內(nèi)的膽汁經(jīng)獸醫(yī)用肉眼檢查，保證它不含血液或膿液，而且其它方面也令人滿意。將令人滿意的膽汁移入標(biāo)有刻度的含乙醇之琥珀色瓶中。膽汁是基本上不含血和膿液的綠色液體。將膽汁加至是乙醇刻度兩倍的刻度處，得到50％膽汁/乙醇溶液。膽汁/乙醇溶液為約50％/50％膽汁/乙醇溶液，是基本上不含外來物的綠色液體。它也顯示了對乙醇USP XXII Part B的陽性。將這些瓶子標(biāo)上收集日期作為份號。各份組成的樣本庫至少要50頭動物。從那些其膽汁入選樣品庫的動物收集部分肝、脾和淋巴結(jié)，并檢查其是否有寄生蟲或疾病的其它指征。
以4200rpm將膽汁/醇混合物離心至少2 小時，溫度保持在20±2℃。傾出上清液并檢查pH和乙醇含量。然后將傾出的液體進(jìn)行活性炭處理。然后監(jiān)測處理后的膽汁/乙醇的光密度(“O.D.”)和傳導(dǎo)性。O.D.值或傳導(dǎo)性在可接受范圍以外時，將需要用活性炭對膽汁/乙醇溶液再次處理以達(dá)到于限制范圍內(nèi)的讀數(shù)。
活性炭處理后，用濾器(例如用可保留2.5μm濾物的濾器)對溶液過濾，蒸發(fā)醇(例如，通過加熱至不高于85℃)，將溶液濃縮至膽汁/乙醇溶液原體積的1/8。將濃縮溶液冷卻至20-25℃。然后將溶液與乙醚混合并將醚相棄去。重復(fù)一次該步驟。將水相加熱除去殘余醚(例如加熱至約55℃約10小時)并進(jìn)一步加熱至80-85℃縮減其體積至膽汁/乙醇溶液原體積的1/10。然后將所產(chǎn)生的組合物進(jìn)行檢測，檢測其外觀、生物活性和乙醇及醚的含量。組合物為基本上不含外來物質(zhì)的清亮淡黃色溶液，且它含有的乙醇不超過10ppm，醚不超過5ppm。在實(shí)施例4描述的生物測定中，菲增殖性生長為18±單位/ml。
用反相高壓液相層析測定同一性和純度。用實(shí)施例4描述的抗增殖方法測定效力。
初始批次的本發(fā)明組合物作為非緩沖的液體而制備出。隨后的批次作為緩沖的液體制備，方法是用鹽酸(1％)溶液和氫氧化鈉(1％溶液)調(diào)節(jié)組合物pH至7.4±0.05，并用二代和一代磷酸鈉鹽作為緩沖液。于104±2℃下在高壓滅菌器中進(jìn)行60分鐘的生物負(fù)載的縮減(Bioburden reduction)。將大包裝的溶液充至5ml或10ml無菌瓶中并蓋上蓋子。然后將這些已灌注并蓋蓋的瓶子用高壓滅菌器進(jìn)行三次消毒處理，每次處理為104℃±2℃，進(jìn)行60分鐘，然后于35℃溫育23±1小時。在每一循環(huán)(高壓滅菌+溫育)之間取樣并檢測其生物負(fù)載。最后一次循環(huán)之后，以黑白為背景肉眼觀察各瓶以檢測可能出現(xiàn)的顆粒。
檢測后從該份中取樣并檢測其與規(guī)格的一致性。檢驗(yàn)包括同一性、無菌性、致熱源性、內(nèi)毒素、生物測定、HPLC及一般安全性(見表1)表1各批次的結(jié)果終產(chǎn)物檢驗(yàn) 批號# 批號# 批號#BC0226BC0227BC0228生物活性 17 14.0 22.5(18.0+/-5單位/ml)同一性/純度 通過 通過 通過與參考物一致安全性(通過試驗(yàn))通過 通過 通過致熱源性(體溫增加應(yīng)不超過0.4℃)內(nèi)毒素≤0.4EU/ml≤0.25≤0.25≤0.25無菌性(無生長) 通過 通過 通過pH(7.40+/-0.05) 7.45 7.39 7.36
表1(續(xù))終產(chǎn)物檢驗(yàn)批號# 批號# 批號#BC0226BC0227BC0228外觀-肉眼(清亮， 通過 通過 通過僅有很少或沒有沉淀的淡黃色液體)外觀-O.D(通過檢驗(yàn))0.088 0.118 0.088滲透壓540 603 445進(jìn)行中的檢驗(yàn)固體(18+/-3mg/ml) 181520氨基酸(800+/-10％mg/ml) 790 742 878乙醇(不大于10ppm) 通過 通過 通過乙醚(不大于10ppm) 通過 通過 通過傳導(dǎo)性(26+/-5mMHO)252229實(shí)施例2本發(fā)明組合物的物理化學(xué)和生物化學(xué)特性制備物許多的理化性質(zhì)(傳導(dǎo)性、滲透壓及總固體)示于表2。更特別地是做出了對按實(shí)施例1方法制備的組合物三個生產(chǎn)批次的檢驗(yàn)結(jié)果。示于表2的結(jié)果顯示所生產(chǎn)產(chǎn)物的無菌性、效力和再現(xiàn)性。請注意乙醇和乙醚僅僅是在檢驗(yàn)中而測定的。實(shí)施例4提供了測定生物活性方法的總結(jié)。
表2產(chǎn)物規(guī)格檢驗(yàn)規(guī)格 方法生物活性18+/-5單位/ml 生物活性同一性/純度 與參考物一致 HPLC安全性 通過檢驗(yàn) 一般安全性檢驗(yàn)(小鼠和豚鼠)21 CFR part 610.11致熱源性 體溫升高不超過0.4℃ 致熱源試驗(yàn)(兔)USP內(nèi)毒素 ＜2 EU/ml LinulusAmoebocyte溶解產(chǎn)物試驗(yàn)USP無菌性 無生長 無菌性試驗(yàn)USPpH 7.40+/-0.05 pH試驗(yàn)USP外觀清亮，僅有很少或沒有 肉眼檢查沉淀的淡黃色液體固體 18+/-3mg/ml凍干氨基酸 800+/-10％μg/ml 三硝基苯-磺酸法滲透壓凝固點(diǎn)降低法USP乙醇 不多于100ppm 直接注射氣相層析乙醚 不多于100ppm 直接注射氣相層析傳導(dǎo)性 26+/-5 mMHO CopenhagenRadiometer Model
理化特性如傳導(dǎo)性、滲透壓和總固體與超過99％鹽的組合物一致。組合物中小于1％的固體是有機(jī)物，沒有脂質(zhì)，約一半為碳水化合物，其余為氨基酸。存在蛋白質(zhì)和肽。SDS凝膠電泳證實(shí)組合物中肽比蛋白質(zhì)多。未測得高分子量。這是肽藥物的重要特征，因?yàn)槲搭A(yù)期有免疫原性。
用非緩沖的產(chǎn)物發(fā)展了對本發(fā)明組合物的HPLC和生物測定法。用這些檢驗(yàn)確定作為緩沖液體和濃縮配方之產(chǎn)物的特征。下文描述的HPLC結(jié)果提示產(chǎn)物在所有圖中均為相同。生物測定顯示濃縮組合物的活性比原組合物高2倍半。因此，已表明實(shí)驗(yàn)中所用的產(chǎn)物是相等的。本發(fā)明組合物的反相(C18)HPLC分析本發(fā)明的組合物在反相HPLC中有一致地再現(xiàn)性，其中在早期排出的組分中可見峰且在27和32分鐘處。在高峰之前，之間和之后，有些較小的強(qiáng)度不一致的峰。三份本發(fā)明濃縮組合物的HPLC讀數(shù)示于圖1-3中。批次B0211(圖4)、B0209(圖5)、B29/3006(圖6)和B15/1606(圖7)的RP-HPLC圖也顯示了很強(qiáng)再現(xiàn)性的圖形。
按下述方法進(jìn)行表征本發(fā)明組合物的RP-HPLC。用Bio-RadHi-Pore RP 318 guard柱(C18)(4.6×30mm，Bio-Rad)和Bio-Rad Hi-Pore RP 318(C18)柱(4.6×250mm)。在溶于水的0.1％三氟乙酸(TFA，Pierce)中對樣品進(jìn)行透析，然后上柱。用緩沖液A過柱10分鐘，然后用線性梯度0-80％的緩沖液B(溶于100％乙腈中的0.1％TFA)過柱55分鐘。此期結(jié)束后，用80％緩沖液B過柱5分鐘并用80％-0％的緩沖液B過柱5分鐘。流速為1.0ml/min。收集連續(xù)流出的級分、貯存并于Speedvac(ModelSVC 200H，Savant Instruments，F(xiàn)armington，N.Y)中濃縮。組合物初級表征將HPLC峰進(jìn)行蛋白質(zhì)測序。起始樣品被稱為RP-HPLC-31.00分鐘的主要HPLC峰。于TFA/CH3CN中的批次0210在進(jìn)行N-末端序列分析時不能得到數(shù)據(jù)。這些結(jié)果可被解釋為或由于量的原因或由于N-末端阻斷。在酸水解后通過氨基酸分析對級分蛋白質(zhì)含量的定量分析顯示已對足夠數(shù)量進(jìn)行了序列分析；然而，由于組合物，可認(rèn)為樣品可能不是蛋白質(zhì)，因而N-末端阻斷不應(yīng)是問題。樣品顯示出下列組成。約70％Glx(谷氨酸/谷氨酰胺)加上約15％甘氨酸(Gly)。進(jìn)一步來講，RP-HPLC等同樣本的分析得出相似結(jié)果68％Glx和15％Gly(表3)。對未分級分離物質(zhì)及幾個其它級分的進(jìn)一步特征化顯示下述結(jié)果。起始物質(zhì)(32mg/ml)產(chǎn)生提示聚谷氨酸肽/蛋白質(zhì)的序列信號，這與氨基酸組合物數(shù)據(jù)一致。
表3操作R1的HPLC級分之Glx Gly的摩爾％(見圖)組分號# 分析號# 摩爾％ 總和(07/11/92)Glx GlyGlx+Gly1a 393 28 44 721b+c 394 35 37 722a 395 39 36 752b 396 35 43 782c 397 44 30 743a 398 69 21 903b 399 70 10 803c 400 52 18 704401 68 15 83402 48 30 78
對幾個HPLC級分的分析(表3)顯示所有均富含Glx(Glu/Gln)(28-70摩爾％)和Gly(10-44摩爾％)。然而各組分在其它氨基酸相對數(shù)量上顯示一個真正的差異。
實(shí)施例3組合物組分的生物活性研究了組合物級分的生物活性。組合物的生物活性被認(rèn)為歸因于小分子量成分(分子量小于3000Da)。這一結(jié)論是通過對四個組合物級分和未分級分組合物進(jìn)行生物活性檢測的實(shí)驗(yàn)確定的。第一級分含有分子量小于3000Da的蛋白質(zhì)和肽，而其余三個級分含有另外較大分子量的蛋白質(zhì)和多肽。所有級分均含有另外較大分子量蛋白質(zhì)和多肽。所有級分和未分級分的組合物均顯示出同樣的生物活性。由于所有級分與未分級分的產(chǎn)物一樣有效，且由于所有級分的共同特性是存在相同濃度的小于3000Da的分子，這樣得出結(jié)論，組合物的生物活性是由分子量小于3000Da的成分而產(chǎn)生。
實(shí)施例4對惡性細(xì)胞系的作用檢測了本發(fā)明組合物對四種惡性細(xì)胞系培養(yǎng)物增殖的作用，這四種細(xì)胞系為Daudi人淋巴瘤細(xì)胞、ME-180宮頸癌細(xì)胞、T-24-人膀胱癌細(xì)胞和小鼠雜交瘤細(xì)胞#6-1。本發(fā)明的組合物對小鼠雜交瘤細(xì)胞具有抗增殖作用。研究提示組合物對小鼠雜交瘤細(xì)胞的抑制作用是抗增殖性的而不是殺細(xì)胞作用。
于小鼠雜交瘤細(xì)胞模型上設(shè)計了基于本發(fā)明組合物可再現(xiàn)的抗增殖作用的生物測定，以更便利的測定組合物的特征。按下文所述進(jìn)行生物測定。調(diào)節(jié)組合物的滲透壓和pH以與細(xì)胞培養(yǎng)基之滲透壓和pH相匹配，從而能夠?qū)⒔M合物的生物活性與其理化特性分開。在培養(yǎng)基中制備等張組合物1∶5至1∶10,000系列稀釋液。對雜交瘤細(xì)胞樣品進(jìn)行特殊的定量測定。用血細(xì)胞計數(shù)器對100μl樣品中的細(xì)胞計數(shù)。用離心濃縮細(xì)胞，然后將細(xì)胞濃縮物調(diào)整至1,000個細(xì)胞/毫升(兩倍于最終所期望的濃度)，方法是加入適宜體積的新鮮培養(yǎng)基。將與組合物相應(yīng)稀釋液(1ml)混合的雜交瘤細(xì)胞懸液(1ml)于潮濕環(huán)境下在37℃溫育在24孔板中，CO2控制在6％。96小時后，每孔取樣100μl×3并置于96孔板中(包括不含細(xì)胞的100μl培養(yǎng)基空白)。用PROMEGA CellTiter 96TM試劑盒測定細(xì)胞密度。通過于595nm處的吸收讀數(shù)(650nm作參考)測定細(xì)胞濃度并以ELISA板讀數(shù)器記錄。對每次測定，制備細(xì)胞濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線。對對數(shù)生長期的培養(yǎng)細(xì)胞取樣、計數(shù)、濃縮并再懸浮于系列稀釋液中。將各稀釋液以100μl％×3取樣并置于96孔板中。通過畫出細(xì)胞密度對減去零細(xì)胞空白和650nm處O.D.后于595nm處“凈”O(jiān).D.的圖制成標(biāo)準(zhǔn)曲線。未知樣品的細(xì)胞密度通過推斷得出。
為計算生物活性，將作為對照百分?jǐn)?shù)(無組合物)的細(xì)胞密度對終組合物稀釋液(以對數(shù)或線性尺度)作圖，利用Spline曲線適配法，將曲線適配穿過各點(diǎn)。然后，用手工方法確定相應(yīng)于細(xì)胞增殖50％抑制的組合物稀釋液并直接換算成組合物單位。定義上一個單位的組合物對1ml細(xì)胞系HYB#6-1(500個細(xì)胞/ml)在37℃和6％CO2條件下培養(yǎng)96小時后產(chǎn)生50％增殖抑制作用。生物測定中本發(fā)明組合物平均活性為18.24±1.82單位/ml。
實(shí)施例5對培養(yǎng)的T和B淋巴細(xì)胞的作用本發(fā)明組合物已顯示出對培養(yǎng)的正常T和B淋巴細(xì)胞無毒性。在有和無組合物的仔細(xì)控制的條件下檢測人淋巴細(xì)胞的生長情況。在含有不同濃度組合物之孔中將標(biāo)準(zhǔn)濃度的淋巴細(xì)胞溫育。當(dāng)將正常T與B淋巴細(xì)胞與相似于臨床應(yīng)用濃度的組合物一起溫育，用臺盼藍(lán)排除法判斷未有副作用。
檢測了組合物對人外周血單核細(xì)胞(PBMN)存活的影響。實(shí)驗(yàn)中將PBMN在含有不同體積的組合物和組織培養(yǎng)基的塑料微孔板中培養(yǎng)24和48小時。此期結(jié)束時，用臺盼藍(lán)染料排除法估計存活細(xì)胞數(shù)。表4顯示在24和48小時時存活細(xì)胞數(shù)下降，然而，存在或無組合物時存活細(xì)胞數(shù)沒有不同。而且，增加組合物量對存活無影響(表4)。因而，組合物未顯示出對人PBMN的細(xì)胞毒性。
表4溫育后有活力PBMN的濃度病人S.Z.
臺盼藍(lán)測定每孔中存活PBMN數(shù)(×108)1濃度(μl/孔)零時間24小時后有活48小時后有活力細(xì)胞(％) 力細(xì)胞(％)00.7020.23(33)0.10(14)25 0.43(61)0.15(21)50 0.10(14)0.23(33)100 0.15(21)0.18(26)200 0.48(69)0.23(33)LPS(μg/孔)1 0.30(43)0.28(40)10 0.25(36)0.13(18)病人E.S.
0 1.3020.70(54)0.33(25)25 0.65(50)0.15(12)50 0.68(52)0.38(29)100 0.75(58)0.23(18)200 0.65(50)0.20(15)
表4(續(xù))溫育后有活力PBMN的濃度病人S.Z.
臺盼藍(lán)測定每孔中存活PBMN數(shù)(×106)濃度(μl/孔)零時間24小時后有活48小時后有活力細(xì)胞(％) 力細(xì)胞(％)LPS(μg/孔)1 0.60(46) 0.53(41)10 0.15(12) 0.15(12)1重復(fù)三次的每孔中已鋪板的大約1×106細(xì)胞數(shù)。2每孔中計數(shù)的實(shí)際細(xì)胞數(shù)(×106)。
實(shí)施例6組合物的細(xì)胞因子含量對本發(fā)明組合物進(jìn)行TNF-α、IL-1α、IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、GM-CSF和IFN的ELISA檢測。已確定本發(fā)明組合物不含有可測濃度的細(xì)胞因子(TNF、IL-1α、IL-1β、IL-4、IL-6、IL-8、GM-CSF和IFN-γ)(見表5)。
表5組合物細(xì)胞因子的ELISA測定組合物細(xì)胞因子 50μl 100μlTNF pg/ml＜5 ＜5檢測限5pg/mlIL-1βpg/ml - 6.5檢測限4.3 pg/mlGM-CSFpg/ml ＜5 -IL-6pg/ml＜7 -檢測限7pg/mlIFNγpg/ml ＜5 -檢測限5pg/mlIL-1αpg/ml ＜50 -檢測限50pg/mlIL-4pg/ml -＜3檢測限3pg/mlIL-8ng/ml ＜4.7檢測限4.7ng//ml實(shí)施例7對按照實(shí)施例1所述方法制備的本發(fā)明組合物的多個批次進(jìn)行了物理、化學(xué)和生物學(xué)性質(zhì)的測定。另外，測定了各批次的化學(xué)組成并進(jìn)行了各批次的氨基酸分析。結(jié)果示于表6-8中。
表6化學(xué)組成批號固體氨基酸 糖 脂類 高分子量mg/mlμg/mlμg/ml μg/ml ＞3kD PROTμg/mlB0201 15.3 4.59 40.85ND＜0.5NAB0202 15.7 13.16 54.95ND＜0.5NAB0203 15.0 72.67 25.5 ND＜0.5NAB0208 7.8 4.53 30 ND＜0.5ND＜1.0B0209 8.5 2.27 24 ND＜0.5ND＜1.0B0211 5.6 1.47 19.2 ND＜0.5ND＜1.0B0106 32.2 1.16 32.6 ND＜0.5ND＜1.0B0706 32.7 1.42 26.2 ND＜0.5ND＜1.0B1306 22.3 8.01 48 ND＜0.5ND＜1.0B2006 21.7 9.73 38.4 ND＜0.5ND＜1.0B2306 28.5 16.35 42 ND＜0.5ND＜1.0物理、化學(xué)和生物學(xué)特性批號pH 傳導(dǎo)性滲透壓吸收值UV，VIS 活性mMHO mOsMO.D.280nm 峰 單位/mlB0201 7.3716.9 361 0.98 404nm 10.5B0202 7.3517.3 298 0.777 無 6.5B0203 7.3 17.7 360 0.67 365nm 21.0B0208 7.0016.1 250 0.453 無 8.1B0209 7.3111.2 259 0.594 無 6.7B0211 7.3534.9 175 0.287 無 7.5B0106 7.5734.3 627 0.341 無 17.2B0706 7.5711.6 627 0.387 無 23.0B1306 8.0235.6 790 1.147 無 17.0B2006 8.5633.9 651 1.024 無 21.0B2306 8.0135.1 623 1.054 無 19.0注釋1.向批號B0106和B0706中加入全等張PBS固體2.批號B1306、B2006和B2306濃縮2倍，不調(diào)整pH
表7化學(xué)組成批號 固體氨基酸糖 脂類高分子量mg/ml μg/ml μg/ml μg/ml ＞3.5kD PROTμg/mlB021331.6 21 61 ND NDR0201/-pH52.5 1553 216 ND NDR0201/+pH55.8 1530 280 ND NDC020336.1 113 42 ND ND0-13/210912.1 149 36 ND NDB27/2806 17.5 28 37 ND NDB29/3006 28.7 26 60 ND NDB15/1606 26.8 41 45 75 ND物理、化學(xué)和生物學(xué)特性批號 pH傳導(dǎo)性 滲透壓 吸收值 UV，VIS 活性mMHOmOsM O.D.280nm 峰單位/mlB0213 7.75 29.5628 0.48 無 14.5R0201-pH 7.95 44.5877 1.59271nm51.50.65O.D.R0201/+pH 7.60 50.011622.29266nm61.51.6O.D.C0203 7.90 34.8657 0.96 無 5.00-13/2109 7.73 17.0316 0.83 無 14.5B27/2806 7.71 22.0453 0.49 無 12.4B29/3006 7.67 28.8605 0.55 無 14.0B15/1606 7.84 35.0753 1.04 無 14.0
表8氨基酸組成批號#B-0208 B-0209 B-0211 01/06 07/06 1306 2006 2306天冬氨酸 365 113 289絲氨酸 69 12 7 17 144119308甘氨酸 22 449274279 4173731 5314 10371組氨酸 192 9068 9381335 2114精氨酸 161 533蘇氨酸 19 13 30 148142250丙氨酸 1731122464 9491002 1423脯氨酸 109274 8176391075酪氨酸 15 55 57 4339 20513545纈氨酸 121 63 31 1015 367335224甲硫氨酸 970461462 13 10712170半胱氨酸 10390 4112 86 49 10異亮氨酸 272184 95 17 23221668亮氨酸 58 9 22124284苯丙氨酸 57 20016 45 80 23賴氨酸191 36 1236 18 15總AAμg/ml4.53 2.27 1.47 1.16 1.42 8.01 9.73 16.35實(shí)施例8單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的激活研究表明本發(fā)明的組合物將激活正常單核細(xì)胞，顯示出對用于測定單核細(xì)胞毒性的Chang肝癌細(xì)胞系的細(xì)胞毒性，研究也顯示癌癥病人(宮頸和子宮癌)的單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞被組合物刺激，攻擊和消滅其自身的特殊腫瘤細(xì)胞。
更特別地是，在本發(fā)明組合物存在時檢測了單核細(xì)胞殺腫瘤功能，且下文初步描述了這些實(shí)驗(yàn)的基本過程。
在肝素化的空試管中收集靜脈血。將血用置于淋巴細(xì)胞分離培養(yǎng)基之上的Hanks平衡鹽溶液(HBSS)以3∶1稀釋并離心得到外周血單核細(xì)胞(PBMN)條帶。離心后，從在培養(yǎng)基中沖洗兩次的界面上回收單核細(xì)胞層，用膠乳吸入(latex ingestion)對單核細(xì)胞計數(shù)。通過粘附于96孔板上分離單核細(xì)胞(于37℃2小時，再經(jīng)2個循環(huán)的沖洗)。估計附著的細(xì)胞大于90％的單核細(xì)胞。將含有吸附細(xì)胞的孔在組合物(11∶10稀釋)、粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞刺激因子或PMA存在情況下溫育過夜。然后沖洗吸附細(xì)胞并與腫瘤細(xì)胞一起溫育過夜。實(shí)驗(yàn)應(yīng)用了標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞系51CR標(biāo)記的Chang肝癌細(xì)胞，因?yàn)樵摷?xì)胞系對自然殺傷細(xì)胞細(xì)胞毒性不敏感。以效應(yīng)器靶細(xì)胞(E∶T)比為20∶1將肝癌靶腫瘤細(xì)胞加至吸附細(xì)胞單層上。之所以用該E∶T比是因?yàn)樗寐淙胗刹煌珽∶T比(5∶1至30∶1)制備的曲線的平臺期。24小時后收集上清液且測定51Cr釋放量。特異性細(xì)胞毒性百分比按如下公式計算％特異性釋放＝(E-S)/(T-S)×100其中E＝在效應(yīng)細(xì)胞存在時自靶細(xì)胞釋放的CPM；S＝在無效應(yīng)細(xì)胞存在時自靶細(xì)胞釋放的CPM；T＝用2％十二烷基硫酸鈉處理后自靶細(xì)胞釋放的CPM。
用該方案，發(fā)現(xiàn)組合物導(dǎo)致健康供者單核細(xì)胞產(chǎn)生對Chang肝癌細(xì)胞系的細(xì)胞毒性。隨后，研究了是否癌癥病人之單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞可被組合物刺激以攻擊和消滅其自身的特定腫瘤。用類似于所描述的標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞系(Chang肝癌細(xì)胞)的方案，分離癌癥病人的單核細(xì)胞和/或腹腔巨噬細(xì)胞(腹腔巨噬細(xì)胞自于腹腔鏡檢查時收集的腹腔液中分離得到)。發(fā)現(xiàn)組合物激活宮頸癌病人外周單核細(xì)胞和腹腔巨噬細(xì)胞產(chǎn)生針對病人自身腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒性。該作用與IFN或脂多糖產(chǎn)生的作用相當(dāng)或更好。也發(fā)現(xiàn)卵巢癌病人腹腔巨噬細(xì)胞在組合物刺激后攻擊和消滅培養(yǎng)的卵巢腫瘤細(xì)胞。
實(shí)施例9對TNF的作用進(jìn)行了評價本發(fā)明組合物對自外周血單核細(xì)胞(PBMN)釋放的細(xì)胞因子之作用。進(jìn)行TNF-α、IL-1α、IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、GM-CSF和IFN的ELISA測定。
在實(shí)施例中描述的研究中應(yīng)用了下述方法。
在TNF的研究中，從5例健康者抽出全血置入肝素化的Vacutainer試管中。用于Ficoll-Hypaque(Pharmacia)上的梯度離心分離外周血單核細(xì)胞(PBMNs)。用磷酸緩沖液(PBS)沖洗PBMN兩次，計數(shù)并以106細(xì)胞/0.5ml的濃度重懸于RPMI 1640培養(yǎng)基(Gibco Labs)中。將細(xì)胞于24孔平底組織培養(yǎng)板(Falcon，Becton.Dickinson)中培養(yǎng)將0.5ml PBMN懸液加入含50ng脂多糖(LPS)(得自大腸桿菌)、10μl胎牛血清和受檢之各相應(yīng)體積組合物(10-300μl)的孔中。為中和組合物的高滲性，將蒸餾水以等同于10％組合物體積加入培養(yǎng)孔中。然后用RPMI將總體積補(bǔ)至1ml/孔。用PBS取代組合物作為對照。在濕潤的5％CO2培養(yǎng)箱中于37℃將細(xì)胞培養(yǎng)2、6、24、48和72小時。在每次溫育期結(jié)束時，收獲細(xì)胞并以9000rpm離心10分鐘的方式獲得無細(xì)胞培養(yǎng)液。樣品貯于-70℃直至進(jìn)行細(xì)胞因子的ELISA(兩周內(nèi))。
用Pierce Micro BCA蛋白測定技術(shù)(Smith et al.，Anal.Biochem.1985，15076-85)進(jìn)行組合物蛋白質(zhì)測定。用蒸餾水將10μl組合物樣品補(bǔ)至1ml。用5種濃度的牛血清白蛋白(0.150μg/ml)作為標(biāo)準(zhǔn)物。用0.1N NaOH作空白。向所有樣品中加入BCA、2％二辛可酸鈉鹽(Pierce)、4％硫酸銅和Microreagent A(NaCO3、NaHCO3、溶于0.2N NaOH的酒石酸)的混合物。將混合物于60℃溫育1小時，冷卻并用分光光度計讀出于562nm處的吸收值。然后將受試樣品中的蛋白質(zhì)數(shù)量與所畫的曲線比較并進(jìn)行相應(yīng)的計算。組合物的蛋白質(zhì)濃度較低估計為32μg/ml。
在以200μl和300μl/孔本發(fā)明組合物刺激人PBMN后，測定上清液中的細(xì)胞因子的合成。組合物的初始制備物對細(xì)胞因子生成無刺激作用(表9)。如果有任何作用的話，提示在PBMN于培養(yǎng)基中單獨(dú)溫育時細(xì)胞因子產(chǎn)生低于基本水平表924小時后組合物對細(xì)胞因子產(chǎn)生的直接作用釋放的細(xì)胞因子量(pg/ml)1測定的細(xì)胞因子 培養(yǎng)基 組合物 LPS100μl 200μl 1μgIL-1α61.6±1259.6±7.854.3±6.0 315±117IL-1β 199±184218±165 188±174 965±99TNF2203±149151±117 107±120 1501±284IL-6 928±776853±673 829±543 2016±41IL-8 126±70394±50377±413361±1653GM-CSF13±4 13±715±11 54±20IFN-γ 11±18 9±145±6 54±94IL-4 ＜3.0 ＜3.0＜3.0 ＜3.01雙份8例病人樣品的平均值2雙份7例病人樣品的平均值3ng/ml
進(jìn)行確定本發(fā)明組合物是否損害LPS刺激的釋放的實(shí)驗(yàn)。用LPS作陽性刺激物，組合物損害LPS刺激的細(xì)胞因子釋放之能力通過對不同細(xì)胞因子的影響進(jìn)行了比較(表10)。組合物明顯抑制了IL-1α、IL-1β和TNF。對其它細(xì)胞因子IL-6、IL-8、IFN-γ和GM-CSF的作用不顯著。然而，在所有實(shí)驗(yàn)中，受試組合物均未放大LPS刺激細(xì)胞因子釋放的作用。
表10LPS和LPS+組合物釋放的細(xì)胞因子之間的差異細(xì)胞因子刺激物測定的細(xì)胞因子 LPS(50ng/m l) LPS+組合物2平均差異IL-1α129±135 77±27-52IL-161314±723 919±460 -395TNF 915±763 497±525 -418IL-6 2320±10812320±11450IL-8(ng/ml)118±62 109±56 -9IFN-γ30±2413±10-17GM-CSF 54±6550±63-41以雙份檢測6例病人的PBMN2組合物批號B0209檢測了不同體積本發(fā)明組合物抑制LPS刺激的TNF釋放之作用。圖8顯示組合物抑制由LPS刺激的PBMN之TNF釋放的劑量反應(yīng)曲線。10μl組合物抑制10％、100μl組合物抑制接近30％。另一批號(B0201)的組合物在200、100和10μl時分別抑制LPS誘導(dǎo)的TNF產(chǎn)生45％、21％和12％。
與此相似，組合物以劑量依賴形式抑制IL-1β的產(chǎn)生100、25和10μl的組合物分別抑制16％、10％和9％。
檢測了不同批號組合物對LPS誘導(dǎo)的TNF釋放之影響。概括來講，以同樣方式產(chǎn)生及來自同一種動物的各批號組合物產(chǎn)生相同的作用。然而，制備方法的改變或組合物來自不同動物種屬則有不同的作用。批號B29/3006、B0213(B＝牛)和C0203(山羊)產(chǎn)生強(qiáng)于由LPS單獨(dú)誘導(dǎo)的TNF釋放(表11)。
表11具有強(qiáng)TNF釋放刺激作用的組合物批號之劑量反應(yīng)效應(yīng)LPS+組合物和單用LPS之間TNFα釋放的差異批號組合物體積(μl) TNF(pg/ml)B0213 10 193±161100 858±819200 2131±1742B29/3006 10 121±10250 422±78100 834±811200 2252±676C0203 10 101±4750 643±231100 2650±1372200 1851±980表12顯示批號B15/1606(濃縮制備物)和B27/2806(它們有中度刺激作用)的結(jié)果。
表12具有中度TNF釋放刺激作用的組合物批號之劑量反應(yīng)效應(yīng)LPS+組合物和單用LPS之間TNFα釋放的差異批號 組合物體積(μl)TNF(pg/ml)B27/280610 -24±12050 71±103100 667±844200 984±200B15/160610 299±35150 294±145100 667±8002001224±446表13顯示批號013/2109(綿羊)具有最小的刺激作用。
表13具有最小TNF釋放刺激作用的組合物批號之劑量反應(yīng)效應(yīng)LPS+組合物和單用LPS之間TNFα釋放的差異批號組合物體積(μl) TNF(pg/ml)013/210950-9±73200 179±162300 178±373表14顯示批號R0201(鯊魚)在大多數(shù)濃度對LPS誘導(dǎo)的TNF產(chǎn)生有抑制作用。
表14具有TNF釋放刺激作用的組合物批號之劑量反應(yīng)效應(yīng)LPS+組合物和單用LPS之間TNFα釋放的差異批號組合物體積(μl) TNF(pg/ml)B0201 50 145±256200-370±385300-400±185開始顯示出組合物影響人PBMN的LPS誘導(dǎo)的TNF釋放。因此，在接著的一系列實(shí)驗(yàn)中，檢測了組合物對LPS誘導(dǎo)的TNF釋放的時間效應(yīng)(表15)。LPS刺激TNF的釋放。2小時時TNF水平升至697pg/ml且6小時達(dá)高峰約2006pg/ml。于24、48和72小時時TNF的釋放進(jìn)行性下降。事實(shí)上，到48和72小時時TNF的釋放僅在基本產(chǎn)生水平之上。與此相對，組合物批號0213(它具有強(qiáng)的刺激TNF釋放作用)于2小時和6小時時未顯示出超過單用LPS的TNF釋放水平。LPS誘導(dǎo)的TNF釋放高峰在6小時時，而組合物與LPS聯(lián)合使用在24小時時產(chǎn)生釋放高峰，此時是LPS刺激作用開始下降之時。不像單用LPS，組合物+LPS在48小時和72小時時繼續(xù)刺激TNF釋放，盡管釋放的TNF量進(jìn)行性下降(表15)。因此，批號0213具有刺激TNF釋放的作用。僅有中度刺激作用的批號B15/1606在2小時和6小時時抑制了LPS誘導(dǎo)的釋放。在24小時時，B15/1606+LPS輕度地刺激TNF釋放。48和72小時時，B15/1606+LPS對TNF釋放只有輕度刺激作用。因而，批號B15/1606有雙相作用；早期它抑制LPS誘導(dǎo)的TNF釋放，主要在24小時時，與LPS聯(lián)用有輕度的刺激TNF釋放作用。因此批號B15/1606具有雙相作用；早期它抑制LPS誘導(dǎo)的TNF釋放，且主要在24小時時，與LPS聯(lián)用有輕度導(dǎo)致TNF釋放的加合作用。
表15不同組合物批號對LPS誘導(dǎo)的TNF釋放的時間效應(yīng)三個不同批號用LPS+組合物和單用LPS之間TNFα釋放(pg/ml)的平均差異時間 LPS誘導(dǎo)的TNF釋放(小時) (50ng/ml) B0213 B15/1606 R02012 697±94 693±339 363±189 62±426 2006±7361949±4221080±377 430±26024800±222 2301±658876±351 343±18348170±149 1419±447234±183 129±7872132±147 945±367 184±107 153±68對LPS誘導(dǎo)的TNF釋放具有抑制作用的批號R0201于2、6和24小時時顯著抑制了LPS誘導(dǎo)的TNF釋放。于48和72小時時，LPS誘導(dǎo)最小的TNF釋放且批號R0201于這些時間有最小的正性和負(fù)性作用。
檢測了批號B0203于不同體積和不同時間下的直接刺激作用。
約100μl時，批號B0203刺激最大量的TNF釋放(表16)。200μl在24小時時觀察到最大的效應(yīng)(表17)。因此，組合物自身可以刺激TNF釋放，這是在無LPS時產(chǎn)生的，而且TNF釋放曲線與用組合物+LPS時相似。顯示出組合物本身對TNF釋放的刺激作用小于它與LPS聯(lián)用時的加合作用。
表16批號B0203刺激TNF釋放的劑量反應(yīng)體積(pg/ml)24小時的TNF釋放平均數(shù)量(μl)無(PBS 50μl) 128±20750223±65100 327±90200 105±54300 189±94表17批號B0203對TNF釋放的時間效應(yīng)時間(小時)TNF釋放1(pg/ml)6 47±15424 106±7348 20±2572 13±896 5.5±61209.5±2中值概括起來，實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示組合物某些批次在以LPS刺激人PBMN時可抑制TNF釋放。其它批次具有雙相作用，提示其部分抑制LPS誘導(dǎo)的TNF釋放，且作為晚期效應(yīng)，具有誘導(dǎo)TNF輕度釋放的能力。第三種制備物對LPS誘導(dǎo)的TNF釋放無抑制作用；但在與LPS不同的時間點(diǎn)，制備物可以刺激人PBMN釋放TNF。總之，本發(fā)明組合物可以調(diào)節(jié)TNF產(chǎn)生，TNF是抗腫瘤反應(yīng)的重要介質(zhì)。數(shù)據(jù)的總結(jié)示于圖9和表18中。
表18TNF生物測定結(jié)果批號 RP-HPLC 來源 正常或濃度 緩沖液 TNF釋放B0213 27，32 牛正常 有 ↑ ↑C0203 27，32 公山羊正常 有 ↑ ↑013/210927，32，21 綿羊 濃縮 有 ↓/↑50，25R0201 21-25，28鯊魚 正常 有 ↓ ↓29，29.5，27，32B29/300627，32牛 正常 有 ↑ ↑B27/2806↓27，↓32牛 正常 有 ↑B15/160627，32，22， 牛 濃縮 有 ↑28有 ↓實(shí)施例10本實(shí)施例總結(jié)性地證明了下述內(nèi)容組合物具有TNF-α釋放活性，且TNF-α釋放活性與內(nèi)毒素的污染無關(guān)。加入巨噬細(xì)胞增強(qiáng)了組合物刺激TNF-α釋放的能力。組合物的高滲性并不對TNF-α釋放活性負(fù)責(zé)。組合物的TNF-α抑制釋放活性可部分地與其它組分分開。組合物TNF-α釋放活性不與C18RP-HPLC結(jié)合，或者結(jié)合得很差。組合物活性大多數(shù)較早地從RP-HPLC中洗脫出來。只有不到20％的組合物活性可以從留在RP-HPLC上的級分中回收并稍后洗脫出來。TNF-α釋放活性可以被一種高含量的有機(jī)緩沖液80％乙腈沉淀。當(dāng)沉淀物在含水緩沖液中重新配制并于RP-HPLC上分析時，結(jié)果顯示沉淀物與組合物于RP-HPLC上的排除峰(excluded Perk)極為相似。有可能將由約30％起始物組成的級分中的組合物活性成分分離并濃縮。A.多粘菌素及TNF-α釋放將多粘菌素加入反應(yīng)體中進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，以消除組合物之內(nèi)毒素作用的任何可能性。多粘菌素抑制了內(nèi)毒素對白細(xì)胞的作用。表19顯示多粘菌素完全抑制了TNF-α的LPS誘導(dǎo)釋放。無多粘菌素時LPS誘導(dǎo)517pg/ml的TNF-α，而在有多粘菌素時，則釋放了11pg/ml的TNF-α，另一方面，組合物在多粘菌素存在時釋放1591pg/ml的TNF-α。在無多粘菌素時，LPS和組合物表現(xiàn)得比僅加入刺激因子的效果更強(qiáng)，這說明組合物在有巨噬細(xì)胞引發(fā)時作用強(qiáng)度更大。
表19多粘菌素對由LPS+組合物誘導(dǎo)的TNF釋放的影響釋放的TNF(pg/ml)受試樣品 加入 總量 -LPSLPS 多粘菌素 11±7 0無 517±1180組合物#B0213 多粘菌素 1591±413 1581無 5256±2585 4738注釋1.釋放的總TNF用1640培養(yǎng)基的TNF釋放校正。2.多粘菌素濃度50,000單位/ml。3.組合物體積200μl。4.用多粘菌素，檢測了8位病人。不加入多粘菌素，檢測了3位病人。5.LPS濃度50ng/10μl。B.反相高壓液相層析(RP-HPLC)級分的TNF釋放活性圖10顯示了批次0213的組合物及用來檢測TNF釋放活性的5個相互分離級分的C18RP-HPLC圖譜。
最初，在多粘菌素存在時檢測了不同級分的效應(yīng)。表20表明RP-HPLC早期洗脫級分(205至2120分鐘)具有大部分可測出的TNF釋放活性。然而，該活性大約只有起始組合物的50％。表20的右欄顯示了樣品的滲透壓。批次B0213的滲透壓很高為369。21分鐘及后來的級分滲透壓正常，而有活性的第一級分具有甚至比起始物還高的滲透壓，這說明組合物中大量的鹽也較早地洗脫出來。因此，如下文所述，對樣品的高滲性是抑制還是增強(qiáng)TNF-α的釋放作了研究。
表20多粘菌素存在下組合物不同HPLC級分的分離與測試釋放的TNF(pg/ml)滲透壓受試樣品總量 -LPS (mOsm)1640 RPMI培養(yǎng)基 0 - 287LPS(50ng/10μl)40±25 0組合物#B0213 1222±4481182 369級分(分鐘)205-2120 554±394 5144342120-2532 7±70 3012532-31550 0 2993155-3458 4±40 2923458-4655 32±28 0 295注釋1.釋放的總TNF用RPMI培養(yǎng)基的TNF釋放校正。2.級分重新配制于PBS中。3.組合物和級分的體積200μl。4.多粘菌素濃度50,000單位/ml。5.受試病人數(shù)55.LPS滲透壓未測。
表21顯示用組合物級分1(205-2120)和2(2120-25.32)對兩例病人所進(jìn)行的另一測試。在級分1中又一次發(fā)現(xiàn)了大部分的活性，但級分2中也有一些活性。然而，級分1和2僅有組合物起始活性的50％。
表21重復(fù)評價在多粘菌素存在時組合物HPLC級分205-2120和2120-2532分鐘的TNF釋放作用釋放的TNF(pg/ml)測試樣品總量 -LPS1640 RPMI培養(yǎng)基 0 -LPS(50ng/10μl) 31±31 0組合物#B0213 2013±726 1983級分(分鐘)205-2120 526±126 4962120-2532 132±108 101注釋1.總的TNF釋放用RPMI培養(yǎng)基的TNF釋放校正。2.級分重新配制于PBS中。3.組合物和級分的體積200μl。4.多粘菌素濃度50,000單位/ml。5.受試病人數(shù)2為了確定級分中是否存在有任何非特異性活性，進(jìn)行一次空白操作，收集同樣的級分并濃縮和測試?？瞻准壏謱?shí)際上不會引起TNF釋放。這個結(jié)果表明RP-HPLC的級分可以用來對TNF-α釋放活性進(jìn)行測試，而不必?fù)?dān)心層析柱或緩沖液對TNF-α釋放活性的影響。
接著在無多粘菌素以便具有LPS的引發(fā)作用的條件下檢測組合物各級分。表22顯示批號B0213誘導(dǎo)了TNF-α顯著的釋放。用所示的洗脫時間，有5份來自RP-HPLC的組合物級分。級分1再一次具有最大的TNF-α釋放活性。然而，由于LPS的引發(fā)作用，級分2至4均具有某些TNF-α釋放活性。級分2(2120-2532)的活性為級分1的25％，并且是其后級分活性的2倍。
表22無多粘菌素時組合物HPLC級分的分離和檢測釋放的TNF(pg/ml)滲透壓受檢樣品 總量 -LPS (mOsm)1640 RPMI培養(yǎng)基 0 - 299LPS(50ng/10μl) 2190 305組合物#B0213 1575±4701356376級分(分鐘)205-2120 656±206436 3212120-2532345±82 126 3092532-3155287±70 68 3053155-3458262±50 43 3043458-4655237±59 18 3761.釋放的總TNF用RPMI培養(yǎng)基的TNF釋放校正。2.級分的重新配制將205-2120的級分配于水中，將2120至4855的級分配于PBS中。3.組合物和級分的體積200μl。4.用于測試TNF釋放的病人數(shù)5人。5.滲透壓為5例病人測試兩次的平均值；標(biāo)準(zhǔn)誤差很小，因而未列出。
鑒于表22顯示了用200μl體積的結(jié)果，表23顯示于無多粘菌素條件下用100μl組合物和100μl其RP-HPLC級分測試另外三例病人的結(jié)果。盡管由組合物引起的釋放比用200μl組合物的低(表22)但結(jié)果相似。級分1含有大部分的活性而后來的級分2和3中只有一些活性。
表23無多粘菌素時組合物HPLC級分的分離和檢測釋放的TNF(pg/ml) 滲透壓受檢樣品 總量 -LPS (mOsm)1640 RPMI培養(yǎng)基 0 - 303LPS(50ng/10μl) 195±72 0 302組合物#B0213 692±266497347級分(分鐘)205-2120 575±82 3793102120-2532 226±65 31 3372532-3155 210±71 14 3053155-3458 192±40 0 3133458-4655 182±73 0 3441.釋放的總TNF用RPMI培養(yǎng)基的TNF釋放校正。2.級分重新配制205-2120的級分配于水中，2120-4855的級分配于PBS中。3.組合物及級分的體積200μl。4.用于測試TNF釋放的病人數(shù)35.滲透壓為受試病人的平均數(shù)；標(biāo)準(zhǔn)誤差很小，因而未列出。C.組合物的滲透性對釋放TNF的影響本發(fā)明的組合物為高滲性。人們研究了本發(fā)明組合物高滲性對TNF-α釋放活性的影響，發(fā)現(xiàn)甚至將滲透性調(diào)至低滲性時，組合物仍能繼續(xù)釋放TNF-α。D.利用高含量有機(jī)溶劑的沉淀作用對組合物進(jìn)行物理化學(xué)分離正如組合物快速洗脫所顯示的那樣，由于組合物的大部分TNF釋放活性未與RP-HPLC結(jié)合，因此人們決定使用其作用原理與反相層析分離法相反的層析柱，其中樣品存在于高濃度有機(jī)溶劑中且允許親水性相互作用。將此分離方法用于小極性的物質(zhì)。然而，當(dāng)組合物被置于80％乙腈中時，沉淀形成了。因此，在高濃度有機(jī)溶劑緩沖液中一定含量的組合物沉淀下來。分離沉淀物和可溶級分。通過冷凍作用沉淀物和可溶級分都得以干燥。將沉淀物和可溶級分重新分配于水溶液中，且將兩者用RP-HPLC分析并且檢測TNF-α釋放活性。表24表明大部分的TNF-α釋放活性包含在沉淀物中。
表24由80％乙腈沉淀制備的組合物各級分的TNF釋放活性釋放的TNF(pg/ml)體積/ 滲透壓受檢樣品濃度總量 -LPS (mOsm)1X 199培養(yǎng)基 0 - 306LPS50ng/10μl161±50 0 301組合物 100μl 471±304 310 307#B0213 200μl 505±210 344 318上清液 100μl 192±63 31309200μl 221±69 60310沉淀物 100μl 626±212 465 307200μl 1299±565 1138 346注釋1.釋放的總TNF用1×199培養(yǎng)基的TNF釋放校正。2.重新分配上清液配制于PBS中；沉淀物配在雙蒸水中。3.沉淀物于(低滲性)70％1×199培養(yǎng)基中。4.受試病人數(shù)55.滲透壓為5例受試病人中4例的平均值；標(biāo)準(zhǔn)誤差很小，因此未列出。
對組合物的沉淀物(圖11)和可溶級分(圖12)二者的RP-HPLC分析表明組合物的RP-HPLC級分1中所含的物質(zhì)主要是沉淀物(圖10)，而可溶物質(zhì)所包含的是組合物的其它RP-HPLC級分(圖10)。因此，用這兩種不同的方法表明組合物的活性包含在由RP-HPLC保留最少的級分中。事實(shí)上，沉淀物以100μl和200μl檢測時具有的活性與未沉淀的組合物相等。
只有200μl沉淀物具有超出正常的滲透壓。因而，用RP-HPLC將組合物的沉淀物和可溶級分(上清液)分離開(圖11和12)并且將它們分成兩個級分(參見RP-HPLC圖)。級分1(200-2110分鐘)等同于被RP-HPLC分離的組合物的相同級分1，級分2等同于被RP-HPLC分離的組合物的級分2至5。然后檢測分離物的TNF-α釋放活性。表26顯示對兩例病人而言，經(jīng)RP-HPLC分離后，無論是沉淀物還是上清液均無任何TNF-α釋放活性。然而，對起初兩例病人的檢測結(jié)果(表25)表明存在著沉淀物未能以理想的體積進(jìn)行檢測的可能性。接下來，對另外的兩例病人并且以更低一點(diǎn)的濃度重新檢測各級分。表26顯示了在50μl和100μl時，沉淀物的級分1具有最大的活性。在50μl時，其釋放的TNF-α比50ng LPS多一倍。然而，在沉淀物的RP-HPLC級分2中也發(fā)現(xiàn)了較少量的釋放活性，另外在上清液的RP-HPLC級分1和2中也發(fā)現(xiàn)了較少量的活性。
表2580％乙腈沉淀組合物的HPLC分離級分的TNF釋放活性釋放的TNF(pg/ml)所用的199體積/ 滲透壓受試樣品 培養(yǎng)基 濃度總量 -LPS(mOsm)培養(yǎng)基 1X 0 - 294LPS 1X 50ng/10μl 194±93 0 294(#B0213) 1X-70％1X100μl 855±88 661 281200μl 926±163732 291上清液215-21281X100μl 92±75 0 2691X200μl 25±25 0 2422148-4613 70％1X 100μl 61±56 0 29670％1X 200μl 2±2 0 297
表25(續(xù))80％乙腈沉淀組合物的HPLC分離級分的TNF釋放活性釋放的TNF(pg/ml)所用的199體積/滲透壓受試樣品 培養(yǎng)基 濃度 總量 -LPS (mOsm)沉淀物200-21101X 100μl183±15 0 3051X 200μl 0 0 3542110-4620 70％1X100μl 62±61 0 29970％1X200μl 0 0 302注釋1.釋放的總TNF用199培養(yǎng)基1×的TNF釋放校正。2.重新配制第一級分配制于雙蒸水中，第二級分配制于PBS中。3.受試病人數(shù)24.滲透壓為受試病人的平均值；標(biāo)準(zhǔn)誤差很小，因而未列出。5.1×和70％1×199培養(yǎng)基中的平均值。
表26以80％乙腈級分的沉淀物和上清液進(jìn)一步滴定后的TNF釋放TNF釋放(pg/ml)體積/滲透壓受檢樣品濃度 總量 -LPS(mOsm)1X199培養(yǎng)基 0 - 317LPS 50ng/10μl 136±38 0 320#B0213 100μl274±80 138 317
表26(續(xù))以80％乙腈級分的沉淀物和上清液進(jìn)一步滴定后的TNF釋放TNF釋放(pg/ml)體積/ 滲透壓受檢樣品 濃度總量 -LPS(mOsm)上清液215-2128 50μl 171±66 35 319100μl 193±73 57 3222148-461350μl 184±34 48 311100μl 162±40 26 310沉淀物200-2110 50μl 287±69 150 333100μl 204±40 68 3552110-462050μl 148±46 11 323100μl 198±44 62 325200μl 1299±5651138346注釋1.釋放的總TNF用199培養(yǎng)基1×的TNF釋放校正。2.重新配制第一級分配制于雙蒸水中，第二級分配制于PBS中。3.受試病人數(shù)24.滲透壓為受試病人的平均值；標(biāo)準(zhǔn)誤差很小，因而未列出。5.所有樣品均在1×199培養(yǎng)基中。E.不同培養(yǎng)基的TNF-α釋放人們已經(jīng)觀察到在199培養(yǎng)基和RPMI 1640中對從RPMI 1640至199培養(yǎng)基導(dǎo)致較低TNF-α釋放的seitch進(jìn)行了評價(表27)。結(jié)果顯示在RPMI 1640培養(yǎng)基中10-200ng的LPS比在199培養(yǎng)基中的LPS能更有效地釋放TNF-α?？梢酝茰y，組合物在RPMI 1640培養(yǎng)基中能產(chǎn)生更大的釋放作用。因此，培養(yǎng)條件可以影響TNF-α釋放的程度。
表27對不同培養(yǎng)基中TNF釋放的評價釋放的TNF滲透壓 釋放的TNF 滲透壓受檢樣品 (pg/ml)(mOsm)(pg/ml) (mOsm)培養(yǎng)基23296 47LPS10ng/10μl124 291 -50ng/10μl155 292356 285100ng/10μl147 293323 289200ng/10μl213 294455 2881000ng/10μl404 298558 292F.組合物的滲透壓表28顯示了組合物不同批次的滲透壓。B0213稍微高一些，為675mOsm。表現(xiàn)出甚至比B0213更好的TNF釋放活性的B0222其高滲性較低，為581mOsm。級分B0226、BC11-06和BC11-09的滲透壓范圍從540到603mOsm。
表28全部批號的滲透壓批號 pH 滲透壓(mOsm)濃縮的B0222 未調(diào)節(jié)pH 411B0222 已調(diào)節(jié)pH 581B0216 已調(diào)節(jié)pH 872B0219 已調(diào)節(jié)pH 886
表28(續(xù))全部批號的滲透壓批號pH 滲透壓(mOsm)未濃縮的B0221未調(diào)節(jié)pH 652B0221已調(diào)節(jié)pH 533B0213已調(diào)節(jié)pH 675B0225已調(diào)節(jié)pH 590B0226已調(diào)節(jié)pH 540BC11-06 已調(diào)節(jié)pH 445BC11-09 已調(diào)節(jié)pH 603實(shí)施例11A.本發(fā)明組合物腫瘤壞死因子(TNF)釋放活性1.組合物的乙腈沉淀物和上清液如上實(shí)施例所示，80％乙腈沉淀物形成了本發(fā)明組合物。對沉淀物和未沉淀(上文稱為上清液)組合物進(jìn)行進(jìn)一步檢測以確定TNF釋放活性位于何處。
表29顯示80％乙腈，一種有機(jī)溶劑沉淀了組合物的TNF釋放成分。而0.04ml的全部組合物釋放了約15pg/ml的TNF，0.05ml組合物的各沉淀批次分別釋放58(B0222)、0(B0221)和17(B0213)pg/ml，這說明80％乙腈沉淀物回收了TNF釋放成分。將沉淀的組合物用相同體積的已將其沉淀的液體重新配制。因此0.1ml的沉淀物來自于0.1ml的總組合物并等于0.1ml的總組合物。
表2980％乙腈制備的Virulizin*之沉淀物的TNF釋放活性釋放的TNF(pg/ml)所用的199孔中 滲透壓受試樣品 培養(yǎng)基 的量 總量 -LPS(mOsm)LPS 1X 50ng 322±115 0 308VirulizinB0222總組合物 80％1X 40μl 337±107 15 312沉淀物 70％1X200μl 1091±13776935170％1X100μl 620±186 29831770％1X 50μl 380±132 58 29770％1X 25μl 312±137 0 294VirulizinB0221總組合物 90％1X 40μl 282±75 0 306沉淀物 70％1X200μl 981±205 66034870％1X100μl 526±169 20531470％1X 50μl 308±104 0 29870％1X 25μl 318±185 0 292VirulizinB0213總組合物90％1X 40μl 383±72 61 312沉淀物70％1X200μl 1143±17282136670％1X100μl 687±186 36532670％1X 50μl 339±133 17 30570％1X 25μl 300±144 0 298注釋1.受試病人數(shù)52.釋放的總TNF用1×199培養(yǎng)基的TNF釋放校正。3.滲透壓未用1×199培養(yǎng)基(311mOsm)校正。4.給出滲透壓平均值，由于標(biāo)準(zhǔn)誤差很小，所以未列出。5.沉淀物重配于雙蒸水中。6.加至孔中的LPS體積為10μl。7.孔的總體積為1000μl 。8.樣品體積相同*本發(fā)明組合物在此也被稱為VIRULIZIN。
令人有興趣注意到的是在早期的研究中通常使用0.1和0.2ml之間的組合物刺激TNF釋放。重新分配至0.1和0.2ml的B0222、B0221和B0213，其沉淀物所釋放的TNF在205至821pg/ml之間。0.1ml的沉淀物，批號B0222、B0221和B0213所釋放的TNF在205與365pg/ml之間，TNF的量非常近似，這說明三個不同批次的TNF釋放活性具有一致性。
在單獨(dú)一組的供體白細(xì)胞上，對組合物經(jīng)80％乙腈沉淀后尚存的上清液進(jìn)行了檢測。而事實(shí)上0.04ml全部批次的組合物(B0222和B0213)釋放了175和233pg/ml的TNF，0.05ml的上清液釋放了42和41pg/ml TNF，約為全部組合物活性的33％。因此，沉淀物中的TNF釋放活性不是用于誘導(dǎo)沉淀物的緩沖液中某些殘余物的結(jié)果。
鑒于前述在不同供體的白細(xì)胞上檢測沉淀物和上清液級分的研究，導(dǎo)致了另一項在相同供體的白細(xì)胞上檢測兩級分的研究。對于兩種受試的批次而言，0.04ml的全部組合物釋放了0到41pg/ml之間的TNF。與此相比，0.05ml相同批次組合物的沉淀物釋放了141和749pg/ml的TNF，而0.05ml上清液級分釋放了6到57pg/ml之間的TNF。因此沉淀物含有很多TNF釋放活性。上清液級分也具有某些TNF釋放活性，但比沉淀物小得多，且不會超過全部組合物。2.本發(fā)明組合物的反相HPLC分離級分由于組合物沉淀物顯示出含有很多TNF釋放活性，所以檢測了沉淀物的C18RP-HPLC圖譜。圖18、19和20分別表示全部組合物、沉淀物和上清液的RP-HPLC圖譜。沉淀物的圖譜主要顯示了全部組合物早期洗脫峰(圖19)，而上清液的圖譜(圖20)除了早期峰較弱外與全部組合物相似。
以下的系列實(shí)驗(yàn)評價了在C18RP-HPLC分離后沉淀物和上清液的活性。由RP-HPLC收集2份沉淀物和上清液2-21分鐘和21-46分鐘。對由RP-HPLC分離的全部組合物各級分的早期研究表明TNF釋放活性主要洗脫在2-20分鐘的級分中。表30顯示了全部組合物和沉淀物及上清液RP-HPLC級分的檢測結(jié)果。在這個特定實(shí)驗(yàn)中，僅使用了10μl的全部組合物但未引起TNF釋放。2-21分鐘部分的沉淀物釋放了TNF，而21-46分鐘部分沒有(表30)。2-21分鐘部分的上清液也釋放了TNF活性，而21-46分鐘部分則釋放了最小量的TNF(表30)。因此對沉淀物和上清液而言，TNF釋放活性主要駐留在C18RP-HPLC的早期洗脫級分中。
表3080％乙腈(2×沖洗)制備的Virulizin*之沉淀物和上清液HPLC級分的TNF釋放活性釋放的TNF(pg/ml)所用的199 孔中 滲透壓受試樣品 培養(yǎng)基 的量 總量-LPS(mOsm)LPS 1X 50ng 99±430 307VirulizinB0222全組合物 80％1X 10μl83±330 289HPLC沉淀物200-213670％1X100μl153±43 54 30670％1X 50μl 50±14 0 2892136-4628 1X 100μl 97±29 0 3061X 50μl103±43 3 306
表30(續(xù))80％乙腈(2×沖洗)制備的Virulizin*之沉淀物和上清液HPLC級分的TNF釋放活性釋放的TNF(pg/ml)所用的199 孔中 滲透壓受試樣品培養(yǎng)基的量 總量 -LPS(mOsm)HPLC上清液200-2135 1X 100μl192±55 92 3301X 50μl183±72 83 3202135-46301X 100μl 65±21 0 3111X 50μl142±40 43 309VirulizinB0213全組合物90％1X10μl 93±36 0 296HPLC沉淀物200-211270％1X 100μl165±52 66 31070％1X50μl 48±15 0 2872112-46121X 100μl 88±31 0 3071X 50μl101±38 1 307HPLC上清液200-2115 1X 100μl193±76 93 3171X 50μl126±43 26 3062115-46201X 100μl 59±24 0 3091X 50μ1126±32 26 312注釋1.受試病人數(shù)52.釋放的總TNF用1×199培養(yǎng)基的TNF釋放校正。3.滲透壓未用1×199培養(yǎng)基(309mOsm)校正；標(biāo)準(zhǔn)誤差很小，所以未列出。4.重新配制沉淀物配于類型1的水中，上清液配于PBS緩沖液中。5.加至孔中的LPS體積為10μl。6.孔含有的總體積為1000μl。
結(jié)果表明沉淀物和上清液中的TNF釋放物質(zhì)可能是密切相關(guān)的分子，如果不相同，僅有的差異(如果有的話)也許是在于80％乙腈中的可溶程度。
在另一實(shí)驗(yàn)中，檢測了三個批次組合物的兩個RP-HPLC部分的沉淀物其TNF釋放活性。表31還顯示了對于三個批次(B0222、B0221和B0213)而言，TNF釋放活性主要在2-21分鐘的部分中。因此，不同的批次是一致的。
表3180％乙腈制備的Virulizin之HPLC沉淀物級分的TNF釋放活性釋放的TNF(pg/ml)所用的199 孔中 滲透壓受試樣品培養(yǎng)基 的量 總量 -LPS(mOsm)LPS(1)1X 50ng 136±62 0 299LPS(1)1X 50ng 81±250 306VirulizinB0222全組合物 1X 40μl 734±276 65932910μl 119±11 38 303HPLC沉淀物200-2125min 70％1X 200μl 20±4 0 354100μl 155±32 74 3072125-46201X 200μl 67±390 313100μl 78±100 310VirnlizinB0221全組合物90％1X 40μl 626±90 49031510μl 62±310 290HPLC沉淀物200-2145min 70％1X 200μl 20±7 0 365100μl 170±690 3292145-4650min. 1X 200μl 45±5 0 336100μl 73±150 311
表31(續(xù))80％乙腈制備的Virulizin之HPLC沉淀物級分的TNF釋放活性釋放的TNF(pg/ml)所用的199 孔中 滲透壓受試樣品 培養(yǎng)基的量 總量-LPS(mOsm)VirulizinB0213全組合物 90％1X40μl620±123 484 31510μl 80±17 0 290HPLC沉淀物200-2130min 70％1X 200μl 6±4 0 393100μl 153±4572 3142130-4630min1X 200μl 182±9647 312100μl78±20 0 310注釋1.對于100和10μl樣品，測試了3例病人。2.對于200和40μl樣品，測試了4例病人。3.釋放的總TNF用199培養(yǎng)基1×的TNF釋放校正。4.199培養(yǎng)基1×@100和10μl-306mOsm，@200和40μl-305mOsm。5.滲透壓為平均數(shù)且未用199培養(yǎng)基1×進(jìn)行校正；6.加至孔中的LPS體積為10μl。7.孔含1000μl的總體積。8.樣品體積相同9.重新配制級分1配于雙蒸水中，級分2配于PBS緩沖液中。
進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)，檢測用80％乙腈洗滌沉淀物的效果。實(shí)驗(yàn)的目的是為了證明TNF釋放活性不會被容易捕獲。0.04ml的全部組合物釋放325pg/ml TNF。0.1ml的2-24分鐘部分的沉淀物釋放324pg/mlTNF，0.05ml時釋放3pg/ml。24-46分鐘部分不釋放TNF。同樣地，0.1和0.05ml的2-24分鐘部分的上清液釋放TNF，而24-46分鐘部分在RP-HPLC上具有某些，但相當(dāng)小的TNF釋放活性。
為了確認(rèn)組合物RP-HPLC分離物的處理并不對TNF釋放活性的存在負(fù)責(zé)，以同樣的方式制備樣品但不加入組合物。PBS和H2O空白樣的RP-HPLC圖譜，它們的沉淀物和上清液圖譜基本上無任何峰。
利用相同供體的單核細(xì)胞，在相同供體的白細(xì)胞上檢測樣品，全部組合物及從2-24分鐘洗脫的沉淀物釋放TNF，而PBS、H2O或者于RP-HPLC上分離的沉淀物在其2-23分鐘部分中無TNF釋放活性。因此，從2-24分鐘洗脫的沉淀物導(dǎo)致特異性的TNF釋放。
從24-46分鐘洗脫的組合物沉淀物部分沒有釋放TNF。實(shí)驗(yàn)表明水與PBS的對照樣分別釋放114和40pg/ml。因此，24-46分鐘的沉淀物部分無特異性TNF釋放。
2-24分鐘及24-46分鐘的上清液級分部分分別釋放了82和68pg/ml的TNF。RP-HPLC的水和PBS空白部分釋放了一些TNF活性。2-25分鐘及25-46分鐘的水部分分別釋放了149和216pg/ml的TNF，而PBS部分分別釋放0和126pg/ml。
因此，沉淀物及上清液級分均有TNF釋放活性。TNF釋放活性的RP-HPLC分離表明二者均較早地從RP-HPLC中洗脫出來，這說明活性成分在物理學(xué)上即使不相同也非常近似。
進(jìn)一步檢測經(jīng)RP-HPLC分離后80％乙腈沉淀物與上清液表32給出了它的總結(jié)性結(jié)果，該結(jié)果減去相同情況下制備的空白樣品的活性。
表32重新配制溶液Virulizin釋放活性的減少所用199孔中 實(shí)際釋放滲透壓受試樣品 培養(yǎng)基的量 TNF-a GM-CSP IL-1β (mOsm)VirulizinB0222全組合物 80％1X40μl178136142 310HPLC沉淀物(min)220-2410 70％1X100μl 75 13 18 3142410-4620 70％1X100μl 0 16 0292HPLC上清液(min)200-23551X 100μl 82 86 03362355-4620 1X 100μl 0 45 29 316注釋1.數(shù)據(jù)來源于Virulizin總表表24.4。2.重新配制Virulizin第1沉淀物級分配于類型1的水中，其它所有級分配于PBS中。3.總量未重新配制，因而未校正。4.樣品體積相等。
全部組合物從24小時的單核細(xì)胞體外釋放TNF、GM-CSF和IL-1β。80％乙腈沉淀物含有相同的釋放活性，并且大部分洗脫在RP-HPLC早期級分中。上清液級分保留有釋放活性，并且大部分洗脫在RP-HPLC早期級分中。上清液級分保留了釋放活性，但它也洗脫在用于TNF和GM-CSF的早期洗脫RP-HPLC級分中。這些結(jié)果表明同一種成分可能釋放了三個細(xì)胞因子。對于GM-CSF和IL-1β來講，某些釋放活性洗脫在RP-HPLC后期級分中的事實(shí)表明在組合物中可能有另一種物質(zhì)能夠作用于單核細(xì)胞去釋放GM-CSF和IL-1β。物理化學(xué)分析SDS凝膠電泳由于已經(jīng)確定TNF、IL-1β和GM-CSF釋放活性可以部分被80％乙腈沉淀，而且多數(shù)釋放活性從C18RP-HPLC中較早洗脫出來，所以對沉淀物級分的理化特性進(jìn)行了研究并將其與全部組合物和組合物上清液級分進(jìn)行了比較。
圖21顯示了全部組合物及組合物的沉淀物與上清液其SDS凝膠電泳。在所有三個例證中，組合物跑得最接近SDS前沿，這說明它具有低分子量，所用的最小標(biāo)準(zhǔn)物為14,400道爾頓。分子篩HPLC通過測試組合物從分子篩HPLC柱中洗脫的時間，以測定組合物分子的大小。將全部組合物、沉淀物和上清液的洗脫時間與標(biāo)準(zhǔn)物比較。所有這三個時間均晚于胰島素，其洗脫時間為24.5分鐘。物化分析又一次說明分子量小于2.400Da。親水(聚羥乙基)HPLCTNF釋放成分較早洗脫出來。因此在有機(jī)溶劑存在的情況下選擇有相反作用的層析柱。即疏水柱。對聚羥乙基柱而言理想的洗脫條件是80％乙腈。然而，如上一實(shí)施例所示，制備物中的某些物質(zhì)在此濃度時會沉淀。因此，對低濃度乙腈條件下的組合物作了分析，此時層析柱主要是作為分子篩柱。圖22和23顯示了全部上清液和沉淀物的圖譜。前一頁總結(jié)了不同峰的洗脫時間。這些洗脫時間表明組合物的活性成分具有低分子量。沉淀成分的氨基酸分析與測序兩份樣品于酸水解前后用氨基酸組成分析法進(jìn)行了蛋白質(zhì)分析乙腈沉淀物和沉淀物的2-20分鐘RP-HPLC洗脫級分。比較酸水解前后的氨基酸含量，說明兩份樣本非常相似。然而在氨基酸組成上兩者有顯著的區(qū)別(酸水解后)，并且使人聯(lián)想到肽鍵水解的游離氨基酸含量上也有顯著差異。這兩種樣品的組成均很特別即它們均富含甘氨酸加谷氨酸/谷氨酰胺。
根據(jù)前面可以推測至少有一種活性成分是蛋白性的。分析顯示很可能有顯著數(shù)量的、未鑒定出的茚三酮陽性(極可能為氨基酸化合物，但其它化合物也會產(chǎn)生反應(yīng))成分，該成分似乎對酸水解穩(wěn)定。樣品中每1000個殘基中的主要氨基酸為Asx(精氨酸)143、Thr(蘇氨酸)31、Glx(谷氨酸)381、Gly(甘氨酸)187和Ala(丙氨酸)170。
對游離的和釋放的(酸水解)氨基酸之間進(jìn)行了比較。表明每1000個殘基中有下述氨基酸Asx(精氨酸)51、Thr 8.6絲氨酸18、Glx(谷氨酸)375、Pro(脯氨酸)17、谷氨酸(Gly)429和丙氨酸86。
游離的1000的比率如下釋放的/1000Asx 4.09Thr 2.03Ser 1.65Glx 1.18Gly 0.37Ala 1.69有5個未確認(rèn)(茚三酮陽性)成分。很可能的分配是半胱氨酸、葡糖胺酸和肌氨酸。也可能是蛋氨酸亞砜和蛋氨酸砜。主要的未確認(rèn)的茚三酮成分似乎為樣品中的游離成分。
實(shí)施例12IL-1β和IL-8的釋放表33顯示本發(fā)明的組合物刺激培養(yǎng)的人單核細(xì)胞釋放IL-1β且該組合物80％乙腈沉淀物比殘留的上清液釋放得更多。而全部組合物并不刺激IL-8的釋放，分級的組合物似乎可以釋放一些IL-8。示于表33中的結(jié)果為減去模擬樣品的IL-1β和IL-8的釋放。
表33用重新配制的溶液Virulizin釋放活性的較小釋放實(shí)際釋放量受測樣品所用的199 孔中的數(shù)量 IL-1βIL-8 滲透壓培養(yǎng)基(pg/ml) (ng/ml) (mOsm)VirulizinB0222總樣品 80％1× 40μl 171 0 304沉淀樣品 70％1× 100μl 160 71 292上清液樣品 90％1× 100μl 1787 335注意1.受試病人數(shù)目52.重新配制，沉淀物于類型1水中；上清液于PBS緩沖液中。3.用來釋放的樣品用1×199培養(yǎng)基及LPS校正釋放的IL-1β和IL-8，分別為154、1065pg/ml和68、294ng/ml。4.培養(yǎng)基及LPS的滲透壓分別為311和309。5.加至孔中的LPS體積10μl。6.孔的總體積1000μl。7.樣品體積相等。物理化學(xué)特征用離子交換HPLC分離所說組分及其沉淀物和上清液。用A×300(陰離子交換)層析和CMX300(陽離子交換)層析均無組分的顯著分離。疏水反相層析法沒有將峰分開。毛細(xì)管電泳毛細(xì)管電泳分析沉淀物。在高pH時，于190nm處觀察到W吸收峰，但該峰在200nm處完全消失。于214nm Uv吸收處沒有明顯的峰。除非游離氨基酸是非衍生的，否則其不能被識別。有人認(rèn)為190nm處的W峰可能是一種鹽。
實(shí)施例13在下述三種指示系統(tǒng)中評價組合物的刺激活性(1)刺激淋巴細(xì)胞DNA的合成；(2)誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒素功能；及(3)誘導(dǎo)單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒素功能。篩選出這些試驗(yàn)是因?yàn)樗鼈兛梢詸z測早已顯示與惡性疾病患者不同臨床指標(biāo)相關(guān)聯(lián)的免疫功能。這些免疫功能的指示物也可調(diào)節(jié)以不同生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑如干擾素或白細(xì)胞介素-2治療的癌癥病人。初始篩選過程的結(jié)果示于下文。
(1)刺激淋巴細(xì)胞DNA的合成與植物凝集素(PHA)最理想的刺激濃度相比。
刺激物 每分鐘計數(shù)培養(yǎng)基 374PHA125,817組合物(#222) 1,116組合物(1∶10) 1,021組合物(1∶50) 649
結(jié)論不同于原型促細(xì)胞分裂劑PHA，該組合物并不刺激淋巴細(xì)胞進(jìn)行芽基發(fā)育和細(xì)胞分化。
(2)刺激淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒素功能與白細(xì)胞介素-2(IL-2)最理想刺激濃度相比刺激物溶解單位培養(yǎng)基 30.8IL-2472.5組合物(純凈)48.1組合物(1∶10) 33.3組合物(1∶50) 44.8結(jié)論不同于淋巴細(xì)胞細(xì)胞毒素功能的原型刺激因子白細(xì)胞介素-2，該組合物未激發(fā)淋巴細(xì)胞細(xì)胞毒性。
(3)組合物對單核細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒素功能的刺激作用與γ干擾素和內(nèi)毒素(γ-IFN和LPS)相比刺激物 細(xì)胞毒性(％)(E/T＝20/1)培養(yǎng)基 4.3IFN+LPS 24.4組合物(純凈)19.7組合物(1∶10) 20.0組合物(1∶50) 11.5結(jié)論組合物能夠刺激外周血單核細(xì)胞以劑量依賴形式表達(dá)殺腫瘤功能。刺激程度可以與由原型巨噬細(xì)胞激活劑γIFN+LPS的聯(lián)合激發(fā)程度相比。組合物在這些體外測定中的作用并不像其它任何巨噬細(xì)胞激活劑那樣需要加入內(nèi)毒素，認(rèn)識到這一點(diǎn)是重要的。如果組合物沒有內(nèi)毒素污染，在這個巨噬細(xì)胞激活測定中的組合物其生物活性被認(rèn)為具有顯著的生物學(xué)性質(zhì)。組合物對單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞的研究因?yàn)楹Y選過程證明組合物不能刺激淋巴細(xì)胞功能但能刺激單核細(xì)胞功能，所以接下來的研究目的是進(jìn)一步表征該化合物的單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞刺激活性。作了大量的比較研究，目的在于測定組合物刺激單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞殺腫瘤功能的劑量反應(yīng)特征以及檢驗(yàn)該化合物的不同批次。研究的主要重點(diǎn)是檢測組合物刺激來自癌癥病人不同解剖部位的單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞殺腫瘤功能的能力。指導(dǎo)這些研究的中心假設(shè)是任何生物刺激因子的治療有效性大部分都將依賴于其在包含惡性疾病的環(huán)境下激發(fā)殺腫瘤功能的能力。這可通過直接刺激于腫瘤微環(huán)境下存在的免疫細(xì)胞而產(chǎn)生。另一種途徑是它可以通過刺激循環(huán)免疫細(xì)胞而產(chǎn)生，如果這些細(xì)胞以后可以回位于惡性疾病部位并在該環(huán)境下發(fā)揮功能的話。對這些研究而言，依靠下列細(xì)胞(1)來源于癌癥病人及對照者的外周血單核細(xì)胞；(2)來源于肺癌病人及患有非惡性肺部疾病對照患者的肺泡巨噬細(xì)胞；以及(3)來源于患婦科惡性腫瘤病人的腹膜巨噬細(xì)胞。1.組合物的劑量反應(yīng)及不同批次的研究這些研究依靠外周血單核細(xì)胞檢測組合物不同劑量及不同批次的刺激活性。三批組合物用來進(jìn)行檢測。它們被稱為批次#s 216、219和222。每一批次的組合物分為不稀釋(純凈)、物質(zhì)1∶10稀釋及1∶50稀釋三種進(jìn)行檢測。結(jié)果以附圖形式于圖24中進(jìn)行描述。
結(jié)論批次#222及216刺激了單核細(xì)胞殺腫瘤功能，批次#219則沒有。在這些預(yù)實(shí)驗(yàn)中，#222顯得超過216。批次#222顯得能夠在未稀釋(純凈)及1∶10稀釋濃度時刺激相同程度的殺腫瘤功能，于1∶50稀釋時有較小但仍可測出的活性。批次#216于未稀釋(純凈)濃度時產(chǎn)生最大的殺腫瘤功能的刺激作用，于1∶10稀釋時刺激作用減小，1∶50稀釋時沒有了可檢測出的活性。如上所述，批次#219于任何所試濃度時均不激發(fā)出可測出的殺腫瘤功能。2.外周血單核細(xì)胞中的殺腫瘤功能對4份來源于對照者的外周血單核細(xì)胞樣品進(jìn)行試驗(yàn)。這些試驗(yàn)利用了組合物的理想刺激濃度(批次#222的1∶10稀釋物)以及γ-IFN+LPS的理想刺激濃度。本研究中的靶細(xì)胞為培養(yǎng)的NK-不敏感細(xì)胞系，Chang肝癌。
刺激物 細(xì)胞毒性(％)(E/T＝20/1)培養(yǎng)基 5.4+/-1γ-IFN+LPS18.6+/-4組合物22.3+/-6再對一份來源于患宮頸癌病人的單核細(xì)胞樣品進(jìn)行檢測。該實(shí)驗(yàn)很重要，因?yàn)椴∪俗陨淼哪[瘤細(xì)胞可用于檢測中的靶細(xì)胞。如前所述，該試驗(yàn)利用了組合物的理想刺激濃度(批次#222的1∶10稀釋物)和γ-IFN+LPS的理想刺激濃度。而且，效應(yīng)器/靶細(xì)胞的比值降至15/1為的是保存病人的腫瘤細(xì)胞。
刺激劑 細(xì)胞毒性(％)(E/T＝20/1)培養(yǎng)基 5.5γ-IFN+LPS 14.4組合物 20.9結(jié)論來源于對照者的外周血單核細(xì)胞中，組合物以等于或大于γIFN+LPS理想刺激濃度激發(fā)的程度刺激單核細(xì)胞對Chang肝癌的殺腫瘤功能。來源于宮頸癌患者的外周血單核細(xì)胞中，組合物以超過γ-IFN+LPS激發(fā)的程度30％的程度刺激對病人自身腫瘤細(xì)胞的殺腫瘤功能。3.來源于婦科惡性腫瘤患者的腹膜巨噬細(xì)胞中的殺腫瘤功能這些實(shí)驗(yàn)是對從1例宮頸癌患者及1例卵巢癌患者的灌洗液中分離的腹膜巨噬細(xì)胞樣品進(jìn)行的。這些實(shí)驗(yàn)用病人自身腫瘤細(xì)胞作為測定中的靶細(xì)胞。如前所述，對組合物的理想刺激濃度(批次#222的1∶10稀釋物)及γ-IFN+LPS的理想刺激濃度作了比較。而且，將效應(yīng)器/靶細(xì)胞比值降至15/1以保存病人的腫瘤細(xì)胞。
刺激劑 宮頸癌 卵巢癌培養(yǎng)基 8.20.6IFN+LPS 29.84.1組合物(1∶10) 13.28.9結(jié)論這些試驗(yàn)結(jié)果突出了這樣一個事實(shí)，即局部腫瘤環(huán)境可能是免疫細(xì)胞對免疫性激活物反應(yīng)的決定因素。在宮頸癌這一例中，其腹腔中無惡性疾病的病原性跡象，且用γ-IFN+LPS發(fā)展的對自體腫瘤的殺腫瘤功能好于組合物。在患卵巢癌的病人中，腹腔中有明顯的腫瘤。針對病人自身腫瘤對γ-IFN+LPS的反應(yīng)至多也只是最小的，而對組合物的反應(yīng)則較大，4.來源于肺癌病人及對照者的肺泡巨噬細(xì)胞中的殺腫瘤功能對從1例非小細(xì)胞肺癌患者及3例肺非惡性疾病患者的支氣管灌洗液中分離的肺泡巨噬細(xì)胞進(jìn)行這些試驗(yàn)。這些試驗(yàn)利用了組合物理想的刺激濃度(批次#222的1∶10稀釋物)和γ-IFN+LPS的理想刺激濃度。這些研究中的靶細(xì)胞為Chang肝癌細(xì)胞，且效應(yīng)器/靶細(xì)胞比值為20/1。
刺激劑 癌癥病人 對照者培養(yǎng)基 2.6+/-2 19.5+/-4γ-IFN+LPS 10.9+/-131.2+/-5組合物 5.2+/-2 18.6+/-8結(jié)論在對如γ-IFN+LPS常規(guī)巨噬細(xì)胞激活劑發(fā)生反應(yīng)的殺腫瘤功能發(fā)展過程中，來自肺癌病人的肺泡巨噬細(xì)胞受到損害。這些結(jié)論與這一觀察相符；它們表明，與對照者相比，來自肺癌病人的肺泡巨噬細(xì)胞的殺腫瘤功能相當(dāng)大程度地減弱。它們還顯示在來自肺癌病人的或者在患非惡性肺部疾病的對照者的肺泡巨噬細(xì)胞中組合物均未激活殺腫瘤功能。
用組合物進(jìn)行的這些體外預(yù)試驗(yàn)證明組合物是一種巨噬細(xì)胞激活劑。所提供的該物質(zhì)能夠在標(biāo)準(zhǔn)的細(xì)胞毒性測定中激發(fā)對NK-不敏感細(xì)胞系及新鮮分離的人腫瘤細(xì)胞的殺腫瘤活性。另外還發(fā)現(xiàn)這些試驗(yàn)中被激發(fā)出的活性為濃度依賴性。組合物體外激活巨噬細(xì)胞殺腫瘤功能的能力可以和現(xiàn)在能得到的最好的巨噬細(xì)胞激活聯(lián)合物，即γ-IFN+LPS內(nèi)毒素的激活能力相比。如上所述，如果組合物沒有被內(nèi)毒素污染，則在無內(nèi)毒素下的組合物其激發(fā)到此種程度的殺腫瘤功能的能力應(yīng)被認(rèn)為具有重要的生物學(xué)性質(zhì)。
如所發(fā)現(xiàn)的其它的巨噬細(xì)胞激活劑一樣，組合物刺激巨噬細(xì)胞殺腫瘤功能的活性隨巨噬細(xì)胞的來源而不同。這說明組合物是一種外周血單核細(xì)胞的杰出激活劑，等同于正常供體γIFN+LPS并且可能優(yōu)于癌癥病人供體的外周血單核細(xì)胞的γIFN+LPS。惡性疾病依其所用的激活劑對單核細(xì)胞殺腫瘤功能的發(fā)展具有顯著的影響(Braun等人，1991)。癌癥患者單核細(xì)胞中不同的巨噬細(xì)胞激活劑其生物活性的一個決定因素是激活劑對花生四烯酸的新陳代謝及細(xì)胞前列腺素分泌物的敏感性。這些用組合物的初始研究，表明由化合物激發(fā)的活性對前列腺素的抑制效應(yīng)不敏感。如果能夠準(zhǔn)確證明前列腺素對用組合物刺激的癌癥患者單核細(xì)胞具有不敏感性，那么這應(yīng)被認(rèn)為在治療學(xué)上具有重要意義，因?yàn)槠渌S多生物激活劑的效力被前列腺素所限制。由2種試樣所做的預(yù)實(shí)驗(yàn)表明組合物可能于腹膜巨噬細(xì)胞中有良好的活性，尤其是當(dāng)惡性病變是在腹腔中時。
這些預(yù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果還說明了當(dāng)不同激活劑刺激不同婦科惡性腫瘤患者腹膜巨噬細(xì)胞殺腫瘤功能的能力作比較時所發(fā)現(xiàn)的情況。這些研究，發(fā)現(xiàn)腹腔中惡性疾病的存在影響了腹膜巨噬細(xì)胞對特殊激活劑的反應(yīng)能力。在患宮頸癌的病人中，在腹腔中一般不存在惡性病變，所以，腹腔中的巨噬細(xì)胞對γIFN+LPS的反應(yīng)正常。然而，當(dāng)惡性病變在腹腔內(nèi)存在時，如卵巢癌，對γ-IFN+LPS的反應(yīng)被抑制。當(dāng)惡性疾病存在時，花生四烯酸的新陳代謝有了部分相關(guān)的改變(Braun等人，1993)。事實(shí)上組合物明顯能夠激活來自卵巢癌病人的腹膜巨噬細(xì)胞對患者自身腫瘤細(xì)胞的殺腫瘤功能，這再一次反映了激活機(jī)制是獨(dú)立于花生四烯酸代謝途徑的。
另一方面，無論惡性病變存在于肺中與否，顯而易見組合物不能激活肺泡巨噬細(xì)胞使之成為殺腫瘤細(xì)胞。已發(fā)現(xiàn)當(dāng)來自肺癌病人的肺泡巨噬細(xì)胞與來自同樣病人的外周血單核細(xì)胞或與來自非惡性肺病患者的對照肺泡巨噬細(xì)胞相比時，其殺腫瘤功能的發(fā)展被顯著地抑制(Siziopikou等人，1991)。因此，在這種情況下，組合物缺乏活性不會令人驚奇。
實(shí)施例14在來源于患婦科疾病病人外周血單核細(xì)胞及腹膜巨噬細(xì)胞中進(jìn)行了對本發(fā)明組合物及其它巨噬細(xì)胞激活劑發(fā)生反應(yīng)的殺腫瘤功能之發(fā)展情況的研究。更具體地說，病例數(shù)為7例，3例為良性疾病，4例為惡性疾病(2例卵巢癌，1例為子宮內(nèi)膜癌，1例為宮頸癌)。外科手術(shù)時，從病人身上切除樣本。用Braun等人的方法(CancerImmunol，Immunother，3255-61，1990)從血標(biāo)本中分離含外周血單核細(xì)胞的制備物，并用Braun等人的方法(Cancer Research533362，1993)分離含腹膜巨噬細(xì)胞的制備物。用Braun等人描述的單核細(xì)胞細(xì)胞毒性測定法(Cancer Immunol Immmunother 3255-61，1990)檢測對本發(fā)明組合物(批次222貯存液1∶10稀釋液)和其它激活劑如γ-IFN(100U/ml)、IL-12(500U/ml)和單核細(xì)胞-CSF(500U/ml)反應(yīng)的腫瘤細(xì)胞細(xì)胞毒性。
結(jié)果示于表34，它表明本發(fā)明的組合物均能刺激來源于患惡性和非惡性婦科疾病病人的外周血單核細(xì)胞及腹膜巨噬細(xì)胞中的殺腫瘤功能。由本發(fā)明組合物激發(fā)的腫瘤細(xì)胞毒性與受測的其它生物刺激劑所激活的細(xì)胞毒性相等或更大。
表34來自于患婦科疾病病人(3例良性疾病，4例惡性疾病)外周血單核細(xì)胞及腹膜細(xì)胞對本發(fā)明組合物及其它巨噬細(xì)胞激活劑發(fā)生反應(yīng)的其殺腫瘤功能的發(fā)展情況單核細(xì)胞/腫瘤細(xì)胞比率-15∶1時的腫瘤細(xì)胞毒性(％±S.E.)激活劑外周血 腹膜巨噬細(xì)胞培養(yǎng)基8.3±33.1±1γ-IFN 18.3±29.5±1IL-1226.0±48.5±2單核細(xì)胞-CSF 16.0±27.0±2本發(fā)明組合物(Virulizin) 23.0±6 12.5±2實(shí)施例15也研究了消炎痛(一種前列腺素合成抑制劑)對癌癥病人外周血單核細(xì)胞發(fā)生對本發(fā)明組合物及其它巨噬細(xì)胞激活劑反應(yīng)的殺腫瘤功能發(fā)展情況的影響。用實(shí)施例14中所描述的測定系統(tǒng)(除了將消炎痛(多至5ng/ml)與本發(fā)明組合物、IL-12(500U/ml)和單核細(xì)胞-CSF(500U/ml)同時加入之外)檢測患惡性疾病病人的樣本。
示于表35中的結(jié)果顯示消炎痛放大了對IFNa、GM-CSF和M-CSF發(fā)生反應(yīng)的細(xì)胞毒性。因此，對IFN-y、GM-CSF和M-CSF反應(yīng)的殺腫瘤功能的發(fā)展被一種消炎痛敏感性功能加以調(diào)節(jié)。相反，對佛波醇酯(PNA)、IL-12及本發(fā)明組合物反應(yīng)的殺腫瘤功能的發(fā)展則不被消炎痛敏感性功能調(diào)節(jié)，即消炎痛不能放大對本發(fā)明組合物、IL-12和PNA反應(yīng)的細(xì)胞毒性。
表35消炎痛(一種前列腺素合成抑制劑)對癌癥病人外周血單核細(xì)胞發(fā)生對本發(fā)明組合物及其它巨噬細(xì)胞激活劑反應(yīng)的殺腫瘤功能發(fā)展情況的影響激活條件*供者 細(xì)胞毒性(％)*IFN-γ 23 11.9±9*IFN-γ+消炎痛 25.2±17*GM-CSF 10 7.8±6*GM-CSF+消炎痛 17.8±8*PMA6 27.3±14*PMA+消炎痛 22.0±17IL-12 3 24.7±5IL-12+消炎痛 25.6±6M-CSF 3 14.1±3M-CSF+消炎痛 19.0±3組合物(Virulizin) 4 18.7±6組合物(Virulizin)+消炎痛 16.4±6實(shí)施例16研究前列腺素E2在消炎痛存在條件下對發(fā)生對本發(fā)明組合物反應(yīng)的殺腫瘤功能發(fā)展情況的影響。受試人員由1名正常人及8名病人(1位患胰腺癌、2位患頭頸部腫瘤，1位患子宮內(nèi)膜異位癥，4位患HIV)組成。用Braun等人(Cancer Immunol.Immunother 3255-61，1990)方法從病人血液標(biāo)本中分離出含外周血單核細(xì)胞的制備物。用Braun等人(Cancer Immunol.I mmunother 3255-61，1990)描述的單核細(xì)胞細(xì)胞毒性測定法測定在有或沒有PGE2(108M)情況下對本發(fā)明組合物(批222貯存液)1∶10稀釋液及消炎痛(多至5～g/ml)反應(yīng)的腫瘤細(xì)胞細(xì)胞毒性。
表36的結(jié)果顯示36個PGE2(108M)病理生理濃度不能抑制在對本發(fā)明組合物反應(yīng)中發(fā)展的殺腫瘤功能的水平。這一結(jié)果對立于PGE2能抑制γ-IFN刺激的單核細(xì)胞殺腫瘤功能(Braun et al.，Cancer Research 533362，1993)的報道。
表36前列腺素E2在消炎痛存在的條件下對發(fā)生對本發(fā)明組合物反應(yīng)的殺腫瘤功能發(fā)展情況的影響單核細(xì)胞/腫瘤細(xì)胞比率＝15∶1時的腫瘤細(xì)胞毒性(％)診斷 組合物 組合物(Virulizin)組合物(Virulizin)(Virulizin) +消炎痛 +消炎痛+PGE2正常19 20 27胰腺癌 15 14 22HNSCC 9 812NHSCC 11 312子宮內(nèi)膜37 37 n.d.異位癥HIV 6 78HIV 15 12 19HIV 21 16 20HIV 23 22 n.d.
實(shí)施例17研究由本發(fā)明組合物刺激的單核細(xì)胞針對自身腫瘤細(xì)胞殺腫瘤功能的發(fā)展情況。用Braun等(1990)的方法從6例病人(3例卵巢癌，1例子宮內(nèi)膜癌，1例宮頸癌及1例ENT癌)的血樣中分離出含外周血單核細(xì)胞的制備物。用Braun等(1990)描述的單核細(xì)胞細(xì)胞毒性測定法(除用病人的腫瘤細(xì)胞替代Chang肝癌細(xì)胞外)測定有或無PGE(108M)時對本發(fā)明組合物(批次222貯存液的1∶10稀釋液)及消炎痛(多至5～g/ml)反應(yīng)的腫瘤細(xì)胞細(xì)胞毒性。用膠原酶及DNA酶處理病人的腫癌細(xì)胞，制備單個細(xì)胞制備物，用Braun等(1990)描述的方法標(biāo)記細(xì)胞。
表37所示的結(jié)果顯示本發(fā)明的組合物可以激活病人自身的單核細(xì)胞殺死其腫瘤。本發(fā)明的組合物至少與目前所用的標(biāo)準(zhǔn)生物激活劑一樣有效。
表37本發(fā)明組合物(Virulizin)刺激的單核細(xì)胞針對自身腫瘤細(xì)胞殺腫瘤功能的發(fā)展情況診斷 培養(yǎng)條件 腫瘤細(xì)胞毒性(％)(E/T-15/1)卵巢癌 培養(yǎng)基2組合物(Virulizin) 11卵巢癌 培養(yǎng)基1γ-干擾素+LPS 4組合物(Virulizin) 9卵巢癌 培養(yǎng)基0γ-干擾素+LPS 14組合物(Virulizin) 11
表37(續(xù))本發(fā)明組合物(Virulizin)刺激的單核細(xì)胞針對自身腫瘤細(xì)胞殺腫瘤功能的發(fā)展情況診斷 培養(yǎng)條件腫瘤細(xì)胞毒性(％)(E/T-15/1)子宮內(nèi)膜癌培養(yǎng)基 6γ-干擾素+LPS 14組合物(Virulizin) 21宮頸癌培養(yǎng)基 8γ-干擾素+LPS 30組合物(Virulizin) 13ENT癌 培養(yǎng)基 11γ-干擾素+LPS 12組合物(Virulizin) 25實(shí)施例14至17的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示本發(fā)明的組合物能夠激活單核細(xì)胞表達(dá)殺腫瘤功能，且它至少與目前臨床應(yīng)用中所用的其它激活劑一樣有效；它在含腹膜巨噬細(xì)胞的血中起作用；且似乎并不受前列腺素抑制作用影響，前列腺素的抑制作用是病人免疫抑制的主要形式之一。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)也支持在腹膜及婦科惡性腫瘤的治療中應(yīng)用該組合物。
實(shí)施例18早期毒性研究在多種動物上進(jìn)行了毒性研究。這些研究總結(jié)于表38。在注射后第14天、21天及30天根據(jù)每天的臨床觀察對所有動物進(jìn)行評估。在整個進(jìn)行注射期間或在隨訪期間(除狗隨訪4個月外，所有動物隨訪1個月)未觀察到任何副作用。
表 38早期毒性研究的總結(jié)動物 數(shù)量劑量小白鼠100 以三天的間隔注射四次，每次肌注0.2ml雄性Wistar大鼠100 以三天的間隔注射四次，每次肌注2.0ml金黃地鼠 60 以四天的間隔注射四次，每次肌注1.5ml豚鼠 60 以三天的間隔注射四次，每次肌注3.0ml兔15 以三天的間隔注射四次，每次肌注5.0ml貓10 以三天的間隔注射六次，每次肌注3.0ml狗12 2ml/kg肌注一次，觀察四個月**30天內(nèi)每三天收集血液學(xué)數(shù)據(jù)，然后每月收集一次。
進(jìn)行一項毒性實(shí)驗(yàn)以確定單次大劑量肌肉注射本發(fā)明組合物的效應(yīng)。有13只大鼠接受了單次肌肉注射5ml/kg的組合物。有三只大鼠觀察了7天，有10只觀察了14天然后無痛苦致死并尸檢。兩組均未觀察到毒性癥狀，且尸檢動物未觀察到顯著的病理改變?；谶@些觀察結(jié)果，確定大鼠組合物肌肉注射的LD50應(yīng)大于5ml/kg。表39總結(jié)了這些結(jié)果。
表39Sprague-Dawley大鼠LD50的估計途徑動物數(shù)量用藥劑量 單位/kg*LD50Sprague3雄性i.m.5ml/kg 52.5 ＞5Dawley大鼠10 i，m，5ml/kg 52.5 ＞5ml/kg(5雄性/5雌性)
*.依測出#B0201 10.5單位/ml的生物活性的預(yù)期范圍計算的單位狗的毒性試驗(yàn)在一項由安大略獸醫(yī)學(xué)院進(jìn)行的研究中，使2只雜種狗應(yīng)用了組合物。表40給出了實(shí)驗(yàn)方案。每只狗均在右腿施用一次劑量的組合物，7天以后在左后腿再給予第二次用藥。在第一次注射后，觀察兩只狗的情況14天。在整個試驗(yàn)期間一天兩次監(jiān)測其食欲、活動能力、體溫、脈博及呼吸頻率。分別于用藥前、用藥24小時、72小時、7天及14天時進(jìn)行尿常規(guī)、血液學(xué)及血清生化學(xué)檢查。兩只動物均未顯示出與兩次注射有關(guān)的疼痛的征象。也未發(fā)現(xiàn)與第二次注射相關(guān)的過敏征象。也未觀察到歸因于藥物的物理或?qū)嶒?yàn)室指標(biāo)的異?；蚋淖儭Ｔ撍庯@示出可被健康狗良好地耐受。
表40狗的毒性試驗(yàn)動物年齡及體重第1次劑量 第2次劑量 劑量單位估算的*單位估算的*間隔雄性雜種 成年5kg 5.5ml i.m. 0.6ml i.m. 7天28.6-50.6單位 3.1-5.5單位雌性雜種 6月齡13kg 12.5ml i.m. 1.3ml i.m. 7天65.0-115.0單位 6.8-12.0單位患惡性新生物動物的治療在一獸醫(yī)醫(yī)院中臨床應(yīng)用了本發(fā)明組合物治療寵物的多種惡性腫瘤。用每周肌肉注射組合物治療患不對常規(guī)治療反應(yīng)的晚期新生物疾病的11只貓和10只狗。表41對此項研究中單個臨床病例的情況進(jìn)行了總結(jié)。注射次數(shù)從2次至69次，體積可多至單一肌注點(diǎn)7.5ml。每周注射的方案允許對各動物進(jìn)行體檢及仔細(xì)監(jiān)測針對每個動物進(jìn)行的診斷試驗(yàn)。臨床醫(yī)師注意到既沒有局部刺激癥狀，也無包括過敏在內(nèi)的嚴(yán)重過敏反應(yīng)。臨床醫(yī)師及動物的主人未觀察到全身性的副反應(yīng)。研究者注意到在一些動物身上出現(xiàn)了某些臨床方面的改善，包括較小的腫瘤變小、食欲及活動能力的改善、體重的顯著增加以及疼痛和/或不適的減輕。
表41表5-5 治療患惡性新生物動物結(jié)果的總結(jié)號碼姓名-年齡 種屬-性別診斷 起止時間注射次數(shù) 外科手術(shù)次數(shù)結(jié)果01 Bandit-13 犬-M/n 口鼻 01.31.87- 16 3 較小的部分反應(yīng)纖維肉瘤 05.19.87 病情進(jìn)行性發(fā)展無痛苦死亡02 Bob-5 貓-M/n局灶性骨化生， 04.02.87- 18 11 首次復(fù)發(fā)16個月有骨肉瘤發(fā)展， 08.10.87 全部均有完全反應(yīng)梭狀細(xì)胞肉瘤，貓纖維肉瘤， 11.08.88- 69 對隨后的治療有反鱗狀的，復(fù)發(fā)的 02.21.90 應(yīng)疾病呈進(jìn)展性梭狀細(xì)胞肉瘤- (腫瘤變得侵入更快)侵入性(尸檢診 無痛苦死亡斷03 J.D.-7 犬-M/n口腔無黑色素瘤 03.02.02.03.87 26 3 完全反應(yīng)良性乳頭狀瘤復(fù) 08.24.87. 20 目前無癥狀(4個月)發(fā)性圓形細(xì)胞肉 12.14.87-04.05.88 14瘤 04.04.89-08.01.89 1711.09.89-11.30.89 15241290 425029189 9404 Mimi-7 犬-F/s侵入性纖維肉瘤 02.27.87-08.10.87 22 5 穩(wěn)定(無變化)復(fù)發(fā) 截肢無復(fù)發(fā)05Goliath-17貓-M/n惡性黑色素瘤纖 04.02.87-09.14.87 22 3 初始主要部分反應(yīng)維肉瘤表41(續(xù))表5-5 治療患惡性新生物動物結(jié)果的總結(jié)號碼 姓名-年齡 種屬-性別診斷起止時間 注射次數(shù) 外科手術(shù)次數(shù)結(jié)果11.30.87-07.25.88 31隨后較小的部分反應(yīng)病情進(jìn)行性發(fā)展無痛苦死亡06Diablo-15 貓-M/n 惡性鱗狀細(xì)胞癌 05.28.89-06.29.87 5 1 初始較小的反應(yīng)然后病情進(jìn)行性發(fā)展無痛苦死亡07Oliver-10 犬-M/n 惡性圓形細(xì)胞肉 02.24.89-05.30.89 12 1 完全反應(yīng)瘤 無癥狀1年08Karu-7 犬-M/n 粘液性小腸癌- 06.01.87-09.14.87 14 1 較小的部分反應(yīng)轉(zhuǎn)移性 然后病情進(jìn)行性發(fā)展無痛苦死亡09Puppy-12貓-M/n 耵聹腺腺癌 07.22.88-10.04.88 10 1 較小的部分反應(yīng)然后病情進(jìn)行性發(fā)展于87年10月10日死亡10Grandpa-16 貓-M/n 退行發(fā)育的新生 01.17.89-03.20.89 9 2 較小的部分反應(yīng)物高等級惡性腫 然后病情進(jìn)行性發(fā)瘤 展于87年3月26日無痛苦死亡11Sam-7 貓-F/s 縱膈淋巴瘤 11.02.87-12.21.87 7 0 較小的部分反應(yīng)然后病情進(jìn)行性發(fā)展于87年12月21日表41(續(xù))表5-5 治療患惡性新生物動物結(jié)果的總結(jié)號碼 姓名-年齡 種屬-性別診斷起止時間 注射次數(shù) 外科手術(shù)次數(shù) 結(jié)果12 Pete-3 貓-M/n 急性貓白血病04.13.87-05.01.8750 短暫較小的部分反應(yīng)然后病情進(jìn)行性發(fā)展死于87年5月5日13Midnight-8 貓-M/n 貓白血病11.24.87-01.01.8820 病情進(jìn)行性發(fā)展無痛苦死于88年1月月7日14Stormy-10 犬-M/n 無黑色素黑色素 03.02.87-07.04.87 完全反應(yīng)瘤9個月后復(fù)發(fā)病情進(jìn)行性發(fā)展15Penny-10犬-F 惡性黑色素瘤03.02.87-07.08.87 部分反應(yīng)病情進(jìn)行性發(fā)展16Muky-5 貓-F 退行發(fā)育性癌02.09.87-06.08.8763 完全反應(yīng)三個月穩(wěn)定期后復(fù)發(fā)17George-10 貓-M 惡性黑色素瘤03.02.87-08.04.8715 1 較小的部分反應(yīng)26個月穩(wěn)定期后無改變18Simon-13犬-M良性前列腺增生 04.02.87-08.31.8710 1 較小的部分反應(yīng)表41(續(xù))表5-5 治療患惡性新生物動物結(jié)果的總結(jié)號碼 姓名-年齡 種屬-性別 診斷起止時間 注射次數(shù) 外科手術(shù)次數(shù) 結(jié)果19 Tequila-14 犬-F/s 惡性小腸腺癌 11.24.89-08.09.90 35 1較小的部分反應(yīng)無痛苦死于90年8月9日20 Sheba-12犬-F/s 侵入性骨肉瘤 12.06.89-06.28.90 25 1初始較小的部分反顱骨 應(yīng)然后病情進(jìn)行性發(fā)展無痛苦死亡21 Mesha-14貓-F/s 骨肉瘤02.07.89-05.06.89 13 2截肢反完全應(yīng)1年無復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移臨床結(jié)果總結(jié)于下文六只動物(3/10狗和3/11貓)有完全反應(yīng)。一只動物(1/11貓)有初始的主要部分反應(yīng)。11只動物(5/10狗及6/11貓)有較小的部分反應(yīng)。1只動物(1/10狗)保持穩(wěn)定，1只動物(1/11貓)無反應(yīng)。表42提供了每個治療反應(yīng)的定義。在動物身上獲得的臨床經(jīng)驗(yàn)提示組合物在治療惡性新生物中有潛在的作用。
表42治療反應(yīng)的定義反應(yīng)定義完全反應(yīng) 活動腫瘤的所有臨床證據(jù)全部消失。病者必須由獨(dú)立的、不少于四周的兩項觀察確定無所有已知疾病。部分反應(yīng)主要的 所有可測出腫瘤的垂直大小乘積之和應(yīng)減小50％以上，其它部位無新病變出現(xiàn)。較小的 所有可測出腫瘤的垂直大小乘積之和應(yīng)減小25-50％；或主觀反應(yīng)如活動狀態(tài)、食欲及健康的感受的改善；或超聲、X線下所見腫瘤壞死或消散或腫瘤致密性及特征的改變提示其粘附性降低及腫瘤移動性增加。病情穩(wěn)定 一個或多個可測出病變的大小增加或減少小于2％，無腫瘤消散、或新的病變出現(xiàn)。病情進(jìn)行性發(fā)展一個或多個可測出的病變大小增加25％，而無腫瘤消散或新病變出現(xiàn)。
實(shí)施例19預(yù)臨床試驗(yàn)對患不可治療的腫瘤的病人用按實(shí)施例1的方法制得之本發(fā)明組合物每公斤0.11ml進(jìn)行治療，每3-5天肌肉內(nèi)給予組合物。在58例治療的病人中無明顯的毒性。在37例可評價的病人中，有3例病人有較小的反應(yīng)，即腫瘤縮小25-50％，有5例病人在此期間病情至少穩(wěn)定8周。最有趣的結(jié)果是在似乎具有最令人鼓舞結(jié)果的胰腺疾病病人中。在7例病人中，1例病情穩(wěn)定了整整11個月。1例極晚期病情的病人病情穩(wěn)定了4個月。正是基于這些結(jié)果才選擇胰腺癌進(jìn)行本發(fā)明組合物的基礎(chǔ)研究。研究的目的是確定組合物在此組病人中的安全性和有效性。
治療包括將本發(fā)明組合物以0.11ml/kg(最小量為7.5ml)劑量一次深部肌內(nèi)注射至臂大肌。在第一周，病人一周接受三次治療，然后一周兩次，直至病情進(jìn)行性發(fā)展。總的來講，有22例病人參與該實(shí)驗(yàn)，且全部可進(jìn)行安全性評價。僅17例病人可進(jìn)行藥效評價。在總計570/次注射中，均無任何局部或全身性毒性的報道。也無任何客觀的反應(yīng)。然而有6例病人病情穩(wěn)定三個月或更長，但其余的病人在頭三個月中病情進(jìn)行性發(fā)展。中值存活期自診斷之日算起為8個月。自首次注射算起，中值存活期為4個月。有3例病人病情穩(wěn)定期超過6個月。一例75歲的病人于自在生活18個月后有肝轉(zhuǎn)移的復(fù)發(fā)。在病情進(jìn)行性發(fā)展之前，他渡過了用組合物后病情絕對穩(wěn)定的8個月。一位患未切除腫瘤疾病的71歲老年婦女至少穩(wěn)定了10個月，且繼續(xù)滿負(fù)荷工作。一位經(jīng)過用藥過程4個月后有局部復(fù)發(fā)的64歲婦女穩(wěn)定了至少8個月。
第四位患不能行手術(shù)的胰腺癌且由于不能獲得組織進(jìn)行病理學(xué)診斷而不能收入本實(shí)驗(yàn)中的病人穩(wěn)定了幾乎一年，盡管雖然應(yīng)用了大劑量組合物，其腫瘤仍進(jìn)行性發(fā)展。總之，組合物在所計劃的劑量范圍內(nèi)，無針對胰腺癌的毒性位點(diǎn)。這提示用組合物在少數(shù)患該種疾病的病人中有短暫的抗增殖活性。
實(shí)施例20胰腺癌臨床研究對患可測出的、經(jīng)活檢證明的胰腺癌的病人進(jìn)行本發(fā)明組合物的II期臨床試驗(yàn)。組合物以肌肉注射7.5ml(0.11ml/kg)，每周三次注射一周，然后每周兩次注射至病情進(jìn)行性發(fā)展。下文描述了試驗(yàn)的詳細(xì)情況。方法治療包括按實(shí)施例1制備組合物，以0.11ml/kg(最小劑量7.5ml)劑量單次深部肌內(nèi)注射至臂大肌，每次注射更換至另一例臂部進(jìn)行注射。在頭一周病人接受3次注射，然后每周兩次注射直至腫瘤進(jìn)行性發(fā)展。
用標(biāo)準(zhǔn)的準(zhǔn)則定義反應(yīng)(Miller et al.，Cancer，1981；47207-214)。完全反應(yīng)(CR)定義為疾病的所有證據(jù)消失至少四周。部分反應(yīng)(PR)定義為最大可測出的病變其兩個最大垂直直徑乘積減少大于50％，無新的病變或無任何病變的進(jìn)行性發(fā)展至少4周。病情進(jìn)行性發(fā)展定義為一個或多個可測出病變的大小有25％或更大的增加，或有新的病變出現(xiàn)。將不符合反應(yīng)或病情進(jìn)行性進(jìn)展標(biāo)準(zhǔn)的疾病病情定義為疾病穩(wěn)定。結(jié)果試驗(yàn)共有22例病人參加，但有5例病人被認(rèn)為不能用于評價藥效。無完全或部分反應(yīng)。3例病人在第一個月內(nèi)病情進(jìn)行性發(fā)展。有6例病人病情穩(wěn)定超過3個月(3.5，3.5，5.8.12+，14+)。整個試驗(yàn)組的中值存活期自診斷之日算起為8個月，自治療之日算起為5個月。1例患經(jīng)活檢證實(shí)的肝轉(zhuǎn)移及CEA為37ng/ml(正常值＜3ng/ml)的病人其肝轉(zhuǎn)移及CEA絕對穩(wěn)定了8個月。1例病情穩(wěn)定5個月。一例病人在Whipple手術(shù)后4個月時其胰腺病有復(fù)發(fā)，且在用組合物后穩(wěn)定了至少1年，只是CEA緩慢升高。第3例病人體內(nèi)經(jīng)皮插入了斯坦特印模并全負(fù)荷工作了至少14個月，而無腫瘤進(jìn)行性發(fā)展的征象。
所有22例病人均進(jìn)行毒性評價，這些病人共接受了500多次注射。無人出現(xiàn)任何與藥物相關(guān)的毒性臨床或?qū)嶒?yàn)室征象。對平行于疾病活動能力的生活質(zhì)量的沒有有害影響?？偘准?xì)胞計數(shù)，絕對淋巴細(xì)胞計數(shù)及血清免疫球蛋白未見顯著變化。
代表自診斷及治療開始時起的生存期的生存曲線分別示于圖13和14中。為了比較，將Gudjonsson(1987)的歷史生存曲線置于圖13之上。另一可比較的歷史生存曲線的例子可見于Bakkevold，Petterson，Arnesjo和Espenhaug(1990)。
存活分析的結(jié)果總結(jié)于表43中。自診斷之日起的平均存活期為281天(圖13)。中值存活期為182天(約5個月)。為了進(jìn)行比較，Gudjonsson(1987)報告其188例外科病人的平均存活期為208天，中值存活期為120天。自治療開始時起的平均存活期為166天(圖14)。中值存活期為133天(約4個月又一周)。
表43方案CO2-104存活期估計值存活期 病人數(shù) 平均存活期標(biāo)準(zhǔn)差中值存活期(天) (天)自診斷方案CO2-104 281 203182之日起病人方案CO2-104 304 157219可評價病人自治療開 方案CO2-104 166 135133始時起病人方案CO2-104 220 132146可評價病人在每個至少接受了13次注射的可評價病人的亞組中也估計了其存活期。22個病人中有14例可進(jìn)行評估。這些病人中(表43)，自診斷時的中值存活期為219天(約7個月又1周)。自治療開始時的中值存活期為146天(約5個月)。
實(shí)施例21有關(guān)惡性黑色素瘤的臨床試驗(yàn)將晚期惡性黑色素瘤定義為包括所有III期及IV期病人以及所有在初次治療后發(fā)生了局域或遠(yuǎn)處復(fù)發(fā)的病人。所有其它治療均由其判別的標(biāo)準(zhǔn)治療為DTIC(dacarbazine)，它所報告的反應(yīng)率為約15％。中值反應(yīng)期為3-6月，并隨之有嚴(yán)重的惡心及嘔吐，且有由肝靜脈栓塞引起急性肝壞死的致死性副作用。該治療不能顯示出確定的生存優(yōu)勢。
本項試驗(yàn)是為了在用于患晚期惡性黑色素瘤時確定本發(fā)明組合物的安全性及有效性并確定其對生存期及生活質(zhì)量的影響。本試驗(yàn)是非對照性的，多中心的試驗(yàn)。
對病人應(yīng)用了初始計劃劑量為7.5ml的本發(fā)明組合物進(jìn)行肌內(nèi)注射，每周3次。在未觀察到器官或骨髓毒性后，給藥計劃增加至每天注射，注射15天，然后維持每周三次注射。隨后施用劑量增加至30天。治療期為36周，然后降至16周，之后病人選擇進(jìn)入一連續(xù)方案。
受試者包括了患惡性黑色素瘤的33位病人(17人為女性，16人為男性)，年齡從17歲至85歲。64％以前接受過治療，36％未接受過治療。在試驗(yàn)的33例病人中，有25例為可評價的。Karnofsky行為狀態(tài)(基礎(chǔ)值)為40-100％，中值80％。試驗(yàn)期末期有11位病人存活，其中5例在治療中。
在16/33病人中(48％)觀察到較小的部分反應(yīng)，1例病人肺部腫瘤減小33％，6例病人疼痛減輕，8例病人在超過一個月的時間內(nèi)體重增加1000克以上(從1000-2600克)。在19/33(58％)的病人中觀察到穩(wěn)定狀態(tài)(60-170天，中值77天)。
圖15、16和17顯示以本發(fā)明組合物治療的病人的存活期，它是與歷史對照值比較的并測為自轉(zhuǎn)移/復(fù)發(fā)診斷時起的存活期(以天計算)。實(shí)線代表了用本發(fā)明組合物治療的病人的存活曲線，虛線代表歷史存活曲線(Balch，C.M.et al.，Cutaneous Melanoma，2nd，ed.1992，Chps，14 and 39，pp，165-187 & 499-508，Lippincott Co.，Philadephia，Penn)。圖15顯示了用本發(fā)明組合物治療的所有病人(包括有一至三處以上部位的腫瘤的病人)的存活期。圖16和17分別顯示了患兩處部位腫瘤及患三處和三處以上部位腫瘤病人的存活期。
用本發(fā)明組合物治療的所有病人這一組一年存活率為39％(Kaplan-Meier估計法)。所有患晚期惡性黑色素瘤(AMM)病人歷史對照的一年存活率為約11％(腫瘤部位的數(shù)目與本研究中病人之腫瘤部位數(shù)具有可比性)。這組病人的中值存活期為315天，而歷史對照的中值存活期為89天。
用本發(fā)明組合物治療的患兩處腫瘤病人的一年存活率為49％，而歷史對照的一年存活率為13％。該組的中值存活期為360天，而歷史對照的中值存活期則為120天。用本發(fā)明組合物治療的患三處及三處以上腫瘤病人的一年存活率為31％，而歷史對照的一年存活率為0％。有三處及三處以上腫瘤病人的中值存活期為205天，而歷史對照的中值存活期為60天。
用體重增加、行為狀態(tài)(Karnofsky)、生活質(zhì)量指數(shù)(Spitzer)及疼痛分級表(Linear Analogue)評定生活質(zhì)量。體重增加隨時間變化的情況示于表44。
表44病人數(shù)/可第1個 第2個 第3個 第4個 第5個 第6個評價病人數(shù)月 月 月 月 月 月11/25 12/25 4/254/251/25 1/25百分比(％)44％48％16％16％4％4％范圍 100-200-100-100-(克) 2400600010002000平均值900 1480525 775 1002000(克)Karnofsky及Spitzer分級表均為主觀性的及在各病人中這兩項基本一致。15例病人在這些指標(biāo)方面無變化。4例病人有波動，后來復(fù)歸以前的水平。1例病人下降(從40％至20％)。
疼痛評價的結(jié)果顯示在第四周有6例疼痛從5(可能最差)降至2(輕度)或0(無疼痛)。1例病人疼痛從3降至0，1例患肝轉(zhuǎn)移的病人疼痛降至0并穩(wěn)定了11個月。9例進(jìn)入試驗(yàn)時為0級疼痛的病人在整個試驗(yàn)中維持了0級疼痛。5例病人有輕度(2個單位)的疼痛增加。3例病人在第2或第3個月期間有短暫的疼痛增加(1至2個單位)。
在對33個病人施用的1734次注射中，21例病人無不良藥物反應(yīng)。12例病人中報道了14次不良藥物反應(yīng)。不良藥物反應(yīng)通常發(fā)生于第4至第8周，且為中度至短暫的，最經(jīng)常出現(xiàn)的是低燒。
歷史對照組與用本發(fā)明組合物治療的方案組間存活期的差異提示用本發(fā)明組合物治療病人會有提高存活期的益處。19例病人的癌癥似乎穩(wěn)定。所有AMM治療的病人均包括在存活期數(shù)據(jù)中。也包括了21例以前曾進(jìn)行治療的病人(許多臨床試驗(yàn)要求未經(jīng)治療的病人，因?yàn)橐郧笆〉闹委煵∪祟A(yù)后很差)。腫瘤數(shù)目很高(82％有多于一處的轉(zhuǎn)移灶)。
存活期及生活質(zhì)量的數(shù)據(jù)提示大多數(shù)病人從治療中得到了某些益處。在試驗(yàn)終末時仍有11位病人存活，且其中5例繼續(xù)進(jìn)行治療。
實(shí)施例22惡性黑色素瘤的病理學(xué)檢查方案下文是對一例患硬腭和牙床進(jìn)行性發(fā)展的惡性黑色素瘤的73歲老年婦女的報告。圖25顯示顯微鏡下所見惡性黑色素瘤的兩幅面面。圖25a中，從上往下看，可以見到伴有角蛋白的上皮層，在此層下方惡性細(xì)胞開始變得更明顯。所見這些黑色素瘤細(xì)胞為圓形或卵圓形，含豐富的嗜曙紅性胞漿及多形性深色染色質(zhì)的胞核。這些細(xì)胞取代了正常的粘膜下組織。所見的血管顯示正常且缺少如由白細(xì)胞(多形核及單核細(xì)胞)出現(xiàn)所代表的任何類型的炎癥/免疫反應(yīng)。這是生長旺盛的腫瘤組織即腫瘤組織結(jié)構(gòu)完整的實(shí)例。，圖25(b)中顯示了以本發(fā)明組合物已治療2個月病人的腫瘤組織樣本。自上而下可看到上皮的連續(xù)性被壞死組織破壞。該壞死組織(生長至相當(dāng)大體積的任何腫瘤中心部位常見)在邊緣罕見，尤其是在惡性黑色素瘤的邊緣，且它是宿主免疫反應(yīng)正對腫瘤發(fā)起攻擊的跡象。在整個照片中為大量的不同于原始腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞。這些細(xì)胞為免疫細(xì)胞-中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞，這些細(xì)胞造成了典型的腫瘤組織結(jié)構(gòu)的破壞。血管壁已被大量的宿主免疫細(xì)胞(箭頭)密集的侵入。這種細(xì)胞性侵入隨后將導(dǎo)致血管的破壞，這反過來防止了腫瘤接受其養(yǎng)分及氧氣的供應(yīng)(缺血性壞死)。這一在該病人組織切片中所見的造成腫瘤破壞的免疫反應(yīng)與已報道的由TNF(腫瘤壞死因子)引起的改變一致，也與在以前的實(shí)施例中描述的試驗(yàn)結(jié)果一致。
用組合物治療后病人的組織切片(圖25b)中顯示的免疫反應(yīng)由組合物將體外TNF免疫調(diào)節(jié)作用與在體內(nèi)抗腫瘤TNF效應(yīng)中之所知密切聯(lián)系起來。
由前文所述，可以認(rèn)為盡管在此為說明目的描述了本發(fā)明的特殊實(shí)施方案，但在不偏離本發(fā)明精神和范圍的情況下進(jìn)行多種修改。因此，除被權(quán)利要求限制外，本發(fā)明并未被限制。
實(shí)施例23活性級分的分離將300ml本發(fā)明組合物樣品在浴溫不超過40℃的rotovap上蒸干。為了保證在蒸發(fā)期間溶液為堿性，每半小時向組合物中加入5滴濃縮的氫氧化銨溶液直至蒸發(fā)完成。所產(chǎn)生的殘余物重11.6克。
然后向2克上述殘余物中加入溶于甲醇溶液中的10％濃縮氫氧化銨20ml。將不溶物濾除，將濾液通過5cm×12.5cm柱中的101.93克60?？焖?flash)硅膠進(jìn)行層析。所用的溶劑系統(tǒng)與溶于甲醇溶液中的10％濃縮氫氧化銨。于10p.s.i的壓力下及以11ml/min的流速進(jìn)行過柱。在有100ml溶劑流出層析柱后，收集12個20ml級分。這些級分的收集與快速向柱下端移動的米色條帶的出現(xiàn)相互關(guān)聯(lián)。
在浸入溶于甲醇的10％濃縮氫氧化銨溶液中的硅膠板上進(jìn)行這些級分的薄層層析(TLC)，用茚三酮噴霧進(jìn)行識別。將具有相似TLC圖的級分混合產(chǎn)生了下列級分混合物，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上將其干燥。
級分 獲得級分的過柱體積產(chǎn)量(克)1-4 100-180 05-6 180-2200.11757-8 220-2600.19699-10 260-3000.015111-12300-3400.0053級分5-6、7-8和9-10與茚三酮有陽性反應(yīng)，Rf值為0.81。
實(shí)施例24在體外檢測由實(shí)施例23所得的級分5-6和9-10的抗增殖效應(yīng)(按實(shí)施例4的方法)及TNF刺激作用(按實(shí)施例9的方法)。結(jié)果顯示如下級分測定 活性5-6 抗增殖效應(yīng)11.57單位/mg5-6 TNF刺激作用-LPS 50pg/mg9-10 抗增殖效應(yīng)2.6單位/mg9-10TNF刺激作用-LPS 1814pg/mg
因此，級分5-6具有抗增殖作用，級分9-10為特別有活性的TNF刺激劑，且有輕度活性的抗增殖作用。
實(shí)施例25用電子撞擊質(zhì)譜(EI MS)和電子噴射質(zhì)譜分析級分5-6樣本以鑒別級分中可能出現(xiàn)的特異的成分。電子噴射MS用溶于水中的5％乙酸作溶質(zhì)，在Perkin-Elmer Sciex API-III分光計上進(jìn)行。在某些情況下，加入甲醇以助溶。在用甘油作基質(zhì)的VG Analyticalmodel ZAB-SE分光計上進(jìn)行用直接插入探針的EI MS，且在KratosAnalytical Profile質(zhì)譜儀上用DCI探針。
所得的光譜回顧顯示下列化合物可能存在于級分5-6中膽堿磷酸、?；悄懰帷⒛憠A-硬脂酸甘油二酯、硬脂酸、硬脂酸甘油二酯、棕櫚酸-硬脂酸甘油二酯和鞘氨醇-油酸軛合物。
實(shí)施例26用4ml 1N HCl溶液將100ml組合物酸化以使其pH等于3。然后用3個100ml的HPLC級的二氯甲烷將組合物提取。然后將二氯甲烷級分混合并在小量的無水硫酸鈉上干燥。再將二氯甲烷溶液用紙過濾至圓底燒瓶中并于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上蒸發(fā)干燥產(chǎn)生0.0049克的一棕色薄層。
將0.0017克此薄層溶于214ppm NH3·H2O溶液中，pH7，且如實(shí)施例4篩選抗增殖活性。該篩選提示此溶液是具有活性的抗增殖劑，其活性為14單位/mg。
實(shí)施例27如下文，更大規(guī)模地重復(fù)實(shí)施例23。向900ml組合物中加入10ml濃縮的氫氧化銨溶液，且在浴溫不超過40℃的旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中將所得溶液蒸發(fā)干燥。為保證蒸發(fā)期間溶液呈堿性，每半小時向組合物中加入5滴濃縮的氫氧化銨溶液，直至蒸發(fā)完成，產(chǎn)生殘留物。
然后向全部殘留物中加入150ml溶于甲醇的10％濃縮氫氧化銨。將溶液超聲處理15分鐘并濾除不溶物。將濾液通過30cm×12cm柱中的1695克60?？焖?flash)硅膠進(jìn)行層析。所用溶劑系統(tǒng)為溶于甲醇溶液中的10％濃縮氫氧化銨，于6p.s.i的壓力下及以30ml/min流速進(jìn)行過柱。過柱的結(jié)果總結(jié)于下表級分號每一級分的體積外觀(ml)1 550 無色2 450 無色3 400 無色4 150 無色5 100 無色6-7 75無色8-13 50無色1450 褐色溶液開始流出15-35 50 褐色溶液36-40 50無色于浸于10％濃縮氫氧化銨溶液中的硅膠板上進(jìn)行TLC，并以茚三酮噴霧進(jìn)行識別。將具有相似TLC圖的級分混合產(chǎn)生了下列級分混合物，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上將其干燥。級分號獲得級分的過柱體積 產(chǎn)量(克)備注3 1000-1400 0.0504白色粉狀固體4-51400-1650 0.0855白色粉狀固體6-81650-1850 0.1555白色粉狀固體9-12 1850-2050 0.3014白色粉狀固體13-14 2050-2150 0.3595白色粉狀固體15-16 2150-2250 0.6914淺棕色-固體發(fā)粘17-18 2250-2350 1.0284褐色-固體呈塊狀19 2350-2400 0.3432褐色-固體呈塊狀20-23 2400-2600 1.1531棕色-固體呈塊狀24-30 2600-2950 0.8517棕色-固體呈塊狀31-34 2950-3150 0.0813棕色油狀從15-16至級分31-34的所有級分混合物與茚三酮均有陽性反應(yīng)Rf值為0.87，該值非常近似于實(shí)施例23的活性級分的Rf值。級分24-30及31-34與茚三酮有另一陽性反應(yīng)Rf值為0.85。
實(shí)施例28于體外檢測了級分4-5、15-16和17-18的抗增殖效應(yīng)(與實(shí)施例4一樣)和TNF刺激作用(與實(shí)施例9一樣)。結(jié)果示于下文級分檢測 活性4-5 抗增殖效應(yīng)4.7單位/mg4-5 TNF刺激作用 -15-16 抗增殖效應(yīng)4.5單位/mg15-16 TNF刺激作用 -17-18 抗增殖效應(yīng)3.9單位/mg17-18 TNF刺激作用 -
因此，級分4-5、15-16和17-18顯示了抗增殖活性，但無TNF刺激作用活性。上述級分的初步分析顯示其在NH4Cl中較高，抑制了TNF產(chǎn)生。
實(shí)施例29將級分15-16和24-30的樣本透析，然后進(jìn)行質(zhì)譜分析，用實(shí)施例25中描述的方法。級分17-18和24-30的未透析樣本也進(jìn)行分析。對所產(chǎn)生光譜的回顧提示可能有下列化合物存在甘氨膽酸、一種三聚己糖胺三聚物(trihexosamine)和?；悄懰?級分15-16)；硬脂酸及一種己糖胺二聚物；及甘氨膽酸(級分24-30)。
實(shí)施例30按如下方法在分開的透析管中對組合物進(jìn)行透析將100ml組合物置入分子量截流大小為100的Spectra/PorC E膜管中。管的末端用夾子封住并將其置入不斷攪動的10L蒸餾水浴中。每天通過從透析管中取1ml溶液并加入3-4滴1/10N硝酸銀溶液對透析進(jìn)行監(jiān)測。氯化物的出現(xiàn)提示透析并不完全。如果透析不完全，用新鮮蒸餾水替換浴液。3-4天后透析完成。透析完后，將已透析物于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上干燥產(chǎn)生每毫升原液獲得0.3mg固體的結(jié)果。
將一份此固體物質(zhì)的樣品溶于HPLC級水中，并于浸入甲醇中10％濃縮氫氧化銨的硅胺板上進(jìn)行TLC，并用茚三酮噴霧進(jìn)行識別。于Rf為0.83處得到陽性反應(yīng)。
實(shí)施例31將一份自實(shí)施例30的固體用質(zhì)譜進(jìn)行分析，按實(shí)施例25中所描述的方法進(jìn)行。對所得結(jié)果的回顧提示可能存在下列化合物鞘氨醇-油酸軛合物、二乙酰唾液酸、巖藻糖己糖胺二聚物、脫氧甘氨膽酸、牛磺膽酸、唾液酸-巖藻糖二聚物及一種二(巖藻酸)己糖胺三聚物。
實(shí)施例32以前的結(jié)果提示組合物的成分(至少是根據(jù)TNFα釋放測定)在C18μBondapack柱上的反相高效液相層析(RP-HPLC)后是在未結(jié)合級分(空隙體積)中存在的。且上柱于C18μBondapack柱上之組合物提取物的大部分(質(zhì)量的70％)在空隙體積中洗脫出。這些結(jié)果提示組合物的活性成分很可能具有很高的極性或雙離子性分子。
為進(jìn)一步檢查以上結(jié)果，通過離子交換層析對活性成分進(jìn)行純化。如果存在帶負(fù)電的活性成分(由其對腫瘤細(xì)胞而不是正常細(xì)胞的抗增殖效應(yīng)以及其引起TNFα釋放的活性測定)，它們將會結(jié)合到陰離子交換樹脂上。實(shí)驗(yàn)方法將10ml Virulizin提取物上柱于陰離子交換層析柱(Bio-RadAG-1，氫氧化物形式，總樹脂濕體積為10ml，柱的大小為1.5cm6.0cm，以Millipore去離子水平衡)上。計算所用樹脂的體積足以將提取物上所有陰離子結(jié)合。收集未結(jié)合的級分并再次上柱以最大程度地結(jié)合至樹脂上。收集第二次流水的未結(jié)合級分并貯存。通過用去離子水(2×20ml)沖洗去除殘留于層析柱空隙體積中的任何未結(jié)合物。用梯度NH4HCO3(20ml//每段)洗脫結(jié)合的分子。洗脫步驟為 0 M0.1M0.2M0.3M0.4M0.5M0.6M1.0M1.5M實(shí)施例33分別按實(shí)施例4和9的方法，分析實(shí)施例32的所有級分樣品的抗增殖活性和TNF刺激活性。
結(jié)果顯示于下文樣品 抗增殖活性引起TNFα釋放的活性-LPS(U/mg) (pg/ml)0 M 0 350.1M 0 -790.2M 0 -760.3M 00.4M 2.50.5M 555.60.6M 0 1071.0M 0 1051.5M 0 189活性測定的結(jié)果顯示于0.6M、1.0M、1.5M級發(fā)中發(fā)現(xiàn)了TNF產(chǎn)生刺激活性?？乖鲋郴钚栽诩壏?.4M(較小活性)和0.5M(較大活性)中存在。
實(shí)施例34對活性級分的薄層層析分析顯示了幾種成分的混合。按實(shí)施例25的質(zhì)譜方法分析來自實(shí)施例32的1.0M級分的樣品。對所產(chǎn)生的光譜進(jìn)行的回顧提示可能有下列化合物唾液酸-甘油二聚物，硫酸膽甾醇和?；悄懰?。
實(shí)施例35按實(shí)施例2的方法對組合物樣品進(jìn)行反相(C18)HPLC分析，方法中有以下改動(1)應(yīng)用了Phenomenex WP 60009-C18柱，250×4.6mm，(2)樣品凍干，然后重新配于溶于水的0.1％三氟乙酸(TFA)中，(3)將重新配成的樣品150μl上柱。
收集洗脫液的不同級分，包括在將重新配成的樣品上樣后約2.40-3.40分鐘時洗脫出的一份級分。
實(shí)施例36按照實(shí)施例9的方法對實(shí)施例35中于約2.40-3.40分鐘時洗脫出的級分樣品進(jìn)行了三次TNF刺激活性的分析。所得結(jié)果如下測定號TNF刺激作用-LPS1 259pg/ml±107pg/ml2 311pg/ml±14pg/ml3 572pg/ml±176pg/ml實(shí)施例37如下文，將實(shí)施例35中于約2.40-3.40分鐘時洗脫出的級分樣品進(jìn)行串聯(lián)柱反相(C18)HPLC。將實(shí)施例35的層析柱與Phenomenexprime-sphere HC-C18柱串聯(lián)，該柱為250×4.6mm。將樣品凍干，然后重配于溶于水的0.1％TFA(緩沖液A)，再將150μl重配的樣本加于柱上。用緩沖液A操作20分鐘，然后用溶于乙腈的0.1％TFA(緩沖液B)之0-80％線性梯度操作35分鐘。此期末期時，用80-0％緩沖液B操作5分鐘。流速為0.9ml/min。在下述自注射時起大約的時間時收集6個洗脫級分。
級分號 時間(分鐘)1 5.6-6.252 6.25-6.63 6.6-7.14 7.1-8.25 8.8-9.66 14.7-16實(shí)施例38將實(shí)施例37的級分1樣品(“1”)和級分2樣品(“2”)凍干并重新配制于214ppm NH3·H2O。然后按實(shí)施例4的方法分析這些樣品的抗增殖作用。所得結(jié)果如下樣品 抗增殖作用1 17.8單位/ml2 0實(shí)施例40按實(shí)施例25的質(zhì)譜法分析實(shí)施例37的6個級分樣品。對這6個級分分析的光譜結(jié)果提示可能存在下列化合物牛磺膽酸、唾液酸-甘油二聚物、NaCl、三甲胺、甲基乙胺以及丙胺。
實(shí)施例41按實(shí)施例4的方法，對下列三個樣品進(jìn)行了抗增殖作用的檢測(1)溶于2.0ml水的10-11mg?；悄懰?，(2)214ppm NH3·H2O；及(3)溶于4.0ml 214ppm NH3·H2O中的0.7mg?；悄懰帷颖?1)和樣本(2)均沒有任何可測出的抗增殖作用。然而樣本(3)有14單位/mg的抗增殖作用。
結(jié)果提示膽酸(如牛磺膽酸)與銨離子聯(lián)合可在低于單獨(dú)檢測時各成分不顯示出活性的濃度情況下顯示出抗增殖活性。因此，將這兩種成分聯(lián)合起來可明顯地協(xié)同影響抗增殖活性。
權(quán)利要求
1.一種用作免疫調(diào)節(jié)劑的組合物，含有分子量小于3000Da的成分，并且具有下列特性a.可從動物的膽汁中提取；b.能夠在體外刺激單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞；c.能夠調(diào)節(jié)腫瘤壞死因子的產(chǎn)生；d.含有不可測水平的IL-1α、IL-1β、TNF、IL-6、IL-8、IL-4、GM-CSF或TNF-γ；e.在惡性小鼠雜交瘤細(xì)胞系中有抗增生作用；f.對人外周血單核細(xì)胞無細(xì)胞毒性；及g.不是內(nèi)毒素。
2.如權(quán)利要求1中所要求的組合物，可從牛膽汁中提取，并能刺激人外周血單核細(xì)胞釋放腫瘤壞死因子。
3.制備如權(quán)利要求1所述組合物的方法，包括(a)將動物膽汁與等體積醇混合，得到膽汁/醇溶液；(b)分離出醇溶性部分并分離基本上不含醇的溶液；(c)從溶液中除去膽汁色素，得到無色液體；(d)處理無色液體以基本除去任何殘留的醇；(e)用醚提取無色液體；分離水相和(f)從水相中除去殘留的醚。
4.如權(quán)利要求3所要求的方法，其中在步驟(e)之前將無色液體濃縮至膽汁/醇溶液體積的大約1/8，在步驟(f)之后將水相濃縮，使之為膽汁/乙醇溶液體積的1/10。
5.用于預(yù)防和治療需要調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答之疾病和病理狀態(tài)的藥物組合物，含有如權(quán)利要求1所述的組合物和任意選擇的一種藥用可接受的稀釋劑或載體。
6.如權(quán)利要求5所要求的藥物組合物，用于預(yù)防和治療需要刺激免疫應(yīng)答之疾病和病理狀態(tài)。
7.如權(quán)利要求5所要求的藥物組合物，用于治療感染性疾病和腫瘤。
8.刺激病人免疫系統(tǒng)的方法，包括給所述病人施用有效量的權(quán)利要求1的組合物。
9.權(quán)利要求1所要求的組合物在預(yù)防和治療需要調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答之疾病和病理狀態(tài)中的應(yīng)用。
10.制備免疫調(diào)節(jié)劑組合物的方法，包括(a)將動物膽汁與水溶性溶劑混合，得到膽汁/溶劑溶液；(b)從膽汁/溶劑溶液中分離基本上不含溶劑的水溶液；(c)從基本上不含溶劑的溶液中除去膽汁色素，得到無色液體。
11.如權(quán)利要求10的方法，其中的水溶性溶劑是醇
12.如權(quán)利要求11的方法，其中的動物膽汁與等體積醇混合。
13.權(quán)利要求10的方法，進(jìn)一步包括將無色液體濃縮至膽汁/溶劑溶液原始體積的大約1/8。
14.權(quán)利要求10的方法，進(jìn)一步包括將無色液體濃縮至膽汁/溶劑溶液原始體積的大約1/10。
15.用作免疫調(diào)節(jié)劑的組合物，含有至少一種分子量小于約3000Da的成分，對人外周血單核細(xì)胞沒有細(xì)胞毒性，并且至少具有下列特性之一(a)能夠在體外刺激單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞產(chǎn)生一種或多種細(xì)胞因子；(b)能夠在體外或體內(nèi)刺激單核細(xì)胞或巨噬細(xì)胞產(chǎn)生腫瘤壞死因子；或(c)在惡生小鼠雜交瘤細(xì)胞系中有抗增生作用；并且，其中所述成分不是內(nèi)毒素IL-1α、IL-1β、TNF、IL-4、IL-6、IL-8、GM-CSF或TNF-γ；
16.權(quán)利要求15的組合物，其中的組合物從動物膽汁中提取。
17.權(quán)利要求16的組合物，其中的組合物從牛膽汁中提取。
18.權(quán)利要求15的組合物，其中的組合物在不存在IL-1α、IL-1β、TNF、IL-4、IL-6、IL-8、GM-CSF和TNF-γ的條件下可于體外或體內(nèi)刺激腫瘤壞死因子的產(chǎn)生。
19.權(quán)利要求18的組合物，其中的組合物能夠在人體中刺激腫瘤壞死因子的產(chǎn)生。
20.權(quán)利要求15的組合物，其中當(dāng)所述組合物被干燥，獲得固體殘留物，并且將2克所述殘留物溶于20ml以甲醇為溶劑的10％濃縮氫氧化銨溶液中，并在除去任何不溶物后，將其在甲醇柱中進(jìn)行柱層析，該柱為5cm×12.5cm，含有102克的60A快速硅膠，并以10磅/英寸2的壓力及11ml/分的流速用溶于甲醇中的10％濃縮氫氧化銨溶液進(jìn)行層析操作，當(dāng)總的層析柱洗脫液的體積達(dá)到約180-220ml，220-260ml或260-300ml之間時，所述成分從層析柱中以一個級分洗脫出來。
21.權(quán)利要求15的組合物，其中當(dāng)10ml所述組合物在含有Bio-Rad AG-1氫氧化物形式樹脂的柱中進(jìn)行陰離子交換層析，且所述樹脂的量足以基本上結(jié)合所述10ml組合物中存在的所有陰離子時，所述的成分被用緩沖液濃度為約0.5-1.5M的碳酸氫銨緩沖液的階式梯度從柱中洗脫出。
22.權(quán)利要求21的組合物，其中所述的成分在大約1.0-1.5M的緩沖液濃度從柱中洗脫出。
23.權(quán)利要求22的組合物，其中所述的成分在大約1.5M的緩沖液濃度從柱中洗脫出。
24.權(quán)利要求15的組合物，其中當(dāng)所述組合物被凍干并在以水為溶劑的0.1％TFA中重新配制，然后在Phenomenex WP60009-C18柱中進(jìn)行反相(C18)HPLC，該柱大小為250×4.6mm，其中溶于水中的0.1％TFA第一緩沖液過柱約10分鐘，然后是溶于乙腈中的0.1％TFA第二緩沖液的0-80％線性梯度過柱約55分鐘，繼而第二緩沖液的80％溶液過柱約5分鐘，第二緩沖液的80％-0％的梯度過柱約5分鐘，其中的流速為1ml/分，柱及緩沖液體積均不過量，在所述重配組合物上柱后，所述成分在約2.4-3.4分鐘從柱中洗脫出。
25.權(quán)利要求15的組合物，其中所述的組合物在溶于水中的0.1％TFA第一緩沖液透析，然后在250×4.6mm Bio-Rad Hi-PoreRP 318(C18)柱中進(jìn)行反相(C18)HPLC，其中第一緩沖液過柱約10分鐘，然后溶于乙腈中的0.1％TFA第二緩沖液的0-80％線性梯度過柱約55分鐘，繼而第二緩沖液的80％溶液過柱約5分鐘，第二緩沖液的80％-0％的梯度過柱約5分鐘，其中的流速為1ml/分，柱及緩沖液體積均不過量，在所述透析過的組合物上柱后，所述成分在約2-21.4分鐘或21.4-25.6分鐘時從柱中洗脫出。
26.權(quán)利要求15的組合物，當(dāng)所述組合物在浸于以甲醇為溶劑的10％濃縮氫氧化銨中的硅膠板上進(jìn)行薄層層析并用茚三酮噴霧進(jìn)行肉眼觀察時，在Rf值約為0.80-0.90處出現(xiàn)與茚三酮的陽性反應(yīng)。
27.在人體中刺激腫瘤壞死因子產(chǎn)生的方法，包括施用有效量的，含有至少一種下列化合物的組合物(a)下列通式的化合物 其中A-B、B-C和C-D間的鍵可以是單鍵或雙鍵，且其中X＝H、OH2＝O或OSO3H；Y＝ 其中R是一個氨基酸殘基；(b)下列通式的化合物(R1O)CH2CH(OR2)CH2(OR3-X)或 其中R1、R2、R3是H、COR4、CH＝CH-R5、X、P(O)(OH)O-或S(O)2O-；X是膽堿、乙醇胺、N-烷基化乙醇胺、絲氨酸、肌醇、含游離羥基的糖、氨基糖、磺化糖或唾液酸；R4是具有約C1-C30碳鏈的飽和或不飽和烷基，或其氧化和羥基化的類似物；R5是烷基或其氧化和羥基化的類似物；(c)粘蛋白水解產(chǎn)物或蛋白多糖的水解產(chǎn)物；或(d)脂溶性維生素。
28.權(quán)利要求27的方法，其中所述的組合物含有至少一種選自下列化合物的物質(zhì)牛磺膽酸及其硫酸化衍生物；甘氨膽酸及其硫酸化衍生物；鞘氨醇；二?；视?；卵磷脂；糖單位長度小于10的寡糖，其中所述寡糖由唾液酸、巖藻糖、己糖胺或硫酸化己糖胺組成；維生素A；視黃酸(retinoic acid)衍生物；視黃醇衍生物；?；撬岷凸劝彼峒捌滠椇衔?。
29.權(quán)利要求27的方法，其中所述組合物另外還含有至少一種選自下列的化合物的物質(zhì)氨、伯烷胺、仲烷胺、叔烷胺和羧酸R6CO2H，其中R6是C1-C30烷基及其飽和或不飽和、氧化或羥基化衍生物。
30.權(quán)利要求29的方法，其中所述組合物含有至少一種選自下列化合物的物質(zhì)牛磺膽酸及其硫酸化衍生物；甘氨膽酸及其硫酸化衍生物；鞘氨醇；二酰基甘油；卵磷脂；糖單位長度小于10的寡糖，其中所述寡糖由唾液酸、巖藻糖、己糖胺或硫酸化己糖胺組成；維生素A；視黃酸衍生物；牛磺酸和谷氨酸及其軛合物。
31.用權(quán)利要求10、11、12、13或14的方法得到的組合物。
32.治療胰腺癌的方法，包括給所述癌癥患者施用治療有效量的權(quán)利要求31的組合物。
33.治療胰腺癌的方法，包括給所述癌癥患者施用治療有效量的權(quán)利要求15、20、21、24、25、27、28或29的組合物。
34.含有鞘氨醇或鹽復(fù)合的鞘氨醇之微團(tuán)的組合物，至少具有下列特性之一(a)能夠在體外刺激單核細(xì)胞或巨噬細(xì)胞產(chǎn)生一種或多種細(xì)胞因子；(b)能夠在體外或體內(nèi)刺激單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞產(chǎn)生腫瘤壞死因子；或(c)在惡性小鼠雜交瘤細(xì)胞系中有抗增生作用。
35.含有視黃酸或其衍生物之微團(tuán)的組合物，至少具有下列特性之一(a)能夠在體外刺激單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞產(chǎn)生一種或多種細(xì)胞因子；(b)能夠在體外或體內(nèi)刺激單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞產(chǎn)生腫瘤壞死因子；或(c)在惡性小鼠雜交瘤細(xì)胞系中有抗增生作用。
36.權(quán)利要求34或35的組合物，其中的微團(tuán)還含有二?；视王?diacyl glyceride)或卵磷脂。
37.權(quán)利要求34、35或36的組合物，進(jìn)一步還含有膽汁酸鹽和銨或烷基銨離子源。
38.含有鞘氨醇、膽汁酸鹽和銨或烷基銨離子源的組合物，至少具有下列特性之一(a)能夠在體外刺激單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞產(chǎn)生一種或多種細(xì)胞因子；(b)能夠在體外或體內(nèi)刺激單核細(xì)胞或巨噬細(xì)胞產(chǎn)生腫瘤壞死因子；或(c)在惡性小鼠雜交瘤細(xì)胞系中有抗增生作用。
39.含有膽汁酸鹽、鞘氨醇、二?；视?、銨或烷基銨離子源和視黃酸衍生物的組合物，至少具有下列特性之一(a)能夠在體外刺激單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞產(chǎn)生一種或多種細(xì)胞因子；(b)能夠在體外或體內(nèi)刺激單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞產(chǎn)生腫瘤壞死因子；或(c)在惡性小鼠雜交瘤細(xì)胞系中有抗增生作用。
40.含有二酰基甘油、卵磷脂和膽汁酸鹽的組合物，至少具有下列特性之一(a)能夠在體外刺激單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞產(chǎn)生一種或多種細(xì)胞因子；(b)能夠在體外或體內(nèi)刺激單核細(xì)胞或巨噬細(xì)胞產(chǎn)生腫瘤壞死因子；或(c)在惡性小鼠雜交瘤細(xì)胞系中有抗增生作用。
41.含有(1)二?；视王ァ?2)卵磷脂和(3)粘蛋白水解產(chǎn)物或蛋白多糖水解產(chǎn)物的組合物，至少具有下列特性之一(a)能夠在體外刺激單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞產(chǎn)生一種或多種細(xì)胞因子；(b)能夠在體外或體內(nèi)刺激單核細(xì)胞或巨噬細(xì)胞產(chǎn)生腫瘤壞死因子；或(c)在惡性小鼠雜交瘤細(xì)胞系中有抗增生作用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種用作免疫調(diào)節(jié)劑的組合物，含有分子量小于3000Da的成分，并且具有下列特性a.可從動物的膽汁中提??；b.能夠在體外刺激單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞；c.能夠調(diào)節(jié)腫瘤壞死因子的產(chǎn)生；d.含有不可測水平的IL-1α、IL-1β、TNF、IL-6、IL-8、IL-4、GM-CSF或TNF-γ；e.在惡性小鼠雜交瘤細(xì)胞系中有抗增生作用；f.對人外周血單核細(xì)胞無細(xì)胞毒性；和g.不是內(nèi)毒素。本發(fā)明還涉及制備該組合物的方法及其作為免疫調(diào)節(jié)劑的應(yīng)用。
文檔編號A61K31/56GK1136777SQ94194002
公開日1996年11月27日 申請日期1994年9月9日 優(yōu)先權(quán)日1993年9月9日
發(fā)明者R·蘭格 申請人:伊穆特克公司