專利名稱：降低了吸附能力以及增加了水解能力的枯草桿菌蛋白酶bpn′變體的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及用于各種清潔組合物中的新型酶變體，以及編碼所述酶變體的基因。
背景酶構(gòu)成了最大類的天然存在的蛋白質(zhì)。各類酶通常催化(使未被耗盡的反應加速進行)不同類型的化學反應。已經(jīng)知道稱為蛋白酶的一類酶具有水解(通過在被裂解化學鍵的任一側(cè)吸取水分子的H和OH而將一種化合物分裂為二種或多種較簡單化合物)其他蛋白質(zhì)的能力。通過將天然存在的和以蛋白質(zhì)工程技術制造的蛋白酶作為添加劑摻入到洗衣用去污制劑中，這種水解蛋白質(zhì)的能力已發(fā)揮了其優(yōu)點。衣服上的許多污漬是蛋白質(zhì)的并且有廣泛特異的蛋白酶能從實質(zhì)上更好地去除這些污漬。
但不幸的是，在自然的細菌環(huán)境中這些蛋白質(zhì)的效率水平通常不會轉(zhuǎn)變成相對的非天然洗滌環(huán)境。特別是，對于在酶的天然環(huán)境之外使用時并不一定能使蛋白質(zhì)特性例如熱穩(wěn)定性，pH穩(wěn)定性，氧化穩(wěn)定性以及底物特異性達到最佳化。
蛋白酶的氨基酸序列決定著該蛋白酶的特性。依據(jù)氨基酸序列變化的位置，性質(zhì)和/或量的大小，蛋白酶氨基酸序列的變化可在不同程度上改變酶的特性，或者甚至使酶失活。已采用幾種方法用于在試圖改善其特性中改變蛋白酶的野生型氨基酸序列，達到增加蛋白質(zhì)在洗滌環(huán)境中的效率。這些方法包括改變氨基酸序列以便在十分不利的條件下提高其熱穩(wěn)定性以及改善其氧化穩(wěn)定性。
盡管本領域內(nèi)描述了各種方法，但仍需要適用于清潔各種表面的新的有效的蛋白酶變體。
發(fā)明目的本發(fā)明的一個目的是提供枯草桿菌蛋白酶酶變體，相對于野生型酶該酶變體改善了水解能力。
本發(fā)明還有一個目的是提供含有這種枯草桿菌蛋白酶酶變體的清潔組合物。
發(fā)明概要本發(fā)明涉及枯草桿菌蛋白酶BPN′變體，它在特異性鑒別的位置上至少含有一、二或三個氨基酸位置上具有不同于野生型枯草桿菌蛋白酶BPN′的氨基酸(即替代)，從而與野生型枯草桿菌蛋白酶BPN′相比，所述BPN′變體增加了對不溶性底物的吸附作用，增加了水解不溶性底物的能力。本發(fā)明還涉及編碼所述枯草桿菌蛋白酶BPN′變體的基因。本發(fā)明還涉及含有所述枯草桿菌蛋白酶BPN′變體的用于清潔各種表面的組合物。
發(fā)明的描述1.枯草桿菌蛋白酶變體本發(fā)明涉及枯草桿菌蛋白酶，尤其是已通過將編碼該酶的各個核苷酸序列進行突變，從而修飾該酶的氨基酸序列所得到的經(jīng)過修飾的BPN′。與野生型枯草桿菌蛋白酶相比，本發(fā)明所述經(jīng)過修飾的枯草桿菌蛋白酶(下文中稱為“BPN′變體”)降低了對不溶性底物的吸附作用并且提高了對不溶性底物的水解作用。本發(fā)明還涉及編碼所述BPN′變體的突變基因。
本發(fā)明的枯草桿菌蛋白酶屬于稱為蛋白酶的一類酶。蛋白酶是裂解肽鍵的催化劑。一種類型的蛋白酶是絲氨酸蛋白酶。由于在活性位點存在必需的絲氨酸殘基這一事實而得以區(qū)分絲氨酸蛋白酶。
在文獻中已詳細地記載了酶水解可溶性底物的速度隨酶濃度增加而加速的研究資料。因此對于表面結(jié)合的底物例如許多清潔應用中遇到的情況而言，水解速率隨表面濃度增加而提高似乎是合情合理的。這種現(xiàn)象已得到證實(Brode，P.F.111和D.S.Rauch，LANGMUIR，“Subtilisin BPN′Activity on an Immolbilized Substrate”，Vol.8，pp.1325-1329(1992))。事實上，對于不溶性底物，當酶的表面濃度變化時，發(fā)現(xiàn)水解速率對表面濃度的線性依賴性(Rubingh，D.N.和M.D.Bauer，“Catalysis of Hydrolysis byProteases at the Protein-Solution Interface，”inPolymer Solution，Blends And Interfaces，Ed.by I.Nodaand D.N.Rubingh，Elsevier，P.464(1992))。令人驚奇的是，當應用該原則尋找有更好清潔性能的變異蛋白酶時，我們沒有發(fā)現(xiàn)具有更好吸附效能的酶。事實上，我們出人意料地確認了相反的情況酶對底物的吸附作用降低了導致了對底物之水解作用的提高(即較好的清潔性能)。
雖然不拘泥于理論，但據(jù)信當將一種變異體與另一種相比較時，改善的清潔性能是由于酶吸附較少時結(jié)合緊密程度也較小，因而在待去除之不溶性蛋白質(zhì)底物的表面上的移動性更大。在有差不多的酶溶液濃度時，這種移動性的提高足以超過任何優(yōu)點，所述優(yōu)點是因較高濃度的酶釋放到表面上而提供的。
將本文描述的突變設計為改變(即降低)酶對表面結(jié)合之污物的吸附作用。在BPN′中，第200-220位的氨基酸在酶分子上形成一個大的外部環(huán)。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)該環(huán)在酶分子對表面結(jié)合肽的吸附中起著重要作用，并且該環(huán)上特定的突變對吸附作用具有顯著的影響。雖然不拘泥于理論，但據(jù)信至少有兩種原因認為該環(huán)對于BPN′分子的吸附作用是重要的。首先，含有該外部環(huán)的氨基酸可以與暴露于該分子的表面緊密接觸。第二，該環(huán)與BPN′分子的活性位點以及結(jié)合袋接近使之在酶對表面結(jié)合之底物(肽/蛋白質(zhì)污漬)的催化生產(chǎn)性吸附中起作用。
如本文使用的，“變體”指具有不同于野生型氨基酸序列的酶。
如本文使用的，“突變BPN′基因”指編碼BPN′變體的基因。
如本文使用的，“野生型枯草桿菌蛋白酶BPN′”是指由SEQ IDNO1表示的枯草桿菌蛋白酶，該枯草桿菌蛋白酶BPN′的氨基酸序列可進一步參見Wells，J.A.，E.Ferrari，D.J.Henner，D.A.Estell和E.Y.Chen，Nucleic Acids Research，Vol.II，7911-7925(1983)的描述，該文獻引入本文作參考。
如本文使用的，術語“野生型氨基酸序列”包括SEQ ID NO1以及在除第199-220位以外的氨基酸序列上有修飾的SEQ ID N01。
如本文使用的，“更親水的氨基酸”是指其親水性大于下表中所示主題氨基酸之親水性的任何其他氨基酸。下面的親水性表(表1)列出了其親水性的增加呈遞減次序的氨基酸(參見Hopp，T.P.，以及Woods，K.R.，“Prediction of Protein AntigenicDeterminants from Amino Acid Sequences”，Proceedingsof the National Academy of Science USA，Vol.78，pp.3824-3828，1981，引入本文作參考)。
表1<

>表1還指出了攜帶電荷的氨基酸(這種特性是以pH為約8-9為基礎的)。帶正電的氨基酸是Arg和Lys，帶負電荷的氨基酸是Glu和Asp，其余的氨基酸則為中性。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施例中，替代氨基酸是中性或者帶負電的，較好的是帶負電的(即Glu或Asp)。
因此，例如“用中性或具有負電荷的同等或更親水的氨基酸替代Gln”是指用Asn(與Gln具同樣親水性)或Ser，Glu或Asp(比Gln的親水性大)替代Gln；這里用于替代的各種氨基酸都是中性或帶負電荷的；并且與Gln相比具有更大的親水性值。同樣，“用中性或具負電荷的更親水的氨基酸替代Pro”的說法是指用Gln，Asn，Ser，Glu或Asp替代Pro。
A.含有至少一個氨基酸替代的變異體在本發(fā)明的一個實施方案中，BPN′變體含有野生型氨基酸序列，其中野生型氨基酸序列在199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、218、219或220中的一個或多個位置上被替代；從而與野生型枯草桿菌蛋白酶BPN′相比該BPN′變體降低了對不溶性底物的吸附作用并且提高了水解不溶性底物的能力。具有替代氨基酸的位置較好是199、200、201、202、205、207、208、209、210、211、212或者215，更優(yōu)選的是200、201、202、205或者207位。
第199位的替代氨基酸較好是Cys、Ala、His、Thr、Pro、Gly、Gln、Asn、Ser、Asp或者Glu。
第200位的替代氨基酸較好是His、Thr、Pro、Gly、Gln、Asn、Ser、Asp或者Glu。
第201位的替代氨基酸較好是Gly、Gln、Asn、Ser、Asp或者Glu。
第202位的替代氨基酸較好是Pro、Gln、Asn、Ser、Asp或者Glu。
第203位的替代氨基酸較好是Met、Cys、His、Pro、Gly、Gln、Asn、Ser、Asp或者Glu。
替代第204位的氨基酸較好是Glu。
第205位的替代氨基酸較好是Leu、Met、Cys、Ala、His、Thr、Pro、Gly、Gln、Asn、Ser、Asp或者Glu。
第206位的替代氨基酸較好是Pro、Ash或者Ser。
第207位的替代氨基酸較好是Asp或者Glu。
第208位的替代氨基酸較好是Pro、Gly、Gln、Asn、Ser、Asp或者Glu。
第209位的替代氨基酸較好是Ile、Val、Met、Cys、Ala、His、Thr、Pro、Gly、Gln、Asn、Ser、Asp或者Glu。
第210位的替代氨基酸較好是Gly、Gln、Asn、Ser、Asp或者Glu。
第211位的替代氨基酸較好是Ala、Pro、Gln、Asn、Ser、Asp或者Glu。
第212位的替代氨基酸較好是Gln、Ser、Asp或者Glu。
第213位的替代氨基酸較好是Trp、Phe、Tyr、Leu、Ile、Val、Met、Cys、Ala、His、Pro、Gly、Gln、Asn、Ser、Asp或者Glu。
第214位的替代氨基酸較好是Phe、Leu、Ile、Val、Met、Cys、Ala、His、Pro、Gly、Gln、Asn、Asp或者Glu。
第215位的替代氨基酸較好是Thr、Pro、Gln、Asn、Ser、Asp或者Glu。
第216位的替代氨基酸較好是His、Thr、Pro、Gly、Gln、Asn、Ser、Asp或者Glu。
第218位的替代氨基酸較好是Glu。
第219位的替代氨基酸較好是Pro、Gln、Asn、Ser、Asp或者Glu。
第220位的替代氨基酸較好是Pro、Gly、Gln、Asn、Asp或者Glu。
參照表1，第199、200、201、202、202、205、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、219和220中任一位置的替代氨基酸較好是中性或者帶負電并且與野生型枯草桿菌蛋白酶BPN′的目的位的氨基酸相比具有同等或更高的親水性，較好是有更高的親水性。
第199、200、201、202、203、205、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、219和220中任一位置的替代氨基酸最好是Asp或者Glu；并且第204或218位的替代氨基酸是Glu。
B.至少含有兩個替代氨基酸的變異體在本發(fā)明的另一個實施方案中，BPN′變異體含有野生型氨基酸序列，其中所述野生型氨基酸序列在第199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219或者220位中的兩個或者多個位置被替代，從而與野生型枯草桿菌蛋白酶BPN′相比，該BPN′變體降低了對不溶性底物的吸附作用并且增加了對不溶性底物的水解作用。含有替代氨基酸的位置較好是199、200、201、202、205、207、208、209、210、211、212或者215位；更好是200、201、202、205或者207位。
199位的替代氨基酸較好是Cys、Ala、His、Thr、Pro、Gly、Gln、Asn、Ser、Asp或者Glu。
200位的替代氨基酸較好是His、Thr、Pro、Gly、Gln、Asn、Ser、Asp或者Glu。
201位的替代氨基酸較好是Gly、Gln、Asn、Ser、Asp或者Glu。
202位的替代氨基酸較好是Pro、Gln、Asn、Ser、Asp或者Glu。
203位的替代氨基酸較好是Met、Cys、Ala、His、Thr、Pro、Gly、Gln、Asn、Ser、Asp或者Glu。
204位的替代氨基酸較好是Asp或者Glu。
205位的替代氨基酸較好是Leu、Val、Met、Cys、Ala、His、Thr、Pro、Gly、Gln、Asn、Ser、Asp或者Glu。
206位的替代氨基酸較好是Pro、Asn、Ser、Asp或者Glu。
207位的替代氨基酸較好是Asp或者Glu。
208位的替代氨基酸較好是Pro、Gly、Gln、Asn、Ser、Asp或者Glu。
209位的替代氨基酸較好是Ile、Val、Met、Cys、Ala、His、Thr、Pro、Gly、Gln、Asn、Ser、Asp或者Glu。
210位的替代氨基酸較好是Ala、Gly、Gln、Asn、Ser、Asp或者Glu。
211位的替代氨基酸較好是Ala、Pro、Gln、Asn、Ser、Asp或者Glu。
212位的替代氨基酸較好是Gln、Ser、Asp或者Glu。
213位的替代氨基酸較好是Trp、Phe、Tyr、Leu、Ile、Val、Met、Cys、Ala、His、Thr、Pro、Gly、Gln、Asn、Ser、Asp或者Glu。
214位的替代氨基酸較好是Phe、Leu、Ile、Val、Met、Cys、Ala、His、Thr、Pro、Gly、Gln、Asn、Ser、Asp或者Glu。
215位的替代氨基酸較好是Thr、Pro、Gln、Asn、Ser、Asp或者Glu。
216位的替代氨基酸較好是His、Thr、Pro、Gly、Gln、Asn、Ser、Asp或者Glu。
217位的替代氨基酸較好是Leu、Ile、Val、Met、Cys、Ala、His、Thr、Pro、Gly、Gln、Asn、Ser、Asp或者Glu。
218位的替代氨基酸較好是Gln、Ser、Asp或者Glu。
219位的替代氨基酸較好是Pro、Gln、Asn、Ser、Asp或者Glu。
220位的替代氨基酸較好是Pro、Gly、Gln、Asn、Ser、Asp或者Glu。
第199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219或者220中的任一位置的替代氨基酸更好是表1所示的中性或者帶負電荷的，并且與野生型枯草桿菌蛋白酶BPN′的目的位置氨基酸相比是具有同等或者更大親水性的，特別是更親水的。
199、200、201、202、203、204、205、206、202、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219或者220中任一位置的替代氨基酸最好是Asp和Glu。
C.至少含三個氨基酸替代的變異體在本發(fā)明另一個實施方案中，BPN′變異體含有野生型氨基酸序列，其中野生型氨基酸序列的第199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219或者220位中的三個或者更多個位置被替代；從而與野生型枯草桿菌蛋白酶BPN′相比，該BPN′變體降低了對不溶性底物的吸附作用，并且提高了對不溶性底物的水解作用。具有替代氨基酸的位置較好是199、200、201、202、205、207、208、209、210、211、212、或者215位，更優(yōu)選的位置是200、201、202、205或者207。
199位的替代氨基酸較好是Cys、Ala、His、Thr、Pro、Gly、Gln、Asn、Ser、Asp或者Glu。
200位的替代氨基酸較好是His、Thr、Pro、Gly、Gln、Asn、Ser、Asp或者Glu。
201位的替代氨基酸較好是Gly、Gln、Asn、Ser、Asp或者Glu。
202位的替代氨基酸較好是Pro、Gln、Asn、Ser、Asp或者Glu。
203位的替代氨基酸較好是Met、Cys、Ala、His、Thr、Pro、Gly、Gln、Asn、Ser、Asp或者Glu。
204位的替代氨基酸選自于Asp或者Glu。
205位的替代氨基酸較好是Leu、Val、Met、Cys、Ala、His、Thr、Pro、Gly、Gln、Asn、Ser、Asp或者Glu。
206位的替代氨基酸較好是Pro、Asn、Ser、Asp或者Glu。
207位的替代氨基酸較好是Asp或者Glu。
208位的替代氨基酸較好是Pro、Gly、Gln、Asn、Ser、Asp或者Glu。
209位的替代氨基酸較好是Ile、Val、Met、Cys、Ala、His、Thr、Pro、Gly、Gln、Asn、Ser、Asp或者Glu。
210位的替代氨基酸較好是Ala、Gly、Gln、Asn、Ser、Asp或者Glu。
211位的替代氨基酸較好是Ala、Pro、Gln、Asn、Ser、Asp或者Glu。
212位的替代氨基酸較好是Gln、Ser、Asp或者Glu。
213位的替代氨基酸較好是Trp、Phe、Tyr、Leu、Ile、Val、Met、Cys、Ala、His、Thr、Pro、Gly、Gln、Asn、Ser、Asp或者Glu。
214位的替代氨基酸較好是Phe、Leu、Ile、Val、Met、Cys、Ala、His、Thr、Pro、Gly、Gln、Asn、Ser、Asp或者Glu。
215位的替代氨基酸較好是Thr、Pro、Gln、Asn、Ser、Asp或者Glu。
216位的替代氨基酸較好是His、Thr、Pro、Gly、Gln、Asn、Ser、Asp或者Glu。
217位的替代氨基酸較好是Leu、Ile、Val、Met、Cys、Ala、His、Thr、Pro、Gly、Gln、Asn、Ser、Asp或者Glu。
218位的替代氨基酸較好是Gln、Ser、Asp或者Glu。
219位的替代氨基酸較好是Pro、Gln、Asn、Ser、Asp或者Glu。
220位的替代氨基酸較好是Pro、Gly、Gln、Asn、Ser、Asp或者Glu。
l99、200、201、202、202、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219或者220中任一位置的替代氨基酸更好是表1所示的中性或者帶負電荷的，并且與野生型枯草桿菌蛋白酶BPN′的目的位置的氨基酸相比具有同等或者更大親水性，優(yōu)選的更親水的氨基酸。
199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219或者220中任一位置的替代氨基酸更好是Asp或者Glu。
D.酶變體的制備實施例1突變的BPN′基因?qū)⒑幸吧涂莶輻U菌蛋白酶BPN′基因的噬菌粒(pSS-5)(Mitchinson，C.and J.A.Wells，(1989)，“ProteinEngineering of Disulfide Bonds in Subtilisin BPN′BIOCHEMISTRY，Vol.28，4807-4815)轉(zhuǎn)化到大腸桿菌ung-菌株CJ236中，并且利用VCSM13輔助噬菌體制備含尿嘧啶的單鏈DNA模板(Kunkel，T.A.，J.D.Roberts and R.A.Zakour，“Rapidand efficient site-specific mutagenesis withoutphenotypic selection”，METHODS IN ENZYMOLOGY，Vol.154，pp.367-382(1987)；如由Yuckenberg，P.D.，F(xiàn).Witney，J.Geisselsoder和J.McClary修改的，“Site-directed in vitromutagenesis using uracil-containing DNA和phagemidvectors”，DIRECTED MUTAGENESIS-A PRACtiCAL Approach，ed.M.J.McPherson，pp.27-48(1991)；兩者引入本文作參考)。利用Zoller和Smith的單引物定位誘變修飾方法(Zoller，M.J.，and M.Smith，“Oligonucleotide-directed mutagenesis usingM13-derived vectorsan efficient and generalprocedure for the production of point mutations inany fragment of DNA”，Mucleic Acids Research，Vol.10，pp.6487-6500(1982)，引入本文作參考)制備所有突變體(基本上按是由Yuckenberg等人，1991(上文)提出的)。利用AppliedBiosystem Inc.380B DNA合成儀制備寡核苷酸。將誘變反應產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌MM294菌株(American Type Culture·Collection大腸桿菌33625)中。采用DNA測序方法驗證所有突變體并且將分離到的DNA轉(zhuǎn)化到枯草芽孢桿菌表達菌株BG2036(Yang，M.Y.，E.Ferrari和D.J.Henner，(1984)，“Cloning of the NeutralProtease Gene of Bacillus subtillis and the Use ofthe Cloned Gene to Create an In Vitro-derivedDeletion Mutation”，Journal of Bacteriology，Vol.160，pp.15-21)中。對于某些突變體，使用在217位氨基酸有移碼終止密碼子突變的經(jīng)修飾的pSS-5產(chǎn)生尿嘧啶模板。設計寡核苷酸，使之在第217位恢復正確閱讀框架并且還編碼在199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219和220位上的隨機替代(對于這些密碼子的所有三個堿基，取所有四種核苷酸的等摩爾和/或可變量混合物)。根據(jù)其消化酪蛋白的能力鑒別出糾正移碼終止并產(chǎn)生功能性酶的突變。采用DNA測序法確定隨機替代。
實施例2發(fā)酵在1升LB葡萄糖肉湯中將含有所需枯草桿菌蛋白酶突變體的枯草芽孢桿菌細胞(BE2036)培養(yǎng)至對數(shù)生長中期，并以10升總體積接種到Biostat ED發(fā)酵罐(B.Braun Biotech，Inc.，Allentown，Pennsylvania)中。發(fā)酵培養(yǎng)基含有酵母提取物、淀粉、消沫劑、緩沖劑以及微量無機物(參見FERMENTATIONA PRACTICALAPPROACH，Ed，B.McNeil and L.M.Harvey，1990)。在發(fā)酵周期中保持肉湯恒定pH為7。加入氯霉素，對誘變質(zhì)粒進行抗生素選擇，將細胞在37℃培養(yǎng)過夜至A600約為60并收獲細胞。
實施例3純化采用下列步驟處理發(fā)酵肉湯以獲得純酶。離心去除肉湯中的枯草芽孢桿菌細胞，并且用100K截留膜去除細顆粒而使肉湯澄清。接著用l0K截留膜濃縮，并且流式透析以減低離子強度并利用0.025M MES緩沖液(2-(N-嗎啉代)甲磺酸)調(diào)pH至5.5。將其加樣到陽離子交換層析柱或者親和吸附層析柱上并用NaCl或者聚乙二醇梯度從柱上洗脫對酶作進一步的純化(參見Scopes，R.K.，PROTEINPURIFICATION PRINCIPLES AND PRACTICE Springer-Verlag，New York(1984)，引入本文作參考)。
利用pNA檢測法(DelMar，E.G.，C.Largman，J.W.Brodrickand M.C.Geokas，ANAL.BiocHEM.，Vol.99，pp.316-320(1979)，引入本文作參考)確定在梯度洗脫期間收集之餾分的活性酶濃度。該檢測法檢測當酶水解可溶性合成底物，琥珀酰-丙氨酸-丙氨酸-脯氨酸-苯丙氨酸-N-?；鶎ο趸桨?sAAPF-pNA)時釋放硝基苯胺的速率。在分光光度計上于410nm處檢測經(jīng)水解反應產(chǎn)生黃顏色的速率并且該速率與活性酶濃度成正比例。另外，檢測280nm處的吸光率以確定總蛋白質(zhì)濃度。計算活性酶/總蛋白的比例得到酶純度，并用于鑒定收集的餾分作為貯存溶液。
為了避免貯存期間酶的自溶，向從層析柱上收集的餾分中加入等量的聚乙二醇。在純化步驟完成之后用SDS-PAGE(十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳)方法檢查貯存酶溶液的純度并且利用購自Sigma化學公司(St.Louis，Missouri)的胰蛋白酶抑制劑II型火雞卵清，以活性位點滴定方法測定絕對酶濃度。測得的轉(zhuǎn)變因子將顯示在該酶分子的各個位置上造成的何種變化會產(chǎn)生具有高于野生型的分解可溶性底物pNA活性的酶變體。
在準備使用時，將酶貯存溶液通過一個Sephadex-G25(Pharmacia，Piscataway，New Jersey)大小排阻柱進行洗脫以去除聚乙二醇和交換緩沖劑。酶貯存溶液中的MES緩沖劑與含有0.01MCaCl2并且用HCl將pH調(diào)至8.6的0.1M Tris緩沖液三(羥甲基氨基甲烷)進行交換。所有試驗均在溫度穩(wěn)定于25℃，pH8.6的Tris緩沖液中進行。
E.酶變體的特征實施例4模型表面制備用購自于CPG Inc.(Fairfield，New Jersey)的氨基丙基控制的微孔玻璃(CPG)作為共價吸附購自于Bachem，Inc，(Torrence，California)之sAAPF-pNA底物的載體。該反應在二甲亞砜中完成并且以(1-乙基-3-[3-(二甲氨基)丙基]碳化二亞胺鹽酸鹽)(EDC)用作為偶聯(lián)劑。反應完成(通過pNA檢測法監(jiān)控)后，除去過量的溶劑，并用二甲亞砜(DMSO)以及重蒸餾水淋洗CPGsAAPF-pNA。隨后在用N2凈化的約70℃烘箱中干燥之。按照Brode，P.F.111，以及D.S.Rauch，“Subtilisin BPN′Activity onan Immobilized Substrate”，LANGMUIR，Vol.8，p.1325-1329(1992)(引入本文作參考)描述的方法進行反應并制備固相化底物。
CPG表面具有62,000±7,000個pNA分子/μm2。其表面積將保持于由CPG Inc.報道的，公認為50.0m2/g的CPG表面積值不變。這表明所使用的將sAAPF-pNA加到CPG上的步驟沒有損壞孔徑結(jié)構(gòu)(平均直徑為486)。
實施例5表面水解檢測法利用CPGsAAPF-pNA，可在單一實驗中檢測出酶變體的吸附作用及對CPG結(jié)合之肽的水解作用。將小體積酶變體貯存溶液加到已經(jīng)過除氣的Tris緩沖液和CPGsAAPF-pNA的燒瓶中。在肘節(jié)作用搖床上將燒瓶振蕩培養(yǎng)90分鐘，在此期間以不同時間間隔(例如在吸附水解的早期階段例如前20分鐘每次間隔2分鐘，直到實驗結(jié)束前每次間隔10分鐘)關閉搖床。使CPGsAAPF-pNA沉積并且從溶液中取樣。按照Brode等人(1992，上文)所述方法完成實驗程序并計算吸附和水解作用水平。
監(jiān)測所有酶抵抗自溶作用的穩(wěn)定性，并且在整個試驗期間不應該顯示有可估計到的自溶損失。因此，可以通過檢測溶液損耗來確定酶的吸附作用。根據(jù)酶變體起始濃度與在各個不同時間點測出的濃度之間的差異算出被吸附的酶變體的量。根據(jù)在410nm處測出的一等份樣品的吸光率讀數(shù)以測出從表面水解的pNA量。將取樣的量與留在燒瓶中的量相加計算出水解的pNA的總量。通過減去無酶存在時由pH＝8.6的Tris緩沖液水解的pNA的量校正該總量數(shù)值。依據(jù)酶效率不同，基底水解的量約為總水解量的7-29％。
實施例6可溶性底物動力學分析用DU-70分光光度計在410nm處檢測作為時間函數(shù)的吸光率值的增加監(jiān)測可溶性底物sAAPF-pNA的水解速率。每次動力學測定均保持恒定酶濃度，并且當?shù)孜餄舛葹?0-700μM sAAPF-pNA時使酶濃度在6-10毫微摩爾的范圍內(nèi)。在900秒的時間內(nèi)每秒鐘檢測一次吸光率，并將數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)到一張LOTUSTM擴大紙(LotusDevelopment Corporation，Cambridge，Massachusetts)上。采用標準的Lineweaver Burk分析法完成對動力學參數(shù)分析，其中將運轉(zhuǎn)起始部分(通常是第一分鐘)的數(shù)據(jù)與線性回歸曲線相配合得到Vo。以標準的倒數(shù)方式用Vo和So作圖得到KM和Kcat。
F.BPN′變體的實例表2中列舉了對表面結(jié)合之底物的吸附作用得以降低并且水解作用得以提高的本發(fā)明的BPN′變體。在描述特定突變時，首先給出野生型中出現(xiàn)的原有氨基酸，然后是其位置編號，第三是替代了的氨基酸。
表2BPN′變體舉例-單突變-Lys213GluAla216GluAla216AspAla216GlySer204GluVal203Glu- 雙重突變 -Lys213Glu＋Tyr217LeuIle205Leu＋Ala216GluIle205Leu＋Ala216AspPro210Ala＋Gly215ThrLys213Glu＋Ala216GluTyr214Phe＋Tyr217AsnGln206Glu＋Ala216GluAla216Glu＋Tyr217LeuGln206Glu＋Tyr217LeuGln206Glu＋Lys213Glu- 三重突變 -Gln206Pro＋Gly211Ala＋Ala216GluLys213Glu＋Ala216Glu＋Tyr217LeuIle205Val＋Pro210Ala＋Lys213GluGln206Glu＋Ala216Glu＋Tyr217LeuGln206Glu＋Lys213Glu＋Tyr217Leu- 四重突變 -Pro210Ala＋Lys213Glu＋Ala216Glu＋Tyr217LeuGln206Glu＋Lys213Glu＋Ala216Glu＋Tyr217LeuSer204Glu＋Gln206Glu＋Ala216Glu＋Tyr217Leu
- 五重突變 -Ile205Leu＋Pro210Ala＋Lys213Glu＋Ala216Glu＋Tyr217LeuSer204Glu＋Gln206Glu＋Lys213Glu＋Ala216Glu＋Tyr217LeuII.清潔組合物在本發(fā)明另一個實施方案中，在用于清潔需要去除蛋白質(zhì)污漬之各種各樣表面的組合物中含有有效量的本發(fā)明的一種或多種酶變體。這樣的清潔組合物包括用于清潔堅硬表面的形態(tài)不定(例如液體和顆粒)的去污組合物；用于清潔織物的形態(tài)不定(例如顆粒狀的，液體和條狀制劑)的去污組合物；碗碟洗滌組合物(形態(tài)不定)；形態(tài)不定(例如，潔牙液、牙膏和漱口藥劑)的口腔清潔組合物；形態(tài)不定的假牙清潔組合物(例如液體或片劑)；以及形態(tài)不定(例如液體，片劑)的隱形眼鏡清潔組合物。如本文使用，“酶變體的有效量”是指在特定的清潔組合物中獲得必需的酶解活性所需的酶變體的量。本領域內(nèi)普通技術人員很容易知道所述有效量，并且所述有效量取決于許多因素，例如所使用的穩(wěn)定酶變體、清潔應用的對象、清潔組合物的特定組分、以及需要液體還是干燥(例如顆粒狀、條狀)組合物等等。本發(fā)明優(yōu)選的清潔組合物包含約0.0001％-10％的一種或多種本發(fā)明的酶變體，較好是含約0.001％-1％，更優(yōu)選的是含約0.01％-0.1％的酶變體。在下文中詳細討論其中應用了本發(fā)明酶變體的各種清潔組合物的幾個實例。除非另有說明，本文使用的所有等份，百分數(shù)和比例都是按重量計算的。
如本文使用的，“非織物的清潔組合物”包括清潔堅硬表面的組合物，洗碗碟的組合物，口部清潔組合物，假牙清潔組合物以及隱形眼鏡清潔組合物。
A.用于堅硬表面、碗碟和織物的清潔組合物本發(fā)明的酶可用于期望有高泡沫產(chǎn)生和好的不溶性底物去除作用的任何去污組合物中。因此，本發(fā)明的酶變化可與各種常規(guī)成分一起使用從而提供全配方制造的堅硬表面清潔劑，碗碟洗滌組合物，織物洗滌組合物等等。這樣的組合物可以是液體、顆粒、條形態(tài)的?？蓪⑦@樣的組合物配制成含有多至30％-60％重量的表面活性劑的流行的“濃縮”去污劑。
本文所述的清潔組合物可以并且較好含有陰離子、非離子、兩性離子等表面活性劑。這樣的表面活性劑通常以約占組合物5％至35％的量存在。
本文中使用的表面活性劑的非限制性的實例包括常規(guī)的C11-C18烷基苯磺酸鹽以及低級和隨意的烷基硫酸鹽，通式為CH3(CH2)x(CHOSO3)-M+)CH3和CH3(CH2)y(CHOSO3-M+)CH2CH3的C10-C18仲(2，3)烷基硫酸鹽，其中x和(y＋1)是至少約7，較好是至少約為9的整數(shù)，并且M是可溶于水的陽離子，特別是鈉，所述表面活性劑還包括C10-C18烷基烷氧基硫酸鹽(尤其是EO1-5乙氧基硫酸鹽)，C10-C18烷基烷氧基羧基鹽(尤其是EO1-5乙氧基羧酸鹽)，C10-C18烷基聚糖苷以及其相應的硫酸化聚糖苷，C12-C18α-磺化脂肪酸酯，C12-C18烷基以及烷基苯酚烷氧基化物(尤其是乙氧基化物和混合的乙氧/丙氧基化物)，C12-C18甜菜堿和硫代甜菜堿(“sultaines”)，C10-C18氧化胺等。本發(fā)明中優(yōu)選的是烷基烷氧基硫酸鹽(AES)以及烷基烷氧基羧酸鹽(AEC)(依據(jù)制造商的要求，將所述的表面活性劑與前面所述的氧化胺和/或甜菜堿或硫代甜菜堿表面活性劑一起使用也是優(yōu)選的)。其他常規(guī)使用的表面活性劑列于規(guī)范的教科書中。特別適用的表面活性劑包括在美國專利5,194,639(Connor等人，1993年3月16日公布，引入本文作為參考)中公開的C10-C18N-甲基葡糖酰胺。
可包含于本發(fā)明組合物中的適用于去污清潔組合物的多種其他成分包括其他的活性成分、載體、助溶劑、加工助劑、染料或色素、用于液體制劑的溶劑等。如果需要另外增加洗滌泡沫，則可將例如C10-C16烷醇酰胺的泡沫增進劑通常以約1％-約10％的水平摻入到組合物中。C10-C14單乙醇和二乙醇酰胺是這樣的泡沫增進劑的一個典型類別的例子。將這樣的泡沫增進劑與高泡沫添加表面活性劑例如上文中提到的氧化胺，甜菜堿以及硫代甜菜堿一起使用也是有利的。如果需要，也可通常加入大約0.1％到2％的可溶性鎂鹽例如MgCl2、MgSO4等以提供額外的泡沫發(fā)生。
本文所述的液體去污組合物可含有水和作為載體的其他溶劑。以甲醇、乙醇、丙醇和異丙醇為代表的低分子量伯或仲醇是適用的。為了溶解表面活性劑可優(yōu)選一水合醇，但也可使用多元醇例如那些含有約2-6個碳原子和約2-6個羥基的多元醇(例如，1，3-丙二醇、乙二醇、甘油和1，2-丙二醇)。該組合物可含有約5％-90％，通常約10％-50％的所述載體。
配制本發(fā)明的去污組合物較好在清洗操作期間使洗滌用水的pH將保持于大約6.8和大約11.0之間。為此通常在該pH范圍內(nèi)配制終產(chǎn)品。將pH值控制在推薦的使用水平上的技術包括使用緩沖液、堿、酸等以及使用本領域技術人員熟知的方法。
當配制本發(fā)明的硬表面清潔組合物和織物清潔組合物時，配制者可能希望使用含量為大約5％-50％重量比的各種助洗劑。典型的助洗劑包括1-10微米的蛭石，聚羧酸鹽例如檸檬酸鹽和氧化二琥珀酸鹽，分層的硅酸鹽、磷酸鹽等。其他常規(guī)助洗劑列于標準配方集中。
同樣地，配制者可能希望在這樣的組合物中使用含量為大約0.001％-1％重量比的各種附加酶例如纖維素酶、脂酶、淀粉酶和蛋白酶。各種洗滌和織物護理酶是洗衣去污劑領域中熟知的。
在這樣的組合物中可以使通常含量約為1％到15％重量比的各種漂白劑化合物，例如過碳酸鹽、過硼酸鹽等。如果需要，所述組合物還可以含有漂白活化劑例如四乙酰乙二胺，壬酰氧化苯磺酸鹽等，這些也是本領域內(nèi)已知的。其使用劑量通常在大約1％-10％重量比范圍內(nèi)。
在這些組合物中都可以以重量約占1％-35％的含量使用各種污斑釋放劑尤其是陰離子寡聚酯型的污斑釋放劑，各種螯合劑尤其是氨基磷酸鹽以及乙二胺二琥珀酸鹽，各種泥土污漬去除劑尤其是乙氧基化的四亞乙基五胺，各種分散劑尤其是多聚丙烯酸鹽和多聚天門冬氨酸鹽，各種增白劑尤其是陰離子增白劑，各種泡沫抑制劑尤其是硅酮和仲醇，各種織物柔軟劑尤其是蒙脫石粘土等。規(guī)范的配方集以及公開的專利中包括對這樣的常規(guī)材料的多方面詳細描述。
本發(fā)明的清潔組合物中也可以使用酶穩(wěn)定劑。這樣的酶穩(wěn)定劑包括丙二醇(較好為大約1％-10％)，甲酸鈉(較好為大約0.1％-1％)以及甲酸鈣(較好為大約0.1％-1％)。
1.硬表面清潔組合物如本文使用，“硬表面清潔組合物”是指用于清潔堅硬表面例如地板、墻壁、浴室磁磚等的液體和顆粒狀去污組合物。本發(fā)明所述的堅硬表面清潔組合物含有有效量的本發(fā)明的一種或多種酶變體，該組合物中活性酶重量較好約占0.001％-10％，更好是約占0.1％-5％，最好是約占0.05％-1％。除含有本發(fā)明的-種或多種酶變體以外，所述硬表面清潔組合物通常含有表面活性劑以及水溶性螯合助洗劑。然而，在某些特定產(chǎn)品如洗窗的噴霧清潔劑中，有時候不使用表面活性劑，因為它們在玻璃表面產(chǎn)生片狀/條紋狀殘留物。
如果有表面活性劑成分，則其含量可以低至占本文所述組合物的0.1％，但通常情況是該組合物含有的表面活性劑為約0.25％-10％，較好約為1％-5％。
該組合物通常含有約0.5％-50％的去污助洗劑，較好是約1％-10％。
pH較好是在約8-12的范圍內(nèi)。如果需要調(diào)整，可使用例如NaOH，碳酸鈉或鹽酸等常規(guī)pH調(diào)節(jié)劑。
在該組合物中可以包含溶劑。適用的溶劑包括但不只限于甘油醚例如二甘醇-己基醚、二甘醇-丁基醚、乙二醇-丁基醚、乙二醇-己基醚、丙二醇-丁基醚、二丙二醇-丁基醚，以及二醇例如2，2，4-三甲基-1，3-戊二醇和2-乙基-1，3-己二醇。如果使用這些溶劑，則通常其含量約為0.5％-15％，較好為大約3％-11％。
另外，如果將組合物以“足夠強度”應用到表面上之后表面沒有被漂清時，則可以在本發(fā)明組合物中使用高揮發(fā)溶劑例如異丙醇或乙醇以有利于組合物較快地從表面上蒸發(fā)。如果使用這些揮發(fā)性溶劑，則通常使用量約占組合物的2％-12％。
下面的實施例中舉例描述了本發(fā)明硬表面清潔組合物的配制實施方案。
實施例7-12液體硬表面清潔組合物實施例編號成分 7 8 9 10 11 12Lys213Glu 0.050.500.020.030.10 0.03Ile205Leu＋Ala216Asp- -- - 0.20 0.02Na2DIDA*EDTA**- - 2.902.90 - -檸檬酸鈉- -- - 2.90 2.90C12烷基苯磺酸鈉 1.95 - 1.95 - 1.95 -C12烷基硫酸鈉 - 2.20 - 2.20 -2.20C12(乙氧基)***硫酸鈉 - 2.20 - 2.20 -2.20C12氧化二甲胺 - 0.50 - 0.50 -0.50異丙基苯磺酸鈉 1.30 - 1.30 - 1.30 -己基二甘醇-乙醚***6.306.306.306.306.30 6.30水****平衡至100％*N-二甘醇-N，N-亞氨基二乙酸二鈉**乙二胺二乙酸四鈉***二甘醇-己基醚****所有配方的pH均調(diào)到7。
在實施例7-10中，用表2中描述的其他BPN′變體替代Lys213Glu，得到基本上類似的結(jié)果。
在實施例11-12中，用表2中描述的其他的BPN′變體-結(jié)合物替代Lys213Glu和Ile205Leu＋Ala216Asp，獲得基本上同樣結(jié)果。
實施例13-18用于清潔硬表面和清除家庭霉菌的噴霧組合物實施例編號成分13 141516 1718Lys213Glu＋Tyr217Leu 0.50 0.05 0.60 0.30 0.20 0.30Ala216Glu - - -- 0.30 0.10辛基硫酸鈉 2.00 2.00 2.00 2.00 2.00 2.00十二烷基硫酸鈉 4.00 4.00 4.00 4.00 4.00 4.00氫氧化鈉 0.80 0.80 0.80 0.80 0.80 0.80硅酸鹽(鈉) 0.04 0.04 0.04 0.04 0.04 0.04香精 0.35 0.35 0.35 0.35 0.35 0.35水 平衡至100％產(chǎn)品pH約為7。
在實施例13-16中，用表2中描述的其他BPN′變體替代Lys213Glu＋Tyr217Leu，基本上具有相同結(jié)果。
在實施例17-18中，用表2中描述的其他BPN′變體結(jié)合物替代Lys213Glu＋Tyr217Leu和Ala216Glu，獲得了基本相同結(jié)果。
2.碗碟洗滌組合物在本發(fā)明的另一實施方案中，碗碟洗滌組合物含有本發(fā)明的一種或多種酶變體。如本文中使用的“碗碟洗滌組合物”是指所有形式的用于清潔碗碟的組合物，其包括但不只限于顆粒狀的和液體形式的。下面的實施例中描述了本發(fā)明的碗碟清洗組合物的具體配制方案。
實施例19-24碗碟清洗組合物實施例編號成分19 2021222324Glu206Pro＋Gly211Ala＋Ala216Glu0.05 0.50 0.02 0.40 0.10 0.03Ile205Leu＋Ala216Asp - - --0.40 0.02C12-C14N-甲基-葡糖酰胺 0.90 0.90 0.90 0.90 0.90 0.90C12乙氧基(1)硫酸鹽 12.00 12.00 12.00 12.00 12.00 12.002-甲基十一烷酸 4.50 4.50 4.05 4.50 4.50 4.50C12乙氧基(2)羧酸鹽4.50 4.50 4.05 4.50 4.50 4.50C12醇乙氧基化物 3.00 3.00 3.00 3.00 3.00 3.00C12氧化胺 3.00 3.00 3.00 3.00 3.00 3.00異丙基苯磺酸鈉 2.00 2.00 2.00 2.00 2.00 2.00乙醇 4.00 4.00 4.00 4.00 4.00 4.00Mg++(如MgCl2)0.20 0.20 0.20 0.20 0.20 0.20Ca++(如CaCl2)0.40 0.40 0.40 0.40 0.40 0.40水****平衡至100％產(chǎn)品pH均調(diào)到7。
在實施例19-22中，用表2中描述的其他BPN′變體替代Gln206Pro＋Gly211Ala＋Ala216Glu獲得了基本上同樣的結(jié)果。
在實施例23-24中，合用表2中描述的其他BPN′變體替代Gln206Pro＋Gly211Ala＋Ala216Glu和Ile205Leu＋Ala216Asp，獲得了基本上同樣結(jié)果。
3.織物清潔組合物在本發(fā)明的另一實施方案中，用于清潔織物的組合物含有一種或多種本發(fā)明的酶變體。如本文中使用的“織物清潔組合物”是所有形式的指用于清潔織物的去污組合物，包括但不限于顆粒，液體和直條形狀的組合物。
a.顆粒狀織物清潔組合物本發(fā)明的顆粒狀織物清潔組合物含有有效量的一種或多種本發(fā)明的酶變體，組合物中活性酶的重量較好約占0.001％-10％，更好是約占0.005％-5％，最好是約占0.01％-1％。除含有一種或多種酶變體以外，顆粒狀織物清潔組合物通常還含有至少一種表面活性劑，一種或多種助洗劑，以及在某些情況下還含有漂白劑。
下面的實施例中描述了本發(fā)明的顆粒狀織物清潔組合物的具體配制方案。
實施例25-28顆粒狀織物清潔組合物實施例編號成分25262728Ala216Asp 0.10 0.20 0.03 0.05Ala216Gly - -0.02 0.05C13直鏈烷基苯磺酸鹽 22.00 22.00 22.00 22.00磷酸鹽(如三聚磷酸鈉) 23.00 23.00 23.00 23.00碳酸鈉23.00 23.00 23.00 23.00硅酸鈉14.00 14.00 14.00 14.00蛭 8.20 8.20 8.20 8.20螯合劑(二亞乙基三胺五乙酸) 0.40 0.40 0.40 0.40硫酸鈉 5.50 5.50 5.50 5.50水 平衡至100％在實施例25-26中，用表2中描述的其他的BPN′變體替代Ala216Asp，獲得了基本上相似結(jié)果。
在實施例27-28中，合用表2中描述的其他的任何BPN′變體替代Ala216Asp和Ala216Gly，獲得了基本上相似結(jié)果。
實施例29-32顆粒狀織物清潔組合物實施例編號成分 29303132Lys2130lu＋Ala216Glu＋Tyr217Leu 0.10 0.20 0.03 0.05Ile205Val＋Pro210Ala＋Lys213Glu - -0.02 0.05C12烷基苯磺酸鹽12.00 12.00 12.00 12.00蛭石A(1-10微米) 26.00 26.00 26.00 26.002-T基辛酸4.00 4.00 4.00 4.00C12-C14仲(2，3)烷基硫酸鈉鹽5.00 5.00 5.00 5.00檸檬酸鈉 5.00 5.00 5.00 5.00熒光增白劑 0.10 0.10 0.10 0.10硫酸鈉 17.00 17.00 17.00 17.00水和次要成分平衡至100％在實施例29-30中，用表2中描述的其他BPN′變體替代Lys213Glu＋Ala216Glu＋Tyr217Leu，得到基本上相似的結(jié)果。
在實施例31-32中，合用表2中描述的任何其他的BPN′變體替代Lys213Glu＋Ala216Glu＋Tyr217Leu以及Ile205Val＋Pro210Ala＋Lys213Glu，得到基本上相似的結(jié)果。
b.液體織物清潔組合物本發(fā)明的液體織物清潔組合物含有有效量的一種或多種本發(fā)明的酶變體，有效量按組合物中的活性酶重量計較好約為0.005％-5％，更好是約為0.01％-1％。通常所述液體織物清潔組合物還含有一種陰離子表面活性劑，一種脂肪酸，一種水溶性去污助洗劑和水。
下面實施例描述了本發(fā)明所述的液體織物清潔組合物的具體配制方案。
實施例33-37液體織物清潔組合物實施例編號成分3324253637Pro210Ala＋Gly215Thr 0.05 0.03 0.30 0.03 0.10Pro210Ala＋Lys213Glu＋Ala216Glu＋Tyr217Leu -- -0.01 0.20C12-C14烷基硫酸鈉鹽 20.00 20.00 20.00 20.00 20.002-T基辛酸 5.00 5.00 5.00 5.00 5.00檸檬酸鈉 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00C10醇乙氧基化物(3) 13.00 13.00 13.00 13.00 13.00單乙醇胺 2.50 2.50 2.50 2.50 2.50水/丙二醇/乙醇(100∶1∶1)平衡至100％在實施例33-35中，用表2中描述的其他的BPN′變體替代Pro210Ala＋Gly215Thr，得到基本相似的結(jié)果。
在實施例36-37中，任意合用表2中描述的其他的任何BPN′變體替代Pro210Ala＋Gly215Thr以及Pro210Ala＋Lys213Glu＋Ala216Glu＋Tyr217Leu，得到基本相似的結(jié)果。
c.條狀織物清潔組合物適用于手洗去織物污斑的本發(fā)明所述的條狀織物清潔組合物含有有效量的本發(fā)明的一種或多種酶變體，優(yōu)選量為約占組合物重量的0.001％-1％，更優(yōu)選的是約為0.01％-1％。
下列實施例中描述了本發(fā)明的條狀織物清潔組合物的配制實施方案。
實施例38-41條狀織物清潔組合物實施例編號成分 38 39 40 41Lys213Glu＋hla216Glu 0.3 - 0.10.02Tyr214Phe＋Tyr217Asn - - 0.40.03C12-C16烷基硫酸Na鹽 20.0 20.0 20.0 20.00C12-C14N-甲基葡糖酰胺 5.05.05.05.00C11-C13烷基苯磺酸Na鹽 10.0 10.0 10.0 10.00碳酸鈉 25.0 25.0 25.0 25.00焦磷酸鈉 7.07.07.07.00三聚磷酸鈉 7.07.07.07.00蛭石A(0.1-10μ) 5.05.05.05.00羧甲基纖維素 0.20.20.20.20聚丙烯酸鹽(酯)(MW1400) 0.20.20.20.20椰子單乙醇酰胺 5.05.05.05.00增白劑，香料 0.20.20.20.20CaSO41.01.01.01.00MgSO41.01.01.01.00水 4.04.04.04.00填充料*平衡至100％*可選用常規(guī)材料例如CaCO3、滑石、粘土、硅酸鹽等。
在實施例38-39中，用表2中描述的其他的BPN′變體替代Lys213Glu＋Ala216Glu，獲得了相似的結(jié)果。
在實施例40-41中，合用表2中描述的其他任何BPN′變體替代Lys213Glu＋Ala216Glu以及Tyr214Phe＋Tyr217Asn，獲得了基本上相似的結(jié)果。
B.其他的清潔組合物除了上文中討論的用于清洗硬表面、碗碟以及織物的清潔組合物以外，如果想要使不溶性底物水解，則可將本發(fā)明的一種或多種酶變體摻入到各種各樣的其他清潔組合物中。這些其他清潔組合物包括但不只限于口腔清潔組合物，假牙清潔組合物以及隱形眼鏡清洗組合物。
1.口腔清潔組合物在本發(fā)明的另一實施方案中，適用于去除牙齒或假牙上的蛋白質(zhì)污物的組合物中包含藥物學上可接受量的本發(fā)明的一種或多種酶變體。如本文中如使用的，“口腔清潔組合物”是指洗牙水、牙膏、牙用凝膠體、牙粉、漱口液、口用噴灑液、口用凝膠、口香糖、糖錠、香粉、藥片、生物膠、預防膏劑、假牙處理溶液等。本發(fā)明的清洗口腔組合物中較好含有占組合物重量約0.0001％-20％，更好約0.001％-10％，最好約0.01％-5％的本發(fā)明的一種或多種酶變體，以及藥學學上可接受的載體。如本文中使用的“藥學學上可接受的”是指該術語描述的藥物、藥劑或非活性成分適合于與人和低等動物組織接觸使用而沒有不適當?shù)亩拘?、不相容性、不穩(wěn)定性、刺激性、過敏反應等，并具有合理的收益/風險比例。
通常，清潔口腔組合物中的口腔清潔成分的藥物學上可接受的清潔口腔載體成分一般約占組合物重量的50％-約99.99％，較好是大約65％-99.99％，最好是大約65％-約99％。
可包含在本發(fā)明的清潔口腔組合物中的藥學學上可接受的載體成分及其他非強制性使用的成分是本領域內(nèi)技術人員熟知的。有關適用于口腔清潔組合物的各種組合物類型、載體成分以及非強制性使用成分，可參見美國專利5,096,700(Seibel，1992年3月17日公布)、美國專利5,028,414(Sampathkumar，1991年7月2日公布)以及美國專利5,028,415(Benedict，Bush和Sunberg，1991年7月2日公布)(所有文獻引入本文作參考)。
下列實施例中描述了配制本發(fā)明清潔口腔組合物的實施方案。
實施例42-45洗牙水組合物實施例編號成分 42 43 44 45Ile205Leu＋Pro210Ala＋Lys213Glu＋Ala216Glu＋Tyr217Leu2.000 3.500 1.500 2.000山梨醇(70％水溶液) 35.000 35.000 35.000 35.000PEG-6*1.000 1.000 1.000 1.000牙科磨料硅石**20.000 20.000 20.000 20.000氟化鈉0.243 0.243 0.243 0.243二氧化鈦 0.500 0.500 0.500 0.500糖精鈉0.286 0.286 0.286 0.286烷基硫酸鈉(27.9％水溶液) 4.000 4.000 4.000 4.000辛香料1.040 1.040 1.040 1.040羧乙烯聚合物***0.300 0.300 0.300 0.300角叉萊膠****0.800 0.800 0.800 0.800水平衡至100％
*PEG-6＝分子量為600的聚乙二醇**由J.M.Huber提供的鑒定為Zeodent119的沉積硅石***由B.F.Goodrich化學公司提供的Carbopol。
****由Hercules化學公司提供的lota角叉膠。
在實施例42-45中，用表2中描述的其他的BPN′變體替代Ile205Leu＋Pro210Ala＋Lys213Glu＋Ala216Glu＋Tyr217Leu，獲得了基本上相似的效果。
實施例46-49漱口組合物實施例編號成分 46 47 48 49Ala216Gly3.007.501.005.00SDA 40醇 8.008.008.008.00香料 0.080.080.080.08乳化劑 0.080.080.080.08氟化鈉 0.050.050.050.05甘油10.00 10.00 10.00 10.00甜味劑 0.020.020.020.02苯甲酸 0.050.050.050.05氫氧化鈉 0.200.200.200.20染料 0.040.040.040.04水 平衡至100％
在實施例46-49中，用表2中描述的其他的BPN′變體替代Ala216Gly，獲得了基本上相似的結(jié)果。
實施例50-53糖錠組合物實施例編號成分50 51 52 53Tyr214Phe＋Tyr217Asn 0.01 0.03 0.10 0.02山梨醇17.50 17.50 17.50 17.50甘露醇17.50 17.50 17.50 17.50淀粉 13.60 13.60 13.60 13.60甜味劑 1.20 1.20 1.20 1.20香料 11.70 11.70 11.70 11.70色素 0.10 0.10 0.10 0.10玉米糖漿平衡至100％在實施例50-53中，用表2中描述的其他的BPN′變體替代Tyr214Phe＋Tyr217Asn，獲得了基本上相似的結(jié)果。
實施例54-57口香糖組合物實施例編號成分 54 5556 57Ile205Val＋Pro210Ala＋Lys213Glu 0.03 0.02 0.10 0.05山梨醇晶體 38.44 38.40 38.40 38.40膠載體*20.00 20.00 20.00 20.00山梨醇(70％水溶液) 22.00 22.00 22.00 22.00甘露醇 10.00 10.00 10.00 10.00甘油 7.56 7.56 7.56 7.56香料 1.00 1.00 1.00 1.00*由L.A.Dreyfus公司提供。
在實施例54-57中，表2中描述的其他BPN′變體用于替代Ile205Val＋Pro210Ala＋Lys213Glu，得到基本相似結(jié)果2.假牙清洗組合物在本發(fā)明另一實施方案中，用于清洗從口腔中拿出之假牙的清洗假牙組合物含有本發(fā)明的一種或多種酶變體。所述假牙清洗組合物含有有效量的本發(fā)明的一種或多種酶變體以及一種假牙清洗載體，本發(fā)明的一種或多種酶變體的量較好約占組合物重量的0.0001％-50％，更好是約占0.001％-35％，最好是約占0.01-20％。各種假牙清洗組合物形式例如泡騰片劑等是本領域熟知的(參見例如美國專利5,055,305，Young，引入本文作參考)，并且通常摻入一種或多種本發(fā)明的酶變體，以便去除假牙上的蛋白質(zhì)污物。
下文實施例中描述了本發(fā)明假牙清洗組合物具體配制方案。
實施例58-61清洗假牙的雙層泡騰片劑實施例編號成分 58 59 6061酸性層Ala216Glu 1.0 1.5 0.01 0.05酒石酸 24.0 24.0 24.00 24.00碳酸鈉4.0 4.0 4.00 4.00氨基磺酸 10.0 10.0 10.00 10.00PEG20,000 4.0 4.0 4.00 4.00碳酸氫鈉 24.5 24.5 24.50 24.50過硫酸鉀 15.0 15.0 15.00 15.00酸性焦磷酸鈉 7.0 7.0 7.00 7.00煅制的硅石2.0 2.0 2.00 2.00TAED*7.0 7.0 7.00 7.00蓖麻油酰硫代琥珀酸酯 0.5 0.5 0.50 0.50香料 1.0 1.0 1.00 1.00
實施例編號成分 58 59 60 61堿性層一水合過硼酸鈉 32.032.032.00 32.00碳酸氫鈉 19.019.019.00 19.00EDTA 3.0 3.0 3.00 3.00三聚磷酸鈉 12.012.012.00 12.00PEG 20,0002.0 2.0 2.00 2.00過硫酸鉀 26.026.026.00 26.00碳酸鈉2.0 2.0 2.00 2.00煅制的硅 2.0 2.0 2.00 2.00染料/香料 2.0 2.0 2.00 2.00*四乙酰乙二胺在實施例58-61中，用表2中描述的其他的BPN′變體替代Ala216Glu，得到基本相似的結(jié)果。
3.隱形眼鏡清洗組合物在本發(fā)明的另一實施方案中，隱形眼鏡清洗組合物含有本發(fā)明的一種或多種酶變體。所述隱形眼鏡清洗組合物含有有效量的一種或多種本發(fā)明的酶變體以及一種隱形眼鏡清洗載體，其中本發(fā)明的一種或多種酶變體較好占組合物重量的大約0.01％-50％，更好約占0.01％-20％，最好約占1％-5％。各種隱形眼鏡清洗組合物形式例如片劑，液體等是本領域內(nèi)熟知的(例如參見美國專利4,863,627,Davies，Meaken和Rees，1989年9月5日公布；美國再頒專利32,672Huth，Lam和Kirai，1988年5月24日再公布；美國專利4,609,493，Schifer，1986年9月2日公布；美國專利4,690,793，Ogunbiyi和Smith，1987年9月1日公布；美國專利4,614,549，Ogunbiyi，Riedhammer和Smith，1986年9月30日公布；以及美國專利4,285,738，Ogata，1981年8月25日公布，所有文獻引入本文作參考)并且通常摻入一種或多種本發(fā)明的酶變體以去除隱形眼鏡上的蛋白質(zhì)污物。
下面的實施例中描述了本發(fā)明的隱形眼鏡清洗組合物的具體配制方案。
實施例62-65隱形眼鏡酶促清洗溶液實施例編號成分62 63 64 65Ile205Leu＋Ala216Asp 0.010.50.12.0葡萄糖50.00 50.0 50.0 50.0非離子型表面活性劑(聚氧2.002.02.02.0乙烯-聚氧丙烯共聚體)陽離子型表面活性劑(聚氧1.001.01.01.0乙烯-烷基苯基醚硫酸酯鈉鹽氯化鈉 1.001.01.01.0硼砂 0.300.30.30.3水 平衡至100％
在實施例62-65中，用表2中描述的其他BPN′變體替代Ile205Leu＋Ala216Asp，獲得基本相似的結(jié)果。
雖然已經(jīng)描述了本發(fā)明的特定實施方案，但對本領域內(nèi)技術人員而言，在不脫離本發(fā)明精神和范圍的前提下對本發(fā)明進行的各種改變和修飾應是顯而易見的。待批權利要求欲復蓋所有落入本發(fā)明范圍內(nèi)的這些修飾。
序列表(1)一般信息(i)申請人(ii)發(fā)明題目降低了吸附作用和增強了水解作用的絲氨酸蛋白酶(iii)序列數(shù)1(iv)相關地址(A)地址THE PROCTER &amp; GAMBLE COMPANY(B)街道11810 EAST MIAMI RIVER ROAD(C)城市ROSS(D)州OH(E)國家USA(F)郵編45061(v)計算機可讀形式(A)介質(zhì)類型軟盤(B)計算機IBM PC兼容機(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件PatentIn Release#1.0，Version#1.25(vi)現(xiàn)行申請資料(A)申請數(shù)量(B)申請日1993.3.1(C)類別(viii)代理人/代理機構(gòu)資料(A)姓名CORSTANJE，BRAHM J.
(B)登記號34,804
(ix)通訊資料(A)電話513-627-2858(B)傳真513-627-0260(2)SEQ ID NO1的信息(i)序列特征(A)長度275個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列描述SEQ ID NO1Ala Gln Ser Val Pro Tyr Gly Val Ser Gln Ile Lys Ala Pro Ala Leu1 5 10 15His Ser Gln Gly Tyr Thr Gly Ser Asn Val Lys Val Ala Val Ile Asp20 25 30Ser Gly Ile Asp Ser Ser His Pro Asp Leu Lys Val Ala Gly Gly Ala35 40 45Ser Met Val Pro Ser Glu Thr Asn Pro Phe Gln Asp Asn Asn Ser His50 55 60Gly Thr His Val Ala Gly Thr Val Ala Ala Leu Asn Asn Ser Ile Gly65 70 75 80VaL Leu GLy VaL Ala Pro Ser Ala Ser Leu Tyr Ala Val Lys Val Leu85 90 95Gly Ala Asp Gly Ser ely Gln Tyr Ser Trp Ile Ile Asn Gly Ile Glu100 105 110Trp Ala Ile Ala Asn Asn Met Asp Val Ile Asn Met Ser Leu Gly Gly115 120 125Pro Ser Gly Ser Ala Ala Leu Lys Ala Ala Val Asp Lys Ala Val Ala130 135 140Ser Gly Val Val Val Val Ala Ala ALa Gly Asn Glu Gly Thr Ser Gly145 150 155 160Ser Ser Ser Thr Val Gly Tyr Pro Gly Lys Tyr Pro Ser Val Ile Ala165 170 175Val Gly Ala Val Asp Ser Ser Asn Gln Arg Ala Ser Phe Ser Ser Val180 185 190Gly Pro Glu Leu Asp Val Met Ala Pro Gly Val Ser Ile Gln Ser Thr195 200 205Leu Pro Gly Asn Lys Tyr Gly Ala Tyr Asn Gly Thr Ser Met Ala Ser210 215 220Pro His Val Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ile Leu Ser Lys His Pro Asn225 230 235 240Trp Thr Asn Thr Gln Val Arg Ser Ser Leu Glu Asn Thr Thr Thr Lys245 250255Leu Gly Asp Ser Phe Tyr Tyr Gly Lys Gly Leu Ile Asn Val Gln Ala260 265 270Ala Ala Gln27權利要求
1.含有野生型氨基酸序列的BPN′變體，其特征在于在野生型氨基酸序列的第199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、218、219或者220位中的一個或多個位置上的氨基酸被替代，其中a.199位的替代氨基酸是Cys、Ala、His、Thr、Pro、Gly、Gln、Ash、Ser、Asp或者Glu；b.200位的替代氨基酸是His、Thr、Pro、Gly、Gln、Asn、Ser、Asp或者Glu；c.201位的替代氨基酸是Gly、Gln、Asn、Ser、Asp或者Glu；d.202位的替代氨基酸是Pro、Gln、Asn、Ser、Asp或者Glu；e.203位的替代氨基酸是Met、Cys、His、Pro、Gly、Gln、Asn、Ser、Asp或者Glu；f.204位的替代氨基酸是Glu；g.205位的替代氨基酸是Leu、Met、Cys、Ala、His、Thr、Pro、Gly、Gln、Asn、Ser、Asp或者Glu；h.206位的替代氨基酸是Pro、Asn或者Ser；i.207位的替代氨基酸是Asp或者Glu；j.208位的替代氨基酸是Pro、Gly、Gln、Asn、Ser、Asp或者Glu；k.209位的替代氨基酸是Ile、Val、Met、Cys、Ala、His、Thr、Pro、Gly、Gln、Asn、Ser、Asp或者Glu；1.210位的替代氨基酸是Gly、Gln、Asn、Ser、Asp或者Glu；m.211位的替代氨基酸是Ala、Pro、Gln、Asn、Ser、Asp或者Glu；n.212位的替代氨基酸是Gln、Ser、Asp或者Glu；o.213位的替代氨基酸是Trp、Phe、Tyr、Leu、Ile、Val、Met、Cys、Ala、His、Pro、Gly、Gln、Asn、Ser、Asp或者Glu；p.214位的替代氨基酸是Phe、Leu、Ile、Val、Met、Cys、Ala、His、Pro、Gly、Gln、Asn、Asp或者Glu；q.215位的替代氨基酸是Thr、Pro、Gln、Asn、Ser、Asp或者Glu；r.216位的替代氨基酸是His、Thr、Pro、Gly、Gln、Asn、Ser、Asp或者Glu；s.218位的替代氨基酸是Glu；t.219位的替代氨基酸是Pro、Gln、Asn、Ser、Asp或者Glu；以及u.220位的替代氨基酸是Pro、Gly、Gln、Asn、Asp或者Glu；其特征在于BPN′變體與野生型枯草桿菌蛋白酶BPN′相比其降低了對不溶性底物的吸收作用并且增加了對不溶性底物的水解作用。
2.根據(jù)權利要求1的BPN′變體，其特征在于a.206位的替代氨基酸是Asn或者Ser；b.211位的替代氨基酸是Pro、Gln、Asn、Ser、Asp或者Glu；c.214位的替代氨基酸是Leu、Ile、Val、Met、Cys、Ala、His、Pro、Gly、Gln、Asn、Asp或者Glu；d.215位的替代氨基酸是Pro、Gln、Asn、Ser、Asp或者Glu。
3.根據(jù)權利要求2的BPN′變體，其特征在于用Gly替代216位的Ala。
4.根據(jù)權利要求2的BPN′變體，其特征在于199、200、201、202、203、205、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、219或者220中任一位置的替代氨基酸是Asp或者Glu；并且204或218位置的替代氨基酸是Glu；其中優(yōu)選地是在199、200、201、202、205、207、208、209、210、211、212或者215位中一個或多個位置上替代，更優(yōu)選地是在200、201、202、205或207位中一個或多個位置上替代。
5.具有單一的氨基酸替代的根據(jù)權利要求1的BPN′變體，其特征在于所述替代是a.在213位用Glu替代Lys，b.在216位用Glu替代Ala，c.在216位用Asp替代Ala，d.在204位用Glu替代Ser，或者e.在203位用Glu替代Val。
6.含有野生型氨基酸序列的BPN′變體，其特征在于該野生型氨基酸序列的第199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219或者220位中的兩個或多個位置被替代，其中a.199位的替代氨基酸是Cys、Ala、His、Thr、Pro、Gly、Gln、Asn、Ser、Asp或者Glu；b.200位的替代氨基酸是His、Thr、Pro、Gly、Gln、Asn、Ser、Asp或者Glu；c.201位的替代氨基酸是Gly、Gln、Asn、Ser、Asp或者Glu；d.202位的替代氨基酸是Pro、Gln、Asn、Ser、Asp或者Glu；e.203位的替代氨基酸是Met、Cys、Ala、His、Thr、Pro、Gly、Gln、Asn、Ser、Asp或者Glu；f.204位的替代氨基酸是Asp或者Glu；g.205位的替代氨基酸是Leu、Val、Met、Cys、Ala、His、Thr、Pro、Gly、Gln、Asn、Ser、Asp或者Glu；h.206位的替代氨基酸是Pro、Asn、Ser、Asp或者Glu；i.207位的替代氨基酸是Asp或者Glu；j.208位的替代氨基酸是Pro、Gly、Gln、Asn、Ser、Asp或者Glu；k.209位的替代氨基酸是Ile、Val、Met、Cys、Ala、His、Thr、Pro、Gly、Gln、Asn、Ser、Asp或者Glu；l.210位的替代氨基酸是Ala、Gly、Gln、Asn、Ser、Asp或者Glu；m.211位的替代氨基酸是Ala、Pro、Gln、Asn、Ser、Asp或者Glu；n.212位的替代氨基酸是Gln、Ser、Asp或者Glu；o.213位的替代氨基酸是Trp、Phe、Tyr、Leu、Ile、Val、Met、Cys、Ala、His、Thr、Pro、Gly、Gln、Asn、Ser、Asp或者Glu；p.214位的替代氨基酸是Phe、Leu、Ile、Val、Met、Cys、Ala、His、Thr、Pro、Gly、Gln、Asn、Ser、Asp或者Glu；q.215位的替代氨基酸是Thr、Pro、Gln、Asn、Ser、Asp或者Glu；r.216位的替代氨基酸是His、Thr、Pro、Gly、Gln、Asn、Ser、Asp或者Glu；s.217位的替代氨基酸是Leu、Ile、Val、Met、Cys、Ala、His、Thr、Pro、Gly、Gln、Asn、Ser、Asp或者Glut.218位的替代氨基酸是Gln、Ser、Asp或者Glu；u.219位的替代氨基酸是Pro、Gln、Asn、Ser、Asp或者Glu；以及v.220位的替代氨基酸是Pro、Gly、Gln、Asn、Ser、Asp或者Glu；其特征在于BPN′變體與野生型枯草桿菌蛋白酶BPN′相比，其降低了對不溶性底物的吸附作用，并且增加了對不溶性底物的水解作用。
7.根據(jù)權利要求6的BPN′變體，其具有雙氨基酸替代。
8.根據(jù)權利要求7的雙氨基酸替代的BPN′變體，其特征在于該雙替代是a.用Ala替代210位的Pro，用Thr替代215位的Gly；b.用Phe替代214位的Tyr，用Asn替代217位的Tyr；c.用Glu替代206位的Gln，用Glu替代216位的Ala；d.用Glu替代216位的Ala，用Leu替代217位的Tyr；e.用Glu替代206位的Gln，用leu替代217位的Tyr；f.用Glu替代206位的Gln，用Glu替代213位的Lys；g.用Glu替代213位的Lys，用Leu替代217位的Tyr；h.用Leu替代205位的Ile，用Glu替代216位的Ala；或者i.用Leu替代205位的Ile，用Asp替代216位的Ala；
9.根據(jù)權利要求7的BPN′變體，其特征在于a.206位的替代氨基酸是Asn或者Ser；b.210位的替代氨基酸是Gly、Gln、Asn、Ser、Asp或者Glu；c.211位的替代氨基酸是Pro、Gln、Asn、Ser、Asp或者Glu；d.214位的替代氨基酸是Leu、Ile、Val、Met、Cys、Ala、His、Pro、Gly、Gln、Asn、Asp或者Glu；以及e.215位的替代氨基酸是Pro、Gln、Asn、Ser、Asp或者Glu；且其中替代較好發(fā)生在199、200、201、202、205、207、208、209、210、211、212或者215位中的二個或多個位置，更好是在200、201、202、205或207位中的二個或多個位置。
10.根據(jù)權利要求9的BPN′變體，其特征在于199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219或者220位中任一位的替代氨基酸是Asp或者Glu。
11.根據(jù)權利要求10的BPN′變體，其特征在于用Glu替代213位的Lys，并且用Glu替代216位的Ala。
12.根據(jù)權利要求6的BPN′變體，其具有三個氨基酸替代。
13.根據(jù)權利要求12的具有三個氨基酸替代的BPN′變體，其特征在于該三個替代是a.用Pro替代206位的Gln，用Ala替代211位的Gly，并且用Glu替代216位的Ala；b.用Val替代205位的Ile，用Ala替代210位的Pro，并且用Glu替代213位的Lys；c.用Glu替代206位的Gln，用Glu替代216位的Ala，并且用Leu替代217位的Tyr；d.用Glu替代206位的Gln，用Glu替代213位的Lys，并且用Leu替代217位的Tyr；或者e.用Glu替代213位的Lys，用Glu替代216位的Ala，并且用Leu替代217位的Tyr。
14.根據(jù)權利要求6的BPN′變體，其具有四或五個氨基酸替代。
15.根據(jù)權利要求14的具有四個替代的BPN′變體，其特征在于該四個替代是a.用Ala替代210位的Pro，用Glu替代213位的Lys，用Glu替代216位的Ala，并且用Leu替代217位的Tyr；b.用Glu替代206位的Gln，用Glu替代213位的Lys，用Glu替代216位的Ala，并且用Leu替代217位的Tyr；或者c.用Glu替代204位的Ser，用Glu替代206位的Gln，用Glu替代216位的Ala，并且用Leu替代217位的Tyr。
16.根據(jù)權利要求l4的具有五個替代的BPN′變體，其特征在于這五個替代是a.用Leu替代205位的Ile，用Ala替代210位的Pro，用Glu替代213位的Lys，用Glu替代216位的Ala，以及用Leu替代217位的Tyr；或者b.用Glu替代204位的Ser，用Glu替代206位的Gln，用Glu替代213位的Lys，用Glu替代216位的Ala，并用Leu替代217位的Tyr。
17.選自于硬表面清潔組合物、碗碟清洗組合物、口腔清潔組合物、假牙清洗組合物以及隱形眼鏡清潔組合物的清潔組合物，其特征在于該清潔組合物含有權利要求1、7、12或14的BPN′變體以及清潔組合物載體。
18.硬表面清潔組合物，其含有權利要求1、7、12或14的BPN′變體以及硬表面清潔載體。
19.突變的BPN′基因，其編碼權利要求1、7、12或14的BPN′變體。
全文摘要
本發(fā)明涉及枯草桿菌蛋白酶BPN′變體，該變體在第199—220位中含有與野生型枯草桿菌蛋白酶BPN′不相同的至少一個或多個氨基酸位置(即替代)，從而該BPN′變體與野生型枯草桿菌蛋白酶BPN相比降低了對不溶性底物的吸附作用并增加了水解不溶性底物的能力。
文檔編號A61K8/66GK1134728SQ94194071
公開日1996年10月30日 申請日期1994年8月31日 優(yōu)先權日1993年9月15日
發(fā)明者P·F·布羅, B·L·巴內(nèi)特, D·N·盧賓 申請人:普羅格特-甘布爾公司