專利名稱：含蛋白酶的洗滌組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及含有新的蛋白酶的多種洗滌組合物，這些蛋白酶是羰基水解酶的變種。
背景酶組成最大一類天然存在的蛋白質(zhì)。每類酶一般催化(加速反應(yīng)而沒有被消耗)一種不同的化學(xué)反應(yīng)。有一類被稱為蛋白酶的酶，由于它們具有能夠水解(及把一個化合物分解成兩個或更多個較簡單的化合物，并把水分子的H和OH部分分別吸收在碎裂的化學(xué)鍵的兩邊)其它蛋白質(zhì)的能力而為人所知。這種水解蛋白質(zhì)的能力已被利用來把天然界存在的蛋白酶和經(jīng)過蛋白質(zhì)工程加工過的蛋白酶，作為一種添加劑并入到洗衣用的洗滌劑制品之中。許多衣服上的污漬是蛋白質(zhì)性的，因此廣譜蛋白酶能使得除去這類污漬的能力得到重大的改進(jìn)。
不幸，這些蛋白質(zhì)在它們的天然的細(xì)菌環(huán)境中的有效濃度，常常不能被轉(zhuǎn)移到相對非自然的洗滌環(huán)境中。特別是，蛋白酶的特性諸如熱穩(wěn)定性、pH穩(wěn)定性、氧化穩(wěn)定性和底物專一性等，在酶的自然環(huán)境以外不能必然地被優(yōu)化來加以利用。
蛋白酶的氨基酸序列決定了蛋白酶的特性。蛋白酶氨基酸序列的變化可能在不同程度上改變酶的性質(zhì)，甚至可能使酶失活，這取決于在氨基酸序列中變化的位置、性質(zhì)和/或數(shù)值。已經(jīng)采用了一些方法來改變酶的氨基酸序列，企圖改進(jìn)它們的性質(zhì)，其目的在于增進(jìn)蛋白酶在諸如洗衣環(huán)境中的洗滌用途時的效率。這些方法包括改變氨基酸序列來增進(jìn)熱穩(wěn)定性以及在很不相同的條件下改進(jìn)氧化穩(wěn)定性。
雖然在本領(lǐng)域中已經(jīng)敘述過種種方法，但仍然繼續(xù)需要新的有效的蛋白酶變種來應(yīng)用于洗滌各種表面。因此本發(fā)明的一個目的是提供一種含有蛋白酶的洗滌組合物，這種蛋白酶是具有改進(jìn)的解蛋白活度、底物專一性、穩(wěn)定性和/或增進(jìn)的品質(zhì)特性的羰基水解酶變種。從以下的詳盡描述中，這些目的以及其它目的將很快變得很明顯。
發(fā)明概要本發(fā)明涉及洗滌組合物，它含有(a)有效量的一種蛋白酶，它是一種具有天然界未曾發(fā)現(xiàn)過的氨基酸序列的羰基水解酶的變種，是通過用不同的氨基酸置換前體羰基水解酶中的多種氨基酸殘基而衍生出來的，其中在前體酶中被置換的多個氨基酸殘基位置相應(yīng)于位置+76與一種或多種下列殘基位置的結(jié)合+99、+101、+103、+104、+107、+123、+27、+105、+109、+126、+128、+135、+156、+166、+195、+197、+204、+206、+210、+216、+217、+218、+222、+260、+265和/或+274，這里數(shù)字標(biāo)明的位置相應(yīng)于天然存在的由解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)得到的枯草溶菌素中的位置，或相應(yīng)于在其它羰基水解酶或枯草溶菌素(諸如遲緩芽孢桿菌(Bacillus lentus)枯草溶菌素)中等價的氨基酸殘基；和(b)一種或多種可與蛋白酶配伍的洗滌組合物材料。
本發(fā)明也涉及洗滌需要洗滌的物品的方法，它是通過使所說的物品與這里描述的是一種羰基水解酶變種的蛋白酶進(jìn)行接觸而完成的。因此本發(fā)明包括一種洗滌織物的方法，它包括最好是在攪拌條件下，使所說的織物與含有所說的蛋白酶的水溶液進(jìn)行接觸。這方法可在低于大約60℃以下的溫度下進(jìn)行，但是在直到沸點(diǎn)的洗衣溫度下當(dāng)然也是很有效的。本發(fā)明還涉及洗滌碗碟的方法，即把需要洗滌的碗碟與這里描述的蛋白酶接觸。本發(fā)明的方法也涉及人身洗滌的方法，所說的方法包括把人類或較低等動物身體需要洗滌的部分與這里描述的蛋白酶接觸。
附圖簡述

圖1A～C描繪的是解淀粉芽孢桿菌枯草溶菌素的DNA和氨基酸序列以及這一基因的部分限制基因圖譜(Seq.ID No.6)。
圖2描繪的是在由解淀粉芽孢桿菌(BPN′)和遲緩芽孢桿菌(野生型)得來的枯草溶菌素中保存的氨基酸殘基。
圖3A和3B描繪的是四種枯草溶菌素的氨基酸序列。最上一行代表由解淀粉芽孢桿菌枯草溶菌素(有時也稱為枯草溶菌素BPN′)中析離的枯草溶菌素的氨基酸序列(Seq.ID No.7)。第二行描繪由枯草桿菌(Bacillus subtilis)析離的枯草溶菌素的氨基酸序列(Seq.ID No.8)。第三行描繪由地衣芽孢桿菌(B.Licheniformis)析離的氨基酸序列(Seq.ID No.9)。第四行描繪了由遲緩芽孢桿菌(Bacillus lentus)析離的枯草溶菌素(在PCT WO89/06276中也被稱為枯草溶菌素309)的氨基酸序列(Seq.IDNo.10)。符號*表明與枯草溶菌素BPN′比較不存在這一特定的氨基酸殘基。
圖4描繪了質(zhì)粒GGA274的構(gòu)造。
圖5描繪了GGT274的構(gòu)造，它是為可靠表達(dá)用于本申請的質(zhì)粒的一個中間體。
圖6A和圖6B描繪了由遲緩芽孢桿菌析離的枯草溶菌素的DNA和氨基酸序列(Seq.ID No.11)。成熟的枯草溶菌素蛋白質(zhì)是在相應(yīng)于Ala的密碼子GCG(334～336)處開始通過密碼子編碼的。
圖7A和7B描繪了本發(fā)明經(jīng)優(yōu)選的實(shí)施方案中的DNA和氨基酸序列(N 76D/S103A/V104I)(Seq.ID No.12)。這圖中的DNA已用在位置76的天冬氨酸、在位置103的丙氨酸和在位置104的異亮氨酸編碼時所描述的方法進(jìn)行修飾。成熟的枯草溶菌素變種蛋白質(zhì)是在相應(yīng)于Ala的密碼子GCG(334～336)處開始通過密碼子編碼的。
圖8描繪了載體pBCDAICAT的構(gòu)造。
圖9描繪了載體pUCCATFNA的構(gòu)造。
圖10表明經(jīng)優(yōu)選的突變體酶在液體洗滌劑配方中比野生型的有更好的穩(wěn)定性。
發(fā)明詳述(1)蛋白酶本發(fā)明包括蛋白酶，它是天然界不存在的羰基水解酶變種，它和它的氨基酸序列與由之衍生的前體羰基水解酶相比，具有不同的解蛋白活度、穩(wěn)定性、底物特異性、pH性能和/或品質(zhì)特性。前體羰基水解酶可以是一種天然界存在的羰基水解酶或重組體水解酶。具體地說，這類羰基水解酶變種具有在天然界未發(fā)現(xiàn)過的氨基酸序列，它是用不同的氨基酸來置換前體羰基水解酶中的多個氨基酸殘基而衍生出來的。這多個前體酶中的氨基酸殘基相應(yīng)于位置+76以及一種或多種下列殘基的位置+99、+101、+103、+104、+107、+123、+27、+105、+109、+126、+128、+135、+156、+166、+195、+197、+204、+206、+210、+216、+217、+218、+222、+260、+265和/或+274，這里數(shù)字標(biāo)示的位置相應(yīng)于天然界存在的由解淀粉芽孢桿菌析離的枯草溶菌素中的位置或其它羰基水解酶或枯草溶菌素，諸如遲緩芽孢桿菌枯草溶菌素中等價的氨基酸殘基的位置。
用于本發(fā)明組合物中的羰基水解酶變種是一種蛋白酶，它包括置換+76位置的氨基酸殘基并結(jié)合一種或多種別的修飾。最好是用于本發(fā)明的變種蛋白酶包括置換、刪除或插入下列組合的氨基酸殘基76/99；76/101；76/103；76/104；76/107；76/123；76/99/101；76/99/103；76/99/104；76/101/103；76/101/104；76/103/104；76/104/107；76/104/123；76/107/123；76/99/101/103；76/99/101/104；76/99/103/104；76/101/103/104；76/103/104/123；76/104/107/123；76/99/101/103/104；76/99/103/104/123；76/99/101/103/104/123；76/103/104/128；76/103/104/260；76/103/104/265；76/103/104/197；76/103/104/105；76/103/104/135；76/103/104/126；76/103/104/107；76/103/104/210；76/103/104/126/265；和/或76/103/104/222.最優(yōu)選地是用于本發(fā)明的變種酶包括置換、刪除或插入下列氨基酸殘基的組合，即解淀粉芽孢桿菌枯草溶菌素的76/99；76/104；76/99/104； 76/103/104； 76/104/107； 76/101/103/104；76/99/101/103/104和76/101/104。
編碼這類羰基水解酶或枯草溶菌素變種的變種DNA序列是由編碼天然存在的或重組體前體酶的前體DNA序列所衍生的。這種變種DNA序列是通過修飾前體DNA序列來編碼置換一種或多種特定的、被前體DNA序列編碼的相應(yīng)于解淀粉芽孢桿菌中下列位置的氨基酸殘基或它們的組合而衍生出來的76、99、101、103、104、107、123、27、105、109、126、128、135、156、166、195、197、204、206、210、216、217、218、222、260、265和/或274。雖然這里為修飾而鑒定的氨基酸殘基是按照可應(yīng)用于解淀粉芽孢桿菌(它已成為在所有枯草溶菌素中慣常使用的鑒定殘基位置的方法)中的數(shù)碼標(biāo)志，但用于本發(fā)明的經(jīng)優(yōu)選的前體DNA序列是如圖6所示的遲緩芽孢桿菌的DNA序列(Seq.ID No.11)。
這些變種DNA序列編碼插入或取代氨基酸殘基76并結(jié)合一種或多種另外的修飾。最好是變種DNA序列編碼取代或插入下列組合的氨基酸殘基76/99；76/101；76/103；76/104；76/107；76/123；76/99/101；76/99/103；76/99/104；76/101/103；76/101/104；76/103/104；76/104/107；76/104/123；76/107/123；76/99/101/103；76/99/101/104；76/99/103/104；76/101/103/104；76/103/104/123；76/104/107/123；76/99/101/103/104；76/99/103/104/123；76/99/101/103/104/123；76/103/104/128；76/103/104/260；76/103/104/265；76/103/104/197；76/103/104/105；76/103/104/135；76/103/104/126；76/103/104/107；76/103/104/210；76/103/104/126/265；和/或76/103/104/222.最優(yōu)選地是變種DNA序列編碼修飾下列殘基的組合76/99；76/104； 76/99/104； 76/103/104； 76/104/107； 76/101/103/104；76/99/101/103/104和76/101/104。這些重組體DNA序列編碼具有新的氨基酸序列的羰基水解酶變種，并且一般至少有一種性質(zhì)是和被前體羰基水解酶DNA序列編碼的酶的同一性質(zhì)有實(shí)質(zhì)上的不同。這類性質(zhì)包括解蛋白活度、底物專一性、穩(wěn)定性、變化了的pH特性和/或增進(jìn)的品質(zhì)特性等。
這里有用的蛋白酶包括在指明的氨基酸殘基位置上用天然存在的19種L-氨基酸中的任何一種進(jìn)行置換的產(chǎn)物。這樣的置換可以在任何前體枯草溶菌素(原核生物的、真核生物的、哺乳動物的等)中進(jìn)行。貫穿整個本申請書都是用通常的一個和三個字母代號來表示各個氨基酸的。這樣的代號已在Dale，J.W(1989)所著的“Molecular Genetics of Bacteria”(細(xì)菌的分子遺傳學(xué))一書的附錄B中認(rèn)定，John Wiley & Sons，Ltd.出版。
最好是，在每個認(rèn)定的氨基酸殘基位置上進(jìn)行的置換包括但不僅限于在位置76的置換包括D、H、E、G、F、K、P和N；在位置99的置換包括D、T、N、Q、G和S；在位置101的置換包括G、D、K、L、A、E、S和R；在位置103的置換包括Q、T、D、E、Y、K、G、R、S和A；在位置104的置換包括所有19種天然界存在的氨基酸；在位置107的置換包括V、L、M、Y、G、E、F、T、S、A、N和I；在位置123的置換包括N、T、I、G、A、C和S；在位置27的置換包括K、N、C、V和T；在位置105的置換包括A、D、G、R和N；在位置107的置換包括A、L、V、Y、G、F、T、S和A；在位置109的置換包括S、K、R、A、N和D；在位置126的置換包括A、F、I、V和G；在位置128的置換包括G、L和A；在位置135的置換包括A、F、I、S和V；在位置156的置換包括D、E、A、G、Q和K；在位置166的置換包括所有天然界存在的19種氨基酸；在位置195的置換包括E；在位置197的置換包括E；在位置204的置換包括A、G、C、S和D；在位置206的置換包括L、Y、N、D和E；在位置210的置換包括L、I、S、C和F；在位置216的置換包括V、E、T和K；在位置217的置換包括所有天然界存在的19種氨基酸；在位置218的置換包括S、A、G、T和V；在位置222的置換包括所有天然界存在的19種氨基酸；在位置260的置換包括P、N、G、A、S、C、K和D；在位置265的置換包括N、G、A、S、C、K、Y和H；在位置274的置換包括A和S。在每個這樣的位置上被置換的特別優(yōu)選的氨基酸被列出在下面的表1中。在表1中雖然指明了具體的氨基酸，但應(yīng)該理解在認(rèn)定的殘基位置上任何一種氨基酸都可被置換。
表I氨基酸被置換/插入的殘基 經(jīng)優(yōu)選的氨基酸+76 D，H+99 D，T，N，G+101 R，G，D，K，L，A，E+103 A，Q，T，D，E，Y，K，G，R+104 I，Y，S，L，A，T，G，F(xiàn)，M，W，D，V，N+107 V，L，Y，G，F(xiàn)，T，S，A，N+123 S，T，I+27 K+105 A，D+109 S，K，R+126 A，I，V，F(xiàn)+128 G，L+135 I，A，S+156 E，D，Q+166 D，G，E，K，N，A，F(xiàn)，I，V，L+195 E+197 E+204 A，G，C+206 L+210 I，S，C+216 V+217 H，I，Y，C，A，G，F(xiàn)，S，N，E，K+218 S+222 A，Q，S，C，I，K+260 P，A，S，N，G+265 N，A，G，S+274 A，S
這些包含在遲緩芽孢桿菌枯草溶菌素的等價于解淀粉芽孢桿菌枯草溶菌素+76氨基酸殘基位置上進(jìn)行過活體外變更的蛋白酶產(chǎn)生出枯草溶菌素變種，它呈現(xiàn)出超過其前體枯草溶菌素的穩(wěn)定性(例如，經(jīng)改進(jìn)的自解蛋白穩(wěn)定性)(參見表IV和表VI)。
同樣，在等價于解淀粉芽孢桿菌枯草溶菌素的+99、+101、+103、+104、+107、+123、+27、+105、+109、+126、+128、+135、+156、+166、+195、+197、+204、+206、+210、+216、+217、+218、+222、+260、+265和/或+274的殘基位置上進(jìn)行活體外的變更，無論單獨(dú)地或相互結(jié)合并與+76位置的變更作任意組合，都會產(chǎn)生枯草溶菌素變種，它們呈現(xiàn)改變了的解蛋白活度、改變了的熱穩(wěn)定性、改變了的pH特性、改變了的底物專一性和/或改變了的品質(zhì)特性。
羰基水解酶是能水解含有 鍵的化合物的蛋白酶，式中的X是氧或氮。它們包括天然界存在的羰基水解酶以及羰基水解酶的重組體。天然界存在的羰基水解酶主要包括水解酶，例如肽水解酶諸如枯草溶菌素或金屬蛋白酶。肽水解酶包括α-氨基?；乃饷?、肽基氨基酸水解酶、?；被饷?、絲氨酸羧肽酶、金屬羧肽酶、硫羥蛋白酶、羧基蛋白酶和金屬蛋白酶。絲氨酸、金屬、硫羥和羧酸蛋白酶以及內(nèi)型和外型蛋白酶都被包括在內(nèi)。
“重組體羰基水解酶”是指這樣的羰基水解酶，其中編碼天然存在的羰基水解酶的DNA序列被修飾以產(chǎn)生一種突變種DNA序列，它編碼時在羰基水解酶氨基酸序列中進(jìn)行置換、插入或刪去一種或多種氨基酸。合適的修飾方法已在這里被公開，也已在美國專利4,760,025(RE 34,606)、美國專利5,204,015以及美國專利5,185,258中被公開，這些專利的公開內(nèi)容在此引入作為參考。
枯草溶菌素是細(xì)菌或霉菌的羰基水解酶，它一般地作用是斷裂蛋白質(zhì)或多肽的肽鍵。像這里使用的那樣，“枯草溶菌素”意指天然界存在的枯草溶菌素或一種重組體枯草溶菌素。已知有各種微生物物種能產(chǎn)生和常常分泌出一系列的天然存在的枯草溶菌素。這一系列中的成員的氨基酸序列不完全是同源的。但是，在這一系列中的枯草溶菌素呈現(xiàn)出相同或相似類型的解蛋白活度。這類絲氨酸蛋白酶共享有一種定義催化三單元組的共同的氨基酸序列，以此把它們與糜蛋白酶相關(guān)類別的絲氨酸蛋白酶相區(qū)別。枯草溶菌素和糜蛋白酶相關(guān)的絲氨酸蛋白酶二者都有包含天冬氨酸、組氨酸和絲氨酸的催化三單元組。在枯草溶菌素相關(guān)的蛋白酶中，這些氨基酸的相對次序，從氨基端讀到羧基端是天冬氨酸-組氨酸-絲氨酸。但是在糜蛋白酶相關(guān)的蛋白酶中，這種相對次序是組氨酸-天冬氨酸-絲氨酸。這樣，這里的枯草溶菌素是指一種具有枯草溶菌素相關(guān)的蛋白酶的催化三單元組的絲氨酸蛋白酶。實(shí)例包括但不限于這里的圖3中所認(rèn)定的那些枯草溶菌素。
“重組體枯草溶菌素”是指這樣一種枯草溶菌素，其中編碼這種枯草溶菌素的DNA系列被修飾以產(chǎn)生一種變種(或突變種)DNA系列，它編碼時在天然存在的枯草溶菌素氨基酸序列中置換、刪去或插入一種或多種氨基酸。產(chǎn)生這類修飾的合適的方法，并且它也可以和這里所公開的方法結(jié)合，已被包括在美國專利4,760,025(RE 34,606)、美國專利5,204,015和美國專利5,185,258的公開內(nèi)容中。
“非人類羰基水解酶”以及對它們編碼的DNA，可以由多種原核生物的和真核生物的生物體中得到。原核生物的生物體的合適的實(shí)例包括格蘭氏陰性生物體諸如大腸桿菌(E.Coli)或假單胞菌屬(Pseudomonas)以及格蘭氏陽性細(xì)菌諸如微球菌屬(Micrococcus)或桿菌。真核生物的生物體，從中可以得到羰基水解酶和它們的基因，其實(shí)例包括酵母諸如啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、霉菌諸如麴菌(Aspergillus sp.)，以及非人類哺乳動物來源諸如，例如，小牛(bovine sp.)，從中可得到編碼羰基水解酶凝乳酶的基因。像用枯草溶菌素那樣，從各種有關(guān)的物種中可得到一系列的羰基水解酶，這些物種在它們系列的成員之間含有的氨基酸序列不完全是同源的，但卻無論如何呈現(xiàn)出相同或相似類型的生物活性。例如，這里使用的非人類的羰基水解酶具有一種功能定義，是專指直接或間接地與原核生物或真核生物源締合的羰基水解酶。
一種“羰基水解酶變種”具有從“前體羰基水解酶”的氨基酸序列衍生的氨基酸序列。前體羰基水解酶(諸如一種枯草溶菌素)包括天然存在的羰基水解酶(枯草溶菌素)和重組體羰基水解酶(枯草溶菌素)。羰基水解酶變種的氨基酸序列是由前體水解酶的氨基酸序列通過置換、刪去或插入一種或多種前體氨基酸序列中的氨基酸而“衍生”出來的。這樣的修飾是對前體羰基水解酶(枯草溶菌素)的氨基酸序列編碼的“前體DNA序列”進(jìn)行的，而不是修改前體羰基水解酶(枯草溶菌素)的酶本身。這類修改前體DNA序列的合適的方法包括這里公開的方法以及本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的方法(參看，例如，EPO 328299、WO 89/06279以及這里已引入作為參考的美國專利和申請書)。
這里作為變更，認(rèn)定了相應(yīng)于解淀粉芽孢桿菌枯草溶菌素的位置+76與一種或多種下列位置組合的具體殘基+99，+101，+103，+104，+107，+123，+27，+105，+109，+126，+128，+135，+156，+166，+195，+197，+204，+206，+210，+216，+217，+218，+222，+260，+265 and/or+274。最好是修飾的殘基是選自下列組合76/99；76/101；76/103；76/104；76/107；76/123；76/99/101；76/99/103；76/99/104；76/101/103；76/101/104；76/103/104；76/104/107；76/104/123；76/107/123；76/99/101/103；76/99/101/104；76/99/103/104；76/101/103/104；76/103/104/123；76/104/107/123；76/99/101/103/104；76/99/103/104/123；76/99/101/103/104/123；76/103/104/128；76/103/104/260；76/103/104/265；76/103/104/197；76/103/104/105；76/103/104/135；76/103/104/126；76/103/104/107；76/103/104/210；76/103/104/126/265；和/或76/103/104/222；最優(yōu)選的組合是76/99；76/104；76/99/104；76/103/104；76/104/107；76/101/103/104；76/99/101/103/104；和76/101/104。這些氨基酸位置數(shù)碼是指那些在圖1中提供的指定給成熟的解淀粉芽孢桿菌的枯草溶菌素的序列。但用于本發(fā)明的蛋白酶并不僅限于這一特定的枯草溶菌素的突變體，而是擴(kuò)展為在“等價”于解淀粉芽孢桿菌枯草溶菌素中特別認(rèn)定的殘基位置上含有氨基酸殘基的前體羰基水解酶。最好是，前體枯草溶菌素是遲緩芽孢桿菌枯草溶菌素，并且在遲緩芽孢桿菌中相應(yīng)于上面列出的等價的氨基酸殘基位置上進(jìn)行置換、刪去或插入。
前體羰基水解酶的一個殘基(氨基酸)等價于解淀粉芽孢桿菌枯草溶菌素的一個殘基，如果它對于解淀粉芽孢桿菌枯草溶菌素中那個具體的殘基或殘基的部分是同系的(即在一級或三級結(jié)構(gòu)中有位置的對應(yīng)性)或類似的(即具有相同或相似的對于結(jié)合、反應(yīng)或化學(xué)相互作用等的功能能力)。
為確立對一級結(jié)構(gòu)的同系性，前體羰基水解酶的氨基酸序列被直接與解淀粉芽孢桿菌枯草溶菌素的一級序列以及特別是一系列已知是枯草溶菌素中不變更的殘基進(jìn)行比較，這些不變更的殘基的序列是已知的。這里的圖2顯示了解淀粉芽孢桿菌枯草溶菌素和遲緩芽孢桿菌枯草溶菌素之間保存的殘基。在校準(zhǔn)保存的殘基并允許進(jìn)行必要的插人和刪去以維持順序之后(即避免保存的殘基經(jīng)由任意的刪去和插入而消除)，即定義了等價于解淀粉芽孢桿菌枯草溶菌素的一級序列中特定的氨基酸殘基。保存的殘基的校準(zhǔn)最好應(yīng)保存100％的這類殘基。但是大于75％或甚至少至50％的保存殘基的校準(zhǔn)也適宜于定義等價殘基。應(yīng)堅持保存催化三單元組Asp32/His64/Ser221。
例如，在圖3中校準(zhǔn)了來自解淀粉芽孢桿菌、枯草桿菌、地衣芽孢桿菌(carlsbergensis)和遲緩芽孢桿菌的枯草溶菌素的氨基酸序列，以提供氨基酸序列之間最大量的同系現(xiàn)象。比較這些序列顯示在每種序列中都含有一些保存的殘基。這些保存的殘基(如BPN′和遲緩芽孢桿菌之間)已在圖2中被認(rèn)定。
這樣，這些保存的殘基即可被用來定義在別的羰基水解酶諸如來自遲緩芽孢桿菌(1989年7月13日發(fā)布的PCT Publication No.WO 89/06279)的枯草溶菌素中相應(yīng)的等價于解淀粉芽孢桿菌枯草溶菌素中的氨基酸殘基，這里經(jīng)優(yōu)選的枯草溶菌素前體酶，或稱作pB92(EP O 328299)的枯草溶菌素，是和優(yōu)選的遲緩芽孢桿菌枯草溶菌素高度同系的。這些枯草溶菌素中有一些的氨基酸序列在圖3A和3B中與解淀粉芽孢桿菌枯草溶菌素的序列校準(zhǔn)，以產(chǎn)生保存的殘基的最大同系現(xiàn)象。像能看到的那樣，與解淀粉芽孢桿菌枯草溶菌素比較，遲緩芽孢桿菌的序列中有一些刪去。這樣，例如，對于在解淀粉芽孢桿菌枯草溶菌素中的Val 165等價氨基酸，在別的枯草溶菌素如遲緩芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌的就是異亮氨酸了。
這樣，例如，解淀粉芽孢桿菌和遲緩芽孢桿菌兩種枯草溶菌素+76號氨基酸位置上的是天冬酰胺(N)。但是在用于本發(fā)明的經(jīng)優(yōu)選的枯草溶菌素變種中，等價于解淀粉芽孢桿菌枯草溶菌素中+76號位置的氨基酸則被天冬氨酸置換。為說明的目的，所有這里為置換認(rèn)定的氨基酸殘基與為每個這類位置進(jìn)行經(jīng)優(yōu)選的置換的比較被列于表II中。
表 II+76 +99 +101 +103 +104 +107 +123桿 菌 ND S Q Y IN(野生型)遲緩芽孢桿菌 NS S S V IN(野生型)最優(yōu)選的置換 DD R A L/Y VS等價殘基也可以在三級結(jié)構(gòu)的水平上通過為其三級結(jié)構(gòu)已被X射線晶體衍射法測定的前體羰基水解酶測定同系物來定義。等價殘基被定義為那些經(jīng)校準(zhǔn)后前體羰基水解酶和解淀粉芽孢桿菌枯草溶菌素的特定氨基酸殘基的兩個或多個主鏈原子(在N上的N、CA上的CA、C上的C和O上的O)的原子坐標(biāo)已在0.13納米之內(nèi)、最好是在0.1納米之內(nèi)的殘基。在最好的模型被定向、并且定位給出研究中的羰基水解酶與解淀粉芽孢桿菌枯草溶菌素的非氫蛋白質(zhì)原子的原子坐標(biāo)的最大重疊后，校準(zhǔn)即告完成。最好的模型是在可獲得的最高分辨率時實(shí)驗(yàn)衍射數(shù)據(jù)給出最低R因子的晶體模型。 其功能類似于解淀粉芽孢桿菌枯草溶菌素的特定殘基的等價殘基，被定義為前體羰基水解酶的那些氨基酸，它可采取這樣一種構(gòu)象，使它們或者能改變、修飾或起作用于蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，底物結(jié)合，或者以一定的方式催化并歸因于解淀粉芽孢桿菌枯草溶菌素的一種特定的殘基。進(jìn)一步，它們是前體羰基水解酶(其三級結(jié)構(gòu)已被X射線晶體衍射法測定)的那些殘基，它占據(jù)一個類似的位置到這種程度，使得雖然給定殘基的主鏈原子可能并不滿足基于占據(jù)同系的位置時等價性的標(biāo)準(zhǔn)，但至少有兩個殘基的側(cè)鏈原子的原子坐標(biāo)是位于解淀粉芽孢桿菌枯草溶菌素相應(yīng)的側(cè)鏈原子的0.13納米以內(nèi)。解淀粉芽孢桿菌枯草溶菌素的三維結(jié)構(gòu)的坐標(biāo)已陳列于EPO Publication No.0251446中(等價于美國專利申請SN08/212,291，它的公開內(nèi)容在此引入作為參考)，并可用來作為上述略圖，用來在三級結(jié)構(gòu)的水平上測定等價殘基。
有一些為置換、插入或刪去而認(rèn)定的殘基是保存的殘基，而另外一些則不是。在殘基不屬于保存殘基的情況下，一種或多種氨基酸的置換僅限于這樣的置換，即它產(chǎn)生的變種具有與在天然界中發(fā)現(xiàn)的不相對應(yīng)的氨基酸序列。在是保存殘基的情況下，這樣的置換不應(yīng)導(dǎo)致一種天然存在的序列。用于本發(fā)明的羰基水解酶變種包括羰基水解酶變種的成熟的形式，也包括這類水解酶變種的原型或預(yù)原型。預(yù)原型是優(yōu)選的構(gòu)造，因?yàn)樗苁刽驶饷缸兎N的表達(dá)、分泌和熟化變得容易。
“原序列”是指連接在羰基水解酶成熟形式的N端部分的氨基酸序列，當(dāng)除去它時導(dǎo)致出現(xiàn)羰基水解酶的“成熟”形式。許多在天然界發(fā)現(xiàn)的蛋白酶是轉(zhuǎn)移酶原的產(chǎn)物，并且在不存在后轉(zhuǎn)移過程時即以這種形式被表達(dá)。為生產(chǎn)羰基水解酶變種，具體地說枯草溶菌素變種的一種經(jīng)優(yōu)選的原序列是解淀粉芽孢桿菌枯草溶菌素的推定的原序列，雖然其它枯草溶菌素的原序列也可被使用。在實(shí)例中，是使用從遲緩芽孢桿菌(ATCC 21536)中得到的枯草溶菌素的推定的原序列。
一種“訊號序列”或“預(yù)序列”是指連接在羰基水解酶的N-端部分或原水解酶的N-端部分的任何氨基酸序列，它可能參與水解酶的成熟形式或原型的分泌。訊號序列的這種定義是功能性的，意謂包括所有那些被枯草溶菌素基因的N-端部分或別的在自然條件下參與使枯草溶菌素或別的羰基水解酶奏效的可分泌的羰基水解酶編碼的氨基酸序列。用于本發(fā)明的蛋白酶利用這樣的序列如這里敘述的那樣來影響羰基水解酶變種的分泌。在實(shí)例中使用的一種經(jīng)優(yōu)選的訊號序列包括熔合到從遲緩芽孢桿菌得到的枯草溶菌素(ATCC 21536)訊號序列的其余部分中的解淀粉芽孢桿菌枯草溶菌素訊號序列的頭七個氨基酸殘基。
一種“預(yù)原型”的羰基水解酶變種是由可用來連接在水解酶氨基末端的具有原序列的水解酶的成熟形式以及一種可用來連接在原序列的氨基末端的“預(yù)”或“訊號”序列所組成的。
“表達(dá)載體”是指含有一個可用來連接在合適的控制序列上的DNA序列的DNA構(gòu)造，這控制序列能在一種合適的宿主中影響所說的DNA的表達(dá)。這樣的控制序列包括一種影響轉(zhuǎn)錄的始發(fā)基因、一種供選擇的操縱序列用來控制這類轉(zhuǎn)錄、一種用來編碼合適的mRNA核蛋白體連接位置的序列和控制轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)譯的終止的序列。這種載體可以是一種質(zhì)粒、一種噬菌體粒子或簡單地就是一種潛在的基因組插入物。一旦轉(zhuǎn)移進(jìn)適當(dāng)?shù)乃拗髦校@種載體就可復(fù)制并獨(dú)立地行使宿主基因的功能，或者在某些情況下可以聯(lián)合到基因本身中去。在本說明書中，“質(zhì)?！焙汀拜d體”有時被交替使用，因?yàn)橘|(zhì)粒是目前最常使用的載體形式。但是，這里也包括這類表達(dá)載體的其它形式，它起著等價的功能并在本專業(yè)中是已知的或?qū)⒊蔀橐阎摹?br> 用于本發(fā)明的“宿主細(xì)胞”一般是原核生物或真核生物宿主，它們最好是用在美國專利4,760,025(RE 34,606)中公開的方法處理過，以使它們不能分泌酶活性的內(nèi)切蛋白酶。一種經(jīng)優(yōu)選的為表達(dá)枯草溶菌素的宿主細(xì)胞是桿菌菌株BG 2036，它缺乏酶活性的中性蛋白酶和堿性蛋白酶(枯草溶菌素)。菌株BG 2036的構(gòu)造以被美國專利5,264,366詳盡描述過。別的為表達(dá)枯草溶菌素的宿主細(xì)胞包括枯草桿菌I168(也已在美國專利4,760,025(RE34,606)和美國專利5,264,366中被描述過，它的公開內(nèi)容在此引入作為參考)，以及任何合適的桿菌菌株諸如地衣芽孢桿菌和遲緩芽孢桿菌等。
宿主細(xì)胞可用重組體DNA技術(shù)構(gòu)成的載體來進(jìn)行轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染。這類轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞既能復(fù)制編碼羰基水解酶的載體，也能表達(dá)所需的羰基水解酶變種。在編碼羰基水解酶變種的預(yù)型或預(yù)原型的情況下，這類變種當(dāng)被表達(dá)時即典型地被從宿主細(xì)胞分泌到宿主細(xì)胞介質(zhì)中去。
在描述兩種DNA區(qū)域之間關(guān)系時所用的術(shù)語“可用來連接的”簡單地意指它們在功能方面是彼此相關(guān)的。例如，一種預(yù)序列可用來連接到一種多肽上，如果它的功能是作為訊號序列，參與最可能涉及訊號序列斷裂的蛋白質(zhì)的成熟形式的分泌。一種始發(fā)基因可用來連接到編碼序列上，如果它控制序列的轉(zhuǎn)錄；一種核蛋白體連接位置可用來連接到編碼序列上，如果它這樣定位可允許進(jìn)行轉(zhuǎn)譯。
編碼天然界存在的前體羰基水解酶的基因可以按照本領(lǐng)域的技術(shù)人員眾所周知的一般方法來得到。這種方法一般包括合成具有編碼感興趣的水解酶區(qū)域的推定序列的標(biāo)記探頭、由表達(dá)這種水解酶的生物體中制備基因庫，并通過雜交到探頭上從庫中篩選出感興趣的基因。陽性雜交克隆然后被繪圖并序列化。用于實(shí)例中的遲緩芽孢桿菌基因可按美國專利5,185,258的實(shí)例1中所描述的方法克隆化，它的公開內(nèi)容在此引入作為參考。用于實(shí)例中的BPN基因可按RE34,606中實(shí)例1中所描述的方法克隆化，它的公開內(nèi)容在此引入作為參考。
克隆化的羰基水解酶然后被用來轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞以用來表達(dá)水解酶。水解酶基因然后被連接進(jìn)高拷貝數(shù)質(zhì)粒中。這種質(zhì)粒在宿主中在下述意義上復(fù)制，即它含有眾所周知的為質(zhì)粒復(fù)制所必需的要素一種可連接到研究中的基因上的始發(fā)基因(它可以基因本身的同系始發(fā)基因來提供，如果它被宿主識別，即被轉(zhuǎn)錄的話)、一個轉(zhuǎn)錄終止和多聚腺苷酸化區(qū)域(是為由來自某些真核生物宿主細(xì)胞中的水解酶基因的宿主轉(zhuǎn)錄的MRNA的穩(wěn)定性所必需的)、它是外源的或者可被水解酶基因的內(nèi)源終止區(qū)域提供，合乎需要的是，一種選擇基因諸如一種耐受抗菌素的基因，它通過在含有抗菌素的介質(zhì)中生長使被質(zhì)粒感染的宿主細(xì)胞得以連續(xù)培養(yǎng)維持。高拷貝數(shù)的質(zhì)粒也含有一種為宿主的復(fù)制來源，通過它能使大量質(zhì)粒得以在細(xì)胞質(zhì)中產(chǎn)生而沒有染色體的限制。但是，在本發(fā)明的范圍內(nèi)也包括把水解酶基因聯(lián)合多次拷貝到宿主基因組中去。這可通過用對同系重組特別敏感的原核生物和真核生物的生物體而變得容易。
用于本發(fā)明實(shí)例中的基因是天然的遲緩芽孢桿菌基因和天然的解淀粉芽孢桿菌基因。另外，一種合成的編碼天然存在的或突變體的前體羰基水解酶(枯草溶菌素)的基因也可被產(chǎn)生。在這樣一種方法中，前體水解酶(枯草溶菌素)的DNA和/或氨基酸序列被測定。此后多次、重疊的合成單股DNA片段即被合成出來，它經(jīng)雜交和連接作用而產(chǎn)生一種編碼前體水解酶的合成DNA。合成基因構(gòu)造的一個實(shí)例被發(fā)表于美國專利5,204,015的實(shí)例3中，它的公開內(nèi)容在此引入作為參考。
一旦天然界存在的或合成的前體羰基水解酶基因被克隆化，即可進(jìn)行一些修飾來增強(qiáng)超出合成天然界存在的前體羰基水解酶范圍以外的應(yīng)用。這類修飾包括生產(chǎn)重組體羰基水解酶，如美國專利4,760,025(RE 34,606)和EPO Publication No.0251446所公開的內(nèi)容以及這里描述的生產(chǎn)羰基水解酶變種。
下列盒式突變方法可用來使得用于本發(fā)明的羰基水解酶變種的構(gòu)造和鑒定變得容易，雖然也可使用其它包括位置定向誘變的方法。首先，天然存在的編碼這種水解酶的基因被獲得并進(jìn)行全部或部分地序列化。然后，序列在想要進(jìn)行變更(刪去、插入或置換)已編碼的酶中一種或多種氨基酸的一點(diǎn)上被校驗(yàn)。評估位于這一點(diǎn)側(cè)面的序列，看是否存在用一個低聚核苷酸池置換一個短的基因片段的限制性位點(diǎn)，該低聚核苷酸池當(dāng)被表達(dá)后將編碼各種突變體。這樣的限制性位點(diǎn)最好是在水解酶基因中的獨(dú)一無二的位置，以使基因片段的置換變得容易。但是，任何在水解酶基因中的不是過分冗長的方便的限制性位點(diǎn)都可以使用，只要是通過限制消化產(chǎn)生的基因碎片能被重新裝配在適當(dāng)?shù)男蛄兄小Ｈ绻谶x擇的位點(diǎn)的方便距離內(nèi)(10至15個核苷酸)不存在限制性位點(diǎn)，可在基因中以這樣的方式通過置換核苷酸來產(chǎn)生這樣的位點(diǎn)，即在最終的構(gòu)造中既沒有讀碼的改變，也沒有編碼氨基酸的改變。為改變它的序列以適合所需要的序列進(jìn)行的基因改變可按照一般已知的方法通過M13引物延伸來完成。確定合適的側(cè)面區(qū)域位置以及評估得出兩個方便的限制性位點(diǎn)序列所需要的變更的工作，可通過遺傳密碼的過剩、基因的限制酶略圖以及大量不同的限制酶而成為例行的常規(guī)工作。注意如果能獲得方便的位于限制性位點(diǎn)側(cè)面的位點(diǎn)，則上述方法只需要用來與不含一個位點(diǎn)的側(cè)面區(qū)域相連接。
一旦天然存在的DNA或合成的DNA被克隆化，位于要被變更的位置側(cè)面的限制性位點(diǎn)即用關(guān)連限制酶消化，許多末端端基互補(bǔ)的低聚核苷酸盒帶即被連接到基因中。誘變作用通過這種方法而被簡化，因?yàn)樗械牡途酆塑账岫伎蛇@樣來合成使具有同樣的限制性位點(diǎn)，并且不必用合成的連接來造成這種限制性位點(diǎn)。
如這里使用的，解蛋白活度被定義為每毫克活性酶中肽鍵的水解速率。已存在許多眾所周知的實(shí)驗(yàn)程序可用來測量解蛋白活度(參見K.M.Kalisz“Microbial Proteinase”，Advances inBiochemical Engineering/Biotechnology，A.Fiechter ed.，1988)(“微生物蛋白酶，高等生物化學(xué)工程/生物技術(shù)”，A.Fiechter出版，1988)。除了解蛋白活度以外，或者作為一種替代物來修飾解蛋白活度，本發(fā)明的變種酶還可以有其它的經(jīng)修飾的特性諸如Km、Kcat、Kcat/Km比率和/或經(jīng)修飾的底物專一性和/或經(jīng)修飾的pH活性特性。這些酶可以為預(yù)期存在的特定的底物而進(jìn)行剪裁，例如，為諸如洗衣用的水解過程中的底物。
一個目標(biāo)是保證得到一種與前體羰基水解酶比較具有改變了的解蛋白活度的變種羰基水解酶，因?yàn)檫@種活度的增加(數(shù)值增大)能更有效地使酶作用于目標(biāo)底物上。同樣感興趣的是與前體比較，具有改變了的熱穩(wěn)定性和/或改變了的底物專一性的變種酶。最好是被變更的羰基水解酶是一種枯草溶菌素。在枯草溶菌素類型的羰基水解酶中用來得到這樣的結(jié)果的具體氨基酸位置，等價于解淀粉芽孢桿菌枯草溶菌素中的+76、+99、+101、+103、+104、+107、+123、+27、+105、+109、+126、+128、+135、+156、+166、+195、+197、+204、+206、+210、+216、+217、+218、+222、+260、+265和/或+274，或者它們的任意組合，這些氨基酸在實(shí)例中提供。在一些場合中，可能需要較低的解蛋白活度。相反，在另一些場合中則可能需要變種酶的解蛋白活度比它的前體更高。另外，還可能期望增加或降低(改變)變種的無論是對堿還是對熱的穩(wěn)定性。在Kcat、Km或Kcat/Km值方面的增加或降低對于用來測定這些動力學(xué)參數(shù)的底物是專一性的。
同樣，已經(jīng)測定，在枯草溶菌素中等價于+76位置并結(jié)合一些其它位置的修飾，對于調(diào)制酶的整體穩(wěn)定性和/或解蛋白活度是重要的。例如，像在實(shí)例中說明的那樣，在經(jīng)優(yōu)選的蛋白酶中，在遲緩芽孢桿菌枯草溶菌素的等價于+76的位置上天冬酰胺(N)可用天冬氨酸(D)置換，并結(jié)合修飾一種或多種下列氨基酸殘基+99、+101、+103、+104、+107、+123、+27、+105、+109、+126、+128、+135、+156、+166、+195、+197、+204、+206、+210、+216、+217、+218、+222、+260、+265和/或+274，以便在得到的變種酶中產(chǎn)生增進(jìn)了的穩(wěn)定性和/或增進(jìn)的活性。
用于本發(fā)明的最優(yōu)選的蛋白酶已在實(shí)例中被陳述。這些包括以下特定的置換殘基的組合N76D/S99D；N76D/V104I；N76D/S99D/V104I；N76D/S103A/V104I；N76D/V104I/I107V；N76D/V104Y/I107V以及N76D/S101R/S103A/V104I。這些置換最好是在遲緩芽孢桿菌(重組體或天然的)枯草溶菌素中進(jìn)行，雖然置換也可以在任何一種桿菌的枯草溶菌素中進(jìn)行。
基于用這種和其它變種枯草溶菌素得到的結(jié)果，可明顯看出解淀粉芽孢桿菌羰基水解酶中等價于位置+76、+99、+101、+103、+104、+107、+123、+27、+105、+109、+126、+128、+135、+156、+166、+195、+197、+204、+206、+210、+216、+217、+218、+222、+260、+265和/或+274上的殘基對于這些酶的解蛋白活度、品質(zhì)和/或穩(wěn)定性以及這類變種酶的清洗或洗滌品質(zhì)是重要的。
下面通過實(shí)例來提供來提供用于本發(fā)明組合物中的蛋白酶的制造方法。
蛋白酶制造實(shí)例為枯草桿菌中GG36基因表達(dá)的構(gòu)造克隆化和為來自遲緩芽孢桿菌的枯草溶菌素基因表達(dá)的構(gòu)造，基本上和美國專利5,185,258中描述的相同。質(zhì)粒GGA274(描述于這里的圖4中)進(jìn)一步用如圖5所示的方式進(jìn)行修飾。在構(gòu)造GGA274質(zhì)粒過程中引入的Pstl位點(diǎn)通過下面將會描述的低聚核苷酸定向誘變的方法，用一種含有下列序列5′GAAGCTGCAACTCGTTAAA 3’(Seq.ID No.1)的低聚核苷酸除去。下面畫有一橫線的“A”殘基消除限制酶Pstl的認(rèn)別序列，并在位置274上把相應(yīng)的氨基酸從丙氨酸改變成蘇氨酸。在位置274上的蘇氨酸是原來發(fā)現(xiàn)在克隆化的遲緩芽孢桿菌枯草溶菌素基因中的野生型殘基。編碼枯草溶菌素的DNA片段被EcoRI和BamHI消化產(chǎn)物從質(zhì)粒GGA274或它的衍生物(GGT274被表示在圖5中)上切除。這DNA碎片再被半克隆化回到用作誘變的基于噬菌體M13的載體，諸如MP19中。誘變之后，EcoRI和HindIII消化產(chǎn)物，在克隆化之后，即履行工作移動變更過的枯草溶菌素基因回到表達(dá)質(zhì)粒諸如GGA274中，以便表達(dá)和回收變更過的枯草溶菌素蛋白質(zhì)。
低聚核苷酸定向的誘變低聚核苷酸定向誘變是按Zoller，M.等人在(1983)MethodsEnzymol.，100468～500中描述的方法來進(jìn)行的。作為一個實(shí)例，一種合成的具有5’GCTGCTCTAGACAATTCG 3’(Seq.IDNo.2)序列的低聚核苷酸被用來改變位置76的氨基酸殘基，使它從天冬酰胺(N)變?yōu)樘於彼?D)，或N76D。下方畫橫線的“G”和“C”殘基指示由野生型基因序列發(fā)生的變化。CA使亮氨酸保留在位置+75上并改變這種氨基酸序列來引入一個xbal限制酶(TCTAGA)的xbal識別位點(diǎn)，同時在GAC處的改變把在+76位置上的天冬酰胺變成天冬氨酸。
為了在位置99、101、103和104處進(jìn)行誘變，可依照所需變更的結(jié)合來使用不同的低聚核苷酸。例如，具有序列為5’GTATTAGGGGCGGACGGTCGAGGCGCCATCAGCTCGATT 3′(Seq.ID No.3)的一種低聚核苷酸被用來同時在一個單一的枯草溶菌素分子中進(jìn)行下列改變S99D；S101R；S103A和V104I。相似地，一種序列為5′TCAGGTTCGGTCTCGAGCGTTGCCCAAGGATTG 3′(Seq.IDNo.4)的低聚核苷酸和一種序列為5′CACGTTGCTAGCTTGAGTTTAG 3′(Seq.ID No.5)的低聚核苷酸被分別用來產(chǎn)生I107V和N123S。同樣，畫橫線的殘基指示由野生型序列發(fā)生的變化，它可產(chǎn)生所期望的或者是氨基酸序列的變化、或者是限制酶識別序列的變化。
枯草溶菌素變種的解蛋白活度按照前述低聚核苷酸定向誘變的方法，制造了列在表III上的變種。每一種這樣的枯草溶菌素變種的解蛋白活度也列在表III上。用P.Bonneau等人(1991)在J.Am.Chem.Soc.，Vol.113，No.3，P1030所述的方法測量合成的多肽底物丁二酰基-L-丙氨-L-丙氨-L-脯氨-L-苯丙氨酰對硝基苯胺水解的動力學(xué)參數(shù)Kcat、Km和Kcat/Km。簡而言之，把枯草溶菌素儲備溶液的小的等分溶液，加到含有溶解在pH值為8.6的0.1M Tris-HCl緩沖液中的底物的1厘米比色池中，并恒溫在25℃。反應(yīng)進(jìn)程用分光光度法跟蹤，即監(jiān)測在410納米處反應(yīng)產(chǎn)物對硝基苯胺的吸光度。通過一種非線性回歸算法使每種反應(yīng)的反應(yīng)速率和產(chǎn)物濃度符合Michaelis-Menten方程，來得到動力學(xué)參數(shù)。
表III測量遲緩芽孢桿菌枯草溶菌素和變種的動力學(xué)參數(shù)Kcat、Km和Kcat/Km蛋白酶# 酶變種 kcat(s-1) KM(M) kcat/KM(s-1M-1)- 遲緩芽孢桿菌枯草溶菌素 170 0.00078 2.18×105-N76D 219 0.0008 2.74×1051N76D/S99D 88 0.00061 1.44×1052N76D/S101R 371 0.0013 2.85×1053N76D/S103A 400 0.0014 2.86×1054N76D/V104I 459 0.0011 4.17×1055N76D/I107V 219 0.0011 1.99×1056N76D/N123S 115 0.0018 6.40×1047N76D/S99D/S101R 146 0.00038 3.84×1058N76D/S99D/S103A 157 0.0012 1.31×1059N76D/S99D/V104I 247 0.00097 2.55×10510 N76D/S101R/S103A 405 0.00069 5.90×10511 N76D/S101R/V104I 540 0.00049 1.10×10612 N76D/S103A/V104I 832 0.0016 5.20×10513 N76D/V104I/I107V 497 0.00045 1.10×10614 N76D/V104Y/I107V 330 0.00017 1.90×10615 N76D/V104I/N123S 251 0.0026 9.65×10416 N76D/I107V/N123S 147 0.0035 4.20×10417 N76D/S99D/S101R/S103A242 0.00074 3.27×10518 N76D/S99D/S101R/V104I403 0.00072 5.60×10519 N76D/S99D/S103A/V104I420 0.0016 2.62×10520 N76D/S101R/S103A/V104I 731 0.00065 1.12×10621 N76D/S103A/V104I/N123S 321 0.0026 1.23×10522 N76D/V104I/I107V/N123S 231 0.0037.70×10423 N76D/S99D/S101R/S103A/V104I 624 0.00098 6.37×10524 N76D/S99D/S103A/V104I/N123S 194 0.0043 4.51×10425 N76D/S99D/S101R/S103A/V104I/N123S311 0.0023 1.35×105
列于表III的結(jié)果說明，所有試驗(yàn)的枯草溶菌素變種保持著解蛋白活度。進(jìn)一步，對數(shù)據(jù)的詳盡分析表明，通過在等價于解淀粉芽孢桿菌枯草溶菌素中的76、99、101、103、104、107和123這些氨基酸殘基位置上進(jìn)行各種置換的組合，可以有意義地改變遲緩芽孢桿菌枯草溶菌素的解蛋白活度。
枯草溶菌素的熱穩(wěn)定性通過上述低聚核苷酸定向誘變方法制得的本發(fā)明的遲緩芽孢桿菌枯草溶菌素及其變種的觀測到的熱穩(wěn)定性的比較被顯示在表IV中。把純化過的酶在0.1M甘氨酸0.01％ Tween-80 pH10.0緩沖液中的濃度為15微克/毫升的溶液，加有或不加50mM CaCl2，等分到小試管中并在10℃保溫5分鐘，10°至60℃保溫超過1分鐘，在60℃保溫20分鐘。然后把試管放在冰上10分鐘。把試管中的等分溶液加到含有1.2mM的合成多肽底物丁二酰-L-丙氨-L-丙氨-L-脯氨-L-苯丙氨酰-對硝基苯胺溶解在0.1Mtris-HCl的pH值為8.6的緩沖液中所形成的溶液并恒溫在25℃的1厘米比色池中，以試驗(yàn)酶的活性。最初的線性反應(yīng)速率是用分光光度法通過監(jiān)測反應(yīng)產(chǎn)物對硝基苯胺在410納米處的吸光度作為時間的函數(shù)來跟蹤的。提供的數(shù)據(jù)為加熱前的百分?jǐn)?shù)活度。列于表IV的結(jié)果指出在加入50mM CaCl2的試驗(yàn)條件下許多變種(26個當(dāng)中的24個)呈現(xiàn)出和遲緩芽孢桿菌差不多的熱穩(wěn)定性。在沒有加50mM CaCl2的試驗(yàn)條件下有許多變種(26個當(dāng)中的19個)其穩(wěn)定性明顯地要比遲緩芽孢桿菌枯草溶菌素的更好。進(jìn)一步，在沒有加50mM CaCl2的試驗(yàn)條件下，變種N76D/S99D、N76D/V104I、N76D/S99D/V104I、N76D/S103A/V104I、N76D/V104I/I107V、N76D/V104Y/I107V和N76D/S101R/S103A/V104I比單一置換的變種N76D要明顯地更穩(wěn)定表IV測量遲緩芽孢桿菌枯草溶菌素及其變種的熱穩(wěn)定性；pH值10，60℃，加入或不加入50mM CaCl2初始活性的保留值％酶 -CaCl2+CaCl2遲緩芽孢桿菌枯草溶菌素 2 96N76D 34 97N76D/S99D 49 98N760/S101R 0 82N760/S103A 26 92N76D/V104I 58 98N76D/I107V 32 96N76D/N123S 0 97N76D/S99D/S101R30 100N76D/S99D/S103A36 100N76D/S99D/V104I48 97N76D/S101R/S103A 26 100N76D/S101R/V104I 38 100N76D/S103A/V104I 58 100N76D/V104I/I107V 60 97N76D/V104Y/I107V 48 74N76D/V104I/N123S 0 98N76D/I107V/N123S 16 100N76D/S99D/S101R/S103A 38 100N76D/S99D/S101R/V104I 33 100N76D/S99D/S103A/V104I 38 98N76D/S101R/S103A/V104I 40 99N76D/S103A/V104I/N123S 1 98N76D/V104I/I107V/N123S 3 99N76D/S99D/S101R/S103A/V104I36 99N76D/S99D/S103A/V104I/N123S2 95N76D/S99D/S101R/S103A/V104I/N123S 0 100
用由質(zhì)粒噬菌體產(chǎn)生的單股DNA模板進(jìn)行低核苷酸定向誘變A.遲緩芽孢桿菌變種的構(gòu)造誘變的實(shí)驗(yàn)程序基本上和前面在低聚核苷酸定向誘變中所描述的相同。單股DNA模板是通過質(zhì)粒噬菌體方法來產(chǎn)生的。為構(gòu)造產(chǎn)生這種單股DNA模板的質(zhì)粒噬菌體載體，我們首先構(gòu)造載體pBCDAICAT。載體構(gòu)造的流程圖被概括于圖8中。首先，來自pC194質(zhì)粒的編碼CAT基因的Clal至Clal碎片(參見Horinouchi，S.和Weisblum，B.，J.Bacteril.，1508～15，1982)被克隆化進(jìn)行pUC19的多鏈接區(qū)域的Accl位點(diǎn)上(New England BioLabs，Beverly，MA)以制造質(zhì)粒pUCCHL，并且由GG36DAI編碼DNA 5′端的EcoRI-Dral 0.6 KB碎片被克隆化進(jìn)入pBSKS質(zhì)粒(stratagene.Inc.，San diego，CA)的EcoRI和EcoRV位點(diǎn)，以制造pBC2SK5。質(zhì)粒pBC2SK5的單一EcoRI位點(diǎn)通過EcoRI消化而消除，接著被填充到被T4催化的DNA聚合酶中，并重新連接以產(chǎn)生沒有EcoRI位點(diǎn)的質(zhì)粒pBC2SK-5R。被克隆化進(jìn)入pBCSK-5R中的EcoRI-Dral碎片以Pstl-HindIII碎片的形式被析離并克隆化到pUCCHL(pUC19多鏈區(qū)的一部分)的Pst1-HindIII位點(diǎn)以產(chǎn)生質(zhì)粒pUCCHL 5R。GG36DAI的編碼序列被切除成為EcoRI-BamHI碎片并克隆化到pUCCHL 5R的EcoRI-BamHI位點(diǎn)上以制造pUCCAT。然后把pUCCAT的大的EcoRI-HindIII碎片克隆化到BS2KS+的EcoRI和HindIII位點(diǎn)上以產(chǎn)生質(zhì)粒pBCDAIVCAT。
為產(chǎn)生單股DNA，含有pBCDAICAT的大腸桿菌用噬菌體R408(可由stratagene，San Diego，CA購得)感染，這可按照Russel.M.，Kidd，S，和Kelley，M.R.在GENE45333～338，1986中所敘述的實(shí)驗(yàn)程序來進(jìn)行。一旦獲得單股DNA模板，即可實(shí)施前面在低聚核苷酸定向誘變中敘述過的標(biāo)準(zhǔn)的誘變方法。一些突變體的構(gòu)造為說明的目的詳述如下為構(gòu)造遲緩芽孢桿菌(GG36)N76D/S103A/V104I/L217H，可將編碼GG36 N76D/S103A/V104I的EcoRI-BamHIDNA碎片用于構(gòu)造pUCCAT(參見圖8)以產(chǎn)生質(zhì)粒pBCDAICAT，在按上述實(shí)驗(yàn)程序制得單股DNA模板后，即可用具有下列序列* *** **X C1al5′ TAT GCC AGC CAC AAC GGT ACT TCG ATG GCT 3′(Seq.IDNo.13)的誘變引物來制造L217H。像前面那樣，下邊畫有橫線的殘基是指明已進(jìn)行的核苷酸變化，xclal是指存在的clal位點(diǎn)在誘變后已被消除。誘變的實(shí)驗(yàn)程序已在前面低聚核苷酸定向誘變中描述過。誘變以后，質(zhì)粒DNA首先被篩選出消除了Clal位點(diǎn)的，并且那些失去Clal位點(diǎn)的克隆被拿去進(jìn)行DNA序列分析以證實(shí)在第217號氨基酸殘基位置上實(shí)施了把L變?yōu)镠的DNA序列。B.BPN′變種的構(gòu)造以及它們在枯草桿菌中的表達(dá)解淀粉芽孢桿菌(BPN′)N76D/Q103A/Y104I/Y217L的構(gòu)造除兩個連續(xù)步驟以外是以相似的方式來進(jìn)行的。先把N76D引入BPN′Y217L以制造BPN′N76D/Y217L，第二次誘變把BPN′N76D/Y217L轉(zhuǎn)化成BPN′N76D/Q103A/Y104I/Y217L。為產(chǎn)生第一次誘變所需的單股DNA模板，可用編碼BPN′Y217L枯草溶菌素的EcoRI-BamHI碎片(是由Y217L質(zhì)粒衍生的，已被描述于Wells，J.等人在PNAS,84,5167,1087發(fā)表的論文中)來構(gòu)造質(zhì)粒pUCCATFNA(參見圖9)。含有BPN′Y217L的pUCCATFNA質(zhì)粒被用來構(gòu)造pBCFNACAT質(zhì)粒(圖9)。像前面敘述的那樣就產(chǎn)生單股DNA。為產(chǎn)生BPN′N76D/Y217L，可用一種具有以下序列的低聚核苷酸引物* *** **Xbal5′C ACA GTTGCG GCT CTA GAT AAC TCA ATC GGT G 3′(Seq.ID No.14)來產(chǎn)生改變N76D。然后由含有BPN′N76D/Y217L的pBCFNACAT質(zhì)粒來制備單股DNA(N76D誘變后的pBCFNACAT質(zhì)粒)并用另一種具有以下序列的低聚核苷酸* *** **x Pvull5′ GCT GAC GGT TCC GGC GCT ATT AGT TGG ATC ATT 3′(Seq.ID No.15)誘變而得到BPN′N76D/Q103A/Y104I/Y217L。涉及的克隆化、單股DNA制備、誘變以及突變體的篩選所有這些步驟都如上面敘述過的方法來進(jìn)行。BPN′基因以及它的變種的表達(dá)可通過直接把質(zhì)粒DNA(含有不同變種BPN′基因的pBCFNACAT)連接到枯草桿菌的缺乏蛋白酶的菌株中來完成，如RE 34,606中所描述的那樣。
像每個這些蛋白酶制造實(shí)例所教授的那樣，已制造了許多變種。為這些變種測定了動力學(xué)數(shù)據(jù)和穩(wěn)定性數(shù)據(jù)。動力學(xué)數(shù)據(jù)是按前面描述過的方法產(chǎn)生的并被提供于表V中。穩(wěn)定性數(shù)據(jù)的產(chǎn)生將在此詳述，結(jié)果列于表VI中。
熱穩(wěn)定性試驗(yàn)程序純化過的酶被緩沖液交換到0.1M甘氨酸·pH10.0、含有0.01％*Tween～80的緩沖液中，這可通過把酶加到含有用這種緩沖液平衡過的Sephadex G-25的層析柱上，并用同樣的緩沖液把酶從柱上洗脫下來而實(shí)施。
往含有0.1M甘氨酸、0.01％Tween，pH為10.0并恒溫在60℃的緩沖液的試管中，加入經(jīng)緩沖液交換過的酶，使最終酶的濃度為15微克/毫升。
在不同時間從60℃的恒溫液中取出等分的試樣并立即試驗(yàn)酶的活性，即把它加入一個1厘米的比色池中，其中含有1.2mM合成肽底物丁二?；?L-丙氨-L-丙氨-L-脯氨-L-苯丙氨酰對硝基苯胺的溶解在pH值為8.6并恒溫在25℃的0.1Mtris-HCl緩沖溶液中而形成的溶液。最初的線性反應(yīng)速率可通過監(jiān)測反應(yīng)產(chǎn)物對硝基苯胺在410納米處的吸光度作為時間的函數(shù)來進(jìn)行分光光度法跟蹤。
半衰期，即50％的酶失活所需時間的長度，是通過在60℃恒溫溶液的反應(yīng)速率作為時間函數(shù)的一級圖形而測出的。
在表VI中提供的數(shù)據(jù)是按在相同條件下測定遲緩芽孢桿菌枯草溶菌素(GG36)半衰期的百分?jǐn)?shù)來表示的。
表V酶 kcat KMkcat/KM(s-1) (mM) (s-1M-1)遲緩芽孢桿菌枯草溶菌素 1700.782.20E+05N76D/S103G/V104*3801.4 2.70E+05N76D/S103A/V104F 7300.332.20E+06N76D/S103A/V104N 7902.8 2.80E+05N76D/S103A/V104S 1700.832.00E+05N76D/S103A/V104T 3701.9 2.00E+05N76D/S103A/V104W 8800.312.80E+06N76D/S103A/V104Y 6900.5 1.40E+06K27R/N76D/V104Y/N123S 5001.2 4.20E+05N76D/S101G/S103A/V104I*6201.3 4.80E+05N76D/S103A/V104I/S105A*5501.3 4.20E+05N76D/S103A/V104I/S105D*4401.7 2.60E+05N76D/S103A/V104T/I107A*1205.7 2.10E+04N76D/S103A/V104T/I107L*3103.2 9.70E+04N760/S103A/V104I/L126A 90 2.2 4.10E+04N76D/S103A/V104I/L126F 1801.9 9.50E+04N76D/S103A/V104I/L126I 1002.4 4.20E+04N76D/S103A/V104I/L126V 64 3.2 2.00E+04N76D/S103A/V104I/S128G*5601.7 3.30E+05N76D/S103A/V104I/S128L*4303.8 1.10E+05N76D/S103A/V104I/L135A 1400.761.80E+05N76D/S103A/V104I/L135F 3900.695.70E+05N76D/S103A/V104A/L135I 1100.731.50E+05N76D/S103A/V104I/L135V 1400.861.60E+05N76D/S103A/V104I/S156E*1702.6 6.50E+04N76D/S103A/V104I/S166D*1603.5 4.60E+04N76D/S103A/V104I/D197E 5101.4 3.60E+05N76D/S103A/V104I/N204A*5301.1 4.80E+05N76D/S103A/V104I/N204G*5801.4 4.10E+05N76D/S103A/V104I/N204C*3701.3 2.90E+05N76D/S103A/V104I/P210I*5001.2 4.20E+05N76D/S103A/V104I/L217H*80 0.631.30E+05N76D/S103A/V104I/M222A 70 3.1 2.30E+04N76D/S103A/V104I/M222S 80 3.1 2.60E+04N76D/S103A/V104I/T260P 6601.5 4.40E+05N76D/S103A/V104I/S265N 5901.3 4.50E+05K27R/N76D/V104Y/I107V/N123S2201.4 1.60E+05K27R/N76D/V104Y/N123S/D197E4301.1 3.90E+05K27R/N76D/V104Y/N123S/N204C4001.1 3.60E+05K27R/N76D/V104Y/N123S/Q206L4401.2 3.70E+05K27R/N76D/V104Y/N123S/S216V4401.2 3.70E+05K27R/N76D/V104Y/N123S/N218S7600.987.80E+05K27R/N76D/V104Y/N123S/T260P4101.2 3.40E+05K27R/N76D/V104Y/N123S/T274A3901 3.90E+05N76D/S103A/V104I/L126F/S265N 1702.1 8.10E+04N76D/S103A/V104I/S156E/S166D*40 6.3 6.40E+03K27R/N76D/V104Y/N123S/G195E/G197E 4100.98 4.20E+05K27R/N76D/V104Y/N123S/G195E/N218S 5400.66 8.20E+05K27R/N76D/V104Y/N123S/D197E/N218S 7700.79 9.80E+05K27R/N76D/V104Y/N123S/N204C/N218S 6100.99 6.20E+05K27R/N76D/V104Y/N123S/Q206L/N218S 5800.78 7.40E+05K27R/N76D/V104Y/N123S/N218S/T260P 6601 6.60E+05K27R/N76D/V104Y/N123S/N218S/T274A 5900.89 6.60E+05K27R/N76D/V104Y/Q109S/N123S/N218S/T5201 5.20E+05274AK27R/N76D/V104Y/N123S/G195E/D197E/N4600.65 7.10E+05218S解淀粉芽孢桿菌枯草溶菌素(BPN′) 500.14 3.60E+05BPN′-N76D/Y217L*3800.46 8.30E+05*帶星號的這些突變體是用由噬菌體質(zhì)粒產(chǎn)生的單股DNA模板進(jìn)行低聚核苷酸定向誘變而制出的；所有其它不帶星號的則是按前面所敘述的低聚核苷酸定向誘變方法制出的。
表VI酶 熱穩(wěn)定性(天然酶的半衰期％)遲緩芽孢桿菌枯草溶菌素 100N76D 590N76D/S99D 840N76D/S103A 390N76D/V104I 660N76D/I107V 710N76D/N123S 70N76D/S99D/S101R610N76D/S99D/S103A590N76D/S99D/V104I910N76D/S101R/S103A 930N76D/S101R/V104I 500N76D/S103A/V104I 460N76D/S103G/V104I*370N76D/S103A/V104F 480N76D/S103A/V104N 230N76D/S103A/V104S 230N76D/S103A/V104T 370N76D/S103A/V104W 280N76D/S103A/V104Y 400N76D/V104I/I107V 940N76D/V104Y/I107V 820N76D/V104I/N123S 80N76D/I107V/N123S 150K27R/N76D/V104Y/N123S100N76D/S99D/S101R/S103A570N76D/S99D/S101R/V104I 1000N76D/S99D/S103A/V104I680N76D/S101G/S103A/V104I*390N76D/S101R/S103A/V104I 470N76D/S103A/V104I/S105A*360N76D/S103A/V104I/S105D*370N76D/S103A/V104T/I107A*270N76D/S103A/V104T/I107L*230N76D/S103A/V104I/N123S 110N76D/V104I/I107V/N123S 220N76D/S103A/V104I/L126A 270N76D/S103A/V104I/L126F 950N76D/S103A/V104I/L126I 410N76D/S103A/V104I/L126V 320N76D/S103A/V104I/S128G*640N76D/S103A/V104I/S128L*760N76D/S103A/V104I/L135A 230N76D/S103A/V104I/L135F 200N76D/S103A/V104I/L135I 510N76D/S103A/V104I/L135V 500N76D/S103A/V104I/S156E*120N76D/S103A/V104I/S166D*590N76D/S103A/V104I/D197E 460N76D/S103A/V104I/N204A*230N76D/S103A/V104I/N204G*240N76D/S103A/V104I/N204C*500N76D/S103A/V104I/P210I*1370N76D/S103A/V104I/I217H*60N76D/S103A/V104I/M222A 520N76D/S103A/V104I/M222S 490N76D/S103A/V104I/T260P 490N76D/S103A/V104I/S265N 360K27R/N76D/V104Y/I107V/N123S 210K27R/N76D/V104Y/N123S/D197E 120K27R/N76D/V104Y/N123S/N204C 110K27R/N76D/V104Y/N123S/Q206L 380K27R/N76D/V104Y/N123S/S216V 140K27R/N76D/V104Y/N123S/N218S 270K27R/N76D/V104Y/N123S/T260P 40K27R/N76D/V104Y/N123S/T274A 60N76D/S99D/S101R/S103A/V104I 690N76D/S99D/S103A/V104I/N123S 110N76D/S103A/V104I/L126F/S265N 810N76D/S103A/V104I/S156E/S166D*220K27R/N76D/V104Y/N123S/G195E/G197E90K27R/N76D/V104Y/N123S/G195E/N218S250K27R/N76D/V104Y/N123S/D197E/N218S270K27R/N76D/V104Y/N123S/N204C/N218S460K27R/N76D/V104Y/N123S/Q206L/N218S1400K27R/N76D/V104Y/N123S/N218S/T260P310K27R/N76D/V104Y/N123S/N218S/T274A180N76D/S99D/S101R/S103A/V104I/N123S90K27R/N76D/V104Y/Q109S/N123S/N218S/T274 230K27R/N76D/V104/N123S/G195E/D197E/N21 240解淀粉芽孢桿菌枯草溶菌素(BPN′) 100BPN′-N76D/Y217L*420*帶星號的這些突變體是用由噬菌體質(zhì)粒產(chǎn)生的單股DNA模板進(jìn)行低聚核苷酸定向誘變而制出的；所有其它不帶星號的則是按前面所敘述的低聚核苷酸定向誘變方法制出的。(3)洗滌組合物材料本發(fā)明的清洗組合物除前面敘述的漂白劑和蛋白酶以外，也包括一種或多種可以和蛋白酶配伍的清洗組合物材料。術(shù)語“清洗組合物材料”，像這里使用的，意指任何選自特定類型所需的清洗組合物以及產(chǎn)物形式(例如液體、顆粒、噴霧組合物)的液體、固體或氣體材料，這些材料也可以和用于組合物中的蛋白酶配伍。清洗組合物材料的具體選擇可通過考慮被清洗的表面、物件或織物以及所需的在使用過程的清洗條件下組合物的形式(例如通過洗滌劑使用)而容易地做出決定。術(shù)語“可配伍的”，像這里使用的，是指洗滌組合物材料不致降低蛋白酶的解蛋白活度到這種程度，以致在正常使用的情形下不再像期望那樣有效。具體的洗滌組合物材料將在后面舉例詳盡說明。
有效量的一種或多種上述蛋白酶被包括在組合物中，用來洗滌許多需要除去蛋白質(zhì)污漬的表面。這樣的洗滌組合物包括為洗滌硬表面的形式不限(例如，液體或顆粒狀)的洗滌劑組合物；為洗滌織物的形式不限(例如，顆粒狀、液體和棒狀配方)的洗滌劑組合物；洗碟用組合物(形式不限)；口腔洗滌組合物，形式不限(例如，牙粉，牙膏和漱口劑配方)；以及假牙洗滌組合物，形式不限(例如，液體、片狀)。像這里所用的，“有效量的蛋白酶”是指為必須達(dá)到的酶活性在具體的洗滌組合物中所需的前面敘述的蛋白酶的量。這樣的有效量能容易地為本領(lǐng)域的技術(shù)人員所確定，并且它基于許多因素，諸如使用的特定的酶的變種、洗滌施用情況、洗滌組合物的具體組分，以及所需的組合物是液體還是干的(例如顆粒或條狀)等等。
優(yōu)選地是本發(fā)明的洗滌組合物中含有由大約0.0001％至大約10％的一種或多種蛋白酶，更優(yōu)選地是含有大約0.001％至大約1％、還更優(yōu)選地是含有大約0.001％至大約0.1％。下面將進(jìn)一步詳盡討論可能使用蛋白酶的各種洗滌組合物的一些實(shí)例。這里使用的所有份數(shù)、百分?jǐn)?shù)和比率除非特別說明都是以重量計算的。
如這里所使用的，“非織物洗滌組合物”包括硬表面洗滌組合物、洗碟組合物、口腔用洗滌組合物、假牙洗滌組合物以及人身洗滌組合物等。A.用于硬表面、碗碟和織物的洗滌組合物蛋白酶可用于任何需要有高度起泡性和/或良好的除去不溶性底物的洗滌劑組合物中。這樣，蛋白酶可以和各種通常的組分一起使用來提供充分配制好的硬表面洗滌劑、洗碗碟組合物、織物洗滌組合物等。這樣的組合物可做成液體、顆粒、條棒等形式、這樣的組合物可被配制成近代“濃縮”的洗滌劑，其中含有多達(dá)30％～60％的表面活性劑。
這種洗滌組合物可任選地，并且優(yōu)選地，含有各種陰離子的、非離子的、兩性離子的等類型的表面活性劑。這類表面活性劑存在的典型濃度為組合物的大約0.1％至大約60％、優(yōu)選地是大約1％至大約35％。
這里使用的表面活性劑的非限制性的實(shí)例包括通常的C11～C18烷基苯磺酸鹽、一級和任意的烷基硫酸鹽、C10～C18二級(2，3)烷基硫酸鹽，其通式為CH3(CH2)x(CHOSO3)-M+)CH3和CH3(CH2)y(CHOSO3-M+)CH2CH3，其中x和(y+1)是至少為大約7的整數(shù)，最好是至少為大約9的整數(shù)，M是一種水溶性的陽離子，特別是鈉，C10～C18烷基烷氧基硫酸酯(特別是EO1～7乙氧基硫酸酯)、C10～C18烷基烷氧基羧酸酯(特別是EO1～7乙氧基羧酸酯)、C10～C18烷基聚糖苷以及它們相應(yīng)的硫酸化的聚糖苷、C12～C18α-磺化的脂肪酸酯、C12～C18烷基和烷基酚烷氧化物(特別是乙氧化物和混合的乙氧化/丙氧化物)、C12～C18三甲銨乙內(nèi)酯以及磺化的三甲銨乙內(nèi)酯(“sultaines”)、C10～C18胺氧化物、C8～C24肌氨酸鹽(特別是油?；“彼猁})、等等。在這里烷基烷氧基硫酸酯(AES)和烷基烷氧基羧酸酯(AEC)是優(yōu)選的。(使用這類表面活性劑結(jié)合前面說過的胺氧化物和/或三甲銨乙內(nèi)酯或磺化的三甲銨乙內(nèi)酯表面活性劑也是優(yōu)選的，這取決于配方師的需要)。其它通常使用的表面活性劑已被列出在標(biāo)準(zhǔn)的教科書中。特別有用的表面活性劑包括C10～C18N-甲基葡糖酰胺，它已被公開于1993年3月16日授予Connor等人的美國專利5,194,639中，在此引入作為參考。
特別有用的是非離子性表面活性劑一類，它是環(huán)氧乙烷與一個憎水部分的縮合產(chǎn)物，它提供一種其平均的親水親油平衡值(HLB)在5至17、優(yōu)選地是6至14、更優(yōu)選地是7至12范圍內(nèi)的表面活性劑。憎水(親油)部分在性質(zhì)上可以是脂肪的或芳香的，并且與任何特定的憎水基團(tuán)縮合的聚氧乙烯基的長度可被容易地調(diào)節(jié)，以產(chǎn)生一種水溶性的化合物，它在親水和憎水元素之間具有所期望的平衡程度。特別優(yōu)選的是每摩爾醇含有3～8摩爾環(huán)氧乙烷的C9～C15一級醇乙氧化物(或混合的乙氧化/丙氧化物)、尤其是每摩爾醇含有6～8摩爾環(huán)氧乙烷的C14～C15一級醇乙氧化物、每摩爾醇含有3～5摩爾環(huán)氧乙烷的C12～C15一級醇乙氧化物、以及它們的混合物。
多個其它用于洗滌劑洗滌組合物中的組分也可包括在這里的組合物中，包括其它活性組分、載體、水溶助長劑、操作助劑、染料或顏料、液體配方的溶劑等。如果希望額外增強(qiáng)起泡作用，可往組合物中加入促泡劑諸如C10～C16醇酰胺，使用的典型濃度為大約1％至大約10％。這類促泡劑的典型類別有一乙醇和二乙醇酰胺。把這類促泡劑與高度起泡的輔助表面活性劑諸如前面提到的胺氧化物、三甲銨乙內(nèi)酯和磺化的三甲銨乙內(nèi)酯一起使用是有益處的。如果需要，可溶性的鎂鹽諸如MgCl2、MgSO4等也可被加入，其濃度典型地是在大約0.1％至大約2％之間，以提供額外的起泡作用。
這里的液體洗滌劑組合物可含有水和別的溶劑作為載體。低分子量的一級或二級醇例如甲醇、乙醇、丙醇和異丙醇都是合適的溶劑。為溶解表面活性劑、一元醇是優(yōu)選的，但是也可以使用那些含有大約2至大約6個碳原子以及大約2至大約6個羥基的多元醇(例如1，3-丙二醇、乙二醇、甘油和1，2-丙二醇)。組合物中可含有大約5％至大約90％、典型地是大約10％至大約50％的這類載體。
這里的洗滌劑組合物最好是這樣來配制，即在水溶液洗滌操作過程中使洗滌水的pH值在大約6.8至大約11.0之間。這樣做成的產(chǎn)品典型地是在這一范圍內(nèi)配制的。在推薦使用的濃度控制pH的技術(shù)包括使用緩沖劑、堿、酸等，對本領(lǐng)域的技術(shù)人員這是眾所周知的。
當(dāng)配制本發(fā)明的硬表面洗滌組合物和織物洗滌組合物使，配方師可能愿意使用濃度為大約5％至大約50％(重量)的各種增效劑。典型的增效劑包括1～10微米的沸石、聚羧酸鹽諸如檸檬酸鹽和氧聯(lián)二丁二酸鹽、層狀硅酸鹽、磷酸鹽等。其它通常的增效劑已被列舉在標(biāo)準(zhǔn)的配方中。
同樣，配方師可能愿意在這樣的組合物中使用各種其它的酶，諸如纖維素酶、脂酶、淀粉酶、過氧化物酶以及蛋白酶，典型地使用濃度為大約0.001％至大約1％(重量)。在洗衣洗滌劑領(lǐng)域中各種照顧到洗滌和織物的酶是眾所周知的。
各種漂白化合物，諸如過碳酸鹽、過硼酸鹽等也可被用于這類組合物中，典型的使用濃度為大約1％至大約15％(重量)。如果需要，這類組合物也可含有漂白活化劑諸如四乙酰基乙二胺、壬酰氧基苯磺酸鹽等，它們在本領(lǐng)域中也是已知的。使用的濃度典型地是在大約1％至大約10％(重量)范圍內(nèi)。
各種污垢釋出劑，特別是陰離子低聚酯類、各種螯合劑、特別是氨基膦酸鹽和乙二胺二丁二酸鹽、各種除塵土污垢劑、特別是乙氧化的四亞乙基五胺、各種分散劑、特別是聚丙烯酸酯和聚天冬氨酸酯、各種增白劑、特別是陰離子增白劑、各種染料轉(zhuǎn)移抑制劑、諸如聚乙烯基吡咯烷酮、各種抑泡劑、特別是聚硅氧烷和二級醇、各種織物軟化劑、特別是綠土和粘土絮凝聚合物(例如聚(氧乙烯))等也可被用于這類組合物中，使用的濃度范圍在大約1％至大約35％(重量)之間。標(biāo)準(zhǔn)的配方和已公開的專利包含多種這類常用材料的詳盡描述。
酶穩(wěn)定劑也可用于本發(fā)明的洗滌組合物中。這類酶穩(wěn)定劑包括丙二醇(含量最好在大約1％至大約10％)、甲酸鈉(含量最好在大約0.1％至大約1％)以及甲酸鈣(含量最好在大約0.1％至大約1％)。1.硬表面洗滌組合物像這里使用的“硬表面洗滌組合物”一詞是指用來洗滌硬表面諸如地板、墻壁、浴室瓷磚等的液體和顆粒狀洗滌劑組合物。本發(fā)明的硬表面洗滌組合物含有有效量的一種或多種蛋白酶，其含量優(yōu)選地為組合物中活性蛋白酶的大約0.0001％至大約10％，更優(yōu)選地是大約0.001％至大約5％，最優(yōu)選地是大約0.001％至大約1％。除含有一種或多種蛋白酶以外，這類硬表面洗滌組合物典型地含有一種表面活性劑和一種水溶性的多價螯合增效劑。但是，在一些特型產(chǎn)物諸如噴霧洗窗劑中有時不用表面活性劑，因?yàn)樗鼈兛赡茉诓ＡП砻娈a(chǎn)生薄霧/條紋狀殘跡。
表面活性劑組分在存在時的含量，可以小至這里的組合物的0.1％，但典型地是在組合物中含有大約0.25％至大約10％，更優(yōu)選地是含有大約1％至大約5％的表面活性劑。
典型地，這種組合物中含有大約0.5％至大約50％的洗滌增效劑，最好含有大約1％至大約10％。最好是pH值是在大約8至12范圍內(nèi)。通常的pH調(diào)節(jié)劑諸如氫氧化鈉、碳酸鈉或鹽酸都可使用，如果調(diào)節(jié)是必需的話。
溶劑可被包括在組合物中。有用的溶劑包括、但不限于，乙二醇醚諸如二乙二醇單己醚、二乙二醇單丁醚、乙二醇單丁醚、乙二醇單己醚、丙二醇單丁醚、二丙二醇單丁醚，以及二醇類諸如2，2，4-三甲基-1，3-戊二醇和2-乙基-1，3-己二醇。當(dāng)使用時，這類溶劑典型地存在濃度為大約0.5％至大約15％，優(yōu)選地是大約3％至大約11％。
另外，高度揮發(fā)性的溶劑諸如異丙醇或乙醇也可用于本發(fā)明組合物中，使得當(dāng)“全強(qiáng)度”施用這種組合物于表面后，表面仍未被洗凈時能讓組合物從表面較快地?fù)]發(fā)變得容易。當(dāng)使用時，揮發(fā)性溶劑在組合物中典型存在的濃度為大約2％至大約12％。
本發(fā)明的硬表面洗滌組合物實(shí)施方案將通過以下非限制性的實(shí)例來闡明。(在下面的實(shí)例中，在實(shí)例中給“蛋白酶”標(biāo)上的號碼是指用于本發(fā)明組合物中具有前面表III中給出的編號的變種)。
實(shí)例1～6液體硬表面洗滌組合物實(shí)例編號組 分 1 23 45 6蛋白酶#12 0.05 0.02 0.02 0.03 0.10 0.03蛋白酶#4 - - - -0.02 0.02EDTA**- -2.90 2.90 - -檸檬酸鈉 - - - -2.90 2.90C12烷基苯磺酸鈉1.95 -1.95 -1.95-C12烷基硫酸鈉 -2.20 -2.20 -2.20C12(乙氧基)硫 -2.20 -2.20 -2.20酸鈉***C12二甲胺氧化物 -0.50 -0.50 -0.50異丙基苯磺酸鈉 1.30 -1.30 -1.30 -己基卡必醇***6.30 6.30 6.30 6.30 6.30 6.30水****平衡到100％注**乙二胺四醋酸四鈉鹽***二乙二醇單己醚****整個配方調(diào)節(jié)到pH值為7。
在實(shí)例1～4中，曾用列舉在表III中的蛋白酶1～11號和13～25號、包括其它被描述于表V和表VI中的用于本發(fā)明的蛋白酶來代替12號蛋白酶，得到基本上類似的結(jié)果。
在實(shí)例5和6中，也曾用表III、V和VI中列舉的用于本發(fā)明的蛋白酶當(dāng)中的任意組合物來代替12號和4號蛋白酶，也得到基本類似的結(jié)果。
實(shí)例7～12洗滌硬表面和除去家具霉菌的噴霧組合物實(shí)例編號組 分78 9 101112蛋白酶#12 0.20 0.05 0.10 0.30 0.20 0.30蛋白酶#4 - -- -0.30 0.10辛基硫酸鈉 2.00 2.00 2.00 2.00 2.00 2.00十二碳烷基硫酸鈉4.00 4.00 4.00 4.00 4.00 4.00氫氧化鈉0.80 0.80 0.80 0.80 0.80 0.80硅酸鹽(Na) 0.04 0.04 0.04 0.04 0.04 0.04香料0.35 0.35 0.35 0.35 0.35 0.35水 平衡到 100％產(chǎn)物pH值為大約7。
在實(shí)例7～10中，曾用列舉在表III中的蛋白酶1～11號和13～25號，包括其它被描述于表V和表VI中的用于本發(fā)明的蛋白酶來代替12號蛋白酶，得到基本類似的結(jié)果。
在實(shí)例11和12中，也曾用表III、V和VI中列出的用于本發(fā)明的蛋白酶當(dāng)中的任意組合物來代替12號和4號蛋白酶，也得到基本類似的結(jié)果。2.洗碗碟組合物在本發(fā)明的另一個實(shí)施方案中，洗碗碟組合物含有一種或多種蛋白酶。像這里所使用的，“洗碗碟組合物”一詞是指所有形式的洗滌碗碟的組合物，包括但不限于，顆粒狀的和液體形式的。本發(fā)明的洗碗碟組合物的實(shí)施方案可用下面的實(shí)例來闡明。
實(shí)例13～18洗碗碟組合物實(shí)例編號組 分 13 14 15 16 17 18蛋白酶#12 0.05 0.50 0.02 0.40 0.10 0.03蛋白酶#4 - - - - 0.40 0.02C12～C14N-甲基0.90 0.90 0.90 0.90 0.90 0.90葡糖酰胺C12乙氧(1) 12.00 12.00 12.00 12.00 12.00 12.00硫酸鹽2-甲基-十一 4.50 4.50- 4.50 4.50 -碳酸C12乙氧(2) 4.50 4.50 4.50 4.50 4.50 4.50羧酸鹽C12醇乙氧化物 3.00 3.00 3.00 3.00 3.00 3.00(4)C12胺氧化物3.00 3.00 3.00 3.00 3.00 3.00異丙基苯磺酸鈉 2.00 2.00 2.00 2.00 2.00 2.00乙醇4.00 4.00 4.00 4.00 4.00 4.00Mg++(以MgCl20.20 0.20 0.20 0.20 0.20 0.20的形式)Ca++(以CaCl20.40 0.40 0.40 0.40 0.40 0.40的形式)水 平衡到100％產(chǎn)物pH值被調(diào)節(jié)至7。
在實(shí)例13～16中，曾用列舉在表III中的蛋白酶1～11號和13～25號，包括其它被描述于表V和表VI中的用于本發(fā)明的蛋白酶來代替12號蛋白酶，得到基本類似的結(jié)果。
在實(shí)例17和18中，也曾用表III、V和VI中列出的用于本發(fā)明的蛋白酶當(dāng)中的任意組合物來代替12號和4號蛋白酶，也得到基本類似的結(jié)果。
實(shí)例19顆粒狀自動洗碗碟組合物組 分 A B C檸檬酸 15.0 - -檸檬酸鹽 4.0 29.0 15.0丙烯酸酯/甲基丙烯酸酯共聚物6.0 - 6.0丙烯酸馬來酸共聚物 - 3.7 -干燥的添加碳酸鹽 9.0 - 20.0堿金屬硅酸鹽 8.5 17.0 9.0石蠟 - 0.5 -苯并二唑 - 0.3 -Termamyl 60 T 1.5 1.5 1.0蛋白酶#12(4.6％金屬小球) 1.6 1.6 1.6過碳酸鹽(AvO) 1.5 - -過硼酸鹽一水合物 - 0.3 1.5過硼酸鹽四水合物 - 0.9 -四乙酰基乙二胺 3.8 4.4 -二亞乙基三胺五甲基膦酸(Mg鹽) 0.13 0.13 0.13烷基乙氧基硫酸鹽-3倍乙氧化的 3.0 - -基乙氧丙氧基非離子型表面活性劑 -1.5-抑泡劑 2.0 - -Olin SLF 18非離子型表面活性劑 -- 2.0硫酸鹽 平衡至100％在實(shí)例19A～C中，曾用列舉在表III中的蛋白酶1～11號和13～25號，包括其它被描述于表V和表VI中的用于本發(fā)明的蛋白酶來代替12號蛋白酶，得到基本類似的結(jié)果。在實(shí)例19A～C中，也曾用表III、V和VI中列出的用于本發(fā)明的蛋白酶當(dāng)中的任意組合物來代替12號蛋白酶，也得到基本類似的結(jié)果。3.織物洗滌組合物在本發(fā)明的另一個實(shí)施方案中，織物洗滌組合物含有一種或多種蛋白酶。像這里所使用的，“織物洗滌組合物”是指所有形式的用來洗滌織物的洗滌劑組合物，包括但不限于顆粒狀的、液體的和條棒狀的。a.顆粒狀的織物洗滌組合物本發(fā)明的顆粒狀織物洗滌組合物包含有效量的一種或多種蛋白酶，其含量最好是組合物中活性酶的重量的大約0.001％至大約10％，更優(yōu)選地是大約0.005％至大約5％，還更優(yōu)選地是大約0.01％至大約1％。除了一種或多種蛋白酶以外，這種顆粒狀織物洗滌組合物中典型地還含有至少一種表面活性劑、一種或多種增效劑以及，在某些情況下，一種漂白劑。
本發(fā)明的顆粒狀織物洗滌組合物的實(shí)施方案可通過以下實(shí)例來闡明。
實(shí)例20～23顆粒狀織物洗滌組合物實(shí)例編號組 分 20 21 22 23蛋白酶#12(4％小球) 0.10 0.20 0.03 0.05蛋白酶#4(4％小球)- - 0.02 0.05C13線型烷基苯磺酸鹽 22.00 22.00 22.00 22.00磷酸鹽(以三聚磷酸鈉的形式) 23.00 23.00 23.00 23.00碳酸鈉 23.00 23.00 23.00 23.00硅酸鈉 14.00 14.00 14.00 14.00沸石 8.20 8.20 8.20 8.20螯合劑(二乙二三胺五乙酸) 0.40 0.40 0.40 0.40硫酸鈉 5.50 5.50 5.50 5.50水 平衡到100％在實(shí)例20～21中，曾用列舉在表III中的蛋白酶1～11號和13～25號，包括其它被描述于表V和表VI中的用于本發(fā)明的蛋白酶來代替12號蛋白酶，得到基本類似的結(jié)果。
在實(shí)例22和23中，也曾用表III、V和VI中列出的用于本發(fā)明的蛋白酶當(dāng)中的任意組合物來代替12號和4號蛋白酶，也得到基本類似的結(jié)果。
實(shí)例24～27顆粒狀織物洗滌組合物實(shí)例編號組 分24 25 26 27蛋白酶#12(4％小球)0.10 0.20 0.03 0.05蛋白酶#4(4％小球) - - 0.02 0.05C12烷基苯磺酸鹽 12.00 12.00 12.00 12.00沸石A(1～10微米) 26.00 26.00 26.00 26.002-丁基辛酸4.00 4.00 4.00 4.00C12～C14二級(2，3)烷基硫酸鹽5.00 5.00 5.00 5.00(鈉鹽)檸檬酸鈉 5.00 5.00 5.00 5.00熒光增白劑0.10 0.10 0.10 0.10硫酸鈉17.00 17.00 17.00 17.00填料，水，次要組分 平衡到100％在實(shí)例24和25中，曾用列舉在表III中的蛋白酶1～11號和13～25號，包括其它被描述于表V和表VI中的用于本發(fā)明的蛋白酶來代替12號蛋白酶，得到基本上類似的結(jié)果。
在實(shí)例26和27中，也曾用表III、V和VI中列出的用于本發(fā)明的蛋白酶當(dāng)中的任意組合物來代替12號和4號蛋白酶，也得到基本類似的結(jié)果。
實(shí)例28和29顆粒狀織物洗滌組合物實(shí)例編號組 分 28 29線型烷基苯磺酸鹽11.410.70牛脂烷基硫酸鹽 1.802.40C14～C15烷基硫酸鹽3.003.10C14～C15醇7倍乙氧化物 4.004.00牛脂醇11倍乙氧化物 1.801.80分散劑 0.070.1聚硅氧烷流體0.800.80檸檬酸三鈉 14.00 15.00檸檬酸 3.002.50沸石32.532.10馬來酸丙烯酸共聚物 5.005.00二亞乙基三胺五亞甲基膦酸1.000.20蛋白酶#12(4％小球) 0.300.30脂酶0.360.40淀粉酶 0.300.30硅酸鈉 2.002.50硫酸鈉 3.505.20聚乙烯基吡咯烷酮0.300.50過硼酸鹽0.501.0酚磺酸鹽0.1 0.2過氧化物酶 0.1 0.1次要組分 加到100％
實(shí)例30和31顆粒狀織物洗滌組合物實(shí)例編號組 分3031線型C12烷基苯磺酸鈉 6.58.0硫酸鈉 15.0 18.0沸石A26.0 22.0次氯基三乙酸鈉 5.05.0聚乙烯基吡咯烷酮 0.50.7四乙?；叶? 3.03.0硼酸 4.0 -過硼酸 0.51.0酚磺酸鹽 0.10.2蛋白酶#12(4％小球) 0.40.4填充劑(例如硅酸鹽、碳酸鹽、 加到100香料、水)實(shí)例32緊密的顆粒狀織物洗滌組合物組 分 重量％烷基硫酸鹽8.0烷基乙氧基硫酸鹽 2.0C25和C45醇3倍和7倍乙氧化物 6.0的混合物聚羥基脂肪酸酰胺 2.5沸石 17.0層狀硅酸鹽/檸檬酸鹽 16.0碳酸鹽7.0馬來酸丙烯酸共聚物5.0污垢釋出聚合物0.4羧甲基纖維素 0.4聚(4-乙烯基吡啶)-N-氧化物 0.1乙烯基咪唑和乙烯基吡咯烷酮的共0.1聚物PEG 2000 0.2蛋白酶#12(4％小球)0.5脂酶 0.2纖維素酶 0.2四乙?；叶?.0過碳酸鹽 22.0乙二胺二丁二酸0.3抑泡劑3.54，4′-雙(2-嗎啉基-4-苯胺基- 0.25s-三嗪-6-基氨基)二苯乙烯-2，2′-二磺酸二鈉鹽4，4′-雙(2-磺酸基肉桂基)聯(lián)苯 0.05二鈉鹽水、香料和次要組分 加到100
實(shí)例33顆粒狀織物洗滌組合物組 分重量％線型烷基苯磺酸鹽 7.6C16～C18烷基硫酸鹽 1.3C14-15醇7倍乙氧化物4.0椰-烷基-二甲基羥乙基氯化銨 1.4分散劑 0.07聚硅氧烷流體 0.8檸檬酸三鈉 5.0沸石4A 15.0馬來酸丙烯酸共聚物 4.0二亞乙基三胺五亞甲基膦酸 0.4過硼酸鹽 15.0四乙?；叶?5.0綠土 10.0聚(氧乙烯)(分子量300,000) 0.3蛋白酶#12(4％小球) 0.4脂酶 0.2淀粉酶 0.3纖維素酶 0.2硅酸鈉 3.0碳酸鈉 10.0羧甲基纖維素 0.2增白劑 0.2水、香料和次要組分 加到100
實(shí)例34顆粒狀織物洗滌組合物組 分重量％線型烷基苯磺酸鹽 6.92牛脂烷基硫酸鹽2.05C14-15醇7倍乙氧化物 4.4C12-15烷基乙氧硫酸鹽-3倍乙氧化物 0.16沸石 20.2檸檬酸鹽 5.5碳酸鹽15.4硅酸鹽3.0馬來酸丙烯酸共聚物4.0羧甲基纖維素 0.31污垢釋出聚合物0.30蛋白酶#12(4％小球)0.2脂酶 0.36纖維素酶 0.13過硼酸鹽四水合物 11.64過硼酸鹽一水合物 8.7四乙?；叶?.0二亞乙基三胺五亞甲基膦酸 0.38硫酸鎂0.40增白劑0.19香料、聚硅氧烷、抑泡劑0.85次要組分 加到100
在這里的實(shí)例28～34的每個實(shí)例中，曾用列舉在表III中的蛋白酶1～11號和13～25號，包括其它被描述于表V和表VI中的用于本發(fā)明的蛋白酶來代替12號蛋白酶，得到基本類似的結(jié)果。也曾在實(shí)例28～34中用表III、V和VI中列出的用于本發(fā)明的蛋白酶當(dāng)中的任意組合物來代替12號蛋白酶，也得到基本類似的結(jié)果。b.液體織物洗滌組合物本發(fā)明的液體織物洗滌組合物包含有效量的一種或多種蛋白酶，其含量優(yōu)選地是組合物的活性蛋白酶重量的大約0.0001％至大約10％，更優(yōu)選地是大約0.001％至大約1％，最優(yōu)選地是大約0.001％至大約0.1％。這樣的液體織物洗滌組合物典型地還另外包含一種陰離子表面活性劑、一種脂肪酸、一種水溶性的洗滌增效劑以及水。
本發(fā)明的液體織物洗滌組合物的實(shí)施方案將通過以下的實(shí)例來闡明。
實(shí)例35～39液體織物洗滌組合物實(shí)例編號組 分35 36 37 38 39蛋白酶#12 0.05 0.03 0.30 0.03 0.10蛋白酶#4 - - - 0.01 0.20C12～C14烷基硫酸鈉 20.0 20.0 20.0 20.0 20.02-丁基辛酸5.00 5.00 5.00 5.00 5.00檸檬酸鈉 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00C10醇乙氧化物(3) 13.00 13.00 13.00 13.00 13.00一乙醇胺 2.50 2.50 2.50 2.50 2.50水/丙二醇/乙醇 平衡到100％(100∶1∶1)在實(shí)例35～37中，曾用列舉在表III中的蛋白酶1～11號和13～25號，包括其它被描述于表V和表VI中的用于本發(fā)明的蛋白酶來代替12號蛋白酶，得到基本類似的結(jié)果。
在實(shí)例38～39中，也曾用表III、V和VI中列出的用于本發(fā)明的蛋白酶當(dāng)中的任意組合物來代替12號和4號蛋白酶，也得到基本類似的結(jié)果。
實(shí)例40～41液體織物洗滌組合物實(shí)例編號組 分 40 41C12-14烯基丁二酸3.0 8.0檸檬酸一水合物 10.0 15.0C12-15烷基硫酸鈉8.0 8.0C12-15醇2倍乙氧化物的硫酸鈉鹽 -3.0C12-15醇7倍乙氧化物 -8.0C12-15醇5倍乙氧化物 8.0 -二亞乙基三胺五(亞甲基膦酸) 0.2 -油酸1.8 -乙醇4.0 4.0丙二醇 2.0 2.0蛋白酶#12 0.2 0.2
聚乙烯基吡咯烷酮 1.0 2.0抑泡劑 0.150.15NaOH 調(diào)到pH值為7.5過硼酸鹽 0.5 1.0酚磺酸鹽 0.1 0.2過氧化物酶 0.4 0.1水和次要組分加到100份在這里的實(shí)例40和41的每個實(shí)例中，曾用列舉在表III中的蛋白酶1～11號和13～25號，包括其它被描述于表V和表VI中的用于本發(fā)明的蛋白酶來代替12號蛋白酶，得到基本類似的結(jié)果。也曾在實(shí)例40和41中，用表III、V和VI中列出的用于本發(fā)明的蛋白酶當(dāng)中的任意組合物來代替12號蛋白酶，也得到基本類似的結(jié)果。c.條棒狀織物洗滌組合物適合于手洗污垢織物的本發(fā)明的條棒狀織物洗滌組合物包含有效量的一種或多種蛋白酶，其含量最好是組合物重量的大約0.001％至大約10％，更優(yōu)選地是大約0.01％至大約1％。
本發(fā)明的條棒狀織物洗滌組合物的實(shí)施方案可通過以下的實(shí)例來闡明。
實(shí)例42～45條棒狀織物洗滌組合物實(shí)例編號組分 42434445蛋白酶#12 0.3-0.1 0.02蛋白酶#4- -0.4 0.03C12～C16烷基硫酸鈉 20.0 20.0 20.0 20.00C12～C14N-甲基葡糖酰胺 5.0 5.0 5.0 5.00C11～C13烷基苯磺酸鈉 10.0 10.0 10.0 10.00碳酸鈉 25.0 25.0 25.0 25.00焦磷酸鈉 7.0 7.0 7.0 7.00三聚磷酸鈉 7.0 7.0 7.0 7.00沸石A(0.1μ～10μ) 5.0 5.0 5.0 5.00羧甲基纖維素 0.2 0.2 0.2 0.20聚丙烯酸酯(MW 1400)0.2 0.2 0.2 0.20椰脂酸-乙醇胺酰胺 5.0 5.0 5.0 5.00增白劑、香料 0.2 0.2 0.2 0.2CaSO41.0 1.0 1.0 1.00MgSO41.0 1.0 1.0 1.00水 4.0 4.0 4.0 4.00填充劑*平衡到100％注*可選自方便的材料諸如CaCO3、滑石、粘土、硅酸鹽等。
在實(shí)例42和43中，曾用列舉在表III中的蛋白酶1～11號和13～25號，包括其它被描述于表V和表VI中的用于本發(fā)明的蛋白酶來代替12號蛋白酶，得到基本類似的結(jié)果。
在實(shí)例44和45中，也曾用表III、V和VI中列出的用于本發(fā)明的蛋白酶當(dāng)中的任意組合物來代替12號和4號蛋白酶，也得到基本類似的結(jié)果。B.其它的洗滌組合物除了上面討論過的硬表面洗滌、碗碟洗滌和織物洗滌組合物以外，一種或多種蛋白酶也可加入各種其它的需要水解一種不溶性底物的洗滌組合物中去。這類其它的洗滌組合物包括但不限于，口腔用洗滌組合物、假牙洗滌組合物以及觸點(diǎn)鏡頭洗滌組合物等。
1.口腔用洗滌組合物在本發(fā)明的另一個實(shí)施方案中，藥物上可接受量的一種或多種蛋白酶被包括在組合物中，用來從牙齒或假牙上除去蛋白質(zhì)性的污漬。像這里所使用的，“口腔用洗滌組合物”是指洗牙水、牙膏、牙膠、牙粉、漱口劑、口腔噴霧劑、口腔膠、口香糖、糖錠、香粉、藥片、生物膠、預(yù)防膏、牙科用溶液等。優(yōu)選地是，本發(fā)明的口腔洗滌組合物含有組合物重量的大約0.0001％至大約20％的一種或多種蛋白酶、更優(yōu)選地是大約0.001％至大約10％，還更優(yōu)選地是大約0.01％至大約5％的蛋白酶，以及一種藥物上可接受的載體。像這里所使用的，“藥物上可接受的”意指這一術(shù)語所描述的藥物、藥劑或惰性組分是適宜于用來和人類和較低等動物的組織相接觸，而沒有不應(yīng)有的毒性、不相容性、不穩(wěn)定性、刺激性、過敏性反應(yīng)等，并有相稱的合理的受益/風(fēng)險比率。
典型地，這種口腔洗滌組合物的口腔洗滌組分的藥物上可接受的口腔洗滌載體組分通常含量為組合物重量的大約50％至大約99.99％，優(yōu)選地是大約65％至大約99.99％，更優(yōu)選地是大約65％至大約99％。
可被包括在本發(fā)明的口腔洗滌組合物中的藥物上可接受的載體組分和供選擇的組分，對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員是眾所周知的。有許多用于口腔洗滌組合物的組合物類型、載體組分和供選擇的組分已被公開于1992年3月17日授權(quán)的Seibel的美國專利5,096,700、1991年7月2日授權(quán)的Sampathkumar的美國專利5,028,414、1991年7月2日授權(quán)的Benedict、Bush和Sunberg的美國專利5,028,415中，所有這些專利都在此引入作為參考。
本發(fā)明的口腔洗滌組合物的實(shí)施方案將通過以下的實(shí)例來闡明。
實(shí)例46～49洗牙水組合物實(shí)例編號組 分46 47 48 49蛋白酶#12 2.000 3.500 1.500 2.000山梨醇(70％水溶液) 35.000 35.000 35.000 35.000PEG-6*1.000 1.000 1.000 1.000硅石牙科磨蝕劑**20.000 20.000 20.000 20.000氟化鈉 0.243 0.243 0.243 0.243二氧化鈦0.500 0.500 0.500 0.500糖精鈉 0.286 0.286 0.286 0.286烷基硫酸鈉(27.9％水溶液)4.000 4.000 4.000 4.000調(diào)味劑 1.040 1.040 1.040 1.040羧乙烯基聚合物***0.300 0.300 0.300 0.300Carrageenan****0.800 0.800 0.800 0.800水 平衡到100％注*PEG-6＝分子量為600的聚乙二醇**沉淀的硅石被鑒定為J.M.Huber提供的Zeodent 119***B.F.Goodrich化學(xué)公司提供的Carbopol****Hercules化學(xué)公司提供的Iota Carrageenan。
在實(shí)例46～49中，曾用列舉在表III中的蛋白酶1～11號和13～25號，包括其它被描述于表V和表VI中的用于本發(fā)明的蛋白酶來代替12號蛋白酶，得到基本類似的結(jié)果。在實(shí)例46～49中，也曾用表III、V和VI中列出的用于本發(fā)明的蛋白酶當(dāng)中的任意組合物來代替12號蛋白酶，也得到基本類似的結(jié)果。
實(shí)例50～53漱口劑組合物實(shí)例編號組 分 50 51 52 53蛋白酶#12 3.00 7.50 1.00 5.00SDA 40醇 8.00 8.00 8.00 8.00調(diào)味劑 0.08 0.08 0.08 0.08乳化劑 0.08 0.08 0.08 0.08氟化鈉 0.05 0.05 0.05 0.05甘油 10.00 10.00 10.00 10.00增香劑 0.02 0.02 0.02 0.02苯甲酸 0.05 0.05 0.05 0.05氫氧化鈉 0.20 0.20 0.20 0.20染料 0.04 0.04 0.04 0.04水平衡到100％在實(shí)例50～53中，曾用列舉在表III中的蛋白酶1～11號和13～25號，包括其它被描述于表V和表VI中的用于本發(fā)明的蛋白酶來代替12號蛋白酶，得到基本類似的結(jié)果。在實(shí)例50～53中，也曾用表III、V和VI中列出的用于本發(fā)明的蛋白酶當(dāng)中的任意組合物來代替12號蛋白酶，也得到基本類似的結(jié)果。
實(shí)例54～57糖錠組合物實(shí)例編號組 分54 55 56 57蛋白酶#120.01 0.03 0.10 0.02山梨糖醇 17.5017.5017.5017.50甘露糖醇 17.5017.5017.5017.50淀粉 13.6013.6013.6013.60增香劑 1.20 1.20 1.20 1.20調(diào)味劑 11.7011.7011.7011.70顏料 0.10 0.10 0.10 0.10玉米糖漿 平衡到100％在實(shí)例54～57中，曾用列舉在表III中的蛋白酶1～11號和13～25號，包括其它被描述于表V和表VI中的用于本發(fā)明的蛋白酶來代替12號蛋白酶，得到基本類似的結(jié)果。在實(shí)例54～57中，也曾用表III、V和VI中列出的用于本發(fā)明的蛋白酶當(dāng)中的任意組合物來代替12號蛋白酶，也得到基本類似的結(jié)果。
實(shí)例58～61口香糖組合物實(shí)例編號組 分 58 59 60 61蛋白酶#12 0.03 0.02 0.10 0.05山梨糖醇晶體 38.4438.4038.4038.40Paloja膠基*20.0020.0020.0020.00山梨糖醇(70％水溶液) 22.0022.0022.0022.00甘露糖醇 10.0010.0010.0010.00甘油 7.56 7.56 7.56 7.56調(diào)味劑1.00 1.00 1.00 1.00注*L.A.Dreyfus公司提供。
在實(shí)例58～61中，曾用列舉在表III中的蛋白酶1～11號和13～25號，包括其它被描述于表V和表VI中的用于本發(fā)明的蛋白酶來代替12號蛋白酶，得到基本類似的結(jié)果。在實(shí)例58～61中，也曾用表III、V和VI中列出的用于本發(fā)明的蛋白酶當(dāng)中的任意組合物來代替12號蛋白酶，也得到基本類似的結(jié)果。2.假牙洗滌組合物在本發(fā)明的另一個實(shí)施方案中，為在口腔外洗滌假牙的假牙洗滌組合物含有一種或多種蛋白酶。這種假牙洗滌組合物包含有效量的一種或多種蛋白酶，其含量優(yōu)選地是組合物重量的大約0.0001％至大約50％的一種或多種蛋白酶、更優(yōu)選地是大約0.001％至大約35％、還更優(yōu)選地是大約0.01％至大約20％，以及一種假牙洗滌載體。各種假牙洗滌組合物形式諸如起泡沫的藥片等在本領(lǐng)域內(nèi)是眾所周知的(參看例如Young的美國專利5,055,305，在此引入作為參考)，并且為從假牙上除去蛋白質(zhì)性的污漬而并入一種或多種蛋白酶一般也是合適的。
本發(fā)明的假牙洗滌組合物的實(shí)施方案將通過下面的實(shí)例來闡明。
實(shí)例62～65雙層起泡假牙洗滌藥片實(shí)例編號組 分 6263 64 65酸性層蛋白酶#12 1.01.50.010.05酒石酸24.0 24.0 24.00 24.00碳酸鈉4.04.04.004.00氨基磺酸 10.0 10.0 10.00 10.00PEG 20,0004.04.04.004.00碳酸氫鈉 24.5 24.5 24.50 24.50過硫酸鉀 15.0 15.0 15.00 15.00酸性焦磷酸鈉 7.07.07.007.00焦化硅石 2.02.02.002.00四乙酰基乙二胺7.07.07.007.00蓖麻油?；腔《猁}0.50.50.500.50調(diào)味劑1.01.01.001.00堿性層過硼酸鈉一水合物 32.0 32.0 32.00 32.00碳酸氫鈉 19.0 19.0 19.00 19.00EDTA 3.03.03.003.00三聚磷酸鈉12.0 12.0 12.00 12.00PEG 20,0002.02.02.002.00過硫酸鉀 26.0 26.0 26.00 26.00碳酸鈉2.02.02.002.00焦化硅石 2.02.02.002.00染料/調(diào)味劑 2.02.02.002.00在實(shí)例62～65中，曾用列舉在表III中的蛋白酶1～11號和13～25號，包括其它被描述于表V和表VI中的用于本發(fā)明的蛋白酶來代替12號蛋白酶，得到基本類似的結(jié)果。在實(shí)例62～65中，也曾用表III、V和VI中列出的用于本發(fā)明的蛋白酶當(dāng)中的任意組合物來代替12號蛋白酶，也得到基本類似的結(jié)果。3.人身洗滌組合物在本發(fā)明的另一個實(shí)施方案中，為洗滌皮膚(以液體和條棒的形式)的人身洗滌組合物包含一種或多種蛋白酶。這類組合物中蛋白酶的含量典型地是組合物重量的大約0.001％至大約5％，優(yōu)選地是大約0.005％至大約2％，最優(yōu)選地是大約0.01％至大約0.8％。像這里描述的其中包含有蛋白酶的經(jīng)優(yōu)選的人身洗滌組合物已在美國專利申請SN 08/121,623和SN 08/121,624中講授過，這兩項(xiàng)專利都是Visscher等人在1993年9月14日提出申請的，它們的公開說明書在此全部引入作為參考。這類組合物將通過以下實(shí)例來闡明。
實(shí)例66含肥皂的液體人身洗滌組合物組 分 重量％肥皂(鉀或鈉) 15.0030％月桂酸酯30％肉豆蔻酸酯25％軟脂酸酯15％硬脂酸酯脂肪酸(按上述比率) 4.50月桂基肌氨酸鈉 6.00Laureth-3硫酸鈉 0.66椰油酰胺基丙基三甲銨乙內(nèi)酯 1.33甘油 15.00丙二醇 9.00Polyquaternium 100.80乙二醇二硬脂酸酯(EDTA) 1.50對羥基苯甲酸丙酯 0.10對羥基苯甲酸甲酯 0.20蛋白酶#120.10KOH或NaOH 如果必需用來調(diào)節(jié)pH值硫酸鈣 3醋酸 3水 平衡到100
實(shí)例67人身洗滌條狀組合物組 分 重量％椰脂?；u乙磺酸鈉 47.20鯨蠟酰基硫酸鈉 9.14石蠟9.05鈉肥皂(就地形成)3.67羥乙磺酸鈉 5.51氯化鈉 0.45二氧化鈦0.4EDTA三鈉鹽 0.1Trisodium Etidronate0.1香料 1.20Na2SO40.87蛋白酶#12 0.10水/次要組分 平衡到100在實(shí)例66～67中，曾用列舉在表III中的蛋白酶1～11號和13～25號，包括其它被描述于表V和表VI中的用于本發(fā)明的蛋白酶來代替12號蛋白酶，得到基本類似的結(jié)果。在實(shí)例66～67中，也曾用表III、V和VI中列出的用于本發(fā)明的蛋白酶當(dāng)中的任意組合物來代替12號和4號蛋白酶，也得到基本類似的結(jié)果。
實(shí)例68洗滌品質(zhì)試驗(yàn)用于本發(fā)明組合物中的蛋白酶變種的洗滌性能，是通過測量除去EMPA 116棉布小塊布樣上的污漬(血液/奶/炭黑在棉布上)(Testfabrics，Inc.，Middlesex.NJ07030)來評價的。
把6塊剪成3×4-1/2英寸帶鋸齒邊的EMPA 116布樣放在含有1000毫升硬度為15 gpg(Ca++∶Mg++為3∶1重量∶重量)的水、7克洗滌劑和合適的酶的7243S Terg-O-Tometer型洗滌機(jī)(United States Testing Co.，Inc.，Hoboken，NJ出品)的每個罐中。所用洗滌劑是德國wfk-Testgewebe GmbH，Adlerstrasse 42，Postfach 130762，D-47759 Krefeld，生產(chǎn)的WFK1洗滌劑組 分最終配方中的％沸石A 25％硫酸鈉 25％蘇打灰 10％線型烷基苯磺酸鹽 8.8％醇乙氧化物(7～8EO) 4.5％鈉肥皂 3％硅酸鈉(SiO2∶Na2O為3.3∶1) 3％往這基礎(chǔ)洗滌劑中加入以下組分組 分 最終配方中的％過硼酸鈉一水合物 13％共聚物(Sokalan CP5)4％TAED(Mykon ATC Green) 3％酶 0.5％增白劑(Tinopal AMS-GX) 0.2％過硼酸鈉一水合物是從Degussa Corporation，Ridgefield-Park.NJ 07660買來的。Sokalan CP5是從BASF Corporation，Parsippany，NJ 07054買來的。Mykon ATC Green(TAED，四乙?；叶?是從英國Warwick International，Limited，Mostyn，Holywell，ClwydCH8 9HE買來的。Tinopal AMS GX是從Ciba-Geigy Corporation.Greensboro，NC 27419買來的。
6塊EMPA 116布樣在60℃在含有酶的洗滌劑中洗滌30分鐘，接著在1000毫升水漂洗兩次，每次5分鐘。為做標(biāo)準(zhǔn)曲線，所加酶的最終濃度為0.05至1ppm；為日常分析用，酶的濃度為0.25ppm。布樣被干燥和擠壓后，用CR 200型Minolta ChromaMeter(Minolta Corporation的產(chǎn)品，Ramsey，NJ 07446)基于L*a*b*標(biāo)度的L值測量布樣的反射度。品質(zhì)用遲緩芽孢桿菌(GG36)蛋白酶品質(zhì)的百分?jǐn)?shù)來報告，它是通過用需要達(dá)到同樣除污品質(zhì)的變種蛋白酶的量來除遲緩芽孢桿菌(GG36)蛋白酶的量，再乘100計算出來的。數(shù)據(jù)被列于表VII中。
表VII酶 洗滌品質(zhì)遲緩芽孢桿菌枯草溶菌素100N76D 310N76D/S103A230N76D/V104I130N76D/V107V160N76D/S99D/S101R 370N76D/S99D/S103A 290N76D/S101R/S103A 130N76D/S101R/V104I 300N76D/S103A/V104I 320N76D/S103G/V104I 160N76D/S103A/V104F 210N76D/S103A/V104N 110N76D/S103A/V104T 170N76D/V104I/I107V 210N76D/S99D/S101R/S103A 220N76D/S99D/S101R/V104I 140N76D/S101G/S103A/V104I170N76D/S101R/S103A/V104I150N76D/S103A/V104I/S105A170N76D/S103A/V104T/I107A120N76D/S103A/V104T/I107L110N76D/S103A/V104I/L126F110N76D/S103A/V104I/S128G280N76D/S103A/V104I/L135I160N76D/S103A/V104I/L135V160N76D/S103A/V104I/D197E170N76D/S103A/V104I/N204A160N76D/S103A/V104I/N204G150N76D/S103A/V104I/P210I470N76D/S103A/V104I/M222A100N76D/S103A/V104I/T260P280N76D/S103A/V104I/S265N190
實(shí)例69在液體洗滌劑配方中蛋白酶的穩(wěn)定性在液體洗滌劑配方中對蛋白酶失活穩(wěn)定性的比較試驗(yàn)，是按照這里概括的實(shí)驗(yàn)程序?qū)t緩芽孢桿菌枯草溶菌素和它的變種酶N76D/S103A/V104I進(jìn)行的。為研究所用的洗滌劑配方，是從市場買來的由The Procter & Gamble公司在美國制造的瓶裝TideUltra液體洗衣洗滌劑。洗滌劑配方必須先經(jīng)熱處理以使其中就地形成的酶失活。這可通過把這種洗滌劑在96℃保溫4.5小時來完成。把濃度范圍在20克/立升酶的遲緩芽孢桿菌枯草溶菌素和N76D/S103A/V104I變種酶的濃縮制品加到在室溫的、已經(jīng)過熱處理的Tide Ultra中，使酶在洗滌劑配方中的最終濃度為0.3克/立升酶。然后把這種帶有酶的、經(jīng)熱處理的洗滌劑在恒溫50℃的水浴中保溫。在0、24、46、76、和112小時的時間間隔分別從恒溫試管中取出等分的試樣，并通過把試樣加到恒溫于25℃的1厘米比色池中來試驗(yàn)酶的活性，比色池中含有1.2mM溶解在0.1Mtris-HCl緩沖液中的pH值為8.6的合成肽底物丁二酰-丙氨-丙氨-脯氨-苯丙氨酰對硝基苯胺。最初的線性反應(yīng)速率是通過監(jiān)測反應(yīng)產(chǎn)物對-硝基苯胺在410nm處的吸收率作為時間的函數(shù)來進(jìn)行分光光度法跟蹤的。如圖10所示，可觀察到變種酶N76D/S103A/V104I比天然的遲緩芽孢桿菌酶具有明顯更大的對失活的穩(wěn)定性。在特定的試驗(yàn)條件下，在Tide Ultra洗滌劑配方中對兩種酶估算的失活半衰期，對遲緩芽孢桿菌枯草溶菌素為45小時，對N76D/S103A/V104I變種酶為125小時。
雖然已經(jīng)描述了本主題發(fā)明的具體實(shí)施方案，但顯然本領(lǐng)域的技術(shù)人員在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下仍能對本主題發(fā)明進(jìn)行各種變化和修改。在所附的權(quán)利要求中，函蓋了想要的所有在本發(fā)明范圍內(nèi)的這類修改。
序列表(1)一般訊息(i)申請人 Baeck，Andre(NMN)Ghosh，Chanchal K.
Graycar，Thomas P.
Bott，Richard R.
Wilson，Lori J.
Brode，Philip F.，IIIBarnett，Bobby L.
Rubingh，Donn N.(ii)發(fā)明名稱含蛋白酶的洗滌組合物(iii)序列數(shù)目15(iv)通信地址(A)地址The Procter & Gamble Company(B)街道11810 East River Road(C)城市辛辛那提(Cincinnati)(D)州奧克拉荷馬(OH)(E)國家美國(USA)(F)郵政編碼45253-8707(v)可讀出的計算機(jī)(A)介質(zhì)類型硬盤(B)計算機(jī)IBM PC兼容的(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件Patentin Release #1.0，版本#1.25
(vi)現(xiàn)行申請日期(A)申請?zhí)?B)申請日期1994年10月13日(C)分類(viii)代理人/代理商信息(A)姓名Zerby，Kim William(B)登記號32,323(C)參考/摘要5040R(ix)電訊信息(A)電話(513)627-2885(B)電傳(513)627-0318(2)SEQ ID NO1的訊息(i)序列特性(A)長度19堿基對(B)類型核酸(C)股單股(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQ ID NO1GAAGCTGCAA CTCGTTAAA 19(2)SEQ ID NO2的訊息(i)序列特性(A)長度18堿基對(B)類型核酸(C)股單股
(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQ ID NO2GCTGCTCTAG ACAATTCG18(2)SEQ ID NO3的訊息(i)序列特性(A)長度39堿基對(B)類型核酸(C)股單股(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQ ID NO3GTATTAGGGG CGGACGGTCG AGGCGCCATC AGCTCGATT 39(2)SEQ ID NO4的訊息(i)序列特性(A)長度33堿基對(B)類型核酸(C)股單股(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQ ID NO4TCAGGTTCGG TCTCGAGCGT TGCCCAAGGA TTG33(2)SEQ ID NO5的訊息(i)序列特性(A)長度22堿基對
(B)類型核酸(C)股單股(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQ ID NO5CACGTTGCTA GCTTGAGTTT AG 22(2)SEQ ID NO6的訊息(i)序列特性(A)長度1497堿基對(B)類型核酸(C)股單股(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQ ID NO6GGTCTACTAA AATATTATTC CATACTATAC AATTAATACA CAGAATAATC TGTCTATTGG 60TTATTCTGCA AATGAAAAAA AGGAGAGGAT AAAGAGTGAG AGGCAAAAAA GTATGGATCA 120GTTTGCTGTT TGCTTTAGCG TTAATCTTTA CGATGGCGTT CGGCAGCACA TCCTCTGCCC 180AGGCGGCAGG GAAATCAAAC GGGGAAAAGA AATATATTGT CGGGTTTAAA CAGACAATGA 240GCACGATGAG CGCCGCTAAG AAGAAAGATG TCATTTCTGA AAAAGGCGGG AAAGTGCAAA 300AGCAATTCAA ATATGTAGAC GCAGCTTCAG TCACATTAAA CGAAAAAGCT GTAAAAGAAT 360TGAAAAAAGA CCCGAGCGTC GCTTACGTTG AAGAAGATCA CGTAGCACAT GCGTACGCGC 420AGTCCGTGCC TTACGGCGTA TCACAAATTA AAGCCCCTGC TCTGCACTCT CAAGGCTACA 480CTGGATCAAA TGTTAAAGTA GCGGTTATCG ACAGCGGTAT CGATTCTTCT CATCCTGATT 540TAAAGGTAGC AAGCGGAGCC AGCATGGTTC CTTCTGAAAC AAATCCTTTC CAAGACAACA 600ACTCTCACGG AACTCACGTT GCCGGCACAG TTGCGGCTCT TAATAACTCA ATCGGTGTAT 660TAGGCGTTGC GCCAAGCGCA TCACTTTACG CTGTAAAAGT TCTCGGTGCT GACGGTTCCG 720GCCAATACAG CTGGATCATT AACGGAATCG AGTGGGCGAT CGCAAACAAT ATGGACGTTA 780TTAACATGAG CCTCGGCGGA CCTTCTGGTT CTGCTGCTTT AAAAGCGGCA GTTGATAAAG 840CCGTTGCATC CGGCGTCGTA GTCGTTGCGG CAGCCGGTAA CGAAGGCACT TCCGGCAGCT 900CAAGCACAGT GGGCTACCCT GGTAAATACC CTTCTGTCAT TGCAGTAGGC GCTGTTGACA 960GCAGCAACCA AAGAGCATCT TTCTCAAGCG TAGGACCTGA GCTTGATGTC ATGGCACCTG1020GCGTATCTAT CCAAAGCACG CTTCCTGGAA ACAAATACGG GGCGTACAAC GGTACGTCAA1080TGGCATCTCC GCACGTTGCC GGAGCGGCTG CTTTGATTCT TTCTAAGCAC CCGAACTGGA1140CAAACACTCA AGTCCGCAGC AGTTTAGAAA ACACCACTAC AAAACTTGGT GATTCTTTGT1200ACTATGGAAA AGGGCTGATC AACGTACAAG CGGCAGCTCA GTAAAACATA AAAAACCGGC1260CTTGGCCCCG CCGGTTTTTT ATTATTTTTC TTCCTCCGCA TGTTCAATCC GCTCCATAAT1320CGACGGATGG CTCCCTCTGA AAATTTTAAC GAGAAACGGC GGGTTGACCC GGCTCAGTCC1380CGTAACGGCC AACTCCTGAA ACGTCTCAAT CGCCGCTTCC CGGTTTCCGG TCAGCTCAAT1440GCCATAACGG TCGGCGGCGT TTTCCTGATA CCGGGAGACG GCATTCGTAA TCGGATC 1497(2)SEQ ID NO7的訊息(i)序列特性(A)長度275氨基酸(B)類型氨基酸(C)股單股(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列描述SEQ ID NO7Ala Gln Ser Val Pro Tyr Gly Val Ser Gln Ile Lys Ala Pro Ala Leu1 5 10 15His Ser Gln Gly Tyr Thr Gly Ser Asn Val Lys Val Ala Val Ile Asp20 25 30Ser Gly Ile Asp Ser Ser His Pro Asp Leu Lys Val Ala Gly Gly Ala35 40 45Ser Mer Val Pro Ser Glu Thr Asn Pro Phe Gln Asp Asn Asn Ser His5055 60Gly Thr His Val Ala Gly Thr Val Ala Ala Leu Asn Asn Ser Ile Gly6570 7580Val Leu Gly Val Ala Pro Ser Ala Ser Leu Tyr Ala Val Lys Val Leu85 90 95Gly Ala Asp Gly Ser Gly Gln Tyr Ser Trp Ile Ile Asn Gly Ile Glu100 105 110Trp Ala Ile Ala Asn Asn Met Asp Val Ile Asn Met Ser Leu Gly Gly115 120 125Pro Ser Gly Ser Ala Ala Leu Lys Ala Ala Val Asp Lys Ala Val Ala130 135 140Ser Gly Val Val Val Val Ala Ala Ala Gly Asn Glu Gly Thr Ser Gly145 150 155 160Ser Ser Ser Thr Val Gly Tyr Pro Gly Lys Tyr Pro Ser Val Ile Ala165 170 175Val Gly Ala Val Asp Ser Ser Asn Gln Arg Ala Ser Phe Ser Ser Val180 185 190Gly Pro Gly Leu Asp Val Met Ala Pro Gly Val Ser Ile Gln Ser Thr195 200 205Leu Pro Gly Asn Lys Tyr Gly Ala Tyr Asn Gly Thr Ser Met Ala Ser210 215 220Pro His Val Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ile Leu Ser Lys His Pro Asn225 230 235 240Trp Thr Asn Thr Gln Val Arg Ser Ser Leu Glu Asn Thr Thr Thr Lys245 250 255Leu Gly Asp Ser Phe Tyr Tyr Gly Lys Gly Leu Ile Asn Val Gln Ala260 265 270Ala Ala Gln275(2)SEQ ID NO8的訊息(i)序列特性(A)長度275氨基酸(B)類型氨基酸(C)股單股(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列描述SEQ ID NO8Ala Gln Ser Val Pro Tyr Gly Ile Ser Gln Ile Lys Ala Pro Ala Leu1 5 10 15His Ser Gln Gly Tyr Thr Gly Ser Asn Val Lys Val Ala Val Ile Asp20 25 30Ser Gly Ile Asp Ser Ser His Pro Asp Leu Asn Val Arg Gly Gly Ala35 40 45Ser Phe Val Pro Ser Glu Thr Asn Pro Tyr Gln Asp Gly Ser Ser His50 55 60Gly Thr His Val Ala Gly Thr Ile Ala Ala Leu Asn Asn Ser Ile Gly65 70 75 80Val Leu Gly Val Ser Pro Ser Ala Ser Leu Tyr Ala Val Lys Val Leu85 90 95Asp Ser Thr Gly Ser Gly Gln Tyr Ser Trp Ile Ile Asn Gly Ile Glu100 105 110Trp Ala Ile Ser Asn Asn Met Asp Val Ile Asn Met Ser Leu Gly Gly115 120 125Pro Thr Gly Ser Thr Ala Leu Lys Thr Val Val Asp Lys Ala Val Ser130 135 140Ser Gly Ile Val Val Ala Ala Ala Ala Gly Asn Glu Gly Ser Ser Gly145 150 155 160Ser Thr Ser Thr Val Gly Tyr Pro Ala Lys Tyr Pro Ser Thr Ile Ala165 170 175Val Gly Ala Val Asn Ser Ser Asn Gln Arg Ala Ser Phe Ser Ser Ala180 185 190Gly Ser Glu Leu Asp Val Met Ala Pro Gly Val Ser Ile Gln Ser Thr195 200 205Leu Pro Gly Gly Thr Tyr Gly Ala Tyr Asn Gly Thr Ser Met Ala Thr210 215 220Pro His Val Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ile Leu Ser Lys His Pro Thr225 230 235 240Trp Thr Asn Ala Gln Val Arg Asp Arg Leu Glu Ser Thr Ala Thr Tyr245 250 255Leu Gly Asn Ser Phe Tyr Tyr Gly Lys Gly Leu Ile Asn Val Gln Ala260 265 270Ala Ala Gln275(2)SEQ ID NO9的訊息(i)序列特性(A)長度274氨基酸(B)類型氨基酸(C)股單股(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列描述SEQ ID NO9Ala Gln Thr Val Pro Tyr Gly Ile Pro Leu Ile Lys Ala Asp Lys Val1 510 15Gln Ala Gln Gly Phe Lys Gly Ala Asn Val Lys Val Ala Val Leu Asp20 25 30Thr Gly Ile Gln Ala Ser His Pro Asp Leu Asn Val Val Gly Gly Ala35 40 45Ser Phe Val Ala Gly Glu Ala Tyr Asn Thr Asp Gly Asn Gly His Gly50 55 60Thr His Val Ala Gly Thr Val Ala Ala Leu Asp Asn Thr Thr Gly Val65 70 75 80Leu Gly Val Ala Pro Ser Val Ser Leu Tyr Ala Val Lys Val Leu Asn85 90 95Ser Ser Gly Ser Gly Ser Tyr Ser Gly Ile Val Ser Gly Ile Glu Trp100 105 110Ala Thr Thr Asn Gly Met Asp Val Ile Asn Met Ser Leu Gly Gly Ala115 120 125Ser Gly Ser Thr Ala Met Lys Gln Ala Val Asp Asn Ala Tyr Ala Arg130 135 140Gly Val Val Val Val Ala Ala Ala Gly Asn Ser Gly Asn Ser Gly Ser145 150 155 160Thr Asn Thr Ile Gly Tyr Pro Ala Lys Tyr Asp Ser Val Ile Ala Val165 170 175Gly Ala Val Asp Ser Asn Ser Asn Arg Ala Ser Phe Ser Ser Val Gly180 185 190Ala Glu Leu Glu Val Met Ala Pro Gly Ala Gly Val Tyr Ser Thr Tyr195 200 205Pro Thr Asn Thr Tyr Ala Thr Leu Asn Gly Thr Ser Met Ala Ser Pro210 215 220His Val Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ile Leu Ser Lys His Pro Asn Leu225 230 235 240Ser Ala Ser Gln Val Arg Asn Arg Leu Ser Ser Thr Ala Thr Tyr Leu245 250 255Gly Ser Ser Phe Tyr Tyr Gly Lys Gly Leu Ile Asn Val Glu Ala Ala260 265 270Ala Gln(2)SEQ ID NO10的訊息(i)序列特性(A)長度269氨基酸(B)類型氨基酸(C)股單股(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列描述SEQ ID NO10Ala Gln Ser Val Pro Trp Gly Ile Ser Arg Val Gln Ala Pro Ala Ala1 5 10 15His Asn Arg Gly Leu Thr Gly Ser Gly Val Lys Val Ala Val Leu Asp20 25 30Thr Gly Ile Ser Thr His Pro Asp Leu Asn Ile Arg Gly Gly Ala Ser35 40 45Phe Val Pro Gly Glu Pro Ser Thr Gln Asp Gly Asn Gly His Gly Thr50 5560His Val Ala Gly Thr Ile Ala Ala Leu Asn Asn Ser Ile Gly Val Leu6570 75 80Gly Val Ala Pro Ser Ala Glu Leu Tyr Ala Val Lys Val Leu Gly Ala85 90 95Ser Gly Ser Gly Ser Val Ser Ser Ile Ala Gln Gly Leu Glu Trp Ala100 105 110Gly Asn Asn Gly Met His Val Ala Asn Leu Ser Leu Gly Ser Pro Ser115 120 125Pro Ser Ala Thr Leu Glu Gln Ala Val Asn Ser Ala Thr Ser Arg Gly130 135 140Val Leu Val Val Ala Ala Ser Gly Asn Ser Gly Ala Gly Ser Ile Ser145 150 155 160Tyr Pro Ala Arg Tyr Ala Asn Ala Met Ala Val Gly Ala Thr Asp Gln165 170 175Asn Asn Asn Arg Ala Ser Phe Ser Gln Tyr Gly Ala Gly Leu Asp Ile180 185 190Val Ala Pro Gly Val Asn Val Gln Ser Thr Tyr Pro Gly Ser Thr Tyr195 200 205Ala Ser Leu Asn Gly Thr Ser Met Ala Thr Pro His Val Ala Gly Ala210 215 220Ala Ala Leu Val Lys Gln Lys Asn Pro Ser Trp Ser Asn Val Gln Ile225 230 235 240Arg Asn His Leu Lys Asn Thr Ala Thr Ser Leu Gly Ser Thr Asn Leu245 250 255Tyr Gly Ser Gly Leu Val Asn Ala Glu Ala Ala Thr Arg260 265(2)SEQ ID NO11的訊息(i)序列特性(A)長度1140堿基對(B)類型核酸(C)股單股(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQ ID NO11ATGAAGAAAC CGTTGGGGAA AATTGTCGCA AGCACCGCAC TACTCATTTC TGTTGCTTTT 60AGTTCATCGA TCGCATCGGC TGCTGAAGAA GCAAAAGAAA AATATTTAAT TGGCTTTAAT120GAGCAGGAAG CTGTCAGTGA GTTTGTAGAA CAAGTAGAGG CAAATGACGA GGTCGCCATT180CTCTCTGAGG AAGAGGAAGT CGAAATTGAA TTGCTTCATG AATTTGAAAC GATTCCTGTT240TTATCCGTTG AGTTAAGCCC AGAAGATGTG GACGCGCTTG AACTCGATCC AGCGATTTCT300TATATTGAAG AGGATGCAGA AGTAACGACA ATGGCGCAAT CAGTGCCATG GGGAATTAGC360CGTGTGCAAG CCCCAGCTGC CCATAACCGT GGATTGACAG GTTCTGGTGT AAAAGTTGCT420GTCCTCGATA CAGGTATTTC CACTCATCCA GACTTAAATA TTCGTGGTGG CGCTAGCTTT480GTACCAGGGG AACCATCCAC TCAAGATGGG AATGGGCATG GCACGCATGT GGCCGGGACG540ATTGCTGCTT TAAACAATTC GATTGGCGTT CTTGGCGTAG CGCCGAGCGC GGAACTATAC600GCTGTTAAAG TATTAGGGGC GAGCGGTTCA GGTTCGGTCA GCTCGATTGC CCAAGGATTG660GAATGGGCAG GGAACAATGG CATGCACGTT GCTAATTTGA GTTTAGGAAG CCCTTCGCCA720AGTGCCACAC TTGAGCAAGC TGTTAATAGC GCGACTTCTA GAGGCGTTCT TGTTGTAGCG780GCATCTGGGA ATTCAGGTGC AGGCTCAATC AGCTATCCGG CCCGTTATGC GAACGCAATG840GCAGTCGGAG CTACTGACCA AAACAACAAC CGCGCCAGCT TTTCACAGTA TGGCGCAGGG900CTTGACATTG TCGCACCAGG TGTAAACGTG CAGAGCACAT ACCCAGGTTC AACGTATGCC960AGCTTAAACG GTACATCGAT GGCTACTCCT CATGTTGCAG GTGCAGCAGC CCTTGTTAAA1020CAAAAGAACC CATCTTGGTC CAATGTACAA ATCCGCAATC ATCTAAAGAA TACGGCAACG1080AGCTTAGGAA GCACGAACTT GTATGGAAGC GGACTTGTCA ATGCAGAAGC GGCAACACGC1140(2)SEQ ID NO12的訊息(i)序列特性(A)長度1140堿基對(B)類型核酸(C)股單股(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQ ID NO12ATGAAGAAAC CGTTGGGGAA AATTGTCGCA AGCACCGCAC TACTCATTTC TGTTGCTTTT 60AGTTCATCGA TCGCATCGGC TGCTGAAGAA GCAAAAGAAA AATATTTAAT TGGCTTTAAT120GAGCAGGAAG CTGTCAGTGA GTTTGTAGAA CAAGTAGAGG CAAATGACGA GGTCGCCATT180CTCTCTGAGG AAGAGGAAGT CGAAATTGAA TTGCTTCATG AATTTGAAAC GATTCCTGTT240TTATCCGTTG AGTTAAGCCC AGAAGATGTG GACGCGCTTG AACTCGATCC AGCGATTTCT300TATATTGAAG AGGATGCAGA AGTAACGACA ATGGCGCAAT CAGTGCCATG GGGAATTAGC360CGTGTGCAAG CCCCAGCTGC CCATAACCGT GGATTGACAG GTTCTGGTGT AAAAGTTGCT420GTCCTCGATA CAGGTATTTC CACTCATCCA GACTTAAATA TTCGTGGTGG CGCTAGCTTT480GTACCAGGGG AACCATCCAC TCAAGATGGG AATGGGCATG GCACGCATGT GGCCGGGACG540ATTGCTGCTT TAGACAACTC GATTGGCGTT CTTGGCGTAG CGCCGAGCGC GGAACTATAC600GCTGTTAAAG TATTAGGGGC GAGCGGTTCA GGCGCCATCA GCTCGATTGC CCAAGGATTG660GAATGGGCAG GGAACAATGG CATGCACGTT GCTAATTTGA GTTTAGGAAG CCCTTCGCCA720AGTGCCACAC TTGAGCAAGC TGTTAATAGC GCGACTTCTA GAGGCGTTCT TGTTGTAGCG780GCATCTGGGA ATTCAGGTGC AGGCTCAATC AGCTATCCGG CCCGTTATGC GAACGCAATG840GCAGTCGGAG CTACTGACCA AAACAACAAC CGCGCCAGCT TTTCACAGTA TGGCGCAGGG900CTTGACATTG TCGCACCAGG TGTAAACGTG CAGAGCACAT ACCCAGGTTC AACGTATGCC960AGCTTAAACG GTACATCGAT GGCTACTCCT CATGTTGCAG GTGCAGCAGC CCTTGTTAAA1020CAAAAGAACC CATCTTGGTC CAATGTACAA ATCCGCAATC ATCTAAAGAA TACGGCAACG1080AGCTTAGGAA GCACGAACTT GTATGGAAGC GGACTTGTCA ATGCAGAAGC GGCAACACGC1140(2)SEQ ID NO13的訊息(i)序列特性(A)長度30堿基對(B)類型核酸(c)股單股
(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQ ID NO13TATGCCAGCC ACAACGGTAC TTCGATGGCT 30(2)SEQ ID NO14的訊息(i)序列特性(A)長度31堿基對(B)類型核酸(C)股單股(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQ ID NO14CACAGTTGCG GCTCTAGATA ACTCAATCGG T31(2)SEQ ID NO15的訊息(i)序列特性(A)長度33堿基對(B)類型核酸(C)股單股(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQ ID NO15GCTGACGGTT CCGGCGCTAT TAGTTGGATC ATT 3權(quán)利要求
1.一種洗滌組合物，它含有(a)有效量的一種蛋白酶，它是一種具有天然界未曾發(fā)現(xiàn)過的氨基酸序列的羰基水解酶的變種，是通過用不同的氨基酸置換前體羰基水解酶中的多種氨基酸殘基而衍生出來的，在所說的前體羰基水解酶中被置換的位置等價于解淀粉芽孢桿菌枯草溶菌素中的+76位置，與選自等價于解淀粉芽孢桿菌枯草溶菌素中的下列位置的一種或多種氨基酸殘基相結(jié)合+99、+101、+103、+104、+107、+123、+27、+105、+109、+126、+128、+135、+156、+166、+195、+197、+204、+206、+210、+216、+217、+218、+222、+260、+265和/或+274；和(b)一種或多種可與蛋白酶配伍的洗滌組合物材料。
2.權(quán)利要求1的洗滌組合物，其中的洗滌組合物材料是選自表面活性劑、溶劑、緩沖劑、酶、污垢釋出劑、除塵土污垢劑、分散劑、增白劑、抑泡劑、織物軟化劑、促泡劑、酶穩(wěn)定劑、增效劑、漂白劑、染料、香料及其混合物。
3.權(quán)利要求1的洗滌組合物，其中洗滌組合物材料含有組合物重量的至少大約1％的表面活性劑，所說的表面活性劑含有選自烷基苯磺酸鹽、一級烷基硫酸鹽、二級烷基硫酸鹽、烷基烷氧基硫酸鹽、烷基烷氧基羧酸鹽、烷基聚糖苷和它們相應(yīng)的硫酸化的聚糖苷、α-磺化的脂肪酸酯、烷基和烷基酚烷氧化物、三甲銨乙內(nèi)酯和磺化的三甲銨乙內(nèi)酯、胺氧化物，N-甲基葡糖酰胺、非離子性的一級醇乙氧化物、非離子性的一級醇混合的乙氧化/丙氧化物，及其混合物等材料。
4.權(quán)利要求3的洗滌組合物，它進(jìn)一步含有至少大約5％的選自沸石、聚羧酸鹽、層狀硅酸鹽、磷酸鹽及其混合物這類增效劑。
5.權(quán)利要求1的洗滌組合物，其中的洗滌組合物材料含有至少一種漂白劑。
6.權(quán)利要求5的洗滌組合物，其中的漂白劑是選自過碳酸鹽、過硼酸鹽及其混合物，并任選還含有至少一種漂白活化劑。
7.權(quán)利要求1的洗滌組合物，其中的洗滌組合物材料含有至少一種選自纖維素酶、脂酶、淀粉酶、蛋白酶、過氧化物酶及其混合物的酶。
8.權(quán)利要求1的洗滌組合物，其中的洗滌組合物材料含有至少一種織物軟化劑。
9.權(quán)利要求1的洗滌組合物，其中用于產(chǎn)生蛋白酶的前體羰基水解酶是一種枯草溶菌素，并且蛋白酶是一種枯草溶菌素變種，其中在下列等價的位置上進(jìn)行了一系列置換76/99，76/101，76/103，76/104，76/107，76/123，76/99/101，76/99/103，76/99/104，76/101/103，76/101/104，76/103/104，76/104/107，76/104/123，76/107/123，76/99/101/103，76/99/101/104，76/99/103/104，76/101/103/104，76/103/104/123，76/104/107/123，76/99/101/103/104，76/99/103/104/123，76/99/101/103/104/123，76/103/104/126，76/103/104/135，76/103/104/197，76/103/104/222，76/103/104/260，76/103/104/265，76/103/104/126/265，27/76/104/123/274，27/76/104/109/123/274，27/76/104/123/218/274，27/76/104/123，27/76/104/107/123，27/76/104/109/123，27/76/104/109/123/218/274，27/76/104/123/197，27/76/104/123/204，27/76/104/123/206，27/76/104/123/216，27/76/104/123/218，27/76/104/123/260，27/76/104/123/195/197，27/76/104/123/195/218，27/76/104/123/197/218，27/76/104/123/204/218，27/76/104/123/206/218，27/76/104/123/218/260，27/76/104/123/195/197/218，76/103/104/217，76/103/104/156，76/103/104/166，76/103/104/105，76/101/103/104，76/103/104/128，76/103/104/21076/103/104/107，76/103/104/204，76/217，76/103/104/156/166和76/103/104/128.
10.權(quán)利要求9中的洗滌組合物，其中的蛋白酶是選自經(jīng)下列置換的枯草溶菌素的變種76/99，76/101，76/103，76/104，76/107，76/123，76/99/101，76/99/103，76/99/104，76/101/103，76/101/104，76/103/104，76/104/107，76/104/123，76/107/123，76/99/101/103，76/99/101/104，76/99/103/104，76/101/103/104，76/103/104/123，76/104/107/123，76/99/101/103/104，76/99/103/104/123，76/99/101/103/104/123，76/103/104/128；76/103/104/260；76/103/104/265；76/103/104/197；76/103/104/105；76/103/104/135；76/103/104/126；76/103/104/107；76/103/104/210；76/103/104/126/265；和/或76/103/104/222.
11.一種織物洗滌組合物，它含有(a)有效量的一種蛋白酶，它是一種具有天然界未曾發(fā)現(xiàn)過的氨基酸序列的羰基水解酶的變種，是通過枯草溶菌素前體羰基水解酶衍生而來的，其中的蛋白酶是選自下列枯草溶菌素的變種N76D/S99D；N76D/S101R；N76D/S103A；N76D/V104I；N76D/I107V；N76D/N123S；N76D/S99D/S101R；N76D/S99D/S103A；N76D/S99D/V104I；N76D/S101R/S103A；N76D/S101R/V104I；N76D/S103A/V104I；N76D/V104I/I107V；N76D/V104Y/I107V；N76D/V104I/N123S；N76D/I107V/N123S；N76D/S99D/S101R/S103A；N76D/S99D/S101R/V104I；N76D/S99D/S103A/V104I；N76D/S101R/S103A/V104I；N76D/S103A/V104I/N123S；N76D/V104I/I107V/N123S；N76D/S99D/S101R/S103A/V104I；N76D/S99D/S103A/V104I/N123S；N76D/S99D/S101R/S103A/V104I/N123S；N76D/S103A/V104I/S128G；N76D/S103A/V104I/T260P；N76D/S103A/V104I/S265N；N76D/S103A/V104I/D197E；N76D/S103A/V104I/S105A；N76D/S103A/V104I/L135I；N76D/S103A/V104I/L126F；N76D/S103A/V104T/L107T；N76D/S103A/V104I/L126F/S265N和N76D/S103A/V104I/M222A以及它們的混合物；和(b)一種或多種可與蛋白酶配伍的洗滌組合物材料，它含有基于組合物重量計算至少大約5％的表面活性劑和至少大約5％的增效劑。
12.權(quán)利要求11的織物洗滌組合物，它進(jìn)一步含有幾種洗滌組合物材料，后者可選自溶劑、緩沖劑、酶、污垢釋出劑、除塵土污垢劑、分散劑、增白劑、抑泡劑、織物軟化劑、促泡劑、酶穩(wěn)定劑、漂白劑、染料、香料及其混合物。
13.權(quán)利要求11的織物洗滌組合物，它進(jìn)一步含有至少一種漂白劑。
14.權(quán)利要求11的織物洗滌組合物，它進(jìn)一步含有至少一種選自纖維素酶、脂酶、淀粉酶、蛋白酶、過氧化物酶以及它們的混合物的酶。
15.權(quán)利要求11的織物洗滌組合物，是以液體、顆粒或條狀的形式。
16.權(quán)利要求11的織物洗滌組合物，其中的蛋白酶是選自以下的枯草溶菌素變種N76D/S99D，N76D/V104I，N76D/S99D/V104I，N76D/S103A/V104I，N76D/V104I/I107V，N76D/V104Y/I107V，N76D/S101R/S103A/V104I，N76D/S99D/S101R/S103A/V104I，N76D/S101R/V104I，及其混合物。
17.權(quán)利要求11的織物洗滌組合物，其中的蛋白酶是選自N76D/V104I、N76D/S103A/V104I的桿菌枯草溶菌素變種及其混合物。
18.一種織物洗滌組合物，它含有(a)大約0.0001％至大約10％的蛋白酶，它是由遲緩芽孢桿菌枯草溶菌素衍生的N76D/S103A/V104I枯草溶菌素變種；(b)至少大約5％的表面活性劑；(c)至少大約5％的增效劑；和(d)任選一種或多種可與蛋白酶配伍的洗滌組合物材料，它們可選自溶劑、緩沖劑、酶、污垢釋出劑、除塵土污垢劑、分散劑、增白劑、抑泡劑、織物軟化劑、促泡劑、酶穩(wěn)定劑、漂白劑、染料、香料及其混合物。
19.權(quán)利要求18的織物洗滌組合物，其中的表面活性劑是選自烷基苯磺酸鹽、一級烷基硫酸鹽、二級烷基硫酸鹽、烷基烷氧基硫酸鹽、烷基烷氧基羧酸鹽、烷基聚糖苷和它們相應(yīng)的硫酸化的聚糖苷、α-磺化的脂肪酸酯、烷基和烷基酚烷氧化物、三甲銨乙內(nèi)酯和磺化的三甲銨乙內(nèi)酯、胺氧化物、N-甲基葡糖酰胺、非離子的一級醇乙氧化物、非離子的一級醇混合的乙氧化/丙氧化物及其混合物；并且其中的增效劑還可選自沸石、聚羧酸鹽、層狀硅酸鹽、磷酸鹽及其混合物。
20.權(quán)利要求19的織物洗滌組合物，它進(jìn)一步含有一種或多種選自漂白劑、織物軟化劑和酶等洗滌組合物材料。
21.權(quán)利要求18的織物洗滌組合物，是以含有至少大約30％表面活性劑的濃縮顆?？椢锵礈旖M合物的形式制造的。
22.一種洗碗碟組合物，它含有(a)大約0.0001％至大約10％的蛋白酶，它是一種具有天然界未曾發(fā)現(xiàn)過的氨基酸序列的羰基水解酶的變種，是由枯草溶菌素前體羰基水解酶衍生而來的，其中的蛋白酶是選自下列枯草溶菌素的變種N76D/S99D；N76D/S101R；N76D/S103A；N76D/V104I；N76D/I107V；N76D/N123S；N76D/S99D/S101R；N76D/S99D/S103A；N76D/S99D/V104I；N76D/S101R/S103A；N76D/S101R/V104I；N76D/S103A/V104I；N76D/V104I/I107V；N76D/V104Y/I107V；N76D/V104I/N123S；N76D/I107V/N123S；N76D/S99D/S101R/S103A；N76D/S99D/S101R/V104I；N76D/S99D/S103A/V104I；N76D/S101R/S103A/V104I；N76D/S103A/V104I/N123S；N76D/V104I/I107V/N123S；N76D/S99D/S101R/S103A/V104I；N76D/S99D/S103A/V104I/N123S；N76D/S99D/S101R/S103A/V104I/N123S；N76D/S103A/V104I/S128G；N76D/S103A/V104I/T260P；N76D/S103A/V104I/S265N；N76D/S103A/V104I/D197E；N76D/S103A/V104I/S105A；N76D/S103A/V104I/L135I；N76D/S103/VV104I/L126F；N76D/S103A/V104T/L107T；N76D/S103A/V104I/L126F/S265N，和N76D/S103A/V104I/M222A及其混合物；(b)大約0.1％至大約10％的表面活性劑；和(c)可供選擇地，一種或多種可與蛋白酶配伍的洗滌組合物材料，它們可選自溶劑、緩沖劑、酶、分散劑、抑泡劑、酶穩(wěn)定劑、漂白劑、染料、香料及其混合物。
23.一種權(quán)利要求22的洗碗碟組合物，其中的蛋白酶是由遲緩芽孢桿菌枯草溶菌素衍生的一般N76D/S103A/V104I枯草溶菌素變種。
24.一種人身用的洗滌組合物，它包含(a)大約0.001％至大約5％(重量)的蛋白酶，它是一種具有天然界未曾發(fā)現(xiàn)過的氨基酸序列的羰基水解酶的變種，是通過用不同的氨基酸置換前體羰基水解酶中的多種氨基酸殘基而衍生出來的，在所說的前體羰基水解酶中被置換的位置等價于解淀粉芽孢桿菌枯草溶菌素中的+76位置，與選自等價于解淀粉芽孢桿菌枯草溶菌素中的下列位置的一種或多種氨基酸殘基相結(jié)合+99、+101、+103、+104、+107、+123、+27、+105、+109、+126、+128、+135、+156、+166、+195、+197、+204、+206、+210、+216、+217、+218、+222、+260、+265和/或+274；(b)大約0.01％至大約95％重量計的表面活性劑體系；和(c)任選大約0.05％至大約50％的一種酶穩(wěn)定劑。
25.權(quán)利要求24的組合物，其中蛋白酶的濃度為大約0.001％至大約2％(重量)。
26.權(quán)利要求25的組合物，其中蛋白酶的濃度為大約0.01％至大約0.8％(重量)。
27.權(quán)利要求24的組合物，其中的表面活性劑體系含有一種選自陰離子的羧酸鹽、胺氧化物、烷基葡糖苷、葡糖酰胺、烷基硫酸鹽、烷基醚硫酸鹽、?；u乙磺酸鹽、烷基磺化丁二酸酯、烷基磷酸酯、乙氧化的磷酸酯、烷基甘油醚磺酸鹽、或其混合物的表面活性劑。
28.權(quán)利要求24的組合物，其中的表面活性劑體系含有一種選自肥皂、?；劝彼猁}、烷基肌氨酸鹽、月桂胺氧化物、椰胺氧化物、椰酰胺基丙胺氧化物。癸基葡糖苷、月桂基硫酸鹽、laureth硫酸鹽、C12～C18?；u乙磺酸鹽、或其混合物的表面活性劑。
29.權(quán)利要求28的組合物、其中的表面活性劑是肥皂，濃度為組合物重量的至少大約2％。
30.權(quán)利要求29的組合物，其中肥皂的濃度為組合物重量的至少大約10％。
31.權(quán)利要求30的組合物，其中肥皂的濃度為組合物重量的至少大約25％。
32.權(quán)利要求28的組合物，其中肥皂對蛋白酶的比率為大約2000∶1至大約8∶1。
33.權(quán)利要求32的組合物，其中肥皂對蛋白酶的比率為大約400∶1至大約40∶1。
34.權(quán)利要求28的組合物，其中的蛋白酶是一種具有天然界未曾發(fā)現(xiàn)過的氨基酸序列的羰基水解酶的變種，是由枯草溶菌素前體羰基水解酶衍生而來的，其中的蛋白酶是選自下列枯草溶菌素的變種N76D/S99D；N76D/S101R；N76D/S103A；N76D/V104I；N76D/I107V；N76D/N123S；N76D/S99D/S101R；N76D/S99D/S103A；N76D/S99D/V104I；N76D/S101R/S103A；N76D/S101R/V104I；N76D/S103A/V104I；N76D/V104I/I107V；N76D/V104Y/I107V；N76D/V104I/N123S；N76D/I107V/N123S；N76D/S99D/S101R/S103A；N76D/S99D/S101R/V104IN76D/S99D/S103A/V104I；N76D/S101R/S103A/V104I；N76D/S103A/V104I/N123S；N76D/V104I/I107V/N123S；N76D/S99D/S101R/S103A/V104I；N76D/S99D/S103A/V104I/N123S；N76D/S99D/S101R/S103A/V104I/N123S；N76D/S103A/V104I/S128G；N76D/S103A/V104I/T260P；N76D/S103A/V104I/S265N；N76D/S103A/V104I/D197E；N76D/S103A/V104I/S105A；N76D/S103A/V104I/L135I；N76D/S103A/V104I/L126F；N76D/S103A/V104T/L107T；N76D/S103A/V104I/L126F/S265N和N76D/S103A/V104I/M222A；及其混合物。
35.一種洗滌織物的方法，所說的方法包括把需要洗滌的織物與一種蛋白酶接觸，這種蛋白酶是由遲緩芽孢桿菌枯草溶菌素衍生的一種N76D/S103A/V104I的枯草溶菌素變種。
36.一種洗滌碗碟的方法，所說的方法包括把需要洗滌的碗碟與一種蛋白酶接觸，這種蛋白酶是由遲緩芽孢桿菌枯草溶菌素衍生的一種N76D/S103A/V104I的枯草溶菌素變種。
37.一種供人身洗滌的方法，所說的方法包括使人或較低等動物需要洗滌的身體部分與一種羰基水解酶的變種接觸，這種酶具有天然界未曾發(fā)現(xiàn)過的氨基酸序列，它是由枯草溶菌素前體羰基水解酶衍生而來的，其中的蛋白酶是選自下列的枯草溶菌素變種N76D/S99D；N76D/S101R；N76D/S103A；N76D/V104I；N76D/I107V；N76D/N123S；N76D/S99D/S101R；N76D/S99D/S103A；N76D/S99D/V104I；N76D/S101R/S103A；N76D/S101R/V104I；N76D/S103A/V104I；N76D/V104I/I107V；N76D/V104Y/I107V；N76D/V104I/N123S；N76D/I107V/N123S；N76D/S99D/S101R/S103A；N76D/S99D/S101R/V104I；N76D/S99D/S103A/V104I；N76D/S101R/S103A/V104I；N76D/S103A/V104I/N123S；N76D/V104I/I107V/N123S；N76D/S99D/S101R/S103A/V104I；N76D/S99D/S103A/V104I/N123S；N76D/S99D/S101R/S103A/V104I/N123S；N76D/S103A/V104I/S128G；N76D/S103A/V104I/T260P；N76D/S103A/V104I/S265N；N76D/S103A/V104I/D197E；N76D/S103A/V104I/S105A；N76D/S103A/V104I/L135I；N76D/S103A/V104I/L126F；N76D/S103A/V104T/L107T；N76D/S103A/V104I/L126F/S265N和N76D/S103A/V104I/M222A；及其混合物。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種含有蛋白酶的洗滌組合物，這種蛋白酶是具有在天然界未曾發(fā)現(xiàn)過的氨基酸序列的一種羰基水解酶變種，是通過用不同的氨基酸置換前體羰基水解酶中的多個氨基酸殘基而衍生出來的，其中在前體酶中被置換的所說的多個氨基酸殘基相應(yīng)于位置+76結(jié)合一種或多種下列殘基位置+99、+101、+103、+104、+107、+123、+27、+105、+109、+126、+128、+135、+156、+166、+195、+197、+204、+206、+210、+216、+217、+218、+222、+260、+265和/或+274。這里數(shù)字標(biāo)明的位置相應(yīng)于天然存在的由解淀粉芽孢桿菌
文檔編號A61K8/22GK1137289SQ94194485
公開日1996年12月4日 申請日期1994年10月13日 優(yōu)先權(quán)日1993年10月14日
發(fā)明者A·貝?？? C·K·格霍什, T·P·格雷卡, R·R·鮑特, L·J·威爾遜, P·F·布洛德三世, B·L·巴爾奈特, D·N·盧賓赫 申請人:普羅格特-甘布爾公司