專利名稱：含硼的肽衍生物及其制備和治療學上的應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及含硼的肽衍生物及其制備和在治療學上的應用。
本發(fā)明化合物具有式(Ⅰ)結構 (Ⅰ)其中R代表氫、直鏈或支鏈的(C1-C4)烷基、直鏈或支鏈的-CO(C1-C4)烷基、或者直鏈或支鏈的-CO2(C1-C4)烷基，R1代表苯基或環(huán)己基，R2代表 ，其中R5是氫或(C1-C4)烷基，并且R3和R4或者各自代表氫，或者一起代表二羥化合物的殘基例如象丁-2，3-二醇、2，3-二甲基丁-2，3-二醇或(1α，3α，5α)-2，6，6-三甲基雙環(huán)[3.1.1]庚-2，3-二醇[(+)-α-蒎烷二醇(pinanediol)]的殘基。
根據取代基R3和R4的定義，本發(fā)明化合物具有3或7個不對稱中心。
本發(fā)明化合物可以純的或混合物形式的光學異構體或幾何異構體的形式存在，所有這些形式均構成本發(fā)明的一部分。
根據本發(fā)明，優(yōu)選的具有3個不對稱中心的化合物是[2(R)]構型的D-丙氨酰-L-脯氨酰胺衍生物，而優(yōu)選的具有7個不對稱中心的化合物是[3aS，[2(R)，3aα，4β，6β，7aα]]構型的D-丙氨酰-N-[(4，6-亞甲基-1，3，2-苯并二氧雜硼雜茂(benzodioxaborol)-2-基)甲基]-L-脯氨酰胺衍生物。
本發(fā)明化合物可以游離堿形式或者可藥用的酸和堿加成鹽的形式存在，所有這些形式均構成本發(fā)明的一部分。
在本發(fā)明化合物中，優(yōu)選的化合物是其中R2代表 的化合物，此處R5是氫或(C1-C4)烷基。
在所述化合物中，更優(yōu)選的化合物是其中R代表氫或者直鏈或支鏈的(C1-C4)烷基、R1代表苯基并且R3和R4各自代表氫的那些化合物。
最后，本發(fā)明最優(yōu)選的化合物是(R)-[1-[(D-苯丙氨酰-L-脯氨酰)氨基]-4-(1H-咪唑-4-基)丁基]硼酸以及其可藥用的酸和堿的加成鹽。
按照反應路線1，可以合成其中R2代表 的本發(fā)明化合物。
反應路線1
在溶劑例如二噁烷中，使式(Ⅱ)的三肽硼化合物(其中R1如前所定義，R3和R4一起代表如前所定義的二羥化合物的殘基，當R7代表直鏈或支鏈的-CO(C1-C4)烷基時R5代表氫，或者當R7代表氫或者直鏈或支鏈的(C1-C4)烷基時R6代表直鏈或支鏈的-CO2(C1-C4)烷基)與式(Ⅲ)化合物(其中R5是氫或(C1-C4)烷基反應，制得式(Ⅰa)化合物。然后，如果需要制得式(Ⅰb)化合物(其中R、R1和R5如前所定義)，可使式(Ⅰa)化合物與鹽酸或三氯化硼反應。
按照反應路線2，可以合成其中R2代表 的本發(fā)明化合物，此處R5是氫或(C1-C4)烷基。
反應路線2
反應路線2(續(xù))
反應路線2(續(xù)) 在溶劑例如丙酮中使式(Ⅳ)的[3aS-(3aα，4β，6β，7aα)]-2-(3-溴丙基)-3a，5，5-三甲基六氫-4，6-亞甲基-1，3，2-苯并二氧雜硼雜茂與碘化鈉反應，制得式(Ⅴ)的[3aS-(3aα，4β，6β，7aα)]-2-(3-碘丙基)-3a，5，5-三甲基六氫-4，6-亞甲基-1，3，2-苯并二氧雜硼雜茂，再使之與式(Ⅵ)化合物(其中R5如前所定義)縮合，制得式(Ⅶ)化合物;該反應在溶劑例如四氫呋喃中于-78℃～+20℃的溫度下進行。然后按Mattheson在Organomettallics，(1984)，3，614中所述的類似的方法，在溶劑例如四氫呋喃中于-100～+20℃的溫度下使式(Ⅶ)化合物與二氯甲基鋰在氯化鋅存在下反應，制得式(Ⅷ)化合物，使該化合物與二(三甲基甲硅烷基)氨基化鋰反應;該反應在溶劑例如四氫呋喃中于-78～+20℃的溫度內進行。將得到的化合物在溶劑例如二噁烷中用鹽酸處理，并且將所得的式(Ⅸ)的鹽酸鹽水解，制得式(Ⅹ)的(R)-α-氨基-丁基硼酸二鹽酸鹽，使該二鹽酸鹽與式(Ⅺ)的二醇(其中R3和R4一起代表如前所定義的二羥化合物的殘基)反應，制得式(Ⅻ)的鹽酸鹽;然后將式(Ⅻ)化合物與式(ⅩⅢ)的二肽活化形式(其中R1如前所定義，當R7代表直鏈或支鏈的-CO(C1-C4)烷基時R6代表氫，或者當R7代表氫或者直鏈或支鏈的(C1-C4)烷基時R6代表直鏈或支鏈的-CO2(C1-C4)烷基，并且X代表吡咯烷-1-基-2，5-二酮或者2-甲基丙氧羰基)縮合，將制得的化合物用鹽酸處理，得到式(Ⅰc)化合物。然后，如果需要制備式(Ⅰd)化合物(其中R、R1和R5如前所定義)，可將式(Ⅰc)化合物與鹽酸或三氯化硼反應。
起始原料可在市場上買到，或者在先有技術中有所描述，或者可按已描述過的方法或本領域技術人員熟知的方法制備。
同樣地，歐洲專利申請No.0293881中描述了式(Ⅱ)的三肽。Kettner等人在J.Biol.Chem.(1990)，265，18289中描述了N-乙酰-D-苯丙氨酰-L-脯氨酸、[3aS-[2(R)，3aα，4β，6β，7aα]]-N-乙酰-D-苯丙氨酰-N-[4-溴-1-(3a，5，5-三甲基六氫-4，6-亞甲基-1，3，2-苯并二氧雜硼雜茂-2-基)丁基]-L-脯氨酰胺和1-[N-[(1，1-二甲基乙氧基]-D-苯丙氨酰]-L-脯氨酸。歐洲專利No.0293881中描述了[3aS-(3aα，4β，6β，7aα)]-2-(3-溴丙基)-3a，5，5-三甲基六氫-4，6-亞甲基-1，3，2-苯并二氧雜硼雜茂。Ngochindo在J.Chem.Soc.Perkin Trans.(1990)，1，1645中描述了2-[(1，1-二甲基乙基)二甲基甲硅烷基]-N，N-二甲基-1H-咪唑-1-磺酰胺。法國專利申請FR 9404287中描述了式(Ⅻ)化合物的制備。按類似于Bajusz在J.Med.Chem.，(1990)，33，1729-1735中所述的方法，由相應的式(ⅩⅢ)化合物(其中R7代表氫)作原料，可制備式(ⅩⅢ)化合物(其中R6代表直鏈或支鏈的-CO2(C1-C4)烷基并且R7代表直鏈或支鏈的(C1-C4)烷基)。
下列實施例說明了某些本發(fā)明化合物的制備。微量元素分析及IR和RMN光譜證實了所得化合物的結構。例舉的化合物的編號相應于后文表中化合物的編號。括號中的比率表示堿∶酸的摩爾比率。
實施例1(化合物1)[3aS-[2(R)，3aα，4β，6β，7aα]]-N-乙酰-D-苯丙酰-N-[4-(1H-咪唑-1-基)-1-(3a，5，5-三甲基六氫-4，6-亞甲基-1，3，2-苯并二氧雜硼雜茂-2-基)丁基]-L-脯氨酰胺的鹽酸鹽(1∶1)1.1.[3aS-[2(R)，3aα，4β，6β，7aα]]-N-乙酰-D-苯丙酰-N-[4-(1H-咪唑-1-基)-1-(3a，5，5-三甲基-六氫-4，6-亞甲基-1，3，2-苯并二氧雜硼雜茂-2-基)丁基]-L-脯氨酰胺將3g(4.8mmol)[3aS-[2(R)，3aα，4β，6β，7aα]]-N-乙酰-D-苯丙酰-N-[4-溴-1-(3a，5，5-三甲基-六氫-4，6-亞甲基-1，3，2-苯并二氧雜硼雜茂-2-基)丁基]-L-脯氨酰胺和0.902g(9.6mmol)1H-咪唑溶解在10ml二噁烷中。于80℃加熱6小時然后真空蒸發(fā)溶劑。將殘余物重新溶解在50ml二氯甲烷中然后連續(xù)用5%碳酸氫鈉水溶液和飽和氯化鈉溶液洗滌有機相。用硫酸鈉干燥，過濾并蒸發(fā)。經硅膠柱色譜法純化，用甲醇∶二氯甲烷(5∶95)混合液洗脫，制得1.2g油狀產物。
產率41%。20D＝-77.5°(c＝1.5;氯仿)。
1.2.[3aS-[2(R)，3aα，4β，6β，7aα]]-N-乙酰-D-苯丙酰-N-[4-(1H-咪唑-1-基)-1-(3a，5，5-三甲基六氫-4，6-亞甲基-1，3，2-苯并二氧雜硼雜茂-2-基)丁基]-L-脯氨酰胺的鹽酸鹽(1∶1)將1.2g(1.97mmol)[3aS-[2(R)，3aα，4β，6β，7aα]]-N-乙酰-D-苯丙氨酰-N-[4-(1H-咪唑-1-基)-1-(3a，5，5-三甲基-六氫-4，6-亞甲基-1，3，2-苯并二氧雜硼雜茂-2-基)丁基]-L-脯氨酰胺溶解在3ml氯仿中并將該溶液冷卻至0℃。加入20ml0.1N的鹽酸/異丙醇溶液，在0℃下攪拌15分鐘，真空濃縮。經五氧化磷干燥后殘余物用乙醚研制。得到1g無定形固體狀的產物，熔點99℃。
產率78%。20D＝-90.4°(c＝1.1;氯仿)。
實施例2(化合物2)(R)-N-乙酰-D-苯丙氨酰-N-[1-(二羥硼基)-4-(1H-咪唑-1-基)丁基]-L-脯氨酰胺的鹽酸鹽(1∶1)將700mg(1.2mmol)[3aS-[2(R)，3aα，4β，6β，7aα]]-N-乙酰-D-苯丙酰-N-[4-(1H-咪唑-1-基)-1-(3a，5，5-三甲基六氫-4，6-亞甲基-1，3，2-苯并二氧雜硼雜茂-2-基)丁基]-L-脯氨酰胺的鹽酸鹽溶解在6ml無水二氯甲烷中。將該溶液冷卻至-78℃并在15分鐘內逐滴加入5ml(5mmol)1M三氯化硼的二氯甲烷溶液。于-78℃攪拌15分鐘并于0℃攪拌45分鐘，然后慢慢加入15ml水。將該溶液于0℃攪拌30分鐘然后加入10%乙酸溶液。分離各相，用3×10ml乙醚萃取水相并蒸發(fā)至干。殘余物經Biogel P2 柱色譜法純化，用10%乙酸洗脫。濃縮含有產物的級份并在乙醚中研磨殘余物，得到白色粉末狀產物。將該產物用2ml水稀釋，得到的溶液經Biorad AG 1W8 (OH型)柱色譜法純化，用水和1N鹽酸溶液洗脫。濃縮含有產物的級份并在乙醚中研磨殘余物，制得50mg產物。
熔點168～175℃(分解)產率10%。20D＝-118.5°(c＝0.6;水)。
實施例3(化合物3)[3aS-[2(R)，3aα，4β，6β，7aα]]-N-乙酰-D-苯丙酰-N-[4-(1H-咪唑-4(5)-基)-1-(3a，5，5-三甲基六氫-4，6-亞甲基-1，3，2-苯并二氧雜硼雜茂-2-基)丁基]-L-脯氨酰胺的鹽酸鹽(1∶1)3.1.[3aS-[2(R)，3aα，4β，6β，7aα]]-α-(3a，5，5-三甲基六氫-4，6-亞甲基-1，3，2-苯并二氧雜硼雜茂-2-基)-1H-咪唑-4(5)-丁胺的鹽酸鹽(1∶2)3.1.1[3aS-(3aα，4β，6β，7aα)]-2-(3-碘丙基)-3a，5，5-三甲基六氫-4，6-亞甲基-1，3，2-苯并二氧雜硼雜茂將37g(122mmol)[3aS-(3aα，4β，6β，7aα)]-2-(3-溴丙基)-3a，5，5-三甲基六氫-4，6-亞甲基-1，3，2-苯并二氧雜硼雜茂和72.7g(488mmol)碘化鈉在500ml丙酮中的溶液在回流溫度下保持24小時。蒸發(fā)溶劑，并將殘余物重新溶解在500ml乙醚和100ml含有1g亞硫酸鈉的水的混合液中。有機相用硫酸鎂干燥，過濾并蒸發(fā)。制得40g產物，該產物在后續(xù)步驟中直接應用。
產率95%。
3.1.2[3aS-(3aα，4β，6β，7aα)]-2-[(1，1-二甲基乙基)二甲基甲硅烷基]-N，N-二甲基-4(5)-[3-(3a，5，5-三甲基六氫-4，6-亞甲基-1，3，2-苯并二氧雜硼雜茂-2-基)丙基]-1H-咪唑-1-磺酰胺將70.5g(244mmol)2-[(1，1-二甲基乙基)二甲基甲硅烷基]-N，N-二甲基-1H-咪唑-1-磺酰胺溶解在250ml四氫呋喃中。將該反應介質冷卻至-78℃并加入152ml(244mmol)1.6M正丁基鋰的己烷溶液。于-78℃攪拌1小時然后加入40g(115mmol)[3aS-(3aα，4β，6β，7aα)]-2-(3-碘丙基)-3a，5，5-三甲基六氫-4，6-亞甲基-1，3，2-苯并二氧雜硼雜茂在100ml四氫呋喃中的溶液。將反應介質在-78℃～+20℃攪拌1小時然后在20℃攪拌2小時。將反應介質倒入350ml含有14.5g(121mmol)硫酸氫鈉的冰-水混合液中。用3×100ml乙醚萃取水相，合并醚相，用硫酸鎂干燥，過濾并蒸發(fā)。殘余物經硅膠柱色譜法純化，用20%乙酸乙酯/己烷溶液洗脫，制得45g產物。
產率73%20D＝+12.5°(c＝1.9;氯仿)。
3.1.3.[3aS-[2(S)，3aα，4β，6β，7aα]]-4(5)-[4-氯-4-(3a，5，5-三甲基六氫-4，6-亞甲基-1，3，2-苯并二氧雜硼雜茂-2-基)丁基]-2-[(1，1-二甲基乙基)二甲基甲硅烷基]-N，N-二甲基-1H-咪唑-1-磺酰胺將8.3g(98mmol)二氯甲烷在100ml四氫呋喃中的溶液冷卻至-100℃。加入39.1ml(98mmol)2.5M正丁基鋰的己烷溶液。在該溫度下保持15分鐘然后加入45g(89mmol)[3aS-(3aα，4β，6β，7aα)]-2-[(1，1-二甲基乙基)二甲基甲硅烷基]-N，N-二甲基-4(5)-[3-(3a，5，5-三甲基六氫-4，6-亞甲基-1，3，2-苯并二氧雜硼雜茂-2-基)丙基]-1H-咪唑-1-磺酰胺在50ml四氫呋喃中的溶液。將反應混合物在-100℃下保持15分鐘并加入9.8g(70mmol)氯化鋅在50ml四氫呋喃中的溶液。在16小時內恢復至+20℃。真空蒸發(fā)并將殘余物重新溶解在200ml二氯甲烷和50ml水的混合液中。分離各相，用100ml二氯甲烷萃取水相。合并有機相，用硫酸鎂干燥，過濾并蒸發(fā)。所得的有色殘余物經硅膠柱色譜法純化，用乙酸乙酯∶己烷(20∶80)混合液洗脫。制得40g無色油狀產物。
產率“80%。20D＝+15.9°(c＝2.65;氯仿)。
3.1.4[3aS-[2(R)，3aα，4β，6β，7aα]]-4(5)-[4-氨基-4-(3a，5，5-三甲基六氫-4，6-亞甲基-1，3，2-苯并二氧雜硼雜茂-2-基)丁基]-N，N-二甲基-1H-咪唑-1-磺酰胺的鹽酸鹽(1∶1)
配制12.6g(78mmol)1，1，1，3，3，3-六甲基二硅氮烷在80ml四氫呋喃中的溶液并加入31ml(78mmol)2.5M正丁基鋰的己烷溶液。在-78℃下保持1小時并加入40g(71mmol)[3aS-[2(S)，3aα，4β，6β，7aα]]-4(5)-[4-氯-4-(3a，5，5-三甲基六氫-4，6-亞甲基-1，3，2-苯并二氧雜硼雜茂-2-基)丁基]-2-[(1，1-二甲基乙基)二甲基甲硅烷基]-N，N-二甲基-1H-咪唑-1-磺酰胺在80ml四氫呋喃中的溶液。在-78℃下攪拌1小時并在+20℃下攪拌16小時。將反應介質冷卻至-78℃，加入78ml(312mmol)4N鹽酸的二噁烷溶液并在-78℃攪拌1小時和在+20℃攪拌2小時。真空蒸發(fā)，并將殘余物重新溶解在200ml氯仿中。過濾并蒸發(fā)，得到32g油狀產物，將該產物用乙醚研制，得到固體狀的產物。
產率89%熔點90～92℃[α]20D＝+11°(c＝1;甲醇)。
3.1.5.[3aS-[2(R)，3aα，4β，6β，7aα]]-α-(3a，5，5-三甲基六氫-4，6-亞甲基-1，3，2-苯并二氧雜硼雜茂-2-基)-1H-咪唑-4(5)-丁胺的鹽酸鹽(1∶2)將32g(70mmol)[3aS-[2(R)，3aα，4β，6β，7aα]]-4(5)-[4-氨基-4-(3a，5，5-三甲基六氫-4，6-亞甲基-1，3，2-苯并二氧雜硼雜茂-2-基)丁基]-N，N-二甲基-1H-咪唑-1-磺酰胺的鹽酸鹽在200ml4N鹽酸中的溶液回流3小時。用4×100ml乙醚萃取該溶液并蒸發(fā)至干。將殘余物重新溶解在100ml甲醇中并加入11.9g(70mmol)[1R-(1α，2α，3α，5α)]-2，6，6-三甲基二環(huán)[3.1.1]庚-2，3-二醇。在20℃下攪拌16小時并蒸發(fā)至干，得到27g油狀產物，將該油狀物用乙醚研制，得到固體狀產物。
熔點75～80℃。
3.2.N-乙酰-D-苯丙氨酰-L-脯氨酸與1-羥基吡咯烷-2，5-二酮的酯將6g(20mmol)N-乙酰-D-苯丙氨酰-L-脯氨酸懸浮在100ml乙酸乙酯和5ml二甲基甲酰胺的混合液中。加入2.53g(22mmol)1-羥基吡咯烷-2，5-二酮并冷卻至0℃。然后分小批量加入4.53g(22mmol)固態(tài)1，3-二環(huán)己基碳二亞胺。在20℃下攪拌20小時，并過濾該懸浮液。將濾液連續(xù)用20ml5%碳酸氫鈉溶液和氯化鈉飽和溶液洗滌，并用硫酸鎂干燥。用乙醚研制所得殘余物，得到8g透明產物，該產物在后續(xù)步驟中直接應用。
3.3.[3aS-[2(R)，3aα，4β，6β，7aα]]-N-乙酰-D-苯丙氨酰-N-[4-(1H-咪唑-4(5)-基)-1-(3a，5，5-三甲基六氫-4，6-亞甲基-1，3，2-苯并二氧雜硼雜茂-2-基)丁基]-L-脯氨酰胺的鹽酸鹽(1∶1)將2.4g(6.4mmol)[3aS-[2(R)，3aα，4β，6β，7aα]]-α-(3a，5，5-三甲基六氫-4，6-亞甲基-1，3，2-苯并二氧雜硼雜茂-2-基)-1H-咪唑-4(5)-丁胺的鹽酸鹽溶解在20ml二氯甲烷中，加入2.5g(6.4mmol)N-乙酰-D-苯丙氨酰-L-脯氨酸與1-羥基吡咯烷-2，5-二酮的酯并將混合物冷卻至-30℃，滴加入3.6ml(25.6mmol)三乙胺并在-30℃～+20℃攪拌2小時然后在+20℃攪拌2小時。然后加入20ml5%碳酸氫鈉水溶液，再用2×20ml二氯甲烷萃取水相。合并有機相，用硫酸鈉干燥，過濾并蒸發(fā)。
將殘余物重新溶解在10ml異丙醇中并在0℃用64ml 0.1N鹽酸的異丙醇溶液處理。蒸發(fā)后，將殘余物用骨炭在乙酸乙酯中脫色并經Sephadex LH-20柱純化，用甲醇洗脫。蒸發(fā)，殘余物用乙醚研制，得到2g無色固體狀產物。
熔點130～135℃，產率51%[α]20D＝-112.1°(c＝1;氯仿)。
實施例4(化合物4)(R)-N-乙酰-D-苯丙氨酰-N-[1-(二羥硼基)-4-(1H-咪唑-4(5)-基)丁基]-L-脯氨酰胺的鹽酸鹽(1∶1)配制2g(3mmol)[3aS-[2(R)，3aα，4β，6β，7aα]]-N-乙酰-D-苯丙氨酰-N-[4-(1H-咪唑-4(5)-基)-1-(3a，5，5-三甲基六氫-4，6-亞甲基-1，3，2-苯并二氧雜硼雜茂-2-基)丁基]-L-脯氨酰胺在30ml二氯甲烷中的鹽酸鹽溶液。將該溶液冷卻至-78℃，逐滴加入12ml 1M三氯化硼的二氯甲烷溶液。將該混合物在-78℃保持15分鐘然后放置在冰浴中并于0℃攪拌45分鐘。向反應介質中加入30ml水，分離各相。用2×25ml的10%乙酸溶液萃取有機相，水相用3×25ml乙醚萃取。合并水相，濃縮，將殘余物稀釋在10ml甲醇中并蒸發(fā)。殘余物經Bio-gel P2柱色譜法純化，用10%乙酸溶液洗脫，然后經Bio-gel P2柱色譜法純化，用1mM鹽酸溶液洗脫，得到800mg產物。
熔點155～160℃，產率52%[α]20D＝-98.5°(c＝0.65;水)。
實施例5(化合物5)[3aS-[2[R[S(R)]]，3aα，4β，6β，7aα]]-[2-[2-[[[4-(1H-咪唑-4-基)-1-(3a，5，5-三甲基六氫-4，6-亞甲基-1，3，2-苯并二氧雜硼雜茂-2-基)丁基]氨基]羰基]吡咯烷-1-基]-2-氧代-1-(苯甲基)乙基]氨基甲酸1，1-二甲基乙酯的鹽酸鹽(1∶1)在環(huán)境溫度下，將7.2g(7.2mmol)N-[(1，1-二甲基乙氧基)羰基]-D-苯丙氨酰-L-脯氨酸在30ml四氫呋喃中的溶液用2.3ml(21mmol)N-甲基嗎啉處理。將反應介質冷卻至-20℃并加入2.72ml(21mmol)氯甲酸異丁酯。將混合物在-20℃攪拌15分鐘，加入7.5g(20mmol)[3aS-[2(R)，3aα，4β，6β，7aα]]-α-(3a，5，5-三甲基六氫-4，6-亞甲基-1，3，2-苯并二氧雜硼雜茂-2-基)-1H-咪唑-4(5)-丁胺的鹽酸鹽在10ml氯仿中的溶液和5.6ml(40mmol)三乙胺。將混合物在-20℃下攪拌30分鐘然后在環(huán)境溫度攪拌24小時。用300ml乙酸乙酯稀釋并連續(xù)用200ml水和200ml氯化鈉飽和溶液洗滌。用硫酸鈉干燥，將溶劑蒸發(fā)至干并將殘余物重新溶解在50ml二氯甲烷中。加入20ml異丙醇/0.1N鹽酸溶液以制備所述鹽酸鹽，經Lichroprep RP18柱色譜法純化，用乙腈/0.02N鹽酸(20%→100%)進行梯度洗脫，得到5g鹽酸鹽形式的產物。
熔點115～120℃，產率45%[α]20D＝-106°(c＝1;氯仿)。
實施例6(化合物6)(R)-[1-[(D-苯丙氨酰-L-脯氨酰)氨基]-4-(1H-咪唑-4-基)丁基]硼酸的鹽酸鹽(1∶3)按實施例4中所述的操作方法，從698mg(1mmol)[3aS-[2[R[S(R)]]，3aα，4β，6β，7aα]]-[2-[2-[[[4-(1H-咪唑-4-基)-1-(3a，5，5-三甲基六氫-4，6-亞甲基-1，3，2-苯并二氧雜硼雜茂-2-基)丁基]氨基]羰基]吡咯烷-1-基]-2-氧代-1-(苯甲基)乙基]氨基甲酸1，1-二甲基乙基酯的鹽酸鹽開始制備，經Lichroprep RP18柱色譜法純化，用乙腈/0.02N鹽酸梯度洗脫，制得300mg所需化合物。
熔點194℃[α]20D＝-131°(c＝1.3;水)。
實施例7(化合物7)[3aS-[2[R[S(R)]]，3aα，4β，6β，7aα]]-[2-[2-[[[4-(5-甲基-1H-咪唑-4-基)-1-(3a，5，5-三甲基六氫-4，6-亞甲基-1，3，2-苯并二氧雜硼雜茂-2-基)丁基]氨基]羰基]吡咯烷-1-基]-2-氧代-1-(苯甲基)乙基]氨基甲酸1，1-二甲基乙酯的鹽酸鹽(1∶1)按實施例5中所述的方法，從[3aS-[2(R)，3aα，4β，6β，7aα]]-5-甲基-α-(3a，5，5-三甲基六氫-4，6-亞甲基-1，3，2-苯并二氧雜硼雜茂-2-基)-1H-咪唑-4-丁胺的鹽酸鹽開始制備，得到600mg產物。
熔點85～90℃[α]20D＝-53.2°(c＝0.86;甲醇)。
后續(xù)的表中說明了本發(fā)明某些化合物的化學結構和化學性質。在“R1”欄中，-C6H5代表苯基并且-C6H11代表環(huán)己基。在“鹽”欄中，“HCl”代表鹽酸鹽，括號中的比率代表堿∶酸的摩爾比。在“F(℃)”欄中，“(d)”表示分解點。



下列試驗中測試了本發(fā)明化合物對于凝血酶和胰蛋白酶的作用1.牛凝血酶對人纖維蛋白原的沉淀作用在人纖維蛋白原的生理鹽水溶液(200μl，2mg/ml)中于37℃下將待測試的化合物或其載體(10μl)培養(yǎng)2分鐘。
然后加入溶解在蒸餾水中的牛凝血酶(200μl)。該凝血酶的最終濃度為0.5 NIH單位/ml。攪拌混合物，記錄形成了明顯纖維蛋白網絡的時間，用秒表示。通過計算100%增加沉淀時間的化合物濃度來定量纖維蛋白形成的抑制作用(CA100)。
2.人凝血酶對人纖維蛋白原的沉淀作用在人纖維蛋白原的生理鹽水溶液(200μl，2mg/ml)中于37℃下將待測試的化合物或其載體(10μl)培養(yǎng)2分鐘。
然后加入溶解在蒸餾水中的人凝血酶(200μl)。該凝血酶的最終濃度為2 NIH單位/ml。攪拌混合物，記錄形成了明顯纖維蛋白網絡的時間，用秒表示。通過計算100%增加沉淀時間的化合物濃度來定量纖維蛋白形成的抑制作用(CA100)。
3.牛凝血酶對大鼠血漿的凝固作用用戊巴比妥鈉(60mg/kg，0.1ml/kg)麻醉重150～200g的雄性CD大鼠。從后眶竇(sinusrétro-orbital)抽血置于3.8%檸檬酸三鈉中(1vol/9vol血)。于室溫在3600g離心力下離心15分鐘，制備血漿。將待測試的化合物或其載體(10μl)與200μl血漿一起在37℃培養(yǎng)2分鐘，然后加入200μl牛凝血酶溶液。該凝血酶的最終濃度為0.75NIH單位/ml。記錄凝血時間，用秒表示。
通過計算100%增加凝血時間的化合物濃度來定量凝血酶的抑制作用(CA100)。
4.人凝血酶誘發(fā)的兔血小板聚集經心臟穿刺術抽血，置于3.8%檸檬酸三鈉中(1vol/9vol血)。在250g離心力下離心10分鐘。移取如此得到的血小板富集的血漿(P3P)并將血小板計數。
向P3P中加入2ng/ml溶解在冷凍tris緩沖液(pH9.0)中的前列腺環(huán)素溶液。將混合物在110g離心力下離心10分鐘并傾析。再加入前列腺環(huán)素在50mM氫氧化鈉(pH 12)中的溶液，使得最終濃度為200ng/ml。再在800g離心力下將P3P離心10分鐘。轉移貧血小板血漿并將該沉淀物懸浮在含有200ng/ml前列腺環(huán)素的一體積tyrode溶液中，該體積等于P3P的初始體積。將該懸浮液在800g下離心10分鐘。在相同條件下再次重復進行上述操作，即將沉淀物置于懸浮液并離心。將最終的沉淀物重新懸浮在無前列腺環(huán)素的tyrode溶液中并靜置2小時以使得前列腺環(huán)素完全除去。用人凝血酶誘發(fā)這些血小板聚集至最終濃度為0.3 NIH單位/ml。用agrégomètre à 4 canaux記錄光密度的變化。將待測試的化合物或其載體加到血小板懸浮液中(加入的最大體積為3μl)，2分鐘后加入凝血酶。測定抑制50%聚集作用的化合物濃度(CI50)。
5.對牛胰蛋白酶的活性室溫下將待測試的化合物或其載體(50μl)與溶解在trisHCl緩沖劑(pH8.0)中的50μl牛胰蛋白酶溶液一起培養(yǎng)5分鐘。胰蛋白酶的最終濃度是229單位/ml。加入底物Na-苯甲酰-L-精氨酸-4-硝基苯胺(50μl，最終濃度50μM)，觸發(fā)反應。將反應混合物在室溫培養(yǎng)20分鐘并在405nm處測量釋放的4-硝基苯胺的光密度。在減去“空白”(100μl緩沖液+50μl底物)的光密度后，用校正曲線來計算4-硝基苯胺的濃度。測定抑制50%酶活性的化合物濃度(CI50)。
類似地測試了本發(fā)明化合物在體外對大鼠血漿的凝血作用。在抽血前用待測試的化合物或其載體經靜脈、口服或皮下途徑處理動物。如上文3中所述測定凝血酶時間。
本發(fā)明化合物是凝血酶抑制劑，CA100和CI50值在10-8～10-6M之間。本發(fā)明化合物對牛胰蛋白酶沒有或幾乎沒有抑制活性，這說明了本發(fā)明化合物的特異性。
本發(fā)明化合物在1mg/kg(靜注)劑量以下抑制大鼠血漿的凝固，并且經口服和皮下途徑也是有效的。
本發(fā)明化合物可用于與血栓形成有關的全部臨床適應癥或者其中可能會涉及血栓形成并發(fā)癥的所有臨床適應癥。
為此目的，本發(fā)明化合物可與合適的賦形劑一起制成任何合適的劑型，例如片劑、糖丸劑、包括明膠膠囊的膠囊劑、可飲用或注射用的懸浮劑或溶液劑等，用于口服、非胃腸途徑或靜脈內給藥，每位患者可施用的日劑量可以是1～1000mg，分1次或多給藥。
權利要求
1.純的或混合物形式的、光學或幾何異構體形式的式(Ⅰ)化合物以及其可藥用的酸和堿加成鹽， 其中R代表氫、直鏈或支鏈的(C1-C4)烷基、直鏈或支鏈的-CO(C1-C4)烷基、或者直鏈或支鏈的-CO2(C1-C4)烷基，R1代表苯基或環(huán)己基，R2代表 ，其中R5是氫或(C1-C4)烷基，并且R3和R4或者各自代表氫，或者一起代表二羥化合物的殘基例如丁-2，3-二醇、2，3-二甲基丁-2，3-二醇或(1α，3α，5α)-2，6，6-三甲基二環(huán)[3.1.1]庚-2，3-二醇[(+)-α-蒎烷二醇]的殘基。
2.根據權利要求1的化合物，其特征在于根據R3和R4的定義，所述構型是[2(R)]或[3aS，[2(R)，3aα，4β，6β，7aα]。
3.根據權利要求1和2的任一權項的化合物，其特征在于R2代 ，其中R5是氫或(C1-C4)烷基。
4.根據權利要求3的化合物，其特征在于R代表氫或直鏈或支鏈的(C1-C4)烷基，R1代表苯基并且R3和R4各自代表氫。
5.(R)-[1-[(D-苯丙氨酰-L-脯氨酰)氨基]-4-(1H-咪唑-4-基)丁基]硼酸以及其可藥用的酸和堿加成鹽。
6.制備權利要求1所述的其中R2代表 并且此時R5為氫或(C1-C4)烷基的式(Ⅰ)化合物的方法，該方法的特征在于將式(Ⅱ)的三肽硼化物與式(Ⅲ)化合物反應， 其中R1如權利要求1中定義，R3和R4一起代表如權利要求1中所述的二羥化合物的殘余，當R7代表直鏈或支鏈的-CO(C1-C4)烷基時R6代表氫，或者當R7代表氫或者直鏈或支鏈的(C1-C4)烷基時R6代表直鏈或支鏈的-CO2(C1-C4)烷基， (Ⅲ)其中R5如權利要求1中定義，制得式(Ⅰa)化合物， (Ⅰa)然后如果需要制備式(Ⅰb)化合物，將式(Ⅰa)化合物與鹽酸或三氯化硼反應 (Ⅰb)其中R、R1和R5如權利要求1中定義。
7.制備權利要求1所述的其中R2代表 并且此時R5為氫或(C1-C4)烷基的式(Ⅰ)化合物的方法，該方法特征在于將式(Ⅻ)的鹽酸鹽與式(ⅩⅢ)二肽的一種活化形式縮合， (Ⅻ)其中R3和R4一起代表如權利要求1中所述的二羥化合物的殘基，R5如權利要求1中定義， (ⅩⅢ)其中R1如權利要求1中定義，當R7代表直鏈或支鏈的-CO(C1-C4)烷基時R6代表氫，或者當R7代表氫或直鏈或支鏈的(C1-C4)烷基時R6代表直鏈或支鏈的-CO2(C1-C4)烷基，X代表吡咯烷-1-基-2，5-二酮或者2-甲基-丙氧羰基，制得的化合物經鹽酸處理，形成式(Ⅰc)化合物， (Ⅰc)然后如果需要制備式(Ⅰd)化合物，將式(Ⅰc)化合物與鹽酸或三氯化硼反應， (Ⅰd)其中R、R1和R5如權利要求1中定義。
8.藥物，其特征在于所述藥物含有權利要求1～5中任一權項所述的化合物。
9.藥物組合物，其特征在于所述組合物含有權利要求1～5中任一權項所述的化合物和與之結合的任何合適的賦形劑。
全文摘要
純的或混合物形式的、光學或幾何異構體形式的式(I)化合物以及其可藥用的酸和堿加成鹽，以及其在治療學上的應用，其中R、R
文檔編號A61K38/05GK1113493SQ95103889
公開日1995年12月20日 申請日期1995年4月11日 優(yōu)先權日1994年4月12日
發(fā)明者S·馬拉特, G·拉薩勒, T·A·佩塞爾, J·C·穆勒 申請人:合成實驗室公司