專(zhuān)利名稱(chēng)：一種治療血管系統(tǒng)疾病的新藥的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明為一種藥物，特別是治療血管系統(tǒng)疾病的藥物。
血管收縮性肽(Endothelin，縮寫(xiě)為ET)，是1988年由柳澤等人從豬動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞的培養(yǎng)上清液中分離鑒定出的由21個(gè)氨基酸組成的肽(柳澤等，nature 332，P411-412)。之后，從對(duì)ET編碼的遺傳因子研究中發(fā)現(xiàn)了與ET結(jié)構(gòu)類(lèi)似的肽，分別命名為ET1、ET2、ET3。組成ET1、ET2、ET3的氨基酸均為L(zhǎng)型。(井上等，Proc.Natl Acad.Sci.USA.86.2863-2867)。這些ET類(lèi)的結(jié)構(gòu)如下 -Leu-Asp-Ile-Ile-Trp-OHA1 A2 A3 A4 A5A6ET1SerSerSer leuMet PheET2SerSerSer TrpLeu PheET3ThrPheThr TyrLys Tyr上述的ET類(lèi)物質(zhì)在生物體內(nèi)具有強(qiáng)烈的血管收縮和升壓作用，推測(cè)它們?yōu)檠h(huán)系統(tǒng)調(diào)節(jié)的內(nèi)在因子，可引起高血壓、心、腦血液循環(huán)疾病(如心肌梗塞)、腎病(如急性腎功能不全)，以及與血管收縮有關(guān)的疾病(J.Med.Chem.，35，1493(1992))。此外，由于ET類(lèi)物質(zhì)對(duì)支氣管平滑肌有收縮作用，推測(cè)與哮喘也有關(guān)。
迄今為止，雖然有對(duì)ET類(lèi)與受體結(jié)合有抑制作用的各種肽的報(bào)導(dǎo)，但非肽類(lèi)化合物只有蒽醌衍生物(日本專(zhuān)利，特開(kāi)昭3-47163號(hào))和脫鎂葉綠甲酯酸衍生物(日本專(zhuān)利，特開(kāi)昭5-331063號(hào))。烏宋酸自1963年從烏索酸氧化得到以后(Bull.calcutta School Trop.Med.，11，20(1963))，雖然進(jìn)行了許多研究，但對(duì)ET與受體結(jié)合的抑制作用未見(jiàn)報(bào)導(dǎo)。
本發(fā)明的目的是提供一種能抑制ET與受體結(jié)合的活性物質(zhì)。
為達(dá)到上述目的，本發(fā)明通過(guò)在受測(cè)物質(zhì)存在下檢測(cè)放射性標(biāo)記的ET與動(dòng)脈株化細(xì)胞膜受體結(jié)合后的殘余量來(lái)衡量受測(cè)物質(zhì)抑制ET與受體結(jié)合的程度，并作為活性篩選指標(biāo)，測(cè)試每一步分離出的各個(gè)餾分的活性，以此來(lái)指導(dǎo)有效成分的分離和純化。經(jīng)過(guò)追蹤分離獲得的烏宋酸，具有顯著地抑制ET與受體結(jié)合的活性，從而完成了本發(fā)明。
本發(fā)明提出一種通式如下的烏宋酸類(lèi) 式中R1和R2可以是H或OH，但其中之一必須是H；或R1和R2一起共同為下列基團(tuán)＝O，＝NOH，＝N-NH2， 式中R3和R4可以是H，或者鹵原子；R3和R4也可結(jié)合形成碳碳雙鍵。
烏宋酸類(lèi)藥理學(xué)允許的鹽，也屬于本發(fā)明的范圍。
通式(I)所表示的化合物的一種—烏宋酸(I′) 是三帖化合物，從中國(guó)藥用植物中用一般的方法可以分離純化得到。根據(jù)已知的方法，也可以從烏索酸氧化得到烏宋酸(khim.Farm.Zh.20 172-178，1986)。式(I)中R1和R2共同為下式＝O，＝NOH，＝N-NH2， 所表示的化合物，可以通過(guò)從R1和R2為＝O所表示的化合物與羥胺、肼、乙二醇等反應(yīng)得到。
R3和R4為鹵素取代的化合物，可以從R3和R4結(jié)合形成雙鍵的化合物經(jīng)囟化及氫鹵化反應(yīng)得到。R3和R4為H的化合物可通過(guò)氫化方法得到。
本發(fā)明所說(shuō)的烏宋酸類(lèi)藥理學(xué)允許的鹽，是指與無(wú)機(jī)離子、有機(jī)基團(tuán)、氨基酸等形成的鹽。無(wú)機(jī)離子是指堿金屬類(lèi)，如鋰、鈉、鉀等；以及堿土金屬類(lèi)，如鎂、鈣等；其它金屬，如鋁、鋅、鐵等也包含在本發(fā)明中。有機(jī)基團(tuán)是指氨類(lèi)，如氨基、伯胺基、仲胺基、叔銨基；含氮類(lèi)(脂肪族、芳香族)是指甲胺基、二甲胺基、三甲銨基、乙胺基、二乙胺基、三乙銨基、丙胺基、二丙胺基、異丙胺基、二異丙胺基、丁胺基、二丁胺基、異丁胺基、特丁胺基、乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、四氫吡咯、哌啶、嗎啉、吡咯、吡啶、賴(lài)氨酸、精氨酸、組氨酸。
本發(fā)明是關(guān)于將烏宋酸類(lèi)及其藥理學(xué)允許的鹽類(lèi)作為有效成份制成ET受體抑制劑，用于哺乳動(dòng)物(如人、狗、貓、兔、鼠等)由于ET引起的各種疾病，如高血壓、冠心病、心肌病、動(dòng)脈硬化、心肌梗塞、大腦動(dòng)脈收縮、大腦缺血、大動(dòng)脈收縮引起的云狀皮下出血、哮喘、急性腎功能不全等的治療和預(yù)防，作為血管擴(kuò)張劑使用。
本發(fā)明的ET與受體結(jié)合的抑制劑，經(jīng)口服或不經(jīng)口服均可以。劑型可以是片劑、丸劑、膠囊、顆粒劑、乳化劑、懸濁劑、注射劑等。這些劑型，分別加適當(dāng)?shù)膿?dān)體、成形劑、其它必要的添加劑，按規(guī)定的方法制成。
式(I)所表示的烏宋酸類(lèi)每天的給藥量，根據(jù)患者的病情、體重、該衍生物的種類(lèi)、給藥方法等不同而有所不同。例如對(duì)于非口服給藥，即皮下、靜脈、肌肉注射和直腸內(nèi)用藥，大約0.01--20mg/公斤體重·日，最好是0.1--10mg/公斤體重·日。如口服，大約0.1--100mg/公斤體重·日，最好是1-10mg/公斤體重·日。
與對(duì)ET與受體結(jié)合有抑制作用的各種肽相比，非肽小分子化合物，即本發(fā)明的烏宋酸類(lèi)，經(jīng)口服給藥不分解，且從自然界中容易得到，這是本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)所在。
下面結(jié)合具體實(shí)施方式
對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明。
實(shí)施例1.烏宋酸的分離采自中國(guó)四川省的丁座草(Xylanche himalaica)全草干燥粉碎后，在室溫下用95％乙醇提取，所得提取液在60℃下減壓濃縮。提取物30g用乙酸乙酯溶解，溶解物(7.93g)用1000g硅膠柱層析分離，洗脫劑為正己烷/異丙醇/96∶4，得活性部分3.44克，Rf＝0.42(正己烷∶異丙醇＝10∶1)。
活性部分繼續(xù)用180g硅膠柱層析，洗脫液從正己烷∶異丙醇/97∶3開(kāi)始到90∶10進(jìn)行梯度洗脫分離，得活性部分3.19g，Rf＝0.38(正己烷∶異丙醇/90∶10)。
這部分繼續(xù)用150g硅膠分離，用正己烷∶乙酸乙酯/80∶20--0∶100梯度洗脫，得活性部分257mg，Rf＝0.49(正己烷∶乙酸乙酯＝75∶25)。
繼續(xù)用25g硅膠分離，用CH2Cl2MeOH/99∶1洗脫，得活性部分101mg，Rf＝0.69，(CH2Cl2MeoH＝95∶5)。
最后用HPLC(島津LC-6A型，分離柱Merck Hibar RT250-25 Lichrosorb Si60，7μm，檢測(cè)波長(zhǎng)254nm，流速9.9ml/min，爐溫20℃，洗脫液為正己烷∶異丙醇/95∶5)分離，得烏宋酸單體16.7mg，Rf＝0.69(CH2Cl2MeOH/95∶5)。
實(shí)施例2.活性試驗(yàn)(1)ET受體標(biāo)準(zhǔn)品從老鼠胎兒胸部大動(dòng)脈得到的株化細(xì)胞A10(Bmax20.3PM，ATCCCRL 1476)作為測(cè)定用的受體細(xì)胞膜標(biāo)準(zhǔn)品。根據(jù)測(cè)定規(guī)程，A10細(xì)胞懸濁液5ml加入38ml稀釋液(CaCl2，BSA，含有Bacitracin50mMDoris緩沖液，PH7.4)，作為受體的稀釋標(biāo)準(zhǔn)液。
(2)125I-ET結(jié)合試驗(yàn)取放射性標(biāo)記的125I-ET ET1(81.4TBq/mmol)8.5KBq，加入受體稀釋標(biāo)準(zhǔn)液175μl和樣品25μl。加入1×10-6M的ET1，測(cè)定非特異的結(jié)合量。反應(yīng)在250μl Doris緩中液中于室溫下進(jìn)行2小時(shí)。反應(yīng)后，用纖維濾紙?jiān)诓Ａ┒飞霞彼龠^(guò)濾，用50mM Doris緩沖液(pH7.4)洗三次，漏斗上留下的放射性物質(zhì)用γ-射線測(cè)定儀測(cè)定。測(cè)定結(jié)果，烏宋酸對(duì)ET1與受體結(jié)合的50％抑制濃度(IC50)約為5μg/ml。
權(quán)利要求
1.一種治療血管系統(tǒng)疾病的藥物，其特征是有效成分是烏宋酸類(lèi)，結(jié)構(gòu)式為 式中R1和R2可以是H或OH，但其中之一必須是H；R1和R2也可以一起共同為下列基團(tuán)＝O，＝NOH，＝N-NH2， R3和R4可以是H，或者囟原子；R3和R4也可以結(jié)合形成碳碳雙鍵。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的藥物，其特征是烏宋酸類(lèi)與堿金屬，如鋰、鈉、鉀等形成的鹽。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的藥物，其特征是烏宋酸類(lèi)與堿土金屬，如鎂、鈣等形成的鹽。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的藥物，其特征是烏宋酸類(lèi)與氨類(lèi)有機(jī)基團(tuán)，如氨基、伯胺基、仲胺基、叔銨基形成的鹽。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的藥物，其特征是烏宋酸類(lèi)與鋁、鋅、鐵等形成的鹽。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的藥物，其特征是烏宋酸類(lèi)與甲胺基、二甲胺基、三甲銨基、乙胺基、二乙胺基、三乙銨基、丙胺基、二丙胺基、異丙胺基、二異丙胺基、丁胺基、二丁胺基、異丁胺基、特丁胺基、乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇銨、四氫吡咯、哌啶、嗎啉、吡咯、吡啶、賴(lài)氨酸、精氨酸、組氨酸等形成的鹽。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種結(jié)構(gòu)通式為所表示的烏宋酸類(lèi)及其藥理學(xué)允許的鹽的藥物(式中R
文檔編號(hào)A61P9/10GK1114564SQ9511123
公開(kāi)日1996年1月10日 申請(qǐng)日期1995年1月27日 優(yōu)先權(quán)日1994年3月24日
發(fā)明者丁立生, 德田昌彥, 川邊紀(jì)雄, 戶上泰彥 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院成都生物研究所, 東麗株式會(huì)社