專利名稱：免疫偶聯(lián)物的制作方法
所提請(qǐng)的發(fā)明涉及新型融合蛋白，它含有與腫瘤相關(guān)的靶向成分和一個(gè)生物活性配基。前者首選單克隆抗體或其片段。它可以識(shí)別一個(gè)優(yōu)先在人腫瘤細(xì)胞如人表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)上表達(dá)的分子；后者從趨化因子蛋白組，最好從C-X-C族中選擇。產(chǎn)生的融合蛋白可以轉(zhuǎn)送生物活性配基到特定的靶細(xì)胞或組織中，這個(gè)新的免疫偶聯(lián)物可被用于腫瘤治療。
多種治療概念已被用于對(duì)癌癥患者的治療中。過去，臨床實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行使用可特異性或選擇性識(shí)別表達(dá)于惡性細(xì)胞表面上的分子的單克隆抗體。這種方法的目的是誘導(dǎo)抗體依賴的細(xì)胞毒性(ADCC)或補(bǔ)體介導(dǎo)的細(xì)胞毒性以消除腫瘤細(xì)胞。另一種方法是細(xì)胞素介導(dǎo)的免疫應(yīng)答的激活作用。細(xì)胞素誘導(dǎo)的抗腫瘤活性可被如下介導(dǎo)(1)細(xì)胞素對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的直接的細(xì)胞毒性/細(xì)胞抑制作用(2)腫瘤抗原的非特異性機(jī)理，例如LAK活性或單核細(xì)胞/粒細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性(3)由CD-4和CD-8陽性T-細(xì)胞介導(dǎo)的腫瘤抗原特異性免疫應(yīng)答。
在這種情況下，一種抗腫瘤的系統(tǒng)免疫已在動(dòng)物模型中觀測(cè)到。
然而，高劑量細(xì)胞素的細(xì)胞毒性及原位存在量的不足引出了靶向腫瘤治療的概念。靶向腫瘤治療的原理是以靶分子，如對(duì)腫瘤相關(guān)抗原特異的單克隆抗體與生物活性效應(yīng)分子的物理結(jié)合為基礎(chǔ)的。由靶分子傳遞的效應(yīng)分子應(yīng)增加腫瘤中細(xì)胞素濃度并減少所需最大劑量。在動(dòng)物模型中，已表明，由瘤內(nèi)注射或被轉(zhuǎn)染瘤細(xì)胞分泌作用而得到的細(xì)胞素在原位的存在可導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的消退(見綜述Colombo and Forni，Inmmunology Today 1548-51，1994)。在這些系統(tǒng)中，細(xì)胞素不減弱腫瘤的增生，但具有激活一個(gè)快速，強(qiáng)力的抗腫瘤反應(yīng)的能力。因此，效應(yīng)分子和靶向成分的物理結(jié)合代表了一種降低生物活性配基的外周存在和增強(qiáng)其瘤內(nèi)的可利用性的方式。而且，單個(gè)腫瘤細(xì)胞或微轉(zhuǎn)移瘤也可被這些分子所定向。
抗體直接導(dǎo)向的生物活性配基應(yīng)可直接或產(chǎn)生一個(gè)靶細(xì)胞致死環(huán)境素而誘導(dǎo)對(duì)靶細(xì)胞的破壞作用。這可由細(xì)胞素如IL-1，IL-2，IL-4，IL-6，IL-7，IL-10，IL-13，IFNS，TNFα和CSFS來完成。這些細(xì)胞因子已被表明可直接或通過激活宿主防御機(jī)制間接地引起抗腫瘤作用(Mire-Sluis，TIBTECH 1174K—77，1993；Colombo etal.，Cancer Res.524853-4857,1992；Thomas & Balkwill，Phar-mac，Ther.52307-330，1991)。
然而，這些細(xì)胞素的絕大多數(shù)雖然可激活效應(yīng)細(xì)胞，但對(duì)其沒有或只有很弱的趨化活性，因此，當(dāng)腫瘤組織中缺乏適量的效應(yīng)細(xì)胞時(shí)，抗腫瘤活性會(huì)很弱。
然而，趨化因子對(duì)許多效應(yīng)細(xì)胞是具趨化活性的，因而會(huì)提高其在腫瘤位點(diǎn)的存在量，其次，它們誘導(dǎo)了大量的效應(yīng)細(xì)胞的功能(見例Miller and Krangel，1992)，“Biology and Biochemistry ofthe ChemokinesA Novel Family of Chemotactic and Inflammato-ry Cytokines”，Critical Reviews in Immunology 12，17)。
IL-8，MIP2α(也稱作GRO-β)和MIP2β(GRO-γ)是C-X-C趨化因子總科的成員。它們作為趨化因子并激活效應(yīng)細(xì)胞的各項(xiàng)功能。因此可代表最優(yōu)的效應(yīng)物。這個(gè)C-X-C趨化因子家族是一個(gè)最近被認(rèn)為是小分子量(8-10KD)的蛋白質(zhì)組，其氨基酸序列顯示出20—50％的同源性并具有趨化和助類活性。IL-8具有一個(gè)極其確定的三維結(jié)構(gòu)(Clore et al.，Biochemistry 291689-1696，1990)并與一些CXC趨化因子共有一個(gè)N-末端ELR基本結(jié)構(gòu)?？梢灶A(yù)期，由于CXC趨化因子中的序列因源性，其三維結(jié)構(gòu)將會(huì)是非常相似的，這已經(jīng)在MCAF/MCP-1的結(jié)構(gòu)中得到證明(Gronenborn & CloreProt.Eng.4，263-269，1991)。
在溶液中，IL-8形成穩(wěn)定的二聚物(Clore et al.，Biochemistry291689-1696，1990)，并且F(ab’)IL-8融合蛋白通過兩個(gè)IL-8單體的相互作用而二聚成一個(gè)二價(jià)的免疫偶聯(lián)物是可能的。這將增強(qiáng)融合蛋白與抗原的相互作用。
到目前已描述過的C-X-C組的成員主要作用于嗜中性粒細(xì)胞?；蚨ㄎ挥诘谒奶?hào)染色體。這一組的成員是PF4，血小板基礎(chǔ)蛋白，hIP10，IL-8，MIP2α和MIP2β。這些蛋白在中性粒細(xì)胞上的作用是趨化活性，脫顆粒作用和呼吸性突放(Sherry and Cerami，Currentoption in Immunology 356-60，1991；Oppenheim et al.，Annu.Rev.Immunol.9617-648，1991；Miller and Krangel，CriticalReviews in Immunology 1217-46 1992；Clark-Lewis et al.，J.Bi-ol.Chem.26623128—23134，1991)。
與C-C家族密切相關(guān)的趨化因子的成員主要作用于單核細(xì)胞?；蚨级ㄎ挥?7號(hào)染色體。這些蛋白是LD78，Act-2，MCAF，1309和RANTES。這些分子在單核細(xì)胞上顯示出強(qiáng)大的趨化活性，(Matsushima et al.，Chem.Immunol.51236-265，1992；Oppen-heim et al.，Annu.Rev.Immunol.9617-648，1991)。
表皮生長(zhǎng)因子(EGF)是一種致表皮及上皮細(xì)胞有絲分裂的多肽激素。當(dāng)EGF與敏感細(xì)胞相互作用時(shí)，它結(jié)合于膜受體(EGFR)。EGFR是一個(gè)大約170KD的跨膜糖蛋白，是Cerb-B原癌基因的基因產(chǎn)物。
鼠的單克隆抗體MAb425用來抗人A431腫瘤細(xì)胞系(ATCCCRL 1555)，并發(fā)現(xiàn)其結(jié)合于EGFR外部功能區(qū)的多肽表位。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，它抑制EGF的結(jié)合，體外介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞毒性，并且體外抑制上皮及直腸、結(jié)腸腫瘤源細(xì)胞系的腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。MAb425的人化或嵌合體的轉(zhuǎn)型從WO 92/15683得知。
因此，本發(fā)明的目的之一是制成這樣一些抗體及其片段它包含有導(dǎo)向腫瘤細(xì)胞表面EGFR抗原的表位和對(duì)其效應(yīng)細(xì)胞具有高度趨化活性，并因此導(dǎo)致低毒性靶向腫瘤治療的生物活性配基。因此，這種免疫偶聯(lián)物體現(xiàn)了類似的原有細(xì)胞素-抗體免疫偶聯(lián)物的改進(jìn)，在引起腫瘤溶解的能力方面二者具有相似的效果，但由于其趨化性質(zhì)，在有效吸引效應(yīng)細(xì)胞到特異性位點(diǎn)的能力方面與原偶聯(lián)物不同。
本發(fā)明涉及一種融合蛋白，此蛋白把單克隆抗體的一部分，至少是抗原識(shí)別位點(diǎn)或識(shí)別EGFR表位的完整單克隆抗體和生物活性配基連接起來，該配基選自趨化因子族，優(yōu)選C-X-C族，尤其是IL-8。編碼這些蛋白的結(jié)構(gòu)是通過DNA重組技術(shù)獲得的。融合蛋白包括抗體重鏈的可變區(qū)和恒定區(qū)的CH1段(CH1-偶聯(lián)物，F(xiàn)ab-片段)及合適的輕鏈，或者抗體重鏈的可變區(qū)和穩(wěn)定區(qū)的CH1及CH2段，或者，抗體重鏈可變區(qū)和穩(wěn)定區(qū)的CH1，CH2，CH3段，每一種情況下，各部位都融合在生物活性配基上。通過與合適輕鏈的共同表達(dá)，可以產(chǎn)生以抗原承載細(xì)胞為靶，并在體內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)活性配基到特異位點(diǎn)的融合蛋白。
與此類似，另一個(gè)免疫偶聯(lián)物可由將趨化因子融合到抗體FV片段的C-末端而得到。這樣的情況下，重、輕鏈可在一個(gè)多肽上表達(dá)，在此多肽上，兩種成分通過合適的連接序列結(jié)合起來以確?？乖Y(jié)合位點(diǎn)的適當(dāng)折疊。不同的結(jié)構(gòu)在

圖1中表明。
免疫偶聯(lián)物的表在產(chǎn)生新的分子，它們結(jié)合有兩種功能首先它們以抗原承載細(xì)胞(EGFR)為靶，其次，它們?cè)隗w內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)活性配基到特異位點(diǎn)。這些配基是強(qiáng)化學(xué)誘引劑和活性物質(zhì)，并導(dǎo)致在腫瘤位點(diǎn)的效應(yīng)細(xì)胞浸潤(rùn)，并可引起隨后的腫瘤破壞作用。
通過使用本發(fā)明的免疫偶聯(lián)物、腫瘤、如黑色素瘤、神經(jīng)膠質(zhì)瘤和癌可被檢測(cè)出來并可在無大量一般毒性作用的情況下得到成功的治療。
因此，本發(fā)明的目的之一是為了提供一個(gè)免疫偶聯(lián)物，它含有一個(gè)單克隆抗體或其片斷，它們可被導(dǎo)向帶有表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)抗原決定基的腫瘤細(xì)胞；還含有融合于上述抗體或抗體片斷的趨化因子蛋白配基。
有幾組不同的趨化因子，如C-X-C和C-C趨化因子。
這樣，依照本發(fā)明的優(yōu)選方案是從C-X-C族中選擇趨化因子。
在C-X-C族中，IL-8是本發(fā)明所傾向的選擇。
因此，本發(fā)明的目的之一是提供一個(gè)免疫偶聯(lián)物，其趨化因子選自C-X-C族并優(yōu)選白細(xì)胞介素8(IL-8)。
依照本發(fā)明，可使用的抗體是完整的抗體或其片斷。合適的片斷是FVS，F(xiàn)abs或F(ab’)2S(依照本申請(qǐng)用語為CH1抗體片斷)，CH3和CH2抗體片段(圖1)。優(yōu)選方案為FVS，CH1-，CH2和CH3抗體片斷。
因此，本發(fā)明的目的之一是提供一個(gè)免疫偶聯(lián)物，其抗體是Fab片段或F(ab’2)片段，這些片段實(shí)質(zhì)包括抗體重鏈的可變區(qū)，恒定區(qū)的CH1段及合適的輕鏈(抗體-CH1偶聯(lián)物)。另一個(gè)免疫偶聯(lián)物，其抗體是一個(gè)實(shí)質(zhì)上包括抗體重鏈可變區(qū)，恒定區(qū)CH1和CH2段及合適輕鏈(抗體-CH2偶聯(lián)物)的抗體片段，還有一個(gè)免疫偶聯(lián)物，其抗體為一完整抗體，主要包括抗體重鏈的可變區(qū)，恒定區(qū)的CH1，CH2和CH3段及合適的輕鏈(抗體-CH3偶聯(lián)物)，最后，還有一個(gè)免疫偶聯(lián)物，其抗體主要包括抗體重鏈的可變區(qū)，合適的輕鏈和一個(gè)連接輕鏈和重鏈(抗體-FV偶聯(lián)物)的多肽序列組成。
本發(fā)明的免疫偶聯(lián)物可包括在抗體(片段)和可產(chǎn)生誘導(dǎo)作用的趨化因子之間的任意一個(gè)限制性位點(diǎn)它使得例如一特異連接肽的引入成為可能，從而保證了偶聯(lián)物與目標(biāo)表位的最佳結(jié)合。合適的連接肽和引入它們的方法在技術(shù)上已眾所周知，并在下文中敘述。依據(jù)本發(fā)明，所選擇的限制性位點(diǎn)是特定DNA結(jié)構(gòu)中唯一的位點(diǎn)。較好的限制位點(diǎn)是NcoI和BclI。
因此，本發(fā)明進(jìn)一步的目的是提供一個(gè)免疫偶聯(lián)物，它含有一個(gè)氨基酸(序列)，該氨基酸(序列)可由抗體/抗體片斷和生物活性配基之間的DNA限制位點(diǎn)推導(dǎo)出，所述限制性位點(diǎn)在整個(gè)融合結(jié)構(gòu)中是唯一的。
本發(fā)明進(jìn)一步的目的是提供一個(gè)免疫偶聯(lián)物，它包含一個(gè)在抗體/抗體片斷與生物活性配基之間的連接肽。
原理上，導(dǎo)向腫瘤細(xì)胞表面EGF受體的所有抗體都是適用的，但單克隆抗體425是優(yōu)選方案。
而且，本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一個(gè)免疫偶聯(lián)物，其抗體和抗體片段來源于鼠的、人化的或嵌合體的MAb425，并且以從MAb425-CH1-IL8 MAb 425-CH2-(NcoI)-IL8，MAb 425-CH2-(BclI)-IL8，MAb 425-FV-IL8，MAb425-CH3-IL8族中選擇為好。
此外，本發(fā)明的另一目的是提供一種上、下文及權(quán)利要求中所定義的免疫偶聯(lián)物的生產(chǎn)方法，它包括將編碼抗體或抗體片段和生物活性配基的DNA序列，通過一個(gè)與所需融合DNA序列互補(bǔ)的寡核苷酸彼此融合在一單鏈DNA上。把產(chǎn)生的目的結(jié)構(gòu)置于表達(dá)載體上，轉(zhuǎn)化此載體到宿主體中，于營(yíng)養(yǎng)液中培養(yǎng)宿主細(xì)胞，并表達(dá)此融合蛋白。
本發(fā)明的免疫偶聯(lián)物適用于臨床治療。
因此，本發(fā)明的目的之一是提供一種藥物配方，它至少包含有一種上、下文及權(quán)利要求中所定義的免疫偶聯(lián)物以及生理學(xué)上許可的載體。
本發(fā)明的目標(biāo)之一是產(chǎn)生一種融合蛋白，它包括作為靶向成分的單克隆抗體和作為效應(yīng)物，具有趨化和激活性質(zhì)的趨化因子IL-8。
第一次，可以證明當(dāng)IL-8和其它趨化因子(例如MIPs)的N-末端被附加的氨基酸，例如抗體的一部分所封閉的時(shí)候，它們可以保持其生物活性。因此，在靶向腫瘤治療中，這個(gè)分子將會(huì)是很有用的，這是由于效應(yīng)細(xì)胞可被導(dǎo)向EGF受體陽性的腫瘤細(xì)胞并在原位被激活。
可以證明，編碼MAb425重鏈及IL-8蛋白的CDNA可用分子生物學(xué)的方法被融合，蛋白可在合適的表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)，而且EGF受體結(jié)合能力在融合蛋白中被保留(圖2)。
IL-8的主要靶細(xì)胞是嗜中性粒細(xì)胞，它們有三種生物學(xué)功能·沿一個(gè)趨化梯度趨化移動(dòng)·釋放帶有預(yù)制備的蛋白水解酶的儲(chǔ)存顆?！ぜ磿r(shí)產(chǎn)生過氧化物陰離子(呼吸性釋放)相應(yīng)地，也研究了MAb425/NcoI/IL-8和MAb425/BclI/IL-8融合蛋白的趨化活性，MPo釋放和過氧化物釋放的介導(dǎo)。
進(jìn)一步，可以看出，本發(fā)明的融合蛋白(例如MAb425/NcoI/IL-8和MAb425/BclI/IL-8)可引起趨化活性，誘導(dǎo)MPO的釋放和過氧化物的釋放。圖3a中所顯示的結(jié)果表明了以上兩種融合蛋白在重組IL-8(圖3b)的范圍內(nèi)對(duì)人中性粒細(xì)胞是有趨化性的，除了應(yīng)成型為二價(jià)形式的MAb425/NcoI/IL-8和MAb425/BclI/IL-8融合蛋白之外，還產(chǎn)生在大腸桿菌(E.coli)中表達(dá)并被純化的一價(jià)F(ab’)-IL-8融合蛋白。圖4顯示出與MAb425F(ab’)相對(duì)比，相應(yīng)的在E.Coli中表達(dá)并被純化的F(ab’)-IL-8融合蛋白對(duì)人中性粒細(xì)胞是具趨化性的。
與游離IL-8相對(duì)比，MAb425/BclI/IL-8融合蛋白具有相當(dāng)強(qiáng)的過氧化物釋放的能力(圖5)，MAb425/NcoI/IL-8融合蛋白活性較小，但明顯高于對(duì)照值(圖5)。單獨(dú)的MAb425無活性。所有的試驗(yàn)均以細(xì)胞松馳素B作為增強(qiáng)劑來進(jìn)行。該試劑在單獨(dú)存在時(shí)無活性(數(shù)據(jù)未顯示)。
兩種融合蛋白均誘導(dǎo)髓過氧化物酶(MPO)的釋放，但MAb425/NcoI/IL-8融合蛋白比MAb425/BclI/IL-8融合蛋白更具活性(圖6)。所有數(shù)據(jù)均參照三硝基甲苯溶解細(xì)胞的數(shù)據(jù)計(jì)算，該數(shù)被稱作100％酶含量。所有數(shù)據(jù)的獲得均使用細(xì)胞松馳素B作為增強(qiáng)劑。
以前已證明，IL-8分子的N-末端帶有高度保守的E-L-R基元對(duì)于受體結(jié)合和信號(hào)傳導(dǎo)是必須的。IL-8的三維結(jié)構(gòu)是一個(gè)兩個(gè)N-末端均在一個(gè)開放構(gòu)型中的勻二聚物。當(dāng)IL-8的兩個(gè)N-末端被附加的氨基酸所封閉時(shí)，其生物活性是可能喪失的。因此，在兩個(gè)CDNA之間引入限制性位點(diǎn)(NcoI/BclI)以產(chǎn)生連接肽從而恢復(fù)N-末端的可接近性。
產(chǎn)生融合蛋白的其它方法，例如兩成分的化學(xué)偶聯(lián)會(huì)導(dǎo)致可能在兩批產(chǎn)品間變動(dòng)的非常不確定的結(jié)構(gòu)。另外，化學(xué)偶聯(lián)會(huì)破壞配體的二級(jí)結(jié)構(gòu)或產(chǎn)生由于不可接近性造成的大多數(shù)蛋白質(zhì)在受體接合方面的鈍化。相比較來說，本發(fā)明的方法可產(chǎn)生確定結(jié)構(gòu)的融合蛋白，這種蛋白可以幾乎無限制地被很重現(xiàn)地表達(dá)。
總之，本發(fā)明的融合蛋白具有下述性質(zhì)—接合于EGFR陽性細(xì)胞—產(chǎn)生趨化活性—介導(dǎo)MPO和過氧化物的釋放—誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的原位溶解。
因此，本發(fā)明的免疫偶聯(lián)物適用于腫瘤治療。
表1表1表明用于產(chǎn)生NcoI或BclI點(diǎn)位，以產(chǎn)生真核表達(dá)的融合蛋白的PCR引物序列。
圖1抗體一細(xì)胞因子免疫偶聯(lián)物的模型。
C＝細(xì)胞因子；VH＝重鏈可變區(qū)；VL＝輕鏈可變區(qū)；CH＝重鏈恒定區(qū)；CL＝輕鏈恒定區(qū)。
圖2以抗EGF-R的ELISA證明MAb425在COS-7的轉(zhuǎn)染上清中正方形MAb425-CH3上清液三角形MAb425-CH2-(NcoI)-IL-8上清液倒三角形MAb425-CH2-(BclI)-IL-8上清液點(diǎn)PHCMV上清液橫軸上清液稀釋度縱軸光密度在490nm圖3a以COS-7轉(zhuǎn)染上清誘導(dǎo)趨化性柱1對(duì)照DMEM/PS柱2未稀釋的PHCMV上清柱3MAb425-CH3上清1∶14稀釋(據(jù)EGF-γ-ELISA的結(jié)果)柱4MAb425-CH3上清1∶28稀釋(據(jù)EGF-γ-ELISA的結(jié)果)柱5未稀釋的MAb425-CH2-(BclI)-IL-8上清(1.76×10-10Mol/L*)柱6MAb425-CH2-(BclI)-IL-8上清1∶2稀釋柱7MAb425-CH2-(NcoI)-IL-8上清，未稀釋(2.0×10-10Mol/L*)柱8MAb425-CH2-(NcoI)-IL-8上清1∶2，稀釋*IL-8濃度以ELISA(Amersham)測(cè)定縱軸每個(gè)計(jì)數(shù)區(qū)的細(xì)胞數(shù)目圖3b純化IL-8介導(dǎo)的趨化作用縱軸每個(gè)計(jì)數(shù)區(qū)的細(xì)胞數(shù)目橫軸IL-8濃度(Mol/L)圖4MAb425-CH1-IL-8(E.Coli)介導(dǎo)的趨化作用點(diǎn)大腸桿菌中表達(dá)的MAb425-CH1-IL-8正方形大腸桿菌中表達(dá)的MAb425-F(ab’)三角形Dulbecco’s/BSA對(duì)照縱軸每個(gè)計(jì)數(shù)區(qū)的細(xì)胞數(shù)目橫軸濃度(Mol/l)圖5COS-7轉(zhuǎn)染上清對(duì)過氧化物釋放的誘導(dǎo)柱1未被刺激的細(xì)胞柱2IL-8 10-7M
柱3未稀釋的MAb425-CH2-(NcoI)-IL-8上清(2.0×10-10Mol/L*)柱4未稀釋的MAb425-CH2-(BclI)-IL-8上清(1.76×10-10Mol/L*)柱5未稀釋的MAb425-CH3上清(OMol/L*)*IL-8的濃度由ELISA(Amersham)測(cè)定縱軸光密度在550nm圖6以COS-7轉(zhuǎn)染上清液誘導(dǎo)MPO釋放柱1未被刺激的細(xì)胞柱2用細(xì)胞松馳素B刺激的細(xì)胞柱3IL-8 10-7M柱4未稀釋的MAb425-CH3上清液柱5MAb425-CH3上清液1∶2稀釋柱6未稀釋的MAb425-CH2-(NcoI)-IL-8上清液柱7MAb425-CH2-(NcoI)-IL-8上清液1∶2稀釋柱8未稀釋的MAb425-CH2-(BclI)-IL-8上清液柱9MAb425-CH2-(BclI)-IL-8上清液1∶2稀釋縱軸與總的MPO量(100％)相比的％MPO活性所有微生物、細(xì)胞素、質(zhì)粒、啟動(dòng)子、抗性標(biāo)記，復(fù)制起始點(diǎn)，限制性位點(diǎn)或申請(qǐng)中提到的其它片段都是商品化的或可普遍得到的。如果沒有給出其它提示，它們僅用作例證，而不是本發(fā)明所必需的，并可相應(yīng)地被其它合適的工具和生物材料代替。
本發(fā)明所必需的相關(guān)技術(shù)在下文中詳盡敘述，其它未詳細(xì)描述的技術(shù)與已知標(biāo)準(zhǔn)方法相符，這些方法或?yàn)榧夹g(shù)熟練人員熟知或在引用的參考文獻(xiàn)，專利申請(qǐng)和標(biāo)準(zhǔn)文獻(xiàn)(如“Atibodies，A Labora-tory Manul”，Harlow，Lane，Cold Spring Harbor，1988)中有更詳細(xì)的描述。
單克隆抗體MAb425是抗人A431癌細(xì)胞系(ATCC CRL 1555)的IgG1鼠單克隆抗體。MAb425結(jié)合于人EGF受體外部功能區(qū)的多肽表位并與EGF競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合。MAb被發(fā)現(xiàn)在體外介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞毒性，并抑制表皮及直腸結(jié)腸腫瘤源細(xì)胞系腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)(Rodeck et al.，Cancer Res.473692，1987)。MAb425的人化或嵌合體轉(zhuǎn)型在WO92/15683中已公開。
趨化因子編碼趨化因子的CDNA既可以從英國(guó)Biotechnology(生化技術(shù))公司購(gòu)買(人IL-8 BBG44Hermann Biermann GmbH，BadNauheim FRG)或由產(chǎn)生人細(xì)胞系U937(ATCC CRL 1593)的細(xì)胞因子中分離出的mRNA產(chǎn)生從產(chǎn)生趨化因子的細(xì)胞中得到的總mRNA是用生產(chǎn)廠家介紹的RNA201(WAK-Chemie，Germany)分離的。此RNA隨后被轉(zhuǎn)錄成CDNA，編碼趨化因子的序列使用從已發(fā)表的DNA序列推測(cè)出的合適引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。
載體PUC19是一系列有關(guān)高拷貝數(shù)大腸桿菌質(zhì)?？寺』d體的一部分，并含有PBR322和MBmp19的幾部分。PUC19包含可誘導(dǎo)的細(xì)菌乳糖啟動(dòng)子-操縱子，其后是多克隆位點(diǎn)(Yanisch-Oerron etal.，Gene 33103-109，1985)。PUC載體可作為商品買到(例如New England Biolabs)。
pBluescipt KS/SK+和KS/SK噬菌體質(zhì)粒載體來自pUC19。這些載體都可作為商品買到(Stratagene，Heidelberg)。原核表達(dá)載體是以PUC19載體衍生物，PSW1載體作為基礎(chǔ)(Ward et al.，Nature 341544-546，1989)，PSW1包含一段序列，該序列編碼從Erwinia Carotovora得到的細(xì)菌pel基因的前導(dǎo)肽。外來DNA被導(dǎo)入框架，在pelB前導(dǎo)序列之后，使得蛋白表達(dá)入外周細(xì)胞質(zhì)中。
真核表達(dá)載體PHCMV(Gillies et al.，Cell 33717。1983)包含有猴病毒40(SV40)的復(fù)制起始點(diǎn)和人誕腺病毒的啟動(dòng)子和增強(qiáng)子區(qū)。這個(gè)啟動(dòng)子和增強(qiáng)子區(qū)的后面是多克隆位點(diǎn)，用以導(dǎo)入表達(dá)基因。在這個(gè)載體中，將MAb425重鏈可變區(qū)的嵌合體形式和與在CH2段末端的趨化因子融合的Cγ1 CH2區(qū)相結(jié)合以產(chǎn)生MAb425重鏈融合蛋白。通過與合適輕鏈相結(jié)合的方式把融合Ig鏈裝入免疫偶聯(lián)物中以形成一價(jià)抗原結(jié)合區(qū)，此區(qū)域隨后可被用于產(chǎn)生一個(gè)對(duì)靶抗原特異的二價(jià)免疫偶聯(lián)物。此重鏈及輕鏈結(jié)構(gòu)可被裝入一個(gè)或分開的載體中。
融合蛋白在真核細(xì)胞中的表達(dá)用于表達(dá)Fab425趨化因子融合蛋白的真核表達(dá)載體的構(gòu)建用PCR技術(shù)融合Mab425與趨化因子人Cγ1恒定區(qū)作為BamHI/BamHI片段被插入PUC19。這個(gè)Cγ1恒定區(qū)包含兩個(gè)SacII位點(diǎn)一個(gè)位于5’基因內(nèi)區(qū)5’BamHI位點(diǎn)下游40bp處，第二個(gè)位于5’BamHI位點(diǎn)下游580bp及CH3段開頭上游140bp處。第二個(gè)SacII位點(diǎn)適于更進(jìn)一步的亞克隆，因此，用一個(gè)連接子導(dǎo)入一個(gè)SnaBI位點(diǎn)會(huì)破壞第一個(gè)SacII位點(diǎn)。在這個(gè)結(jié)構(gòu)中(ΔSacII Cγ1)從SacII位點(diǎn)向下游的片段能夠很容易地被交換。
1.IL-8從PUC18載體(BglII/EcoRI)上切下并被插入pBlueScript SK+(Stratagene GmbH，Heidelberg)(Smal/EcoRI)，從而去掉BgIII和SamI位點(diǎn)。ΔSacII Cγ1克隆的SacII/×baI片段被插入pBlueskript SK+。兩個(gè)基因均使用PCR技術(shù)以合適的引物擴(kuò)增—對(duì)于ΔSacII cγ13’引物CH2段的末端序列和NcoI位點(diǎn)。
5’引物反向測(cè)序引物—對(duì)于IL-8 3’引物通用測(cè)序引物5’引物一個(gè)NcoI位點(diǎn)及IL-8起始序列產(chǎn)物被切下并以SK+SacII/EcoRI連接。所得肽序列CH2段C-末端的絲氨酸被變?yōu)榧琢虬彼幔琁L-8部分N-末端的絲氨酸被變?yōu)楦拾彼帷?br> 在兩個(gè)多肽之間接點(diǎn)上新產(chǎn)生的序列是5′AAA GCC ATG GGT GCT3′Lys Ala Met Gly Alacγ1CH2 IL-8(2-72)使用引物(表1)進(jìn)行同樣步驟以便在兩個(gè)基因中導(dǎo)入BclI位點(diǎn)。所得的融合基因在Cγ1恒定區(qū)與IL-8基因之間有一個(gè)BclI位點(diǎn)，此融合基因編碼CH-2段的全部序列，兩上附加氨基酸(纈氨酸，異亮氨酸)，設(shè)有前兩個(gè)氨基酸(絲氨酸丙氨酸)的IL-8序列。
在兩個(gè)多肽之間的接點(diǎn)上新產(chǎn)生的序列是5′GCC AAA GTG ATC AAA GAA 3′Ala Lys Val Ile Lys Glucγ1CH2
IL-8(3-72)使用SacII和EcoRI限制性位點(diǎn)將PCR產(chǎn)物亞克隆入SK+。為了真核表達(dá)的需要，把這些配合基因克隆進(jìn)pHcmv載體。
表1
免疫偶聯(lián)物在真核細(xì)胞中的表達(dá)免疫偶聯(lián)物在真核細(xì)胞中的表達(dá)需要將含有重鏈和輕鏈的載體DNA引入宿主細(xì)胞中。已經(jīng)介紹有多種不同的方法，如電穿孔，DEAE葡聚糖，磷酸鈣，脂質(zhì)體或原生質(zhì)體的融合。只要編碼免疫偶聯(lián)物的重組DNA序列在那種細(xì)胞型中被恰當(dāng)?shù)剞D(zhuǎn)錄成mRNA，任何一種宿主細(xì)胞型都可以使用。宿主細(xì)胞可以是不產(chǎn)生免疫球蛋白的骨髓瘤細(xì)胞，如Sp2/0-AG14(ATCC CRL 1581)，P3×63Ag8.653(ATCC CRL 1580)或倉(cāng)鼠細(xì)胞例如。CHO-KL(ATCCCCL61)或CHO/DHFR-(ATCC CRL 9096)，或BHK-21(ATCCCCL 10)。為瞬時(shí)表達(dá)的需要，可以使用COS-1(ATCC CRL 1650)或COS-7(ATCC CRL 1651)。
免疫偶聯(lián)物的瞬時(shí)表達(dá)表達(dá)載體PHCMV包含有猴病毒40(SV40)的復(fù)制起始點(diǎn)。細(xì)胞系COS-7是猴細(xì)胞系CV-1的一個(gè)分支，原細(xì)胞系已被轉(zhuǎn)入起始點(diǎn)缺乏的SV-40病毒。因此，含有SV40復(fù)制起始點(diǎn)的質(zhì)粒將會(huì)被擴(kuò)增，免疫偶聯(lián)物的產(chǎn)物也將會(huì)增加。72小時(shí)后收集上清液，用ELISA檢測(cè)EGF受體的結(jié)合情況及趨化因子濃度。
免疫偶聯(lián)物的永久表達(dá)把含有表達(dá)免疫偶聯(lián)物的重組結(jié)構(gòu)的載體導(dǎo)入合適的宿主細(xì)胞中。重鏈和輕鏈結(jié)構(gòu)可以被裝入同一個(gè)或分開的不同載體中；在后一種情況中，兩個(gè)載體可以帶有同一選擇標(biāo)記，如新霉毒抗性或二氫葉酸還原酶(DHFR)?；蛘邘в卸€(gè)不同的選擇標(biāo)記用于兩個(gè)載體都存在時(shí)的篩選。DHFR標(biāo)記的選擇只能在DHFR負(fù)性細(xì)胞系如CHO/DHFR-中進(jìn)行。為了表達(dá)免疫偶聯(lián)物，可以使用EGF受體特異性的ELISA分析混合種群。對(duì)陽性克隆進(jìn)一步的篩選可使用限度稀釋克隆法進(jìn)行。
M425趨化因子免疫偶聯(lián)物的純化由宿主細(xì)胞制造的M425免疫偶聯(lián)物可以使用任何一種合適的方法進(jìn)行收集和純化，例如使用靶抗原、抗細(xì)胞因子抗體或抗個(gè)性基因抗體的親合色譜法(例如Harlow，lane，I.c.)。
本發(fā)明中使用經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)方法(如Kostelny et al.(1992)，J.Im-munol，148，1547)，由MAb425制取的抗個(gè)性基因抗體進(jìn)行純化。
為了獲得純的FV-免疫偶聯(lián)物，將表達(dá)質(zhì)粒(見下)轉(zhuǎn)入適于蛋白表達(dá)的大腸桿菌菌株。細(xì)胞生長(zhǎng)到OD578＝0.5，并用異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)(ImM)誘導(dǎo)。細(xì)胞生長(zhǎng)過夜，收集上清液及細(xì)胞。上清液用一個(gè)依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)步驟制備的抗MAb425，抗個(gè)性基因的色譜柱進(jìn)行分離。以含有0.5M Nacl的磷酸鹽緩沖液洗柱，結(jié)合在柱上的蛋白用PH＝2.5的含0.5M Nacl的100mm甘氨酸洗脫。洗脫液立即用PH8.0的2.5M Tris中和，將含有MAb425-CH1-IL-8的各部分合并，濃縮并對(duì)PBS透析。
用于Fab425-趨化因子的原核表達(dá)載體的構(gòu)建及Fv-趨化因子融合蛋白的表達(dá)Fv片段依據(jù)Glock shuber等人的方法制成(Bit-chemistry 291362-1367，1990)。編碼輕鏈和重鏈Fd片段或Fv片段的DNA序列被導(dǎo)入PSW1載體的多克隆位點(diǎn)中。輕鏈成熟編碼序列，重鏈成熟編碼序列及Fv編碼序列位于細(xì)菌pelB基因的前導(dǎo)肽之后。重鏈的編碼序列包含一個(gè)NcoI(3’末端)位點(diǎn)。以PCR修飾編碼CDNA的趨化因子以導(dǎo)入NcoI(5’末端)和NotI(3’末端)或EcoRI(用于Fv融合)限制性位點(diǎn)。在框架中，趨化因子基因被直接融合于重鏈的CH1區(qū)或Fv段。相應(yīng)地，一個(gè)連接肽，例如(Gly-Gly-Gly-Gly-Sex)x，這里x可為1到4，可被導(dǎo)入CH1區(qū)和趨化因子基因之間。這種連接子及其制作方法可從文獻(xiàn)(如Curtis等，1991，Proc、Natl、Acad、Sci、U.S.A，88，5809)中得知。
這些載體使功能性F(ab’)(＝CHI)及Fv-趨化因子，融合蛋白在大腸桿菌中的有效表達(dá)成為可能。輕鏈和重鏈-趨化因子融合蛋白定位于在可誘導(dǎo)的乳糖啟動(dòng)子(Skerra和Pluckthun，Science 2421038-1040，1988)調(diào)控下的單二順反子信使RNA上，因此，F(xiàn)ab/Fv-融合蛋白的表達(dá)可根據(jù)對(duì)培養(yǎng)條件的要求來誘導(dǎo)。從二順反子信使RNA上翻譯，兩個(gè)蛋白傾向于合成等量的Fd-趨化因子融合蛋白和輕鏈，以增加正確裝配入功能性Fab/Fv融合蛋白的可能性。這兩個(gè)多肽被分泌入大腸桿菌外周胞質(zhì)中，在那里發(fā)生二硫鍵的折疊，形成并裝配入功能性Fab 425 CH1/Fv融合蛋白中。延長(zhǎng)細(xì)菌的培養(yǎng)可導(dǎo)致大腸桿菌外膜的部分滲透性使得融合蛋白可擴(kuò)散入培養(yǎng)基中。
Mab425免疫偶聯(lián)物的結(jié)合作用Mab425免疫偶聯(lián)物的結(jié)合性質(zhì)用EGF-受體特異性的ELISA測(cè)定。簡(jiǎn)言之，就是微滴定度板在4℃用純化的EGF-受體包被過夜。用含有融合蛋白的上清液或含有未被偶聯(lián)的Mab片段的上清液孵育該板。洗板以移去未被結(jié)合的材料，然后平板先用偶聯(lián)于過氧化物酶的羊抗人IgG及IgM(重鏈和輕鏈)，再用底物孵育，以檢測(cè)結(jié)合于EGF-受體的抗體。在490nm測(cè)定結(jié)合的EGF-受體特異性蛋白的量。
Mab425-IL-8免疫偶聯(lián)物的生物活性效應(yīng)細(xì)胞的分離為了檢測(cè)生物活性，按Hoslett等(Am.J.Pathol 119101-110，1985)以前所述，從健康供血者的全血中新鮮分離出人外周血嗜中性粒細(xì)胞。離心分離血漿，用葡聚糖沉降法分離紅細(xì)胞，最后用percoll-梯度離心法分離淋巴細(xì)胞和白細(xì)胞。分離出的中性粒細(xì)胞立即使用。
趨化活性的檢測(cè)趨化性的檢測(cè)依據(jù)Fald等(J.Immunol Methocls 33239-247，1980)所述方法進(jìn)行。簡(jiǎn)言之，就是使用48boyden chamber及5um的膜，純化的中性粒細(xì)胞以1×106細(xì)胞/ml的濃度被重新懸浮于DEME介質(zhì)中(DEME，1％青霉素，1％鏈霉素，10％FCS，2mML谷氨酰胺，1mM谷銅酸鈉，10mM HEPES)。含有融合蛋白的上清液或?qū)φ丈锨逡悍湃胂旅娴目字?，以膜覆蓋上面的孔中盛裝細(xì)胞懸液。在37℃孵育30分鐘后，把膜移去并在2％戊二醛。中將膜固定10分鐘。然后，在魏格特氏鐵蘇木精染劑中將粘附于膜上的細(xì)胞染色3分鐘。在顯微鏡下，測(cè)定結(jié)合于膜的細(xì)胞數(shù)目。
在中性粒細(xì)胞中誘導(dǎo)酶釋放能力的測(cè)定為評(píng)估這些免疫偶聯(lián)物在中性粒細(xì)胞中誘導(dǎo)顆粒釋放的能力，要控制上清液中髓過氧化物酶的活性(Henson等，J.Immunol 121851；1978)試驗(yàn)在每孔5×105個(gè)細(xì)胞的96孔微量滴定度板中進(jìn)行。與刺激物孵育(37℃)后，離心滴定度板，并把不含細(xì)胞的上清液轉(zhuǎn)移到另一個(gè)96孔微量滴定度板中。這個(gè)不含細(xì)胞離的上清液與二茴香胺(作為底物)孵育并在492nm測(cè)定吸收度使用濃度為10-7M的FMLF作為陽性對(duì)照。為測(cè)定全部酶含量，以三硝基甲苯溶解未經(jīng)刺激的細(xì)胞。以對(duì)全部酶含量(溶解)的百分比計(jì)算活力。
過氧化物釋放能力的測(cè)定細(xì)胞色素C可被O2-所還原并因此改變它的吸收度。這個(gè)吸收度的變化對(duì)估計(jì)過氧化物的活性是一個(gè)有價(jià)值的標(biāo)志。此試驗(yàn)依據(jù)Guthrie等(J.Exp.Med 1601656-1671，1984)所述方法在每孔5×105個(gè)細(xì)胞的96孔微量滴定度板中進(jìn)行。將刺激物與細(xì)胞色素C孵育后，離心平板，在550nm測(cè)定上清液的吸收度。
進(jìn)一步的免疫偶聯(lián)物據(jù)以上描述，已經(jīng)制備并研究了抗EGFR-CH1，-CH2-，CH3及Fv的免疫偶聯(lián)物(帶有/不帶有限制性位點(diǎn)和連接子)，它們包含有作為趨化因子組分的MIP-2α及MIP-2β。這些結(jié)構(gòu)顯示出與IL-8分枝相似的性質(zhì)。
免疫偶聯(lián)物的治療用途本發(fā)明的免疫偶聯(lián)物可為治療目的給藥于病人。因此，本發(fā)明的目的之一是提供一種藥物配方，它包含有至少一個(gè)在上文及權(quán)利要求中定義的融合蛋白作為活性成分，并輔以一種或多種藥學(xué)許可的載體，賦形劑或稀釋劑。
本發(fā)明中的免疫偶聯(lián)物典型的給藥方式是靜脈內(nèi)或胃腸外注射。一般來說，這些免疫偶聯(lián)物給藥的劑量范圍很廣足以產(chǎn)生目標(biāo)腫瘤的抑制及腫瘤溶解效應(yīng)。這個(gè)劑量依賴于病人的年齡，個(gè)體條件，性別及疾病程度，并可以在0.1mg/kg到200mg/kg之間變動(dòng)，傾向于選擇每日劑量在0.1mg/kg到100mg/kg之間，一次或多劑量給藥，持續(xù)一天或幾天。
胃腸外給藥的制劑包括無菌水溶液或非水溶液，懸液及乳劑。非水溶劑可以是丙二醇，聚乙二醇，植物油如橄欖油和可注射的有機(jī)酯如油酸乙酯，以及在技術(shù)上已知的適于這些意圖的其他溶劑。本項(xiàng)發(fā)明的免疫偶聯(lián)物可被用在一種含有生理學(xué)許可的載體的成分中。這些合適的載體可以是鹽水，PBS，林格氏溶液及乳酸化的林格氏溶液。防腐劑和其他添加劑如抗菌素，抗氧劑及螯合劑也可以出現(xiàn)在藥物配方中。
所提請(qǐng)發(fā)明的藥物配方適用于對(duì)所有類型腫瘤的治療，包括黑色素瘤，神經(jīng)膠質(zhì)瘤及癌癥，也包括血液腫瘤和固體腫瘤。
權(quán)利要求
1.免疫偶聯(lián)物，包含有導(dǎo)向承載表皮生長(zhǎng)因子受體抗原表位的腫瘤細(xì)胞的單克隆抗體或其片段，以及融合于上述抗體或抗體片段的趨化因子蛋白質(zhì)。
2.權(quán)利要求1中的免疫偶聯(lián)物，其趨化因子選自C-X-C族。
3.權(quán)利要求2中的免疫偶聯(lián)物，其趨化因子是IL-8。
4.權(quán)利要求1至3之一中的免疫偶聯(lián)物，其抗體是一個(gè)主要包含抗體重鏈的可變區(qū)、恒定區(qū)的CH1段及合適輕鏈(抗體-CH1偶聯(lián)物)的Fab片段或F(ab)2片段。
5.權(quán)利要求1至3之一中的免疫偶聯(lián)物，其抗體是一個(gè)主要包含有抗體重鏈的可變區(qū)、恒定區(qū)的CH1和CH2段及合適輕鏈(抗體-CH2偶聯(lián)物)的抗體片段。
6.權(quán)利要求1至3之一中的免疫偶聯(lián)物，其抗體是一個(gè)主要包含有抗體重鏈的可變區(qū)，恒定區(qū)的CH1、CH2和CH3段及合適輕鏈(抗體CH3偶聯(lián)物)的抗體片段。
7.權(quán)利要求1至3之一中的免疫偶聯(lián)物，它主要由抗體重鏈的可變區(qū)、合適輕鏈以及一段連接重鏈輕鏈(抗體一Fv偶聯(lián)物)的多肽序列所組成。
8.權(quán)利要求1至6之一中的免疫偶聯(lián)物，它包含可由抗體/抗體片斷和生物活性配基之間的一個(gè)限制性位點(diǎn)推導(dǎo)出的一個(gè)氨基酸(序列)，上述限制性位點(diǎn)在整個(gè)融合結(jié)構(gòu)中是唯一的。
9.權(quán)利要求1至7之一中的免疫偶聯(lián)物，它包含一位于抗體/抗體片段與生物活性配基之間的連接肽。
10.權(quán)利要求1至8之一中的免疫偶聯(lián)物，其抗體或抗體片段來源于鼠的，人化的或嵌合體的MAb425。
11.選自MAb425-CH1-IL8，MAB425-CH2-(NcoI)-IL-8，MAb425-CH2-(BclI)-IL8，MAb425-Fv-IL8，MAb425-CH3-IL8組的一個(gè)免疫偶聯(lián)物。
12.權(quán)利要求1至10之一的免疫偶聯(lián)物的生產(chǎn)方法，它包括將編碼抗體或抗體片段及生物活性的配基的DNA序列通過與所需融合DNA序列互補(bǔ)的單鏈DNA彼此融合在一單鏈DNA上，將產(chǎn)生的結(jié)構(gòu)放入表達(dá)載體中，轉(zhuǎn)化此載體到宿主生物體中，在營(yíng)養(yǎng)液中培養(yǎng)此宿主細(xì)胞并表達(dá)此融合蛋白。
13.藥物組合物，它包含至少一個(gè)權(quán)利要求1至10中的免疫偶聯(lián)物以及生理學(xué)上許可的載體。
14.權(quán)利要求1至10之一中的免疫偶聯(lián)物應(yīng)用于制備抗腫瘤的藥物。
全文摘要
本項(xiàng)發(fā)明涉及新型免疫偶聯(lián)物，其包含對(duì)人EGF一受體分子特異性的一個(gè)單克隆抗體或其片段，以及趨化因子族中的一員，傾向于從C-X-C族中選拔，例如白細(xì)胞介素8。這些免疫偶聯(lián)物誘導(dǎo)細(xì)胞毒性和趨化活性并且適用于靶向腫瘤治療。
文檔編號(hào)A61K39/385GK1123185SQ95116279
公開日1996年5月29日 申請(qǐng)日期1995年9月14日 優(yōu)先權(quán)日1994年9月16日
發(fā)明者W·霍爾茲, I·馮·霍格恩, W·斯特里瑪特爾, S·瑪滋庫(kù) 申請(qǐng)人:默克專利股份有限公司