專利名稱：與抗血栓形成和血纖維蛋白溶解的治療劑組合使用的含vWF濃縮物的治療劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及含Von Willebrand氏因子(vWF)的藥物作為血抗凝劑的應(yīng)用，它可單獨使用或與血纖維蛋白溶解劑一起使用，用于進行治療。為了減小病人出血的危險可同時進行給藥或繼抗凝劑和溶素治療后給藥。治療的原理可被描述為將所需的抗凝和/或纖維蛋白溶解作用與不需要的出血趨向的副作用分開。
凝血和纖維蛋白解成分失去平衡時，在臨床上一方面表現(xiàn)為形成血栓，另一方面表現(xiàn)為出血。兩種病理現(xiàn)象都會威脅生命。例如在血栓形成的情況下，如涉及急性心肌梗塞形成，在許多例子中，需要調(diào)節(jié)溶解和凝血的占優(yōu)勢的一方。例如，通過給予鏈激酶(SK)或纖維蛋白溶酶原激活劑(t—PA或uPA，適當(dāng)重組的)來支持纖維蛋白溶解系統(tǒng)，以便溶解已經(jīng)存在的任何血凝塊。凝血系統(tǒng)或者被完全抑制或者被衰減，例如通過肝素或低分子量肝素(LWMH)的方式，或通過凝血酶抑制劑的方式，例如，如合成的抑制劑MCI—9038(Tamaoy等，Thromb.Hoemost.56，1，28—34，1987)或重組的水蛭素(r—Hir)，或者通過Xa因子抑制劑的方式如重組的tick抗凝蛋白(tick anticoagulant Protein)(r—TAP)，或通過血小板拮抗劑如阿斯匹林或直接對抗血小板的7E3抗體。結(jié)果使因血栓形成而閉塞的血管打開，而且也預(yù)防血栓的形成。不過，在血管損傷時，需要一定的形成血栓的能力，以便防止在這些部位出血。
按照現(xiàn)有技術(shù)的描述，試圖通過中斷治療或通過給予凝血促進劑(解毒劑)來阻止可能發(fā)生在抗凝血劑治療或與溶解治療合并的抗凝治療中的任何威脅生命的出血。此凝血促進劑含有VIII因子(FVIII)或者增加血液中FVIII的內(nèi)源性濃度的物質(zhì)如去氨加壓素(DDAVP)(Mannucci PM，Ruggeri ZM，Pareti F1，CapitanoA，1977，Lancet，1，869—872，EP036771381，1992；美國專利5204323,1993)，或抗纖維蛋白溶解劑如與去氨加壓素混合的抑肽酶，凝血酸、∈—氨基己酸和4—氨基甲基苯甲酸(WO9220361，1992)。其它凝血促進劑特別是由凝血因子組成，某些已經(jīng)是激活的，商業(yè)產(chǎn)品為FEIBA(Immuno AG)，或由凝血酶原濃縮物組成，商業(yè)產(chǎn)品為Beriplex(Behring Werke AG)或Autopeex(Baxter INC.)。所有這些解毒劑主要使活性化合物的治療作用降低，并因此也降低這些化合物產(chǎn)生的副作用。然而，預(yù)計上述解毒劑作用包含使先前治療結(jié)果(抗凝血)失去價值的危險，并具有隨后形成血栓的嚴(yán)重后果。
在臨床實踐中，激活部分促凝血酶原激酶的時間(aPTT)用作定量度量抗凝血和纖維蛋白溶解作用，出血時間(BT)用于度量出血趨向性。一種確定出血時間的方法(也是在人類臨床實踐中非常普遍的)是通過Simplate法來測量皮膚的出血時間(Lethagen S.和Klings，1993，Thrombosis Haemosteasis 70,595—597)?？傊?，在該意義上，aPTT和BT之間的相關(guān)性非常好，作用的增加(測量的aPTT值的增加)也引起隨后的副作用的增加，即出血時間延長。
血管損傷后止血過程的機制研究表明在最初的止血階段，血小板主要通過von Willebrand氏因子(vWF)方式與內(nèi)皮下的膠原纖維結(jié)合。vWF是僅有的能有效地與暴露的膠原蛋白以低的(如在靜脈區(qū)域)和高的(如在動脈、冠狀區(qū)或與空斑確定相關(guān)的血管狹窄)剪切速率相結(jié)合(Ruggeri ZM，Seminars inhematalogy，1994，31，229—239)。隨后血小板凝聚，預(yù)計包含凝血酶的凝聚的血小板凝縮并收縮，結(jié)果在第二個止血階段產(chǎn)生止血結(jié)果(Hemker Hc和Poliwoda H，1993，1—18，Barthels M和Poldowa H，editors Thieme Verlag，stuttgart，，Germany)。
到目前為止，vWF是已知的最大溶解性血漿蛋白。它是一種多體的糖蛋白，具有兩個生物特性。介導(dǎo)血小板與局部損傷血管粘合，繼而形成血栓，并起運載促凝血因子VIII的作用(Ruggeri ZM.1993 Current Opinion in cell Bialogy，5,898—906)。在內(nèi)皮下膜存在一定量的vWF，也以游離因子VIH的形式在血小板的a顆粒中貯存。血小板具有兩個vWF受體1.在GPIb一Ix—V復(fù)合物中的GPIb和2.GP IIb—IIIa(Ruggeri ZM，1994 Seminars inHematology 31，229—239)。通過前一受體的方式，vWF介導(dǎo)血小板在損傷的血管部位上粘合，然后通過GP IIb—IIIa受體的方式進行隨后的血小板凝集，盡管這種凝集主要是持續(xù)的纖維蛋白與GP IIb—IIIa受體的結(jié)合。面對這樣的背景，在文獻中有關(guān)于將結(jié)合vWF的抑制劑用作抗凝劑的原理的討論(Alevriadou BR，Moake JL，Turner NA，Ruggeri ZM，F(xiàn)olie BJ，Phillips MD，Schreiber AB，Hrinda ME，McIntire IV，1993，Blood，81，1263—1276；Gralnick HR，Williams S，Mckeown L，Kramer W，Krutzsch H，Gorecki M，Pinet A，Garfinkel LI，1992，Proc.Natl，Acad.Sci.USA,89,7880—7884)。
現(xiàn)已驚奇地發(fā)現(xiàn)，當(dāng)另外將血漿vWF給予用水蛭素進行抗凝血治療試驗的豬時，不會防礙系統(tǒng)的抗凝血作用(aPTT)，出血副作用(BT)減低到低于出血時間兩倍的水平，然后保持恒定。在未輸入vWF的對照實驗中，BT升高到約為正常出血時間的3倍(圖1)。


圖1vWF對γ—水蛭素誘導(dǎo)的豬皮膚出血時間的影響，0.3mg/kg×hr—水蛭素(安慰劑組，·)；0.3mg/kg×hr—水蛭素加(3小時后)，66vWF單位/kg，靜注濃縮藥團，和187vWF單位/kg×h，靜脈輸入vWF(vWF組，△)因而，通過與抗凝血治療劑和(合適時)與纖維蛋白溶解治療劑合并使用的方法，達到了本發(fā)明的目的，該方法是通過適當(dāng)補充含vWF的溶液，使上述的所需作用(由aPTT表示的)和不需要的出血副作用(BT表示的)之間的相關(guān)性分開在保留了治療作用、即排除血栓形成危險的同時，最大限度地減小了由抗凝劑或纖維蛋白溶解劑的作用所引起的副作用。
所以，本發(fā)明涉及vWF的應(yīng)用，用于制備一種在因給予抗血栓形成和/或纖維蛋白溶解劑而產(chǎn)生出血時作為假解毒劑的藥劑。另外，本發(fā)明涉及藥物組合物，它含有抗血栓形成劑和/或纖維蛋白溶解劑作為組分A，并含有vWF或具有vWF活性的片斷作為組分B。
所使用的vWF濃縮物例如可為商業(yè)產(chǎn)品HaemateHS(Behringwerke AG)，除含vWF外，它可含有FVIII。實施例1在輸注水蛭素后和合并輸注vWF溶液(HaemateHS等于Haemate P)后的出血時間過程和aPTT過程。
7頭閹割后的雄性豬，靜脈輸注0.3mg重組的水蛭素(r—水蛭素)/kg×h共7小時。輸注開始后3小時，3頭豬另外靜注含vWF的濃縮物藥團(66vWF單位/kg)，隨后輸注187vWF單位/kg×h共2小時(vWF組)。其它4頭豬給予相應(yīng)容積的氯化鈉溶液來代替vWF(安慰劑組)。試驗期間，用Simplate法測定皮膚的出血時間(Organon—Teknika)，根據(jù)Neothromtin法測定血漿的aPTT(Beliringwerke AG)。如圖1所示，開始兩組的出血時間都升高，而7小時后，安慰劑組升高到正常值的約3倍。在vWF組中，用vWF治療后出血時間減小，并幾乎在7小時后再次達到正常值(在6和7小時時兩組的區(qū)別是統(tǒng)計學(xué)上顯著的)。因此，vWF能使因給予凝血酶抑制劑r—水蛭素而增加的出血危險重新正?；?br> 在相同的試驗中，測定r—水蛭素的抗凝血活性指征aPTT。如表1所示，可發(fā)現(xiàn)在安慰劑組和vWF組之間無顯著性差異；可看到兩組的aPTT增加約2倍。
表1

下列抗凝劑可與vWF并用肝素；LMW肝素；合成(重組)凝血酶抑制劑如r—水蛭素，及其衍生物如聚乙二醇水蛭素或Hirulog；合成的低分子量的凝血酶抑制劑如阿加曲班(Argartroban)(MCI 9098，見Tamao y et al.loc.cit)；合成或重組FXa抑制劑如TAP；合成或重組FVII抑制劑如組織因子途徑抑制劑(TFPI)；血小板對抗劑如乙酰水楊酸或合成纖維蛋白原受體抑制劑和血小板抗體(例如7E3)；維生素K對抗劑如體法林，苯丙香豆素和醋硝香豆素。
下列纖維蛋白溶解劑非常適合于與上述抗凝劑和vWF并用鏈激酶；纖維蛋白溶酶原激活劑(rt—PA和uPA)及其衍生物如APSAC。
實施例2
當(dāng)與水蛭素和阿斯匹林并用時，vWF溶液(Haemata對出血時間的作用。
在本試驗中，凝血酶抑制劑水蛭素與血小板抑制劑斯匹林并用，共使用4頭豬。首先以20mg/kg的濃度輸注阿斯匹林半小時，然后以0.3mg/kg×h的濃度輸注(t＝0)水蛭素7小時。
3小時后，2頭豬給予vWF溶液(HaemateHS)，具體地靜注66vWF單位/kg藥團，然后靜脈輸入187vWF單位/kg×h2小時。其余的豬給予相應(yīng)量的氯化鈉溶液。表2顯示，3小時后，出血時間升高到原始值(0值)的約2.5倍。然而，給予vWF溶液6小時后導(dǎo)致出血時間明顯減小(降至原始值的1.8倍)，用Nacl處理的豬表2 水蛭素和阿斯匹林的抗凝作用由vWF濃縮物減小的出血時間

*HaemateHS
實施例3因為所用的vWF溶液(HaemateHS)除vWF外，也含有凝血因子VIII(FVIII)，所以可以進行試驗來測定是否可以給予含低量FVIII的vWF濃縮物，以用于減小由r—水蛭素引起的出血時間延長。7頭豬輸注0.3mg r—水蛭素/kg×h7小時。3小時后，3頭豬用含低量FVIII的vWF濃縮物處理(靜注66vWF單位/kg藥團，并靜脈輸注187vWF單位/kg×h)。4頭豬給予相應(yīng)量氯化鈉溶液。表3顯示，含低量FVIII的vWF也減小r—水蛭素增加的出血時間。
權(quán)利要求
1.vWF或具有vWF活性的片斷的應(yīng)用，用來制備一種試劑，該試劑可矯正因給予抗血栓形成和/或纖維蛋白溶解劑引起的出血。
2.一種藥用組合物，它含有組分A抗血栓形成劑和/或纖維蛋白溶解劑和，組分BvWF或有vWF活性的片斷。
3.權(quán)利要求2的藥用組合物，其中各組分以分離的單劑量形式存在。
全文摘要
本發(fā)明涉及用作血抗凝劑的含Von Willebrand氏因子(vWF)的藥物，它可單獨使用或與血纖維蛋白溶解劑一起使用，用于進行治療。為了減小病人出血的危險，可同時給藥或繼抗凝劑和溶素治療后給藥。治療的原則為，在治療期間，將所需的抗凝和/或纖維蛋白溶解作用與不需要的出血趨向的副作用分開。
文檔編號A61K38/55GK1128168SQ9511871
公開日1996年8月7日 申請日期1995年10月18日 優(yōu)先權(quán)日1994年10月20日
發(fā)明者M·里爾斯, G·迪克耐特 申請人:柏林魏克股份公司