專(zhuān)利名稱(chēng)：新型呼吸道病毒性疾病治療藥物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種防治病毒性疾病的藥劑，其活性成份是抗白細(xì)胞蛋白酶(以下簡(jiǎn)稱(chēng)ALP)。更具體地說(shuō)，本發(fā)明涉及一種含ALP作活性成份，用以防治由Clara類(lèi)胰蛋白酶激活的病毒所導(dǎo)致呼吸道病毒性疾病的藥劑。
背景技術(shù)：
ALP存在于外分泌物中，如支氣管粘液，唾液，精液，宮頸粘液和鼻涕中。它是一種絲蛋白酶抑制劑，分子量12KDa，包含107個(gè)氨基酸殘基。它也被認(rèn)為是與分泌性白細(xì)胞蛋白酶抑制劑(SLPI)，支氣管粘液抑制劑，粘性蛋白酶抑制劑和人精液抑制劑相同的物質(zhì)。ALP的氨基酸序列已被測(cè)定(專(zhuān)利公開(kāi)號(hào)WO86/03497)。其蛋白基團(tuán)也被分離并測(cè)序(專(zhuān)利公開(kāi)號(hào)WO86/03519)。
從同源性比較，已知ALP包含兩個(gè)抑制劑區(qū)，一個(gè)是N-端區(qū)，被認(rèn)為起抑制多種胰蛋白酶樣酶作用，另一個(gè)是C-端區(qū)，通過(guò)X-衍射晶體結(jié)構(gòu)分析，認(rèn)為與胰凝乳蛋白酶結(jié)合，并具有抑制彈性蛋白酶的作用[M.G.Gruetter，The EMBO.Journal.Vol.7，No.2，PP.345-351(1988)]。
由于ALP可抑制胰凝乳蛋白酶樣酶如白細(xì)胞彈性蛋白酶和組織蛋白酶G，又可抑制胰蛋白酶樣酶如胰蛋白酶，纖溶酶，激肽釋放酶和凝血酶等，已知它與肺氣腫，關(guān)節(jié)炎，腎小球腎炎，牙周炎，肌肉萎縮，腫瘤侵入(專(zhuān)利公開(kāi)號(hào)WO86/03497)，慢性支氣管炎和慢性宮頸炎(日本未受審查專(zhuān)利公開(kāi)號(hào)62-259591)有關(guān)。當(dāng)然，ALP在病毒性疾病中的作用還是未知的。
病毒感染有以下幾步，1)病毒附著于靶細(xì)胞之膜受體上，2)病毒包膜與靶細(xì)胞膜間發(fā)生膜融合，3)病毒基因組傳輸?shù)桨屑?xì)胞內(nèi)。在發(fā)生膜融合的步驟2)中，病毒包膜中的糖蛋白前體必須轉(zhuǎn)化成有膜融合活性的成熟病毒包膜糖蛋白形式。通過(guò)蛋白分解完成這步轉(zhuǎn)化后，病毒獲得了使病毒包膜與呼吸道細(xì)胞膜融合的能力。流感病毒中的血凝素(HA)和仙臺(tái)(Sendai)病毒(副粘液副流感一型病毒)中的F0是其包膜糖蛋白前體，它們的蛋白分解斷裂對(duì)病毒感染性表達(dá)及病毒復(fù)制都是必需的。
近期的發(fā)明者們已成功地從鼠肺中分離一種新的精氨酸特異性絲蛋白酶，命名為“Clara類(lèi)胰蛋白酶”(tryptase Clara)(The Journal of Biological Chemistry，Vol.267，PP.13573-13579，1992)。
Clara類(lèi)胰蛋白酶將仙臺(tái)病毒中的F0斷裂成兩個(gè)亞單位F1和F2，在試管內(nèi)以劑量依賴(lài)方式激活該病毒的感染性。另外，已經(jīng)知道在鼠肺中Clara類(lèi)胰蛋白酶抗體抑制仙臺(tái)病毒的蛋白分解激活作用，從而抑制病毒復(fù)制和鼠肺上的病理改變(Journal of Virology.Vol.66，PP.7211-7216，1992)。
此外，Clara類(lèi)胰蛋白酶也斷裂流感病毒A/Aichi/2/68(H3N2)中的HA成HA1和HA2(TheJournal of Biological Chemistry，Vol.267，PP.13573-13579，1992)。
總的來(lái)說(shuō)，Clara類(lèi)胰蛋白酶被認(rèn)為是決定在呼吸道中接觸性傳染病毒之致病性的一個(gè)主要因素。
本發(fā)明者們此前已發(fā)現(xiàn)肺的表面活性劑可抑制Clara類(lèi)胰蛋白酶斷裂病毒包膜糖蛋白前體，從而阻斷了病毒對(duì)支氣管粘上皮細(xì)胞感染及病毒復(fù)制(專(zhuān)利公開(kāi)號(hào)WO94/00181，F(xiàn)EBS Letters，322，115-119(1993))。

發(fā)明內(nèi)容
為尋找抑制Clara類(lèi)胰蛋白酶激活病毒的物質(zhì)，本發(fā)明者們不斷研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)ALP能夠顯著抑制由Clara類(lèi)胰蛋白酶引起的病毒激活，從而達(dá)到抑制被病毒感染動(dòng)物體內(nèi)之病毒復(fù)制的目的。本發(fā)明也因此得以完成。
本發(fā)明提供一種含ALP作活性成份的防治病毒性疾病的藥劑。
依據(jù)本發(fā)明所使用的ALP不僅包括天然分離純化的和使用基因工程方法(如，用專(zhuān)利公開(kāi)號(hào)WO86/03519，WO89/06239，日本未經(jīng)審查專(zhuān)利公開(kāi)No.62-259591，No.3-123490等提供的方法)制備的ALP，也包括對(duì)ALP氨基酸序列的某些部分作取代，消去，插入和加成處理、具有與ALP同樣活性的蛋白。
本發(fā)明之防治藥劑所針對(duì)的病毒性疾病包括由以下病毒所引起的疾病流感病毒(influenza virus)，副粘病毒(paramyxovirus)，呼吸道合胞體病毒(respiratorysyncytial virus)(以下簡(jiǎn)稱(chēng)“RS病毒”)，鼻病毒(rhinovirus)，冠狀病毒(coronavirus)，呼吸道腸道病毒(reovirus)，腺病毒(adenovirus)，柯薩奇病毒(Coxsackie virus)，艾柯病毒(echovirus)，單純皰疹病毒(simple herpes virus)，輪狀病毒(rotavirus)，腸道病毒(enterovirus)，脊髓灰質(zhì)炎病毒(poliovirus)，巨細(xì)胞病毒(cytomegalovirus)，帶狀水痘病毒(varicella zoster virus)和愛(ài)滋病毒(HIV)。但它更適合感染發(fā)生在呼吸道上的病毒性疾病，而該感染是由于Clara類(lèi)胰蛋白酶所激活的病毒引起的，也即有包膜的病毒，如流感病毒，副粘病毒，RS病毒，麻疹病毒(measles virus)和流行性腮腺炎病毒(mumps virus)。
附圖簡(jiǎn)述

圖1顯示了ALP對(duì)Clara類(lèi)胰蛋白酶斷裂仙臺(tái)病毒包膜之糖蛋白前體F0的抑制作用。
圖2顯示了ALP對(duì)Clara類(lèi)胰蛋白酶斷裂流感病毒包膜之糖蛋白前體HA的抑制作用。
圖3顯示了ALP對(duì)在培養(yǎng)細(xì)胞中仙臺(tái)病毒和流感病毒感染的抑制作用。其中“A”代表仙臺(tái)病毒感染實(shí)驗(yàn)，“B”代表流感病毒感染實(shí)驗(yàn)。
圖4顯示了ALP對(duì)感染流感病毒(鼠耐(mouse-adapted)流感病毒A/Asia/1/57(H2N2))鼠的作用情況。“A”表示鼠肺上病毒的效價(jià)，“B”表示肺部受損害程度?！癆”中，實(shí)線代表沒(méi)有ALP時(shí)病毒的效價(jià)，虛線代表有ALP時(shí)病毒的效價(jià)，空心圓圈代表病毒總效價(jià)，實(shí)心圓圈代表活性病毒效價(jià)。在箭頭所指的點(diǎn)上給予ALP。
發(fā)明的最佳實(shí)施方案以下將對(duì)ALP對(duì)病毒性疾病作用情況作描述，在每個(gè)實(shí)驗(yàn)中使用下列的ALP，病毒和類(lèi)胰蛋白酶。ALP所使用的天然ALP，依照日本未經(jīng)審查的專(zhuān)利公開(kāi)62-259591提供的方法制備。病毒所使用的病毒為仙臺(tái)病毒，流感病毒[流感病毒A/Aichi/2/68(H3N2)和鼠耐流感病毒A/Asia/1/57(H2N2)]。在發(fā)育雞卵的羊膜腔中培養(yǎng)的仙臺(tái)病毒和流感病毒被懸浮于不含鈣的磷酸鹽緩沖液中，比率為254HAU/ml(血細(xì)胞凝集作用單位(hemagglutination unit)/毫升)。Clara類(lèi)胰蛋白酶依據(jù)Kido的方法，Clara類(lèi)胰蛋白酶由鼠肺中制得(The Journal of BiologicalChemistry，Vol.267，PP.13573-13579，1992)。
鼠肺用生理鹽水清洗后用剪刀剪碎，在PH5.5條件下勻化，然后離心，所得的上清液用作提取物。該粗提取物通過(guò)一個(gè)CM-52 Cellulose柱(商品名)和一個(gè)CM-52 Sephadex柱(商品名)作離子交換色譜分離，收集活性組分，其活性用Boc-Gln-Ala-Arg-MCA作底物來(lái)測(cè)定。所收集的活性組分通過(guò)一個(gè)精氨酸-Sepharose柱(商品名)作親和色譜分離，該柱對(duì)絲蛋白酶特異性吸附。通過(guò)特異性吸附收集洗脫液中的胰蛋白酶樣酶。最后酶溶液通過(guò)凝膠過(guò)濾柱，收集活性組分，分離純化得Clara類(lèi)胰蛋白酶。ALP抑制病毒蛋白斷裂實(shí)驗(yàn)(實(shí)施例1--仙臺(tái)病毒)實(shí)驗(yàn)依照The Journal of Virology，Vol.66，PP.7211-7216，1992所提供的方法進(jìn)行。
Clara類(lèi)胰蛋白酶50μg/ml和不同濃度的ALP(10nM，100nM和1μM)溶于蒸餾水中，在0℃下，預(yù)溫育5分鐘，然后測(cè)定生長(zhǎng)在LLC-MK2細(xì)胞中用[3H]胺基葡萄糖標(biāo)記的滅活仙臺(tái)病毒的F0蛋白的可斷裂性。圖1顯示用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺電泳所作的分析結(jié)果。
結(jié)果發(fā)現(xiàn)ALP以劑量依賴(lài)的方式抑制Clara類(lèi)胰蛋白酶斷裂F0成亞單位F1、F2，在1μM時(shí)100％抑制。(實(shí)施例2--流感病毒)依據(jù)The Journal of Biological Chemistry，Vol.267，PP.13573-13579，1992和[實(shí)施例1]中提供的方法對(duì)Clara類(lèi)胰蛋白酶斷裂流感病毒(流感病毒A/Aichi/2/68(H3N2))中的HA蛋白成HA1和HA2進(jìn)行研究。
如圖2所示，ALP以劑量依賴(lài)的方式抑制Clara類(lèi)胰蛋白酶斷裂HA成亞單位HA1和HA2。ALP抑制病毒感染實(shí)驗(yàn)(體外)(實(shí)施例3--仙臺(tái)病毒)此項(xiàng)實(shí)驗(yàn)依照專(zhuān)利公開(kāi)號(hào)WO94/00131提供的方法進(jìn)行。Clara類(lèi)胰蛋白酶(20μg/ml)和不同濃度的ALP(0.1，10，100和1000nM)在生理鹽水中0℃預(yù)溫育20分鐘。然后，在37℃下用此反應(yīng)混合液處理生長(zhǎng)在LLC-MK2細(xì)胞中的滅活仙臺(tái)病毒5分鐘。反應(yīng)用抑蛋白酶肽(100μg/ml)終止，通過(guò)此處理所得的活性仙臺(tái)病毒再加到LLC-MK2細(xì)胞中培養(yǎng)15小時(shí)，之后，CIU(細(xì)胞感染單位Cell Infecting Unit)用免疫熒光細(xì)胞計(jì)數(shù)法測(cè)定。病毒感染性由CIU效價(jià)(log10CIU/ml)表達(dá)。(實(shí)施例4--流感病毒流感病毒A/Aichi/2/68(H3N2))實(shí)驗(yàn)處理過(guò)程，CIU測(cè)定及病毒感染性效價(jià)測(cè)定方法同實(shí)施例3，只是用流感病毒(流感病毒A/Aichi/2/68(H3N2))代替仙臺(tái)病毒，用MDCK細(xì)胞代替LLC-MK2細(xì)胞。
圖3顯示了ALP對(duì)仙臺(tái)病毒和流感病毒感染的抑制作用。滅活病毒在用Clara類(lèi)胰蛋白酶處理前的效價(jià)分別為1×104CIU/ml和1.2×104CIU/ml，用Clara類(lèi)胰蛋白酶激活后分別上升至4×106CIU/ml和1.8×106CIU/ml。
以劑量依賴(lài)方式加入ALP(1nM-1μM)，ALP可減弱這兩種病毒的感染性，并抑制Clara類(lèi)胰蛋白酶對(duì)病毒包膜糖蛋白的斷裂作用。100nM-1μM濃度范圍內(nèi)可觀察ALP幾乎100％的抑制病毒感染作用。ALP對(duì)病毒感染之抑制作用的實(shí)驗(yàn)(體內(nèi))(實(shí)施例5--ALP抗流感作用動(dòng)物實(shí)驗(yàn))本實(shí)驗(yàn)依照J(rèn)ournal of Virology，Vol.66，PP.7211-7216，1992中所描述方法進(jìn)行。
具體地說(shuō)，SD老鼠(3周齡，體重120g，日本Charles River公司出產(chǎn))鼻內(nèi)感染1×104斑塊形成單位(plaque-forming unit PFU)的流感病毒(鼠耐流感病毒A/Asia/1/57(H2N2))，在病毒感染后，每只鼠每8小時(shí)鼻內(nèi)給藥ALP 6μg(50μl)共15次，對(duì)照組給50μl生理鹽水。在指定的時(shí)間內(nèi)，每24小時(shí)宰殺三只老鼠，測(cè)定肺勻漿中總病毒和活性病毒效價(jià)。
總的肺部炎癥用肉眼觀察的損害程度來(lái)表達(dá)，肺損害程度分0～4共5檔，分別代表不同程度的肝樣變，也即棕色區(qū)對(duì)肺的總表面積之比。損害程度規(guī)定為，相對(duì)于肺的總表面積，0檔為0％的肝樣變，1檔為1～25％，2檔為26～50％，3檔為51～75％，4檔為76～100％。
結(jié)果見(jiàn)圖4。
感染流感病毒(鼠耐流感病毒A/Asia/1/57(H2N2))并給生理鹽水的老鼠，在第5天病毒效價(jià)增至2000倍，其中至少95％為活性病毒?？捎^察到嚴(yán)重的肺部炎癥，第7天達(dá)到峰值，并持續(xù)到第9天。
相反，對(duì)于那些鼻腔每次給藥ALP 6μg每鼠共15次的老鼠，到第5天僅顯示小的病毒效價(jià)增加，約為10倍。僅相當(dāng)于沒(méi)給ALP鼠的病毒效價(jià)的0.5％。此外，這些略微增加的病毒中的95％仍保持滅活。肺部炎癥在第5天達(dá)到峰值1檔，炎癥情況僅顯示少量的增加。
因此，ALP明顯地抑制了病毒感染的造成的肺損害的擴(kuò)大，證明了其抑制病毒感染發(fā)展的作用。方法和劑量根據(jù)本發(fā)明，用以防治病毒性疾病的單劑量為對(duì)于嬰兒含ALP 0.1μg～500mg，優(yōu)選為1μg～100mg，更優(yōu)選為10μg～10mg；對(duì)成人含ALP 0.5μg～1000mg，優(yōu)選為5μg～500mg，更優(yōu)選為50μg～50mg。藥品溶于電解質(zhì)溶液如水或生理鹽水中，其濃度調(diào)為0.1～500mg/ml，優(yōu)選為0.5～200mg/ml，更優(yōu)選為1～100mg/ml，在病毒感染之前或病毒性疾病發(fā)病之后將其灌入或噴入呼吸道中，或也可采用漱口劑形式。
本發(fā)明中的防治藥劑也可根據(jù)需要加入藥品添加劑如穩(wěn)定劑，防腐劑，等滲劑，緩沖劑或懸浮劑；或加入藥劑如支氣管擴(kuò)張劑，鎮(zhèn)咳劑，抗過(guò)敏劑，退熱鎮(zhèn)痛劑，抗生素，合成抗菌藥物或別的抗病毒藥物。劑型可以是液劑，或供使用前懸浮的粉末劑或氣霧劑，也可裝填在小瓶，安瓶或別種密封容器中做成防腐制劑。
工業(yè)實(shí)用性因此，ALP可顯著地抑制Clara類(lèi)胰蛋白酶對(duì)病毒的激活并抑制病毒在動(dòng)物體內(nèi)的復(fù)制。
因此，包含ALP為活性成分的配方可有效地應(yīng)用于防治病毒性疾病，特別是針對(duì)由Clara類(lèi)胰蛋白酶激活的病毒引發(fā)的病毒性疾病，也即那些感染呼吸道的有包膜糖蛋白的病毒，如流感病毒，副流感病毒，RS病毒，麻疹病毒和流行性腮腺炎病毒。
權(quán)利要求
1.一種含有抗白細(xì)胞蛋白酶作活性成份的Clara類(lèi)胰蛋白酶抑制劑。
2.一種含有抗白細(xì)胞蛋白酶作活性成份的防治病毒性疾病的藥劑。
3.如權(quán)利要求2的防治病毒性疾病的藥劑，其中，病毒是指含有包膜糖蛋白，通過(guò)感染呼吸道進(jìn)行復(fù)制的病毒。
4.如權(quán)利要求2或3的防治病毒性疾病的藥劑，其中，病毒是指由Clara類(lèi)胰蛋白酶激活的病毒。
5.如權(quán)利要求2，3或4的防治病毒性疾病的藥劑，其中，病毒為流感病毒，副流感病毒，RS病毒，麻疹病毒和流行性腮腺炎病毒。
6.一種治療病毒性疾病的方法，其中，病人被給予有醫(yī)療效能的抗白細(xì)胞蛋白酶。
7.如權(quán)利要求6的治療病毒性疾病的方法，其中，病毒是指含有包膜糖蛋白，通過(guò)感染呼吸道進(jìn)行復(fù)制的病毒。
8.如權(quán)利要求6或7的治療病毒性疾病的方法，其中，病毒是指由Clara類(lèi)胰蛋白酶激活的病毒。
9.如權(quán)利要求6，7或8的治療病毒性疾病的方法，其中，病毒為流感病毒，副流感病毒，RS病毒，麻疹病毒和流行性腮腺炎病毒。
10.抗白細(xì)胞蛋白酶用于制備治療病毒性疾病的藥物組合物的應(yīng)用。
11.如權(quán)利要求10的用途，其中，病毒是指含有包膜糖蛋白，通過(guò)感染呼吸道進(jìn)行復(fù)制的病毒。
12.如權(quán)利要求10或11的用途，其中，病毒是指由Clara類(lèi)胰蛋白酶激活的病毒。
13.如權(quán)利要求10，11或12的用途，其中，病毒為流感病毒，副流感病毒，RS病毒，麻疹病毒和流行性腮腺炎病毒。
全文摘要
本發(fā)明是一種防治病毒性疾病的藥劑，其活性成分為抗白細(xì)胞蛋白酶(ALP)。含有ALP作活性成分的配方對(duì)抗病毒性疾病特別有效，尤其是針對(duì)由Clara類(lèi)胰蛋白酶激活的病毒引起的病毒性疾病，也即含有包膜糖蛋白、并通過(guò)感染呼吸道進(jìn)行復(fù)制的病毒，如流感病毒，副流感病毒，RS病毒，麻疹病毒和流行性腮腺炎病毒。
文檔編號(hào)A61K38/57GK1144488SQ9519221
公開(kāi)日1997年3月5日 申請(qǐng)日期1995年3月20日 優(yōu)先權(quán)日1994年3月23日
發(fā)明者木戶(hù)博, 田代真人, 關(guān)戶(hù)祥三郎 申請(qǐng)人:東京田邊制藥株式會(huì)社