專利名稱：苯甲酰胺衍生物，含所述衍生物的組合物及它們的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及新的式I化合物 這里R1，R2，R3，R4和R5其中的一個(gè)表示OH，而其余的符號(hào)表示H；涉及含所述化合物的藥物組合物，和涉及所述化合物作為抗寄生蟲劑、抗細(xì)菌劑、抗真菌劑、抗病毒劑的用途。
現(xiàn)有技術(shù)硝基噻唑化合物PH5576(2-(乙酰氧基)-N-(5-硝基2-噻唑基)苯甲酰胺)是下式I化合物 其中R1＝O-COCH3；R2＝R3＝R4＝R5＝H這一化合物(下面稱之為化合物B-式II)的制備和應(yīng)用公開在US3,950,351以及該申請人公開的其它公開文獻(xiàn)中。
在US3,950,351中，式II化合物B的制備是通過使下式化合物 Hal＝鹵素與下式化合物反應(yīng)制備的 這一反應(yīng)并不適合制備純的式I化合物 其中R1，R2，R3，R4和R5其中的一個(gè)表示OH，而其余的符號(hào)表示H；而且，與現(xiàn)有技術(shù)能夠預(yù)測的相反，即現(xiàn)有技術(shù)預(yù)測酰氧基的存在是化合物具備抗菌，抗寄生蟲活性和效果...所必須的，現(xiàn)在發(fā)現(xiàn)式I化合物 這里R1，R2，R3，R4和R5其中的一個(gè)表示OH，而其余的符號(hào)表示H；雖然其中不含有酰氧基，但還是具有出色的抗寄生蟲、抗細(xì)菌、抗真菌的活性。所說的式I化合物對(duì)于寄生蟲，真菌，細(xì)菌具有基本上立即的作用。也發(fā)現(xiàn)所述化合物具有抗病毒活性。
我們也發(fā)現(xiàn)含所述化合物I的組合物中較好還含有潤濕劑。最優(yōu)選的組合物是其中含潤濕劑和淀粉衍生物的組合物。
申請人所做的試驗(yàn)也表明通過同時(shí)采用本發(fā)明化合物和潤濕劑，所述化合物的作用大大增強(qiáng)，并且采用這樣的混合物可能治療下腹病變例如腸道病變(腹瀉)，胃腸道感染，腸道感染，性傳遞的感染，陰道感染和泌尿生殖感染。
因此，本發(fā)明也涉及可治療下腹感染的組合物，所說的組合物含有★有效量的式I活性成分 ★和潤濕劑所說的組合物優(yōu)選還含有淀粉衍生物。
本發(fā)明概述本發(fā)明涉及新的式I的化合物C 其中R1，R2，R3，R4和R5其中的一個(gè)表示OH，而其余的符號(hào)表示H；優(yōu)選的，R1＝OH。
本發(fā)明也涉及含上述式I化合物，優(yōu)選其中R1＝OH的式I化合物(式III)作為活性劑的藥物組合物。根據(jù)一實(shí)例，組合物含有下式化合物A 其中R1＝OH和R2＝R3＝R4＝R5＝H和下式化合物的混合物作為活性劑 這樣的組合物對(duì)寄生蟲、真菌、細(xì)菌、病毒同時(shí)具有基本立即的作用或?qū)δc道病變具有基本上立即的治療作用和一定程度上具有滯后的作用或治療作用。
這樣的組合物是適合于治療人類病變的或可防止人類的疾病的，這些疾病如寄生蟲感染、細(xì)菌感染、真菌感染、腹瀉和其它腸道病變?nèi)缬刹《疽鸬牟∽儭?br> 在所說的組合物中，式III化合物A的重量含量在0.5和20％之間，優(yōu)選在0.5和10％之間，更優(yōu)選在0.5和5％之間 所說的重量含量是相對(duì)于式III化合物A 與下式化合物B的混合物的重量而言的 本發(fā)明也涉及本發(fā)明化合物的應(yīng)用，特別是涉及本發(fā)明的組合物作為抗寄生蟲劑，抗細(xì)菌劑，抗真菌劑，抗病毒劑的用途。
組合物可以進(jìn)一步含有活性劑如驅(qū)腸蟲劑和抗病毒劑。
組合物也可含有潤濕劑和/或淀粉衍生物和/或賦形劑。
抗下腹病變或感染，優(yōu)選是在腸道或陰道條件下，的口服施用的組合物，優(yōu)選固體組合物，含有★有效量的下式B化合物 ★潤濕劑，并且可能，但優(yōu)選含有★至少一種淀粉衍生物。
后面所述的組合物也可含有其它的活性劑，例如驅(qū)蟲劑如非班太爾(febantel)，吡喹酮，左咪唑，丙硫咪唑，磺唑氨酯，moxidectin，異阿凡曼霉素，米爾倍霉素等。
化合物B的制備和應(yīng)用在US3,950,351，和US4,315,018中公開。
在含有式I化合物C(如化合物A)和/或化合物B的組合物中存在的潤濕劑優(yōu)選為陰離子表面活性劑，并且優(yōu)選選自下述化合物組成的組別糖酯、聚氧乙烯、聚氧丙烯、失水己糖醇衍生物、脂肪鏈烷醇酰胺、脂肪胺氧化物、蔗糖、甘露糖醇、山梨糖醇、卵磷脂、聚乙烯基吡咯烷酮、脂肪酸酯、蔗糖的甘油酯、木糖的甘油酯、聚氧乙烯甘油酯、脂肪酸和脂肪醇聚氧乙烯醚的酯，以及脫水山梨糖醇的聚氧乙烯脂肪酸酯、脫水山梨糖醇的脂肪酸聚氧乙烯酯、甘油酯聚甘油酯、醇聚甘油酯的酯及其混合物。
優(yōu)選的合適的潤濕劑為蔗糖二硬脂酸酯，PVP(聚乙烯基吡咯烷酮)等。
本發(fā)明組合物優(yōu)選含有淀粉衍生物，特別是淀粉的羧基衍生物如羧甲基淀粉，其鈉衍生物或其鹽。
例如相對(duì)于活性劑的重量而言，組合物中含有至多20％重量，優(yōu)選1-10％重量的表面活性劑，和相對(duì)于活性劑的重量含有至多20％重量，優(yōu)選1-10％重量的淀粉衍生物。
本發(fā)明也涉及抗病毒和/或下腹感染的口服施用的蓋侖(galenic)制劑，這些感染如腸道、陰道、泌尿生殖的病變或不適，所說的蓋侖制劑由含有組合物的核組成，組合物含有★有效量的化合物C和/或化合物A和/或化合物B作為活性劑，★潤濕劑，可能但優(yōu)選含有★淀粉衍生物或其鹽，所說在組合物中水的含量少于25％重量，所說的核優(yōu)選采用薄膜涂布，這樣的薄膜是在胃的酸性介質(zhì)中不溶，但在腸介質(zhì)中溶解的。
蓋侖制劑中優(yōu)選的組合物，潤濕劑等是指前面公開關(guān)于本發(fā)明組合物的那些。
本發(fā)明也涉及組合物或蓋侖制劑在治療腹瀉，治療肝臟病變等方面的用途。
本發(fā)明也涉及可治療下腹器官如陰道或泌尿生殖的病變或不適，直腸疾病的軟膏、凝膠、霜?jiǎng)┗蛩▌?。軟膏，?yōu)選為凝膠的形式，含有化合物I和/或化合物B，潤濕劑以及賦形劑。
潤濕劑優(yōu)選是指前面關(guān)于組合物和/或蓋侖制劑所列的那些潤濕劑。
而且，本發(fā)明也涉及含有式I化合物C和/或化合物B，和潤濕劑的抗細(xì)菌組合物。這樣的組合物是抗需氧菌以及厭氧菌活性的，因此具有很寬的活性譜。
因此，本發(fā)明也涉及殺滅或防止細(xì)菌在介質(zhì)中存在或生長的方法。在所說的方法中，用本發(fā)明的抗菌組合物處理細(xì)菌或介質(zhì)，例如通過將組合物噴灑到細(xì)菌上，或通過將載體浸入到介質(zhì)等中進(jìn)行。
本發(fā)明也涉及治療動(dòng)物優(yōu)選人的腹瀉的方法，其中所用的組合物含有★有效量的化合物C和/或化合物B作為活性劑，★潤濕劑，★淀粉衍生物該組合物是口服施用的。
本發(fā)明還涉及食品組合物如食品糊劑或酸乳，含有作為防腐劑的★有效量的式I化合物C(優(yōu)選化合物A)和/或化合物B★可能但優(yōu)選含有潤濕劑，并且可能但優(yōu)選與潤濕劑同時(shí)還含有★淀粉衍生物。
本發(fā)明圖的描述

圖1表示式III式化合物A的UV譜 圖2表示式III化合物A的IR譜，和圖3表示III化合物A的HPLC質(zhì)譜。
對(duì)本發(fā)明的描述純的式I化合物
其中R1，R2，R3，R4和R5其中的一個(gè)表示OH，而其余的符號(hào)表示H，可以由式I化合物制備 其中R1，R2，R3，R4和R5其中的一個(gè)表示酰氧基，而其余的符號(hào)表示H。
將所說的化合物懸浮于鹽酸和水的貧混合物中，然后過濾經(jīng)這樣處理后的化合物并用水洗滌，然后洗后的化合物可能干燥。
制備實(shí)施例化合物A的制備具體的制備實(shí)施例如下所述將根據(jù)US3,950,351公開的方法制備的2g 2-(乙酰氧基)-N-(5-硝基-2-噻唑基)苯甲酰胺(即PH5776)，化合物B，懸浮于20ml 37％鹽酸溶液中，介質(zhì)保持在50℃24小時(shí)并緩慢攪拌。
經(jīng)過所述的處理后，將介質(zhì)過濾得到固體顆粒。用水洗滌所得的顆粒直到PH7并且在50℃爐中干燥。
所得的產(chǎn)物外觀為黃色針狀微晶，其熔點(diǎn)為254℃(熔點(diǎn)是在Mettler FP儀器上根據(jù)毛細(xì)管測定法測定的)。
結(jié)構(gòu)的確定是通過百分(含量)分析，UV譜(見圖1)，IR譜(見圖2)和氣相色譜-質(zhì)譜(見圖3)進(jìn)行的。結(jié)構(gòu)測定的結(jié)果如下所示C10，H7，N3，O4，S1；258計(jì)算值C 46.51％ H 2.71％ N 16.40％ S 12.40％測得值45.98％ 2.63％ 16.71％ 12.67％λmax＝350nm(CD＝0.605).
試驗(yàn)1組合物O的制備本發(fā)明組合物的制備是通過將PH5776和上述制備的化合物混合，所說化合物的重量含量相對(duì)于所說的化合物和PH5776的重量而言為4％。
組合物A1在100ml水中將100g硝噻醋柳胺(PH5776)和10g聚乙烯基吡咯烷酮(潤濕劑)和5g羧甲基淀粉混合，真空干燥所得的混合物。
所述的組合物可隨后用于制備粒劑，小藥囊，片劑或膠囊以適合于頰或口服施用。
組合物B1，C1，D1，E1，F(xiàn)1，G1類似于組合物A1制備組合物，除了采用5g和2g聚乙烯基吡咯烷酮，2g和1g羧甲基淀粉。
下表中給出了組合物中硝噻醋柳胺“N”，聚乙烯基吡咯烷酮“PVP”和羧甲基淀粉“CS”的含量(g)。
組合物H1，I1，J1含有硝噻醋柳胺以及其它活性劑的組合物的制備是通過制備含有PVP和羧甲基淀粉的含水介質(zhì)和向所述的介質(zhì)中加入硝噻醋柳胺和其它的活性劑來制備的。然后干燥介質(zhì)使得含水量低于5％。
組合物A2到J2制備類似于組合物A1-J1的組合物。
組合物A2-J2不同于組合物A1-J1之處僅在于它們含有硝噻醋柳胺(PH5776-化合物B)和下式化合物A的混合物
(在組合物A1-J1中僅僅含有硝噻醋柳胺)下表給出了制備組合物A2-J2時(shí)所采用的化合物A和B的量。
制備蓋侖制劑制劑K1
將500g粉狀硝噻醋柳胺與10g聚乙烯基吡咯烷酮，20g羧甲基淀粉，25g玉米淀粉，5g硬脂酸鎂和50g水混合，然后將得到的混合物制成560mg顆粒(即含500mg活性劑的顆粒)。然后將得到的直徑約為1厘米的粒劑在約50℃干燥。
然后通過噴灑熱的糖溶液將得到的微顆粒進(jìn)行涂布，糖涂層形成了一薄膜。制劑K2將480g硝噻醋柳胺(PH5776)和20g化合物A粉狀混合物與10g聚乙烯基吡咯烷酮，20g羧甲基淀粉，25g玉米淀粉，5g硬脂酸鎂和50g水混合，然后將得到的混合物制成560mg顆粒(即含500mg活性劑的顆粒)。然后將得到的直徑約為1厘米的粒劑在約50℃干燥。
然后通過噴灑熱的糖溶液將得到的微顆粒進(jìn)行涂布，糖涂層形成了一薄膜。
微顆?？梢院幸环N或幾種賦形劑或其它活性劑是顯而易見的，例如微晶纖維素(Avicel@FMC)，甲基纖維素，乙基纖維素，羧甲基纖維素，羥基乙基纖維素，羥丙基纖維素，淀粉等。
同樣薄膜也可含有★可藥用賦形劑如增塑劑(plastifiant)，色素，填充劑，潤濕劑，潤滑劑....或它們的混合物，和★可生成薄膜的組合物，其中包括在胃酸中不溶但在腸中溶解的物質(zhì)(聚合物或非聚合物，例如纖維素乙?；彵蕉姿狨?acetophthalate)，聚乙烯基乙酰基鄰苯二甲酸酯，羥丙基甲基纖維素....)。
試驗(yàn)試驗(yàn)1第I期藥物動(dòng)力學(xué)研究是對(duì)口服了單一500mg劑量組合物O6名志愿者進(jìn)行的。通過高壓液相色譜測量血液中2-(羥基)-N-(5-硝基-2-噻唑基)苯甲酰胺約為3mcg/ml。在治療后的第一個(gè)24小時(shí)內(nèi)這一產(chǎn)物在尿液中未經(jīng)改變排出。在血液和尿液中未發(fā)現(xiàn)(2-乙酰氧基)-N-(5-硝基-2-噻唑基)苯甲酰胺。
II期臨床研究是對(duì)總數(shù)80名病人進(jìn)行的，后期處理中重復(fù)進(jìn)行的糞便檢查和/或陰道涂片表明500mg的組合物A1每天兩次連續(xù)服用3-7天，對(duì)抗下述蟲或菌等是非常有效的陰道毛滴蟲、溶組織內(nèi)阿米巴、脆核雙核變形蟲(Gardia lamblia)、蟯蟲、蛔蟲(Ascaris lumbricoides)、美洲板口線蟲、十二指腸鉤蟲(Ancylostoma duodenale)、毛首鞭蟲、糞類圓線蟲、Taeniasaginata、Taenia soliun、闊節(jié)裂頭絳蟲(Diphylobottrium latum)和短膜殼絳蟲?？赡褪苄粤己茫诏煶讨袃H在約10％病人身上可觀察到少量的上腹疼痛、惡心、嘔吐和腹瀉。在治療前和治療后進(jìn)行的血液化學(xué)和血液學(xué)測試表明其不受組合物的影響。
陰道毛滴蟲的體外研究表明2-(乙酰氧基)-N-(5-硝基-2-噻唑基)苯甲酰胺具有最小抑制濃度0.5-1.25mcg/ml，而2-(羥基)-N-(5-硝基-2-噻唑基)苯甲酰胺在同樣的試驗(yàn)條件下的抑制濃度為1-1.25mcg/ml。這表明了2-(羥基)-N-(5-硝基-2-噻唑基)苯甲酰胺的抗寄生蟲活性相當(dāng)于2-(乙酰氧基)-N-(5-硝基-2-噻唑基)苯甲酰胺。然而，這些研究表明2-(羥基)-N-(5-硝基-2-噻唑基)苯甲酰胺具有基本立即的作用，而2-(乙酰氧基)-N-(5-硝基-2-噻唑基)苯甲酰胺卻不是這樣。
最后體外研究表明組合物抗下述格蘭氏陽性和格蘭氏陰性菌是有效的，需氧菌如金黃色葡萄球菌、大腸埃希氏菌、宋內(nèi)志賀菌、HelicobacterPylori；厭氧菌如脆核擬桿菌、Fusobacterium ulcerans、Veillonellaalcadescens、陰道加德諾菌，酵母真菌的皮真菌如須發(fā)癬菌、頭癬小孢霉、絮狀表皮癬菌和白色念球菌。采用式I化合物 其中R1、R2、R3、R4和R5其中一個(gè)表示OH，而其余的符號(hào)表示H，優(yōu)選采用化合物A，甚至在較小量，即可提高通式I化合物，特別是PH5776，或化合物B的效力是可能的。
試驗(yàn)2和3為了表明本發(fā)明組合物的效果，對(duì)兩組小鼠(均為4-8周齡、18-20g重)進(jìn)行試驗(yàn)，兩組小鼠均以Cryptosporidium parvum感染。
感染的小鼠患上慢性腹瀉。
在治療前，通過糞便檢查很容易確定小鼠是否患有慢性腹瀉。
采用前面公開的硝噻醋柳胺的組合物D1進(jìn)行治療。通過口管飼法給患有慢性腹瀉的小鼠進(jìn)行治療1周，每天接受約0.01g硝噻醋柳胺(即約0.6g/kg小鼠)。
一周治療后，已不大可能通過糞便檢查區(qū)別出哪一組小鼠首先患上腹瀉。
也采用組合物D2治療感染的小鼠。通過口管飼法給所說的小鼠治療1周，每天接受約0.0096g硝噻醋柳胺和約0.0004g式III化合物A。
一周治療結(jié)束之前，已不大可能通過糞便分析確定哪一組小鼠首先患上腹瀉。
試驗(yàn)4和5制備含10g活性劑的含水組合物(100g)。
對(duì)于含有硝噻醋柳胺或硝噻醋柳胺(9.6g)和化合物A的混合物作為活性劑的組合物，所述組合物中還可含有0.5g蔗糖二硬脂酸酯。
可用組合物治療多種寄生蟲、蠕蟲、細(xì)菌和真菌。
組合物的活性在下表中給出
P1＝硝噻醋柳胺＋蔗糖二硬脂酸酯P2＝硝噻醋柳胺＋化合物A＋蔗糖二硬脂酸酯P3＝丙硫咪唑P4＝甲苯咪唑P5＝甲硝噠唑
P1＝硝噻醋柳胺＋蔗糖二硬脂酸酯P2＝硝噻醋柳胺＋化合物A＋蔗糖二硬脂酸酯P3＝丙硫咪唑P4＝甲苯咪唑P5＝甲硝噠唑試驗(yàn)5下面給出測定抗病毒效果和毒性的一般方法。
測定抗病毒效果和毒性的試驗(yàn)室方法A、人類包皮成纖維細(xì)胞的制備在包皮環(huán)切術(shù)后盡可能快得到人類新生兒包皮并置于含有萬古霉素、兩性霉素B、盤尼西林和慶大霉素(以通常的濃度)的最低必需培養(yǎng)基(MEM)中4小時(shí)。然后除去培養(yǎng)基，將包皮切成碎片并重復(fù)洗滌直到不存在紅色的細(xì)胞。隨后在CO2孵育器中于37℃下連續(xù)攪拌下，用0.25％胰蛋白酶使組織受胰蛋白酶作用15分鐘。15分鐘后期，使組織置于燒瓶底部。通過無菌干酪布(cheesecloth)將含有細(xì)胞的上清液傾入到含MEM和10％牛胎兒血清的燒瓶中。在整個(gè)胰蛋白酶作用步驟中都將含培養(yǎng)基的燒瓶放置于冰中。每次加入細(xì)胞后，用含血清的少量MEM洗滌干酪布。每次都向包皮碎片中加入新鮮胰蛋白酶。重復(fù)上述步驟直到?jīng)]有細(xì)胞。然后，將含有培養(yǎng)基的細(xì)胞于1000RPM4℃下離心4分鐘。棄去液體上清液并將細(xì)胞懸浮于少量MEM和10％FBS(牛胎兒血清)。然后將細(xì)胞置于合適數(shù)目的25cm2組織培養(yǎng)燒瓶中。當(dāng)細(xì)胞生長至匯合而需要胰蛋白酶作用時(shí)，將它們逐漸擴(kuò)充到較大燒瓶中。細(xì)胞保存于萬谷霉素和兩性霉素上至第四代。
B.致細(xì)胞病變作用的抑制試驗(yàn)一HSV，HCMV、VZV。
在使用前24小時(shí)，將低傳代次數(shù)的人類包皮成纖維細(xì)胞接種于96孔組織培養(yǎng)平板中，這是以2.5×104細(xì)胞/ml的細(xì)胞濃度在0.1ml最低必需培養(yǎng)基(MEM)中進(jìn)行的，培養(yǎng)基中補(bǔ)充有10％牛胎兒血清(FBS)。然后在CO2孵育器中37℃將細(xì)胞孵育24小時(shí)。孵育后，除去培養(yǎng)基并向所有孔中(除第一排)加入含有2％FBS的100μlMEM。在第一排中，在一式三份孔中加入125μl試驗(yàn)藥物。將培養(yǎng)基單獨(dú)加入細(xì)胞和病毒對(duì)照孔中。然后通過Cetus液體手動(dòng)儀器轉(zhuǎn)移25μl藥物，按1∶5連續(xù)稀釋第一排孔以及其余的孔。在稀釋藥物后，向每孔中加入濃度合適的100μl病毒，除了細(xì)胞對(duì)照孔中是加入100μlMEM。對(duì)于HSV-1和HSV-2試驗(yàn)，可采用的病毒濃度為1000PFU/孔。對(duì)于CMZ和VZV試驗(yàn)，加入的病毒濃度可為2500PFU/孔。然后，對(duì)HSV-1和HSV-2而言，將平板在CO2孵育器中37℃孵育3天，對(duì)VZV而言孵育10天或?qū)MV來說孵育14天。孵育期后，吸出培養(yǎng)基并用0.1％結(jié)晶紫溶液染色30分鐘。然后除去染料并用自來水漂洗平板直到洗去所有過多的染料。使平板干燥24小時(shí)，然后在Skatron Plate Reader于620nm處讀數(shù)。
C.采用半固體覆蓋法(overlay)進(jìn)行的HSV-1和HSV-2的噬斑(plaque)減小試驗(yàn)。
試驗(yàn)前2天，將HFF(人類包皮成纖維細(xì)胞)細(xì)胞置入6孔平板中并在37℃5％CO2和90％濕度下孵育。在試驗(yàn)這一天，藥物是在2×MEM中由所需濃度的2倍構(gòu)成，然后采用2×MEM以1∶5對(duì)6個(gè)濃度的藥物連續(xù)稀釋。起始濃度通常是200μg/nl到0.06μg/ml。所用的病毒在含有10％FBS的MEM中稀釋至所需的濃度以造成每孔中20-30噬斑。從孔中吸去培養(yǎng)基，并向兩孔中各加入0.2ml病毒，同時(shí)將0.2ml培養(yǎng)基加入測量藥物毒性的孔中。然后將平板孵育1小時(shí)同時(shí)每15分鐘振蕩一下。孵育期后，等量的1％瓊脂糖加到等體積的各個(gè)藥物稀釋液中。得到最終藥物濃度開始是100μg/ml，結(jié)束時(shí)是0.03μg/ml和最終的瓊脂糖覆蓋物濃度為0.5％。將2ml體積的藥物瓊脂糖混合物加到各個(gè)孔中并孵育平板3天，之后用1.5％中性紅溶液給細(xì)胞染色。4-6小時(shí)的孵育期結(jié)束后，吸去染料，采用立體顯微鏡放大10×倍后對(duì)噬斑計(jì)數(shù)。
EC50(50％有效濃度)表示抑制病毒的致病變作用50％所需的濃度。
IC50(50％抑制濃度)表示抑制細(xì)胞繁殖50％所需要的濃度。
選擇指數(shù)(S.I.)＝IC50/EC50D.VZV噬斑減少試驗(yàn)-半固體覆蓋法該方法與上述HSV噬斑試驗(yàn)基本相同，只有兩個(gè)區(qū)別1、加入藥物后，孵育盤10天。
2、在第3天和第6天，另外加入1ml覆蓋物與等量2×MEM和1％瓊脂糖。
E、CMV噬斑試驗(yàn)-半固體覆蓋法該方法同樣與上述HSV噬斑試驗(yàn)基本相同，只有少量細(xì)微的差別。用于起始覆蓋物和隨后兩次覆蓋物的瓊脂糖為0.8％而非1％。在第4天和第8天，是與另外1ml覆蓋物一起孵育試驗(yàn)物14天。
F.采用液體培養(yǎng)基覆蓋物的噬斑減少試驗(yàn)采用液體覆蓋物的噬斑減少試驗(yàn)類似于采用瓊脂糖覆蓋物的試驗(yàn)，加入病毒的步驟與常規(guī)的噬斑試驗(yàn)相同。所采用的藥物區(qū)域濃度是含2％FBS的MEM。藥物不是像上述試驗(yàn)?zāi)菢佑?×濃度構(gòu)成，而是由所需的濃度構(gòu)成。對(duì)HSV-1和HSV-2試驗(yàn)來說，將由Baxter Health Care Corporaton得到的抗體制劑按1∶500稀釋并加入到藥物在其中稀釋的培養(yǎng)基中去。對(duì)CMV和VZV，在覆蓋物中不采用抗體。對(duì)CMV試驗(yàn)，在第5天加入不含新藥的另外的培養(yǎng)基并一共孵育10天。對(duì)VZV，在第5天加入另外的培養(yǎng)基并一共孵育10天。對(duì)所有試驗(yàn)來說在孵育末期，向各孔中加入2ml1∶10的中性材料稀釋液并孵育6小時(shí)。然后吸去液體并采用立體顯微鏡對(duì)噬斑計(jì)數(shù)。
G.EBV的篩選和確認(rèn)試驗(yàn)1.病毒有兩類感染的EBV原型。一類可通過P3HR-1細(xì)胞系上清液中衍生出的病毒來說明。這類細(xì)胞系產(chǎn)生非轉(zhuǎn)移病毒，它在B細(xì)胞系最初感染或重復(fù)感染之后引起早期抗原(early antigen)(EA)的產(chǎn)生。另一原型通過B-95-8病毒說明。這種病毒使索血液淋巴細(xì)胞不會(huì)死亡并導(dǎo)致狨猴腫瘤。然而，即使在帶有EBV基因組模板的細(xì)胞系中也不造成一時(shí)的產(chǎn)出性感染(abortiveproductive infection)。我們試驗(yàn)中采用的病毒是P3HR-1。
2.細(xì)胞系Ramos是由Burkitt′s淋巴腫瘤衍生的但不含可檢測到的EBV基因組模板的異常的B細(xì)胞系，并且是EBNA陰性的，用P3HR-1通過Ramos的體外感染得到Ramos/AW并且含有常駐的EBV基因組模板/細(xì)胞。Raji是含有60EBV基因組/細(xì)胞的Burkitt′s淋巴瘤細(xì)胞系并且是用于篩選抗EBV EA表達(dá)的抗病毒活性的首選細(xì)胞。Daudi是含有152EBV基因組模板/細(xì)胞的低水平發(fā)生器(producer)。在0.25％-0.5％細(xì)胞中它自發(fā)地表達(dá)EBV EA。在隨后的研究中可用來證明活性。這些細(xì)胞系通過EBV表達(dá)EA(D)，EA(R)、和VCA而對(duì)重復(fù)感染反應(yīng)。將所有細(xì)胞系維持在補(bǔ)充有10％FCS、L-谷氨酰胺和100μg/ml慶大霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基中。每周兩次給培養(yǎng)物補(bǔ)充營養(yǎng)并調(diào)整細(xì)胞濃度至3×105/ml。將細(xì)胞保持在37℃用5％CO2濕化的條件下。
3.單克隆抗體的免疫熒光試驗(yàn)用EBV的P3HR-1菌株使細(xì)胞感染，在吸收(37℃下45分鐘)和洗滌了細(xì)胞培養(yǎng)物后加入試驗(yàn)藥物。在完全培養(yǎng)基中孵育培養(yǎng)物2天以使病毒基團(tuán)表達(dá)。在孵育的48小時(shí)后，計(jì)數(shù)各個(gè)樣品的細(xì)胞數(shù)目并制備涂片。然后向孵育的細(xì)胞中加入對(duì)不同EA組分和VCA的單克隆抗體并洗滌。隨后熒光素結(jié)合兔抗-鼠Ig抗體；給涂片上熒光陽性的細(xì)胞計(jì)數(shù)。計(jì)算對(duì)EA或VCA而言培養(yǎng)物中細(xì)胞陽性的總數(shù)并比較。
H.細(xì)胞增生試驗(yàn)-毒性試驗(yàn)前24小時(shí)，以含10％FBS的MEM中每孔2.5×104細(xì)胞的濃度在一個(gè)6-孔盤中接種。在試驗(yàn)?zāi)且惶?，在含?0％FBS的MEM中系列地稀釋藥物，藥物范圍從100μg/ml至0.03μg/ml，以1∶5的增量進(jìn)行。對(duì)于必須在DMSO中增溶的藥物來說，向?qū)φ湛字屑尤牒?0％DMSO的MEM。然后從孔中吸去培養(yǎng)基并再向各孔中加入2ml的各個(gè)藥物濃度。然后在CO2孵育器于37℃孵育72小時(shí)。結(jié)束時(shí)，除去培養(yǎng)基-藥物溶液并洗滌細(xì)胞。向各孔中加入1ml 0.25％的胰蛋白酶并孵育直到盤中開始出現(xiàn)細(xì)胞。然后用吸管劇烈地上下吸動(dòng)細(xì)胞-培養(yǎng)基混合物以分散懸浮液，將0.2ml混合物加到9.8ml Isoton III中并采用Coulter計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)。各個(gè)樣品為三份重復(fù)的孔，每份計(jì)數(shù)三次。
I.細(xì)胞毒性的MTT試驗(yàn)試驗(yàn)前24小時(shí)，以每孔2.5×104個(gè)細(xì)胞的濃度將HFF細(xì)胞置于96孔盤中。24小時(shí)后，吸去培養(yǎng)基并向第一排孔中加入125微升藥物，然后按照與CPE試驗(yàn)類似的方式采用自動(dòng)Cetus liquid Handling系統(tǒng)按1∶5系列地稀釋。然后使盤在CO2孵育器中于37℃孵育7天。這時(shí)向各孔中加入50微升濃度1μg/ml的MTT于Dulbecco′s磷酸鹽緩沖鹽溶液中的溶液。然后再將盤孵育4小時(shí)。這時(shí)，除去培養(yǎng)基并以100μl0.04N鹽酸的異丙醇溶液替換。輕微振蕩后，在盤讀數(shù)器(plate reader)上于550nm處讀數(shù)。
J、中性紅吸收試驗(yàn)-毒性得到平板細(xì)胞的步驟和藥物的加入與MTT試驗(yàn)相同。
加入藥物后，在CO2孵育器中于37℃將平板孵育7天。此時(shí)吸去培養(yǎng)基/藥物并加入200μl/孔0.01％中性紅的DPBS溶液。將其在CO2孵育器中孵育1小時(shí)。吸去染料并采用Nunc平板清洗儀洗滌。除去DPBS洗液后，加入200μg/孔的50％ETOH(乙醇)/1％冰乙酸(于H2O中)。旋轉(zhuǎn)平板15分鐘并且在平板讀數(shù)器上于550nm記錄光密度。
試驗(yàn)5a在培養(yǎng)物中HBV復(fù)制的抗病毒活性(HepatitesB)在2.2.15細(xì)胞培養(yǎng)物中測試抗-HBV化合物的步驟簡單概述如下(Korba和Milman，1991，Antiviral Res。217217)。
★將慢性產(chǎn)生HBV的人類肝臟細(xì)胞(Acs等，1987，PNAS844641)在24孔組織培養(yǎng)平板中接種并生長融合。
★然后連續(xù)9天每天加入試驗(yàn)化合物。在治療第0、3、6和9天收集培養(yǎng)基(在治療期間每天變化)并保存以待細(xì)胞外(病毒粒子)HBV DNA分析。
★在處理第9天后，將已處理的細(xì)胞溶化24小時(shí)以進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)HBV基因型分析。
★然后針對(duì)整體水平HBV DNA(細(xì)胞外和細(xì)胞內(nèi)DNA)和HBV復(fù)制相對(duì)率(細(xì)胞內(nèi)DNA)以定性和定量方式來分析HBV DNA。
在2.2.15細(xì)胞培養(yǎng)物中化合物毒性的測定步驟簡單概述如下(Korba和Gerin，已提交公開)★在96孔平底組織培養(yǎng)平板上使2.2.15細(xì)胞生長融合并如上述用化合物處理(在0.2ml培養(yǎng)基/孔)。每個(gè)化合物測定4種濃度，各自在3份培養(yǎng)物中進(jìn)行，各自相差3-10倍。
★在各96孔平板中保存未處理的對(duì)照培養(yǎng)物。在各96孔平板上，不含細(xì)胞的孔用于光散射的校正。
★通過對(duì)中性紅染料吸收的抑制測定毒性，測定是在處理9天后24小時(shí)，通過測定510nm處相對(duì)于未處理細(xì)胞的吸收度進(jìn)行的(Finter等，1969，J.Med.Chem.5419)。
化合物A的抗病毒活性是與Zalcitabine相比較的。
我們發(fā)現(xiàn)當(dāng)采用化合物A時(shí)，具有50％抑制病毒致病變作用的有效濃度(EC50)為1.8±0.1mg/ml(μg/l)，而細(xì)胞毒性濃度(抑制50％細(xì)胞增生的濃度)大于1000μg/ml。因此化合物A的選擇指數(shù)SI＞1000/1.8，即指數(shù)大于500。
對(duì)Zalcitabine，試驗(yàn)結(jié)果如下EC501.8±0.2μg/mlCC50261±24μg/ml即選擇指數(shù)SI為261/1.8即約145，正如可從試驗(yàn)中觀察到的，化合物A的毒性低于Zalcitabine，這樣就可以獲得抗HBV復(fù)制的較合適的治療作用同時(shí)具有較小的副作用。
試驗(yàn)5b抗VZV的抗病毒活性硝噻醋柳胺(96％)和化合物A(4％)的混合物也可用于測定其抗VaricellaZoster Virus(標(biāo)準(zhǔn)的試驗(yàn)室菌株)的活性。
發(fā)現(xiàn)對(duì)所說的化合物抗Varicella Zoster Virus的EC50為4μg/ml和CC50為34μg/ml，即S.I.指數(shù)約為8.5。
考慮到混合物的低毒性和有效性，這一混合物特別適合于治療對(duì)抗病毒劑如無環(huán)鳥苷產(chǎn)生耐藥性的Varicella Zoster Virus。
本發(fā)明化合物或組合物可口服，例如以片劑形式。
本發(fā)明組合物，特別是含有PH5776和/或其余的抗病毒劑的組合物，對(duì)皰疹病毒具有廣譜作用，這些病毒如1型皰疹單顯性(SIMPLEX)病毒(HSV-1，HSV抗無環(huán)鳥苷)；2型皰疹單顯性病毒(HSV-S，HSV-2抗無環(huán)鳥苷)；人類巨細(xì)胞病毒(HCMV、HCMV抗ganciclovir)；
varicella zoster病毒(VZV、VZV抗無環(huán)鳥苷)；EPSTEIN-BARR BIRUS S(EBV)鼠巨細(xì)胞病毒(MCMV)。
組合物中可含有已知的如適合于制成口服形式的賦形劑。
組合物優(yōu)選含有潤濕劑和可能含有淀粉衍生物。
權(quán)利要求
1.下式化合物 其中R1，R2，R3，R4和R5其中的一個(gè)表示OH，而其余的符號(hào)表示H。
2.含有下式化合物作為活性劑的藥物組合物 其中R1，R2，R3，R4和R5其中的一個(gè)表示OH，而其余的符號(hào)表示H。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的藥物組合物，它含有作為活性劑的下式化合物A 其中R1＝OH和R2＝R3＝R4＝R5＝H和下式化合物B的混合物
4.口服施用的權(quán)利要求2或3的藥物組合物，所說的組合物還含有潤濕劑。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的藥物組合物，其中至少一種潤濕劑選自陰離子表面活性劑。
6.根據(jù)權(quán)利要求4的藥物組合物，其中的潤濕劑選自糖酯、聚氧乙烯、聚氧丙烯、失水己糖醇衍生物、脂肪鏈烷醇酰胺，脂肪胺氧化物、蔗糖、甘露糖醇、山梨糖醇、卵磷脂、聚乙烯基吡咯烷酮、脂肪酸酯、蔗糖的甘油酯、木糖的甘油酯、聚氧乙烯甘油酯、脂肪酸和脂肪醇聚氧乙烯醚的酯，以及脫水山梨糖醇的聚氧乙烯脂肪酸酯、脫水山梨糖醇的脂肪酸聚氧乙烯酯、甘油酯聚甘油酯、醇聚甘油酯的酯及其混合物。
7.前面任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的藥物組合物，其中含有淀粉衍生物。
8.根據(jù)權(quán)利要求7的藥物組合物，其中含有羧甲基淀粉或其鹽。
9.根據(jù)權(quán)利要求4的組合物，其中含有相對(duì)于活性劑重量而言至多20％重量的表面活性劑，和相對(duì)于活性劑或多種活性劑重量而言至多20％重量的淀粉衍生物。
10.口服施用的蓋侖制劑，包括含有下述組合物的核，所述組合物含有★有效量的式I化合物 其中R1，R2，R3，R4和R5其中的一個(gè)表示OH，而其余的符號(hào)表示H，它可能與下式化合物B混合 ★潤濕劑，和★淀粉衍生物，所說組合物的含水量少于25％重量。
11.根據(jù)權(quán)利要求10的制劑，其中含有羧甲基淀粉或其鹽。
12.治療下腹感染的軟膏，其中含有★有效量的式I化合物 其中R1，R2，R3，R4和R5其中的一個(gè)表示OH，而其余的符號(hào)表示H，它可能與下式化合物B混合 和★潤濕劑。
13.根據(jù)權(quán)利要求12的軟膏，其中含有淀粉衍生物。
14.式I化合物作為抗寄生蟲劑的用途， 其中R1，R2，R3，R4和R5其中的一個(gè)表示OH，而其余的符號(hào)表示H。
15下式化合物A 其中R1＝OH和R2＝R3＝R4＝R5＝H和下式化合物B的混合物作為抗寄生蟲劑的用途。
16.式I化合物作為抗細(xì)菌的用途， 其中R1，R2，R3，R4和R5其中的一個(gè)表示OH，而其余的符號(hào)表示H。
17.下式化合物A 其中R1＝OH和R2＝R3＝R4＝R5＝H和下式化合物B的混合物作為抗細(xì)菌的用途
18.式I化合物作為抗真菌的用途， 其中R1，R2，R3，R4和R5其中的一個(gè)表示OH，而其余的符號(hào)表示H。
19.下式化合物A 其中R1＝OH和R2＝R3＝R4＝R5＝H和下式混合物B的混合物作為抗真菌劑的用途
20.下式化合物作為抗病毒劑的用途， 其中R1，R2，R3，R4和R5其中的一個(gè)表示OH，而其余的符號(hào)表示H。
21.下式化合物作為抗病毒劑的用途， 其中R1，R2，R3，R4和R5其中的一個(gè)表示OH，而其余的符號(hào)表示H。
22.下式化合物A 其中R1＝OH和R2＝R3＝R4＝R5＝H和下式化合物的混合物作為抗毒劑的用途
23.食物組合物，其中含有作為防腐劑的★有效量的式I化合物 其中R1，R2，R3，R4和R5其中的一個(gè)表示OH，而其余的符號(hào)表示H，★可能含有下式B化合物 ★可能含有淀粉衍生物
全文摘要
本發(fā)明涉及新的式(I)化合物，其中R1、R2、R3、R4和R5中的一個(gè)表示OH，其余符號(hào)表示H；涉及含所述化合物的組合物，以及涉及所說化合物作為抗寄生蟲劑、抗細(xì)菌劑、抗真菌劑和抗病毒劑的用途。
文檔編號(hào)A61K31/425GK1145621SQ95192524
公開日1997年3月19日 申請日期1995年4月11日 優(yōu)先權(quán)日1994年4月13日
發(fā)明者讓-弗蘭克伊斯·羅西格諾爾 申請人:讓-弗蘭克伊斯·羅西格諾爾