專利名稱：菠蘿蛋白酶的醫(yī)學(xué)用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及菠蘿蛋白酶在治療由細(xì)胞內(nèi)信號介導(dǎo)的各種疾病和癥狀中的應(yīng)用。具體地說本發(fā)明涉及菠蘿蛋白酶在治療諸如癌癥和自身免疫疾病的疾病和癥狀及做為免疫抑制劑中的應(yīng)用。另外，菠蘿蛋白酶可用作疫苗佐劑。
菠蘿蛋白酶是在植物風(fēng)梨科組織中發(fā)現(xiàn)的蛋白水解酶的統(tǒng)稱。菠蘿蛋白酶是來自菠蘿(Ananas comosus)莖的各成份的混合物。它含有至少兩種蛋白水解酶，但也含非蛋白水解酶，包括酸性磷酸酶和過氧化物酶；它也可能含有淀粉酶和纖維素酶活性。另外，也存在各種其它成份。
菠蘿蛋白酶以前曾用于治療包括炎癥的各類癥狀，特別是它曾用于治療腹瀉。菠蘿蛋白酶在治療感染性腹瀉中的用途在WO-A-9301800中有描述，其中認(rèn)為菠蘿蛋白酶經(jīng)過以蛋白水解破壞病原體的腸道受體而發(fā)揮作用，在WO-A-8801506中講授了菠蘿蛋白酶將病原體和腸道受體分開。
現(xiàn)在已發(fā)現(xiàn)，除了感染性腹瀉外，菠蘿蛋白酶也在非感染性腹瀉的治療中有用，當(dāng)然，這不能以WO-A-9301800中建議的作用機(jī)制解釋。
Taussig等，Planta Medica，1985，538-539和Maurer等，Planta Medioa，1988，377-381都建議菠蘿蛋白酶可能在抑制腫瘤生長中有用。Taussig等把這歸功于具有過氧化物酶活性的組份或菠蘿蛋白酶成份，但沒有提供機(jī)制的其它解釋。然而，Maurer等講授了菠蘿蛋白酶能誘導(dǎo)白血病細(xì)胞系的分化且這一能力來自于蛋白水解活性。菠蘿蛋白酶的作用機(jī)制也不清楚。在治療諸如炎癥的其它癥狀中菠蘿蛋白酶發(fā)揮作用的作用機(jī)制也尚無滿意的解釋。
在WO-A-9400147中描述的各個實(shí)驗(yàn)證實(shí)蛋白水解酶、特別是菠蘿蛋白酶能抑制分泌。該申請也公開了菠蘿蛋白酶能減少毒素結(jié)合活性并能抑制諸如熱不穩(wěn)定性毒素(LT)和霍亂毒素(CT)的毒素及諸如熱穩(wěn)定性毒素(ST)的毒素的分泌效應(yīng)。這與ST具有不同于LT和CT的作用方式這一事實(shí)無關(guān)。這些觀察結(jié)果可用菠蘿蛋白酶混合物的一種成分(莖菠蘿蛋白酶)似乎能調(diào)節(jié)環(huán)核苷酸途徑這一事實(shí)來解釋。另外，也證實(shí)菠蘿蛋白酶抑制由鈣(Ca2+)依賴性途徑引起的分泌。
LT和ST都由大腸桿菌產(chǎn)腸毒素菌株(ETEC)產(chǎn)生。一些ETEC菌株也產(chǎn)生稱為定居因子抗原的菌毛粘附素。這些粘附素促進(jìn)ETEC菌珠附著到小腸粘膜上，從而有利于腸毒素的定居和傳遞。腹瀉疾病最終取決于腸毒素的生產(chǎn)和有效傳遞。
腸毒素經(jīng)過激活信號途徑刺激細(xì)胞的分泌。細(xì)胞內(nèi)的內(nèi)部信號經(jīng)過“第二信使”實(shí)現(xiàn)。
人體的每一個細(xì)胞常受到其環(huán)境中各種信號的攻擊。正常細(xì)胞接受并處理這些信號，可能促進(jìn)生長，分化或死亡或控制其它的細(xì)胞功能，如腸上皮細(xì)胞液體的分泌。因此，信號是了解細(xì)胞中最終決定其命運(yùn)的過程的關(guān)鍵。通過細(xì)胞表面具有不同生化活性的受體接受信號并將該信息進(jìn)一步傳遞給效應(yīng)器蛋白質(zhì)。接著，這些蛋白質(zhì)加工信號并將其轉(zhuǎn)導(dǎo)給細(xì)胞內(nèi)的其它分子。發(fā)生在細(xì)胞與生長因子相互作用之后和細(xì)胞反應(yīng)發(fā)生前的一系列生化事件稱為信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。
大多數(shù)細(xì)胞信號經(jīng)過GTP-結(jié)合蛋白質(zhì)、各種蛋白質(zhì)激酶、蛋白磷酸酶、脂修飾酶和諸如Ca2+和環(huán)腺苷酸單磷酸(環(huán)AMP或cAMP)的第二信使傳遞。經(jīng)過轉(zhuǎn)錄起動基因表達(dá)和隨后細(xì)胞蛋白質(zhì)翻譯的因子在核中最終解釋指令。
已知至少有3種信號途徑對于分泌是重要的。一條途徑使用了第二信使，環(huán)AMP。另一途徑使用第二信使環(huán)烏苷單磷酸(環(huán)GMP或cGMP)。這二個信使稱為環(huán)核苷酸。第三信號途徑(Ca2+依賴途徑)需要Ca2+作為第二信使。WO-A-9400147講授了莖菠蘿蛋白酶能經(jīng)過干擾環(huán)核苷酸和Ca2+依賴性途徑從而影響分泌而阻止腹瀉。
本發(fā)明人目前已探索了其它細(xì)胞內(nèi)信號途徑，并驚奇地發(fā)現(xiàn)除了其對環(huán)核苷酸途徑的作用之外，菠蘿蛋白酶似乎也作用于其它胞內(nèi)信號傳遞途徑，特別是那些由磷酸肌醇、蛋白激酶和/或蛋白磷酸酶所調(diào)節(jié)的那些途徑。
因此，在本發(fā)明的第一個方面，提供了菠蘿蛋白酶在制備用于依賴于肌醇磷酸、蛋白激酶和/或蛋白磷酸酶的作用調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)信號途徑的試劑中的應(yīng)用。
在本發(fā)明說明書中，肌醇磷酸指任意磷酸化的肌醇分子，不管磷酸化的程度或磷酸基團(tuán)的位置如何。肌醇磷酸的例子包括磷脂酰-4，5-雙磷酸(PIP2)和肌醇-1，4，5-三磷酸(IP3)。蛋白激酶和蛋白磷酸酶指任何能經(jīng)過加上或去掉磷酸分子將蛋白質(zhì)的非活性形式轉(zhuǎn)變成活性形式的分子。
已發(fā)現(xiàn)菠蘿蛋白酶對于控制導(dǎo)致諸如后葉加壓素和凝血酶的非聯(lián)合細(xì)胞外信號分子且特別是影響細(xì)胞生長和增生的信號分子(如白細(xì)胞介素和其它生長因子)之生產(chǎn)的肌醇磷酸，蛋白激酶或蛋白質(zhì)磷酸酶依賴型信號途徑特別有用。
為了生長或增生，正常細(xì)胞需要由鄰近和身體其它部分的其它細(xì)胞產(chǎn)生的生長因子提供的信號。這與癌細(xì)胞的自主行為相反，它由自己本身內(nèi)部產(chǎn)生的信號控制。涉及細(xì)胞生長控制的各種蛋白質(zhì)的功能可經(jīng)過改變蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)或異常大量地產(chǎn)生正常蛋白質(zhì)的突變束加強(qiáng)或修飾。因此，在癌細(xì)胞中，接受和處理信號的細(xì)胞器產(chǎn)生缺陷，細(xì)胞不能加工這些信號并作出合適的反應(yīng)。具有缺陷型生長抑制信號的細(xì)胞，如那些由缺陷型腫瘤抑制基因產(chǎn)生的細(xì)胞不能平衡生長刺激信號。由于該缺陷，信號級聯(lián)中的生長抑制信號未被傳遞，細(xì)胞不能控制其本身的增生。當(dāng)腫瘤抑制基因失活時產(chǎn)生癌。同樣，由于刺激信號級聯(lián)的缺陷受到過度刺激的細(xì)胞表現(xiàn)出過度增生。癌基因是產(chǎn)生功能改變的蛋白質(zhì)的基因，其活化強(qiáng)烈地、持續(xù)地促進(jìn)細(xì)胞生長。癌基因破壞精細(xì)平衡的細(xì)胞增生的分子控制，在該程度下接著發(fā)生惡性生長。
已證實(shí)諸如v-src和相關(guān)v-abl蛋白質(zhì)的蛋白酪氨酸激酶是實(shí)驗(yàn)和人癌癥中最常涉及的蛋白質(zhì)之一。c-src是在正常細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的激酶并受其它激酶的調(diào)節(jié)。發(fā)現(xiàn)在癌細(xì)胞中v-src失去這種調(diào)節(jié)。由于在c-src和v-src蛋白質(zhì)之間一些氨基酸的差異，v-src激酶具有永久性高活性。該突變型蛋白質(zhì)酪氨酸激酶的劇烈催化活性對細(xì)胞生長的控制具有有害影響。只有受到生長因子的刺激含c-src的正常細(xì)胞才會生長；含v-src的癌細(xì)胞顯示出不同于外部提供的生長因子獲得性獨(dú)立。同時，可能不再對外部生長抑制信號作出反應(yīng)。因此，產(chǎn)生癌癥并形成腫瘤。
蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸化級聯(lián)(或激酶級聯(lián))在通過信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的調(diào)節(jié)事件中起著巨大的作用。許多生長因子受體具有酪氫酸激酶活性，當(dāng)被激活時，在酪氫酸殘基上觸發(fā)多個細(xì)胞蛋白質(zhì)的磷酸化。這一磷酸化過程的結(jié)果引起靶蛋白質(zhì)獲得或失去功能。p21c-ras在介導(dǎo)從受體酪氨酸激酶接受的促分裂和分化信號中發(fā)揮著關(guān)鍵作用(Wood等，cell，68，1041-1050，1992；Thomas等，cell，68，1031-1040，1992)，該作用激活一些激酶，包括蛋白激酶C(PKC)成員，Raf，促分裂原活化蛋白質(zhì)(MAP)和S6激酶家族(Cantley等，Cell，64，281-302，1991)。這些激酶可從多個膜受體上整合信號。
現(xiàn)在認(rèn)識到，在涉及將受體起動信號轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)核的信號途徑中的一個關(guān)鍵成員是促分裂原活化蛋白質(zhì)激酶(MAPK)的家族。MAPK是絲氨酸/蘇氨酸激酶，它被細(xì)胞中的各種生長因子和腫瘤誘發(fā)物激活。進(jìn)行過充分研究的這些激酶是P42MAPK和P44MAPK(也分別稱為ERK2和ERK1，pp42mapk/erk2和pp44mapk/erk1/mpk，也稱為微管相關(guān)蛋白激酶；髓鞘堿性蛋白(MBP)激酶；和RSKI和II)MAP激酶的底物包括pp90和70s rsk激酶和一些轉(zhuǎn)錄因子，主要是Jun(Pulverer等，Nature，353，670-674，1991)，Myc和p62TCF。影響轉(zhuǎn)錄活性的蛋白質(zhì)是在癌癥處理中最廣泛涉及的。
MAP激酶的激活機(jī)制非常復(fù)雜。MAPK在靜止細(xì)胞中以去磷酸化形式存在且當(dāng)酪氨酸和蘇氨酸殘基磷酸化時被活化(Boulton等，Cell，65，663-675，1991)。在體外，如果任一殘基去磷酸化，這種激活幾乎完全逆轉(zhuǎn)(Anderson等，Nature，343，651-653，1990)。最近報道PAC1是抑制MAP-激酶調(diào)節(jié)的報告基因表達(dá)的MAP激酶磷酸酶(Ward等，Nature，367651-653(1994))。在MAP激酶中酪氨酰和蘇氨酰調(diào)節(jié)位點(diǎn)的磷酸化受雙重特異性MAP激酶激酶(MKK或MEK)的介導(dǎo)。MEK又通過被包括原癌基因產(chǎn)物Raf(Anderson等，Biochem.J.，277，573-576，1991)的MAP激酶激酶激酶磷酸化而受到調(diào)節(jié)，且MEKK又受蛋白激酶C(PKC)的調(diào)節(jié)。
現(xiàn)在本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)菠蘿蛋白酶能干擾對生長較重要的信號傳遞途徑，特別是導(dǎo)致諸如IL-2，血小板產(chǎn)生的生長因子(PDGF)和胰島素樣生長因子(IGF)的生長因子之生產(chǎn)的信號傳遞途徑。
T-淋巴細(xì)胞用作證實(shí)細(xì)胞生長促進(jìn)機(jī)制作用模式的細(xì)胞模型。T-淋巴細(xì)胞的生長通過生長因子產(chǎn)生，受體作用，細(xì)胞質(zhì)信號加工和核內(nèi)基因反應(yīng)調(diào)節(jié)。T-淋巴細(xì)胞是常用的測量增生的模型，因?yàn)樵摷?xì)胞易于發(fā)病且白細(xì)胞介素-2(IL-2)的作用已充分證實(shí)，IL-2是增生和生長所需的T-細(xì)胞生長因子。
事實(shí)上，T細(xì)胞和其它類型的細(xì)胞需要刺激以啟動為增生所必需的一系列事件。免疫系統(tǒng)含有億萬個白血細(xì)胞或淋巴細(xì)胞，它分成2類；B淋巴細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞。B細(xì)胞在保護(hù)宿主抵抗細(xì)胞外病原體上發(fā)揮作用，T細(xì)胞保護(hù)宿主抵抗細(xì)胞內(nèi)病原體。B細(xì)胞和T細(xì)胞分別使用B-細(xì)胞受體(BCR)和T-細(xì)胞受體(TCR)識別不同抗原的不同形式。
T-細(xì)胞激活是一個需要蛋白質(zhì)酪氨酸激酶活性的復(fù)雜過程，它導(dǎo)致細(xì)胞生長和分化。激活需要抗原被TCR識別及T細(xì)胞表面的其它分子與存在抗原的細(xì)胞相互作用。當(dāng)給T細(xì)胞提供合適的抗原和次級協(xié)同刺激信號時，T細(xì)胞以兩種主要的方式發(fā)生反應(yīng)。一種是變大并分裂，從而增加與抗原反應(yīng)的細(xì)胞數(shù)。另一種是分泌淋巴因子或細(xì)胞因子，蛋白質(zhì)，其直接抑制病原體或使其它細(xì)胞補(bǔ)充進(jìn)來參加免疫反應(yīng)。細(xì)胞因子白細(xì)胞介素2(IL-2)是T細(xì)胞生長因子，它在調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)中發(fā)揮關(guān)鍵性作用。
靜止T-細(xì)胞不能與IL-2正常發(fā)生反應(yīng)，因?yàn)檫@些細(xì)胞不能在其細(xì)胞表面表達(dá)可檢測的高親和力的IL-2受體?？乖碳な钦T導(dǎo)高親和力IL-2受體表達(dá)所必需的，從而引起IL-2的反應(yīng)性。因此，由T細(xì)胞抗原受體(TCR)、協(xié)同刺激信號刺激提供的起始激活信號通過誘導(dǎo)IL-2生產(chǎn)和IL-2受體表達(dá)起動T細(xì)胞激活。隨后的T細(xì)胞增生由IL-2與其IL-2受體的相互作用起動。如果T-細(xì)胞僅通過TCR接受信號，T細(xì)胞會變得無活力或可能死亡(稱為細(xì)胞程序死亡)。如果T-細(xì)胞僅接受協(xié)同刺激信號，則T細(xì)胞保持靜止(不發(fā)生反應(yīng))。
上面所有的事件需要酪氨酸磷酸化，因?yàn)榈鞍踪|(zhì)酪氨酸激酶抑制劑可抑制大多數(shù)(如果不是全部)與TCR刺激相聯(lián)系的隨后事件(Mustelin等，Science，247，1584-1587，1990；June等.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，87，7722-7726，1990)。蛋白質(zhì)酪氨酸激酶活性的TCR-介導(dǎo)的誘導(dǎo)導(dǎo)致包括TCR zeta鏈(Baniyash等，J.Biol.Chem.，263，18225-18230，1988)，磷酸脂酶c g1(PLCg1)Weiss等，Proc，Natl.Acad，SciUSA，88，5484-5488，1991)，cD 5(Davies等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89，6368-6372，1992)，原癌基因vav(Bustelo and Barbacid，Science，256，1196-1199，1992)，含續(xù)酪肽的蛋白質(zhì)(VCP)，埃茲蛋白(Egerton等，EMBO J.，11，3533-3540和J.Immunol.，149，1847-1852，1992)，2AP-70(chan等，cell，71，649-662，1992)和MAPK(Nel等，J.Immunol.，144，2683-2689，1990)的許多細(xì)胞蛋白質(zhì)的酪氨酸磷酸化。
PLC g1酪氨酸磷酸化導(dǎo)致其催化激活，導(dǎo)致磷脂酰肌醇(PI)途徑中第二信使產(chǎn)生。PLC裂解磷脂酰肌醇4，5-雙磷酸(PIP2)，導(dǎo)致形成肌醇1，4，5-三磷酸(IP3)和1，2-二脂酰甘油(DAG)。這些分子接著作為細(xì)胞內(nèi)第二信使發(fā)揮功能以分別誘導(dǎo)Ca2+增加和PKC活化。PKC活化后，原癌基因Ras被激活，Raf-1激酶活性增強(qiáng)且MAPK變成磷酸化。MAPK活化引起原癌基因c-fos與c-jun形成二聚體以形成轉(zhuǎn)錄復(fù)合物AP-1.AP-1復(fù)合物與DNA上的成份結(jié)合以啟動IL-2的轉(zhuǎn)錄。
圖1概括了導(dǎo)致IL-2基因轉(zhuǎn)錄和IL-2生產(chǎn)的PI途徑中與TCR活化相關(guān)的一些事件。
發(fā)現(xiàn)菠蘿蛋白酶抑制與生長刺激相關(guān)的激酶級聯(lián)。在該信號傳遞途徑中的一個因子是ras蛋白質(zhì)，在25至30％的人腫瘤中發(fā)現(xiàn)異常形。菠蘿蛋白酶能夠抑制T-細(xì)胞增長所需的信號，這很可能是經(jīng)過抑制包括MAP激酶的蛋白質(zhì)的酪氨酸磷酸化來實(shí)現(xiàn)。
由于其抑制MAP激酶和其它蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸化的能力，菠蘿蛋白酶能作為抗癌劑發(fā)揮作用，因?yàn)樗惨种浦T如血小板來源的生長因子(PGDF)和成纖維細(xì)胞和上皮細(xì)胞中的表皮生長因子(EGF)的生長因子過度生產(chǎn)。
另外，由于能抑制T-細(xì)胞的增生，它是一種免疫抑制劑，在防止宿主排斥移植器官或治療諸如糖尿病，多處硬化和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的自身免疫疾病中有用。這一發(fā)現(xiàn)與WO-A-9301800中所講授的含諸如菠蘿蛋白酶的蛋白酶之組合物具有非特異性的免疫刺激活性完全相反。
事實(shí)上，我們發(fā)現(xiàn)菠蘿蛋白酶可用于刺激或抑制細(xì)胞因子生產(chǎn)，這取決于它是用于處理激活的細(xì)胞(如那些已受到刺激的細(xì)胞)還是未激活(即靜止或休息)的細(xì)胞。因此，它可用作免疫抑制劑，例如用于防止組織排異；或用作免疫刺激劑，例如作為疫苗佐劑。借助于其抑制細(xì)胞因子生產(chǎn)和酪氨酸磷酸化的能力，菠蘿蛋白酶也可用于防止或處理毒性攻擊。菠蘿蛋白酶也可用于治療過敏反應(yīng)。
正如上面所討論的，菠蘿蛋白酶是各種成份的混合物。盡管在WO-A-9400147中已講授莖菠蘿蛋白酶是負(fù)責(zé)介導(dǎo)環(huán)核苷酸途徑的菠蘿蛋白酶成份，但不清楚是否莖菠蘿蛋白酶也負(fù)責(zé)菠蘿蛋白酶對激酶途徑的作用還是菠蘿蛋白酶混合物的一些其它成份負(fù)責(zé)。
然而，這并不影響本發(fā)明的工作，因?yàn)橹辽俅种频牟ぬ}蛋白酶混合物能影響MAP激酶的磷酸化(或激活)。
菠蘿蛋白酶可用各種途徑用藥，包括腸道，例如口服，鼻內(nèi)，口腔或肛門用藥或腸胃外用藥，例如經(jīng)靜脈內(nèi)，肌肉內(nèi)或腹膜內(nèi)注射。然而，優(yōu)選口服途徑。
口服用藥時為了幫助菠蘿蛋白酶通過胃，需要以腸保護(hù)型制品配制該酶。其它口服可用的配方包括糖漿，酏劑和硬和軟膠囊，它可以是腸覆蓋型的。
菠蘿蛋白酶活性在較寬的pH范圍內(nèi)(pH2-9)是穩(wěn)定的。因此，腸保護(hù)(或腸覆蓋)菠蘿蛋白酶抵抗胃內(nèi)酸性條件并非是必需的。然而，可能必需保護(hù)該酶免受消化道酸性蛋白酶的消化。因此，菠蘿蛋白酶可與緩沖劑(如碳酸氫鹽)一起施用。
菠蘿蛋白酶的劑量通常以Rorer單位，F(xiàn)IP單位，BTU(菠蘿蛋白酶酪氨酸單位)、CDU(酪蛋白消化單位)，GDU(明膠消化單位)或MCU(凝乳單位)來測量。蛋白酶活性的一個Rore單位定義為在pH7和25℃下水解標(biāo)準(zhǔn)化酪蛋白底物使在280nm時每分鐘吸光率增加0.00001的酶量。菠蘿蛋白酶活性的一個FIP單位指標(biāo)準(zhǔn)制品的量，它在標(biāo)準(zhǔn)條件下以某一起始速率水解合適的酪蛋白制品(FIP對照)，使每分鐘釋放的肽量不被特定的蛋白沉淀劑沉淀，在275nm下產(chǎn)生與1μm酪氨酸相同的吸光率。BTU，CDU，GDU和MCU按文獻(xiàn)中的定義如下BTU一個菠蘿蛋白酶酪氨酸單位，是在測定條件下(例如，在pH5和30℃下消化酸變性的血紅蛋白底物后)每分鐘釋放1微摩爾酪氨酸的酶量。
CDU從pH7.0的標(biāo)準(zhǔn)酪蛋白底物在37℃消化1分鐘后釋放1微克酪蛋白所需的酶的量。
GDU在45℃和pH4.5下消化20分鐘后從標(biāo)準(zhǔn)明膠溶液釋放1毫克(10-3g)氨基氮的酶活性。
1100BTU/g＝750CDU/mg＝1200GDU/g。
盡管精確的劑量由醫(yī)生或醫(yī)務(wù)人員來控制，但發(fā)現(xiàn)日劑量從50到4000GDU/天可能是合適的，例如，從100到1000GDU/天。日劑量可用每天一個或多個等分試劑來提供，例如一天二次，三次或四次。特別優(yōu)選的劑量是10mg/kg(一個普通的成年人劑量為700mg，相當(dāng)于2800BTU)。
現(xiàn)在將以下面的實(shí)施例來描述本發(fā)明。實(shí)施例中提到一些附圖，其中圖1描述了與導(dǎo)致IL-2基因轉(zhuǎn)錄和IL-2生產(chǎn)的磷脂酰肌酸(PI)途徑中之T-細(xì)胞受體活化相聯(lián)系的事件。
圖2在T-細(xì)胞雜交瘤GA15獲得的蛋白質(zhì)上檢測MAP激酶的免疫印跡。GA15用鈣離子載體，PMA或離子載體與PMA結(jié)合刺激或用PBS進(jìn)行假處理(未刺激對照)。細(xì)胞用菠蘿蛋白酶或用PBS處理。
圖3檢測MAP激酶的免疫印跡。從用鈣離子載體結(jié)合PMA激活的或PBS處理的(未刺激對照)GA15中獲得蛋白質(zhì)，GA15已用菠蘿蛋白酶或用PBS處理。測定在給定的時間間隔內(nèi)樣品中MAP激酶的存在。
圖4顯示了在用菠蘿蛋白酶或PBS處理的刺激的T-細(xì)胞中MAP激酶對時間的存在。
圖5是顯示產(chǎn)生的抗MAPK高度保守肽(ErK1)的多克隆抗體識別Mr 42000和44000兩個蛋白質(zhì)的免疫印跡。
圖6是與MAPK抗體的免疫印跡，顯示了在用菠蘿蛋白酶處理的細(xì)胞中對蛋白質(zhì)磷酸化正常觀察到的電泳遷移率改變被部分抑制。
圖7顯示了在體外GA15細(xì)胞中菠蘿蛋白酶處理對IL-2，IL-4和IFN-γmRNA積累的影響。當(dāng)用PMA(20ng/ml)和鈣離子載體A23187(500ng/ml)刺激時用菠蘿蛋白酶處理的GA15細(xì)胞積累較少的IL-2，IL-4和IFN-γmRNA。
圖8顯示了用菠蘿蛋白酶處理的脾T-細(xì)胞用2c11(αCD3e)和CD28(αCD28)刺激時產(chǎn)生較少的IL-2。
圖9顯示了菠蘿蛋白酶處理對體外脾下細(xì)胞IL-2，IL-4和r-INF mRNA積累的影響。當(dāng)用制動的抗-CD3e(4μg/ml)和可溶性抗-CD28(10μg/ml)mAb刺激時用菠蘿蛋白酶處理的脾T-細(xì)胞積累較少的IL-2，IL-4和IFN-γmRNA。
圖10顯示了當(dāng)用固相抗-CD3e(4μg/ml)和可溶性抗-CD28(10μg/ml)mAb刺激時，菠蘿蛋白酶處理增加脾-T細(xì)胞增生。
圖11a和b顯示了菠蘿蛋白酶處理增加抗-CD3e(a)和抗-CD28(b)mAb與脾T細(xì)胞的細(xì)胞表面結(jié)合，所示為FAC圖移向右側(cè)。
圖12顯示了菠蘿蛋白酶增加抗-CD3e mAb與GA15細(xì)胞表面的結(jié)合。
圖13a和b顯示了在脾T-細(xì)胞中酪氨酸磷酸化蛋白質(zhì)的免疫印跡。圖13a顯示菠蘿蛋白酶處理誘導(dǎo)56和58KDa蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸化。圖13b顯示了菠蘿蛋白酶處理抑制16Kda蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸化。
圖14顯示了菠蘿蛋白酶處理對體外GA15細(xì)胞中IL-2，IL-4和IFN-γmRNA積累的影響。當(dāng)用固相抗-CD3e(4μg/ml)和可溶性抗-CD28(10μg/ml)mAb刺激時，用菠蘿蛋白酶處理的細(xì)胞中積累更多的IL-2，IL-4和IFN-γmRNA。
圖15顯示了菠蘿蛋白酶對綿羊體內(nèi)紅血細(xì)胞(SRBC)抗體反應(yīng)的影響。用菠蘿蛋白酶處理的小鼠具有更多生產(chǎn)抗SRBC之抗體的B細(xì)胞。
材料和方法細(xì)胞系Tho細(xì)胞雜交瘤GA15用于研究酪氨酸磷酸化的實(shí)驗(yàn)。從胸癌BW5147與Th2克隆F4的融合產(chǎn)生GA15，F(xiàn)4對與I-Ab相聯(lián)的KLH具有特異性(Fox，Int.Immunol.，5，323-330，1993)。細(xì)胞在由補(bǔ)充了10％胎牛血清(Inovar Bologicals，Gaithersburg，MD)，50mm 2-巰基乙醇，40mM谷氨酰胺和50μg/ml慶大霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基(biofluids，Rockville，MD)組成的組織培養(yǎng)基(TCM)中維持。
動物研究了菠蘿蛋白酶預(yù)處理對分離的鼠脾T-細(xì)胞的IL-2生產(chǎn)的影響。雄性C57BL/ONCr1BR小鼠購自Charies River Laboratories(Wilmington，MA，USA)。幼年小鼠(3至4月齡)和老年小鼠(20到26月齡)用于配對實(shí)驗(yàn)。不使用發(fā)現(xiàn)具有腫瘤、可見皮膚損傷或明顯病狀的小鼠。為了進(jìn)行體內(nèi)實(shí)驗(yàn)和研究IL-2，IL-4和IFN-γmRNA積累的實(shí)驗(yàn)，雌性Balb/c小鼠購自A.Tuck和Son Ltd(UK)。使用6到10周齡的小鼠。
拮抗劑佛波酯在結(jié)構(gòu)上與1，2-二脂酰甘油(DAG)相關(guān)，從而引起PKC激活，它誘導(dǎo)Raf-1的多磷酸化(Morrison等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.85，8855-8859，1988)，以及MAP激酶的活化(Chung等，Mol.all.Biol.，11，1868-1874，1991)。離子載體增加細(xì)胞中的胞質(zhì)自由鈣，后者又結(jié)合鈣調(diào)蛋白和PKC。
為了進(jìn)行酪氨酸磷酸化實(shí)驗(yàn)，佛波醇12，豆蔻酸13-乙酸(PMA)和鈣離子載體A23187用于刺激細(xì)胞。佛波酯和離子載體處理T-淋巴細(xì)胞協(xié)同作用以模擬第二信使二乙酯酰甘油(DAG)和肌醇1，4，5-三磷酸(IP3)的效應(yīng)，從而再生出許多TCR刺激特征(Truneh等，Nature，313，318-320，1985)，如IL-2分裂，IL-2受體表達(dá)和T細(xì)胞增生。
從小鼠分離脾T-細(xì)胞經(jīng)過折斷頸椎處死動物，并無菌取出脾臟。在由補(bǔ)充有10％加熱滅活的胎牛血清(FCS)(GIBCO實(shí)驗(yàn)室)和2mM L-谷氨酰胺，5×10-52-ME和抗生素(50mg/ml慶大霉素和10U/ml青霉素)的RPMI1640(GIBCO實(shí)驗(yàn)室，Grand Island，Ny)組成的組織培養(yǎng)基(TCM)中制備單細(xì)胞懸液。在裂解緩沖液(140mM NH4Cl，17mM Tris，pH7.2)中以5×107淋巴細(xì)胞/ml裂解紅細(xì)胞2-5分鐘。經(jīng)過加入TCM終止裂解，經(jīng)過在尼龍絨(Polysciences，Warrington，PA)上37℃培養(yǎng)1小時純化T細(xì)胞(Julius et al.，Eur.J.Immunol.3645，(1973))。在流出物中收集T細(xì)胞，以流式細(xì)胞光度術(shù)評價含有790％的Thy-1和＜5％MHCII型+細(xì)胞。
為了測量鼠T-細(xì)胞產(chǎn)生的IL-2，單克隆抗體(mAb)用作模擬在T細(xì)胞表面和存在抗原的細(xì)胞之間發(fā)生的分子相互作用的頡抗劑。單克隆抗體2C11(抗-CD3e鏈)用于交聯(lián)TCR受體并模擬抗原肽/主要組織相容性(MHC)刺激的頡抗效應(yīng)。經(jīng)過使用抗-CD28 mAb(37.51)通過CD28提供協(xié)同刺激信號。已證實(shí)CD28分子與抗體的連接和TCR的交聯(lián)起動導(dǎo)致IL-2生產(chǎn)和T細(xì)胞增生的特異性信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。
其它試劑從所示來源購買試劑綿羊紅血細(xì)胞(SRBC)來自TCS Biological(Buckingham，UK)；抗-CD3e-鏈mAb(145-2c11)來自Pharmingen(San Diego，CA)；抗-CD28 mAb(PV-1)和多克隆倉鼠IgG(對照倉鼠IgG)由Drc.June(NMRI，Bethesda，mD)惠贈；山羊抗-倉鼠IgG Ab，佛波醇12-豆蔻酸13-乙酸(PMA)，鈣離子載體A23187均來自Sigma(Dorset，UK)；小鼠抗磷酸酪氨酸mAb(4G10)來自UpstateBiotechnology(Lake Placid，NY)；連接有辣根過氧化物酶的山羊抗-小鼠IgG Ab來自Southern Biotechnology Associates(Birmingham，AL)；連接有異硫氰酸熒光素(FITC)的山羊抗-倉鼠IgG Ab來自Cappel(Durham，NC)；RNA 201B來自Cinna/Biotecx Laboratories(Houston，TX)RNAguard，dNTP都來自Pharmacia Biotech(St Albans，Herts)；MMLV-逆轉(zhuǎn)錄酶，隨機(jī)引物都來自GIBCO BRL(Gaithersberg，MD)；biotaq聚合酶來自Bioline(London，UK)；粗制菠蘿蛋白酶提取物(E.C.3.4.22.4)(批號TAD8TK1125)來自Miles Scientific(Elkhart，IN)。
GA15細(xì)胞處理和刺激為了進(jìn)行磷酸蛋白實(shí)驗(yàn)，在第二信使刺激前用菠蘿蛋白酶(15μg/ml或50μg/ml，在pH7.4的磷酸鹽緩沖溶液中稀釋)預(yù)處理GA15(1×106細(xì)胞)30分鐘。經(jīng)過重復(fù)離心(1500rpm，Sorvall RT 6000B冷凍離心機(jī)；Dupont)和在RPMI中重新懸浮洗滌細(xì)胞二次。單獨(dú)用PBS載體處理對照細(xì)胞。
細(xì)胞用鈣離子載體(1μm)，PMA(10ng/ml)或離子載體與PMA結(jié)合刺激各種時間長度。刺激后，裂解細(xì)胞并按下面所述測定酪氨酸磷酸化的蛋白質(zhì)。
測定脾T-細(xì)胞中IL-2的生產(chǎn)為了測定IL-2生產(chǎn)，將鼠脾T細(xì)胞以每孔105細(xì)胞在96孔，平底，微培養(yǎng)板(Corning，Corning，NY，USA)上培養(yǎng)。用100μg/ml固相(與平板結(jié)合)抗小鼠CD3e mAb(145-2c11)(Leo等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.，84，1374，1987)與10μg/ml可溶性抗-小鼠CD28 mAb(37.51)(Gross等，J.Immunol.，144，3201，1990)刺激細(xì)胞。為了提供固相抗-小鼠CD3e mAb，在PBS中稀釋145-2c11腹水，以50μl加到微培養(yǎng)板上，4℃培養(yǎng)16小時，然后將孔在PBS中洗滌3次。在收獲培養(yǎng)上清分析IL-2活性前將一式三份培養(yǎng)物在濕潤的5％CO2中37℃培養(yǎng)24小時。使用IL-2依賴型細(xì)胞系CTL-L按以前所述測量IL-2活性(Gtllis等，J.Immunol.，120，2027，1978)。簡單地說，在96孔平底微培養(yǎng)板上以4×103CTL-L細(xì)胞/孔系列稀釋上清。24小時后，用0.5μci/孔[3H]胸腺嘧啶再脈沖細(xì)胞16小時。收獲細(xì)胞并用液閃計(jì)數(shù)測定增生。單位使用重組鼠IL-2(Pharmingen，San Diego，CA，USA)作標(biāo)準(zhǔn)。
在測置IL-2，IL-4和IFN-γmRNA積累的實(shí)驗(yàn)中和在FACS分析中，在含50μg/ml菠蘿蛋白酶的RPMI 1640中以107細(xì)胞/ml在37℃培養(yǎng)細(xì)胞30分鐘。偽處理的細(xì)胞用等體積的磷酸緩沖鹽溶液(0.1M，ph7.4；PBS)(菠蘿蛋白酶稀釋劑)培養(yǎng)。培養(yǎng)后，細(xì)胞在RPMI 1640中洗滌3次，然后垂懸于TCM中。
細(xì)胞培養(yǎng)物的mRNA測定在研究細(xì)胞因子mRNA積累的實(shí)驗(yàn)中，GA15雜交瘤以2ml培養(yǎng)體積在24孔平底板(Nunc，Rosskilde，Denmark)中以每孔2.5×106個細(xì)胞培養(yǎng)4小時。脾T細(xì)胞以4ml培養(yǎng)體積在6孔平底板(Flow Laboratories，Mclean，VA)中以每孔5×106個細(xì)胞培養(yǎng)24小時。在研究增生的實(shí)驗(yàn)中，脾T細(xì)胞以一式三份在96孔平底板(Nunc)中以每孔105個細(xì)胞在200μl培養(yǎng)體積中培養(yǎng)36小時。這些培養(yǎng)物用0.5μCi[3H]TdR脈沖16小時，然后收獲到玻璃纖維上并計(jì)數(shù)摻入的[3H]TdR。全部試劑在TCM中稀釋，除了固相抗-CD3e mAb的制備是在PBS中稀釋mAb，加到培養(yǎng)板上以覆蓋孔的底部，在4℃培養(yǎng)16小時，然后用PBS洗滌孔3次。所有細(xì)胞在37℃下在潤濕的5％CO2中培養(yǎng)。
流式細(xì)胞光度術(shù)染色前，細(xì)胞在1ml含50％過濾的馬血清的熒光激活細(xì)胞分類(FACS)緩沖液(含1％加熱滅活的FCS的PBS，0.02％NaN3)中在冰上培養(yǎng)30分鐘，然后用FACS緩沖液洗滌一次。細(xì)胞在100μlFACS緩沖液中在冰上用抗-CD3e mAb，抗-CD28 mAb或倉鼠IgG對照Ab(均為10μg/ml)染色30分鐘并用FACS緩沖液洗滌一次。經(jīng)過將細(xì)胞在100μl FACS緩沖液中在冰上用FITC連接的抗倉鼠IgG(10μg/ml)培養(yǎng)30分鐘然后在FACS緩沖液中洗滌一次檢測特異性接合到細(xì)胞表面的Ab。細(xì)胞垂懸于1％多聚甲醛(在FACS緩沖液中稀釋)中并在4℃貯存。在Becton Dickinson FACS can流式細(xì)胞光度計(jì)(BectonDickinson，Mountain View，CA)上分析細(xì)胞。淋巴細(xì)胞向前和側(cè)向分散通過閘門，數(shù)據(jù)在對數(shù)刻度上標(biāo)示。細(xì)胞因子mRNA的PCR分析使用以前描述的半定量RT-PCR試驗(yàn)的修改方法測量IL-2，IL-4和IFN-γmRNA的積累(Svetic等，J.Immunol.1472391-2397(1991))。簡單地說，使用RNA201 B根據(jù)廠商說明書(Cinna/BiotecxLaboratories)從細(xì)胞和脾組織(Chomczynski and Sacchi，Anal.Biochem.162156-159(1987))分離RNA，以標(biāo)準(zhǔn)方法(Sambrook等，MolecularCloningA Laboratory Manual，2nd.edn，Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，NY(1989))使用從樣品中回收的3μg總RNA以25μl的終反應(yīng)體積逆轉(zhuǎn)錄mRNA。使用2.5μl逆轉(zhuǎn)錄的mRNA樣品作為cDNA模板從25μl的終體積進(jìn)行PCR，每個樣品以一式2份進(jìn)行。對IL-2，IL-4，IFN-γ特異性的寡核苷酸和管家基因次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(HPRT)和PCR的其它成份如前面所述(Svetic等(1991)，出處同上)。
全部PCR由在95℃變性1分鐘，在55℃退火1分鐘和在72℃延伸2分鐘組成。PCR循環(huán)數(shù)用于保證當(dāng)擴(kuò)增產(chǎn)物可被檢測但低于飽和濃度時終止擴(kuò)增，測定各細(xì)胞因子并分析RNA樣品。經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳和根據(jù)廠家建議將DNA轉(zhuǎn)移到Hybond N+尼龍膜上按大小分離擴(kuò)增的DNA來檢測PCR產(chǎn)物(Amershan，Buckinghamshire，UK)。
使用以辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的，與ECL化學(xué)發(fā)光檢測系統(tǒng)反應(yīng)的細(xì)胞因子特異性寡核苷酸(Svetic等(1991)出處同上)按廠家所述(Amersham)顯示擴(kuò)增的細(xì)胞因子mRNA。特異性信號記錄在放射自顯影膜(Kodak，Rochester，NY)上，使用Phoretix 1-D軟件(phoretixInternational，New castle，UK)在Sharp JX-3F6計(jì)算密度計(jì)(Sharp，日本)上分析。
由HPRT產(chǎn)物產(chǎn)生的信號強(qiáng)度用于保證進(jìn)入PCR的靶cDNA的平均負(fù)荷。一般來說，HPRT產(chǎn)物產(chǎn)生的信號為不同處理組以相同方式刺激的細(xì)胞中分離的樣品之相應(yīng)信號強(qiáng)度的10％以內(nèi)。計(jì)算各樣品中相對于HPRT產(chǎn)物產(chǎn)生的信號由細(xì)胞因子產(chǎn)物產(chǎn)生的信號的強(qiáng)度。
細(xì)胞的免疫印跡按Thomas等(Cell，68，1031-1040，1992)所述進(jìn)行細(xì)胞磷酸酪氨酸印跡。簡單地說，經(jīng)過在冰冷的裂解緩沖液(50mM Tris，pH 7.4，150mMNaCl34mM EDTA，1％Triton X-100，4mM Sodium orthovanadate，1mM PMSF，50mM NaF，10μg/ml亮抑蛋白酶肽)中在持續(xù)搖動的條件下裂解細(xì)胞30分鐘從1×106GA15細(xì)胞制備細(xì)胞溶胞產(chǎn)物。將溶胞產(chǎn)物澄清(14,000xg 2分鐘)，懸浮于SDS-PAGE樣品緩沖液中并煮沸5分鐘。將含等量蛋白質(zhì)的樣品在12.5％SDS-聚丙烯酰胺凝膠上分辨。分離的蛋白質(zhì)經(jīng)電泳轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素(BioRad)上，未占據(jù)的結(jié)合位點(diǎn)在含5％牛血清白蛋白(Sigma，fraction Vi BSA)，0.05％NP-40，170mMNaCl和50mM Tris(pH7.5)的封閉溶液中封閉。將免疫印跡物與1μg/ml抗磷酸酪氨酸單克隆抗體(4G10；IgG 26k)(Upstate BiochemicalIndustries，NY)保溫以檢測酪氨酸磷酸化的蛋白質(zhì)。以辣根過氧化物酶連接的山羊抗小鼠IgG檢測結(jié)合的單克隆抗體。使用ECL化學(xué)發(fā)光反應(yīng)(Amersham Corp.，Arlington Heights，IL)測定免疫反應(yīng)性，特異性信號記錄在放射自顯影膠片上。
使用兔抗大鼠MAP激酶R2(erk1-CT)多克隆IgG，接著用辣根過氧化物酶連接的山羊抗兔IgG進(jìn)行分離蛋白質(zhì)的免疫印跡以檢測MAP激酶。使用的抗MAP激酶抗體識別分別由erk1基因，mapk基因和mpk基因編碼的42kda，43kda和44kda MAP激酶。
用αCD3e和αCD28mAb刺激后分析蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸化刺激前細(xì)胞以5-10×107細(xì)胞/ml在37℃的RPMI 1640中懸浮5分鐘。使用的PMA和鈣離子載體A23187分別為20和500ng/ml。經(jīng)過在各mAb為10μg/ml的條件下在冰上保溫T細(xì)胞30分鐘進(jìn)行CD3e和CD28 mAb的交聯(lián)。洗去多余的抗體后，將細(xì)胞以5-10×107細(xì)胞/ml懸浮于RPMI1640中(均在4℃)。在37℃下與10μg/ml山羊抗-倉鼠IgG進(jìn)行交聯(lián)。按


和說明書中所示的時間刺激細(xì)胞。經(jīng)過加入冰冷的終止緩沖液，產(chǎn)生0.5％Triton x-100，25mM Tris，pH7.2，75mM NaCl，400mM EDTA，10mM氟化鈉，400mM Sodiumorthoranadate，10mM磷酸鈉，74mg/ml亮抑蛋白酶肽，740mMPMSF和74μg/ml抑蛋白酶肽的終濃度終止刺激。在4℃裂解后，樣品以12,000rpm(13,200g)在4℃離心15分鐘。收集澄清后的上清液，加入等體積的2X SDS-PAGE樣品緩沖液(50mM Tris，pH7，700mM-2ME，50％(v/v)甘油，2％(w/v)SDS，0.01％(w/v)溴酚蘭)。蛋白質(zhì)以100℃溶解5分鐘并以SDS-PAGE分辨。
羊紅血細(xì)胞試驗(yàn)小鼠在實(shí)驗(yàn)的1，4和6天接受3×200μl 200μg菠蘿蛋白酶或等體積的0.9％NaCl(菠蘿蛋白酶稀釋劑)的靜脈內(nèi)(i.v.)注射。在實(shí)驗(yàn)的第4天兩個處理組接受100μl腹膜內(nèi)(i.p.)注射107SRBC或等體積的0.9％NaCl(SRBC稀釋劑)。在第7天處死小鼠，取出其脾臟，并按細(xì)胞制備部分所述分離脾細(xì)胞。以Weir(1986)所述的以Jerne和Nordin的原始方法為基礎(chǔ)的試驗(yàn)測定分泌對SRBC抗原具有特異性的抗體的B細(xì)胞數(shù)。簡單地說，在160μl，由5×105個脾細(xì)胞，6×106SRBC和127溶于RPMI 1640的豚鼠補(bǔ)體組成的溶液中進(jìn)行測定。反應(yīng)混合物放入經(jīng)過將兩玻璃片與雙側(cè)管連接然后封上蠟制成的室中。樣品在37℃保溫1小時，然后計(jì)算形成空斑的細(xì)胞(PFC)(即分泌SRBC特異性Ab的B細(xì)胞)。
結(jié)果實(shí)施例1在GA15中菠蘿蛋白酶對離子載體和佛波酯誘導(dǎo)的酪氨酸磷酸化的影響測定了菠蘿蛋白酶預(yù)處理的T-細(xì)胞對酪氨酸激酶細(xì)胞底物的第二信使刺激的影響。使用特異性抗磷酸酪氨酸抗體的免疫印跡顯示了用PMA，離子載體或PMA結(jié)合離子載體(PMA+Ca)刺激5分鐘后一些蛋白質(zhì)帶的酪氨酸磷酸化。大約42Kda的主要蛋白質(zhì)帶是最清晰的。PMA+Ca的協(xié)同效應(yīng)增加了磷酸化帶的強(qiáng)度(圖2)。
菠蘿蛋白酶對酪氨酸磷酸化的效應(yīng)以抗磷酸酪氨酸免疫印跡檢測時其抑制42kda帶存在的能力來測定。當(dāng)用全部第二信使頡抗物刺激時，菠蘿蛋白酶預(yù)處理的GA15細(xì)胞封閉42kda蛋白質(zhì)的酪氨酸磷酸化。這一帶未用磷酸酪氨酸免疫印跡檢測。由于PMA+Ca組合的協(xié)同效應(yīng)，隨后的全部實(shí)驗(yàn)用該組合進(jìn)行。
接著檢查了磷酸化的動力學(xué)并測定了在5分鐘時菠蘿蛋白酶抑制酪氨酸磷酸化的能力是時間的作用還是菠蘿蛋白酶完全抑制酪氨酸磷酸化。發(fā)現(xiàn)菠蘿層的酶并不完全抑制磷酸化，但延遲酪氨酸磷酸化(圖3)。然后經(jīng)過對放射自顯影的光密度測定法測量定量磷酸化的動力學(xué)(見圖4)。盡管酪氨酸磷酸化延遲，但該帶的磷酸化并未達(dá)到在未處理的對照中觀察到的相同強(qiáng)度且到180分鐘為止完全脫磷酸化(資料未顯示)。
當(dāng)用第二信使頡抗物刺激細(xì)胞時，除了42kda蛋白質(zhì)外，還觀察到一些尚未鑒定的其它蛋白質(zhì)的抑制。盡管如此，以抗磷酸酪氨酸免疫印跡檢查時，菠蘿蛋白酶不影響未刺激細(xì)胞中豐富的細(xì)胞磷酸蛋白質(zhì)的總體磷酸化。主要42kda磷酸化帶的鑒定如上所述，用生長因子及以佛波酯和鈣離子載體處理后MAPK家族的一些成員在酪氨酸殘基上磷酸化。由于文獻(xiàn)中描述的MAPK的分子量與本實(shí)驗(yàn)酪氨酸磷酸化的主要蛋白質(zhì)帶相對應(yīng)，我們假定在GA15細(xì)胞中觀察到的42kda蛋白質(zhì)是MAPK。因此我們使用抗-MAPK抗體檢測GA15細(xì)胞中的MAPK。
圖5顯示了針對MAPK高度保守肽(ErK1)的多克隆抗體識別Mr 42,000和44,000兩種蛋白質(zhì)(分別假定為erK1和erK2)。42kda蛋白質(zhì)顯示出的電泳遷移率與在刺激的T-細(xì)胞中檢測的42kda的含磷酸酪氨酸的蛋白質(zhì)相似。44kda帶也與酪氨酸磷酸化不依賴于PMA加離子載體刺激的蛋白質(zhì)相關(guān)。也檢測到48kda的蛋白質(zhì)和其它低分子量的蛋白質(zhì)，盡管這些帶在未加抗-MAPK的對照免疫印跡中也檢測到，認(rèn)為該反應(yīng)性無特異性。
在所有試驗(yàn)樣品中以抗MAPK抗體的免疫印跡顯示出相似強(qiáng)度，表明在菠蘿蛋白酶處理的細(xì)胞中觀察到的酪氨酸磷酸化強(qiáng)度減少不是由于存在的蛋白質(zhì)水平不同。電泳遷移率經(jīng)過其在電泳遷移中的特征性延遲檢測磷酸化的MAP激酶，我們還研究了是否本實(shí)驗(yàn)中磷酸化的42kda帶是MAPK。經(jīng)過用抗-MAPK抗體進(jìn)行免疫印跡分析檢查細(xì)胞溶胞產(chǎn)物。
以MAPK抗體進(jìn)行的免疫印跡表明電泳遷移率的改變與正常情況下在MAPK磷酸化中觀察到的一致。在用菠蘿蛋白酶處理的細(xì)胞中這種遷移率的改變也被部分封閉(圖6)。菠蘿蛋白酶對體外GA15中IL-2，IL-4和IFN-γmRNA生產(chǎn)的影響上面顯示用菠蘿蛋白酶處理GA15 T細(xì)胞雜交瘤，當(dāng)用PMA和鈣離子載體A23187刺激細(xì)胞時導(dǎo)致酪氨酸磷酸化改變。具體地說，菠蘿蛋白酶顯著減少稱為MAP激酶的42KDa蛋白質(zhì)的酪氨酸磷酸化。為了測定是否酪氨酸磷酸化方式的改變由菠蘿蛋白酶導(dǎo)致的任何功能改變誘導(dǎo)，我們測量了細(xì)胞因子mRNA在GA15中的積累。
經(jīng)過培養(yǎng)4小時后使用RT-PCR試驗(yàn)測定編碼這些細(xì)胞因子的mRNA的積累來試驗(yàn)菠蘿蛋白酶對IL-2，IL-4和IFN-γ生產(chǎn)的影響。用PMA和A23187刺激GA15細(xì)胞。這種組合刺激(PMA和A23187)直接激活細(xì)胞信號傳遞途徑，因而繞過全部細(xì)胞表面分子。使用相當(dāng)短的培養(yǎng)期限(4h)是為了保證積累的細(xì)胞因子mRNA是使用特異性刺激的結(jié)果而不是新合成的細(xì)胞因子的自分泌效應(yīng)。
在單獨(dú)用TCM培養(yǎng)的細(xì)胞中檢測不到細(xì)胞因子mRNA。與對照(PBS)細(xì)胞相比，用PMA和A23187刺激后的全部細(xì)胞因子mRNA種類的積累在用菠蘿蛋白酶處理的GA15細(xì)胞中一直較低(圖7)。對于IL-4，細(xì)胞因子mRNA積累的差別最明顯。在用菠蘿蛋白酶處理的細(xì)胞中明顯更低(n＝3，p＜0.05)。由于MAP激酶的酪氨酸磷酸化與細(xì)胞因子基因轉(zhuǎn)錄相聯(lián)系(pelech，curr.Biol.3513(1993))，我們假定細(xì)胞因子mRNA積累的減少由MAP激酶酪氨酸磷酸化的減少引起。菠蘿蛋白酶對脾T-細(xì)胞中IL-2生產(chǎn)的影響接著我們研究了當(dāng)通過細(xì)胞表面分子刺激時在從小鼠(鼠)脾分離的正常T-細(xì)胞中菠蘿蛋白酶是否影響細(xì)胞因子生產(chǎn)。第一種刺激組合(PMA+A23187)直接激活細(xì)胞信號途徑，因而繞過了所有細(xì)胞表面分子。固相αCD3e和可溶性抗CD28 mAb的組合通過T細(xì)胞受體(經(jīng)CD3e鏈)提供初級信號并通過CD28提供共同刺激信號以激活細(xì)胞信號級聯(lián)。以前已顯示出兩種刺激組合(PMA+A23187；αCD3e+αCD28)提供最適T-細(xì)胞激活(Truneh等，Nature，313318-320(1985)；Linsley and Ledbetter，Ann.Rev.Immund.，11191(1993))，但使用的機(jī)制不同(即分別是直接和間接作用)。
測量了經(jīng)幼鼠脾T細(xì)胞分泌進(jìn)培養(yǎng)上清中的IL-2。在抗-CD28mAb存在下用固相抗-CD3e mAb刺激T細(xì)胞24小時，如上所述。在缺乏抗體或單獨(dú)存在抗-CD28或抗-CD3e的條件下培養(yǎng)T細(xì)胞用做對照。
圖8顯示了單個實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。在缺乏抗體或見有單獨(dú)的抗-CD28時培養(yǎng)的T細(xì)胞不產(chǎn)生可檢測水平的IL-2(資料未顯示)。同樣地，單獨(dú)的固相抗-CD3e產(chǎn)生幾乎檢測不到的IL-2水平。由于通過TCR的初級信號和共同刺激信號都是最適T細(xì)胞激活所需要的，所以在兩種抗體存在的條件下培養(yǎng)T細(xì)胞。
在培養(yǎng)物中抗CD-28和抗-CD3e的組合導(dǎo)致T細(xì)胞產(chǎn)生的IL-2大量增加。刺激后，在幼年和老年小鼠間觀察到IL-2生產(chǎn)的差異。這一現(xiàn)象在文獻(xiàn)中有廣泛的報道(Thoman及Weigle，1989進(jìn)行了綜述)。另外，正如以前在GA15實(shí)驗(yàn)中觀察到的，用菠蘿蛋白酶預(yù)處理的T細(xì)胞比僅用PBS預(yù)處理的T細(xì)胞產(chǎn)生的IL-2明顯要少。在年老和年幼小鼠中注意到相似的減少、當(dāng)用通過TCR的初級信號和經(jīng)CD28輔助分子的共同刺激信號最理想地刺激T細(xì)胞時，觀察到這一效應(yīng)。菠蘿蛋白酶的效應(yīng)似乎不與年齡相關(guān)，因?yàn)槟暧缀湍昀闲∈蟮腡細(xì)胞都表現(xiàn)出IL-2生產(chǎn)減少。菠蘿蛋白酶對體外脾T-細(xì)胞中IL-2，IL-4和IFN-γmRNA生產(chǎn)的影響接著我們研究了菠蘿蛋白酶誘導(dǎo)的酪氨酸磷酸化方式的改變是否影響脾T-細(xì)胞產(chǎn)生的其它細(xì)胞因子。經(jīng)過測量編碼這些細(xì)胞因子的mRNA的積累，我們研究了菠蘿蛋白酶對IL-2，IL-4和IF-γ生產(chǎn)的影響。在單獨(dú)的培養(yǎng)基中或在固相抗-CD3e和可溶性抗-CD28mAb之組合存在的條件下培養(yǎng)T細(xì)胞24小時。在僅含TCM培養(yǎng)的細(xì)胞中檢測不到細(xì)胞因子mRNA(資料未顯示)。
刺激后全部細(xì)胞因子mRNA種類的積累在菠蘿蛋白酶處理的T細(xì)胞中比對照要低(圖9)。對于IL-4，細(xì)胞因子mRNA積累的差異最顯著，在用抗CD3e和抗-CD28 mAb刺激的菠蘿蛋白酶處理的細(xì)胞中明顯較少(n＝3，p＜0.05)。菠蘿蛋白酶對體外脾T-細(xì)胞增生的影響由于在菠蘿蛋白酶預(yù)處理的脾T細(xì)胞中觀察到細(xì)胞因子mRNA積累減少且這些細(xì)胞因子(特別是IL-2和IL-4)對T細(xì)胞增生較重要，因此可期望菠蘿蛋白酶會引起T細(xì)胞增生減少。因而我們經(jīng)過測量用抗-CD3e和抗-CD28 mAb刺激的細(xì)胞中摻入的3H-TdR研究了菠蘿蛋白酶對T細(xì)胞增生的影響。令人驚奇的是，菠蘿蛋白酶預(yù)處理的T細(xì)胞引起T細(xì)胞增生明顯增加(n＝6；p＜0.05)，而不是象預(yù)期的那里減少增生(圖10)。這些矛盾的效應(yīng)的一個可能的解釋是，菠蘿蛋白酶可能引起細(xì)胞因子生產(chǎn)減少，但增加對細(xì)胞中生長因子的反應(yīng)性，如對IL-2和IL-4的反應(yīng)性(很可能是經(jīng)過修飾這些生長因子的細(xì)胞表面受體或經(jīng)過對信號級聯(lián)的影響增加表達(dá)。菠蘿蛋白酶對脾T細(xì)胞表面分子的影響由于以前已證實(shí)菠蘿蛋白酶去掉特異性T細(xì)胞表面分子(Hale及Haynes，J.Immunol.，1493809-3816(1992))，我們用流式細(xì)胞光度術(shù)研究了是否菠蘿蛋白酶去掉菠蘿蛋白酶處理的脾T細(xì)胞上的CD3e和CD28分子。用于這些研究的mAb與上面所述的用于刺激試驗(yàn)的相同。我們觀察到與脾T細(xì)胞表面CD3e的結(jié)合對于用菠蘿蛋白酶處理的細(xì)胞一直更高(圖11a)。還發(fā)現(xiàn)抗-CD28 mAb與CD28(在脾T細(xì)胞上以可檢測的水平表達(dá))的結(jié)合增加(圖11b)。這些結(jié)果表明菠蘿蛋白酶處理去掉的細(xì)胞表面分子不是所觀察到的細(xì)胞因子mRNA積累減少的原因，盡管mAb與CD3e和CD28分子的結(jié)合增加可能引起菠蘿蛋白酶處理的細(xì)胞增生增加。菠蘿蛋白酶對GA15細(xì)胞表面分子的影響由于我們觀察到αCD3e與菠蘿蛋白酶處理后的脾T細(xì)胞結(jié)合增加，我們也研究了是否菠蘿蛋白酶會影響GA15細(xì)胞上的CD3e和CD28分子。用于這些研究的mAb與上面所述的刺激試驗(yàn)中所用的相同。菠蘿蛋白酶處理后mAb與GA15表面的CD3e的結(jié)合似乎又略有增加(以平均熒光強(qiáng)度的增加表示(圖形移向右側(cè))(圖12)。這一結(jié)果與以前對脾T-細(xì)胞觀察到的一致。這種觀察到的增加是特異性事件，因?yàn)樵诓ぬ}蛋白酶和PBS處理的GA15中，對照mAb未顯示出高于背景水平的結(jié)合增加?？?CD3e mAb與GA15表面的結(jié)合增加不可能由CD3e的表達(dá)增加引起，因?yàn)榧?xì)胞僅在37℃下用菠蘿蛋白酶處理了30分鐘，且隨后的染色程序在4℃進(jìn)行，其中預(yù)期的細(xì)胞活性非常小。很可能mAb與CD3e結(jié)合的增加由菠蘿蛋白酶修飾該分子暴露了更多的抗原決定簇引起。
菠蘿蛋白酶對正常鼠體外脾T細(xì)胞中酪氨酸磷酸化的影響前面我們研究了菠蘿蛋白酶對GA15細(xì)胞中酪氨酸磷酸化的影響。接著我們研究了菠蘿蛋白酶處理對正常鼠T細(xì)胞酪氨酸磷酸化的影響。從健康的Balb/c小鼠脾臟分離T細(xì)胞并用PMA和A23187或固相抗-CD3e和可溶性抗-CD28mAb刺激，如上面對GA15細(xì)胞所述。分離脾T細(xì)胞，然后按Vandenberghe等〔J.Exp.Med.175951-960(1992)〕所述在含5ng/ml PMA的TCM中培養(yǎng)48小時，接著進(jìn)行刺激以分析酪氨酸磷酸化。在PMA中預(yù)培養(yǎng)的理由是在休息T細(xì)胞中酪氨酸磷酸化的增加非常難以檢測(Vandenberghe等，(1992)出處同上)。
在脾T細(xì)胞中觀察到的酪氨酸磷酸化方式與以前在GA15中觀察到的不同(圖13a和13b)。菠蘿蛋白酶抑制低分子量(大約16KDa)蛋白質(zhì)的酪氨酸磷酸化，不管細(xì)胞是否受到刺激(圖13b)。以前在GA15中觀察到的42KDa酪氨酸磷酸化MAP激酶帶未檢測到。對于這些細(xì)胞需要更靈敏的試驗(yàn)測量MAP激酶活性。在脾T細(xì)胞和GA15中酪氨酸磷酸化方式的另一顯著的區(qū)別是菠蘿蛋白酶處理導(dǎo)致蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸化(圖13)，而在GA15細(xì)胞中刺激后有抑制效應(yīng)。當(dāng)用PMA和A23187或抗-CD3e和抗-CD28 mAb刺激T細(xì)胞時，觀察到主要56KDa酪氨酸磷酸化蛋白質(zhì)。另外，在這些細(xì)胞中還檢測到略大于58KDa的酪氨酸磷酸化蛋白質(zhì)。除非T細(xì)胞用菠蘿蛋白酶處理，否則檢測不到這些蛋白質(zhì)的酪氨酸磷酸化。這些蛋白質(zhì)在用抗-CD3e和抗-CD28 mAb刺激2到5分鐘后發(fā)生酪氨酸磷酸化，且在刺激后保持磷酸化至少30分鐘(圖13a和13b)。由于一些蛋白質(zhì)的磷酸化與細(xì)胞反應(yīng)激活相聯(lián)系，菠蘿蛋白酶在T細(xì)胞中誘導(dǎo)酪氨酸磷酸化的能力表明菠蘿蛋白酶可激活這些細(xì)胞。以前研究菠蘿蛋白酶對脾T細(xì)胞增生的影響獲得的結(jié)果表明這些細(xì)胞被菠蘿蛋白酶激活。
實(shí)施例2在前面的實(shí)施例中我們注意到，菠蘿蛋白酶引起GA15細(xì)胞(一種T細(xì)胞雜交瘤)中蛋白質(zhì)(特別是MAP激酶)磷酸化減少。我們還觀察到當(dāng)用佛波酯和離子載體刺激時，菠蘿蛋白酶處理GA15細(xì)胞導(dǎo)致IL-2，IL-4和IFN-γ減少。另外，我們還觀察到當(dāng)提供更多的生理刺激(即分別經(jīng)T-細(xì)胞受體提供信號和經(jīng)CD28提供共同刺激信號的αCD3e和αCD28)時，菠蘿蛋白酶處理正常鼠脾T-細(xì)胞引起IL-2，IL-4和IFN-γ同樣減少。綜合起來，這些資料表明酪氨酸磷酸化的減少與細(xì)胞因子生產(chǎn)的減少相關(guān)。然而，從顯示蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸化增加的圖13中所獲得的資料和在脾T-細(xì)胞增生中觀察的增加(圖10)表明菠蘿蛋白酶也刺激或激活T細(xì)胞。
我們進(jìn)行了進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)并研究了菠蘿蛋白酶對用αCD3e和αCD28刺激GA15細(xì)胞后產(chǎn)生的細(xì)胞因子mRNA的影響(前面實(shí)施例1的實(shí)驗(yàn)中研究了菠蘿蛋白酶和PMA+A23187對細(xì)胞因子生產(chǎn)的影響)。
令人感興趣的是我們觀察到了當(dāng)用菠蘿蛋白酶處理細(xì)胞并用抗-CD3e和抗-CD28 mAbs刺激時細(xì)胞因子mRNA生產(chǎn)增加(圖14)。
這種細(xì)胞因子mRNA積累的方式與在實(shí)施例1中觀察到的相反，其中當(dāng)用佛波酯加離子載體刺激時菠蘿蛋白酶減少GA15細(xì)胞中細(xì)胞因子mRNA積累。
另外，對IL-4而言細(xì)胞因子mRNA積累的差異最顯著，在用抗-CD3e和抗-CD28 mAb刺激的菠蘿蛋白酶處理的細(xì)胞中顯著更高(n＝3，p＜0.05)(前面在用PMA+A23187刺激的GA15細(xì)胞中菠蘿蛋白酶引起IL-4 mRNA積累明顯更低(n＝3，p＜0.05)。對上面所述的這種不同結(jié)果的一個可能的解釋是在GA15細(xì)胞中，菠蘿蛋白酶處理抑制了直接由PMA+A23187刺激的信號途徑，但能增加與細(xì)胞表面分子，如CD3e和CD28相聯(lián)系的可選擇的信號級聯(lián)。
菠蘿蛋白酶在小鼠體內(nèi)的效應(yīng)至此提供的資料表明菠蘿蛋白酶對T細(xì)胞有多種影響(取決于所研究的細(xì)胞類型，有刺激效應(yīng)和抑制效應(yīng))。我們已顯示了對正常脾T細(xì)胞(主要是原始的或未激活的T細(xì)胞)和T細(xì)胞雜交瘤GA15(代表激活的T細(xì)胞)酪氨酸磷酸化的不同影響。另外，當(dāng)細(xì)胞表面分子的配體用于刺激細(xì)胞時(即，抗-CD3e和抗-CD28 mAb)，菠蘿蛋白酶處理增加了GA15中細(xì)胞因子mRNA積累，但在正常脾T細(xì)胞中細(xì)胞因子mRNA減少，盡管引起這些細(xì)胞中增生增加。
由于在體外培養(yǎng)的細(xì)胞間觀察到了差異，我們接著研究了菠蘿蛋白酶對未受損的動物T細(xì)胞功能的影響。研究了菠蘿蛋白酶對在與綿羊紅血細(xì)胞(SRBC)反應(yīng)的T細(xì)胞依賴性抗性體內(nèi)模型(Weir，Handbook 0fExpermental Immunology，1-4，4th edn，Blackwell ScientificPublications，Oxford，UK(1986))中已充分描述的T細(xì)胞激活的影響。該試驗(yàn)直接測量了用SRBC抗原免疫后產(chǎn)生的對SRBC有特異性的Ab的B細(xì)胞數(shù)(即，噬斑形成細(xì)胞(PFC))。該反應(yīng)取決于SRBC特異性T細(xì)胞增生和細(xì)胞因子(特別是IL-4的生產(chǎn))。
用鹽水免疫的小鼠(對照)產(chǎn)生非常少的PFC，不管它們是用菠蘿蛋白酶還是鹽水(對照)預(yù)處理(圖15)。這表明菠蘿蛋白酶處理不引起PFC的自發(fā)生產(chǎn)。在用SRBC免疫的小鼠中，與對照動物相比施用菠蘿蛋白酶引起PFC明顯增加(n＝11，p＜0.05)(圖15)。這一結(jié)果的一個可能的解釋是菠蘿蛋白酶處理引起SRBC特異性T細(xì)胞增生增加(與在用體外脾T細(xì)胞進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)中看見的增生增加相似，圖10)，導(dǎo)致T細(xì)胞對B細(xì)胞產(chǎn)生SRBC-特異性Ab的輔助增強(qiáng)。然而，我們不能排除菠蘿蛋白酶直接刺激B細(xì)胞或一些涉及抗體反應(yīng)的其它細(xì)胞的可能性。不管涉及的到準(zhǔn)確機(jī)制，該結(jié)果表明了菠蘿蛋白酶作為佐劑的新應(yīng)用。
討論已報道菠蘿蛋白酶抑制腸細(xì)胞中諸如環(huán)AMP、環(huán)GMP和Ca2+的各種次級信使的分泌效應(yīng)。菠蘿蛋白酶的作用機(jī)制尚不清楚，但認(rèn)為其作用與細(xì)胞中環(huán)核苷酸的積累相近。
考慮到菠蘿蛋白酶對腸細(xì)胞的影響，第二信使和蛋白質(zhì)磷酸化在這些事件中所起的作用，我們研究了菠蘿蛋白酶是否能抑制其它細(xì)胞中的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)。具體地說，我們檢查了菠蘿蛋白酶對肌醇途徑和為細(xì)胞因子(IL-2，IL-4和IFN-γ)生產(chǎn)和T-細(xì)胞增生所需要的酪氨酸磷酸化的影響。我們假定，如果菠蘿蛋白酶影響細(xì)胞中的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，那么這種抑制就會伴隨著T細(xì)胞不能產(chǎn)生細(xì)胞因子、主要自泌型生長因子和增生。
結(jié)果表明，當(dāng)用佛波酯和鈣離子載體及抗表面分子的抗體刺激時，菠蘿蛋白酶能抑制或刺激蛋白質(zhì)的酪氨酸磷酸化。我們鑒定的一個受影響的蛋白質(zhì)推定為MAPK(分裂素激活的蛋白激酶)。一些觀察結(jié)果支持我們推斷的鑒定1)在用佛波酯和鈣離子載體刺激T細(xì)胞時，MAPK變成磷酸化，且在T細(xì)胞受體與共同刺激分子連接時也磷酸化。
2)與42kda的文獻(xiàn)值相對應(yīng)的42kda蛋白質(zhì)在用佛波酯和離子載體刺激GA15細(xì)胞時磷酸化。當(dāng)用菠蘿蛋白酶處理細(xì)胞時該蛋白質(zhì)不磷酸化或磷酸化顯著減少。
3)用特異性抗-MAPK抗體免疫印跡導(dǎo)致識別42kda蛋白質(zhì)帶。
4)免疫印跡顯示菠蘿蛋白酶引起42kda蛋白質(zhì)電泳遷移率延遲，這是MAPK磷酸化的特征。
由于菠蘿蛋白酶對酪氨酸磷酸化和MAPK的抑制效應(yīng)，我們假定這種抑制可能與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)減少相聯(lián)系。MAPK對IL-2生產(chǎn)較重要，因?yàn)樗芰姿峄饎覫L-2轉(zhuǎn)錄所需的其它蛋白質(zhì)(如C-Jun)。因此，我們試驗(yàn)了菠蘿蛋白酶抑制鼠脾T細(xì)胞IL-2生產(chǎn)的能力。令人感興趣的是，用菠蘿蛋白酶預(yù)處理的T細(xì)胞在用抗CD3e mAb和CD28 mAb刺激后產(chǎn)生的IL-2比僅用PBS預(yù)處理的T細(xì)胞明顯較少。
菠蘿蛋白酶作用的準(zhǔn)確機(jī)制尚不了解。很可能是經(jīng)過抑制酪氨酸激酶活性或經(jīng)過刺激磷酸酶引起蛋白質(zhì)脫磷酸化(例如激活CD45)來抑制酪氨酸磷酸化。
不論其作用機(jī)制如何，已報道蛋白質(zhì)酪氨酸激酶活性的調(diào)控劑具有免疫抑制特性(June等，Proc.Natl.Acad.Sci，USA，87,7722-7726,1990)。已顯示除莠霉素A抑制抗原受體-刺激的T細(xì)胞激活的早期生化事件并且與蛋白質(zhì)酪氨酸激酶活性的抑制相關(guān)。然而，除莠霉素不能抑制佛波酯和離子載體的刺激效應(yīng)。菠蘿蛋白酶的效應(yīng)與以前報道的除莠霉素A的效應(yīng)的區(qū)別在于菠蘿蛋白酶能抑制T細(xì)胞受體的刺激效應(yīng)(在抗體連接實(shí)驗(yàn)中證實(shí))和第二信使的效應(yīng)(佛波酯和離子載體)。
菠蘿蛋白酶具有不同于納巴霉素的效應(yīng)，后者也報道具有免疫抑制特性。與納巴霉素不同，菠蘿蛋白酶抑制MAP激酶的酪氨酸磷酸化(Chung等，Cell69，1227-1236，1992)。另一種免疫抑制劑環(huán)孢菌素A抑制鈣調(diào)磷酸酯，也明顯不同于菠蘿蛋白酶的作用。
由于除莠霉素和納巴霉素抑制蛋白質(zhì)酪氨酸活性和信號轉(zhuǎn)錄的能力，建議將它們用作免疫抑制劑。在本試驗(yàn)中，菠蘿蛋白酶顯示出抑制T細(xì)胞的酪氨酸磷酸化，因此可推斷菠蘿蛋白酶也可具有作為免疫抑制劑的潛力。
除莠霉素A也顯示出在許多細(xì)胞系中誘導(dǎo)分化，在一個例子中，與蛋白質(zhì)酪氨酸激酶活性的抑制相關(guān)(Kondo等，J.Cell.Biol.，190，285-293，1989)。
上面討論的結(jié)果表明了菠蘿蛋白酶的許多潛在應(yīng)用。菠蘿蛋白酶影響T細(xì)胞中酪氨酸磷酸化方式的事實(shí)表明由這些信號機(jī)制引起的細(xì)胞事件可經(jīng)過使用菠蘿蛋白酶來操縱。另外，由于菠蘿蛋白酶對不同哺乳動物細(xì)胞類型的不同效應(yīng)以及在所有這些細(xì)胞酪氨酸磷酸化中的重要性，菠蘿蛋白酶能調(diào)節(jié)在大范圍細(xì)胞中由信號機(jī)制引發(fā)的細(xì)胞事件。
除了菠蘿蛋白酶對酪氨酸磷酸化的影響外，我們發(fā)現(xiàn)菠蘿蛋白酶處理T細(xì)胞能修飾細(xì)胞表面受體以增加與配體的結(jié)合。以前，認(rèn)為菠蘿蛋白酶僅經(jīng)過裂解表面受體影響T細(xì)胞(Hale和Haynes，(1992)出處同上)。因此，我們相信我們已發(fā)現(xiàn)了另外兩個機(jī)制(除了裂解細(xì)胞表面分子外)，菠蘿蛋白酶以該機(jī)制影響T細(xì)胞(即修飾酪氨酸磷酸化和修飾特異性細(xì)胞表面受體以增加與其生理學(xué)配體的結(jié)合)。
基于這些結(jié)果，相信菠蘿蛋白酶可用于修飾下面的細(xì)胞過程修飾細(xì)胞因子的生產(chǎn)我們有了菠蘿蛋白酶能刺激(圖14)或抑制(圖7，8和9)T細(xì)胞中細(xì)胞因子生產(chǎn)的直接證據(jù)。使用菠蘿蛋白酶刺激細(xì)胞因子生產(chǎn)的潛在應(yīng)用包括作為免疫受損個體或感染了寄生蟲/病原體的患者的免疫增強(qiáng)劑和作為疫苗(其直接證據(jù)見圖15)或化療的佐劑。使用菠蘿蛋白酶抑制細(xì)胞因子生產(chǎn)的潛在應(yīng)用包括作為防止移植后組織排斥和防止自身免疫反應(yīng)的免疫抑制劑。菠蘿蛋白酶也可以具有作為防止毒性攻擊的應(yīng)用(個體的炎癥性細(xì)胞因子生產(chǎn)是毒性攻擊的重要原因)。包括MAP激酶的蛋白質(zhì)的磷酸化據(jù)認(rèn)為在毒性攻擊中是重要的。已證實(shí)酪氨酸激酶抑制劑抑制體內(nèi)膿毒休克(Novogrodsky等，Science，2641319-1322(1994))。同樣，菠蘿蛋白酶可用于防止過敏反應(yīng)。接觸過敏原后細(xì)胞釋放炎癥性細(xì)胞因子和其它細(xì)胞產(chǎn)物，如組胺。導(dǎo)致細(xì)胞分泌炎癥產(chǎn)物的信號傳遞級聯(lián)涉及酪氨酸磷酸化。
刺激T細(xì)胞增生或分化我們有菠蘿蛋白酶能刺激正常脾T細(xì)胞增生的直接證據(jù)(圖10)。由于隨著原始T細(xì)胞的增生，它能分化成特定類型的產(chǎn)細(xì)胞因子的細(xì)胞這一事實(shí)，我們相信菠蘿蛋白酶也可以影響這一分化過程。使用菠蘿蛋白酶刺激T細(xì)胞增生的潛在應(yīng)用與增加細(xì)胞因子生產(chǎn)的應(yīng)用一樣。然而，除了增加可導(dǎo)致更多細(xì)胞能產(chǎn)細(xì)胞因子的T細(xì)胞增生外，還有更多的細(xì)胞提供細(xì)胞-細(xì)胞相互作用，它除了細(xì)胞因子生產(chǎn)外，還是免疫反應(yīng)的關(guān)鍵成份。促進(jìn)細(xì)胞分化的另一優(yōu)勢是在白血病或T細(xì)胞癌中，其中T細(xì)胞癌起因于未分化的T細(xì)胞群體增加(N.B.我們未期望菠蘿蛋白酶能刺激異常T細(xì)胞的增生，因?yàn)樵贕A15細(xì)胞，(一種T細(xì)胞雜交瘤)中產(chǎn)生的資料證實(shí)菠蘿蛋白酶抑制這些細(xì)胞的增生)。
防止T細(xì)胞死亡菠蘿蛋白酶引起正常T細(xì)胞增生(圖10)的一個可能的解釋是它防止程序化的細(xì)胞死亡(細(xì)胞程序死亡)。細(xì)胞死亡的減少導(dǎo)致更多的細(xì)胞變得能摻入3H-TdR(用于測量增生)。細(xì)胞程序死亡是細(xì)胞受刺激破壞其自身的DNA并死亡的特定事件。在大多數(shù)免疫反應(yīng)中，這是必須的事件(防止過多的細(xì)胞積累)。但在某些情況下也有免疫抑制后后，如在HIV感染和老化中(即過多細(xì)胞死亡，剩余的細(xì)胞不足以抵抗感染)(Perandones等，J.Immunol.1513521-3529(1993))。由于細(xì)胞程序死亡的起始依賴于特定的細(xì)胞信號事件，菠蘿蛋白酶影響酪氨酸磷酸化(它可能涉及刺激或防止細(xì)胞程序死亡)的證據(jù)(圖13a)也支持菠蘿蛋白酶防止細(xì)胞程序死亡的可能應(yīng)用。
防止寄生蟲/病原菌在細(xì)胞中的侵入和存活寄生蟲和病原菌的侵入及隨后在細(xì)胞中存活取決于這些生物利用宿主細(xì)胞信號傳遞途徑(Bliska等，Cell.73903-920(1993))。具體地說，已證實(shí)沙門氏菌磷酸化MAP激酶，MAP激酶使細(xì)菌經(jīng)巨噬細(xì)胞變成內(nèi)谷體(Galan等，Nocture 357588-589(1992))。然后細(xì)菌增生并破壞細(xì)胞。由于已表明菠蘿蛋白酶修飾宿主信號傳遞途徑(圖13a)，特別是抑制(MAP激酶)酪氨酸磷酸化(圖2)，因此我們相信菠蘿蛋白酶的另一潛在應(yīng)用是抑制寄生蟲/病原菌侵入或其在細(xì)胞中的存活。
權(quán)利要求
1.菠蘿蛋白酶在制備用于調(diào)節(jié)依賴于肌醇磷酸蛋白激酶和/或蛋白磷酸酶的細(xì)胞內(nèi)信號途徑之試劑中的應(yīng)用。
2.如權(quán)利要求1所要求的應(yīng)用，其中信號途徑依賴于肌醇磷酸。
3.如權(quán)利要求1或2中所要求的應(yīng)用，其中該試劑調(diào)節(jié)控制細(xì)胞生長和增生的途徑。
4.如權(quán)利要求3中所要求的在制備用于減少或防止細(xì)胞生產(chǎn)生長因子之試劑中的應(yīng)用。
5.如權(quán)利要求4中所要求的在制備用于防止形成MAP激酶之試劑中的應(yīng)用。
6.菠蘿蛋白酶在用于治療或控制由肌醇磷酸，蛋白激酶和/或蛋白磷酸酶介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)介導(dǎo)的疾病之試劑的制備中的應(yīng)用。
7.菠蘿蛋白酶在用于調(diào)節(jié)細(xì)胞因子生產(chǎn)的試劑之制備中的應(yīng)用。
8.如權(quán)利要求7所要求的應(yīng)用，其中的試劑刺激細(xì)胞因子生產(chǎn)。
9.如權(quán)利要求8所要求的應(yīng)用，其中的試劑用作疫苗的免疫增強(qiáng)劑和/或佐劑。
10.權(quán)利要求7中所要求的應(yīng)用，其中的試劑抑制細(xì)胞因子生產(chǎn)。
11.權(quán)利要求10中所要求的應(yīng)用，其中的試劑是免疫抑制劑。
12.權(quán)利要求11中所要求的應(yīng)用，其中的試劑用于防止或治療組織排異，或防止自身免疫反應(yīng)。
13.權(quán)利要求10中所要求的應(yīng)用，其中的試劑用于防止或治療毒性攻擊。
14.菠蘿蛋白酶在制備用于治療或防止自身免疫疾病或受體產(chǎn)生的移植排異之試劑中的應(yīng)用。
15.權(quán)利要求14中所要求的應(yīng)用，其中自身免疫疾病是多處硬化或類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。
16.菠蘿蛋白酶在制備用于防止或治療毒性攻擊之試劑中的應(yīng)用。
17.菠蘿蛋白酶在制備用作疫苗佐劑的試劑中的應(yīng)用。
18.菠蘿蛋白酶在制備用于治療癌癥之試劑中的應(yīng)用。
19.菠蘿蛋白酶在制備用于防止或治療過敏的試劑中的應(yīng)用。
20.一種治療或防止自身免疫疾病的方法，該方法包含給病人施用有效量的菠蘿蛋白酶。
21.一種治療或防止移植排異的方法，該方法包含給病人施用有效量的菠蘿蛋白酶。
22.一種治療或防止毒性攻擊的方法，該方法包含給病人施用有效量的菠蘿蛋白酶。
23.一種誘導(dǎo)免疫刺激的方法，該方法包含給病人施用有效量的菠蘿蛋白酶和疫苗。
24.菠蘿蛋白酶在制備防止細(xì)胞程序死亡之試劑中的應(yīng)用。
25.一種防止細(xì)胞程序死亡的方法，該方法包含給病人施用有效量的菠蘿蛋白酶。
26.菠蘿蛋白酶在制備用于抑制、防止或治療寄生蟲和/或病原菌感染的試劑中的應(yīng)用。
27.一種抑制、防止或治療寄生蟲和/或病原菌感染的方法，該方法包含給病人施用有效量的菠蘿蛋白酶。
28.一種治療癌癥的方法，該方法包含給病人施用有效量的菠蘿蛋白酶。
29.一種防止或治療過敏的方法，該方法包含給病人施用有效量的菠蘿蛋白酶。
全文摘要
菠蘿蛋白酶，一種來自菠蘿莖的酶混合物已發(fā)現(xiàn)是一種細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的調(diào)節(jié)劑，特別是其中肌醇磷酸起作用的途徑中的調(diào)節(jié)劑，因此在治療由這些細(xì)胞內(nèi)信號途徑介導(dǎo)的各種疾病和癥狀中有用。
文檔編號A61P31/04GK1151119SQ9519376
公開日1997年6月4日 申請日期1995年6月26日 優(yōu)先權(quán)日1994年6月24日
發(fā)明者T·L·邁諾特, C·英沃達(dá) 申請人:科特克斯有限公司