專利名稱：：博代氏桿菌所產(chǎn)皮膚壞死毒素和類毒素的純化方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及預(yù)防豬傳染病的藥物。更具體地說，本發(fā)明涉及一種博代氏桿菌所產(chǎn)皮膚壞死毒素的改良的類毒素，一種含有該類毒素和巴斯德氏菌所產(chǎn)皮膚壞死毒素的類毒素的類毒素混合物以及該類毒素的制備方法。
背景技術(shù)：
：萎縮性鼻炎(以下簡稱AR)是一種豬慢性呼吸道疾病，具有極強(qiáng)的傳染性，其原發(fā)癥狀有鼻甲萎縮，鼻發(fā)育不全，鼻出血，鼻部彎斜，并引起其他呼吸道疾病等等。已知該病由產(chǎn)毒的支氣管敗血性博代氏桿菌(以下簡稱“Bb”)和產(chǎn)毒的出血敗血性巴斯德氏菌(以下簡稱“Pm”)引起，這兩種菌可使上呼吸道粘膜感染。Bb作為一種粘附因子，具有血紅細(xì)胞凝集作用和積聚作用，因而容易附著于鼻粘膜，而Pm不具這樣的粘附因子，因此不能由其自身定殖。所以，為了建立Pm感染，在鼻粘膜部位引起損害的一種易感因子是必須的，而這樣一種有代表性的易感因子就是Bb。已知與引起鼻粘膜損害有關(guān)的病原學(xué)因子是一種氣管細(xì)胞毒素和一種皮膚壞死毒素。在一個(gè)實(shí)驗(yàn)性感染試驗(yàn)中，先用Bb使豬感染，幾天后接著用Pm進(jìn)行鼻內(nèi)感染，結(jié)果引發(fā)如在一個(gè)牧場里所觀察到的那樣嚴(yán)重的AR。博代氏桿菌屬包括百日咳博代氏桿菌、付百日咳博代氏桿菌、支氣管敗血性博代氏桿菌以及avium博代氏桿菌等。這些桿菌產(chǎn)生各種具有生物學(xué)活性的物質(zhì)。Bb皮膚壞死毒素(以下簡稱“BbT”)就是這樣的物質(zhì)之一，可以由任一種博代氏桿菌產(chǎn)生。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，具有諸如出血壞死活性，引起鼻甲萎縮的活性，引起鼻發(fā)育不全的活性，致死活性，平滑肌血管收縮活性，引起局部血循環(huán)阻斷活性，引起脾萎縮活性，抑制抗體產(chǎn)生的活性等生物活性的BbT在博代氏桿菌病中起重要作用，而且還發(fā)現(xiàn)，BbT在小豬肺炎病灶形成過程中也起著重要作用(RoopII，R.M.eta1.，Infect.Immun.，55，p.217-222(1987))。另一方面，一部分出血壞死性巴斯德氏菌，或一部分非典型巴斯德氏菌可產(chǎn)生Pm皮膚壞死毒素(以下簡稱“PmT”)。業(yè)已證實(shí)，具有諸如出血壞死活性，致鼻甲萎縮的活性，致發(fā)育不全的活性，致死活性，致局部血循環(huán)阻斷的活性和致脾萎縮的活性等生物活性的PmT，在由產(chǎn)毒性Pm引起的疾病方面起重要作用。而且還發(fā)現(xiàn)，PmT與由產(chǎn)毒性Pm所致豬肺炎病灶的形成密切相關(guān)(Iwatsu，S.andSawada，T.；Jpn.J.vet.Sci.，50，p.1200-1206(1988))。雖然BbT和PmT二者都不被分泌入培養(yǎng)基中，而是在菌細(xì)胞中積蓄起來，但它們在長期的培養(yǎng)后，由于溶菌作用，可以從菌細(xì)胞內(nèi)釋放出來，進(jìn)入培養(yǎng)基上清液中。在體內(nèi)過程中，由于溶菌作用從菌細(xì)胞中釋放出來的皮膚壞死毒素可影響生命體。在上面提及的情況下，皮膚壞死毒素在生命體中的保護(hù)作用尚不清楚，為了闡明這種保護(hù)作用的機(jī)理，需要開發(fā)一種大規(guī)模制備皮膚壞死毒素的方法和開發(fā)一種皮膚壞死毒素的類毒素，用于預(yù)防該病。但是，皮膚壞死毒素由于其自身的下述性質(zhì)一直難于純化對熱的不穩(wěn)定性，在純化操作進(jìn)行過程中容易引起自身凝集，與菌細(xì)胞衍生的諸如脂質(zhì)、酸性蛋白和疏水物質(zhì)等這樣一類物質(zhì)形成復(fù)合物。而且，鑒于BbT和PmT盡管具有相似的生物活性但沒有免疫學(xué)交叉反應(yīng)性，從獸醫(yī)和豬飼養(yǎng)業(yè)觀點(diǎn)出發(fā)，人們一直熱切希望開發(fā)一種安全、有效的BbT-PmT類毒素混合物。迄今為止，用于從含細(xì)菌皮膚壞死毒素的溶液中，特別是從博代氏桿菌菌細(xì)胞提取物中部分純化皮膚壞死毒素的已知方法包括采用離子交換色譜的純化方法(Kume，K.etal.，Infect.Immun.，52(4)，p.370-377(1986))。但是，這種方法的缺點(diǎn)是重復(fù)性差。我們也了解到一種利用透析、蔗糖梯度超速離心和凝膠過濾色譜部分純化皮膚壞死毒素的方法(Endoh，M.etal.，Microbiol.Immunol.，30，(7)，p.659-673(1986))。但這一方法同樣顯示重復(fù)性差的缺點(diǎn)，況且，盡管采用了多步純化步驟，仍不能提供足夠純度的純化。另一個(gè)例子是采用以核酸去除劑、陰離子交換色譜和羥基磷灰石吸附色譜處理的純化方法(Horiguchi，Y.etal.，Microbiol.Pathogen.，6，P.361-368(1989))。但是，這一純化方法同樣有其不足，在于它需要一種昂貴的試劑，即核酸去除劑，而且涉及多步純化步驟。還有一種采用核酸去除試劑、透析和陽離子交換色譜的純化方法(Horiguchi，Y.etal.，F(xiàn)EMSMicrobiol.Letters，66，p.39-44(1990))。雖然這種純化方法具有高重復(fù)性，并能提供較高純度的皮膚壞死毒素，但像在上一個(gè)方法中指出的那樣，它也需要一種昂貴的試劑。還有一個(gè)實(shí)例是采用鹽析和染料配體親和色譜的純化方法(ZhangY.L.andSekuraR.D.，Infect.Immun.，59(10)，p.3754-3759(1991))。雖然這種純化方法顯示出高重復(fù)性，但其不足是提供的純化純度不充分。迄今報(bào)告的滅活A(yù)R疫苗有三個(gè)類型，即滅活的Bb單價(jià)疫苗，滅活的Pm單價(jià)疫苗以及滅活的Bb/Pm雙價(jià)疫苗，每一種疫苗都已加以研究，或已經(jīng)投入實(shí)際應(yīng)用。滅活的Bb疫苗包括含有由經(jīng)甲醛、戊二醛等滅活的無致病力的一種細(xì)菌，并添加鋁凝膠或油佐劑的疫苗(Goodnow，R.A.Vet.Med.SmallAnim.Clin.，72，P.1210-1212(1977)；Nakase，Y.etal.，Proc.Int.PigVet.Soc.Congr.，8，(1976)；Giles，C.J.andSmith，I.M.，Vet.Bull.(London)，53，p.327-338(1983))。還發(fā)現(xiàn)，存在于Bb外膜上并具有腺苷酸環(huán)化酶活性的一種68KDa蛋白，顯示預(yù)防萎縮性鼻炎的作用(MontarazJ.A.etal.，Infect.Immun.，47，p.744-755(1985))。還了解到一種組成疫苗，含一種Bb產(chǎn)生的纖維狀血凝素作為主要成份(Hansen，G.R.etal.；InAtrophicrhinitisinpigs(Ed.Peterson，K.B.andNielsen，N.C.)CommunicationoftheEuropeanCommunities，Luxembourg，p.89-97(1983)，andOhgitani，T.etal.，Vaccine，9，p.653-658(1991))另據(jù)報(bào)道，為了提供一種抗毒素而添加皮膚壞死毒素的一種疫苗并不是有效的(Soderlind，O.andBergstrom，G.Int.pigVet.Sci.Congr.，p.175(1984)；Marel，C.M.vonderetal.，Int.pigVet.Sci.Congr.，p.170(1984))。另一方面，一種滅活的Pm單純疫苗含有Pm類毒素(Pederson，K.B.andBarfod，K.Nord.Vet.Med.，31，p.293-302(1982)；Foged，N.F.etal.，Vet.Rec.，125，p.7-11(1989))，這種疫苗業(yè)已得到研究，或已投入實(shí)際應(yīng)用。Bb/Pm聯(lián)合滅活疫苗包括(1)、無致病力的Bb與無致病力的能產(chǎn)生PmT的PmD型細(xì)菌的混合物(該混合物還添加不能產(chǎn)生PmT的細(xì)菌)，或Bb與PmT類毒素的混合物(Barford，K.andPederson，K.B.，Nord.Vet.Med.，36，p.337-345(1984)；Baalsrud，K.J.，ActaVet.Scand.，28，p.305-311(1987))；deJong，M.F.etal.，Vet.Quart.9，p.49-59(1987))；Kobisch，M.andPennings，A.Vet.Rec.，124，p.57-61(1989))，這種混合疫苗只是為了預(yù)防AR的目的；(2)、無致病力的Bb與無致病力的可產(chǎn)生PmT的PmD型細(xì)菌以及無致病力的PmA型細(xì)菌的混合物(Ostle，A.G.etal.，Vet.Med.p.722-775(1986))，這種混合疫苗的目的是預(yù)防AR和肺炎；(3)、無致病力的Bb與無致病力的PmA型細(xì)菌、無致病力的insidiosa丹毒絲菌以及PmT類毒素的混合物(Jayappa，H.etal.Int.PigVet.Soc.Congr.，p.44(1988))。這種混合疫苗的目的是預(yù)防其他疾病以及AR和肺炎。這三種疫苗都已投入實(shí)際應(yīng)用。鑒于BbT在Bb感染引起的鼻甲萎縮和肺炎病灶形成方面起著重要作用，ZoopII，R.M.等人指出需要一種BbT類毒素(Infect.Immun.，55，p.217-222(1987))。然而，他們從未提到將BbT和PmT類毒素聯(lián)合使用。Chanter，N等人已經(jīng)提出，由于BbT和PmT協(xié)同作用誘導(dǎo)的豬鼻粘膜損害可創(chuàng)造有利于Bb和Pm繁殖的環(huán)境，所以PmT類毒素與Bb的這種重要毒素的結(jié)合應(yīng)用更為有效(Res.Vet.Sci.，47，p.48-53(1989))。但是，含具有BbT活性組分的疫苗的應(yīng)用至今尚未成功地增強(qiáng)BbT中和抗體的產(chǎn)生(Soderlind，O.andBergstrom，G.，Proc.Int.PigVet.Sci.Congr.，p.175(1984)；Marel，C.M.vonder.etal.，Proc.Int.PigVet.Sci.Congr，p.170(1984))。另一方面，Nakai等人透露，在接受高純度BbT類毒素的豬和小鼠中，中和抗體的產(chǎn)生得到增強(qiáng)(The111thJapanVeterinarySociety，lectureabstract，p.183(1991))。但是，他們也從未提到該BbT類毒素與PmT類毒素的聯(lián)合應(yīng)用。本發(fā)明的公開內(nèi)容為了找到一種有效純化皮膚壞死毒素(dermonecrotictoxin)的方法，本發(fā)明的發(fā)明人作了認(rèn)真的研究，作為研究結(jié)果，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)(1)、用下面的純化方法能容易獲得回收率較高、內(nèi)毒素含量較低的部分純化的皮膚壞死毒素即采用一種以直接硫酸化法作硫酸化處理的色譜凝膠，或一種與硫酸化后的分子共價(jià)結(jié)合的色譜凝膠，例如，纖維素硫酸酯凝膠，肝素固定化的吸附凝膠或硫酸化的烷基固定化吸附凝膠，對含皮膚壞死毒素的溶液，例如博代氏桿菌(Bordetella)提取物作色譜分離；(2)、對上述用經(jīng)直接硫酸化法作硫酸化處理的色譜凝膠或與硫酸化后的分子共價(jià)結(jié)合的色譜凝膠獲得的部分純化的皮膚壞死毒素，進(jìn)一步作透析、陽離子交換色譜和凝膠過濾色譜分離，能容易地獲得回收率較高的高純度的皮膚壞死毒素；(3)與未經(jīng)純化的博代氏菌細(xì)胞提取物中的皮膚壞死毒素相比，采用經(jīng)直接硫酸化法作硫酸化處理的色譜凝膠或與硫酸化分子共價(jià)結(jié)合的色譜凝膠作色譜分離所得的部分純化的皮膚壞死毒素的免疫反應(yīng)性大大改善。而且，本發(fā)明人業(yè)已證實(shí)，用化學(xué)處理法所獲得的皮膚壞死毒素級(jí)分的減毒產(chǎn)物能有效地和安全地用于預(yù)防豬的萎縮性鼻炎，該皮膚壞死毒素組分的制備方法是將該博代氏桿菌菌細(xì)胞提取物與借助直接硫酸化法硫酸化的色譜凝膠或共價(jià)結(jié)合了硫酸化分子的色譜凝膠相接觸，以便使該皮膚壞死毒素吸附到凝膠上，并與雜質(zhì)分開，接著將這種皮膚壞死毒素從凝膠上洗脫下來。這樣，本發(fā)明得以完成。為了建立豬的Pm感染，Bb的預(yù)先感染作為引起豬鼻粘膜部位損傷的一種因素是必須的。凡是用BbT抗毒素免疫的豬，由Bb和Pm感染引起的鼻粘膜上的Pm克隆和鼻甲萎縮都得到減輕。然而，由于可以看到不同個(gè)體之間效果的明顯波動(dòng)，據(jù)透露，單用BbT類毒素對AR滅活疫苗來說，是不夠的?；谏厦嫣岬降难芯拷Y(jié)果，為了開發(fā)一種類毒素混合物，本發(fā)明人進(jìn)行了認(rèn)真的研究，結(jié)果，已經(jīng)找到一種類毒素混合制劑能有效、安全地用于預(yù)防豬的萎縮性鼻炎，該類毒素混合制劑的制備方法是將從用纖維素硫酸酯凝膠等分離方法自博代氏桿菌菌細(xì)胞提取物中，純化至比活性達(dá)37,000MND/mg蛋白或更高活性的毒素中分離得到的類毒素，與從由產(chǎn)毒的Pm所產(chǎn)生的PmT分離得到的類毒素相混合。這樣就形成一種類毒素混合制劑，即本發(fā)明的第二實(shí)施方案。本文所用的最小壞死劑量(MND)是指這樣一個(gè)劑量單位1MND規(guī)定為在1μg/ml的脂多糖(例如，從血清型O111B4大腸桿菌衍生的一種脂多糖)存在下，給豚鼠皮內(nèi)注射后一天，產(chǎn)生一個(gè)不小于5mm直徑壞死斑所需要的最小劑量的皮膚壞死毒素。附圖的簡要描述圖1顯示本發(fā)明皮膚壞死毒素純化方法的一個(gè)步驟中的色譜圖。圖2顯示本發(fā)明皮膚壞死毒素純化方法的一個(gè)步驟中的色譜圖。圖3顯示本發(fā)明皮膚壞死毒素純化方法的一個(gè)步驟中的色譜圖。圖4顯示本發(fā)明皮膚壞死毒素的純化方法所得皮膚壞死毒素組分的分析結(jié)果。圖5顯示根據(jù)本發(fā)明所獲得的類毒素在小鼠模型上的藥效試驗(yàn)結(jié)果。圖6顯示根據(jù)本發(fā)明所獲得的類毒素在懷孕母豬模型上的藥效試驗(yàn)結(jié)果。圖7顯示對BbT中和抗體保護(hù)作用方面的研究結(jié)果。實(shí)施本發(fā)明的最佳方法本發(fā)明提供一種部分純化皮膚壞死毒素的方法，該方法包括以下步驟將含皮膚壞死毒素的溶液與用直接硫酸化法硫酸化了的色譜凝膠，或共價(jià)結(jié)合了硫酸化分子的色譜凝膠相接觸，以使該皮膚壞死毒素吸附到凝膠上，然后將其從凝膠上洗脫下來。本發(fā)明還提供一種從采用該部分純化皮膚壞死毒素的方法純化所得BbT衍生的BbT類毒素，以及一種用以下方法制備的類毒素混合制劑將該BbT類毒素與從產(chǎn)毒性Pm所產(chǎn)生的PmT衍生的一種類毒素相混合。該類毒素混合制劑對預(yù)防豬的萎縮性鼻炎是安全、有效的。本發(fā)明中用作起始材料的含皮膚壞死毒素的溶液包括從Bb、百日咳博代氏桿菌和付百日咳博代氏桿菌得到的菌細(xì)胞提取物。本發(fā)明的起始材料還包括從采用基因工程技術(shù)表達(dá)BbT的細(xì)胞所得的提取物。本發(fā)明中所用的優(yōu)選提取物是從Bb得到的菌細(xì)胞提取物。以通常的方式，用下列方法培養(yǎng)Bb用博-讓二氏培養(yǎng)基(Bordet-Gengou)和麥康基氏培養(yǎng)基(Macconkey)等瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)，或用像蛋白胨培養(yǎng)基(Horiguchi，Yetal.，Microb.Pathogen.，6，p.361-368(1989))、Cohen-Willer培養(yǎng)基和Stenner-Scholte培養(yǎng)基等這樣一類液體培養(yǎng)基作靜止培養(yǎng)、搖床培養(yǎng)和充氣旋轉(zhuǎn)器培養(yǎng)。用Conradi棒等器具把瓊脂培養(yǎng)基上的細(xì)菌培養(yǎng)物混懸于纖維素硫酸酯凝膠的起始緩沖液中。在用離心法回收菌細(xì)胞后，液體培養(yǎng)基中的細(xì)菌培養(yǎng)物，被混懸于纖維素硫酸酯凝膠的起始緩沖液中?？捎孟铝蟹椒兓@得的菌細(xì)胞懸液Kume，K等的方法(Infect.Immun.52(4)，p.370-377(1986))；Endoh，M等的方法(Microbiol.Immul.，30(7)，P.659-673(1986))；Horiguchi，Y等的方法(Microbial.Pathogen.，6，p.361-368(1988)或FEMSMicrobiol.Letters，66，p.39-44(1990))；ZhangY.L和SekuraR.D.的方法(Infect.Immun.，59(10)，p.3754-3759(1991))；或用直接硫酸化法進(jìn)行硫酸化后的色譜凝膠如纖維素硫酸酯凝膠或共價(jià)結(jié)合了硫酸化分子的凝膠，作吸附色譜分離。但是，根據(jù)本發(fā)明，最優(yōu)選的實(shí)施方案是將這種菌細(xì)胞懸浮液用直接硫酸化法硫酸化后的凝膠或與硫酸化分子共價(jià)結(jié)合的凝膠作吸附色譜分離純化。菌細(xì)胞懸液經(jīng)超聲處理、酶處理、擠壓和反復(fù)凍融等處理，以制備菌細(xì)胞勻漿，再用離心法或膜過濾法除去細(xì)胞碎片。可直接地，或進(jìn)一步經(jīng)使用核酸去除劑、脫鹽和超速離心等作的純化的預(yù)處理后，將如此所得的細(xì)菌提取物用于本發(fā)明的方法。根據(jù)本發(fā)明的方法，預(yù)處理并不總是必要的，而是菌細(xì)胞提取物可直接地用具有硫酸化分子作配體的吸附凝膠或經(jīng)直接硫酸化法硫酸化了的吸附凝膠作吸附色譜分離，從而使該純化操作過程十分簡單和方便。現(xiàn)就本發(fā)明所述的、以經(jīng)直接硫酸化法硫酸化了的色譜凝膠或共價(jià)結(jié)合了硫酸化分子的色譜凝膠舉例說明如下本發(fā)明所用的“經(jīng)直接硫酸化法硫酸化的色譜凝膠”是指其凝膠本身在如吡啶這樣的有機(jī)溶劑存在下，經(jīng)由例如酯鍵，與氯磺酸和硫酸酐這樣的硫酸化劑直接反應(yīng)而被硫酸化的一種色譜凝膠(例如纖維素)，典型地包括硫酸酯被導(dǎo)入由晶纖維素或晶形區(qū)纖維素和非晶形區(qū)纖維素組成的球形纖維素中的纖維素硫酸酯凝膠。所得的纖維素硫酸酯保留了起始物的形狀，在水性溶劑中不溶，而且具有優(yōu)良的物理穩(wěn)定性，因此而適于用作色譜凝膠。這些作為起始材料的纖維素，例如以Avicel(由AsahiKaseiKogyoK.K.生產(chǎn))和CellulofineGC-15，GH-25，GC-100，GC-200(Chisso公司生產(chǎn))等商品名，易于在市場上買到。這種作為起始材料的纖維素可用上面提及的方法作硫酸化處理，某些已經(jīng)硫酸化了的纖維素，例如“SulfatedCellulofine”(Chisso公司生產(chǎn))，是可從市場上買得到的。本發(fā)明采用的“與硫酸化分子共價(jià)結(jié)合的色譜凝膠”是指與肝素(一種高度硫酸化的葡糖胺多糖)或磺丙基(一種硫酸化的烷基)或具磺基(sulfonegroup)的藍(lán)色染料通過CNBr法等共價(jià)結(jié)合的，含有諸如交聯(lián)纖維素、交聯(lián)葡聚糖或交聯(lián)瓊脂糖凝膠一類天然高分子量聚合物，或諸如親水性乙烯基聚合物或苯乙烯二乙烯基苯共聚物一類的合成高分子量聚合物的色譜凝膠，其中包括許多可從市場上買得到的產(chǎn)品。與肝素共價(jià)結(jié)合的色譜凝膠包括“肝素瓊脂糖凝膠CL-6B(“HeparinSepharoseCL-6B”)(Pharmacia公司)，“AffigelHeparinGel”(Bio-Rad公司)，“HeparinCellulofine”(SeikagakuKogyoK.K.公司)等等。與藍(lán)色染料共價(jià)結(jié)合的色譜凝膠包括“AffigelBlueGel”(Bio-Rad公司)，“AF-blueToyopearl”(TosoK.K.公司)，“BlueCellulofine”(SeikagakuKogyoK.K.公司)等等。與磺丙基共價(jià)結(jié)合的色譜凝膠包括“SP-Sephadex”(Pharmacia公司)，“SP-Toyopearl650M”(TosoK.K.公司)等等。按如下的方法，采用含硫酸基(sulfategroup)作配基的吸附凝膠或經(jīng)直接硫酸化法硫酸化的吸附凝膠，從含皮膚壞死毒素的溶液中，尤其是從博代氏桿菌菌細(xì)胞提取物中，進(jìn)行皮膚壞死毒素的純化和收集。雖然本發(fā)明以纖維素硫酸酯凝膠的應(yīng)用作為優(yōu)選實(shí)施方案加以說明，但在相似的條件下，也可使用其他的凝膠。預(yù)先用中性范圍pH(pH7-9)并具有適當(dāng)比電導(dǎo)率(雖然因凝膠種類的不同，其數(shù)值在某種程度上可有所波動(dòng)，但通常為20mS/cm或更低，一般為3-20mS/cm，較普通用的是5-20mS/cm)的緩沖液平衡纖維素硫酸酯凝膠，即為了有利于凝膠色譜的洗滌和洗脫，緩沖液的比電導(dǎo)率需要加以標(biāo)化，例如，添加了濃度范圍為0-0.2M氯化鈉的0.02M磷酸鹽緩沖液。接著做吸附操作，使皮膚壞死毒素吸附到纖維素硫酸酯凝膠上。以批式純化或柱式純化這種工業(yè)上常用的方式進(jìn)行一系列純化操作，如把皮膚壞死毒素吸附到纖維素硫酸酯凝膠上，洗滌凝膠，洗脫皮膚壞死毒素等等。采用批式純化時(shí)，把纖維素硫酸酯放入博代氏桿菌菌細(xì)胞提取物中，在溫度為0-30℃和pH范圍約7.0-9.0的條件下，緩慢攪拌混合物10-60min，以便使皮膚壞死毒素吸附到纖維素硫酸酯上。在這種情況下，在吸附操作進(jìn)行前，需要把纖維素硫酸酯作適當(dāng)?shù)臐饪s或稀釋，以便使博代氏桿菌菌細(xì)胞提取物的比電導(dǎo)率落在上面提到的范圍內(nèi)，通常為3-20mS/cm或更低些。吸附操作完成后，把提取物和凝膠的混合物裝入過濾器，并作負(fù)壓抽濾，以將凝膠與濾液分開。將具有上述固定范圍比電導(dǎo)率(通常為約3-20mS/cm，或更低)和pH約5-10的適宜緩沖液，例如添加0.1M氯化鈉的0.02M磷酸鹽緩沖液，倒入該分離的凝膠中，用負(fù)壓抽濾洗滌凝膠。然后將pH約5-10，比電導(dǎo)率高于上述固定范圍而一般低于130mS/cm(例如，優(yōu)選范圍約為22-46mS/cm)的適宜緩沖液，例如添加濃度為0.2-0.5M氯化鈉的磷酸鹽緩沖液，倒入該凝膠中，以洗脫吸附的皮膚壞死毒素。采用柱式純化時(shí)，起始材料、洗滌用緩沖液和洗脫用緩沖液的條件可以與批式純化的條件相似。本發(fā)明推薦把緩沖液的流速調(diào)整到約10ml/cm2/hr-500ml/cm2/hr。本發(fā)明的這種純化法使含皮膚壞死毒素溶液中的皮膚壞死毒素能夠特異地吸附，其提供的皮膚壞死毒素純度提高幾十倍到110倍，且皮膚壞死毒素的回收率高(40-100％)。內(nèi)毒素可引起發(fā)熱或休克一類的副反應(yīng)，在菌細(xì)胞勻漿提取物中，其與皮膚壞死毒素共存，含量很高，但它不能被吸附到纖維素硫酸酯凝膠上，因此內(nèi)毒素的含量可降低到1/30-1/800。獲得的純化皮膚壞死毒素的比活性高達(dá)4×105至3×106MND/mg蛋白，在SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳上形成一條主帶。正如上面所提到的，根據(jù)本發(fā)明的純化方法，可以以高產(chǎn)率和高純度，從含皮膚壞死毒素的起始溶液中提取所需要的皮膚壞死毒素。純化操作十分簡單，純化所用的色譜吸附劑可以自己制備，也可以低成本從市場買到，從反復(fù)使用后沒有變質(zhì)的經(jīng)濟(jì)觀點(diǎn)來看，該吸附劑也是極其令人滿意的。因此，對皮膚壞死毒素的工業(yè)化生產(chǎn)來說，本發(fā)明的純化方法是一種十分令人滿意的方法。此外，本發(fā)明的純化方法也可以與傳統(tǒng)的陽離子交換色譜和凝膠過濾色譜等純化方法結(jié)合應(yīng)用以進(jìn)一步提高純度，籍此提供比傳統(tǒng)純化方法所獲得的更為出色的結(jié)果。用本發(fā)明的方法純化的皮膚壞死毒素經(jīng)化學(xué)試劑處理后可轉(zhuǎn)變成類毒素，后者失去毒素活性而保留免疫原性。用普通的方法，例如用甲醛(Nakai，T.etal.，Infect.Immun.，46，p.429-434(1984))或戊醛(Endoh，M.etal.，Microbiol.Immunol.，30，p.659-673(1986))等試劑能將皮膚壞死毒素轉(zhuǎn)變成類毒素。為了在把該類毒素給予生命體后誘導(dǎo)體液免疫，佐劑與類毒素一同施用。所用佐劑的例子有鋁凝膠、油佐劑和皂角苷等。該類毒素顯示出比未純化的皮膚壞死毒素組分更高的免疫原性，還十分安全，這些特點(diǎn)被下面闡述的諸實(shí)施例中的資料所證實(shí)。由本發(fā)明的純化方法獲得的部分純化的皮膚壞死毒素具有高純度，并除去了大部分內(nèi)毒素，因此可用于制備動(dòng)物用疫苗。此外，在本發(fā)明的純化方法與傳統(tǒng)的純化方法聯(lián)合應(yīng)用而使該部分純化的皮膚壞死毒素的純度進(jìn)一步得到提高的情況下，該部分純化的皮膚壞死毒素也可用于制備各種試劑或藥劑，甚至可用于制備人用百日咳博代氏桿菌疫苗。大多數(shù)自然感染的Bb病例不產(chǎn)生BbT中和抗體，但具有細(xì)菌凝集作用的抗體以高比率增加，后者已被用于該病的血清學(xué)診斷。根據(jù)本發(fā)明人的觀測，在有AR出現(xiàn)的15個(gè)縣的48個(gè)農(nóng)場的327頭豬中，只有一個(gè)農(nóng)場(占2.1％)的2頭豬(占0.6％)中查出BbT中和抗體陽性。傳統(tǒng)的Bb滅活疫苗可使細(xì)菌凝集作用的抗體增加，從而干擾診斷。但是，本發(fā)明的純化法與常規(guī)純化法聯(lián)合應(yīng)用，進(jìn)一步提高BbT的純度后，可制備一種能產(chǎn)生中和抗體但不會(huì)增加具細(xì)菌凝集作用的抗體的類毒素。能夠使疫苗誘導(dǎo)的抗體和感染誘導(dǎo)的抗體之間具有血清學(xué)差別的疫苗或類毒素謂之“標(biāo)識(shí)疫苗”。例如，在無特殊病原體(SPF)的農(nóng)場里，如果出現(xiàn)任何原因引起的Bb感染而使用本發(fā)明的類毒素以防止AR，則可借助測定具有細(xì)菌凝集作用的抗體，查出被感染的豬。本發(fā)明的另一個(gè)方面是提供一種含有根據(jù)本發(fā)明的純化方法制備的BbT類毒素以及由巴斯德氏菌所產(chǎn)皮膚壞死毒素的類毒素之類毒素混合制劑。就本發(fā)明所用的PmT來說，作為起始材料的Pm菌細(xì)胞提取物包括從產(chǎn)毒性Pm或非典型巴斯德氏菌來源的菌細(xì)胞提取物(Kamp，E.M.I.E.etal.，Vet.Rec.，126，p.434-437(1990))。另外的選擇是，本發(fā)明的起始材料也包括PmT由基因工程技術(shù)表達(dá)的菌細(xì)胞之提取物。本發(fā)明所用的優(yōu)選提取物是來源于產(chǎn)毒性Pm的菌細(xì)胞提取物，產(chǎn)毒性Pm采用普通的方法加以培養(yǎng)，例如在心臟浸液培養(yǎng)基、酪蛋白胰酶大豆肉湯、Luria-Bertani培養(yǎng)基、肉浸液培養(yǎng)基等一類液體培養(yǎng)基中作靜止培養(yǎng)、搖動(dòng)培養(yǎng)或充氣旋轉(zhuǎn)器培養(yǎng)(deJong，M.F.andAkkermans，J.P.W.M.，Vet.Quart.，8，p.294-314)，或用右旋糖-淀粉培養(yǎng)基、血瓊脂培養(yǎng)基和YPC培養(yǎng)基等一類瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)(Namioka，S.andMurata，M.，CornellVet.，51，p.498-507(1961))。用Conradi棒等器具，把瓊脂培養(yǎng)基上的細(xì)菌培養(yǎng)物混懸于Tris緩沖液等中。用離心法回收菌細(xì)胞后，將液體培養(yǎng)基中的細(xì)菌培養(yǎng)物，混懸于供下面純化步驟用的適宜緩沖液中。菌細(xì)胞混懸液經(jīng)超聲處理、酶處理、擠壓和反復(fù)凍融等方式處理，以便制成菌細(xì)胞勻漿。用離心法或膜過濾法除去細(xì)胞碎片。用離子交換色譜和以能識(shí)別PmT的抗體制備的親和色譜等分離方法純化菌細(xì)胞提取物。另外的選擇是，產(chǎn)毒性Pm的培養(yǎng)物在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)24至65小時(shí)后所獲得的上清液也可作為起始材料用于純化，或者直接用于減毒處理。如此制備的皮膚壞死毒素組分用甲醛、戊醛等作解毒處理。解毒處理完成后，采用透析等方法，以磷酸鹽緩沖的生理鹽水取代緩沖液，并往里面加入佐劑?？梢约尤氲淖魟┓独ㄤX凝膠、油佐劑和皂角苷等。將濃度2倍于添加了佐劑的單價(jià)疫苗的一種抗原溶液，與另一種濃度2倍于添加了佐劑的單價(jià)疫苗的抗原溶液相混合，即可制成類毒素混合制劑。根據(jù)本發(fā)明獲得的類毒素混合制劑不但十分安全，而且還能誘導(dǎo)中和BbT和PmT的抗體，因此能保護(hù)豬免患因這二種毒素引起的鼻甲萎縮或發(fā)育不全。在下小豬前至少一周，當(dāng)以2-6周的間隔給妊娠母豬肌肉注射根據(jù)本發(fā)明得到的BbT類毒素和類毒素混合制劑兩次時(shí)，即可通過初乳提供的母體抗體防止其后代受感染。對于后來的分娩，只要在臨產(chǎn)前接種一針本發(fā)明的類毒素，即可足以建立免疫。就嚴(yán)重AR感染的農(nóng)場的情況而言，以2至6周的間隔給出生不少于7天的仔豬肌內(nèi)注射本發(fā)明的類毒素二次，也能夠有效地建立直接的保護(hù)作用。通過下面的制備方法和實(shí)例可對本發(fā)明進(jìn)行更詳細(xì)地說明，但是不應(yīng)理解為本發(fā)明僅限于此。實(shí)施例制備方法1在不高于0℃的溫度下，把氯磺酸(117克)逐滴加到吡啶(600ml)中，攪拌混勻。在氯磺酸逐滴加入后，將混合物加熱至65至70℃，往里面加入CellulofineGC-15(80g，Chisso公司生產(chǎn))，在65-70℃條件下攪拌該混合物3小時(shí)，使其反應(yīng)。反應(yīng)完成后，將混合物冷卻，加入10％氫氧化鈉水溶液，以逐漸中和該混合物。將凝膠過濾分離出來，并用0.01M磷酸鹽緩沖的生理鹽水充分洗滌凝膠，以產(chǎn)生纖維素硫酸酯凝膠。制備方法2在不高于0℃的溫度下，把氯磺酸(117克)滴加到吡啶(600ml)中，將混合物攪拌混勻。在氯磺酸逐滴加入后，將混合物加熱至65-70℃，往里面加入色譜用Avicel(80克，微晶纖維素，AsahiKaseiKogyoK.K.公司生產(chǎn))，攪拌期間混合物溫度保持在65-70℃4小時(shí)。反應(yīng)完成后，將混合物冷卻，加入10％氫氧化鈉水溶液，以中和該混合物。過濾分離出凝膠，并用0.01M磷酸鹽緩沖的生理鹽水充分洗滌凝膠，以產(chǎn)生結(jié)晶纖維素硫酸酯凝膠。制備方法3在0-5℃溫度下，將氯磺酸(82克)逐滴加到吡啶(500ml)中，將混合物攪拌混勻。在氯磺酸逐滴加入后，將混合物加熱至65-70℃。往里加入80克CellulofineGC-25(Chisso公司生產(chǎn))，將混合物在65-70℃條件下攪拌4小時(shí)，使發(fā)生反應(yīng)。反應(yīng)完全后，將混合物冷卻，并緩慢加入10％氫氧化鈉水溶液，以中和混合物。過濾分離出凝膠，并用0.01M磷酸鹽緩沖的生理鹽水(pH7.2)充分洗滌凝膠，以產(chǎn)生纖維素硫酸酯凝膠。實(shí)施例1(從色譜柱梯度洗脫)將按制備方法1制備的CellulofineGC-15硫酸酯凝膠填裝色譜柱(50mm(內(nèi)徑)×200mm)中，并用0.02M磷酸鹽緩沖液(pH8.0；比電導(dǎo)率約3mS/cm)平衡該柱。將Bb菌株S611的細(xì)胞提取液(200ml)加到柱中，然后用上述的緩沖液洗滌柱，以洗掉碎片。接著用添加0-0.5M氯化鈉的磷酸鹽緩沖液(pH8.0，比電導(dǎo)率約3-46mS/cm)作梯度洗脫，得到含總蛋白量9.1mg的皮膚壞死毒素的組分。皮膚壞死毒素的回收率為39.6％，純度(純化的皮膚壞死毒素組分的比活性/菌細(xì)胞勻漿提取物的比活性)高達(dá)32.1。實(shí)施例2(從色譜柱逐段洗脫)將按制備方法1所制備的CellulofineGC-15硫酸酯凝膠填裝色譜柱(252mm(內(nèi)徑)×210mm)中，并用0.02M磷酸鹽緩沖液(pH8.0；比電導(dǎo)率約3mS/cm)平衡該柱。將Bb菌株S611的細(xì)胞提取物(總蛋白量為29-35克)加到柱上，然后用添加0-0.15M氯化鈉的0.02M磷酸鹽緩沖液(pH7.8-8.0，比電導(dǎo)率約3-17mS/cm)洗滌柱，以洗掉細(xì)菌碎片。接著用添加0.3-0.5M氯化鈉的磷酸鹽緩沖液(pH7.5-7.7；比電導(dǎo)率約30-46mS/cm)洗脫，得到含總蛋白量為0.2-1.1克的皮膚壞死毒素的組分。如表1所示，皮膚壞死毒素的回收率為76-100％，純度(純化的皮膚壞死毒素組分的比活性/菌細(xì)胞勻漿提取物的比活性)高達(dá)22-114，而內(nèi)毒素含量降低到0.1-3％。表1(a)用BCA微量蛋白試驗(yàn)(Pierce)測定(b)用Endospacy(SeikagakuKogyoK.K.)測定實(shí)施例3(從肝素瓊脂糖凝膠柱梯度洗脫)將肝素瓊脂糖CL-6B凝膠(Pharmacia公司生產(chǎn))填裝色譜柱(25mm(內(nèi)徑)×140mm)，并用0.02M磷酸鹽緩沖液(pH8.0；比電導(dǎo)率約3mS/cm)平衡該柱。Bb菌株S611的細(xì)胞提取液(總蛋白量為420mg)加到柱上，然后用上述緩沖液洗柱，以洗去菌細(xì)胞碎片。接著用添加0-0.5M氯化鈉的磷酸鹽緩沖液(pH8.0；比電導(dǎo)率約3-46mS/cm)作梯度洗脫，獲得含24mg總蛋白的皮膚壞死毒素的組分。皮膚壞死毒素的回收率為40.8％，純度(純化皮膚壞死毒素的比活性/菌細(xì)胞勻漿提取物的比活性)高達(dá)7。分析結(jié)果見表2。實(shí)施例4(從SP-Toyopearl650M柱上作梯度洗脫)將SP-Toyopearl650M柱(Toso.K.K.公司生產(chǎn))填充色譜柱(50mm(內(nèi)徑)×140mm)，并用0.02M磷酸鹽緩沖液(pH8.0；比電導(dǎo)率約3mS/cm)平衡該柱。Bb菌株S611的細(xì)胞提取液(總蛋白量631mg)加到柱上，然后用上述緩沖液洗滌柱，以洗除菌細(xì)胞碎片。接著用添加0-0.5M氯化鈉的磷酸鹽緩沖液(pH8.0；比電導(dǎo)率約3-46mS/cm)作梯度洗脫，獲得含2mg總蛋白的皮膚壞死毒素組分。皮膚壞死毒素的回收率為11.5％，純度(純化的皮膚壞死毒素組分的比活性/菌細(xì)胞勻漿提取物的比活性)高達(dá)35.5。分析結(jié)果見表2。實(shí)施例5(高純度純化方法)將按實(shí)施例1制備的纖維素硫酸酯凝膠純化組分，對33mM檸檬酸鹽/66mM磷酸氫二鈉/1M尿素(pH5.0)作透析。將透析液(9.1mg總蛋白)加到用相同緩沖液平衡過的SP-Toyopearl650M(TosoK.K.公司生產(chǎn)；10mm(內(nèi)徑)×80mm)柱上，接著用相同緩沖液洗滌以洗掉碎片。然后用添加0-0.5M氯化鈉的上述緩沖液作梯度洗脫，得到含皮膚壞死毒素(3.1mg總蛋白)的組分(SP組分)。該SP組分在用50mM磷酸鹽緩沖液(pH7.1)/0.3M硫酸鈉/1M尿素平衡過的TSK-gelG3000SW柱(21mm(內(nèi)徑)×600mm)上，用高效液相色譜(HPLC)作進(jìn)一步純化，得到含皮膚壞死毒素(1.3mg總蛋白)的組分(HPLC組分。圖1至圖3分別顯示這些色譜分離結(jié)果。菌細(xì)胞勻漿提取物和皮膚壞死毒素各組分的分析結(jié)果列于表3和圖4，純化的毒素性質(zhì)列于表4。表3</tables>(a)根據(jù)BCA蛋白測定(Pierce公司生產(chǎn))表4.分子量146kDa最小皮膚壞死劑量0.23ng最小脾萎縮劑量0.07ng小鼠LD503.8ng實(shí)施例6(降低毒性)將甲醛加入到按實(shí)施例1至5制備的各皮膚壞死毒素組分中，在37-40℃下使其反應(yīng)3-14天，以使毒性降低。將10％甲醛的3％當(dāng)量加到皮膚壞死毒素組分中，第2天的加入當(dāng)量仍為3％，第3天加入2％當(dāng)量。降低毒性的反應(yīng)結(jié)束后，將皮膚壞死毒素組分對磷酸鹽緩沖的生理鹽水作透析處理。實(shí)施例7(加入佐劑)把氫氧化鋁凝膠和防腐劑(乙汞硫代水楊酸鈉或甲醛)加到按實(shí)施例6制備的解毒皮膚壞死毒素中。實(shí)施例8(小鼠效價(jià)試驗(yàn))給5周齡ddy小鼠腹腔注射0.5ml按實(shí)施例7獲得的類毒素，隔2周注射一次，共二次。在最后一次免疫后二周，給動(dòng)物腹腔注射約50(25-100)個(gè)LD50的皮膚壞死毒素進(jìn)行攻擊，觀察7天內(nèi)的存活率。結(jié)果如圖5顯示。類毒素劑量與小鼠存活率之間呈正相關(guān)。實(shí)施例9(對繁殖豬的安全性試驗(yàn))如實(shí)施例6一樣，將按實(shí)施例2制備的組分作去毒處理。按實(shí)施例7制備添加氫氧化鋁凝膠的類毒素(2-50μg/2ml/一次劑量)，并給10周齡的SPF豬作肌內(nèi)注射，隔3周注射一次，共注射2次。在受試豬中，均未觀察到由于注射引起的臨床癥狀和體溫異常。實(shí)施例10(對妊娠母豬的有效性試驗(yàn))如實(shí)施例5獲得的HPLC組分按實(shí)施例6作降低毒性處理。按實(shí)施例7制備添加氫氧化鋁凝膠的類毒素(25μg/ml)后，給妊娠母豬作肌內(nèi)注射，于下小豬前3周和6周各肌注一次，每次注射體積為2ml。給對照母豬注射安慰劑疫苗。喂以充足母體初乳的新生仔豬于出生后3天，鼻內(nèi)給予2×108Bb菌株S611活細(xì)胞作攻擊，其中一半仔豬于2和3周齡時(shí)，各肌注一針2600MND皮膚壞死毒素作進(jìn)一步攻擊。表5顯示所獲得的皮膚壞死毒素中和抗體滴度。產(chǎn)小豬的母豬血和初乳中BbT中和抗體滴度分別為32和256，而仔豬的母體抗體滴度為128。其母體抗體保持陽性達(dá)6周以上。注射安慰劑的對照母豬及其仔豬均為血清學(xué)陰性。攻擊試驗(yàn)結(jié)果列于表6。12頭對照豬中有9頭查出鼻甲萎縮(評(píng)級(jí)為+-+++)，而免疫組中均未查出鼻甲萎縮。兩組動(dòng)物之間回收的鼻內(nèi)細(xì)菌無差別。至于體重增長，如圖6所示，當(dāng)除用Bb活菌攻擊外還用皮膚壞死毒素作攻擊后，二組之間有差別。2周齡時(shí)用皮膚壞死毒素作首次攻擊后，對照組的體重增長率減少到免疫組的三分之一，3周齡時(shí)用皮膚壞死毒素作第二次攻擊后，對照組的豬全部死亡。表5(a)分娩時(shí)<p>表6攻擊物鼻甲細(xì)菌組別豬編號(hào)BbBbT萎縮回收(a)備注Y126+--/-b)++++Y127+--/-+Y128+--/-++++免疫Y129+--/-++++Y130++-/-+Y131++-/-++++Y132++-/-++++Y133++-/-+Y134++-/-++++Y151+-+/++++Y152+--/+++++Y153+--/+++++Y154+-++/+++++Y155+-+/++對照Y156+--/-++++Y157+++++/++NTc)第2天死亡d)Y158+++++/+++NT第2天死亡Y159+++++/++NT第6天死亡Y160+++++/++NT第5天死亡Y161++++/++NT第1天死亡Y162+++/+NT第3天死亡(a).鼻內(nèi)拭子涂抹的培養(yǎng)皿上出現(xiàn)的菌落數(shù)；-0，+～50，++～100，+++～200，++++＞200(b).分成5級(jí)(-，+，++，+++，++++)作評(píng)定；左鼻甲骨/右鼻甲骨的得分。(c).未作試驗(yàn)(d).第二次BbT攻擊后算起的天數(shù)實(shí)施例11(對繁殖豬的效價(jià)試驗(yàn))將按實(shí)施例2獲得的組分按實(shí)施例6作減毒處理。按實(shí)施例7制備添加氫氧化鋁凝膠的類毒素(25μg/2ml/每次劑量)后，給10周齡的SPF豬作肌肉注射，以3周間隔注射二次。最后一次免疫后4周，經(jīng)鼻內(nèi)給予2×108活Bb菌攻擊豬，檢測皮膚壞死毒素中和抗體的滴度直至攻擊后3周為止。如表7所示，對照豬即使在攻擊后仍保持BbT中和抗體血清學(xué)陰性。另一方面，免疫組中的所有豬均轉(zhuǎn)變成BbT中和抗體血清學(xué)陽性。注射2或6μg/2ml/每次劑量類毒素免疫的豬在攻擊后中和抗體滴度呈現(xiàn)迅速的升高，而注射20或50μg/2ml/每次劑量類毒素免疫的豬在攻擊后中和抗體滴度無明顯升高。據(jù)報(bào)道，皮膚壞死毒素具有抑制抗體產(chǎn)生的作用(Sekiya，K.Microbiol.Immunol.，27，p.905-915(1983))。攻擊后對照豬中和抗體不見升高的原因，看來像是由于攻擊細(xì)菌引起的BbT的免疫抑制作用。因此，鑒于免疫組豬中和抗體的急劇升高是由于不受BbT抑制抗體產(chǎn)生作用的影響，提示2μgBbT類毒素這一劑量對繁殖的豬是有效的。表7BbT鼻內(nèi)類毒)豬編)首次免疫后各周的首次免疫后各周的細(xì)菌素劑號(hào)b).BbT中和抗體滴度Bb凝集抗體滴度回收量a)034571003710結(jié)果0Y135＜1＜1＜1＜1＜1＜1＜10＜10＜1040++Y136＜1＜1＜1＜1＜1＜1＜10＜10＜1080++++2Y137＜1＜11688128＜10＜10＜10640+++Y138＜1＜1163216512＜10＜10＜101280+++Y139＜1＜1816161024＜10＜10＜1080++++6Y140＜1＜1163216512＜10＜10＜10640+++Y141＜1＜1166416128＜10＜10＜10320-Y142＜1＜164643264＜10＜10＜10160++++20Y143＜1＜132646432＜10＜10＜10640++++Y144＜1＜14881＜10＜10＜1040+Y145＜1＜1163288＜10＜10＜10320++50Y146＜1＜164646464＜10＜10＜101280+++Y147＜1＜11281286432＜10＜10＜10320+Y148＜1＜1642566464＜10＜10＜10640++a).μg/2ml/單次劑量b).于0周和3周給10周齡SPF豬肌肉注射BbT類毒素兩次，7周時(shí)鼻內(nèi)給予活Bb菌作攻擊。制備方法4(破碎的菌細(xì)胞提取物BbT類毒素1)將Bb菌S611株置發(fā)酵罐蛋白胨培養(yǎng)基中在37℃通氣培養(yǎng)24小時(shí)。用離心法濃縮菌細(xì)胞，然后用機(jī)械破碎法將菌細(xì)胞破碎。用離心法或微孔濾膜(孔徑0.45μm)過濾法除去細(xì)菌碎片后，在獲得的溶液(即BbT粗組分)中加入終濃度為0.8％的甲醛，在37-40℃條件下減毒處理7天。所得類毒素對磷酸鹽緩沖的生理鹽水進(jìn)行透析。以1mg(以鋁含量計(jì))/ml的用量將氫氧化鋁凝膠加到經(jīng)過透析的產(chǎn)物中，形成BbT類毒素1。制備方法5(BbT類毒素2)按制備方法4獲得的BbT粗組分在纖維素硫酸酯凝膠柱上作色譜分離純化。將該BbT粗組分加到用20mM磷酸鹽緩沖液(pH8.0)經(jīng)過平衡的纖維素硫酸酯凝膠柱上，然后用相同緩沖液洗滌凝膠。用添加了1.5MNaCl和1M尿素的20mM磷酸鹽緩沖液(pH8.0)將BbT從纖維素硫酸酯凝膠柱(7.8cm(內(nèi)徑)×45cm)上洗脫下來。按制備方法4將洗脫的組分(CS1組分)作解毒處理，經(jīng)透析后加入氫氧化鋁凝膠，形成BbT類毒素2。制備方法6(BbT類毒素3)用TSKgelHW65(2.64cm(內(nèi)徑)×69cm)和HW75(2.64cm(內(nèi)徑)×64cm)柱相結(jié)合的色譜分離法將按制備方法5獲得的CS1組分作進(jìn)一步純化。使CS1組分通過已用添加0.3M硫酸鈉和1M尿素的0.05M磷酸鹽緩沖液(pH7.2)平衡過的該色譜柱，并用相同緩沖液作分級(jí)分離。然后合并含皮膚壞死毒素的諸級(jí)分(組分)。按制備方法4將合并的級(jí)分作解毒處理，經(jīng)透析后加入氫氧化鋁凝膠，形成BbT類毒素3。制備方法7(BbT類毒素4)按制備方法4獲得的粗提BbT組分在纖維素硫酸酯凝膠柱上作色譜分離純化。將該粗提BbT加到已用添加0.1MNaCl的20mM磷酸鹽緩沖液(pH8.0)平衡過的纖維素硫酸酯凝膠上，并用相同緩沖液洗滌凝膠。用添加0.5MNaCl的20mM磷酸鹽緩沖液(pH8.0)將BbT從纖維素硫酸酯凝膠上洗脫下來。按制備方法4將洗脫的組分(CS2組分)作解毒處理，經(jīng)透析后加入氫氧化鋁凝膠，形成BbT類毒素4。制備方法8(BbT類毒素5)按制備方法7獲得的CS2組分用Affi-gelblue柱(BioRad公司生產(chǎn)；100-200目；5.0cm(內(nèi)徑)×17cm)作進(jìn)一步純化。將CS2組分對50mMTris緩沖液(pH7.5)透析后，加到已用相同緩沖液平衡過的Affigelblue柱上，將柱用已添加1M磷酸氫二鈉的50mMTris緩沖液(pH7.5)加以洗滌。在用50mMTris緩沖液(pH7.5)將該柱作進(jìn)一步洗滌后，用已添加2M氯化鎂和1M尿素的50mMTris緩沖液(pH7.5)將BbT洗脫下來。按制備方法4將此純化組分作解毒處理，經(jīng)透析后加入氫氧化鋁凝膠，形成BbT類毒素5。制備方法9(BbT抗毒素)將如實(shí)施例1和實(shí)施例5獲得的高純度BbT組分按制備方法4作解毒處理，經(jīng)透析后加入氫氧化鋁凝膠，形成BbT類毒素6。給27周齡的SPF豬接種該類毒素，在3個(gè)月中共接種8次，每次接種1ml，使產(chǎn)生BbT抗毒素(中和抗體滴度為4,096；凝集作用抗體的滴度＜20)。制備方法10(PmT類毒素)將產(chǎn)毒性PmD型菌S70株置含心臟浸液肉湯的發(fā)酵罐中37℃通氣培養(yǎng)24小時(shí)。用離心法濃縮菌細(xì)胞后用機(jī)械破碎法加以破碎。用離心法或微孔濾膜(孔徑0.45μm)過濾法除去碎片后所得的溶液(縮寫為“粗制PmT”)通過陰離子交換色譜加以純化。將粗制PmT加到已用添加0-0.3MNaCl或Tris緩沖液的中性磷酸鹽緩沖液平衡過的陰離子交換器上，然后用相同緩沖液洗滌陰離子交換器。用添加0.4-0.5MNaCl的相同緩沖液將PmT從該交換器上洗脫下來。在該部分純化的PmT組分中加入0.4％的甲醛，在37℃進(jìn)行14天或更長時(shí)間的減毒。獲得的類毒素對磷酸鹽緩沖的生理鹽水作透析。把氫氧化鋁凝膠以1mgAl/ml的用量加到透析液中，形成PmT類毒素。實(shí)施例12(用各種純化法所獲得的BbT類毒素對豚鼠的免疫原性)將按制備方法4-8獲得的活性為3,000MND/ml(解毒前的活性)的幾種BbT類毒素給豚鼠(Hartely；雌性；5周齡)在大腿部作肌注，每種類毒素的注射體積為0.5ml。在注射后28天給動(dòng)物放血，測定BbT中和抗體的滴度。用磷酸鹽緩沖的生理鹽水將滅活血清作雙倍系列稀釋，進(jìn)行中和抗體測定。將等量BbT(滴度4MND/0.1ml)加到稀釋血清中，在冰冷條件下反應(yīng)過夜。之后，取0.1ml混合物注入豚鼠皮下，注射后1天進(jìn)行檢測，中和抗體滴度以抑制皮膚壞死反應(yīng)的血清最大稀釋度(即血清的稀釋倍數(shù))表示。如表8所示，注射具比活性為1.4×104MND/mg蛋白的BbT類毒素1和2的豚鼠保持中和抗體的血清學(xué)陰性。在注射具比活性3.7×104MND/mg蛋白的BbT類毒素3的情況下，3只豚鼠中有2只為血清學(xué)陽性，注射比活性大于7.8×104MND/mg蛋白的BbT類毒素的所有動(dòng)物都轉(zhuǎn)為血清學(xué)陽性。在純化期間BbT易于成為不溶性，并容易與像脂、酸性蛋白等一類細(xì)菌衍生的物質(zhì)形成復(fù)合物(Wordlaw，A.C.andParton，R.Pharmacol.Ther.，19，p.1-53(1983))。由此看來，減少這些細(xì)菌衍生物能夠使解毒更充分，或可減少BbT分子上免疫原的抗原決定基的掩蔽，以增強(qiáng)抗原提呈的效果，從而提高BbT類毒素的免疫原性。表8BbT類毒素比活性(MND/mg蛋白)皮膚壞死毒素中和抗體滴度114000＜2＜2＜2214000＜2＜2＜2337000＜224476000323212859600083232無致病力疫苗-＜2＜2＜2(由A生產(chǎn))無致病力疫苗-＜2＜2＜2(由B生產(chǎn))每種類毒素濃度調(diào)整到3000MND/ml，并以1mgAl/ml的用量加入氫氧化鋁凝膠。實(shí)施例13(BbT中和抗體的保護(hù)作用方面)給2日齡SPF豬腹腔注射按制備方法10所獲得的BbT抗毒素，注射體積分別為0.2，1.0，2.0或20ml，使豬被動(dòng)免疫。3日齡時(shí)鼻內(nèi)給予108CFU的Bb菌S611株作攻擊。7日齡時(shí)肌注粗制BbT(1,940MND/每頭豬)作進(jìn)一步攻擊。如圖7所示，在BbT中和抗體滴度大于1時(shí)，可觀察到對抗BbT致死活性的保護(hù)作用，而當(dāng)其中和抗體滴度大于4時(shí)，還可能免遭皮膚壞死。實(shí)施例14(PmT中和抗體的保護(hù)作用方面)按制備方法10所得粗制PmT類毒素與等量的福氏不完全佐劑混合，加以乳化。8頭SPF妊娠母豬分成二組，免疫組6頭，對照組二頭。免疫組的豬在妊娠期間，肌肉注射類毒素(840MND/ml)2-5次，注射體積3ml/次/每頭豬。分娩后仔豬喂以足量初乳，2日齡或9日齡時(shí)，肌注20-160MND粗制PmT作攻擊。攻擊后連續(xù)14天觀察小豬，并檢查鼻甲損傷。如表9所示，觀察到在PmT中和抗體滴度大于2時(shí)，可保護(hù)小豬免患PmT所致鼻甲萎縮，即使中和抗體滴度小于2時(shí)也有可能保護(hù)小豬免遭死亡。表9試驗(yàn)類別PmT中和抗體滴度a)死亡數(shù)/總數(shù)b)平均鼻甲萎縮得分c)免疫組1280/20640/20320/30160/5040/1020/90對照組＜20/102.4＜23/142.3a)攻擊時(shí)用胚胎期牛肺細(xì)胞測得的母體抗體滴度。b)給2日齡或9日齡小豬在大腿部位肌注20-160MNDPmT作攻擊。c)鼻甲萎縮的平均得分值；0正常，1輕度，2中度，3重度，4極重度。實(shí)施例15(在用BbT抗毒素被動(dòng)免疫的仔豬上所作的Bb和Pm攻擊試驗(yàn))給2日齡SPF仔豬腹腔注射20ml按制備方法10所獲BbT抗毒素，作被動(dòng)免疫。在3和7日齡時(shí)分別給豬鼻內(nèi)施用108CFU的Bb菌S611株和108CFU的Pm菌D型S70株，6周齡時(shí)進(jìn)行尸體解剖。如表10所示，用BbT抗毒素免疫后，可從鼻粘膜回收大量Bb菌，而與對照相比，Pm菌的回收量則相當(dāng)?shù)?。對照組的鼻甲損傷評(píng)定為重度(+-+)到極重度(++++)，而免疫組中，一頭豬為正常(-)，其余豬為重度到極重度，表明個(gè)體與個(gè)體之間的差異很大。表10不同日齡時(shí)BbT不同日齡時(shí)PmT鼻內(nèi)細(xì)菌組別仔豬中和抗體滴度中和抗體滴度鼻甲回收量豬號(hào).性別3715304437153044萎縮BbPmDa)Y89♀256NT643216＜2NT＜2＜2＜2++++++++++免疫組Y100♀256128643264＜2＜2＜2＜2＜2-++++-Y125256128643232＜2＜2＜2＜2＜2+++++++-Y80＜1NT＜1＜1＜1＜2NT＜2＜2＜2++++++++++++對照組Y83♀＜1NT＜1＜1＜1＜2NT＜2＜2＜2+++++++++++Y99♀＜1＜1＜1＜1＜1＜2＜2＜2＜2＜2++++++++++++a)給2日齡仔豬腹腔注射豬抗BbT抗血清*小豬3日齡時(shí)鼻內(nèi)給予BbS611菌(188CFU/頭)，7日齡時(shí)鼻內(nèi)給予PmDS70菌(108CFU/頭)，使其遭受攻擊。皮膚壞死毒素在菌細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生，借助細(xì)菌溶解從菌細(xì)胞分泌出來。因此，BbT抗毒素不能阻斷Bb在鼻粘膜上的繁殖。為了Pm的繁殖，Bb應(yīng)預(yù)先在鼻粘膜部位已引起損害。作為由Bb所產(chǎn)生的可引起鼻粘膜損害的因子，BbT(Elias，B.etal.，Jpn.J.Vet.Sci.，52，p.677-688(1990))和氣管細(xì)胞毒素(Cookson，B.T.andGoldman，W.E.，J.Cell.Biochem.，11B(Suppl.)p.124；Dugal，F(xiàn).etal.，Can.J.Vet.Res.，56，p.260-264(1992))是最重要的。由于氣管細(xì)胞毒素具有終止氣管纖毛運(yùn)動(dòng)的作用，破壞纖毛上皮細(xì)胞的作用以及加速粘液分泌的作用，所有這些作用對于Pm的繁殖都是至關(guān)重要的，因此，用BbT抗血清免疫只能部分地阻斷Pm的繁殖。鑒于這些事實(shí)，應(yīng)建立至少是抗BbT和氣管細(xì)胞毒素的免疫，以阻斷Pm在鼻粘膜上的繁殖。但是，氣管細(xì)胞毒素類毒素離實(shí)際應(yīng)用相差甚遠(yuǎn)，面臨許多問題有待解決，例如，純化方法的建立、免疫原性以及產(chǎn)率等。因此，為了防止萎縮性鼻炎的原發(fā)癥狀而避免經(jīng)濟(jì)損失，AR滅活疫苗應(yīng)至少包含皮膚壞死毒素的類毒素混合制劑。實(shí)施例16(類毒素混合制劑的實(shí)施例)將氫氧化鋁凝膠加到按實(shí)施例2和6所得的解毒BbT中，其混合物加以攪拌。BbT類毒素貯存溶液的制備方法是把BbT濃度調(diào)整到8,700-220,000MND/ml(相當(dāng)于解毒前2-50μg/mlBbT蛋白)，把鋁的濃度調(diào)整到0.5-2.5mg/ml，并加入防腐劑。PmT貯存溶液的制備方法是在按制備方法10所得的濃度為3,400MND/ml或更高(解毒前的毒素量)的解毒PmT中，加入氫氧化鋁凝膠以及防腐劑。所用的防腐劑有0.01％乙基汞硫代水楊酸鈉或0.1-0.4％甲醛。BbT貯存溶液與PmT類毒素貯存溶液等量混合，形成類毒素混合制劑。給9周齡SPF豬頸部肌注接種該類毒素混合制劑2ml，接種二次，間隔3周。間隔一段時(shí)間后，制備血清，測定BbT中和抗體和PmT中和抗體的滴度。用胎牛肺細(xì)胞做中和試驗(yàn)，測定PmT中和抗體的滴度(Rutter，J.M.andLuther，P.D.，Vet.Rec.，114，p.393-396(1984))。表11顯示豬的中和抗體滴度，而表12則是小鼠的滴度試驗(yàn)結(jié)果。未觀察到給豬和小鼠接種后，BbT和PmT類毒素單用和類毒素混合制劑之間的免疫原性的明顯差別。該類毒素混合制劑顯現(xiàn)足以起保護(hù)作用的中和抗體反應(yīng)，而且是十分安全的。表11首次免疫后不同天數(shù)首次免疫后不同天數(shù)試驗(yàn)組別a)豬的BbT中和抗體滴度PmT中和抗體滴度編號(hào)0102135506401021355064BbT單用Y117＜1＜1＜132328＜2＜2＜2＜2＜2＜2Y118＜1＜1＜1＜1＜1＜1＜2＜2＜2＜2＜2＜2Y119＜1＜1＜164168＜2＜2＜2＜2＜2＜2類毒素Y120＜1＜1＜1643216＜2＜2＜2256128128混合制劑Y121＜1＜1＜11684＜2＜2＜2643216Y122＜1＜1＜122＜1＜2＜2＜2643232PmT單用Y123＜1＜1＜1＜1＜1＜1＜2＜2＜2643216Y124＜1＜1＜1＜1＜1＜1＜2＜2＜212812864Y125＜1＜1＜1＜1＜1＜1＜2＜2＜212812864對照Y114＜1＜1＜1＜1＜1＜1＜2＜2＜2＜2＜2＜2Y115＜1＜1＜1＜1＜1＜1＜2＜2＜2＜2＜2＜2Y116＜1＜1＜1＜1＜1＜1＜2＜2＜2＜2＜2＜2a)于0天和21天，將每種類毒素在頸部作肌注。表12</tables>表中所列中和抗體滴度系指攻擊時(shí)所測得的滴度。權(quán)利要求1.細(xì)菌所產(chǎn)生的皮膚壞死毒素的純化方法，其特征在于使含皮膚壞死毒素的溶液與一種通過直接硫酸化反應(yīng)硫酸化的色譜凝膠或一種與硫酸化分子共價(jià)結(jié)合的色譜凝膠接觸，從而使皮膚壞死毒素被吸附到凝膠上，然后從凝膠上把吸附的皮膚壞死毒素洗脫下來。2.根據(jù)權(quán)利要求1的皮膚壞死毒素的純化方法，其中吸附凝膠選自纖維素硫酸酯凝膠，后者是導(dǎo)入硫酸酯的纖維素，或選自含有與肝素、磺丙基或其分子內(nèi)含磺基(sulfonegroup)的蘭色染料單獨(dú)結(jié)合或聯(lián)合結(jié)合的天然高分子量聚合物或合成高分子量聚合物的色譜凝膠。3.根據(jù)權(quán)利要求1的皮膚壞死毒素的純化方法，其包含以下步驟(1)、用pH為7-9，固定的比電導(dǎo)率范圍為3-20mS/cm或更低的緩沖液將凝膠作預(yù)處理，使借助直接硫酸化反應(yīng)而被硫酸化的色譜凝膠或與硫酸化分子共價(jià)結(jié)合的色譜凝膠達(dá)到平衡，(2)、使含皮膚壞死毒素的溶液與具有硫酸基作為配基的吸附凝膠，或借助直接硫酸化作用而被硫酸化的吸附凝膠，在pH7-9，溫度0-30℃以及固定的比電導(dǎo)率范圍為3-20mS/cm或更低的條件下相接觸，(3)、在從凝膠洗脫皮膚壞死毒素前，先用pH為5-10，固定的比電導(dǎo)率范圍為3-20mS/cm或更低的緩沖液洗滌吸附凝膠，以及(4)、用pH為5-10，比電導(dǎo)率大于3-20mS/cm的固定范圍直至達(dá)130mS/cm的緩沖液從凝膠上洗脫皮膚壞死毒素。4.根據(jù)權(quán)利要求3的皮膚壞死毒素純化方法，包括下列步驟(1)、用pH為7-9，比電導(dǎo)率為20mS/cm或更低的緩沖液將凝膠作預(yù)處理，使纖維素硫酸酯凝膠達(dá)到平衡，(2)、在pH為7-9，溫度為0-30℃以及比電導(dǎo)率為20mS/cm或更低的條件下，使含皮膚壞死毒素的溶液與纖維素硫酸酯凝膠接觸，(3)、用pH為5-10以及比電導(dǎo)率為20mS/cm或更低的緩沖液在自凝膠洗脫皮膚壞死毒素前，先洗滌吸附凝膠，(4)、用pH為5-10以及比電導(dǎo)率范圍為22-130mS/cm的緩沖液將皮膚壞死毒素從凝膠上洗脫下來。5.根據(jù)權(quán)利要求3的皮膚壞死毒素純化方法，包括下列步驟(1)、用pH為7-9以及比電導(dǎo)率范圍為3-5mS/cm的緩沖液將凝膠預(yù)先處理，使結(jié)合肝素的色譜凝膠平衡，(2)、用pH為7-9，溫度為0-30℃以及比電導(dǎo)率范圍為3-5mS/cm的條件下，使含皮膚壞死毒素的溶液與結(jié)合肝素的色譜凝膠相接觸，(3)、在自凝膠洗脫皮膚壞死毒素前，先用pH為5-10以及比電導(dǎo)率范圍為3-5mS/cm或更低的緩沖液洗滌吸附凝膠，(4)、用pH為5-10以及比電導(dǎo)率范圍為3-130mS/cm的緩沖液將皮膚壞死毒素從凝膠上洗脫下來。6.根據(jù)權(quán)利要求1或3的皮膚壞死毒素純化方法，其中含皮膚壞死毒素的溶液是博代氏桿菌菌細(xì)胞提取物。7.根據(jù)權(quán)利要求1或3的皮膚壞死毒素的純化方法，其中含皮膚壞死毒素的溶液是采用基因工程技術(shù)使博代氏桿菌的皮膚壞死毒素在其內(nèi)得到表達(dá)的微生物或細(xì)胞的培養(yǎng)物或提取物。8.一種皮膚壞死毒素類毒素，其制備方法包括用化學(xué)方法處理部分純化的皮膚壞死毒素或高度純化的皮膚壞死毒素，以使該皮膚壞死毒素類毒素失去皮膚壞死毒素的活性而保留其免疫原性；該部分純化的皮膚壞死毒素的制備方法是使含由博代氏桿菌所產(chǎn)皮膚壞死毒素的溶液，與一種借助直接硫酸化反應(yīng)得以硫酸化的色譜凝膠，或一種與硫酸化分子共價(jià)結(jié)合的色譜凝膠相接觸，從而使皮膚壞死毒素被吸附到凝膠上，接著再從該凝膠上把皮膚壞死毒素洗脫下來；而該高度純化的皮膚壞死毒素是通過將該部分純化的皮膚壞死毒素作進(jìn)一步純化而制備的。9.根據(jù)權(quán)利要求8的皮膚壞死毒素類毒素，其中所述部分純化的皮膚壞死毒素是由包含以下步驟的純化方法所制備(1)、用pH為7-9以及固定的比電導(dǎo)率范圍為3-20mS/cm或更低的緩沖液預(yù)先處理凝膠的方法，使靠直接硫酸化反應(yīng)而得以硫酸化的色譜凝膠，或與硫酸化分子共價(jià)結(jié)合的色譜凝膠達(dá)到平衡，(2)、使含皮膚壞死毒素的溶液與靠直接硫酸化反應(yīng)而得以硫酸化的色譜凝膠，或與硫酸化分子共價(jià)結(jié)合的色譜凝膠，在pH為7-9，溫度為0-30℃以及固定的比電導(dǎo)率范圍為3-20mS/cm或更低的條件下相接觸，(3)、在從凝膠上洗脫皮膚壞死毒素之前，先用pH為5-10以及固定的比電導(dǎo)率范圍為3-20mS/cm或更低的緩沖液洗滌吸附凝膠，以及(4)、用pH為5-10和比電導(dǎo)率大于3-20mS/cm的固定范圍直到130mS/cm的緩沖液把皮膚壞死毒素從凝膠上洗脫下來。10.根據(jù)權(quán)利要求要求8的皮膚壞死毒素類毒素，其比活性為3.75×105最小壞死劑量(下文中簡稱為MND)/mg蛋白或更高。11.一種聯(lián)合疫苗，含有由博代氏桿菌所產(chǎn)皮膚壞死毒素的類毒素和由巴斯德氏菌所產(chǎn)皮膚壞死毒素的類毒素。12.根據(jù)權(quán)利要求11的聯(lián)合疫苗，含有權(quán)利要求8的由博代氏桿菌所產(chǎn)皮膚壞死毒素的類毒素和由巴斯德氏菌所產(chǎn)皮膚壞死毒素的類毒素。13.根據(jù)權(quán)利要求11的聯(lián)合疫苗，含有權(quán)利要求9的由博代氏桿菌所產(chǎn)皮膚壞死毒素的類毒素以及巴斯德氏菌所產(chǎn)皮膚壞死毒素的類毒素。14.根據(jù)權(quán)利要求11的聯(lián)合疫苗，其中所述由博代氏桿菌所產(chǎn)的皮膚壞死毒素的類毒素具有的比活性為37,000MND/mg蛋白或更高。全文摘要本發(fā)明目的在于提供一種制備皮膚壞死毒素的方法，由博代氏桿菌所產(chǎn)皮膚壞死毒素的經(jīng)過改良的類毒素以及含有該改良的由博代氏桿菌所產(chǎn)皮膚壞死毒素的類毒素和由巴斯德氏菌所產(chǎn)皮膚壞死毒素的類毒素的類毒素混合制劑。本發(fā)明提供一種部分純化皮膚壞死毒素的方法，包括使含皮膚壞死毒素的溶液與一種借助直接硫酸化反應(yīng)而被硫酸化的色譜凝膠，或一種與硫酸化分子共價(jià)結(jié)合的色譜凝膠相接觸，從而使皮膚壞死毒素吸附到凝膠上，然后從凝膠上把吸附的皮膚壞死毒素洗脫下來。本發(fā)明還提供從博代氏桿菌所產(chǎn)皮膚壞死毒素獲得的類毒素，該皮膚壞死毒素用上述的部分純化皮膚壞死毒素的方法制備，還提供將該毒素與產(chǎn)毒性巴斯德氏菌所產(chǎn)生的皮膚壞死毒素的類毒素相混合而制得的類毒素混合制劑，該類毒素混合制劑用于預(yù)防豬的萎縮性鼻炎是安全、有效的。文檔編號(hào)A61K39/00GK1154655SQ95194457公開日1997年7月16日申請日期1995年6月7日優(yōu)先權(quán)日1994年6月10日發(fā)明者河合透,牛島稔大,高瀨公三,藤川英雄申請人:財(cái)團(tuán)法人化學(xué)及血清療法研究所