專(zhuān)利名稱(chēng)：非自動(dòng)失活的定位表達(dá)的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，該逆轉(zhuǎn)錄病毒載體包括能進(jìn)行啟動(dòng)子轉(zhuǎn)變的載體(ProCon載體)。該載體系統(tǒng)能被用作定位基因治療的基因轉(zhuǎn)移載體。
將逆轉(zhuǎn)錄病毒載體用于基因治療業(yè)已得到許多關(guān)注，而且，目前已成為在美國(guó)和歐洲得到批準(zhǔn)的多種方案中可選的轉(zhuǎn)移治療基因的方法(Kotani等，1994)。然而，上述方案大多要求在體外用帶有治療基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體轉(zhuǎn)染靶細(xì)胞，隨后再把感染成功的細(xì)胞送回?fù)p傷了的個(gè)體內(nèi)(Rosenberg等，1992；關(guān)于綜述，參見(jiàn)Anderson，1992)。這種來(lái)自體內(nèi)的基因的治療方案適于治療醫(yī)學(xué)疾病，其中，所述靶細(xì)胞群易被分離(例如淋巴細(xì)胞)。另外，這種來(lái)自體內(nèi)的靶細(xì)胞的感染使得可以給藥大量的濃縮了的病毒，而且該病毒在使用之前可作嚴(yán)格的安全試驗(yàn)。
遺憾的是，僅有一部分可用于基因治療的靶細(xì)胞易被分離、培養(yǎng)，然后再被導(dǎo)入。此外，來(lái)自體內(nèi)的基因的治療所需的復(fù)雜技術(shù)及相應(yīng)的高花費(fèi)，事實(shí)上妨礙了其在世界范圍內(nèi)的廣泛應(yīng)用。未來(lái)的簡(jiǎn)便省錢(qián)的基因治療將要求一種體內(nèi)途徑，在該途徑中，以注射病毒載體或產(chǎn)生病毒載體的細(xì)胞或簡(jiǎn)單植入能產(chǎn)生逆轉(zhuǎn)錄病毒的細(xì)胞的形式直接對(duì)患者給藥。
當(dāng)然，這種體內(nèi)途徑會(huì)引起種種新問(wèn)題。首先而且最重要的是，必須強(qiáng)調(diào)考慮到安全性。由于植入了能產(chǎn)生病毒的細(xì)胞而可能產(chǎn)生病毒，而且沒(méi)有機(jī)會(huì)預(yù)先檢驗(yàn)所產(chǎn)生的病毒。明白有關(guān)使用該系統(tǒng)所會(huì)遇到的一定危險(xiǎn)，以及爭(zhēng)取生產(chǎn)出能減少這種危險(xiǎn)的新系統(tǒng)是重要的。
逆轉(zhuǎn)錄病毒載體系統(tǒng)由兩個(gè)部分組成(

圖1)1)該逆轉(zhuǎn)錄病毒載體本身是一種被修飾了的逆轉(zhuǎn)錄病毒(載體質(zhì)粒)，其中，編碼病毒蛋白的基因已被有待轉(zhuǎn)移到靶細(xì)胞里的治療基因和標(biāo)記基因所取代。由于編碼病毒蛋白的基因被取代有效地破壞了該病毒，必需由該系統(tǒng)中的第二個(gè)部分對(duì)其進(jìn)行拯救，該部分能提供上述被修飾了的逆轉(zhuǎn)錄病毒所缺少的病毒蛋白。
所述第二個(gè)部分是
2)能產(chǎn)生大量病毒蛋白，但缺乏產(chǎn)生可復(fù)制病毒能力的細(xì)胞系。該細(xì)胞系被稱(chēng)為包裝細(xì)胞系，它由被另一種質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系組成，該質(zhì)粒帶有使所述被修飾了的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體能被包裝的基因。
為了產(chǎn)生所述包裝了的載體，將該載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到所述包裝細(xì)胞系中，在這些條件下，所述被修飾了的逆轉(zhuǎn)錄基因組(包括插入的治療基因和標(biāo)記基因)由所述載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)錄，并被包裝到被修飾了的逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒(重組病毒顆粒)中。然后，用這種重組病毒感染靶細(xì)胞，在此過(guò)程中，載體基因組和所攜帶的任何標(biāo)記或治療基因被整合到該靶細(xì)胞的DNA中。由這種重組病毒顆粒感染的細(xì)胞不能產(chǎn)生新的載體病毒，因?yàn)樵谶@樣的細(xì)胞中沒(méi)有病毒蛋白。然而，帶有治療及標(biāo)記基因的載體DNA被整合到細(xì)胞DNA上，并可以在被感染的細(xì)胞中表達(dá)。
由于原病毒形式的逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組實(shí)際上是以隨機(jī)形式整合到受感染細(xì)胞的基因組中(Varmus，1988)，根據(jù)其插入激活可以鑒定若干細(xì)胞原癌基因(Varmus，1988；Van Lohuizen和Berns，1990)。由于類(lèi)似機(jī)理可能會(huì)導(dǎo)致接受帶有被用于治療其它已存在的醫(yī)學(xué)疾病的治療基因的逆轉(zhuǎn)錄載體治療的患者長(zhǎng)癌，已產(chǎn)生一再發(fā)生的倫理問(wèn)題。大多數(shù)研究人員會(huì)同意，復(fù)制缺陷逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，例如復(fù)制所有目前使用的整合至或靠近與有關(guān)控制細(xì)胞增殖的細(xì)胞基因的載體的可能性小到趨近于零。不過(guò)，通常還是承認(rèn)，由單一的感染事件所引發(fā)的可復(fù)制逆轉(zhuǎn)錄病毒的極為迅速地發(fā)展會(huì)最終產(chǎn)生，足以使得這種表型整合變成極為真實(shí)的可能的整合事件。
對(duì)逆轉(zhuǎn)錄病毒系統(tǒng)進(jìn)行優(yōu)化，以減少出現(xiàn)可復(fù)制病毒的機(jī)會(huì)。不過(guò)，已有許多文獻(xiàn)證明，所述逆轉(zhuǎn)錄病毒載體系統(tǒng)的組份之間的重組，會(huì)導(dǎo)致潛在致病性可復(fù)制病毒的產(chǎn)生，業(yè)已構(gòu)建了若干代載體系統(tǒng)，以減少這種重組的危險(xiǎn)(見(jiàn)Salmons和Günzburg的綜述，1993)。
從安全角度和純實(shí)踐角度來(lái)看，在考慮采用體內(nèi)基因治療時(shí)的另一個(gè)考慮因素是逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的定位。很清楚，由載體所攜帶的治療基因不應(yīng)該在所有組織和細(xì)胞中不加選擇地表達(dá)，而只能在要求的靶細(xì)胞中表達(dá)。如果待轉(zhuǎn)移的基因是用于切除特定腫瘤細(xì)胞的毒素基因的話(huà)，這一點(diǎn)尤為重要。很顯然，切除其它非靶細(xì)胞是很不合在此之前，業(yè)已披露了若干會(huì)使所攜帶的治療基因定位的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體系統(tǒng)(Salmons和Gunzburg，1993)。這些方法中的大部分涉及將感染行為局限于預(yù)定細(xì)胞類(lèi)型，或是用異源啟動(dòng)子指導(dǎo)轉(zhuǎn)入特定類(lèi)型細(xì)胞中的連鎖的治療基因或標(biāo)記基因的表達(dá)。所用的異源啟動(dòng)子應(yīng)當(dāng)只能在這種類(lèi)型的細(xì)胞中啟動(dòng)連鎖基因的表達(dá)這種啟動(dòng)子在所述細(xì)胞中是有正常活性的。所述啟動(dòng)子已早先同標(biāo)記基因或治療基因一起被插入到所述逆轉(zhuǎn)錄病毒載體上的gag、pol或env基因位點(diǎn)上。
在所述基因旁側(cè)的逆轉(zhuǎn)錄病毒長(zhǎng)末端重復(fù)序列(LTR)帶有逆轉(zhuǎn)錄病毒啟動(dòng)子，該啟動(dòng)子通常是非特異性的，它可以啟動(dòng)在許多不同類(lèi)型細(xì)胞中的表達(dá)(Majors，1990)。有人報(bào)道過(guò)LTR啟動(dòng)子與異源內(nèi)部啟動(dòng)子如在上文中所述的組織專(zhuān)一性啟動(dòng)子之間的啟動(dòng)子干擾。另外，業(yè)已知道逆轉(zhuǎn)錄病毒LTRs具有強(qiáng)增強(qiáng)子，它們可以獨(dú)立地或是與逆轉(zhuǎn)錄病毒啟動(dòng)子一起干擾靠近該逆轉(zhuǎn)錄病毒的整合位點(diǎn)的細(xì)胞基因的表達(dá)。其機(jī)理已被證實(shí)為是因動(dòng)物的致癌性所致(Van Lohuizen和Berns)。以上兩個(gè)發(fā)現(xiàn)促進(jìn)了自動(dòng)失活載體(SIN)的發(fā)展，其中，逆轉(zhuǎn)錄病毒啟動(dòng)子在靶細(xì)胞內(nèi)是功能性失活的(PCT/WO94/29437)。對(duì)所述載體的進(jìn)一步修飾包括將啟動(dòng)子基因盒插入LTR片段，以產(chǎn)生雙拷貝載體(PCT/WO89/11539)。不過(guò)，在這兩種載體中，插入到載體主體上的或插入到LTR片段上的異源啟動(dòng)子直接同標(biāo)記/治療基因連接。
上文提及的早先所披露的帶有缺失的3′LTR的SIN載體(PCT/WO94/29437)還使用了一個(gè)強(qiáng)異源啟動(dòng)子，如巨細(xì)胞病毒(CMV)啟動(dòng)子，由它代替逆轉(zhuǎn)錄病毒5′LTR啟動(dòng)子(無(wú)U3 5′LTR)啟動(dòng)所述載體結(jié)構(gòu)在包裝細(xì)胞系中的表達(dá)。在3′LTR中還有一個(gè)異源聚腺苷酸化信號(hào)(PCT/WO94/29437)。
本發(fā)明的目的是要構(gòu)建一個(gè)新的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，可將其用作定位基因治療的安全的基因轉(zhuǎn)移載體，它與包裝結(jié)構(gòu)發(fā)生重組的可能性較少。這種新載體在3′LTR上帶有異源啟動(dòng)子和/或調(diào)節(jié)因子，在感染之后，該啟動(dòng)子和/或調(diào)節(jié)因子被復(fù)制并易位至靶細(xì)胞的5′LTR，最終控制標(biāo)記/治療基因的表達(dá)，這些基因并不直接同啟動(dòng)子連接，而是插入載體的主體上。這種載體不能進(jìn)行自動(dòng)失活，而能進(jìn)行啟動(dòng)子交換，給啟動(dòng)子轉(zhuǎn)變(Promoter Conversion)取名為Procon。
由于啟動(dòng)子轉(zhuǎn)變不會(huì)導(dǎo)致自動(dòng)失活，因此，逆轉(zhuǎn)錄病毒載體在靶細(xì)胞內(nèi)具有轉(zhuǎn)錄活性。不過(guò)，兩個(gè)LTRs會(huì)在靶細(xì)胞內(nèi)構(gòu)成一個(gè)大的異源啟動(dòng)子/增強(qiáng)子序列。這樣可以減少整合在靶細(xì)胞中的載體經(jīng)過(guò)較長(zhǎng)時(shí)間后發(fā)生失活的可能性，這種失活與已報(bào)導(dǎo)過(guò)常規(guī)載體的失活現(xiàn)象(Xu等，1989)相同；還可以減少與內(nèi)源逆轉(zhuǎn)錄病毒序列發(fā)生重組的可能性，而這種重組會(huì)產(chǎn)生潛在的致病性可復(fù)制病毒，因而提高了該系統(tǒng)的安全性。
在本發(fā)明中，未對(duì)逆轉(zhuǎn)錄病毒載體結(jié)構(gòu)的5′LTR進(jìn)行修飾，該病毒載體在包裝細(xì)胞中的表達(dá)由正常的逆轉(zhuǎn)錄病毒U3啟動(dòng)子啟動(dòng)?？梢赃M(jìn)行正常的逆轉(zhuǎn)錄病毒聚腺苷酸化，而且在3′LTR中沒(méi)有異源聚腺苷酸化信號(hào)。這對(duì)于體內(nèi)基因治療方法的改進(jìn)來(lái)說(shuō)是重要的，因?yàn)楸M管包裝細(xì)胞在產(chǎn)生重組病毒，但是通過(guò)正常病毒啟動(dòng)子進(jìn)行的正常生理調(diào)節(jié)，而且還可能涉及聚腺苷酸化的正常的病毒控制在很長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)都在體內(nèi)占據(jù)優(yōu)勢(shì)。
預(yù)計(jì)，對(duì)這種新逆轉(zhuǎn)錄病毒的進(jìn)一步修飾包括細(xì)胞的序列，而不是異源啟動(dòng)子和/或調(diào)節(jié)因子。這使得與細(xì)胞的序列的位點(diǎn)專(zhuān)一性重組有更高的選擇性，以便將逆轉(zhuǎn)錄病毒載體定向整合到縮主細(xì)胞基因組的特定位點(diǎn)(Saller，1994)。
為了實(shí)現(xiàn)上述及其它目的，本發(fā)明提供了一種能進(jìn)行啟動(dòng)子轉(zhuǎn)變的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，它包括結(jié)構(gòu)U3-R-U5的5′LTR片段；一個(gè)或幾個(gè)選自編碼和非編碼序列的序列；一個(gè)或多個(gè)選自編碼和非編碼序列的序列以及一個(gè)3′LTR片段，它包括完全或部分缺失的U3片段，其中，所述缺失的U3片段被一個(gè)多接頭序列所取代，隨后是R和U5片段。
所述多接頭序列帶有至少一個(gè)特有的限制位點(diǎn)，并且優(yōu)選帶有至少一個(gè)插入的異源DNA片段。所述異源DNA片段優(yōu)選是選擇的調(diào)節(jié)因子和啟動(dòng)子，其表達(dá)優(yōu)選是靶細(xì)胞專(zhuān)一性的，但也可能是沒(méi)有調(diào)節(jié)功能的DNA片段。
所述異源DNA片段優(yōu)選與一個(gè)或幾個(gè)細(xì)胞序列同源。所述調(diào)節(jié)因子和啟動(dòng)子優(yōu)選可由反式作用分子調(diào)節(jié)。
通過(guò)下面對(duì)本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施方案的說(shuō)明，可以理解本發(fā)明的其它目的、特征和優(yōu)點(diǎn)。
所述靶細(xì)胞專(zhuān)一性調(diào)節(jié)因子和啟動(dòng)子選自下列因子中的一個(gè)或幾個(gè)乳清酸性蛋白(WAP)，小鼠乳腺瘤病毒(MMTV)、β-乳球蛋白和酪蛋白專(zhuān)一性調(diào)節(jié)因子和啟動(dòng)子，胰腺專(zhuān)一性調(diào)節(jié)因子和啟動(dòng)子(包括碳酸酐酶11和β-葡糖激酶調(diào)節(jié)因子和啟動(dòng)子)，淋巴細(xì)胞專(zhuān)一性調(diào)節(jié)因子和啟動(dòng)子，(包括免疫球蛋白和MMTV淋巴細(xì)胞專(zhuān)一性調(diào)節(jié)因子和啟動(dòng)子)，以及MMTV專(zhuān)一性調(diào)節(jié)因子和啟動(dòng)子，MMTV專(zhuān)一性調(diào)節(jié)因子和啟動(dòng)子能賦予糖皮質(zhì)激素反應(yīng)性或指導(dǎo)在乳腺中的表達(dá)。所述調(diào)節(jié)因子和啟動(dòng)子優(yōu)選調(diào)節(jié)所述逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的至少一個(gè)編碼序列的表達(dá)。所述LTR片段選自下列因子中的至少一個(gè)鼠白血病病毒(MLV)、小鼠乳腺瘤病毒(MMTV)、鼠肉瘤病毒(MSV)、猴免疫缺損病毒(SIV)、人免疫缺損病毒(HIV)、人嗜T淋巴細(xì)胞病毒(HTLV)、豬免疫缺損病毒(FIV)、豬白血病病毒(FELV)、牛白血病病毒(BLV)和Mason-Pfizer-猴病毒(MPMV)。
所述逆轉(zhuǎn)錄病毒載體優(yōu)選是基于BAG載體(Price等，1987)或LXSN載體(Miller和Rosman，1989)。
所述編碼序列優(yōu)選是選自下列因子中的一個(gè)或幾個(gè)標(biāo)記基因、治療基因、抗病毒基因、抗瘤基因和細(xì)胞因子基因。
所述標(biāo)記和治療基因優(yōu)選選自下列因子中的一個(gè)或幾個(gè)β-半乳糖苷酶基因、新霉素基因、單純皰疹病毒胸腺嘧啶激酶基因、嘌呤霉素基因、胞嘧啶脫氨酶基因、潮霉素基因、分泌堿性磷酸酶基因、鳥(niǎo)嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(gpt)基因、醇脫氫酶基因和次黃嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(HPRT)基因。
本發(fā)明另一個(gè)實(shí)施方案中設(shè)計(jì)改變或部分缺失至少一段逆轉(zhuǎn)錄病毒整合所需的逆轉(zhuǎn)錄病毒序列。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了一種逆轉(zhuǎn)錄病毒載體系統(tǒng)，它包括作為第一個(gè)部分的一個(gè)上述逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，還包括一個(gè)包裝細(xì)胞系，該細(xì)胞系具有編碼待包裝的所述逆轉(zhuǎn)錄病毒載體所需的蛋白質(zhì)的至少一種逆轉(zhuǎn)錄病毒結(jié)構(gòu)或重組逆轉(zhuǎn)錄病毒結(jié)構(gòu)。
所述包裝細(xì)胞系具有編碼這種逆轉(zhuǎn)錄病毒蛋白的逆轉(zhuǎn)錄病毒結(jié)構(gòu)或重組逆轉(zhuǎn)錄病毒結(jié)構(gòu)，這種蛋白不能由所述逆轉(zhuǎn)錄病毒載體編碼。所述包裝細(xì)胞系優(yōu)選選自包括psi-2、psi-Crypt、psi-AM、GP+E-86、PA317和GP+envAM-12，或選自任何用重組結(jié)構(gòu)超感染的使能表達(dá)來(lái)源于其它有包膜的病毒的表面蛋白的因子。
本發(fā)明的另一種實(shí)施方案涉及使用具有缺乏整合酶功能的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒結(jié)構(gòu)的包裝細(xì)胞系。
在把本發(fā)明的上述逆轉(zhuǎn)錄病毒載體引入逆轉(zhuǎn)錄病毒包裝細(xì)胞系并感染所述靶細(xì)胞之后，提供一種逆轉(zhuǎn)錄病毒的原病毒，其中，在被感染靶細(xì)胞的逆轉(zhuǎn)錄過(guò)程中，所述多接頭和插入所述3′LTR上的多接頭里的任何序列都被復(fù)制，并在所得到的原病毒的3′LTR也在所得原病毒的5′LTR中出現(xiàn)。
本發(fā)明還包括本發(fā)明的逆轉(zhuǎn)錄病毒原病毒的mRNA以及根據(jù)本發(fā)明由逆轉(zhuǎn)錄病毒載體所產(chǎn)生的任何RNA。
本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案提供了用于通過(guò)體外和體內(nèi)方式把同源和/或異源核苷酸序列導(dǎo)入人體或動(dòng)物體內(nèi)的非治療方法，包括用本發(fā)明的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體轉(zhuǎn)染本發(fā)明逆轉(zhuǎn)錄病毒載體系統(tǒng)的包裝細(xì)胞系，并用由該包裝細(xì)胞系所產(chǎn)生的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒感染靶細(xì)胞群。所述核苷酸序列選自下列因子中的一個(gè)或幾個(gè)編碼蛋白質(zhì)的基因或該基因的一部分、調(diào)節(jié)序列和啟動(dòng)子。
所述逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體系統(tǒng)和逆轉(zhuǎn)錄病毒原病毒及其RNA可用來(lái)生產(chǎn)用于包括人在內(nèi)的動(dòng)物基因治療的藥用組合物。另外，還可將其定向整合到同源細(xì)胞序列中。
本發(fā)明應(yīng)用了典型的逆轉(zhuǎn)錄病毒啟動(dòng)子轉(zhuǎn)變?cè)怼?br> 所述逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組由一個(gè)具有結(jié)構(gòu)R-U5-gag-pol-env-U3-R的RNA分子組成(圖2)。在逆轉(zhuǎn)錄過(guò)程中，該U5片段被復(fù)制并位于所產(chǎn)生的DNA分子的右手端，同時(shí)，U3片段也被復(fù)制并位于所產(chǎn)生的DNA分子的左手端(圖2)。所得到的結(jié)構(gòu)U3-R-U5被稱(chēng)為L(zhǎng)TR(長(zhǎng)末端重復(fù)序列)，因此它們是相同的并且是在該DNA結(jié)構(gòu)或原病毒的兩端重復(fù)的(Varmus，1988)。原病毒左手端的U3片段具有啟動(dòng)子(見(jiàn)下文)。該啟動(dòng)子啟動(dòng)一種RNA轉(zhuǎn)錄物的合成，該合成始于左側(cè)U3和R片段之間的邊界，終止于右側(cè)R和U5片段之間的邊界(圖2)。該RNA被包裝成逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒，并被轉(zhuǎn)移到待感染的靶細(xì)胞里。在靶細(xì)胞中，該RNA基因組以上述方式再次進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。
根據(jù)本發(fā)明，構(gòu)建了一種逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，其中，右側(cè)的U3片段被改變(圖3)，但保持了正常的左側(cè)U3結(jié)構(gòu)(圖3)；利用位于左側(cè)U3片段里的正常逆轉(zhuǎn)錄病毒啟動(dòng)子，可將所述載體轉(zhuǎn)錄成RNA。不過(guò)，所產(chǎn)生的RNA將僅帶有改變了的右側(cè)U3結(jié)構(gòu)。逆轉(zhuǎn)錄之后，在感染的靶細(xì)胞中所述改變了的U3結(jié)構(gòu)位于逆轉(zhuǎn)錄病毒結(jié)構(gòu)的兩端(圖3)。
如果改變了的片段帶有多接頭(見(jiàn)下文)而不是U3片段，可以輕易地插入任何啟動(dòng)子，包括指導(dǎo)組織專(zhuān)一性表達(dá)的啟動(dòng)子，如WAP啟動(dòng)子(見(jiàn)下文)。這種啟動(dòng)子局限于用在所述靶細(xì)胞中，用于表達(dá)由該逆轉(zhuǎn)錄病毒載體所攜帶的連鎖基因的表達(dá)?；蛘呋虺酥?，為了基因定向的目的，可用同源重組的方法將與一個(gè)或幾個(gè)細(xì)胞序列同源的DNA片段插入所述多接頭中(見(jiàn)下文)。
根據(jù)本發(fā)明，“多接頭”是指短的人工合成的DNA片段，該片段上帶有若干獨(dú)特的限制位點(diǎn)，使得任何啟動(dòng)子或DNA片段都容易被插入?！爱愒吹摹币辉~是指在自然界中正常情況下非密切毗連的DNA序列的任意組合。
基因表達(dá)由啟動(dòng)子調(diào)節(jié)。缺乏啟動(dòng)子功能時(shí)基因?qū)⒉荒軌虮磉_(dá)。實(shí)際上，正常的MLV逆轉(zhuǎn)錄病毒啟動(dòng)子是非選擇性的，即，它在大多數(shù)類(lèi)型的細(xì)胞中都是有活性的(Majors，1990)。不過(guò)，若干現(xiàn)有啟動(dòng)子僅能在極為特殊的細(xì)胞類(lèi)型中表現(xiàn)出活性。理想的候選方案是將這種組織專(zhuān)一性啟動(dòng)子用于調(diào)節(jié)逆轉(zhuǎn)錄病毒載體上的基因的表達(dá)是，和將治療基因限制在特定的靶細(xì)胞中表達(dá)。
在所述包裝細(xì)胞系中，所述逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的表達(dá)是由U3片段上的正常的非選擇性逆轉(zhuǎn)錄病毒啟動(dòng)子調(diào)節(jié)(圖3)。然而，一旦該載體進(jìn)入所述靶細(xì)胞，就會(huì)發(fā)生啟動(dòng)子轉(zhuǎn)變，而且，治療或標(biāo)記基因，如b-半乳糖苷酶由選擇導(dǎo)入多接頭中的組織專(zhuān)一性啟動(dòng)子啟動(dòng)表達(dá)(圖3)。事實(shí)上，不僅可將任何組織專(zhuān)一性啟動(dòng)子包括在該系統(tǒng)內(nèi)，以便對(duì)多種不同的細(xì)胞類(lèi)型進(jìn)行選擇定向，此外，在發(fā)生轉(zhuǎn)變之后該逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)也不再與病毒類(lèi)似。當(dāng)然，從安全角度考慮，這具有極為重要的后果，因?yàn)槠胀ǖ幕颥F(xiàn)有的人工逆轉(zhuǎn)錄病毒載體易于同逆轉(zhuǎn)錄包裝結(jié)構(gòu)和/或內(nèi)源逆轉(zhuǎn)錄病毒發(fā)生遺傳重組，產(chǎn)生潛在地致病性的病毒。啟動(dòng)子轉(zhuǎn)變(Procon)載體不同于逆轉(zhuǎn)錄病毒，因?yàn)檗D(zhuǎn)變之后它不再帶有U3逆轉(zhuǎn)錄病毒啟動(dòng)子，從而減少了遺傳重組的可能性。
所述逆轉(zhuǎn)錄病毒啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)被攜帶于LTR的U3片段里。LTRs上攜帶有使其能整合到靶細(xì)胞基因組上的信號(hào)。這種逆轉(zhuǎn)錄病毒原病毒的整合也可歸因于病原性變化(Van Lohuizen和Berns，1990)。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，Procon載體可以攜帶修飾的LTRs，而不再攜帶整合所需的信號(hào)。這又會(huì)提高這種載體系統(tǒng)的潛在安全性。
基因定向按照本發(fā)明的另一方面，可將所述逆轉(zhuǎn)錄病毒載體用于定向整合到靶細(xì)胞中。與諸如腺病毒的其它病毒相比，將原病毒DNA形式的逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組整合到靶細(xì)胞中是對(duì)將逆轉(zhuǎn)錄病毒用作載體的一個(gè)重大發(fā)展，因?yàn)樗茏屴D(zhuǎn)移的基因長(zhǎng)期穩(wěn)定地表達(dá)。不過(guò)，這種整合的隨機(jī)性會(huì)對(duì)逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的使用造成大的缺陷，因?yàn)樗黾恿思?xì)胞腫瘤抑制基因或原癌基因插入失活并從而誘發(fā)腫瘤的可能性(Van Lohuizen Berns，1990)。
業(yè)已將同源重組成功地用于把轉(zhuǎn)染或顯微注射的DNA定向整合特定的DNA位點(diǎn)上，并將其普遍用于構(gòu)建“失效”轉(zhuǎn)基因小鼠或動(dòng)物(參見(jiàn)Capecchi，1989的綜述；Bradley等，1992；Morrow和Kucherlapati，1993)。遺憾的是，借助這種純物理方法的基因轉(zhuǎn)移效率極低。相反，由逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移十分有效，可機(jī)乎100％地感染細(xì)胞群。逆轉(zhuǎn)錄病毒基因轉(zhuǎn)移與同源重組相結(jié)合，可以構(gòu)成一種理想的基因座定向整合系統(tǒng)。
我們已研究了將長(zhǎng)的同源DNA片段引入逆轉(zhuǎn)錄病毒上的不同位點(diǎn)，以促進(jìn)通過(guò)同源重組進(jìn)行整合的可行性(Saller，1994)。對(duì)基因轉(zhuǎn)變和同源重組都進(jìn)行了評(píng)價(jià)。用帶有單拷貝HSV-tk基因的細(xì)胞系作為靶細(xì)胞，我們能夠以高出以前由他人報(bào)道過(guò)的頻率15倍的頻率破壞靶序列(Ellis和Bernstein，1989)。重組的DNA片段的克隆證明了靶tK序列和逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的存在(Saller，1994)。
為了進(jìn)行定向整合，將與細(xì)胞的序列同源的DNA片段插入ProCon載體的多接頭上。在感染靶細(xì)胞及逆轉(zhuǎn)錄之后，這些序列將出現(xiàn)在該原病毒的5′末端。已證實(shí)末端同源性有利于與同基因細(xì)胞序列(Bradley，1991)的同源重組(Bradley，1991)。通過(guò)感染攜帶有突變形式的同源序列的靶細(xì)胞，可導(dǎo)致重組，并從而修復(fù)突變序列?；蚴莾H有同源序列重組到細(xì)胞基因組里，或是整個(gè)載體被插入(Saller，1994)。這種載體不僅可用于基因修復(fù)，還可用于指導(dǎo)帶有治療基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體整合到所述基因組的特定基因座上，已知其不具有活性基因。這將導(dǎo)致上述插入激活或失活的可能性明顯減少，并從而有助于使用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的安全性。
下面的實(shí)施例將對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步說(shuō)明。不過(guò)，這些實(shí)施例并非用于限定本發(fā)明的范圍，因?yàn)橐獙?duì)其做出明顯改進(jìn)是顯而易見(jiàn)的，而且，對(duì)本領(lǐng)域的任何熟練技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，其它改進(jìn)和替換也是顯而易見(jiàn)的。
用于實(shí)施例本發(fā)明的重組DNA方法為標(biāo)準(zhǔn)方法，為本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員所熟知，并在以下文獻(xiàn)中有詳細(xì)記載，例如“分子克隆”(Molecular Cloning)(Sambrook等，1989)和“分子克隆實(shí)踐指南”(APractical Guide to MolecularCloning)(Perbal，1984)。
對(duì)下列實(shí)施例中涉及到的附圖的簡(jiǎn)要說(shuō)明如下圖1逆轉(zhuǎn)錄病毒載體系統(tǒng)圖2逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組，逆轉(zhuǎn)錄圖3ProCon原理圖4PCR分析，MLV探針圖5PCR分析，MMTV探針圖6β-半乳糖苷酶在感染的NIH和EF43細(xì)胞中的表達(dá)圖7β-半乳糖苷酶在感染的來(lái)自妊娠的小鼠初生乳腺中的表達(dá)圖8在把病毒注射到妊娠的Balb/c小鼠的乳腺及皮膚之后β-半乳糖苷酶的表達(dá)圖9β-半乳糖苷酶在感染的乳腺瘤細(xì)胞中的表達(dá)圖10逆轉(zhuǎn)錄病毒載體通過(guò)同源重組進(jìn)行的定向整合實(shí)施例1用帶有乳腺專(zhuān)一性啟動(dòng)子的ProCon載體感染之后的乳腺專(zhuān)一性表達(dá)。
在被稱(chēng)為BAG的鼠白血病病毒(MLV)逆轉(zhuǎn)錄載體上(Price等，1987)，β-半乳糖苷酶基因是由LTR的U3片段上的濫交(即非組織專(zhuān)一性)MLV啟動(dòng)子啟動(dòng)(圖3)。根據(jù)本發(fā)明，構(gòu)建了一個(gè)BAG載體的衍生物，其中，位于3′LTR(圖3)上的MLV啟動(dòng)子(U3)缺失并被一個(gè)多接頭所取代，所述多接頭有利于引入異源啟動(dòng)子。在被導(dǎo)入包裝細(xì)胞系之后，所述缺少U3的BAG載體由5′LTR上的MLV啟動(dòng)子(U3)啟動(dòng)表達(dá)。在感染其靶細(xì)胞之后，由于在其生活周期中所發(fā)生的逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組的重組，會(huì)使所述多接頭在上述逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組的兩端被復(fù)制。因此，可以構(gòu)建這樣的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，其中，可由任何插入多接頭中的異源啟動(dòng)子來(lái)操縱BAG的β-半乳糖苷酶基因在靶細(xì)胞中的表達(dá)(圖3)。
根據(jù)上面所提出的原理，已將下述特殊啟動(dòng)子插入多接頭片段或修飾的BAG載體小鼠乳腺瘤病毒(MMTV)啟動(dòng)子的幾個(gè)亞片段，包括能賦予糖皮質(zhì)激素反應(yīng)性的片段和帶有一個(gè)指導(dǎo)乳腺表達(dá)的因子的片段。
乳清酸性蛋白(WAP)啟動(dòng)子。該啟動(dòng)子控制WAP的表達(dá)，使其僅在妊娠并泌乳的嚙齒動(dòng)物的乳腺中產(chǎn)生。
用所構(gòu)建的MMTV和WAP逆轉(zhuǎn)錄病毒載體感染各種細(xì)胞的感染研究，已證實(shí)了插入多接頭的啟動(dòng)子對(duì)β-半乳糖苷酶基因表達(dá)的控制。
為了產(chǎn)生逆轉(zhuǎn)錄病毒載體顆粒，已把攜帶有MMTV和WAP的ProCon載體轉(zhuǎn)染到包裝細(xì)胞系GP+E86里(Markowitz等，1988)。通過(guò)新霉素抗性篩選(該抗性是由載體編碼)，獲得了能產(chǎn)生重組ProCon病毒的細(xì)胞的穩(wěn)定群體及克隆。用含有病毒的該細(xì)胞群體的上清液感染小鼠乳腺細(xì)胞系EF43(Günzburg等，1988)及小鼠成纖維細(xì)胞系(Jainchill等，1969)。感染4天之后裂解靶細(xì)胞，并進(jìn)行定量β-半乳糖苷酶分析，分析結(jié)果表明，由帶有WAP的ProCon載體感染的每一種細(xì)胞都沒(méi)有表達(dá)，而在由帶有MMTV的ProCon載體感染的兩種細(xì)胞中都能很好地表達(dá)(圖6)。這一結(jié)果與WAP啟動(dòng)子的行為一致，該WAP啟動(dòng)子僅能在孕晚期和泌乳期在體內(nèi)起作用，而不能以EF43細(xì)胞為代表的在大多數(shù)單純的體外乳腺細(xì)胞培養(yǎng)體系中起作用。為了研究帶有WAP的ProCon載體是否在復(fù)雜的由初生乳腺衍生的細(xì)胞系培養(yǎng)系統(tǒng)中有活性，對(duì)獲自8-10天妊娠期小鼠(圖7)或乳腺瘤(圖9)的初生器官進(jìn)行培養(yǎng)，并用轉(zhuǎn)染細(xì)胞系的同一穩(wěn)定轉(zhuǎn)染群體的上清液感染。通過(guò)β-半乳糖苷酶活性證實(shí)，帶有WAP啟動(dòng)子片段的Procon載體和帶有MMTV啟動(dòng)子片段的Procon載體在該初生細(xì)胞(圖7)和乳腺瘤衍生細(xì)胞(圖9)中都有活性。
為了研究帶有WAP和MMTV的ProCon載體在體內(nèi)是否有活性，以及β-半乳糖苷酶的表達(dá)是否局限于體內(nèi)乳腺，將含有ProCon病毒的介質(zhì)原位注射到妊娠期為8-10天的小鼠的乳腺或皮膚里。5天后殺死小鼠，制備細(xì)胞提取物并進(jìn)行β-半乳糖苷酶分析。帶有WAP片段的Procon載體和MTV片段的ProCon載體都只能在妊娠的乳腺中表達(dá)，而不能在皮膚里表達(dá)(參見(jiàn)圖8中的M和S)。因此，在體內(nèi)，兩個(gè)啟動(dòng)子的調(diào)節(jié)因子把表達(dá)局限于乳腺，而在體外，WAP啟動(dòng)子的調(diào)節(jié)因子保留其嚴(yán)格的組織專(zhuān)一性，但MMTV啟動(dòng)子的調(diào)節(jié)因子則不然。
這種帶有組織專(zhuān)一性啟動(dòng)子和調(diào)節(jié)因子的ProCon載體可用于指導(dǎo)治療基因在預(yù)定類(lèi)型細(xì)胞、組織和器官中的表達(dá)?？捎玫闹委熁虬ň哂锌笻IV和抗腫瘤作用的蜂毒肽基因，和能引起細(xì)胞死亡的基因(包括胸腺嘧啶激酶基因、鳥(niǎo)嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶基因和胞嘧啶脫氨酶基因，細(xì)胞色素P450基因，以及如SDI/WAF-1/CIP-1的與細(xì)胞周期調(diào)節(jié)有關(guān)的基因)。
實(shí)施例2證實(shí)由ProCon載體感染的細(xì)胞中的啟動(dòng)子轉(zhuǎn)變，該載體原先就在3′LTR中攜帶有MMTV啟動(dòng)子。
將帶有來(lái)自小鼠乳腺瘤病毒(MMTV)的啟動(dòng)子片段的ProCon載體轉(zhuǎn)染到一個(gè)包裝細(xì)胞系里，并把所得到的重組載體顆粒用于感染所建立的人膀胱癌細(xì)胞系(EJ)。在含有新霉素類(lèi)似物G418的培養(yǎng)基里對(duì)感染的細(xì)胞克隆進(jìn)行選擇(因?yàn)樗幂d體上帶有由內(nèi)部SV40啟動(dòng)子啟動(dòng)的新霉素抗性基因)。用感染的克隆之一和未轉(zhuǎn)染的親代EJ細(xì)胞制備DNA，并用所制備的DNA進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)。PCR反應(yīng)是用兩個(gè)引物中的一個(gè)進(jìn)行的，該引物專(zhuān)一性識(shí)別并結(jié)合MMTV序列(圖4和5中的A，B)或LTR的MLVR片段(圖4中的C)，與此同時(shí)有一個(gè)引物位于標(biāo)記基因里(圖4和5)。由于所述標(biāo)記基因引物僅位于MMTV(或MLVR片段)序列的下游，如果發(fā)生啟動(dòng)子轉(zhuǎn)變，由MMTV引物所獲得的正PCR信號(hào)與標(biāo)記基因引物一起指示這一變化。在圖4中，在同來(lái)自MLV序列的標(biāo)記片段雜交之后顯示出采用引物A、B或C的PCR產(chǎn)物，證實(shí)了所有3種產(chǎn)物都來(lái)源于MLV序列。片段的大小可以證實(shí)已發(fā)生了啟動(dòng)子轉(zhuǎn)變。圖5表示采用引物A和B并與MMTV特異探針雜交的PCR產(chǎn)物，再次證實(shí)已發(fā)生了啟動(dòng)子轉(zhuǎn)變。
實(shí)施例3構(gòu)建用于定向整合的ProCon載體可利用與上述實(shí)施例1中相同的BAG載體構(gòu)建逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，其中，可將與細(xì)胞序列同源的DNA序列插入到LTR中。所得到的載體可用于將插入到該載體的同源序列或該載體的全部或部分定向整合到宿主細(xì)胞基因組中的同源序列中。
按照以上提出的原理，已將單純皰疹病毒(HSV)的胸腺嘧啶激酶(tk)基因的片段插入到修飾的BAG載體的多接頭部分(tk突變體見(jiàn)圖10，Saller，1994)。
業(yè)已建立起一個(gè)細(xì)胞系，它沒(méi)有哺乳動(dòng)物tk基因的功能性拷貝，而帶有HSV-tk基因的一個(gè)拷貝(Saller，1994)。已用帶有tk的BAG載體對(duì)該細(xì)胞系進(jìn)行了感染，并篩選到了HSV-tk基因已被破壞的細(xì)胞(圖10)。
上述實(shí)施例說(shuō)明了本發(fā)明所提供的載體發(fā)生啟動(dòng)子轉(zhuǎn)變的原理和結(jié)果。
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權(quán)利要求
1.一種能進(jìn)行啟動(dòng)子轉(zhuǎn)變的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，該病毒載體包括結(jié)構(gòu)U3-R-U5的一個(gè)5′LTR片段；一個(gè)或幾個(gè)選自編碼和非編碼序列的序列；以及一個(gè)包括全部或部分缺失的U3片段的3′LTR片段，其中，所述缺失的U3片段由多接頭序列取代，隨后是R和U5片段。
2.如權(quán)利要求1的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，該逆轉(zhuǎn)錄病毒載體包括結(jié)構(gòu)U3-R-U5的一個(gè)5′LTR片段；一個(gè)或幾個(gè)選自編碼和非編碼序列的序列；以及一個(gè)包括全部或部分缺失的U3片段的3′LTR片段，其中，所述缺失的U3片段由多接頭序列取代，隨后是R和U5片段。
3.如權(quán)利要求1的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，其特征在于所述多接頭序列帶有至少一個(gè)特異性的限制位點(diǎn)。
4.如權(quán)利要求3的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，其特征在于所述多接頭序列帶有至少一個(gè)插入的異源DNA片段。
5.如權(quán)利要求4的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，其特征在于所述異源DNA片段選自調(diào)節(jié)因子和啟動(dòng)子中的一個(gè)或幾個(gè)。
6.如權(quán)利要求5的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，其特征在于所述調(diào)節(jié)因子和啟動(dòng)子的表達(dá)是靶細(xì)胞專(zhuān)一性的。
7.如權(quán)利要求6的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，其特征在于所述靶細(xì)胞專(zhuān)一性的調(diào)節(jié)因子和啟動(dòng)子選自下列組份中的一個(gè)或幾個(gè)WAP、MMTV、b-乳球蛋白和酪蛋白專(zhuān)一性調(diào)節(jié)因子和啟動(dòng)子，胰腺專(zhuān)一性調(diào)節(jié)因子和啟動(dòng)子(包括碳酸酐酶11和b-葡糖激酶調(diào)節(jié)因子和啟動(dòng)子)，淋巴細(xì)胞專(zhuān)一性調(diào)節(jié)因子和啟動(dòng)子(包括免疫球蛋白和MMTV淋巴細(xì)胞專(zhuān)一性調(diào)節(jié)因子和啟動(dòng)子)，以及能賦予糖皮質(zhì)激素反應(yīng)性或指導(dǎo)乳腺表達(dá)的MMTV專(zhuān)一性調(diào)節(jié)因子和啟動(dòng)子。
8.如權(quán)利要求5-7中任一項(xiàng)的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，其特征在于所述調(diào)節(jié)因子和啟動(dòng)子調(diào)節(jié)所述逆轉(zhuǎn)錄病毒的至少一個(gè)編碼序列的表達(dá)。
9.如權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，其特征在于所述LTR片段選自下列組份的LTRs中的至少一個(gè)MLV、MMTV、MSV、SIV、HIV、HTLV、FIV、FelV、BLV和MPMV的LTRs。
10.如權(quán)利要求1-9中任一項(xiàng)的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，其特征在于所述逆轉(zhuǎn)錄病毒載體是BAG載體。
11.如權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，其特征在于所述編碼序列選自下列組份中的一個(gè)或幾個(gè)標(biāo)記基因，治療基因、抗病毒基因、抗腫瘤基因和細(xì)胞因子基因。
12.如權(quán)利要求11的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，其特征在于所述標(biāo)記或治療基因選自下列組份中的一個(gè)或幾個(gè)b-半乳糖苷酶基因和新霉素基因，單純皰疹病毒，胸腺嘧啶激酶基因，嘌呤霉素基因，胞嘧啶胞脫氨酶基因，潮霉素基因，分泌堿性磷酸酶基因，鳥(niǎo)嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(gpt)基因，醇脫氫酶基因和次黃嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(HPRT)基因。
13.如權(quán)利要求1-12中任一項(xiàng)的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，其特征在于所述編碼逆轉(zhuǎn)錄病毒蛋白的編碼序列中的至少一個(gè)被改變或至少部分缺失。
14.如權(quán)利要求1-13中任一項(xiàng)的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，其特征在于涉及逆轉(zhuǎn)錄病毒整合的逆轉(zhuǎn)錄病毒序列被改變或至少部分缺失。
15.如權(quán)利要求1-14中任一項(xiàng)的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，其特征在于所述異源DNA片段與一個(gè)或幾個(gè)細(xì)胞序列或該序列的一部分同源。
16.如權(quán)利要求1-15中任一項(xiàng)的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，其特征在于所述調(diào)節(jié)因子可由反式作用分子調(diào)節(jié)。
17.一種逆轉(zhuǎn)錄病毒載體系統(tǒng)，該逆轉(zhuǎn)錄病毒載體系統(tǒng)包括作為第一個(gè)部分的一個(gè)如權(quán)利要求1-16中任一項(xiàng)的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，和一個(gè)包裝細(xì)胞系，該包裝細(xì)胞系具有至少一個(gè)編碼包裝所述逆轉(zhuǎn)錄病毒載體所需的蛋白質(zhì)的逆轉(zhuǎn)錄病毒或重組逆轉(zhuǎn)錄病毒結(jié)構(gòu)。
18.如權(quán)利要求17的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，其特征在于所述包裝細(xì)胞系具有編碼逆轉(zhuǎn)錄病毒蛋白的逆轉(zhuǎn)錄病毒結(jié)構(gòu)或重組逆轉(zhuǎn)錄病毒結(jié)構(gòu)，該逆轉(zhuǎn)錄病毒蛋白不能由權(quán)利要求1-16中任一項(xiàng)的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體編碼。
19.如權(quán)利要求17或18的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，其特征在于所述包裝細(xì)胞系選自psi-2、psi-Crypt、psi-AM、GP+E-86、PA317和GP+envAM-12。
20.一種在體外和在體內(nèi)將同源或異源核苷酸序列導(dǎo)入人或動(dòng)物細(xì)胞的治療或非治療方法，該方法包括用如權(quán)利要求1-16中任一項(xiàng)的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體轉(zhuǎn)染如權(quán)利要求17-19中任一項(xiàng)的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體系統(tǒng)的包裝細(xì)胞系，還包括用由所述包裝細(xì)胞系所產(chǎn)生的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒感染靶細(xì)胞群體。
21.如權(quán)利要求20的治療或非治療方法，其特征在于所述核苷酸序列選自下列組份中的一個(gè)或幾個(gè)編碼蛋白質(zhì)的基因或基因的部分、調(diào)節(jié)序列或啟動(dòng)子。
22.通過(guò)在如權(quán)利要求17-19中任一項(xiàng)的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體系統(tǒng)中復(fù)制如權(quán)利要求1-16中任一項(xiàng)的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體所產(chǎn)生的一種逆轉(zhuǎn)錄病毒原病毒，其特征在于，在感染的靶細(xì)胞中的逆轉(zhuǎn)錄過(guò)程中，所述多接頭或任何插入到3′LTR的所述多接頭中的序列被復(fù)制，并出現(xiàn)在所產(chǎn)生的原病毒的5′LTR和3′LTR中。
23.將權(quán)利要求1-16中任一項(xiàng)的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體用來(lái)生產(chǎn)可用于包括人在內(nèi)的哺乳動(dòng)物的基因治療的藥用組合物。
24.將權(quán)利要求17-19中任一項(xiàng)的逆轉(zhuǎn)錄病毒系統(tǒng)用來(lái)生產(chǎn)可用于包括人在內(nèi)的哺乳動(dòng)物的基因治療的藥用組合物。
25.將權(quán)利要求22的逆轉(zhuǎn)錄病毒原病毒用來(lái)生產(chǎn)可用于包括人在內(nèi)的哺乳動(dòng)物的基因治療的藥用組合物。
26.將權(quán)利要求1-16中任一項(xiàng)的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體用于整合至所述同源的細(xì)胞序列上的定向整合。
27.將權(quán)利要求17-19中任一項(xiàng)的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體用于整合至所述同源的細(xì)胞序列上的定向整合。
28.將權(quán)利要求22的逆轉(zhuǎn)錄病毒原病毒用于整合至所述同源的細(xì)胞序列上的定向整合。
29.如權(quán)利要求22的逆轉(zhuǎn)錄病毒原病毒的mRNA。
30.如權(quán)利要求1-16中任一項(xiàng)的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的RNA。
31.用權(quán)利要求1-16中任一項(xiàng)的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體轉(zhuǎn)染權(quán)利要求17-19中任一項(xiàng)的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體系統(tǒng)的包裝細(xì)胞系，并在合適條件下培養(yǎng)該細(xì)胞系所得到的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒。
32.一種藥用組合物，該藥用組合物含有治療有效劑量的如權(quán)利要求31的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒。
全文摘要
本發(fā)明涉及能進(jìn)行啟動(dòng)子轉(zhuǎn)變的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，它包括結(jié)構(gòu)U3-R-U5的一個(gè)5′LTR片段；一個(gè)或幾個(gè)選自編碼和非編碼序列的序列；以及包括全部或部分缺失的U3片段的3′LTR片段，其中，所述缺失的U3片段被一個(gè)多接頭序列取代，其后是R和U5片段。所述逆轉(zhuǎn)錄病毒載體能進(jìn)行啟動(dòng)子轉(zhuǎn)變，并可用作定位基因治療的基因轉(zhuǎn)移載體。
文檔編號(hào)A61K48/00GK1159210SQ95194903
公開(kāi)日1997年9月10日 申請(qǐng)日期1995年9月1日 優(yōu)先權(quán)日1994年9月2日
發(fā)明者沃爾特·H·岡茲伯格, 羅伯特·M·薩勒 申請(qǐng)人:Gsf環(huán)境與健康研究中心有限公司