專利名稱：含d-2-烷基色氨酸的能促進生長激素釋放的多肽化合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及含有D-2-烷基色氨酸的寡肽化合物，該化合物可以使親軀體細胞(somatotrope)釋放生長激素(GH)，而且口服時具有活性。
在給哺乳動物服用能誘導(dǎo)生長激素(GH)釋放的化合物之后，動物體內(nèi)的GH水平提高。在服藥后如果獲得足夠高的GH水平的話，可使得動物的生長加快、產(chǎn)肉量增加、并能提高產(chǎn)乳量。而且，業(yè)已知道，給哺乳動物服用已知的生長激素釋放劑，如生長激素釋放激素(GHRH)，可以提高動物的生長激素水平。
給動物服用生長激素釋放肽也可以提高其體內(nèi)的生長激素水平，某些肽在以前已經(jīng)公開，例如，可參考如下美國專利US 4,223,019、US4,223,020、US 4,223,021、US 4,224,316、US 4,226,857、US4,228,155、US 4,228,156、US 4,228,157、US 4,228,158、US4,410,512、US 4,410,513、US 4,411,890和US 4,839,344。
因此，目前需要的是相當(dāng)簡單的、能夠促進生長激素釋放的短鏈多肽，這種多肽還要具備如下條件制備起來簡單、方便，易于純化和配制，而且口服時具有活性。
多年來研究較多的生長激素釋放肽(GHRP)之一是GHRP-6(C.Y.Bowers等，Endocrinology 1141537(1984))，其結(jié)構(gòu)式為His-D-Trp-Ala-Trp-D-Phe-Lys-NH2。GHRP-6在體外和體內(nèi)都能釋放生長激素，而且動物和人口服時都有活性。其分子機理業(yè)已被研究過，還有其類似物之一的七肽GHRP-1(Cheng等，Endocrinology 1242791(1989)；M.S.Akman等，Endocrinology1321286(1993))也已被研究過。業(yè)已發(fā)現(xiàn)，與天然GHRP相反，這些肽是通過不同的GH釋放受體和不同的機制起作用，它們獨立于cAMP，而且是通過其它的胞內(nèi)途徑，如供鈣轉(zhuǎn)移途徑和依賴于蛋白激酶C(PKC)的過程起作用(L.Bresson-Bepoldin和L.Dufy-Barbe，Cell.Calcium 15，247，(1994))。
業(yè)已發(fā)現(xiàn)，在GHRP系列的寡肽中引入D-2-烷基色氨酸(2-Mrp)，可以全新的方式修飾已知的胞內(nèi)GH釋放機制。在某些場合，業(yè)已證實其能夠明顯提高鼠和人的腦垂體前葉中腺苷酸環(huán)化酶的活性，但其具體的機理尚有待徹底查明。
因此，通過在色氨酸的2-位(在其D-構(gòu)型上)引入一個烷基所進行的修飾，除了有利于提高Trp殘基的穩(wěn)定性之外(R.DeghenghiWO 91/18016，
公開日為1991年11月28日；R.Deghenghi等，LifeSciences 54，1321，(1994))，而且還能出人意料地徹底改變其胞內(nèi)機制，使其獨立于鈣，有時依賴于腺苷酸環(huán)化酶，而且它更類似于GHRH，及其它肽激素(James D.Watson等，Molecular Biology of the Gene，4th版，The Benj arnin/Cummings Publishing Company，Inc.，Menlo Park，California，1987，P.60)。
本發(fā)明的其它意外的特殊特征是，某些五肽、六肽和七肽具有很高的效價和理想的口服活性/效價比，該系列較小的四肽也是如此。
本發(fā)明寡肽的分子式如下A-D-Mrp-(Ala)n-B-C，其中，A是任何天然L-氨基酸或其D-異構(gòu)體，前提是，如果B是Trp而C是D-Phe-Lys-NH2的話，A不是His，或者A是咪唑乙酰基、異哌啶甲?；?isonipecotyl)、4-氨基丁?；?，4-(氨基甲基)環(huán)己烷羰基、Glu-Tyr-Ala-His、Tyr-Ala-His、Tyr-His、D-Thr-His，更理想的是，A是D-Ala、D-Thr、Tyr；D為右旋異構(gòu)體，Mrp是2-烷基色氨酸，最好是2-甲基色氨酸；n是0或1；B是L-或D-Trp、Phe或D-β-Nal；C是NH2、D-Phe-LysNH2、Phe-LysNH2、D-Trp-LysNH2、D-Phe-Lys-ThrNH2、D-Phe-Lys-D-ThrNH2、OR，其中R是C1-C3烷基，更理想的是，當(dāng)B是Trp時，C是Phe-LysNH2或D-Phe-LysNH2，而當(dāng)B是Phe時，C是D-Trp-LysNH2。
本發(fā)明基于如下發(fā)現(xiàn)能夠促進生長激素釋放并提高動物血液中生長激素水平的不同短鏈多肽的特征是，所有這類多肽的肽鏈上都含有2-烷基色氨酸的D-異構(gòu)體(D-2-Me-Trp或D-Mrp)。
屬于本發(fā)明范圍內(nèi)的多肽的分子式為A-D-Mrp-(Ala)n-B-C，其中，A是任何天然L-氨基酸或其D-異構(gòu)體，前提是，如果B是Trp而C是D-Phe-Lys-NH2，則A不是His，或者A是咪唑乙?；愡哙ぜ柞；?-氨基丁?；?、4-(氨基甲基)環(huán)己烷羰基、Glu-Tyr-Ala-His、Tyr-Ala-His、Tyr-His、D-Thr-His，更理想的是，A是D-Ala、D-Thr，Tyr；D是右旋異構(gòu)體，Mrp是2-烷基色氨酸，最好是2-甲基色氨酸；n是0或1；B是L-或D-Trp、或D-β-Nal；C是NH2、D-Phe-LysNH2、Phe-LysNH2、D-Trp-LysNH2、D-Phe-Lys-ThrNH2、D-Phe-Lys-D-ThrNH2、OR，其中R是C1-C3烷基，更理想的是，當(dāng)B是Trp時，C是Phe-LysNH2或D-Phe-LysNH2，而當(dāng)B是Phe時，C是D-Trp-LysNH2和由可以藥用的有機酸或無機酸與所述多肽中任一種所形成的加成鹽。
這里所采用的氨基酸殘基的縮寫與肽的標準命名一致Gly＝甘氨酸Tyr＝L-酪氨酸Ile＝L-異亮氨酸Glu＝L-谷氨酸Thr＝L-蘇氨酸Phe＝L-苯丙氨酸Ala＝L-丙氨酸Lys＝L-賴氨酸Asp＝L-天冬氨酸Cys＝半胱氨酸Arg＝L-精氨酸Gln＝L-谷氨酰胺
Pro＝L-脯氨酸Leu＝L-亮氨酸Met＝L-蛋氨酸Ser＝L-絲氨酸Asn＝L-天冬酰胺His＝L-組氨酸Trp＝L-色氨酸Val＝L-纈氨酸此外，D-β-Nal＝D-β-萘基丙氨酸；INIP＝異哌啶甲?；籌MA＝咪唑乙?；籊AB＝4-氨基丁?；籑rp＝2-烷基色氨酸。
本發(fā)明中的烷基是含有1-3個碳原子的低級烷基，例如，甲基、乙基、丙基、異丙基。其中甲基最佳。
所有以“D”開頭的氨基酸的3字母縮寫表示該氨基酸殘基的D-構(gòu)型。
在本發(fā)明的實施方案中，優(yōu)選的生長激素釋放化合物有INIP-D-Mrp-D-Trp-Phe-Lys-NH2；INIP-D-Mrp-D-β-Nal-Phe-Lys-NH2；IMA-D-Mrp-D-Trp-Phe-Lys-NH2；IMA-D-Mrp-D-β-Nal-Phe-Lys-NH2；GAB-D-Mrp-D-Trp-Phe-Lys-NH2；GAB-D-Mrp-D-β-Nal-Phe-Lys-NH2；GAB-D-Mrp-D-β-Nal-NH2；GAB-D-Mrp-D-β-Nal-OC2H5；4-(氨基甲基)環(huán)己烷羰基-D-Mrp-D-Trp-Phe-Lys-NH2；4-(aminomethyl)ciclohexanecarbonyl-D-Mrp-D-β-Nal-Phe-Lys-NH2；
D-Ala-D-Mrp-Ala-Trp-D-Phe-LysNH2；D-Thr-D-Mrp-Ala-Trp-D-Phe-LysNH2；His-D-Mrp-Ala-Phe-D-Trp-LysNH2；Tyr-His-D-Mrp-Ala-Trp-D-Phe-LysNH2；His-D-Mrp-Ala-TrpNH2；D-Thr-D-Mrp-Ala-TrpNH2；其中，Mrp是2-甲基色氨酸，而INIP、IMA和GAB的定義如上文所述，以及與上述多肽中任一種與可以藥用的有機酸或無機酸形成的加成鹽。
這些化合物可以腸胃外方式服用，但更常見的是鼻內(nèi)服用和口服，或是配成控釋系統(tǒng)，如可生物降解的微膠囊、微球、皮下植入物等。
本發(fā)明的肽化合物可按照肽化學(xué)的常用方法合成，如固相方法和在溶液中合成，或通過本領(lǐng)域已知的經(jīng)典方法合成。固相合成從肽的C-末端開始。可通過如下方式制備合適的原料，例如，將需要保護的α-氨基酸連接在的氯甲基化樹脂、羥甲基化樹脂、二苯甲基胺樹脂(BHA)或?qū)谆郊谆窐渲?p-Me-BHA)上。例如，由BioRad實驗室(Richmond，California)以BIOBEADSSx1為商標的一種氯甲基化樹脂。羥甲基樹脂的制備如Bodansky等所述(Chem.Ind.(London)38，15997，(1996))。BHA樹脂由Pietta和Marshall所披露(Chem.Comm.，650(1970))，并且由Peninsula Laboratories Inc.(Belmont，California)將其商品化。
在開始結(jié)合以后，α-氨基酸的保護基可用不同的酸試劑除去，包括在室溫下溶于有機溶劑中的三氟乙酸(TFA)或氫氯酸(HCl)。在除去α-氨基酸上的保護基之后，其余的保護氨基酸按所需順序逐步連接在一起。每個保護氨基酸通常要使用約3倍以上的合適的羧基活化基進行反應(yīng)，活化基有溶解在二氯甲烷(CH2Cl2)或二甲基甲酰胺(DMF)中的二環(huán)己基碳化二亞胺(DCC)或二異丙基碳化二亞胺(DIC)及其混合物。在合成所需的氨基酸序列后，可通過用一種諸如氟化氫(HF)之類的試劑處理的方法把所需的肽從支持樹脂上切下來，它不僅能把肽從樹脂上切下來，而且能切下側(cè)鏈上更常見的保護基。當(dāng)使用氯甲基化樹脂或羥甲基化樹脂時，用HF處理會導(dǎo)致游離形式酸肽的形成。當(dāng)采用BHA或p-Me-BHA樹脂時，用HF處理會直接導(dǎo)致游離形式酰胺肽的形成。
以上所述的固相方法在本領(lǐng)域中廣為人知，并由Atherton和Sheppard所披露(Solid Phase Peptide Synthesis，IRL Press，Oxford，1989)。
某些可用于合成本發(fā)明的肽組成部分的液相方法由Bodansky等做了詳細披露(Peptide Synthesis第二版，John Wiley&Sons，New York，N.Y.1976)，并可見于Jones的文章(The Chemical Synthesis ofPeptides，Clarendon Press，Oxford，1994)。
可以有效劑量給動物和人服用上述化合物，所述有效劑量可由本領(lǐng)域的專家很方便地加以確定，而且可隨受治對象的種類、年齡、性別和體重加以調(diào)整。例如，對人來說，當(dāng)通過靜脈注射服用時，優(yōu)選的劑量范圍為約0.1～10μg總肽/公斤體重。當(dāng)口服時通常需要更高的劑量。例如，由人口服時，劑量水平一般為約30～約1000μg多肽/公斤體重。實際劑量水平可根據(jù)以上說明由經(jīng)驗加以確定。
含有上述多肽的有機和無機加成鹽的活性成分和其混合物、且有選擇地與媒介物、稀釋劑、基質(zhì)或緩釋包衣混合的組合物也屬于本發(fā)明的范圍。適于皮下植入的、含有可生物分解的基質(zhì)的緩釋藥用形式特別理想。所述基質(zhì)的例子披露在WO 9222600和WO9512629中。
生物活性用10日齡大鼠確定上述化合物的體內(nèi)活性，按照R.Deghenghi等的詳細披露(Life Sciences 54，1321，(1994))，以300μg/kg的劑量或在劑量應(yīng)答研究中以不同的劑量對大鼠進行皮下注射(s.c.)。結(jié)果歸納在下表中，在處理以后15分鐘測定釋放的GH。
GHRP-2(對照標準)的結(jié)構(gòu)為D-Ala-D-β-Nal-Ala-Trp-D-Phe-Lys-NH2(Chen和Clarke，J.Neuroend.7，179(1995))。
表肽皮下注射劑量，μg/kg GH對照 釋放的GH(ng/ml) (ng/ml)His-D-Mrp-Ala-Trp-DPhe- 30031±8176±20Lys-Thr-NH2His-D-Mrp-Ala-Trp-DPhe- 30031±8169±27Lys-D-Thr-NH2D-Thr-D-Mrp-Ala-Trp-D- 30031±8266±20Phe-Lys-D-Thr-NH2D-Thr-His-D-Mrp-Ala-Trp-D- 30031±886±19Phe-Lys-NH2D-Ala-D-Mrp-Ala-Trp-D- 40 34±1200±20Phe-Lys-NH2D-Ala-D-Mrp-Ala-Trp-D- 32034±1251±32Phe-Lys-NH2
續(xù)表肽皮下注射劑量，μg/kg GH對照 釋放的GH(ng/ml) (ng/ml)His-D-Mrp-Ala-Trp-NH25000 69±14 124±37咪唑乙?；?D-Mrp- 300 20±3159±27Ala-Trp-D-Phe-Lys-NH2INIP-D-Mrp-D-Trp-Phe- 300 15 155Lys-NH2INIP-D-Mrp-D-β-Nal- 300 15 150Phe-Lys-NH2GAB-D-Mrp-D-Trp-Phe-Lys-NH2300 10 110(GHRP-2) 300 10 98.6
在獲自重150克的大鼠的腦垂體前葉細胞中測定腺苷酸環(huán)化酶的體外活性，與肽D-Ala-D-Mrp-Ala-Trp-D-Phe-LysNH2的EC50＝0.23nm的基線相比，其活性增加了30％，而GHRP-6(His-D-Trp-Ala-Trp-D-Phe-LysNH2)表現(xiàn)為無活性。
下面的實施例對本發(fā)明做了進一步的說明。
例1合成GAB-D-Mrp-D-Trp-Phe-Lys-NH2(Mrp-2-甲基色氨酸)所述合成是通過采用9-芴甲氧羰基(Fmoc)-氨基酸的固相方法進行的，包括按照本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的幾種方法之一進行的樹脂制備、在反應(yīng)柱中組合，如E.Atherton和R.C.Sheppard在“Solid PhasePeptide Synthesis”(IRL Press在Oxford University的出版社，1989)中所公開的方法。保護氨基酸為Fmoc-Lys(Fmoc)-Opfp(Opfp＝五氟苯基酯)、Fmoc-Phe-Opfp、Fmoc-D-Trp-Opfp、Fmoc-2-MeTrp-Opfp和Fmoc-GAB-Opfp(GAB＝γ-氨基丁酸)。此外，將Castro’s試劑、BOP和PyBOP(見Le Nguyen和Castro(1988)，Peptide Chemistry 1987，P.231-238，Protein ResearchFoundation Qsaka；和Tetrahedron Letters 31，205(1990))用作直接連接劑也是有利的。
在切除并分離之后，將標題肽以乙酸鹽的形式純化。純度(HPLC)98％，MW(M+H+)＝764.3(理論值＝763.9)。
例2按照例1所述方法制備以下的肽，并以乙酸鹽的形式獲得INIP-D-Mrp-D-Trp-Phe-Lys-NH2；純度(HPLC)＝99.0％，MW(M+H+＝790.4；理論值＝790.0)INIP-D-Mrp-D-β-Nal-Phe-Lys-NH2；純度(HPLC)＝96.5％，MW(M+H+＝801.4；理論值＝801.0)IMA-D-Mrp-D-Trp-Phe-Lys-NH2；純度(HPLC)＝99.2％，MW(M+H+＝786.5；理論值＝786.8)IMA-D-Mrp-D-β-Nal-Phe-Lys-NH2；純度(HPLC)＝97.3％， MW(M+H+＝798.3；理論值＝797.9)GAB-D-Mrp-D-β-Nal-Phe-Lys-NH2；4-(氨基甲基)環(huán)己烷羰基-D-Mrp-D-Trp-Phe-Lys-NH2；4-(氨基甲基)環(huán)己烷羰基-D-Mrp-D-β-Nal-Phe-Lys-NH2；D-Ala-D-Mrp-Ala-Trp-D-Phe-LysNH2；D-Thr-D-Mrp-Ala-Trp-D-Phe-LysNH2；His-D-Mrp-Ala-Phe-D-Trp-LysNH2；Tyr-His-D-Mrp-Ala-Trp-D-Phe-LysNH2；His-D-Mrp-Ala-TrpNH2；D-Thr-D-Mrp-Ala-TrpNH2；其中，Mrp是2-甲基色氨酸，INIP、IMA和GAB如在上文中所定義的。
權(quán)利要求
1.一種肽，其分子式為A-D-Mrp-(Ala)n-B-C，其中，A是任何天然L-氨基酸或其D-異構(gòu)體，前提是，如果B是Trp而且C是D-Lys-NH2的話，A不是His；或者A是咪唑乙?；?、異哌啶甲酰基、4-氨基丁?；?、4-(氨基甲基)環(huán)己烷羰基、Glu-Tyr-Ala-His、Tyr-Ala-His、Tyr-His、D-Thr-His；D是右旋異構(gòu)體，Mrp是2-烷基色氨酸；n是0或1；B是L-或D-Trp、Phe或D-β-Nal；C是NH2、D-Trp-LysNH2、D-Phe-LysNH2、Phe-LysNH2、D-Phe-Lys-ThrNH2、D-Phe-Lys-D-ThrNH2、OR，其中R是C1-C3烷基，以及所述多肽中任一種與可以藥用的有機酸或無機酸的加成鹽。
2.如權(quán)利要求1的肽，其中Mrp選自2-甲基色氨酸、2-乙基色氨酸、2-丙基色氨酸、2-異丙基色氨酸。
3.如權(quán)利要求1的肽，其中Mrp是2-甲基色氨酸。
4.如權(quán)利要求1的肽，其中A是咪唑乙酰基、異哌啶基、4-氨基丁?；?、D-Ala、D-Thr、Tyr。
5.如權(quán)利要求1的肽，其中C是Phe-LysNH2、D-Trp-LysNH2、NH2、OR，其中R是C1-C3烷基。
6.如權(quán)利要求1的肽，其選自IMA-D-Mrp-D-Trp-Phe-LysNH2；IMA-D-Mrp-D-β-Nal-Phe-LysNH2；INIP-D-Mrp-D-Trp-Phe-LysNH2；INIP-D-Mrp-D-β-Nal-Phe-LysNH2；GAB-D-Mrp-D-Trp-Phe-LysNH2；GAB-D-Mrp-D-β-Nal-Phe-LysNH2；GAB-D-Mrp-D-β-Nal-NH2；GAB-D-Mrp-D-β-Nal-OC2H5；4-(氨基甲基)環(huán)己烷羰基-D-Mrp-D-Trp-Phe-Lys-NH2；4-(氨基甲基)環(huán)己烷羰基 -D-Mrp-D-β-Nal-Phe-Lys-NH2.
7.如權(quán)利要求1的肽，其選自咪唑乙?；?D-Mrp-Ala-Trp-D-Phe-LysNH2；D-Ala-D-Mrp-Ala-Trp-D-Phe-LysNH2；D-Thr-D-Mrp-Ala-Trp-D-Phe-LysNH2；His-D-Mrp-Ala-TrpNH2；D-Thr-D-Mrp-Ala-TrpNH2；His-D-Mrp-Ala-Phe-D-Trp-LysNH2；D-Thr-D-Mrp-Ala-Trp-D-Phe-Lys-D-ThrNH2；D-Thr-His-D-Mrp-Ala-Trp-D-Phe-LysNH2；His-D-Mrp-Ala-Trp-D-Phe-Lys-ThrNH2；His-D-Mrp-Ala-Trp-D-Phe-Lys-D-ThrNH2
8.如權(quán)利要求6或7的肽，其中Mrp是2-甲基色氨酸。
9.將權(quán)利要求1-8的肽用于生產(chǎn)用于促進動物生長激素釋放的藥物的用途。
10.如權(quán)利要求9的用途，其中所述藥物可用于人體治療。
11.將權(quán)利要求7的肽用于生產(chǎn)用于促進腺苷酸環(huán)化酶胞內(nèi)活性的提高的藥物的用途。
12.藥用組合物，包括有效劑量的權(quán)利要求1-8的至少一種肽作為活性成分，可選擇性地與載體或賦形劑混合。
13.如權(quán)利要求12的組合物，該組合物為適于腸胃外服用、鼻內(nèi)服用、口服、控釋服用、皮下植入物的形式。
全文摘要
一種分子式為A-D-Mrp-(Ala)
文檔編號A61K38/07GK1158622SQ95195323
公開日1997年9月3日 申請日期1995年9月13日 優(yōu)先權(quán)日1994年9月27日
發(fā)明者R·德根格希 申請人:R·德根格希