專利名稱：：有效地作為無(wú)毒口服佐劑的突變腸毒素的制作方法在本說(shuō)明書中所述的研究由美國(guó)海軍部分資助，授與號(hào)N00014-83-K-0192。政府對(duì)本發(fā)明享有一定權(quán)利。1.發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及大腸桿菌熱不穩(wěn)定腸毒素(LT)的一種遺傳學(xué)上獨(dú)特突變型，及其作為一種口服佐劑用于誘導(dǎo)粘膜和血清抗體。特別地，該突變LT被一個(gè)氨基酸取代而修飾，使其失去固有的毒性，但保留了該分子完整的佐劑特點(diǎn)。2.發(fā)明背景微生物病原體可以通過(guò)幾種機(jī)制中的一種感染宿主。它們可以通過(guò)外傷引起的外皮破裂進(jìn)入，可以被載體傳導(dǎo)而導(dǎo)入或與粘膜表面相互作用。大多數(shù)人病原體通過(guò)最后一種機(jī)制，即與粘膜表面相互作用后始發(fā)疾病。通過(guò)這種機(jī)制作用的細(xì)菌和病毒病原體首先與粘膜表面接觸，它們可以在那兒附著，然后定居或被特化的表皮中遮蓋派伊爾結(jié)及其它淋巴濾泡的吸收細(xì)胞(M細(xì)胞)攝取〔Bockman及Cooper，1973，Am.J.Anat.136455-477；Owenetal.，1986，J.Infect.Dis.1531108-1118〕。進(jìn)入淋巴組織的生物體可在淋巴濾泡里被容易地殺死，因此作為提供給濾泡中免疫細(xì)胞的抗原(如霍亂弧菌)激起可能的保護(hù)免疫應(yīng)答?；蛘呓?jīng)過(guò)局部防御機(jī)制仍能存活的病原生物體可能從濾泡傳播并繼而引起局部的或系統(tǒng)疾病(即免疫受損害宿主中的沙門菌屬細(xì)菌，脊髓灰質(zhì)炎病毒，輪狀病毒)。針對(duì)感染生物體的特異毒力決定簇的分泌IgA(sIgA)抗體在總體粘膜免疫方面起重要作用〔Cebraetal.，1986，InVaceines86，Brownetal.，(ed.)ColdSpringHarborLaboratorg，NewYork.p.p129-133〕，在許多情況下，通過(guò)刺激產(chǎn)生針對(duì)感染生物體的相應(yīng)毒力決定簇的粘膜sIgA水平，來(lái)預(yù)防粘膜表面的初始感染是可能的，分泌IgA可以通過(guò)封閉附著和/或定居，中和表面作用毒素或防止宿主細(xì)胞的侵襲來(lái)防止病原體與粘膜表面的初始相互作用。雖然已經(jīng)做了廣泛的研究來(lái)確定，細(xì)胞介導(dǎo)的免疫及血清抗體在抵抗感染因子的保護(hù)作用方面的作用，對(duì)sIgA的調(diào)節(jié)，誘導(dǎo)和分泌卻知之甚少。非腸道施用滅活的完整細(xì)胞和完整病毒的制劑對(duì)引發(fā)保護(hù)性血清IgG和抵抗在發(fā)病機(jī)理中具有明顯血清期的生物體(即傷寒桿菌，B肝炎)的延遲型超敏反應(yīng)是有效的。然而，非腸道疫苗對(duì)引發(fā)粘膜sIgA反應(yīng)無(wú)效，并對(duì)與粘膜表面相互作用但不侵入的細(xì)菌(如霍亂弧菌)無(wú)效。但最近有這樣的證據(jù)，即非腸道施用的疫苗可能至少對(duì)一種病毒有效，它是首先與粘膜表面相互作用的輪狀病毒〔Conneretal.，1993，J.Virol.676633-6641〕。推測(cè)保護(hù)作用來(lái)自抗原特異性IgG滲出到粘膜表面來(lái)中和病毒。因此，同時(shí)刺激血清和粘膜抗體的機(jī)制對(duì)有效疫苗是重要的。如果抗原提呈到優(yōu)先起始IgAB-細(xì)胞形成的派伊爾結(jié)中的T、B淋巴細(xì)胞和輔助細(xì)胞，則口服免疫對(duì)誘導(dǎo)特異sIgA反應(yīng)有效。派伊爾結(jié)含有介導(dǎo)B-細(xì)胞直接從IgM細(xì)胞同型轉(zhuǎn)換到IgAB-細(xì)胞的輔助T(TH)-細(xì)胞。該結(jié)還含有啟動(dòng)終未B-細(xì)胞分化的T-細(xì)胞。已接觸抗原的B-細(xì)胞然后遷移到腸系膜的淋巴結(jié)并進(jìn)行分化，進(jìn)行胸導(dǎo)管，然后進(jìn)入總循環(huán)，并播種到機(jī)體所有的分泌組織，包括腸固有層和呼吸道。然后由成熟的漿細(xì)胞產(chǎn)生IgA，IgA與結(jié)合在膜上的分泌成分復(fù)合，轉(zhuǎn)運(yùn)到能與侵入病原體相互作用的粘膜表面上〔StroberandJacobs，1985，In宿主防御機(jī)制的進(jìn)展，第4卷，粘膜免疫GallinandFauci(ed.)，RavenPress，NewYork.p.p.1-30；TomasiandPlaut，1985，In宿主防御機(jī)制的進(jìn)展，第4卷，粘膜免疫GallinandFauci(ed.)，RavenPress，NewYork.p.p.31-61〕。這種共同的粘膜免疫系統(tǒng)的存在部分解釋了對(duì)抵御通過(guò)首先與粘膜表面相互作用而始發(fā)感染的病原生物體起保護(hù)作用的活口服疫苗和口服免疫的可能性。已經(jīng)開發(fā)許多用于口服免疫的方法，包括利用細(xì)菌的減毒突變體(即沙門菌屬細(xì)菌)作為異種抗原的載體(CardenasandClements，1992，Clin.Microbiol.Rev.5328-342；Clementsetal.，1992，In重組DNA疫苗合理性及策略Isaacson(ed.)，MarcelDecker，NewYork.p.p.293-321；ClementsandCardenas，1990，Res.Microbiol.141981-991；ClementsandEl-Morshidy，1984，Infect.Immun.46564-569〕。將抗原膠囊化到由聚DL-丙交酯-乙交酯(PGL)，蛋白樣聚合物-類蛋白組成的微球中〔Sanitagoetal.，1993，Pharma-CeuticalResearch101243-1247〕，明膠膠囊，不同的脂質(zhì)體制劑〔Alvingetal.，1986，Vaccine4166-172；GarconandSix，1993，J.Immunol.1463697-3702；Gould-FogeriteandMannino，1993，In脂質(zhì)體技術(shù)第二版Vol.III，Gregoriadis(ed.)〕，吸附到毫微顆粒上，使用親脂免疫刺激復(fù)合物(ISCOMS)〔MowatandDonachie，1991，ImmunologyToday12383-385〕，以及加入具有已知佐劑性質(zhì)的細(xì)菌產(chǎn)物〔Clementsetal.，1988，Vaccine6269-277；Elson，1989，ImmunologyToday14629-33；LyckeandHolmgren，1986，Immunology59301-308；Lyckeetal.，1992，Eur.J.Immunol.222277-2281〕。兩種具有最大可能作為口服佐劑的細(xì)菌產(chǎn)物是由各株霍亂弧菌產(chǎn)生的霍亂毒素(CT)，和由大腸桿菌的一些腸毒性株產(chǎn)生的熱不穩(wěn)定腸毒素(LT)。雖然LT和CT具有許多相同的特點(diǎn)，但它們雖然是不同的分子，具有使它們獨(dú)一無(wú)二的生化和免疫學(xué)差異?；魜y的大量腹瀉是一種強(qiáng)效力外腸毒素的結(jié)果，它引起腺苷酸環(huán)化酶的激活，接著使細(xì)胞內(nèi)環(huán)3′-，5′-腺苷單磷酸酯(cAMP)水平升高?；魜y腸毒素(CT)是一個(gè)84,000道爾頓，由兩個(gè)主要的，非共價(jià)結(jié)合，免疫學(xué)上不同的區(qū)域或結(jié)構(gòu)域(“霍亂毒素-A’和“霍亂毒素-B”)組成的多聚蛋白質(zhì)〔FinkelsteinandLospalluto，1969，J.Exp.Med.130185-202〕。其中該56,000道爾頓區(qū)域或霍亂腸菌素負(fù)責(zé)毒素與宿主細(xì)胞膜受體GM1(半乳糖基-N-乙酰氨基半乳糖基saminyl-(sialyl)-半乳糖基-葡萄糖基神經(jīng)酰胺)的結(jié)合，該受體基本上在所有真核細(xì)胞的表面被發(fā)現(xiàn)?；魜y腸菌素由五個(gè)非共價(jià)結(jié)合的亞基組成，而A區(qū)域(27,000道爾頓)負(fù)責(zé)毒素多種生物學(xué)作用。CT的兩個(gè)亞基與該分子免疫學(xué)性質(zhì)之間的關(guān)系曾經(jīng)是大量辨論的原因。一方面，當(dāng)CT口服施用時(shí)，它是一種能同時(shí)激發(fā)血清和粘膜抗毒素抗體反應(yīng)形成的很好的免疫原。此發(fā)現(xiàn)并不新穎，因?yàn)橐阎魜y病人在從臨床霍亂漸愈期間抗毒素抗體的滴度逐漸升高〔Finkelstein，1975，Curr.Top.Microbid.Immunol.69637-196〕。研究該反應(yīng)本質(zhì)的人們的一個(gè)重要發(fā)現(xiàn)是現(xiàn)實(shí)的CT不像其它大多數(shù)蛋白抗原，不誘導(dǎo)對(duì)自身的口服耐受性〔ElsonandEalding，1984，J.Immunol.1332892-2897；ElsonandEalding，1984，J.Immunol.1322736-2741〕。當(dāng)只喂給小鼠B-亞基時(shí)，也發(fā)現(xiàn)這是真的，通過(guò)在孟加拉國(guó)進(jìn)行的霍亂疫苗現(xiàn)場(chǎng)試驗(yàn)證實(shí)此觀察，其中B-亞基與殺死的完整細(xì)胞聯(lián)合使用的口服免疫引起粘膜和系統(tǒng)的抗毒素抗體反應(yīng)〔Svennerholmetal.，1984，J.Infect.Dis.149884-893〕。CT除了是一種有效的口服免疫原，還具有一些其它已報(bào)道的免疫學(xué)性質(zhì)。如上面指出的，Elson和Ealding〔ElsonandEalding，1984，J.Immunol.1332892-2897〕觀察到口服CT不誘導(dǎo)對(duì)自身的耐受。而且同時(shí)口服CT和一種可溶蛋白抗原鑰孔蜮形血藍(lán)素(KLH)導(dǎo)致抗CT和KLH分泌IgA反應(yīng)的形成，并廢除對(duì)KLH口服耐受的誘導(dǎo)。這些發(fā)現(xiàn)繼而被Lycke和Holmgren〔LyckeandHolmgren，1986，Immunology59301-308〕證實(shí)和擴(kuò)展。當(dāng)人們?cè)噲D確定CT的A和B亞基對(duì)該分子佐劑性質(zhì)的作用時(shí)發(fā)生混亂。下列由Elson概括的觀察〔Elson，1989，ImmunologyToday14629-33〕是那些混亂的基礎(chǔ)·CT不誘導(dǎo)對(duì)自身的口服耐受〔ElsonandEalding，1984，J.Immunol.1332892-2897〕·CT-B不誘導(dǎo)對(duì)自身的口服耐受〔ElsonandEalding，1984，J.Immunol.1332892-2897〕·CT可防止對(duì)其它抗原的耐受的誘導(dǎo)，當(dāng)CT被同時(shí)施用并用作那些抗原的一種佐劑時(shí)〔ElsonandEalding，1984，J.Immunol.1332892-2897；LyckeandHolmgren，1986，Immunology59301-308〕。·CT可作為CT-B的佐劑〔ElsonandEalding，1984，J.Immunol.1332892-2897〕·熱凝集CT幾乎沒(méi)有毒性，但是一種有效的口服免疫原〔Pierceetal.，1983，Infect.Immun.401112-1118〕?！T-B可以在傳統(tǒng)的半抗原-載體結(jié)構(gòu)中作為一種免疫原“載體”〔Cebraetal.，1986，InVaccines86，Brownetal.，(ed.)，ColdSpringHarborLaboratory，NewYork.p.p.129-133；McKenzieandHalsey，1984，J.Immunol，1331818-1824〕。一些研究人員已經(jīng)從這些發(fā)現(xiàn)斷定B-亞基一定具有一些固有的佐劑活性。Cebra等〔Cebraetal.，1986，InVaccines86，Brownetal.，(ed.)，ColdSpringHarborLaboratory，NewYork.p.p.129-133〕，Lycke和Holmgren〔LyckeandHolmgren，1986，Immunology59301-308〕和Liang等〔Liangetal.，1988，J.Immunol.1411495-1501〕會(huì)辯論反對(duì)該結(jié)論。Cebra等〔Cebraetal.，1986，InVaceines86，Brownetal.，(ed.)ColdSpringHarborLaboratorg，NewYork.p.p129-133〕證明純化的CT-B當(dāng)十二指腸內(nèi)給藥時(shí)對(duì)提高派伊爾結(jié)中特異抗霍亂毒素B-細(xì)胞的頻率有效，但與CT相反，不產(chǎn)生大量的提呈IgA的B-細(xì)胞。Lycke和Holmgren〔LyckeandHolmgren，1986，Immunology59301-308〕通過(guò)測(cè)量口服免疫小鼠固有層中分泌免疫球蛋白的細(xì)胞，比較了CT和CT-B增強(qiáng)腸粘膜對(duì)KLH免疫反應(yīng)的能力。在他們的系統(tǒng)中，未發(fā)現(xiàn)對(duì)被試任何劑量的B-亞基反應(yīng)的產(chǎn)生抗-KLH細(xì)胞的增加。最終，Liang等〔Liangetal.，1988，J.Immunol.1411495-1501〕發(fā)現(xiàn)當(dāng)CT-B連同滅活的Sendai病毒口服給藥時(shí)沒(méi)有佐劑作用。觀察到分離B-亞基佐劑活性的地方，典型地具有兩個(gè)原因之一。首先，傳統(tǒng)制備B-亞基的方法是在變性劑(即鹽酸胍或蟻酸)存在下通過(guò)凝膠過(guò)濾，將全毒素進(jìn)行層析分離。然后收集分離的亞基，除去變性劑。用此技術(shù)制備的B-亞基一定受到微量A-亞基的污染，以致于復(fù)性時(shí)重建了少量全毒素。第二個(gè)原因與免疫載體的定義有關(guān)。與其它許多可溶性蛋白一樣，B-亞基可以作為一種免疫載體向免疫系統(tǒng)提呈抗原。假如那些抗原足夠小以致不具有好的致免疫性，它們可以傳統(tǒng)的半抗原-載體構(gòu)型制成致免疫的。同樣，有與B-亞基相關(guān)的“假設(shè)”免疫增強(qiáng)，特別對(duì)于口服施用，因?yàn)锽-亞基與上皮細(xì)胞表面結(jié)合，并可能固定于一種附著抗原被腸相關(guān)淋巴組織加工。然而，對(duì)這種抗原穩(wěn)定化機(jī)制的任何可能的優(yōu)點(diǎn)，都可以被跨越非免疫相關(guān)組織的抗原的分布所抵消，即小腸上皮細(xì)胞的表面。在粘膜反應(yīng)情況下，免疫學(xué)相關(guān)部位是派伊爾結(jié)，特別對(duì)依賴于抗原特異性T細(xì)胞的B細(xì)胞激活〔StroberandJacobs，1985，In宿主防御機(jī)制的進(jìn)展，第4卷，粘膜免疫GallinandFauci(ed.)，RavenPress，NewYork.p.p.1-30；TomasiandPlaut，1985，In宿主防御機(jī)制的進(jìn)展，第4卷，粘膜免疫GallinandFauci(ed.)，RavenPress，NewYork.p.p.31-61；Brandtzaeg，1989，Curr.Top.Microbio.Immunol.14613-25〕。因而，該條件勝任在派伊爾結(jié)中發(fā)生的從IgM細(xì)胞到IgAB-細(xì)胞的同型轉(zhuǎn)變。位于上皮細(xì)胞表面的抗原可能有助于誘導(dǎo)B細(xì)胞增殖的抗原，因?yàn)閬嗩愱?yáng)性絨毛上皮細(xì)胞可能在分泌部位作為抗原提呈細(xì)胞用于T細(xì)胞激活，因此增加細(xì)胞因子產(chǎn)生，終末B細(xì)胞分化，增加分泌成分的表達(dá)，并增加IgA特異性抗原的外部轉(zhuǎn)運(yùn)〔Tomasi，T.B.，andA.G.Plaut.1985，In宿主防御機(jī)制的進(jìn)展，第4卷，粘膜免疫GallinandFauci(ed.)，RavenPress，NewYork.p.p.31-61〕這些事件的關(guān)系尚未明確地解釋為B-亞基作為其它抗原的載體，術(shù)語(yǔ)“佐劑”的使用似乎對(duì)這種作用不合適。已經(jīng)清楚分子的佐劑性質(zhì)屬于全毒素，其中B-亞基是受體識(shí)別所需要的，并利于A-亞基滲透進(jìn)入細(xì)胞。A-亞基也是佐劑活性所必需的，推測(cè)其具有ADP-核糖基化的活性，并能增加細(xì)胞內(nèi)cAMP水平(見(jiàn)下)。B-亞基單獨(dú)可以作為其它抗原的載體，因?yàn)楫?dāng)它們與那些抗原結(jié)合時(shí)，能夠被固定化以由腸相關(guān)淋巴組織加工。雖然LT和CT具有許多共同的特點(diǎn)，它們明顯地是不同的分子，具有使它們獨(dú)一無(wú)二的生化和免疫學(xué)差異，包括在核苷酸和氨基酸序列同源性20％的差異〔DallusandFalkow，1980，Nature，288499-501〕。兩種毒素具有相同的亞基數(shù)目和排列，相同的生物學(xué)作用機(jī)制，并在許多體外試驗(yàn)中具有相同的比活〔ClementsandFinkelstein，1979，Infect.Immun.24760-769；Clementsetal.，1980，Infect.Immun.2491-97〕。然而，這些分子之間存在不僅影響其外毒素性質(zhì)還影響其作為佐劑能力的顯著差異。不同于霍亂弧菌產(chǎn)生的CT，LT存在于相關(guān)細(xì)胞并只在細(xì)胞裂解過(guò)程中從大腸桿菌中釋放〔ClementsandFinkelstein，1979，Infect.Immun.24760-769〕。CT一旦合成后就從弧菌分泌出來(lái)，并能被容易地從培養(yǎng)物上清中鑒定和純化。所以，與CT相比，LT當(dāng)剛從細(xì)胞分離時(shí)并非有完整的生物活性。與細(xì)菌毒素的A-B模型相一致，LT需要蛋白酶水解和二硫化物還原成為完全活性的。沒(méi)有蛋白酶水解處理，酶活性A1部分不能與A2部分分離，也不能到達(dá)小腸上皮細(xì)胞基底層(basolateral)表面的靶底物(腺苷酸環(huán)化酶)。這對(duì)CT也是一樣的，但該毒素在純化過(guò)程中，暴露于培養(yǎng)物上清液中的蛋白酶完成該蛋白水解。因?yàn)長(zhǎng)T不是完全生物活性的，在純化過(guò)程中用體外生物學(xué)試驗(yàn)如Y-1腎上腺細(xì)胞試驗(yàn)或滲透因子試驗(yàn)難以鑒定。分離材料激活中的差異導(dǎo)致LT和CT在生物系統(tǒng)中反應(yīng)閾值的差異。例如，CT劑量為5-10μg誘導(dǎo)小鼠腸中可察覺(jué)的網(wǎng)流體分泌。LT在大于100μg水平誘導(dǎo)小鼠腸中可察覺(jué)的網(wǎng)流體分泌。在兔結(jié)扎的回腸袢中，差異是引人注目的和清晰的。而且，在靈長(zhǎng)目動(dòng)物，LT在被試的高達(dá)1mg的任何劑量均顯示不能誘導(dǎo)流體分泌。這是報(bào)道的CT誘導(dǎo)人陽(yáng)性流體運(yùn)動(dòng)所用量的200倍。當(dāng)LT暴露于具有胰蛋白酶樣特性的蛋白水解酶時(shí)，該分子在任何生物測(cè)試系統(tǒng)均與CT難區(qū)分。這被Clements和Finkelstein清楚地證明〔ClementsandFinkelstein，1979，Infect.Immun.24760-769〕。除了上面報(bào)道的差異外，LT對(duì)含有糖類的基質(zhì)具有不尋常的親合性。特別是分子量為90,000的LT，從葡聚糖柱(葡萄糖)洗脫下的表觀分子量為45,000，從瓊脂糖柱(半乳糖)洗脫下的表觀分子量為0。這說(shuō)明它與含半乳糖的基質(zhì)結(jié)合，并且可以通過(guò)使用半乳糖以純的形式從那些基質(zhì)洗脫下來(lái)。LT不僅與用于純化的柱上的瓊脂糖結(jié)合，而且更重要地與其它含半乳糖的生物分子結(jié)合，包括糖蛋白和脂多糖。LT的凝集素樣結(jié)合性質(zhì)導(dǎo)致LT比CT在哺乳動(dòng)物細(xì)胞上有更廣泛的受體分布，CT只與GM1結(jié)合。這可能部分說(shuō)明這兩種分子誘導(dǎo)不同輔助T淋巴細(xì)胞反應(yīng)能力上差異的原因〔McGheeetal.，1994，MucosalImmunologyUpdate，Spring1994，RavenPress，NewYork，p21〕。McGhee等報(bào)道的這些研究中〔McGheeetal.，1994，MucosalImmunologyUpdate，Spring1994，RavenPress，NewYork，p21〕，顯示用疫苗對(duì)小鼠的口服免疫，如將CT作為粘膜佐劑的破傷風(fēng)類毒素(TT)，通過(guò)產(chǎn)生IL-4和IL-5而非IL-2和INF-gamma的TH細(xì)胞證明，在派伊爾結(jié)和脾臟中選擇性地誘導(dǎo)TH2型細(xì)胞〔對(duì)細(xì)胞因子網(wǎng)更全面的綜述見(jiàn)Araietal.，1990，Ann.Rev.Biochem.59783-836〕。重要地，當(dāng)CT被用作粘膜佐劑時(shí)，除IgA應(yīng)答外它還增強(qiáng)抗原特異性IgE應(yīng)答。由于預(yù)料到誘導(dǎo)速發(fā)型超敏反應(yīng)這種IgE應(yīng)答的增強(qiáng)嚴(yán)重地危及CT作為粘膜佐劑的安全性。與此相反，當(dāng)LT用作口服粘膜佐劑時(shí)，同時(shí)誘導(dǎo)TH1和TH2細(xì)胞，而且主要是抗原特異性IgA應(yīng)答，沒(méi)有IgE應(yīng)答。這兩種分子還具有許多免疫學(xué)差異，如通過(guò)免疫擴(kuò)散研究〔ClementsandFinkelstein，1978，Infect.Immun.211036-1039；ClementsandFinkelstein，1978，Infect.Immun.22709-713〕，體外中和研究和在接受B-亞基完整細(xì)胞霍亂疫苗的志愿者中對(duì)LT相關(guān)的大腸桿菌腹瀉的部分預(yù)防〔Clementsetal.，1980，J.Infect.Dis158372-377〕所證明?？傊@些發(fā)現(xiàn)表明盡管LT和CT表面上相似，它們是獨(dú)一無(wú)二的分子，并且LT是一種實(shí)用的口服佐劑而CT不是。對(duì)LT佐劑性質(zhì)的證明產(chǎn)生于本發(fā)明的一位發(fā)明者研究LT對(duì)口服抗原耐受形成的影響。尚不清楚如果給出兩分子間觀察到的差異，是否LT也影響口服耐受的誘導(dǎo)，或者LT起已證明的CT所起的佐劑作用。因此，本發(fā)明者檢測(cè)了一些參數(shù)，包括LT對(duì)OVA口服耐受的作用，在觀察的反應(yīng)中LT兩亞基的作用，改變時(shí)間和施用途徑的情況下輸送LT影響，先暴露于OVA對(duì)LT影響OVA耐受的能力的影響，LT作為佐劑與兩種不相關(guān)抗原的使用，及免疫途徑對(duì)抗OVA反應(yīng)的影響。從這些研究得到的結(jié)果總結(jié)如下〔Clementsetal.，1988，Vaccine6269-277；Clementsetal.，1988，AbstractNo.B91，88thAnn.Mcet.Am.Soc.Microbiol〕1.同時(shí)施用LT和OVA表明可防止誘導(dǎo)OVA耐受，并對(duì)OVA及PBS致敏的動(dòng)物，分別增強(qiáng)血清抗-OVAIgG反應(yīng)30-90倍。該作用被確定為毒素具酶活的A-亞基的作用，因?yàn)锽-亞基單獨(dú)不能影響耐受性誘導(dǎo)。2.先用OVA致敏再喂以LT的動(dòng)物比那些初始免疫中同時(shí)施用LT和OVA的動(dòng)物，形成明顯較低的血清IgG和粘膜的IgA抗-OVA反應(yīng)，表明先暴露于抗原降低LT影響耐受的作用及其作為佐劑的能力。一旦耐受性建立，LT不能廢除之。還發(fā)現(xiàn)對(duì)CT也是真的，當(dāng)動(dòng)物先用OVA免疫再口服卵清蛋白加CT，而且提供了一些對(duì)有益觀察的洞悉，即當(dāng)使用這些佐劑時(shí)不增加對(duì)非靶向攝入抗原的抗體反應(yīng)。3.第一次暴露于抗原時(shí)，只接受一次LT的動(dòng)物，其血清IgG和粘膜IgA應(yīng)答與經(jīng)三次OVA/LT致敏的反應(yīng)相同，表明應(yīng)答的許諾發(fā)生在早期并在第一次暴露于抗原時(shí)，還證明對(duì)應(yīng)答主要是針對(duì)血清IgG還是粘膜IgA，可以通過(guò)是否施用胃腸外加強(qiáng)劑量來(lái)控制。4.如果動(dòng)物沒(méi)有預(yù)先用兩種抗原中任何一種免疫，同時(shí)施用LT和兩種可溶性蛋白抗原導(dǎo)致抗兩種抗原的血清和粘膜抗體的形成。這是一項(xiàng)重要的發(fā)現(xiàn)，因?yàn)長(zhǎng)T作為佐劑的一種可能的應(yīng)用是形成對(duì)復(fù)合抗原如殺死的細(xì)菌或病毒的粘膜抗體的形成，在這里對(duì)多種抗原反應(yīng)的能力是重要的。Tamura等〔Tamuraetal.，U.S.PatentNo.5，182，109〕的研究證明鼻內(nèi)施用LT和/或CT增加對(duì)共同施用的抗原的抗體滴度。然而，在Tamura等中沒(méi)有教導(dǎo)口服給藥時(shí)，這些毒素可誘導(dǎo)保護(hù)性免疫應(yīng)答。顯然，LT具有明顯的免疫調(diào)節(jié)能力，不論作為預(yù)防特異抗原耐受的誘導(dǎo)的一種手段，還是作為佐劑用于口服抗原，而且引發(fā)產(chǎn)生抗施用抗原的血清IgG和粘膜IgA。這提出了針對(duì)各種病原體，包括口服施用死的或減毒劑或特異劑的相關(guān)致病力決定簇的有效免疫方案的可能性。然而，該“毒素”當(dāng)被如腸蛋白水解酶進(jìn)行蛋白水解作用裂解時(shí)，或口服施用足夠高濃度時(shí)能刺激網(wǎng)腔(netlamemal)分泌反應(yīng)的事實(shí)會(huì)妨礙其能力的調(diào)查或阻止其在合適條件下的應(yīng)用。如果LT在不減少其佐劑性質(zhì)下可以“去毒”，這個(gè)問(wèn)題可以解決。這令人們意識(shí)到這可能是怎樣實(shí)現(xiàn)，有必要進(jìn)一步分析LT和CT的作用機(jī)制以及這些分子結(jié)構(gòu)上和功能上的關(guān)系。如前面指出的，LT和CT以具有A和B成分的多亞基毒素合成。毒素與宿主細(xì)胞膜受體初始相互作用后，B區(qū)域利于A-亞基滲透穿過(guò)細(xì)胞膜。巰基還原時(shí)，A成分分裂成兩個(gè)較小的多肽鏈。其中A1片段催化上皮細(xì)胞基質(zhì)層表面腺苷酸環(huán)化酶復(fù)合物中興奮性GTP結(jié)合蛋白(Gs)的ADP-核糖基化，而且這導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)cAMP水平升高。此cAMP增加引起水和電解質(zhì)分泌到小腸中，它通過(guò)與兩種cAMP-敏感的離子轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制相互作用，包括1)跨越絨毛狀上皮細(xì)胞紋綠的NaCl共轉(zhuǎn)運(yùn)，和2)通過(guò)濾泡細(xì)胞分泌致電Na+依賴的Cl-〔Field，1980，InSecretorydiarrhea，F(xiàn)ieldetal.(ed.)，WaverlyPress，Baltimorep.21-30〕。A亞基還是與這些毒素的免疫增強(qiáng)相關(guān)的主要部分。該亞基然后成為可能的操作靶子以分開分子的毒性和免疫學(xué)功能。Lycke等〔Lyckeetal.，1992，Eur.J.Immunol.222277-2281〕最近的報(bào)道搞清楚影響該毒素ADP-核糖基化酶活性的變化和改變?cè)黾蛹?xì)胞內(nèi)cAMP水平的能力的變化也阻止該分子的佐劑作用。因此必須開發(fā)另一種去毒方法。3.發(fā)明概述本發(fā)明基于驚奇的發(fā)現(xiàn)，即失去毒性作用和缺乏ADP-核糖基轉(zhuǎn)移酶活性的LT突變形式仍保留其作為免疫佐劑的活性。LT的突變形式通過(guò)單個(gè)氨基酸取代Arg192-Gly192而與野生型不同，它使一個(gè)胰蛋白酶敏感位點(diǎn)不敏感。蛋白水解酶位點(diǎn)的喪失防止A亞基的蛋白水解加工成其毒性形式。天然LT當(dāng)?shù)谝淮螐募?xì)菌分離時(shí)沒(méi)有毒性，但當(dāng)暴露于蛋白酶如哺乳動(dòng)物小腸中發(fā)現(xiàn)的，則具有潛力為完全有毒的。LT的突變形式不再具有由于蛋白水解激活而變?yōu)橛卸镜臐摿ΑＴ撏蛔僉T(此后稱mLT)保有增強(qiáng)針對(duì)與LT或mLT不相關(guān)抗原的動(dòng)物免疫反應(yīng)(如IgG，IgA)的能力且無(wú)毒副作用。實(shí)驗(yàn)證據(jù)顯示mLT具有為口服抗原作佐劑的用途；這種施用導(dǎo)致對(duì)與mLT一起施用的抗原的血清IgG和/或粘膜IgA的產(chǎn)生。本發(fā)明提供一種在宿主中誘導(dǎo)對(duì)任何口服抗原的血清和/或粘膜免疫反應(yīng)的方法，它包括向宿主施用有效量的mLT并口服有效量的該抗原。優(yōu)選地該抗原和mLT優(yōu)選在開始時(shí)同時(shí)施用。本方法和組合物提供一種改善的口服免疫方式，用于產(chǎn)生抗病原微生物的血清和粘膜抗體。針對(duì)滲透或侵入并穿過(guò)粘膜表面的病原微生物的IgA抗體反應(yīng)的產(chǎn)生能夠指向那個(gè)表面，而能夠產(chǎn)生顯著的血清抗體反應(yīng)以防止病原微生物的感染，其中，該病原微生物正是血清抗體所保護(hù)的。本發(fā)明對(duì)任何特異抗原是有用的，在那里特異的中和抗體反應(yīng)將有益于消除與該抗原相關(guān)的生理或疾病狀態(tài)。本發(fā)明還提供一種組合物，可用作抗表達(dá)霍亂樣腸毒素的腸毒素細(xì)菌生物體的一種疫苗成分及其使用方法。本發(fā)明還提供在這些方法中有用的一種組合物。該組合物包含有效量的mLT與有效量的抗原。4.附圖簡(jiǎn)述通過(guò)參考下列對(duì)本發(fā)明的詳細(xì)描述，本發(fā)明特殊實(shí)施方案的實(shí)施例以及附圖，會(huì)更全面地了解本發(fā)明，其中圖1.質(zhì)粒pBD94的圖譜，它在1ac啟動(dòng)子的控制下編碼A和B亞基。質(zhì)粒pBD95在A亞基的第192個(gè)氨基酸殘基處有一個(gè)堿基替換，編碼甘氨酸而非精氨酸，它保留了閱讀框但消除了蛋白酶水解位點(diǎn)。圖中顯示對(duì)應(yīng)于胰蛋白酶敏感區(qū)的氨基酸序列和Arg192-Gly192氨基酸替換位點(diǎn)。圖2.圖解證明隨CT量的增加ADP-ribosylagmatine水平的劑量依賴性增加。圖3.小鼠喂以125μg的天然LT而非125μg的mLT后的流體積蓄。腸-屠體比定義為腸重量除以剩余的屠體重量。圖4.mLT作為免疫佐劑的能力。圖4A，mLT誘導(dǎo)對(duì)應(yīng)于OVA的血清IgG的能力。圖4B，mLT誘導(dǎo)對(duì)應(yīng)于OVA的粘膜sIgA的能力。圖5.mLT保留了防止對(duì)LT口服耐受誘導(dǎo)的能力的實(shí)驗(yàn)證明。圖5A，mLT誘導(dǎo)對(duì)應(yīng)于LT的血清IgG的能力。圖5B，mLT誘導(dǎo)對(duì)應(yīng)于LT的粘膜sIgA的能力。5.發(fā)明詳述本發(fā)明包含用于促進(jìn)抗原的粘膜和血清抗體產(chǎn)生的組合物及其應(yīng)用方法，這些抗原同遺傳學(xué)改造的細(xì)菌毒素同時(shí)口服施用。改造的毒素是大腸桿菌熱不穩(wěn)定腸毒素(LT)的一種形式，它是通過(guò)基因工程喪失其胰蛋白酶敏感部位使分子無(wú)毒，而且出人意料地保留其作為免疫佐劑的能力。突變的LT在此稱做“mLT”。本發(fā)明基于一個(gè)出人意料和令人吃驚的結(jié)果的發(fā)現(xiàn)，即mLT與LT一樣是一種有效的免疫佐劑。mLT不再有ADP-核糖基化的酶活性，因?yàn)锳亞基不能被蛋白水解加工。與Lycke及其同事發(fā)表的研究不同，他們弄清影響LT的ADP-核糖基化活性的改變也阻止該分子的免疫佐劑作用〔Lyckeetal.，1992，Eur.J.Immunol.222277-2281〕，目前描述的mLT雖然如實(shí)施例中所證明的不具有ADP-核糖基化活性，但保留了免疫佐劑活性。這里描述的大腸桿菌熱不穩(wěn)定腸毒素的新突變形式表現(xiàn)為佐劑，并激發(fā)產(chǎn)生被遞送的抗原的血清IgG和粘膜sIgA。這項(xiàng)令人驚奇的發(fā)現(xiàn)的用途在于佐劑有效量的mLT可用于抗各種病原體的有效免疫方案，包括口服有效量的mLT佐劑與殺死的或減毒的病原體或特異病原體的相關(guān)毒力決定簇，不必?fù)?dān)心口服CT或LT所帶來(lái)的真正或潛在的毒副作用。本發(fā)明廢棄了現(xiàn)有技術(shù)，因?yàn)楸景l(fā)明可以用于各種免疫學(xué)應(yīng)用，在此CT、LT或它們的亞基可能已被使用，但現(xiàn)在使用的mLT沒(méi)有真正的或潛在的與其使用相關(guān)的副作用，如腹瀉。與LT相比，雖然當(dāng)首次從細(xì)菌分離時(shí)LT無(wú)毒，但當(dāng)暴露于如在哺乳動(dòng)物腸中發(fā)現(xiàn)的蛋白酶時(shí)有可能是完全有毒的，mLT不可能由于蛋白酶水解激活變?yōu)橛卸?。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案是作為抗表達(dá)霍亂樣毒素的腸毒生物體的疫苗的一種成分。本發(fā)明者已指出mLT在給藥時(shí)(見(jiàn)下)不受口服誘導(dǎo)的免疫耐受，因此mLT能起作用而且很有希望作為直接抗腸毒生物體的疫苗的一種成分?，F(xiàn)有技術(shù)提供抗表達(dá)霍亂樣毒素生物體的疫苗，包含殺死的完整細(xì)胞和毒素的B亞基。通過(guò)在疫苗中用mLT替換B亞基，該疫苗在兩個(gè)不同方面得以改進(jìn)。第一，具有A和B亞基的mLT將不僅誘導(dǎo)對(duì)B亞基的免疫反應(yīng)，而且還誘導(dǎo)對(duì)A亞基的免疫反應(yīng)。這為有效中和提供了更多的表位。第二，mLT固有的佐劑活性會(huì)增強(qiáng)抗疫苗中殺死的完整細(xì)胞成分的免疫應(yīng)答。而且，其它研究者〔Haseetal.，1994，Infect.Immun.622051-3057〕已指出A亞基通過(guò)改變ADP-核糖基化酶活性的活性部位以修飾使其不再有毒(與作為本發(fā)明主題的蛋白水解部位相反)，便能夠誘導(dǎo)針對(duì)野生型A亞基的免疫應(yīng)答。然而，現(xiàn)在這樣改造的A亞基缺乏免疫佐劑活性，所以不如mLT更有希望成為疫苗成分。再者，因?yàn)榭筸LT的抗體與LT和CT交叉反應(yīng)，mLT可用于直接抗多種類型表達(dá)霍亂樣毒素的腸毒細(xì)菌生物體，如埃希氏桿菌屬和弧菌屬細(xì)菌的疫苗。5.1mLT的生產(chǎn)野生型LT毒素被發(fā)現(xiàn)于能產(chǎn)生此毒素的產(chǎn)腸毒素的大腸桿菌株的天然存在質(zhì)粒編碼。本發(fā)明者先前已從叫做H10407的大腸桿菌人分離物中克隆了LT基因。該亞克隆由插入pBR322質(zhì)粒PstI位點(diǎn)的H10407腸毒素質(zhì)粒中的5.2kbDNA片段組成〔Clementsetal.，1983，Infect.Immun.40653〕。此叫做pDF82的重組質(zhì)粒已被廣泛鑒定并在天然LT啟動(dòng)子的控制下表達(dá)LT。此過(guò)程的下一步是將LT基因置于強(qiáng)啟動(dòng)子的控制之下，此處的pUC18質(zhì)粒的lac啟動(dòng)子。通過(guò)分別分離LT-A和LT-B的基因并將它們重組在載體質(zhì)粒的一個(gè)盒中完成。這是一個(gè)重要步驟，因?yàn)樗试S合理數(shù)量的LT的純化并衍生為隨后分析的突變體。該叫做pBD94的質(zhì)粒圖解見(jiàn)圖1。CT和LT都用連接A1和A2片段的胰蛋白酶敏感肽鍵合成。此肽鍵必須是缺口的，以使該分子“有毒”。對(duì)白喉毒素，原型A-B毒素和各種其它細(xì)菌毒素也一樣。不論通過(guò)細(xì)菌蛋白酶或腸腔中的蛋白酶，如果A1-A2鍵沒(méi)有去掉，則A1片段不能達(dá)到其小腸上皮細(xì)胞基質(zhì)層表面的靶上。與CT相比，LT當(dāng)剛從細(xì)胞分離時(shí)不具完全的生物學(xué)活性。LT還需要蛋白水解成為完全活性的，而且蛋白水解激活不發(fā)生于細(xì)菌內(nèi)部。所以，改變分子的毒性并不影響ADP-核糖基化酶活性的一種方法可能是通過(guò)基因操作，去掉連接A亞基的A1和A2成分的胰蛋白酶敏感氨基酸。如果該分子不能被蛋白水解切割，它就無(wú)毒。本領(lǐng)域的技術(shù)人員會(huì)預(yù)言該分子可能保持其ADP-核糖基化酶活性并最終保持其佐劑功能。圖1表示分開A1和A2片段的二硫包裹區(qū)域的序列。該區(qū)域中有一個(gè)精氨酸殘基，它被認(rèn)為是激活該分子毒性所必需的切割位點(diǎn)。該區(qū)域通過(guò)定位致突變被改變，以使分子對(duì)蛋白水解消化不敏感，最終無(wú)毒。定位致突變通過(guò)將單鏈DNA與合成的寡核苷酸雜交完成的，該寡核苷酸除接近中央的失配區(qū)域外與單鏈模板互補(bǔ)。就是這個(gè)區(qū)域含有想要的一個(gè)或多個(gè)核苷酸改變。與單鏈靶DNA雜交后，該寡核苷酸用DNA聚合酶延伸以產(chǎn)生一個(gè)雙鏈結(jié)構(gòu)。缺口然后用DNA連接酶封口，針雙鏈體結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化到大腸桿菌宿主中。由于DNA的半保留復(fù)制模式，使用此方法的突變體理論產(chǎn)率是50％。實(shí)際上，產(chǎn)率更低。然而有些方法能改進(jìn)產(chǎn)率并用于選擇寡核苷酸定向突變體。采用的系統(tǒng)利用第二突變寡核苷酸，在兩次突變策略中產(chǎn)生改變的限制性部位。下一步是將Arg替換成另一氨基酸(即，GGA＝甘氨酸替換AGA＝精氨酸)，雖然消除了蛋白水解位點(diǎn)但保留了閱讀框。然后通過(guò)瓊脂糖親合層析，從已經(jīng)測(cè)序證明的一個(gè)突變體(pBD95)純化mLT。其它純化方法對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員是顯而易見(jiàn)的。此叫做LT(R192G)的突變LT通過(guò)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)對(duì)胰蛋白酶敏感鍵的修飾。樣品暴露或不暴露于胰蛋白酶進(jìn)行檢測(cè)并與天然(未修飾的)LT相比較。當(dāng)與胰蛋白酶溫育時(shí)mLT不裂解為A1和A2，因而表明去掉了對(duì)蛋白酶的敏感性。5.2mLT和非相關(guān)抗原的給藥形式根據(jù)本發(fā)明，mLT能與任何生物學(xué)上相關(guān)抗原和/或疫苗聯(lián)合用藥，以獲得對(duì)所說(shuō)抗原和/或疫苗增強(qiáng)的免疫反應(yīng)。在優(yōu)選實(shí)施方案中，mLT和抗原以含有有效量的mLT和有效量的抗原的藥物組合物被同時(shí)施用。給藥形式為口服。mLT和抗原的相對(duì)量會(huì)依照被采用抗原的本性和被免疫動(dòng)物的種類而變化。在一個(gè)實(shí)施方案中，先施用mLT和抗原，再用相關(guān)抗原加強(qiáng)免疫。在另一個(gè)實(shí)施方案中不施用加強(qiáng)免疫。加強(qiáng)免疫的時(shí)間選擇依賴于抗原和被處理的種類。通過(guò)常規(guī)實(shí)驗(yàn)，容易確定劑量范圍以及對(duì)被施用種類和抗原的加強(qiáng)免疫時(shí)間選擇的變更。加強(qiáng)免疫可只有抗原或與mLT合用。加強(qiáng)免疫的給藥形式可口服、鼻腔或胃腸外，但如果在加強(qiáng)免疫中用mLT，優(yōu)選采用口服給藥。本發(fā)明的方法和組合物想要在不成熟和成熟的脊椎動(dòng)物中使用，特別是鳥類、哺乳動(dòng)物和人。有用的抗原，做為例子但不做為限制，可包括來(lái)自細(xì)菌致病株抗原(釀膿鏈球菌、肺炎鏈球菌、淋病奈瑟氏球菌、腦膜炎奈瑟氏球菌、白喉棒狀桿菌、肉毒梭狀芽孢桿菌、產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌、破傷風(fēng)梭狀芽孢桿菌、流感嗜血桿菌、肺炎克雷伯氏桿菌、臭鼻克雷伯氏桿菌、鼻硬結(jié)克雷伯氏桿菌、金黃色葡萄球菌、霍亂弧菌、大腸桿菌、綠膿桿菌、胎兒彎曲菌(弧菌)、吸水性產(chǎn)氣單孢菌、蠟樣芽胞桿菌、緩慢愛(ài)德華氏菌、結(jié)腸炎耶樂(lè)森氏桿菌、鼠疫耶爾森氏桿菌、假結(jié)核耶爾森氏菌、痢疾志賀氏菌、福氏志賀氏菌、宋內(nèi)志賀氏菌、鼠傷寒沙門氏桿菌、梅毒密螺旋體、極細(xì)密螺旋體、品他病密螺旋體、奮森氏疏螺旋體、包柔氏疏螺旋體菌、黃疸出血型鉤端螺旋體、結(jié)核分枝桿菌、鼠弓形體、卡氏肺囊蟲、土拉熱弗郎西斯氏菌、流產(chǎn)布魯氏菌、豬型布魯氏菌、馬爾他布魯氏菌、支原體屬、普氏立克次體、恙蟲病立克次體、衣原體屬；致病真菌(粗球孢子菌、煙曲菌、白色念珠菌、皮炎牙生菌、新型隱球菌、莢膜組織胞漿菌)；原生動(dòng)物(Entomoebahistolytica、tenas毛滴蟲、人毛滴蟲、陰道毛滴蟲、剛比亞錐蟲、羅德西亞錐蟲、克氏錐蟲、杜氏利什曼原蟲、熱帶利什曼原蟲、巴西利什曼錐蟲、肺炎肺囊蟲、間日瘧原蟲、惡性瘧蟲、三日瘧原蟲)；或腸蟲(蟯蟲、毛首鞭蟲、人蛔蟲、旋毛線蟲、糞類圓線蟲、日本血吸蟲、曼氏裂體吸蟲、埃及血吸蟲，和鉤蟲)以完整細(xì)胞形式或從技術(shù)上已知的設(shè)計(jì)用于生長(zhǎng)所述生物體的培養(yǎng)基中部分分離的形式，或者通過(guò)基因工程技術(shù)或化學(xué)合成得到的所述生物體的保護(hù)抗原提呈給免疫系統(tǒng)。其它相關(guān)的抗原為致病病毒(做為例子但不做為限制痘病毒、皰疹病毒、單純皰疹病毒1、單純皰疹病毒2、腺病毒、乳多空病毒、腸病毒、小RNA病毒、細(xì)小病毒、呼腸病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、流感病毒、副流感病毒、腮腺炎病毒、麻疹、呼吸合胞體病毒、風(fēng)疹、蟲媒病毒、彈狀病毒、沙粒病毒、肝炎A病毒、肝炎B病毒、肝炎C病毒、肝炎E病毒、非A/非B肝炎病毒、鼻病毒、冠狀病毒、輪狀病毒和人免疫缺陷病毒)以完整的或從技術(shù)上已知的設(shè)計(jì)用于生長(zhǎng)這些病毒的培養(yǎng)基中部分分離的形式，或者通過(guò)基因工程技術(shù)或化學(xué)合成得到的保護(hù)抗原提呈給免疫系統(tǒng)。相關(guān)抗原的其它例子包括但不限于疫苗。這些疫苗的例子包括但不限于流感疫苗、百日咳疫苗、白喉和破傷風(fēng)毒素與百日咳疫苗聯(lián)用，肝炎A疫苗、肝炎B疫苗、肝炎C疫苗、肝炎E疫苗、日本腦炎疫苗、皰疹疫苗、麻疹疫苗、風(fēng)疹疫苗、腮腺炎疫苗、麻疹、腮腺炎和風(fēng)疹的混合疫苗、乳頭瘤病毒疫苗、細(xì)小病毒疫苗、呼吸合胞體病毒疫苗、Lyme病疫苗、脊髓灰質(zhì)炎疫苗、瘧疾疫苗、水痘疫苗、淋病疫苗、HIV疫苗、血吸蟲病疫苗、輪狀病毒(rota)疫苗、支原體疫苗、肺炎球菌疫苗、腦膜炎球菌疫苗等。這些可用已知的普通方法生產(chǎn)?？傊?，這些疫苗包含完整的生物體或用技術(shù)人員已知的技術(shù)培養(yǎng)和分離的病毒，或者包含通過(guò)基因工程技術(shù)或化學(xué)合成生產(chǎn)的這些生物體或病毒的相關(guān)抗原。其生產(chǎn)被解釋但不限于如下流感疫苗含有完整或部分血凝素、涎酸酶、核蛋白以及基質(zhì)蛋白的疫苗，它們能通過(guò)用醚和去垢劑純化接種于雞胚的病毒，或通過(guò)基因工程技術(shù)或化學(xué)合成獲得。百日咳疫苗含有完整或部分百日咳病毒、血凝素、以及K-凝集素的疫苗，它們能用甲醛從減毒毒素中獲得，即通過(guò)鹽析或超速離心從百日咳桿菌的培養(yǎng)基或菌體中提取，或通過(guò)基因工程技術(shù)或化學(xué)合成獲得。白喉和破傷風(fēng)類毒素與百日咳疫苗聯(lián)用百日咳疫苗、白喉和破傷風(fēng)類毒素的混合疫苗。日本腦炎疫苗含有完整或部分抗原蛋白的疫苗，它通過(guò)在小鼠腦內(nèi)培養(yǎng)病毒，用離心或乙醇純化病毒顆粒并滅活而獲得，或通過(guò)基因工程技術(shù)或化學(xué)合成獲得。肝炎B疫苗含有完整或部分通過(guò)鹽析或超速離心分離并純化HBs抗原獲得的抗原蛋白的疫苗，它從帶有肝炎的血液得到，或通過(guò)基因工程技術(shù)或化學(xué)合成獲得。麻疹疫苗含有完整或部分生長(zhǎng)在培養(yǎng)的雞胚細(xì)胞或雞胚中的病毒的疫苗，或者通過(guò)基因工程或化學(xué)合成得到的保護(hù)性抗原。風(fēng)疹疫苗含有完整或部分生長(zhǎng)在培養(yǎng)的雞胚細(xì)胞或雞胚中的病毒的疫苗，或者通過(guò)基因工程技術(shù)或化學(xué)合成得到的保護(hù)性抗原。流行性腮腺炎疫苗含有完整或部分生長(zhǎng)在培養(yǎng)的兔細(xì)胞或雞胚中的病毒的疫苗，或者通過(guò)基因工程或化學(xué)合成得到的保護(hù)性抗原。麻疹、風(fēng)疹和腮腺炎的混合疫苗通過(guò)混合麻疹、風(fēng)疹和腮腺炎疫苗得到的疫苗。輪狀病毒(Rota)疫苗含有完整或部分生長(zhǎng)于培養(yǎng)的MA104細(xì)胞或從病人糞便分離的病毒的疫苗，或者通過(guò)基因工程或化學(xué)合成得到的保護(hù)抗原。支原體的疫苗含有完整或部分生長(zhǎng)在支原體液體培養(yǎng)劑的支原體細(xì)胞，或者通過(guò)基因工程或化學(xué)合成得到的保護(hù)抗原的疫苗。通過(guò)本方法可以獲得有效預(yù)防的那些條件對(duì)技術(shù)人員是顯而易見(jiàn)的。本發(fā)明的疫苗制劑組合物可以期望的比例通過(guò)將上述抗原和/或疫苗與mLT混合來(lái)制備。該制劑應(yīng)該經(jīng)嚴(yán)格無(wú)菌處理，并且每種成分也應(yīng)無(wú)菌。熱原或變應(yīng)原自然應(yīng)盡可能完全地除掉。本發(fā)明的抗原制劑可通過(guò)分別制備抗原本身和mLT使用。而且本發(fā)明包含一個(gè)試劑盒，它含有有效量的抗原和佐劑有效量的mLT。在使用中該試劑盒的成分可以先混合起來(lái)再口服給藥，或在一短的時(shí)間間隔內(nèi)分別口服各成分。本發(fā)明的疫苗制劑組合物可以液體或固體藥物載體混合，該組合物可以片劑、膠囊、粉劑、粒劑、懸液或溶液形式，該組合物也可以含有適當(dāng)?shù)姆栏瘎⑸睾拖阄秳┗虍a(chǎn)生緩慢釋放的試劑。本發(fā)明藥物組合物制劑中可使用的可能載體包括但不限于明膠膠囊、蔗糖、纖維素衍生物如羧甲基纖維素鈉、明膠、talc、硬脂酸鎂、植物油如花生油等，甘油、山梨醇、瓊脂和水。載體也可做為粘合劑以利于組合物的成片而方便口服。本發(fā)明的疫苗制劑組合物可通過(guò)冷凍干燥或其它本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法以一種穩(wěn)定的儲(chǔ)藏形式保存以隨時(shí)使用。做為口服給藥疫苗制劑可在緩沖鹽水，牛奶，或其它任何生理上相容的液體介質(zhì)中重配成懸液，該介質(zhì)可以通過(guò)加入適當(dāng)?shù)纳睾拖阄秳┳兊母追?。疫苗制劑組合物可在口服有效量胃酸中和劑后服用。雖然為此目的可使用許多化合物，但是優(yōu)選碳酸氫鈉。疫苗組合物或以腸溶包被膠囊(即只有通過(guò)胃后膠囊才溶解)遞送。6.實(shí)施例下列實(shí)施例僅為解釋而不是以任何方式限制本發(fā)明的范圍而被介紹。6.1mLT的構(gòu)建野生型LT毒素被發(fā)現(xiàn)于能產(chǎn)生此毒素的產(chǎn)腸毒素的大腸桿菌株的天然存在質(zhì)粒編碼。本發(fā)明者先前已從叫做H10407的大腸桿菌人分離物中克隆了LT基因。該亞克隆由插入pBR322質(zhì)粒PstI位點(diǎn)的H10407腸毒素質(zhì)粒中的5.2kbDNA片段組成〔Clementsetal.，1983，Infect.Immun.40653〕。此叫做pDF82的重組質(zhì)粒已被廣泛鑒定并在天然LT啟動(dòng)子的控制下表達(dá)LT。此過(guò)程的下一步是將LT基因置于強(qiáng)啟動(dòng)子的控制之下，此處的pUC18質(zhì)粒的lac啟動(dòng)子。通過(guò)分別分離LT-A和LT-B的基因并將它們重組在載體質(zhì)粒的一個(gè)盒中完成。這是一個(gè)重要步驟，因?yàn)樗试S合理數(shù)量的LT的純化并衍生為隨后分析的突變體。該叫做pBD94的質(zhì)粒圖解見(jiàn)圖1。CT和LT都用連接A1和A2片段的胰蛋白酶敏感肽鍵合成。此肽鍵必須是缺口的，以使該分子“有毒”。對(duì)白喉毒素，原型A-B毒素和各種其它細(xì)菌毒素也一樣。不論通過(guò)細(xì)菌蛋白酶或腸腔中的腸蛋白酶，即蛋白水解加工或激活，如果A1-A2鍵沒(méi)有去掉，則A1片段不能達(dá)到其小腸上皮細(xì)胞基質(zhì)層表面的靶上。與CT相比，LT當(dāng)剛從細(xì)胞分離時(shí)不具完全的生物學(xué)活性。LT還需要蛋白水解成為完全活性的，而且蛋白水解激活不發(fā)生于細(xì)菌內(nèi)部。所以，改變分子的毒性并不影響ADP-核糖基化酶活性的一種方法可能是通過(guò)基因操作，去掉連接A亞基的A1和A2成分的胰蛋白酶敏感氨基酸。如果該分子不能被蛋白水解切割，它就無(wú)毒。本領(lǐng)域的技術(shù)人員會(huì)預(yù)言該分子可能保持其ADP-核糖基化酶活性并最終保持其佐劑功能。圖1表示分開A1和A2片段的二硫包裹區(qū)域的序列。該區(qū)域中有一個(gè)精氨酸殘基，它被認(rèn)為是激活該分子毒性所必需的切割位點(diǎn)。該區(qū)域通過(guò)定位致突變被改變，以使分子對(duì)蛋白水解消化不敏感，最終無(wú)毒。定位致突變通過(guò)將單鏈DNA與合成的寡核苷酸雜交完成的，該寡核苷酸除接近中央的失配區(qū)域外與單鏈模板互補(bǔ)。就是這個(gè)區(qū)域含有想要的一個(gè)或多個(gè)核苷酸改變。與單鏈靶DNA雜交后，該寡核苷酸用DNA聚合酶延伸以產(chǎn)生一個(gè)雙鏈結(jié)構(gòu)。缺口然后用DNA連接酶封口，針雙鏈體結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化到大腸桿菌宿主中。由于DNA的半保留復(fù)制模式，使用此方法的突變體理論產(chǎn)率是50％。實(shí)際上，產(chǎn)率更低。然而有些方法能改進(jìn)產(chǎn)率并用于選擇寡核苷酸定向突變體。采用的系統(tǒng)利用第二突變寡核苷酸，在兩次突變策略中產(chǎn)生改變的限制性部位。下一步是將Arg替換成另一氨基酸(即，GGA＝甘氨酸替換AGA＝精氨酸)，雖然消除了蛋白水解位點(diǎn)但保留了閱讀框。然后通過(guò)瓊脂糖親合層析，從已經(jīng)測(cè)序證明的一個(gè)突變體(pBD95)純化mLT。其它純化方法對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員是顯而易見(jiàn)的。此叫做LT(R192G)的突變LT通過(guò)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)對(duì)胰蛋白酶敏感鍵的修飾。樣品暴露或不暴露于胰蛋白酶進(jìn)行檢測(cè)并與天然(未修飾的)LT相比較。當(dāng)與胰蛋白酶溫育時(shí)不裂解為mLTA1和A2，因而表明去掉了對(duì)蛋白酶的敏感性。6.2mLT對(duì)Y-1腎上腺細(xì)胞的作用本領(lǐng)域技術(shù)人員可能預(yù)言mLT在Y-1腎上腺細(xì)胞試驗(yàn)中沒(méi)有活性。這個(gè)預(yù)言可能基于先前的發(fā)現(xiàn)〔ClementsandFinkelstein，1979，Infect.Immun.24760-769〕，即無(wú)缺口LT在此試驗(yàn)系統(tǒng)中比CT活性小1000倍以上，而且在該試驗(yàn)中胰蛋白酶處理激活的LT與CT具同等水平的生物學(xué)活性。此實(shí)驗(yàn)中無(wú)胰蛋白酶激活情況下觀察到的LT殘存活性被推測(cè)為不能被解釋的一些殘余蛋白酶活性的作用。例如，在Y-1腎上腺細(xì)胞傳代培養(yǎng)過(guò)程中使用胰酶。因此推測(cè)不能被切口的LT在Y-1腎上腺細(xì)胞試驗(yàn)中可能完全無(wú)活性。結(jié)果見(jiàn)表1。表I</tables>表I證明了出人意料的發(fā)現(xiàn)，即mLT即使沒(méi)有被蛋白水解加工，在Y-1腎上腺細(xì)胞試驗(yàn)中仍保持活性的基本水平。如表I所示，經(jīng)胰酶處理的CT和天然LT對(duì)Y-1腎上腺細(xì)胞具有相同水平的活性(15pg)。相比之下，mLT(48,000pg)比CT天然CT活性?。?000倍，并不能被胰酶激活。殘存的基礎(chǔ)活性無(wú)疑反映了腎上腺細(xì)胞激活的不同的并到現(xiàn)在為止，除需要A1-A2連接的分離之外未知的通路。6.3mLT的ADP-核糖基化酶活性因?yàn)橛肎ly192置換Arg192的突變不改變A1部分的酶促部位，所以本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以預(yù)測(cè)mLT可能保留其ADP-核糖基化酶活性。為了檢測(cè)該性質(zhì)，采有NAD-AgmatineADP-核糖轉(zhuǎn)移酶試驗(yàn)，[Mossetal.，1993，J.Biol.Chem.2686383-6387]。如圖2所示，CT產(chǎn)生劑量依賴性ADP-ribosylagmatine水平的升高，該分子ADP-核糖轉(zhuǎn)移酶活性的作用的升高。表II</tables>表II以表格形式證明了出人意料的發(fā)現(xiàn)，即mLT不論有無(wú)胰酶激活，均缺少任何可察覺(jué)的ADP-核糖基化酶活性，即使沒(méi)有改變酶促部位，并且在Y-1腎上腺細(xì)胞試驗(yàn)中有可證明的活性基礎(chǔ)水平。6.4mLT的腸毒素活性由于出人意料的發(fā)現(xiàn)即使酶促部位沒(méi)有改變，在有或無(wú)胰酶激活條件下mLT缺乏任何可檢測(cè)到的ADP-核糖基化酶活性，而且另外發(fā)現(xiàn)在Y-1腎上腺細(xì)胞試驗(yàn)中有基礎(chǔ)活性水平，因此不清楚是否mLT會(huì)保留其腸毒性特性。mLT的理想制劑為保留其作為免疫佐劑的能力，但沒(méi)有真正的或潛在的副作用，如與LT或CT的使用有關(guān)的腹瀉。圖3證明在伸展小鼠模型中，在125μg劑量下mLT不誘導(dǎo)網(wǎng)流體分泌。該劑量比在此模型中LT的佐劑有效劑量高出五倍多。重要的是，天然LT在此水平可看到其可能的毒性。6.5mLT的佐劑活性由于mLT不具有可證明的ADP-核糖轉(zhuǎn)移酶活性且非腸毒的，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可能預(yù)測(cè)其缺乏佐劑性質(zhì)。這個(gè)預(yù)測(cè)可能基于Lycke等的報(bào)道[Lyckeetal.，1992，Eur.J.Immunol.222277-2281]，在此人們清楚地知道影響毒素ADP-核糖基化酶活性和改變?cè)黾蛹?xì)胞內(nèi)CAMP水平的能力的變化也阻礙分子的佐劑功能。如上證明的，mLT無(wú)ADP-核糖基化酶活性，只在Y-1腎上腺細(xì)胞中有一些未確定的基礎(chǔ)活性，mLT在伸展小鼠模型中不誘導(dǎo)網(wǎng)流體分泌。為了檢測(cè)mLT的佐劑活性，進(jìn)行下列實(shí)驗(yàn)。免疫三組BALB/C小鼠。用鈍頭灌胃針給動(dòng)物胃內(nèi)接種(Popper&amp;Sons，Inc.NewHydePark，NewYork)。在0天，各組口服免疫如下A組接受含5mgOVA的0.5mlPBS，B組接受含5mgOVA和25μg天然LT的0.5mlPBS，C組接受含5mgOVA和25μgmLT的0.5mlPBS。在7和14天再施用各劑量。在21天，所有動(dòng)物腹腔注射含1μgOVA的20％Maalox進(jìn)行加強(qiáng)免疫。i.p.后一周，處死接種的動(dòng)物并用ELISA測(cè)試直接抗OVA和LT的血清IgG和粘膜IgA抗體。用于ELISA的試劑和抗血清購(gòu)自西格瑪化學(xué)公司。用于ELISA的樣品用磷酸鹽緩沖鹽水(PH7.2)-0.05％吐溫20(PBS-TWEEN)進(jìn)行系列稀釋。對(duì)抗LT測(cè)定，預(yù)先用每孔1.5μg混合神經(jīng)節(jié)苷脂(III型)包被微滴定板，然后每孔加1μg純化的LT?？筄VA在先用每孔10μgOVA包被的微滴定板上測(cè)定。血清抗LT和抗OVA用偶聯(lián)堿性磷酸酶兔抗鼠IgA(α-鏈特異的)抗血清測(cè)試后，再用偶聯(lián)堿性磷酸酶的兔抗羊IgG的抗血清測(cè)試。反應(yīng)用3NNaOH終止。IgG和IgA的從純化的鼠骨髓瘤蛋白的標(biāo)準(zhǔn)曲線確定(MOPC315，gA(IgA12)MOPC21，gG1LittonBionetics，Inc.，Charleston，SC)。6.5.1血清IgG抗OVA如圖4A所示，口服OVA和LT的動(dòng)物在隨后用OVA(4，058μg/ml)胃腸外免疫后，比那些只灌注OVA并隨后胃腸外用OVA免疫的(無(wú)可檢測(cè)到的抗OVA反應(yīng))(Stadentt-檢驗(yàn)P＝.031)形成明顯較高的血清IgG抗OVA反應(yīng)。明顯的，口服OVA和mLT的動(dòng)物在隨后用OVA(1，338μg/ml)胃腸外免疫后，也比那些只灌注OVA并隨后胃腸外用OVA免疫的(無(wú)可檢測(cè)到的抗OVA反應(yīng))(Studentt-檢驗(yàn)P＝.0007)形成明顯較高的血清IgG抗OVA反應(yīng)。6.5.2粘膜sIgA抗OVA如圖4B所示，在這些相同組的動(dòng)物中在比較抗OVAIgA反應(yīng)時(shí)獲得相似的結(jié)論?？诜﨩VA和LT的動(dòng)物在隨后用OVA(869nl/ml)胃腸外免疫后，比那些只灌注OVA并隨后胃腸外用OVA免疫的(無(wú)可檢測(cè)到的抗OVA反應(yīng))(Studentt-檢驗(yàn)p＝.0131)形成明顯較高的粘膜IgA抗OVA反應(yīng)。如上，口服OVA和mLT的動(dòng)物在隨后用OVA(230ng/ml)胃腸外免疫后，比那些只灌注OVA并隨后胃腸外用OVA免疫的(無(wú)可檢測(cè)到的抗OVA反應(yīng))(Studentt-檢驗(yàn)p＝.0189)形成明顯較高的粘膜IgA抗OVA反應(yīng)。6.5.3血清IgG抗LT在這些相同的動(dòng)物中，還檢測(cè)了LT和mLT引發(fā)抗LT抗體反應(yīng)的能力。這是重要的，因?yàn)檫@將提供突變的LT除了做為其它蛋白的佐劑外，是否能防止誘導(dǎo)對(duì)其自身耐受的跡象。如圖5A所示，口服OVA和LT的動(dòng)物在隨后用OVA(342μg/ml)胃腸外免疫后，比那些只灌注OVA并隨后胃腸外用OVA免疫的(無(wú)可檢測(cè)到的抗LT反應(yīng))(Studentt-檢驗(yàn)p＝.0005)形成明顯較高的血清IgG抗LT反應(yīng)?？诜﨩VA和mLT的動(dòng)物在隨后用OVA(552μg/ml)胃腸外免疫后，比那些只灌注OVA并隨后胃腸外用VOA免疫的(無(wú)可檢測(cè)到的抗LT反應(yīng))(Studentt-檢驗(yàn)p＝.0026)也形成明顯較高的血清IgG抗LT反應(yīng)。6.5.4粘膜sIgA抗LT如圖5B所示，在這些相同組的動(dòng)物中，在比較抗LTIgA反應(yīng)時(shí)獲得相似的結(jié)論?？诜﨩VA和LT的動(dòng)物在隨后用OVA(4328ng/ml)胃腸外免疫后，比那些只灌注OVA并隨后胃腸外用OVA免疫的(無(wú)可檢測(cè)到的LT反應(yīng))(Studentt-檢驗(yàn)p＝.0047)形成明顯較高的粘膜IgA抗LT反應(yīng)。如上，口服OVA和mLT的動(dòng)物在隨后用OVA(1463ng/ml)胃腸外免疫后，比那些只灌注OVA并隨后胃腸外用OVA免疫的(無(wú)可檢測(cè)到的抗LT反應(yīng))(Studentt-檢驗(yàn)p＝.0323)也形成明顯較高的粘膜IgA抗LT反應(yīng)。7.微生物的保藏下列質(zhì)粒于1994年8月18日保藏在美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)，Rockville，MD，并已被授予所示的保藏號(hào)質(zhì)粒保藏號(hào)大腸桿菌LTR192G中的pBD95ATCC69683在此描述并權(quán)利要求的發(fā)明不被在此公開的具體實(shí)施方案限制其范圍，因?yàn)檫@些實(shí)施方案意欲作為本發(fā)明幾個(gè)方面的解釋。任何等效的實(shí)施方案意欲在本發(fā)明的范圍內(nèi)。實(shí)際上本發(fā)明的各種修改，除了那些在此已指出和描述的以外，對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，會(huì)從前面的描述中變得明顯。這些修改也被意欲處于附加的權(quán)利要求范圍內(nèi)。還應(yīng)該知道，所有的堿基對(duì)和氨基酸殘基數(shù)目以及核苷酸和肽的大小是近似的，并為了描述而使用。在此引用了許多文獻(xiàn)，其全部公開內(nèi)容在此全文引入做為參考。PCT/RO/134表(1981年1月)權(quán)利要求書按照條約第19條的修改1.一種包含細(xì)菌腸毒素全毒素突變形式的一種組合物，它在佐劑有效劑量下具有減少的毒性但保留免疫佐劑活性。2.權(quán)利要求1的組合物，它對(duì)蛋白水解激活不敏感。3.權(quán)利要求1的組合物，為大腸桿菌熱不穩(wěn)定腸毒素全毒素的一種突變形式，因?yàn)樗哂忻庖咦魟┗钚缘珳p少的ADP-核糖基化活性而與天然LT性質(zhì)不同。4.權(quán)利要求1的組合物，為大腸桿菌熱不穩(wěn)定腸毒素全毒素的一種突變形式，因?yàn)樵撊舅氐腁亞基對(duì)蛋白水解激活不敏感而與天然LT性質(zhì)不同。5.權(quán)利要求1的組合物，它被裝載于具有ATCC保藏號(hào)69683的大腸桿菌LTR192G中質(zhì)粒pDD95編碼，它表達(dá)大腸桿菌熱不穩(wěn)定腸毒素的A和B亞基。6.一種含有一種抗原與權(quán)利要求1的組合物組合的疫苗制劑。7.一種含有一種抗原與權(quán)利要求1的組合物組合的口服疫苗制劑。8.權(quán)利要求6或7的疫苗制劑，其中該抗原為致病菌的細(xì)菌抗原，該菌選自鏈球菌屬、奈瑟氏球菌屬、棒狀桿菌屬、梭狀芽胞桿菌屬、嗜血桿菌屬、克雷白氏桿菌屬、葡萄球菌屬、弧菌屬、埃希氏菌屬、假單孢菌屬、彎曲桿菌屬、產(chǎn)氣單孢菌屬、芽胞桿菌屬、愛(ài)德華氏菌屬、耶爾森菌屬、志賀氏菌屬、沙門菌屬、密螺旋體屬、疏螺旋體屬、鉤端螺旋體屬、分枝桿菌屬、弓形體屬、肺囊蟲屬、弗朗西斯氏菌屬、布魯氏菌屬、支原體屬、立克次體屬和衣原體屬的微生物。9.權(quán)利要求6和7的疫苗制劑，其中該抗原選自流感疫苗，水痘疫苗，白喉類毒素，破傷風(fēng)類毒素，百日咳疫苗，日本腦炎疫苗，百日咳、白喉和破傷風(fēng)類毒素的混合疫苗，Lyme病疫苗，脊髓灰質(zhì)炎疫苗，瘧疾疫苗，皰疹疫苗，HIV疫苗，乳頭狀瘤病毒疫苗，肝炎B疫苗，輪狀病毒(rota)疫苗，彎曲桿菌屬疫苗，霍亂疫苗，腸道病原性大腸桿菌疫苗，腸毒大腸桿菌疫苗，沙門菌疫苗、志賀氏菌疫苗、血吸蟲病疫苗，麻疹疫苗，風(fēng)疹疫苗，流行性腮腺炎疫苗麻疹、風(fēng)疹和腮腺炎的聯(lián)合疫苗，以及支原體疫苗。10.含有有效量抗原和佐劑有效量的權(quán)利要求1的組合物的混合物，并可用于在宿主中產(chǎn)生對(duì)病原體保護(hù)性免疫反應(yīng)的組合物。11.含有有效量抗原和佐劑有效量的權(quán)利要求1的組合物的混合物，并可用于在宿主中產(chǎn)生對(duì)病原體保護(hù)免疫反應(yīng)的口服組合物。12.如權(quán)利要求1要求用于藥劑的突變腸毒素。13.一種含有兩種成分，并可用于在宿主中產(chǎn)生對(duì)病原體保護(hù)免疫反應(yīng)的試劑盒；兩種成分分別為(a)有效量的抗原和(b)佐劑有效量的突變大腸桿菌熱不穩(wěn)定腸毒素全毒素，因?yàn)樵撊舅氐腁亞基對(duì)蛋白水解激活不敏感而與天然LT和CT性質(zhì)不同，但該全毒素保留免疫佐劑活性，其中所述兩種成分在口服可接受的載體中，并且所述成分可在混合到一起后或在短時(shí)間內(nèi)分別給藥。14.權(quán)利要求1或10的組合物，其中野生型大腸桿菌熱不穩(wěn)定腸毒素的氨基酸Arg192被Gly192替換。15.權(quán)利要求6或7的疫苗制劑，其中野生型大腸桿菌熱不穩(wěn)定腸毒素的氨基酸Arg192被Gly192替換。16.權(quán)利要求13的試劑盒，其中野生型大腸桿菌熱不穩(wěn)定腸毒素的氨基酸Arg192被Gly192替換。17.在宿主中產(chǎn)生或支持對(duì)一種抗原的保護(hù)性或適應(yīng)性免疫反應(yīng)的方法，包括口服施用有效量的抗原與佐劑有效量的突變大腸桿菌熱不穩(wěn)定腸毒素全毒素的混合物，因?yàn)樵撊舅氐腁亞基對(duì)蛋白水解激活不敏感而與天然LT和CT性質(zhì)不同，但該全毒素在口服可接受的載體中保留免疫佐劑活性。18.權(quán)利要求17的方法，在此產(chǎn)生血清反應(yīng)。19.權(quán)利要求17的方法，在此產(chǎn)生粘膜反應(yīng)。20.權(quán)利要求17的方法，在此隨后施用抗原加強(qiáng)免疫。21.權(quán)利要求17的方法，其中該抗原選自細(xì)菌、病毒、原生動(dòng)物、真菌、蠕蟲和其它微生物病原體。22.權(quán)利要求17的方法，其中該混合物以單劑量施用。23.誘導(dǎo)對(duì)腸毒細(xì)菌生物體保護(hù)性免疫反應(yīng)的方法，包括將mLT用作疫苗的一種成分直接抗該腸毒細(xì)菌生物體。24.權(quán)利要求23的方法，其中該腸毒細(xì)菌生物體選自表達(dá)霍亂樣毒素的腸毒細(xì)菌生物體。25.權(quán)利要求24的方法，其中該腸毒細(xì)菌生物體選自埃希氏菌屬和弧菌屬細(xì)菌。權(quán)利要求1.一種含有大腸桿菌熱不穩(wěn)定腸毒素全毒素突變形式的組合物，所述突變形式具有免疫佐劑活性但通過(guò)NAD-AgmatineADP-糖基轉(zhuǎn)移酶實(shí)驗(yàn)測(cè)得沒(méi)有ADP-核糖基化酶活性。2.一種含有具有免疫佐劑活性的大腸桿菌熱不穩(wěn)定腸毒素全毒素突變形式的組合物，其中全毒素的A亞基不被胰酶裂解。3.權(quán)利要求1或2的組合物，它被裝載于具有ATCC保藏號(hào)69683大腸桿菌LTR192G中的質(zhì)粒PBD95編碼，表達(dá)大腸桿菌熱不穩(wěn)定腸毒素的A和B亞基。4.一種含有一種抗原與權(quán)利要求1或2的組合物組合的疫苗制劑。5.權(quán)利要求4的疫苗制劑，其中抗原選自流感疫苗，水痘疫苗，白喉類毒素，破傷風(fēng)類毒素，百日咳疫苗，日本腦炎疫苗，百日咳、白喉和破傷風(fēng)類毒素的混合疫苗，Lyme病疫苗，脊髓灰質(zhì)炎疫苗，瘧疾疫苗，皰疹疫苗，HIV疫苗，乳頭狀瘤病毒疫苗，肝炎B疫苗，輪狀病毒(rota)疫苗，彎曲桿菌屬疫苗，霍亂疫苗，腸道病原性大腸桿菌疫苗，腸毒大腸桿菌疫苗，血吸蟲病疫苗，麻疹疫苗，風(fēng)疹疫苗，流行性腮腺炎疫苗，麻疹、風(fēng)疹和腮腺炎的聯(lián)合疫苗，以及支原體疫苗。6.一種含有有效量抗原和佐劑有效量的權(quán)利要求1或2的組合物的混合物，并可應(yīng)用于在宿主中產(chǎn)生對(duì)病原體保護(hù)性免疫反應(yīng)的組合物。7.一種含有兩種成分，并可應(yīng)用于在宿主中產(chǎn)生對(duì)病原體保護(hù)性免疫反應(yīng)的試劑盒；兩種成分分別為(a)有效量的抗原和(b)具有免疫佐劑活性但通過(guò)NAD-AgmatineADP-糖基轉(zhuǎn)移酶實(shí)驗(yàn)測(cè)得沒(méi)有ADP-核糖基化酶活性的佐劑有效量的突變大腸桿菌熱不穩(wěn)定腸毒素全毒素，其中所述兩種成分在口服可接受的載體中，并且所述成分可在混合到一起后或在短時(shí)間內(nèi)分別給藥。8.權(quán)利要求1或6的組合物，其中A亞基不被胰酶裂解。9.權(quán)利要求4的組合物，其中A亞基不被胰酶裂解。10.權(quán)利要求7的試劑盒，其中A亞基不被胰酶裂解。11.權(quán)利要求1或6的組合物，其中野生型大腸桿菌熱不穩(wěn)定腸毒素的氨基酸Arg192被Gly192替換。12.權(quán)利要求4的組合物，其中野生型大腸桿菌熱不穩(wěn)定腸毒素的氨基酸Arg192被G1y192替換。13.權(quán)利要求7的試劑盒，其中野生型大腸桿菌熱不穩(wěn)定腸毒素的Arg192被Gly192替換。14.在宿主中產(chǎn)生或支持對(duì)一種抗原保護(hù)性或適應(yīng)性免疫反應(yīng)的方法，包括口腔施用一種在口服可接受的藥物載體中，有效量的抗原與具有免疫佐劑活性，但通過(guò)NAD-AgmatineADP-糖基轉(zhuǎn)移酶實(shí)驗(yàn)測(cè)得沒(méi)有ADP-核糖基化酶活性的佐劑有效量的突變大腸桿菌熱不穩(wěn)定腸毒素全毒素的混合物。15.權(quán)利要求14的方法，在此產(chǎn)生血清反應(yīng)。16.權(quán)利要求14的方法，在此產(chǎn)生粘膜反應(yīng)。17.權(quán)利要求14的方法，在此隨后施用抗原加強(qiáng)免疫。18.權(quán)利要求14的方法，其中該抗原選自細(xì)菌，病毒，原生動(dòng)物，真菌，蠕蟲和其它微生物病原體。19.權(quán)利要求14的方法，其中該混合物以單劑量物施用。20.一種誘導(dǎo)對(duì)腸毒細(xì)菌生物體保護(hù)性免疫反應(yīng)的方法，包括將mLT用作疫苗的一種成分直接抗該腸毒細(xì)菌生物體。21.權(quán)利要求20的方法，其中該腸毒細(xì)菌生物體選自表達(dá)霍亂樣毒素的腸毒細(xì)菌生物體。22.權(quán)利要求20的方法，其中該腸毒細(xì)菌生物體選自埃希氏菌屬細(xì)菌和弧菌屬細(xì)菌。全文摘要在此提供用于大腸桿菌熱不穩(wěn)定腸毒素的一種新突變形式的方法和組合物，這種腸毒素已喪失毒性但仍保留其免疫學(xué)活性。這種腸毒素與不相關(guān)抗原聯(lián)合使用，當(dāng)部分作為口服疫苗制劑施用時(shí)，獲得對(duì)所述抗原增強(qiáng)的免疫應(yīng)答。文檔編號(hào)A61P31/04GK1164191SQ95195838公開日1997年11月5日申請(qǐng)日期1995年7月18日優(yōu)先權(quán)日1994年8月26日發(fā)明者J·D·克萊曼茲,B·L·狄金森申請(qǐng)人:圖蘭恩教育基金管理人