專利名稱：干細(xì)胞增殖抑制因子及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及調(diào)節(jié)干細(xì)胞周期的干細(xì)胞增殖抑制因子在治療患有自身免疫病、衰老、癌癥、骨髓發(fā)育不良、前白血病、白血病、銀屑病或涉及過度增殖情況的其它疾病的人或動物中的應(yīng)用。本發(fā)明也涉及預(yù)先或已經(jīng)接觸化療藥物、其它對已進(jìn)入細(xì)胞周期的干細(xì)胞有損害的藥物或輻射的人或動物的治療方法。最后，本發(fā)明涉及用于自體和異體移植方法或用于基因轉(zhuǎn)移的干細(xì)胞的維持培養(yǎng)或擴(kuò)大培養(yǎng)的改進(jìn)。
背景技術(shù)：
在更新系統(tǒng)(renewing system)中的大多數(shù)終期細(xì)胞是短壽命的且在生命過程中不斷地被替代。例如，血細(xì)胞來源于具有自我更新能力的多潛能造血干細(xì)胞(HSC)。造血干細(xì)胞是造血細(xì)胞的一個(gè)亞群。造血細(xì)胞可以從例如骨髓、臍帶血或外周血(未活化的或用例如G-CSF的藥劑活化的)獲得；造血細(xì)胞包括干細(xì)胞群、祖細(xì)胞、分化細(xì)胞、輔助細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞以及有助于形成產(chǎn)生成熟血細(xì)胞所必需的環(huán)境的其它細(xì)胞。由于造血干細(xì)胞對于造血和免疫系統(tǒng)的所有成熟細(xì)胞的發(fā)育是必不可少的，因此在患者接受化療或其它藥物治療時(shí)，造血干細(xì)胞的存活對于重建機(jī)體的全部功能性宿主防御系統(tǒng)是必需的。
造血細(xì)胞的產(chǎn)生受一系列因子的調(diào)控，這些因子刺激造血細(xì)胞的生長，分化，其中一些因子如紅細(xì)胞生成素和G-CSF目前已用于臨床。然而，尚未完全表征的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的一部分是形成了調(diào)控過程中的負(fù)向調(diào)節(jié)(negative arm)的反饋機(jī)制(Eaves et al，Blood，78110-117，1991)。
在早期的研究中，Lord和其同事們發(fā)現(xiàn)在正常的鼠和豬骨髓提取物中存在著一種可溶性蛋白因子，它能可逆性地抑制造血干細(xì)胞的細(xì)胞周期(Lord et al.，Br.J.Haem.，34441-446，1976)。這種活性抑制物(分子量50～100kD)被命名為干細(xì)胞抑制因子(SCl)。
由于體內(nèi)檢測需要大量的受照射的小鼠這一固有的困難，初始來源的這種因子的純化沒能完成。為了克服這些困難，Pragnell和其同事們建立了一個(gè)體外檢測初級造血細(xì)胞的方法并篩選了作為活性抑制物來源的細(xì)胞系(見Graham et al.，Nature，344442-444，1990)。
由于早期的研究已鑒定出巨噬細(xì)胞是干細(xì)胞抑制因子的可能來源(Lord et al.，Blood Cells，6581-593，1980)，因此選擇了小鼠巨噬細(xì)胞系J774.2(Graham et al.，Nature，344442-444，1990)。Graham等用該細(xì)胞系的條件培養(yǎng)基進(jìn)行純化，分離到一種抑制性肽，它被證明與以前所描述的細(xì)胞因子，巨噬細(xì)胞炎性蛋白1-α(MIP-1α)，相同。因此，MIP-1α是從細(xì)胞系分離得到的，而不是從初級材料得到的。盡管Graham等觀察到MIP-1α抗體消除了骨髓粗提取物的活性，但其他工作者的研究表明其它抑制活性是重要的。例如，Graham等(J.Exp.Med.178925-32，1993)提出TGFβ，而不是MIP-1α是造血干細(xì)胞的一個(gè)基本抑制因子。Eaves等(PNAS 9012015-19，1993)進(jìn)一步提出在正常骨髓中MIP-1α和TGFβ兩者都處于較理想的水平，而且抑制作用需要兩個(gè)因子之間的協(xié)同作用。
其它工作者描述了另外一些干細(xì)胞抑制因子。Frindel和其同事從胎牛骨髓和肝臟提取物中分離了一種四肽，它有干細(xì)胞抑制活性(Lenfant et al.，PNAS 86779-782，1989)。Paukovits等(Cancer Res，50328-332，1990)表征了一種五肽，當(dāng)它以單體形式存在時(shí)是一種抑制因子，當(dāng)它以二聚體形式存在時(shí)是一種干細(xì)胞周期刺激因子。在各種離體系統(tǒng)中，還有一些因子也被認(rèn)為是抑制性的(見Wright和Pragnell，Bailliere’s ClinicalHaematology v.5，pp 723-39，1992(Bailliere Tinadall.Paris))。
Tsyrlova等(SU156261A1)公開了干細(xì)胞增殖抑制因子的純化方法。
至今，這些因子還沒有一個(gè)被批準(zhǔn)用于臨床。然而，確實(shí)需要有效的干細(xì)胞抑制因子。與化療或放療有關(guān)的主要毒性是破壞了正常增殖的細(xì)胞，導(dǎo)致骨髓抑制和胃腸毒性。一個(gè)有效的干細(xì)胞抑制因子將保護(hù)這些細(xì)胞并使治療方案最優(yōu)化。正如根據(jù)臨床情況，對各種刺激性細(xì)胞因子(即如下細(xì)胞因子IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-9、IL-11、IL-13、IL-14、IL-15、G-CSF、GM-CSF、紅細(xì)胞生成素、血小板生成素、干細(xì)胞因子，flk2/flt3配基等等，它們刺激造血細(xì)胞周期)有確定的需要一樣，對各種抑制性因子可能也有不同的臨床需要。
血紅蛋白是一種高度保守的具有約64,000道爾頓分子量的四聚體蛋白，它由兩條α鏈和兩條β鏈組成。每條鏈結(jié)合一個(gè)血紅素分子(亞鐵血紅素IX)，一個(gè)含鐵輔基。脊椎動物α和β鏈可能來源于單一的祖先基因，該基因被復(fù)制，然后分開；在鏈自身之間和不同脊椎動物之間，兩條鏈在很大程度上存在序列一致性(見

圖16A)。在人類中，16號染色體上的α鏈簇含有兩個(gè)編碼相同多肽的α基因(α1和α2)，以及編碼其它α樣鏈的基因ζ、θ和幾個(gè)非轉(zhuǎn)錄的擬基因(見圖16B人α鏈的cDNA和氨基酸序列)。11號染色體上的β鏈簇由以下基因組成一個(gè)β鏈基因和幾個(gè)β樣基因δ、ε、Gγ和Aγ，以及至少兩個(gè)非表達(dá)的擬基因(見圖16C人β鏈cDNA和氨基酸序列)。
在發(fā)育過程中，這些基因的表達(dá)發(fā)生變化。在已被深入表征的人的造血過程中，胚胎成紅細(xì)胞成功地合成了兩個(gè)ζ鏈和兩個(gè)ε鏈的四聚體(GowerI)，兩個(gè)α鏈和兩個(gè)ε鏈的四聚體(Gower II)或兩個(gè)ζ鏈和兩個(gè)γ鏈的四聚體(Hb Portland)。隨著胚胎發(fā)生的進(jìn)程，占優(yōu)勢的形式由胎兒血紅蛋白(Hb F)構(gòu)成，它由兩個(gè)α鏈和兩個(gè)γ鏈組成。成人血紅蛋白(兩個(gè)α鏈和兩個(gè)β鏈)在胎兒期開始合成，在出生時(shí)大約50％的血紅蛋白具有成人的形式，大約到6月齡時(shí)轉(zhuǎn)換完成。在成人中，血紅蛋白的絕大部分(大約97％)是具有兩條α鏈和兩條β鏈的種類(Hb A)以及少量的可檢測到的Hb F或δ鏈(Hb A2)。
血紅素對血細(xì)胞生成的影響已被廣泛地研究(見S.Sassa，Seminars Hemat.25312-20，1988和N.Abraham et al.，Int.J.Cell Cloning 9185-210，1991 for reviews)。成紅細(xì)胞的成熟需要血紅素，在體外，氯化血紅素(氯化亞鐵血紅素IX-即帶有一個(gè)氯離子的血紅素)增加CFU-GEMM、BFU-E和CFU-E的增殖。同樣，氯化血紅素增加長期骨髓培養(yǎng)中的細(xì)胞結(jié)構(gòu)(cellularity)。I.癌癥的化療與放療對刺激性生長因子的大量有成果的研究導(dǎo)致許多這些因子(紅細(xì)胞生成素、G-CSF、GM-CSF等等)在臨床上的應(yīng)用。這些因子已經(jīng)降低了與化療和放療有關(guān)的死亡率和發(fā)病率。通過阻斷干細(xì)胞進(jìn)入細(xì)胞周期從而使它們避免毒副作用這樣的可選擇的策略，可以意識到對接受化療或放療的病人的其他臨床益處。II.骨髓移植骨髓移植(BMT)對于各種血液病，自身免疫病和惡性疾病是一個(gè)有用的治療措施；目前的治療包括從臍帶血或外周血(未活化的或用例如G-CSF的藥劑活化的)以及骨髓獲得造血細(xì)胞。造血細(xì)胞的間接體內(nèi)(ex vivo)操作目前被用于將初級干細(xì)胞擴(kuò)增成適于移植的群體。該方法的最適化要求(1)足夠數(shù)目的能夠維持長期造血重建的干細(xì)胞；(2)抗宿主誘導(dǎo)的T淋巴細(xì)胞的移植物的排除；(3)殘存惡性細(xì)胞的缺失。該方法能夠用包括干細(xì)胞抑制因子的間接體內(nèi)擴(kuò)增而被最優(yōu)化。
為了清除殘留的惡性細(xì)胞而用細(xì)胞毒藥物凈化造血細(xì)胞的效果受到這些化合物對正常造血細(xì)胞，尤其是干細(xì)胞的毒性的限制。這就需要在凈化過程中對正常細(xì)胞進(jìn)行有效保護(hù)；保護(hù)作用可以通過使用有效的抑制因子使干細(xì)胞脫離細(xì)胞周期而實(shí)現(xiàn)。III.收集外周干細(xì)胞對于自體移植，外周血干細(xì)胞(PBSC)具有許多超過骨髓的潛在優(yōu)點(diǎn)。由于涉及腫瘤或以前接受放療而沒有合適的骨髓采集部位的病人仍然能進(jìn)行外周血干細(xì)胞收集。血干細(xì)胞的應(yīng)用很好地排除了全身麻醉及對不能耐受的病人進(jìn)行外科手術(shù)的需要。收集血細(xì)胞所必需的單采血液成分(apheresis)技術(shù)是行之有效的而且在大多數(shù)醫(yī)療中心可以廣泛應(yīng)用。該方法的主要限制是在用藥物或生長因子(例如環(huán)磷酰胺、G-CSF、干細(xì)胞因子)活化后在外周血中干細(xì)胞的低正常穩(wěn)定狀態(tài)頻率和高細(xì)胞周期狀態(tài)。一種有效的干細(xì)胞抑制因子對使細(xì)胞回到靜止?fàn)顟B(tài)，從而防止它們在分化過程中丟失是有用的。IV.過度增殖性失調(diào)的治療許多疾病以過度增殖狀態(tài)為特征，在該狀態(tài)中，異常調(diào)節(jié)的干細(xì)胞引起終期細(xì)胞過度生成。這些疾病狀態(tài)包括，但不限于，有上皮細(xì)胞過度增生的銀屑病，以出現(xiàn)小腸息肉為特征的胃腸道癌前狀態(tài)。干細(xì)胞抑制因子對于治療這種情況的疾病是有用的。V.基因轉(zhuǎn)移將遺傳信息轉(zhuǎn)移到造血細(xì)胞的能力目前正被用于臨床。對于基因治療來說，造血細(xì)胞是最有用的靶，因?yàn)殚g接體內(nèi)操作及處理這一組織時(shí)容易進(jìn)行且有廣泛的經(jīng)驗(yàn)，而且血細(xì)胞能滲入組織。更進(jìn)一步講，通過將有功能的基因插入到人的造血系統(tǒng)的初級干細(xì)胞中，可以使人的某些遺傳缺陷得以糾正。
用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體或基因轉(zhuǎn)移的物理技術(shù)將基因?qū)肴说脑煅?xì)胞中存在幾個(gè)限制(1)造血組織中的干細(xì)胞頻數(shù)低，必須發(fā)展高效基因轉(zhuǎn)移技術(shù)；(2)周期越短的干細(xì)胞對于載體的易感性就越高，但是通過用生長因子刺激干細(xì)胞增殖導(dǎo)致感染率的增加對長期基因表達(dá)產(chǎn)生相反的效應(yīng)。因?yàn)?，含有轉(zhuǎn)基因的細(xì)胞被迫進(jìn)行不可逆分化，并喪失它們的自我更新能力。這些問題能夠通過使用干細(xì)胞抑制因子得以改善，從而防止分化和自我更新能力的喪失。
發(fā)明概述本發(fā)明涉及屬于干細(xì)胞增殖抑制因子的多肽(“INPROL”)及其應(yīng)用。
本發(fā)明包括以如下性質(zhì)為特征的干細(xì)胞增殖抑制因子(a)在鼠脾集落形成(CFU-S)試驗(yàn)中比活(IC50)小于或等于20ng/ml(見實(shí)施例4)，(b)分子量大于10,000，小于100,000道爾頓(通過超濾)，(c)活性對胰蛋白酶降解敏感，
(d)比MIP-1α和TGFβ更疏水且可通過反相層析與二者分離(見實(shí)施例12)，(e)在水溶液中，在37℃、55℃或75℃下加熱1小時(shí)后保留生物學(xué)活性，(f)用1％鹽酸丙酮沉淀后保留生物學(xué)活性。
本發(fā)明被進(jìn)一步表征，并通過在短期預(yù)培養(yǎng)(見實(shí)施例5)后在體外試驗(yàn)中獲得抑制作用的能力將其與其他侯選干細(xì)胞抑制因子(例如，MIP-1α、TGFβ和各種寡肽)區(qū)分開來。
本發(fā)明也包括含有治療各種疾病的INPROL的藥物組合物。
本發(fā)明提供一個(gè)通過施用有效量的干細(xì)胞抑制組合物而治療預(yù)先暴露于能造成干細(xì)胞死亡或損傷的藥劑的患者的治療方法。通過這種方法保護(hù)的干細(xì)胞可能是通常在骨髓中存在或分裂的造血干細(xì)胞。此外，干細(xì)胞可能是位于例如小腸或頭皮或身體的其它部位的上皮細(xì)胞，或位于生殖器官的生殖細(xì)胞。雖然動物治療也在本方法的范圍內(nèi)，但本發(fā)明的方法可以被合乎需要地應(yīng)用于人類。作為在此處使用的術(shù)語，“患者”或“病人”涉及動物，比如哺乳動物，包括人。
在另一方面，本發(fā)明為保護(hù)和恢復(fù)經(jīng)受化療的病人的造血、免疫或其它干細(xì)胞系統(tǒng)提供了方法，其包括對病人施用有效劑量的INPROL。
另一方面，本發(fā)明涉及對任何癌癥的輔助治療方法，其中包括以實(shí)體瘤為特征的那些癌癥，該方法是通過對患癌癥的病人施用有效劑量的INPROL來保護(hù)骨髓、胃腸道及其它器官的干細(xì)胞免受化療和放療的毒性作用而完成的。
本發(fā)明的另一方面還涉及白血病的治療，包括用有效劑量的INPROL處理含有增殖性白血病細(xì)胞的造血細(xì)胞，以抑制正常干細(xì)胞的增殖，以及用能破壞白血病細(xì)胞的細(xì)胞毒藥劑處理骨髓。該方法可以通過隨后使用刺激骨髓增殖的其它藥劑(例如集落刺激因子)處理骨髓而提高療效。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，該方法是在體內(nèi)進(jìn)行的。此外，該方法對間接體內(nèi)凈化和擴(kuò)增用于移植的造血細(xì)胞也是有用的。
另一方面，本方法涉及治療患有由干細(xì)胞增殖引起的任何疾病的患者。這些疾病，如銀屑病、脊髓發(fā)育不良、一些自身免疫病、老年性免疫低下均可通過對患者施用有效劑量的INPROL部分抑制干細(xì)胞的增殖而得到治療。
本發(fā)明提供了一種可逆性保護(hù)干細(xì)胞免于可殺傷或損害干細(xì)胞的細(xì)胞毒藥劑對其損傷的方法。該方法包括對預(yù)先暴露于這類藥劑的患者施用有效劑量的INPROL。
本發(fā)明也提供通過下述方法從豬或其它骨髓中(見實(shí)施例12)分離的干細(xì)胞增殖抑制因子。
(a)提取骨髓，通過過濾去除顆粒狀物質(zhì)，(b)56℃加熱處理40分鐘，隨后冰浴冷卻，(c)通過4℃，10000g離心30分鐘去除沉淀，(d)將上清加入10倍體積的攪拌的冰冷的丙酮(含1％體積濃鹽酸)，4℃，保溫16小時(shí)進(jìn)行酸沉淀，(e)4℃，20,000g離心30分鐘分離沉淀，用冷丙酮洗，隨后干燥，(f)通過反相層析分離，用5-氟尿嘧啶預(yù)處理并在鼠IL-3存在下培養(yǎng)的骨髓細(xì)胞抑制集落形成，以及通過280nm吸收和SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳來監(jiān)測活性。
本發(fā)明也提供基本上不含其它蛋白類物質(zhì)的干細(xì)胞增殖抑制因子的純化方法，該方法包括上述步驟，將在下面詳述。
本發(fā)明也提供對人或動物的治療方法，其中所說的干細(xì)胞增殖抑制因子能起到改善由于細(xì)胞過度增殖而引起的免疫抑制的作用。
本發(fā)明也提供對人或動物的治療方法，其中所述干細(xì)胞增殖抑制因子的施用是在將干細(xì)胞暴露于細(xì)胞毒藥劑或輻射而誘導(dǎo)增殖后進(jìn)行的。干細(xì)胞通常是處于靜止期，但化療后被激活而進(jìn)入細(xì)胞周期。這意味著它們對第二次化療更敏感；本方法保護(hù)它們免于這種治療。
本發(fā)明也提供
對人或動物的治療方法，其中為了加強(qiáng)免疫應(yīng)答，所述干細(xì)胞增殖抑制因子可作為輔劑在接種前或與接種一起施用。
本發(fā)明也提供對接受細(xì)胞毒藥物或輻射治療的人或動物的治療方法，它包括施用有效劑量的干細(xì)胞增殖抑制因子來保護(hù)干細(xì)胞免于傷害。
本發(fā)明也包括一種藥物組合物，它包含血紅蛋白和藥用載體。
本發(fā)明也包括一種藥物組合物，它包含(a)選自血紅蛋白α鏈、β鏈、γ鏈、δ鏈、ε鏈和ζ鏈的多肽，和(b)一種藥用載體。這種藥物組合物可以由從上述物組中選出的帶有或不帶有血紅素的單一多肽，多肽混合物或二聚體或多聚體形式的多肽組成。
本發(fā)明也包括具有如下序列的多肽Phe-Pro-His-Phe-Phe-Asp-Leu-Ser-His-Gly-Ser-Ala-Gln-Val，Cys-Phe-Pro-His-Phe-Phe-Asp-Leu-Ser-His-Gly-Ser-Ala-Gln-Val-Cys，其中的兩個(gè)半胱氨酸殘基形成一個(gè)二硫鍵Cys-Phe-Pro-His-Phe-Phe-Asp-Leu-Ser-His-Gly-Ser-Ala-Gln-Val-Cys，其中的兩個(gè)半胱氨酸通過一個(gè)碳橋相連，和Asp-Ala-Leu-Thr-Asn-Ala-Val-Ala-His-Val-Asp-Asp-Met-Pro-Asn-Ala-Leu-Ser-Ala，本發(fā)明也包括編碼上述已確定的肽的DNA序列，含有所述DNA序列的載體和含有所述載體的宿主細(xì)胞。通過用標(biāo)準(zhǔn)化學(xué)技術(shù)(例如固相合成)或重組技術(shù)(例如融合系統(tǒng)，如那些使用谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(D.B.Smith and K.S.Johnson，Gene 6731-40，1988)，硫氧還蛋白(LaVallie et al.，Biotechnology 11187-193，1993)或泛素(Butt et al.，PNAS 862540-4，1989；US Patent 5,391,490)的融合系統(tǒng))合成這些肽類。
此外，本發(fā)明還包括抑制干細(xì)胞增殖的方法，它包括將造血細(xì)胞與一種能結(jié)合阿片受體(優(yōu)選阿片受體的μ亞類)的化合物接觸。某些肽類(被稱為“hemorphin”)已從血紅蛋白中被分離得到，其表現(xiàn)出阿片樣的活性(例如Brantl et al.，Eur.J.Pharm，125309-10，1986；Davis et al.，Peptides 10747-51，1989；Karelin et al.，Bioch.Biophys.Res.Comm，202410-5，1994；Zhao et al，Ann.N.γ.Acad.Sci 750452-8，1995)。各篇文獻(xiàn)在此引入作為參考。
本發(fā)明還包括抑制干細(xì)胞增殖的方法，它包括用選自具有下列序列的hemorphin肽與造血細(xì)胞接觸Leu-Val-Val-Tyr-Pro-Trp-Thr-Gln-Arg-Phe，Leu-Val-Val-Tyr-Pro-Trp-Thr-Gln-Arg，Leu-Val-Val-Tyr-Pro-Trp-Thr-Gln，Leu-Val-Val-Tyr-Pro-Trp-Thr，Leu-Val-Val-Tyr-Pro-Trp，Leu-Val-Val-Tyr-Pro，Val-Val-Tyr-Pro-Trp-Thr-Gln，Tyr-Pro-Trp-Thr-Gln-Arg-Phe，Tyr-Pro-Trp-Thr-Gln-Arg，Tyr-Pro-Trp-Thr-Gln， 和Tyr-Pro-Trp-Thr。
以上肽類與其它阿片樣肽類，如Tyr-MIF-1家族的一些肽類(見Reed et al.Neurosci.Biobehav.Rev.18519-25，1994 forreview)，酪蛋白衍生的酪嗎啡因(Brantl et al.，Hoppe-Seyler’sZ.Physiol.Chem.3601211-16，1979；Loukas et al.，Biochem.224567-4573，1983；Fiat and Jolles，Mol Cell.Biochem.875-30，1989)，細(xì)胞色素b衍生的，被命名為cytochrophins的肽類(Brantl et al.，Eur.J.Pharm.111293-4，1985)以及來自被篩選出結(jié)合阿片受體的組合文庫的肽類有序列相似性。(見Dooley et al.，Peptide Research 8124-137，1995 forreview)。各篇文獻(xiàn)在此引入作為參考。
本發(fā)明也包括抑制干細(xì)胞增殖的方法，它包括將選自Tyr-MIF-1相關(guān)的肽類，酪嗎啡因和cytochrophins的一種肽與造血細(xì)胞接觸。特別包括具有這樣序列的Tyr-MIF-1肽類。
Tyr-Pro-Try-Gly-NH2，Tyr-Pro-Lys-Gly-NH2，Tyr-Pro-Leu-Gly-NH2，和
Pro-Leu-Gly-NH2。
本發(fā)明也包括在哺乳動物中實(shí)施基因治療的方法，它包括a)從所說的哺乳動物中分離出造血細(xì)胞，b)可選地，用至少一種刺激性細(xì)胞因子間接體內(nèi)地處理所述造血細(xì)胞，以誘導(dǎo)干細(xì)胞增殖，c)用預(yù)先確定的基因轉(zhuǎn)染所述造血細(xì)胞，d)用INPROL間接體內(nèi)地接觸所述轉(zhuǎn)染的造血細(xì)胞，e)向哺乳動物移植步驟d的造血細(xì)胞，f)可選地，在體內(nèi)用INPROL處理所述的哺乳動物。
本發(fā)明也包括間接體內(nèi)進(jìn)行干細(xì)胞擴(kuò)增的方法，它包括用INPROL和至少一種刺激性細(xì)胞因子處理所說的造血細(xì)胞。在與刺激性細(xì)胞因子作用前、作用過程中和/或作用后，INPROL與造血細(xì)胞作用。
本發(fā)明也包括一種藥物組合物，它包括(a)INPROL和(b)至少一種抑制性化合物，它選自MIP-1α、TGFβ、TNFα、INFα、INFβ、INFγ、五肽pyroGlu-Glu-Asp-Cys-Lys，四肽N-乙酰-Ser-Asp-Lys-Pro和三肽谷胱甘肽(Gly-Cys-γGlu)。
本發(fā)明還包括一種藥物組合物，它包括(a)INPROL和(b)至少一種選自IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-9、IL-11、IL-13、IL-14、IL-15、G-CSF、GM-CSF、M-CSF、紅細(xì)胞生成素、血小板生成素、干細(xì)胞因子和flk2/flt3配基的刺激性化合物。
本發(fā)明描述一種干細(xì)胞抑制因子(INPROL)，它不同于本領(lǐng)域已知的細(xì)胞抑制因子，如MIP-1α、TGFβ、Frindel和其同事們的四肽、Paukovits和同事們的五肽(cf.，Wright & Pragnell，1992(op.cit))。通過超濾測得天然存在的INPROL的分子量超過10,000道爾頓，該分子量不同于四肽以及五肽。在反相層析系統(tǒng)中它比MIP-1α或TGFβ更疏水，所以明顯不同于那些細(xì)胞因子。此外，它的作用方式不同于以前所述的任何一種抑制因子，當(dāng)僅在預(yù)培養(yǎng)階段使用時(shí)，它在體外試驗(yàn)中仍具有活性。例如，MIP-1α僅在預(yù)培養(yǎng)階段使用時(shí)活性喪失(實(shí)施例5)。此外，天然存在的INPROL在測定“高增殖潛能細(xì)胞”(HPP-PFC)試驗(yàn)中是有活性的，而MIP-1α無活性(實(shí)施例6)。
附圖簡述圖1-4顯示各階段的純化產(chǎn)物的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳。
圖1-第1泳道是糜蛋白酶原，第2泳道是卵白蛋白，第3泳道是牛血清白蛋白，第4泳道是分子量小于30kD的級分，第5泳道是分子量為30-50kD的級分，第6泳道是分子量為50-100kD的級分。
圖2-第1泳道是(40-80％)硫酸銨沉淀，第2-5泳道是DEAE級分(第2泳道代表活性級分)。
圖3-第1泳道是硫酸銨沉淀后的上清，第2泳道是DEAE活性級分，第3-5泳道是凝膠過濾級分(第5泳道代表活性級分)。
圖4-第2泳道代表終產(chǎn)物。
圖5-顯示最后純化作用的反相高壓液相層析。
圖6-顯示3H-胸苷摻入(CPM)FDCP-mix系的細(xì)胞中，不含(對照＝0％抑制)和含各種濃度從豬骨髓純化的INPROL(pINPROL)。數(shù)據(jù)相對對照值而歸一化。
圖7-顯示用丙酸睪酮(TSP)、TSP+pINPROL，或載體(對照)處理小鼠后在細(xì)胞周期的S期中的細(xì)胞百分?jǐn)?shù)。每組含25只動物(每個(gè)時(shí)間點(diǎn)3-4只)。
圖8-顯示用兩劑量的5-FU處理小鼠，用或不用pINPROL處理小鼠后，小鼠的存活情況。每組含30只動物。圖9-顯示用或不用pINPROL處理的受輻射小鼠的存活情況。每組含50只動物。
圖10A和10B-顯示用Ara-c或Ara-c+pINPROL處理1周(10A)和3周(10B)后正常骨髓長期培養(yǎng)細(xì)胞的再生情況。
圖11-顯示用致死劑量照射并移植用培養(yǎng)基(對照)或含pINPROL(25ng/ml)培養(yǎng)基培養(yǎng)4小時(shí)后的3×104骨髓細(xì)胞的小鼠的存活情況(每組75只)。對存活情況監(jiān)測30天。
圖12-顯示用致死劑量照射后，小鼠骨髓細(xì)胞培養(yǎng)物14天后形成的CFU-GM數(shù)，和供體骨髓細(xì)胞用pINPROL或培養(yǎng)基預(yù)培養(yǎng)4小時(shí)后CFU-GM的恢復(fù)情況。
圖13-顯示每周取出的淋巴長期培養(yǎng)物的懸浮細(xì)胞，該培養(yǎng)物被清洗，在用培養(yǎng)基或pINPROL預(yù)培養(yǎng)4小時(shí)后用IL-7(10ng/ml)鋪板。
圖14-顯示用pINPROL處理的白血病外周血細(xì)胞改善的再聚集能力。
通過含和不含pINPROL平板的粘附和非粘附LTC細(xì)胞測定長期培養(yǎng)初始細(xì)胞(LTC-IC)，并在第7天計(jì)數(shù)CFU-GM。數(shù)據(jù)與對照值對比使之標(biāo)準(zhǔn)化。
圖15A-顯示在53％乙腈時(shí)洗脫的純pINPROL的C4反相層析。第1泳道是粗樣品，第2泳道是分子量標(biāo)準(zhǔn)，第3泳道是純化樣品。圖15B顯示在43.9％乙腈時(shí)洗脫的MIP-1α的C4反相層析。圖15C顯示pINPROL粗樣品和反相層析后純化樣品的SDS-PAGE譜圖。
圖16-顯示血紅蛋白序列圖16A顯示人α血紅蛋白的cDNA和氨基酸序列，圖16B顯示人β血紅蛋白的cDNA和氨基酸序列。根據(jù)氨基酸進(jìn)行計(jì)數(shù)。圖16C顯示人、鼠、豬血紅蛋白的α、β鏈的氨基酸序列的比較。
圖17-顯示pINPROL的C4反相高壓液相色譜圖(圖17A)與晶化豬血紅蛋白的C4反相高壓液相色譜圖(圖17B)的比較。
圖18-顯示晶化豬血紅蛋白的C4反相高壓液相色譜級分的SDS-PAGE凝膠。第1泳道顯示標(biāo)準(zhǔn)分子量，第2泳道顯示來自第一個(gè)峰(在47.11分鐘)的級分48-49，第3泳道顯示來自第二個(gè)峰(在49.153分鐘)的級分50-51，第4泳道顯示來自第三個(gè)峰(在52.25分鐘)的級分54-55，第5泳道顯示來自第四個(gè)峰(在53.613分鐘)的級分56-57。
圖19-顯示pINPROL(圖19A)與純化的豬β血紅蛋白(圖19B)的二維凝膠電泳的比較。
圖20-顯示純化的豬α血紅蛋白、β血紅蛋白或pINPROL在FDCP-MIX分析中的作用的比較。
圖21-顯示用淺洗脫梯度反相分離豬血紅蛋白。
為了使本文描述的發(fā)明被更充分地理解，下面將對其進(jìn)行詳述。這個(gè)描述，是本發(fā)明的實(shí)例，不能被認(rèn)為是特別限制本發(fā)明，本領(lǐng)域技術(shù)人員知道的那些變化將被認(rèn)為屬于本發(fā)明的范圍。優(yōu)選實(shí)施方案詳述INPROL可逆性地抑制干細(xì)胞分裂。具體地說，在暫時(shí)抑制造血干細(xì)胞分裂上，INPROL是有效的。因此，本發(fā)明方法可被應(yīng)用于減輕化療對病人的造血、骨髓和免疫系統(tǒng)的不希望有的副作用，這是通過保護(hù)干細(xì)胞免于用于消滅癌細(xì)胞或病毒感染細(xì)胞的化療藥物或輻射所造成的損害而實(shí)現(xiàn)的。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，給病人以足夠劑量的INPROL來抑制干細(xì)胞分裂，而化療藥物作用于患病細(xì)胞?；熕幬锲鹱饔煤螅蒊NPROL抑制的干細(xì)胞不需要進(jìn)一步處理即可回復(fù)到分裂細(xì)胞。如果想要增強(qiáng)造血功能的再生，可另外使用刺激性生長因子或細(xì)胞因子。
此處使用的術(shù)語“INPROL”包括如在實(shí)施例中純化的哺乳動物蛋白、血紅蛋白、血紅蛋白的α鏈(帶或不帶血紅素基團(tuán))、血紅蛋白的β鏈(帶或不帶血紅素基團(tuán))、α和β鏈的混合物(帶或不帶血紅素基團(tuán))、以及具有抑制干細(xì)胞增殖能力的這些蛋白質(zhì)的片段或類似物，包括胚胎形式，胎兒形式和成人形式(例如α、β、γ、δ、ε或ζ鏈，單獨(dú)存在或是混合物，二聚體或是多聚體，含有或是不含有血紅素基團(tuán))。術(shù)語“INPROL”包括天然存在以及非天然存在(例如重組產(chǎn)生的)形式的這些蛋白質(zhì)。
在典型的臨床情況中，病人每天靜脈注射或輸注劑量單位形式的INPROL，所用劑量為例如0.01-100mg/kg，優(yōu)選0.1-1.0mg/kg，在例如標(biāo)準(zhǔn)化療或放療前4-60小時(shí)前施用INPROL。
在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，用INPROL預(yù)先治療可以提高化療藥物或輻射劑量，使之超出患者能夠正常耐受的劑量范圍。
大部分造血干細(xì)胞在正常情況下處于靜止期(不在細(xì)胞周期中)。然而作為對化療誘導(dǎo)的造血損傷的代償反應(yīng)，化療后一大部分干細(xì)胞進(jìn)入細(xì)胞周期，這使之特別易受隨后的細(xì)胞毒化療或治療性放射劑量的損害。通過抑制這些干細(xì)胞的細(xì)胞周期，INPROL治療允許更早或更頻繁地隨后施用細(xì)胞毒化療，不管是用常規(guī)劑量還是提高的劑量。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，初次劑量的化療約24小時(shí)到10天后施用INPROL(0.1mg～6g，優(yōu)選1.0～60mg)。再過4-60小時(shí)，優(yōu)選24～48小時(shí)后，實(shí)施另一劑量的化療。根據(jù)療效，持續(xù)進(jìn)行化療和INPROL的交替循環(huán)?；熕幬锖褪┯梅桨甘歉鶕?jù)適合在標(biāo)準(zhǔn)臨床實(shí)踐中的具體腫瘤類型而選擇的?？蛇x地，在化療或放療后，為了進(jìn)一步促進(jìn)造血功能重建，使用激活性生長因子，如G-CSF、干細(xì)胞因子。
對于間接體內(nèi)應(yīng)用，可使用0.1ng-100ng/106細(xì)胞/ml，優(yōu)選20-50ng/106細(xì)胞/ml的INPROL。
在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，INPROL被用于制備用于移植的自體造血細(xì)胞。用有效量的INPROL間接體內(nèi)處理造血細(xì)胞以抑制干細(xì)胞分裂，然后，對骨髓培養(yǎng)物施用有效量的化療藥物或輻射以清除癌細(xì)胞。對進(jìn)入細(xì)胞周期的細(xì)胞有專一性的化療藥物是優(yōu)選的。這樣處理后的骨髓被再輸入自身供體。任選地，用一種已知刺激造血的藥物治療病人以促進(jìn)病人造血功能的重建。
在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，INPROL被用于治療白血病時(shí)的輔助性治療。例如，在白血病細(xì)胞不響應(yīng)INPROL的疾病狀態(tài)中，用INPROL間接體內(nèi)處理白血病造血干細(xì)胞。正常干細(xì)胞的增殖通過施用INPROL而被阻止。因此，在這期間用一個(gè)細(xì)胞周期特異性的細(xì)胞毒藥物處理增殖的白血病細(xì)胞，防止了正常干細(xì)胞群的損傷。此外，在藥物或輻射治療過程中，選擇性地使用刺激性細(xì)胞因子如IL-3或GM-CSF，誘導(dǎo)白血病細(xì)胞進(jìn)入細(xì)胞周期而正常干細(xì)胞被所用的INPROL保護(hù)。用化療藥物或輻射治療病人以消滅白血病細(xì)胞，然后將凈化的骨髓移植給病人以進(jìn)行造血功能的重建。
同樣地，在另一個(gè)治療嚴(yán)重病毒感染血細(xì)胞或淋巴細(xì)胞如HIV感染病人的實(shí)施方案中，造血細(xì)胞間接體內(nèi)地用INPROL處理，隨后用抗病毒藥物，消滅感染細(xì)胞的藥物或基于抗體的系統(tǒng)清除感染細(xì)胞。隨后用成髓(myeloablative)抗病毒劑或成髓化療根除病人的病毒宿主細(xì)胞，將INPROL處理的骨髓細(xì)胞回輸給病人。
INPROL被用于治療與干細(xì)胞過度增殖有關(guān)的疾病。例如，銀屑病是一種由皮膚上皮細(xì)胞過度增殖引起的疾病，有時(shí)用細(xì)胞毒藥物治療。其它涉及干細(xì)胞增殖的前瘤的損害也適合用有效劑量的INPROL，它被用于完全或部分抑制干細(xì)胞的增殖。對于這些應(yīng)用，含有INPROL的局部或透過皮膚傳遞的組合物(例如油膏、洗液、凝膠或貼膏)被用于合適的部位，作為腸道用藥的替代。在大多數(shù)白血病中，白血病祖細(xì)胞(leukemia progenitor)是分化的細(xì)胞群，它不受INPROL的影響，因此，可用上述的使用INPROL的方法治療。在白血病祖細(xì)胞是非常初級的，并且對INPROL的抑制非常敏感的情況下，可以通過施用有效劑量的INPROL使白血病細(xì)胞的增殖減弱。
用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)對INPROL多肽產(chǎn)生單克隆或多克隆抗體。用在本領(lǐng)域中已知的許多可檢測的標(biāo)記物標(biāo)記這些抗體或INPROL多肽。通過以診斷目的直接將其施用給患者，這些標(biāo)記的INPROL或抗INPROL抗體作為干細(xì)胞的標(biāo)志被用于鑒定和分離干細(xì)胞。此外，這些標(biāo)記的多肽或抗體間接體內(nèi)地被用于鑒定造血細(xì)胞制備物中的干細(xì)胞，從而在凈化骨髓中的前瘤細(xì)胞時(shí)能夠去除這些干細(xì)胞。用相似的方式，這些標(biāo)記的多肽或抗體被用于鑒定和分離上皮干細(xì)胞或其它干細(xì)胞。此外，這些標(biāo)記的或未標(biāo)記的抗體，可以通過中和INPROL活性而治療性地應(yīng)用或通過檢測循環(huán)的(circulating)INPROL的水平而診斷性地應(yīng)用。
INPROL能用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)從人基因或表達(dá)重組的人INPROL的cDNA文庫中克隆。例如，用從純化蛋白中獲得的序列信息，構(gòu)建能被標(biāo)記(例如用32P標(biāo)記)的寡核苷酸探針，用它來篩選合適的cDNA文庫(例如來自骨髓)?？蛇x地，用抗體或合適的功能分析方法(例如實(shí)施例2所述)從合適的來源(例如骨髓)中篩選編碼INPROL的cDNA表達(dá)文庫。血紅蛋白本身，以及單獨(dú)的α，β鏈，已經(jīng)用在本領(lǐng)域中已知的方法克隆并表達(dá)(見Pagnier et al.，Rev.Fr.Transfus.Hemobiol.35407-15，1992；Looker et al.，Nature 356258-60，1992；Methods in Enzymology Vol.231，1994)。各篇文章在此引入作為參考。
本發(fā)明包括這樣的DNA序列，它包括引入用于選定的非哺乳類宿主表達(dá)的“優(yōu)選”密碼子；提供限制性內(nèi)切酶的切割位點(diǎn)；提供附加的起始、終止或調(diào)節(jié)DNA序列，該序列有利于構(gòu)建適于表達(dá)載體或產(chǎn)生或純化血紅蛋白的α、β、γ、δ、ε和/或ζ鏈。
本發(fā)明也提供編碼血紅蛋白α、β、γ、δ、ε和/或ζ鏈的多肽類似物或衍生物的DNA序列，這些序列從一個(gè)或更多氨基酸殘基的相同性或其位置來說不同于天然型(即缺失型類似物含有少于所有特定殘基的殘基；替代型類似物的一個(gè)或更多的特異殘基被其它殘基取代；添加型類似物中有一個(gè)或更多的氨基酸殘基被加到多肽的末端或中間部分)，但它具有天然型的部分或所有的性質(zhì)。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，INPROL是通過基因組或cDNA克隆或通過基因合成得到的外源DNA序列在原核或真核宿主中表達(dá)的表達(dá)產(chǎn)物(例如通過培養(yǎng)的細(xì)菌、酵母、高等植物、昆蟲和哺乳類細(xì)胞)。即，在優(yōu)選的實(shí)施方案中，INPROL是“重組的INPROL”。在典型的酵母(例如釀酒酵母)或原核(例如大腸桿菌)宿主細(xì)胞中的表達(dá)產(chǎn)物與任何哺乳類的蛋白無關(guān)，在脊椎動物細(xì)胞中的表達(dá)產(chǎn)物(例如非人類的哺乳類(例如COS或CHO)和鳥類)與任何人類蛋白無關(guān)。根據(jù)所采用的宿主，本發(fā)明的多肽可以是糖基化的或非糖基化的。本發(fā)明的多肽也可任選地包括起始的甲硫氨酸殘基(在第一位)。
本發(fā)明也包含如血紅蛋白α、β、γ、δ、ε和/或ζ鏈的多肽類似物的其它產(chǎn)物。這些類似物包括血紅蛋白的α、β、γ、δ、ε和/或ζ鏈的片段。根據(jù)已知方法，人們能容易地設(shè)計(jì)和制造編碼適合多肽的微生物表達(dá)的基因，這些多肽的一級序列不同于本文從一個(gè)或更多殘基的相同性或其位置來具體說明的多肽(例如替代、末端和中間添加及缺失)。通過熟知的定點(diǎn)突變技術(shù)很容易地完成cDNA和基因組基因的修飾，并用于產(chǎn)生血紅蛋白α、β、γ、δ、ε或ζ鏈的類似物和衍生物。此類產(chǎn)物至少具有INPROL的生物學(xué)活性之一，但在其它方面可能不同。例如，本發(fā)明的產(chǎn)物包括α、β、γ、δ、ε或ζ鏈，它們通過缺失被縮短；或它們對水解更穩(wěn)定(因此，可能比天然型有更明顯或長期的效應(yīng))；或它們已被改變?yōu)槿笔Щ蚣尤胍粋€(gè)或更多個(gè)潛在O-糖基化和/或N-糖基化位點(diǎn)，或它們有一個(gè)或更多的半胱氨酸殘基缺失或被丙氨酸、絲氨酸殘基取代，而且從微生物系統(tǒng)中更容易以活性的形式被分離；或者它們有一個(gè)或更多的酪氨酸殘基被苯丙氨酸取代而且或多或少易與靶蛋白結(jié)合或靶細(xì)胞的受體結(jié)合。也包括的是只復(fù)制一部分連續(xù)的氨基酸序列的多肽片段或者在α、β、γ、δ、ε或ζ鏈內(nèi)的二級結(jié)構(gòu)，這些片段可能具有INPROL的一個(gè)特性(例如結(jié)合抗體)，沒有其它特性(例如干細(xì)胞抑制活性)。值得注意的是，為了使本發(fā)明的任何一個(gè)或多個(gè)產(chǎn)物有治療用途或其它用途(如抑制因子拮抗作用的檢測)，這些產(chǎn)物的活性不是必需的(見Weiland et al.，Blut 44173-5，1982)。在干細(xì)胞抑制因子或其受體過度產(chǎn)生的情況下，競爭性拮抗劑是有用的。
此外，源于保留了生物學(xué)活性的蛋白序列的多肽可以用標(biāo)準(zhǔn)的方法化學(xué)合成。本發(fā)明也提供編碼血紅蛋白α、β、γ、δ、ε和/或ζ鏈的多肽類似物或衍生物序列，從一個(gè)或更多氨基酸殘基的相同性或其位置來說，這些多肽類似物或衍生物不同于天然型(例如缺失型類似物含有少于所有特定殘基的殘基；替代型類似物，其中一個(gè)或更多的特定殘基被其它殘基取代；無論是天然存在還是在本領(lǐng)域中已知的其它類似物如D-氨基酸；添加型類似物，其中一個(gè)或更多的氨基酸殘基被化學(xué)修飾以增加穩(wěn)定性、可溶性和/或抗蛋白水解性)，但它們具有天然型的一些或所有的性質(zhì)。
通過不同方法能夠鑒定以上所述的肽序列。天然血紅蛋白活性鏈(例如α鏈)的三維結(jié)構(gòu)與結(jié)構(gòu)相關(guān)的無活性蛋白(例如肌紅蛋白)的比較能夠鑒別出在三維空間中具有不同構(gòu)象的區(qū)域，這些區(qū)域是活性肽類的候選區(qū)域。另一方法用選擇性的蛋白水解，在此方法中，用蛋白水解酶有限地消化血紅蛋白的鏈產(chǎn)生可分離(例如通過反相高壓液相色譜，然后對干細(xì)胞抑制進(jìn)行分析)的肽類，通過化學(xué)合成也可產(chǎn)生肽類(例如固相合成)；一系列包含感興趣的血紅蛋白鏈序列(例如α鏈)的重復(fù)肽類(例如15聚體)能非常容易地產(chǎn)生并在干細(xì)胞分析中被檢測。通過多步化學(xué)合成能產(chǎn)生組合文庫，并且選擇的氨基酸位置是可變化的，導(dǎo)致有許多肽類似物有待于篩選(例如Dooley et al.，Peptide Research 8124-137，1995)。另外，可以應(yīng)用重組方法，用直接點(diǎn)突變鑒定特定血紅蛋白鏈的活性所必需的重要?dú)埢?。被認(rèn)為具有干細(xì)胞抑制因子活性區(qū)域的鏈(例如α鏈)能夠被來自相關(guān)但無活性的蛋白(例如肌紅蛋白)的區(qū)域所替換，并在干細(xì)胞活性分析中檢測，以鑒定活性必需區(qū)。這樣鑒定的區(qū)域能夠被作為肽類表達(dá)并在干細(xì)胞周期分析中檢測活性。
來自其它種系的同源或類似形式的INPROL被用于獸醫(yī)的不同方面，類似于上面所述的本發(fā)明的治療實(shí)施方案。
INPROL通過使細(xì)胞可逆性地處在非分裂的“靜止?fàn)顟B(tài)”而作用于細(xì)胞周期干細(xì)胞。當(dāng)需要刺激靜止期的干細(xì)胞進(jìn)入分裂期時(shí)(例如在用癌癥化療藥物或輻射治療病人后)給病人施用集落刺激因子和其它造血刺激物。這些因子包括但不限于M-CSF(CSF-1)、GM-CSF、G-CSF、巨核細(xì)胞-集落刺激因子、血小板生成素、干細(xì)胞因子或其它細(xì)胞因子如IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-9、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14或紅細(xì)胞生成素。
通過常規(guī)的化學(xué)方法并結(jié)合適當(dāng)?shù)膶Ω杉?xì)胞抑制活性的生物分析，純化或合成了有干細(xì)胞抑制活性的INPROL多肽或活性片段，示例見下文描述的方案。
在本發(fā)明的實(shí)施方案中，治療有效量的INPROL蛋白或其治療有效片段與藥用載體混合使用。這種INPROL組合物一般通過腸胃外注射或輸注給藥。根據(jù)要達(dá)到的治療效果可以選用皮下注射、靜脈內(nèi)注射或肌肉內(nèi)注射。
當(dāng)全身性地施用時(shí)，用于本發(fā)明的治療組合物是以無致熱原，腸道可吸收的水溶液形式存在。具有一定pH值、等滲性、穩(wěn)定性、載體蛋白等等的藥用無菌蛋白溶液，是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。
本發(fā)明還包括藥物組合物，其包含本發(fā)明的多肽產(chǎn)物與合適的稀釋劑、保護(hù)劑、增溶劑、乳化劑、輔助劑和/或在INPROL治療中有用的載體。這里使用的“治療有效量”是指對給定情況和實(shí)施范圍提供治療效果的劑量。這樣的組合物是液體、凝膠、油膏或凍干的或其它的干制劑，而且包括各種緩沖成分的稀釋劑(例如Tris-HCl、醋酸鹽、磷酸鹽)、pH值和離子強(qiáng)度、添加劑，如防止表面吸附的白蛋白或明膠、去污劑(例如吐溫20、吐溫80、Pluronic F68、膽酸鹽)、增溶劑(例如甘油、聚乙二醇)、抗氧化劑(例如抗壞血酸、偏亞硫酸氫鈉)、保護(hù)劑(例如硫抑汞、苯乙醇、對羥苯甲酸酯)、填充劑或滲透壓修飾劑(例如乳糖、甘露糖醇)、共價(jià)多聚附著物如聚乙二醇與蛋白質(zhì)，與金屬離子形成的絡(luò)合物，或?qū)⑦@些物質(zhì)摻入多聚化合物(例如多聚乳酸、多聚乙醇酸、水凝膠等)顆粒制劑內(nèi)部或表面，或摻入脂質(zhì)體、niosome、微乳糜顆粒、分子團(tuán)、單層或多層囊泡、可注射的生物降解膠囊或微球，或蛋白基質(zhì)、血影、原生質(zhì)球、皮膚附貼膏或其它已知釋放或包裝藥物的方法。這些組合物將影響INPROL的物理狀態(tài)、溶解性、穩(wěn)定性、體內(nèi)釋放率和體內(nèi)的清除率?？煽氐幕蚓忈尩慕M合物包括親脂性容納物(例如脂肪酸、臘、油)的制劑。本發(fā)明也包括用多聚物(例如poloxamers或poloxamine)包裹的顆粒組合物及與抗組織特異性受體、配基或抗原偶聯(lián)或與組織特異性受體的配基偶聯(lián)的INPROL。本發(fā)明組合物的其它實(shí)施方案涉及保護(hù)性包衣的顆粒形式、蛋白酶抑制因子或各種途徑用藥(包括腸道、肺吸入、鼻、局部(皮膚或粘膜)和口腔)的滲透增加劑。在另一實(shí)施方案中，含有INPROL的組合物被局部施用，或通過透皮的貼膏使用。
在一實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物以劑量單位形式封裝于無菌小瓶或安瓿中。
本發(fā)明也包括這樣的組合物，其包含一種或更多的附加因子如化療藥物(例如5-氟尿嘧啶(5FU)、阿糖胞苷、環(huán)磷酰胺、順氯氨鉑、卡鉑阿霉素、doxyrubicin、鬼臼亞乙苷、紫杉酚、烷化劑)，抗病毒藥物(例如疊氮胸苷、無環(huán)鳥苷)，腫瘤壞死因子，細(xì)胞因子(例如白細(xì)胞介素)，抗增殖藥物，抗代謝藥物，干擾DNA代謝的藥物。
對于治療預(yù)先暴露某種細(xì)胞毒藥物的病人或治療干細(xì)胞過度增殖的方法中涉及的劑量方案由主治醫(yī)生確定，要考慮各種改變藥物作用的因素，例如患者病情、體重、性別、飲食，各種感染的嚴(yán)重性，給藥的時(shí)間，以及其它臨床因素。
病人暴露于細(xì)胞毒藥物或輻射后，本發(fā)明的治療方法可任選地給病人施用一種或多種淋巴因子、集落刺激因子或其它細(xì)胞因子、血細(xì)胞生成素、干擾素或生長因子，以全面刺激由先前使用INPROL治療而被抑制的干細(xì)胞(和其子細(xì)胞)的生長和分裂。促進(jìn)造血的治療性藥物包括IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、Meg-CSF、M-CSF(CSF-1)、GM-CSF、G-CSF或紅細(xì)胞生成素。這些藥物的劑量是根據(jù)它們在臨床試驗(yàn)中對化療或干細(xì)胞移植后促進(jìn)造血重建的療效中獲得的知識來選擇的。這些劑量將根據(jù)病人的身體狀況、化療藥的劑量和類型或病人受到的輻射劑量和類型的變化而調(diào)整。對接受治療的病人施用INPROL引起的干細(xì)胞抑制的反向進(jìn)程通過常規(guī)方法加以監(jiān)測。
在白血病的治療中，在用細(xì)胞毒藥物治療或輻射治療中同時(shí)施用抑制正常干細(xì)胞周期的INPROL和白血病細(xì)胞生長的刺激物(如IL-3或GM-CSF)，是有益處的。通過這個(gè)方案，在正常細(xì)胞及白血病細(xì)胞的細(xì)胞周期狀態(tài)之間和藥物敏感性之間可能達(dá)到最大的差異。
實(shí)施例1體內(nèi)干細(xì)胞增殖抑制分析為了測定干細(xì)胞的增殖，通過3H-TdR“自殺法”測定細(xì)胞周期S期的CFU-S數(shù)目(Becker et al.，Blood 26296-308，1965)。
在靜脈內(nèi)注射造血細(xì)胞后8-12天，通過受到致死劑量照射的小鼠脾中形成的宏觀集落，能夠在體內(nèi)檢測未成熟的造血祖細(xì)胞-脾臟集落形成單位(CFU-S)(Till & McCulloch 1961)。
對于標(biāo)準(zhǔn)CFU-S增殖檢測分析，通常采用3H-TdR“自殺法”(Becker et al.，1965)。該方法基于DNA合成過程中放射性標(biāo)記的胸腺嘧啶(3H-TdR)作為合成DNA前體物質(zhì)摻入細(xì)胞內(nèi)。在檢測時(shí)處于細(xì)胞周期S期的CFU-S被高放射活性殺死，因此在脾臟中不能形成集落。那么，通過注射與3H-TdR共同培養(yǎng)的細(xì)胞樣品和無3H-TdR共同培養(yǎng)的細(xì)胞樣品所形成的CFU-S數(shù)之間的差異表明初始樣品增殖CFU-S的百分?jǐn)?shù)。
就抑制因子來說僅影響進(jìn)入細(xì)胞周期的CFU-S，它在正常小鼠骨髓中低于總CFU-S群的7-10％。用未刺激動物的骨髓干細(xì)胞群不能進(jìn)行抑制因子實(shí)驗(yàn)。
為了刺激CFU-S增殖，采用苯肼(PHZ)或亞致死劑量的輻射(Lord，1976)。
根據(jù)睪酮丙酸化物(TSP)對CFU-S細(xì)胞周期的刺激效應(yīng)(Byron et al.，Nature.2281204，1970)我們建立了使用TSP的方法，它簡化了測定及不引起任何副作用。TSP誘導(dǎo)CFU-S增殖的刺激作用在注射后20～24小時(shí)出現(xiàn)，這種效應(yīng)至少7天內(nèi)均可觀察到。
純化抑制因子過程中所用篩選級分的方法如下小鼠、BDF1或CBF1小鼠系被用于全部實(shí)驗(yàn)。
為了誘導(dǎo)30-35％的CFU-S進(jìn)入S期，供體小鼠按10mg/100kg劑量的TSP腹腔注射0.2ml/只鼠。24小時(shí)后取股骨骨髓制備細(xì)胞懸液。然后以5～10×107/ml細(xì)胞與不同對照和實(shí)驗(yàn)組分在37℃水浴中培養(yǎng)3.5小時(shí)。每組2管(一管用于熱實(shí)驗(yàn)(有放射性)和一管冷實(shí)驗(yàn)(非放射性))。
3.5小時(shí)后，3H-TdR(1毫居里/毫升、比活18-25居里/毫摩爾)加入熱實(shí)驗(yàn)管中以每毫升細(xì)胞懸液中加入200μl體積的3H-TdR；冷實(shí)驗(yàn)管中什么也不加，在37℃連續(xù)培養(yǎng)30分鐘以上。
培養(yǎng)30分鐘后，加入10ml冷(4℃)培養(yǎng)基含400μg/ml非放射性胸腺嘧啶終止殺傷反應(yīng)。細(xì)胞粗略洗滌(3次)，重懸細(xì)胞并稀釋至注射所用的理想濃度，通常為2-4×104細(xì)胞/只小鼠，用0.3-0.5ml。
受體小鼠每組8-10只，注射細(xì)胞前6小時(shí)照射，不能遲于6小時(shí)。
在第9-12天取受體小鼠脾臟，用Tellesnitsky’s液固定，通過目測計(jì)數(shù)脾結(jié)節(jié)。S期細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)用公式計(jì)算%S=a-ba×(100%)]]>其中a-沒有用3H-TdR的CFU-S數(shù)b-用3H-TdR的CFU-S數(shù)提供在表1中的INPROL的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，用INPROL處理后的細(xì)胞周期干細(xì)胞對3H-TdR有抗性反應(yīng)。對這個(gè)及以下所有的實(shí)施例，術(shù)語pINPROL是指從豬骨髓中純化的蛋白。對S期特異細(xì)胞毒藥物阿糖胞苷、羥基脲(數(shù)據(jù)未顯示)也看到了相同的保護(hù)作用。如果處理的干細(xì)胞用含非放射性胸腺嘧啶的冷培養(yǎng)基洗滌，在小鼠脾臟中存活干細(xì)胞增殖正常地形成集落。
表1pINPROL與骨髓細(xì)胞培養(yǎng)4小時(shí)期間對CFU-S增殖的抑制活性
*每2×104細(xì)胞的CFU-S實(shí)施例2 體外干細(xì)胞增殖抑制分析應(yīng)用下面的檢測系統(tǒng)(Lord et al.，The Inhibitors ofHematopoiesis，pp.227-239，1987)顯示了INPROL的直接效應(yīng)。多系因子(IL-3)依賴細(xì)胞系FDCP mixA4(A4)，維持培養(yǎng)在IMDM培養(yǎng)基中，其中含20％馬血清和10％WEHI-3條件培養(yǎng)基作為集落刺激IL-3的來源。
用3H-TdR摻入分析檢測增殖A4細(xì)胞(5×104在100μl培養(yǎng)基中，其中含20％馬血清和50％的WEHI-3條件培養(yǎng)上清)在37℃，5％CO2中培養(yǎng)16小時(shí)。
開始加入INPROL或粗制的BME(骨髓提取物)(組分IV)，然后向每組加入3H-TdR(3.7KBq in 50μl at 740GBq/mmol)再繼續(xù)培養(yǎng)3小時(shí)。通過收獲細(xì)胞和用下列公式計(jì)算抑制百分率測定增殖率。
在正常骨髓提取物式pINPROL的階段劑量存在下生長的FDCPmix-A4細(xì)胞摻入3H-TdR被顯示在圖6，結(jié)果顯示純化的pINPROL組分至少此初始材料活性高1000倍。對于有效抑制來說，暴露時(shí)間(16小時(shí))是一個(gè)重要因素并顯示pINPROL對干細(xì)胞A4細(xì)胞系的直接效應(yīng)。實(shí)施例3 體內(nèi)注射INPROL導(dǎo)致CFU-S增殖抑制劑量和作用持續(xù)時(shí)間體內(nèi)注射INPROL的作用研究表明INPROL能有效地阻斷CFU-S的募集進(jìn)入細(xì)胞周期。因而，保護(hù)這些細(xì)胞免于進(jìn)一步治療時(shí)的細(xì)胞毒效應(yīng)。顯示出其臨床潛在應(yīng)用價(jià)值。
本實(shí)驗(yàn)方案有兩個(gè)目的體內(nèi)注射時(shí)檢查INPROL對CFU-S的效應(yīng)及確定涉及細(xì)胞周期干細(xì)胞的INPROL活性的有效持續(xù)時(shí)間。
為了刺激CFU-S增殖，根據(jù)在例1中所提到的效應(yīng)，注射睪酮丙酸化物(TSP)。
在0天BDF1小鼠注射TSP(10mg/100g)，24小時(shí)后，每個(gè)實(shí)驗(yàn)組(4只/每組)的小鼠腹腔內(nèi)一次性注射pINPROL 0μg、5μg、10μg和15μg/小鼠。
pINPROL注射后24小時(shí)，殺死小鼠按例1所述的分析方法測定進(jìn)入細(xì)胞周期CFU-S的百分?jǐn)?shù)。與未處理小鼠7％的細(xì)胞周期CFU-S相比TSP注射誘導(dǎo)大約50％的CFU-S進(jìn)入細(xì)胞周期。pINPROL在劑量低于2μg/只鼠時(shí)就能抑制由TSP誘導(dǎo)的增殖作用低于正常水平。
對于效應(yīng)持續(xù)時(shí)間的評價(jià)，一組小鼠(每組21只)只注射TSP，而另一組注射TSP和pINPROL(TSP注射后24h)一周內(nèi)每24小時(shí)從每組中取出3只小鼠按描述的方法(例1)測定進(jìn)入周期的CFU-S及測定骨髓中CFU-S周期狀態(tài)。圖7提供的資料表明，TSP的效應(yīng)持續(xù)時(shí)間至少7天。單次注射INPROL能使CFU-S進(jìn)入靜止期并使它們脫離細(xì)胞周期不超過48-72小時(shí)。由于大多數(shù)用于癌癥和白血病化療的藥物在體內(nèi)有相當(dāng)短的半衰期通常小于24小時(shí)。根據(jù)已獲得的資料INPROL在體內(nèi)的效應(yīng)要比化療藥物如阿糖胞苷或羥基脲在體內(nèi)具有活性的有效時(shí)間長，更重要地，由于在第一次化療和放療(對干細(xì)胞無損傷)與第二次治療(對CFU-S損傷)之間有一個(gè)較長的間隔(長于24小時(shí)，短于96小時(shí))在兩次應(yīng)用化療藥物和放射之間的間隔期內(nèi)，單次注射INPROL就足夠了。對于幾個(gè)重復(fù)周期的細(xì)胞毒治療或輻射治療、根據(jù)INPROL效應(yīng)的持續(xù)時(shí)間采用相同的策略。實(shí)施例4INPROL保護(hù)用5-FU處理后立即被刺激進(jìn)入細(xì)胞周期的大多數(shù)初級造血干細(xì)胞免于暴露于第二次5-FU5-FU能急劇減少骨髓池和淋巴池中的細(xì)胞數(shù)目。它通常被認(rèn)為是細(xì)胞周期特異性的，把迅速增殖的細(xì)胞作為靶，因?yàn)樵诩?xì)胞周期的S期或?qū)е录?xì)胞死亡前，核苷酸的類似物摻入到DNA上。單次劑量的5-FU不影響小鼠骨髓的長期存活及免疫造血重建。然而，實(shí)驗(yàn)表明(Harrison et al.，Blood 781237-1240，1991)多潛能造血干細(xì)胞(PHSC)在5-FU首次劑量后3-5天短暫的期間變得易受第二次劑量5-FU的損傷。它被解釋為正常情況下PHSC進(jìn)入細(xì)胞周期太慢，以致對單次劑量的5-FU是無效的，而且由于初次5-FU的處理所造成的刺激使PHSC迅速進(jìn)入細(xì)胞同期循環(huán)。我們已經(jīng)提出用INPROL能使PHSC返回到慢細(xì)胞周期狀態(tài)，由此保護(hù)PHSC不受第二次5-FU治療的損傷。
用于這些實(shí)驗(yàn)的小鼠是雄性BDF1小鼠。5-FU貯存液用生理鹽水配制10mg/ml。在實(shí)驗(yàn)的第0天每只處理小鼠通過尾靜脈接受5-FU 2mg/10g體重；24小時(shí)后腹腔內(nèi)注射pINPROL(10μg/100g體重)，在第3天給小鼠第二次注射5-FU，通過監(jiān)測實(shí)驗(yàn)組(用pINPROL治療)和對照組中的小鼠死亡進(jìn)行存活研究，每組30只小鼠，存活曲線見圖8。實(shí)施例5 INPROL與MIP-1α在骨髓細(xì)胞預(yù)培養(yǎng)中的作用本實(shí)驗(yàn)的目的是比較在體外用pINPROL和MIP-1α對小鼠骨髓細(xì)胞預(yù)培養(yǎng)的抑制效應(yīng)。
采用下面的方法體內(nèi)6-15周齡BDF1小鼠，在從股骨收集骨髓前48小時(shí)在腹腔內(nèi)注射5-FU，200mg/kg體重。
體外計(jì)數(shù)一個(gè)細(xì)胞合并懸液，總量2ml含5×106細(xì)胞，含或不含pINPROL或MIP-1α，含5％馬血清，加L-谷氨酰胺的IMDM培養(yǎng)基，在37℃，5％CO2培養(yǎng)4小時(shí)，然后將細(xì)胞洗2次，重新計(jì)數(shù)，按以下最終濃度細(xì)胞鋪制甲基纖維素平板。
0.8％甲基纖維素25％馬血清20ng/ml鼠重組IL-3L-谷氨酰胺5×105細(xì)胞/mlIMDM培養(yǎng)基平板在37℃、5％CO2、100％濕度培養(yǎng)11天，計(jì)數(shù)50個(gè)細(xì)胞以上的集落。
表2組別 集落數(shù) 對照百分比對照 31.0100％pINPROL 21.25 68.5％MIP-1α 35.25 114％實(shí)施例6INPROL抑制HPP-CFC的增殖用于評價(jià)鼠重建干細(xì)胞和早期祖細(xì)胞的一個(gè)體外分析方法是高增殖潛能集落(HPP-PFC)分析。其它相關(guān)分析方法，例如CFU-A、CFU-GM、CFU-E和CFU-GEMM，進(jìn)行性地檢測有限的祖細(xì)胞群(M.Moore，Blood 1772122-2128，1991)。這個(gè)例子顯示用pINPROL預(yù)處理細(xì)胞抑制它們增殖，然而，在這些條件下MIP-1α卻無此作用。
用5-FU(200mg/kg，腹腔注射)處理BDF1小鼠，然后分析HPP-CFC數(shù)。通過離心洗細(xì)胞調(diào)濃度為1～5×106/ml。培養(yǎng)液中加入 pINPROL(25ng/ml)或者M(jìn)IP-1α(200ng/ml)對照不加藥物，培養(yǎng)細(xì)胞4小時(shí)，培養(yǎng)后，洗細(xì)胞并鋪制瓊脂平板(0.3％)含30％胎牛血清和來自5637和WEHI-3B細(xì)胞系的聯(lián)合條件培養(yǎng)基(7.5％每種條件培養(yǎng)基由Sharp et al 1991推薦)在60mm平皿中鋪制平板濃度為5×104細(xì)胞/ml，第14天計(jì)數(shù)集落結(jié)果表示如下表3組別 HPP-CFU 對照的百分比(％)對照組15.5±1.2 100％pINPROL 8.3±0.7 53.5％MIP-1α 15.8±0.9 101％根據(jù)這些結(jié)果，MIP-1α僅在預(yù)培養(yǎng)期存在時(shí)不抑制大多數(shù)未成熟祖細(xì)胞的增殖。在這些條件下，pINPROL確實(shí)能有效地抑制增殖。表明pINPROL和MIP-1α之間在生物學(xué)活性方面存在根本差異。實(shí)施例7 INPROL對恢復(fù)輻射誘導(dǎo)骨髓再生障礙的治療作用骨髓再生障礙是癌癥放射治療的基本限制毒性。一些生長因子(例如G-CSF、GM-CSF，紅細(xì)胞生成素)已經(jīng)被證明能加速因輻射導(dǎo)致骨髓衰竭的恢復(fù)。通過應(yīng)用干細(xì)胞增殖抑制因子起保護(hù)作用的概念是在處理造血損傷中的一個(gè)不同和互補(bǔ)的方法。按照早期建立的治療方法(實(shí)施例3、4)一個(gè)致死劑量照射的小鼠模型被建立。在該領(lǐng)域中眾所周知，接受9Gy鈷-60照射的小鼠10-14天后開始死亡。到第30天死亡率大約50％。這個(gè)致死劑量被用于我們的模型，方法是把它分成兩次相繼的4.5Gy照射，中間間隔3天。初步數(shù)據(jù)表明，在那個(gè)模型中的存活曲線與單次用9Gy照射的存活曲線非常接近。然而，對CFU-S增殖的實(shí)驗(yàn)表明，首次照射后24小時(shí)，35-50％的CFU-S被誘導(dǎo)增殖。第二次劑量照射前給予干細(xì)胞抑制因子能保護(hù)這種細(xì)胞。
為了檢測這種可能性，在第0天小鼠(50只鼠/組)接受4.5Gy照射。24小時(shí)后，一組小鼠接受pINPROL(2μg/只鼠，腹腔注射)，而另一組對照組注射生理鹽水。在第3天給予第二次劑量照射(4.5Gy)。
圖9表明，單次劑量pINPROL后提高了存活。這種模型的條件對治療任何癌癥與臨床密切相關(guān)。包括以實(shí)體瘤為特征的腫瘤。對患有癌癥病人實(shí)施這種治療是在兩個(gè)連續(xù)照射劑量之間給予一個(gè)有效劑量的INPROL。因此，對癌癥的治療允許使用較大劑量的輻射。把這種模式擴(kuò)展到化療藥物也是可能的。實(shí)施例8 INPROL被用于自體骨髓移植骨髓移植僅是已知對幾種白血病有效治療的方法(CML、AML和其它)。對于回輸自體骨髓的內(nèi)外條件將提供無白血病細(xì)胞污染的正常干細(xì)胞以及能夠再集居于受體造血系統(tǒng)并有攻擊性和有效治療的潛在自體源源。
1.長期骨髓培養(yǎng)L1210白血病模型對INPROL在阿糖胞苷凈化期間保護(hù)造血作用的研究根據(jù)TcksoZ等(Blood 55931-936，1980)建立的長期骨髓培養(yǎng)及白血病細(xì)胞系L1210，它通過2周的共培養(yǎng)適合長期骨髓培養(yǎng)。正常和白血病祖細(xì)胞同時(shí)生長出現(xiàn)在這些LTBMC/L1210聯(lián)合培養(yǎng)基中與白血病病人的骨髓中的情況相似。通過在含有或不含WEHI-3的條件培養(yǎng)基(鼠IL-3產(chǎn)生細(xì)胞系)上生長的瓊脂集落能區(qū)分正常集落形成單位(CFU)和白血病的集落形成單位。正常細(xì)胞在缺乏IL-3時(shí)進(jìn)行凋亡，而白血病細(xì)胞在缺乏IL-3時(shí)能形成集落。來自LTBMC-L1210成分的懸浮細(xì)胞在IL-3存在下產(chǎn)生大約150個(gè)集落(正常造血集落)而當(dāng)生長在沒有IL-3(白血病集落)每50,000細(xì)胞制板的情況產(chǎn)生70個(gè)集落。
凈化方法如下在第0天從含LTBMC-L1210的培養(yǎng)瓶中去掉懸浮細(xì)胞和培養(yǎng)基(Tsyrlova et al in LeukemiaAdvames inBiology and therapy v35.1988)換成2ml含200μg阿糖胞苷(AraC)的培養(yǎng)基。培養(yǎng)20小時(shí)后，用培養(yǎng)液洗去含AraC的原培養(yǎng)液并換成2ml新鮮培養(yǎng)敷對照組)或含25ng/ml終濃度的pINPROL的培養(yǎng)基培養(yǎng)4小時(shí)。這次預(yù)培養(yǎng)后，細(xì)胞被再次用含100μg/瓶阿糖胞苷的培養(yǎng)基在37℃培養(yǎng)3小時(shí)，每組4瓶，LTBMC-L1210培養(yǎng)物被洗3次并換用新鮮的LTBC培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)3-4周作為再生研究。
圖10所示資料，僅用阿糖胞苷處理的對照培養(yǎng)基中沒有細(xì)胞生長，而在INPROL保護(hù)的培養(yǎng)瓶中由于來自貼壁層祖細(xì)胞的增殖造血的再生出現(xiàn)極快。然而，來自實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞鋪在只含有IL-3的瓊脂板上生長出大約100個(gè)CFU(集落形成單位)每50,000個(gè)細(xì)胞，至少在4周培養(yǎng)期間沒有發(fā)現(xiàn)白血病細(xì)胞生長。因此，用有效劑量的阿糖胞苷結(jié)合INPROL在體內(nèi)外處理骨髓能清除癌細(xì)胞而干細(xì)胞被受到保護(hù)。有可能把該模式擴(kuò)展應(yīng)用到其它形式的化療和放射治療中。
2.離體條件下通過INPROL處理提高骨髓再集居能力(MRA)和30天輻射防護(hù)作用骨髓再集居能力(MRA)，是指細(xì)胞重新集居于致死劑量照射小鼠骨髓的能力以及授予30天輻射防護(hù)的能力。是一個(gè)在體內(nèi)直接測定造血抑制動物的潛在恢復(fù)能力(Visser et al Blood Cells14369-384，1988)。
對于輻射防護(hù)研究，BDF1小鼠被照射9.5Gy通過移植睪酮刺激的供體小鼠骨髓而恢復(fù)。一組受體小鼠通過用培養(yǎng)基預(yù)培養(yǎng)4小時(shí)的骨髓細(xì)胞而恢復(fù)(對照組-A組)，另一組(B組)通過用含25ng/mlpINPROL的培養(yǎng)基預(yù)培養(yǎng)4小時(shí)的骨髓細(xì)胞而恢復(fù)。兩組細(xì)胞洗滌后以每只小鼠30,000細(xì)胞移植給被照射的動物。存活資料見圖11。三次實(shí)驗(yàn)的總和以正常對照組為100％被描述。到第30天pINPROL培養(yǎng)增加小鼠的存活率從對照組的36.5％升至61.8％。
通過用INPROL預(yù)培養(yǎng)誘導(dǎo)的MRA增加可能是提高輻射防護(hù)作用機(jī)制之一。為了驗(yàn)證這一假說，根據(jù)Visser等(op.cit)方法測定了MRA。簡述如下，供體小鼠用睪酮預(yù)處理，它們的骨髓用培養(yǎng)基或含pINPROL的培養(yǎng)基預(yù)培養(yǎng)4小時(shí)，然后注射給被照射的動物。在第13天取受體股骨的骨髓細(xì)胞以三個(gè)不同濃度(0.01、0.05和0.1相當(dāng)于一個(gè)股骨)在含有20％馬血清、10％WEHI條件培養(yǎng)中鋪制瓊脂平板、第7天的細(xì)胞集落數(shù)代表MRA，就當(dāng)時(shí)受體骨髓中的集落形成而言是供體的未成熟干細(xì)胞的祖細(xì)胞。
如圖12所見，用INPROL預(yù)培養(yǎng)細(xì)胞的MRA比對照組多(B)。實(shí)施例9 INPROL對干細(xì)胞的抗過度增殖效應(yīng)能改變它們的分化異常CFU-S的過度增殖不僅在細(xì)胞毒藥物或放射后恢復(fù)期可見，而且也作為正常老齡化的結(jié)果。并且被認(rèn)為是脊髓發(fā)育不良綜合癥的一個(gè)主要特征，它伴隨分化障礙。例如，紅系分化占優(yōu)勢而沿粒系途徑的分化被減弱。
骨髓細(xì)胞用含25ng/ml pINPROL的培養(yǎng)基或培養(yǎng)基(對照組)在37℃培養(yǎng)4小時(shí)，洗滌細(xì)胞，然后用含20％馬血清，2U/ml紅細(xì)胞生成素和10％WEHI條件培養(yǎng)基鋪制瓊脂平板，在第7天計(jì)數(shù)BFU-E和GM-CFU集落數(shù)。表4中總結(jié)了三次實(shí)驗(yàn)的資料，每組每個(gè)點(diǎn)4只動物，鋪制4個(gè)平皿。
由表4可見，來自用INPROL未受傷害的年青動物(BDF1小鼠8-12周齡)的正常骨髓培養(yǎng)不改變各種類型集落的數(shù)目或比例。用睪酮-propinate(TSP)預(yù)先處理的BDF1供體顯示與以前(例1、3、4)所見的CFU-S增殖-樣的增加，在紅系祖細(xì)胞數(shù)目上(BFU-E集落)稍有增加，GM-CFU下降，通過用INPROL預(yù)培養(yǎng)這些改變將全部被消除。此外，異常高水平的CFU-S增殖返回到在細(xì)胞周期S期中CFU-S的10％。CFU-S過度增殖已知是一些種系小鼠易感于病毒白血病的一個(gè)特征，例如，Balb/c小鼠(表4)及在老齡鼠中均能觀察到這現(xiàn)象。在TSP處理的BDF1小鼠中所見的定型祖細(xì)胞的同樣再分布在Balb/c鼠和老齡(23-25月齡)BDF1鼠中被觀察，它們具有共同的異常高水平的CFU-S增殖。通過用INPROL預(yù)培養(yǎng)糾正CFU-S的增殖和分化。什么與臨床更密切，研究表明體內(nèi)注射INPROL(2μg/只小鼠)影響CFU-S的增殖及紅系(BFU-E)和GM集落的比率(表4)。
表4INPROL對CFU-S分化成定型祖細(xì)胞BFU-E和CFU-GM的影響骨髓供體 pINPROL3H-TdR殺傷 BFU-ECFU-GMCFU-S百分?jǐn)?shù)年輕BDF1- 12.0±0.328.33±1.9146.22±3.44+ 15.0±1.322.00±3.7447.70±3.72老齡BDF1- 47.1±1.943.75±1.5424.0±1.33+ 11.4±0.715.25±1.4544.0±7.63TSP刺激的 - 53.2±1.632.67±2.4415.71±2.28BDF1+ 7.2±0.4 12.00±1.8335.50±1.4Balb/c - 57.0±1.947.86±2.9633.57±3.45+ 23.0±2.424.86±2.5370.60±4.96實(shí)施例10 INPROL的免疫刺激活性已經(jīng)觀察到含有高比例增殖的CFU-S與INPROL一起培養(yǎng)不僅改變了CFU-S的細(xì)胞周期而且也改變了它們的分化。改變了占優(yōu)勢的紅系分化以有利于粒系祖細(xì)胞和淋巴系祖細(xì)胞的分化。由于細(xì)胞毒化療或放療的免疫抑制副作用以及免疫抑制伴隨過度增殖干細(xì)胞失調(diào)和衰老，INPROL這一特性具有重要作用。
本實(shí)施例顯示了INPROL對來自根據(jù)Wittlock和Witt(Ann.Rev.Immun.3213-35，1985)建立的淋巴系長期培養(yǎng)(LLTC)未成熟前體細(xì)胞分化成前B細(xì)胞的直接效應(yīng)通過在含IL-7的甲基纖維素中形成集落測定這種效應(yīng)。
按所述方法建立LLTC并用新鮮LLTC培養(yǎng)基(Terry FoxLabs.，Vancouver，Canada)飼養(yǎng)一周兩次。每周收集一次非貼壁細(xì)胞、洗滌、用含25ng/ml plNPROL培養(yǎng)基或培養(yǎng)基本身作對照培養(yǎng)4小時(shí)，培養(yǎng)后洗滌細(xì)胞，以105細(xì)胞/ml甲基纖維素含30％胎牛血清和10ng/ml的IL-7鋪制平板。圖13顯示三周的數(shù)據(jù)。在對照組中大的前B細(xì)胞集落的數(shù)目變化隨時(shí)間的增加而增加，但用INPROL預(yù)培養(yǎng)總是刺激集落的生長高于對照水平4-8倍。這表明INPROL的免疫刺激特性。這可應(yīng)用在糾正免疫缺陷狀態(tài)和增加想要的免疫應(yīng)答，例如疫苗接種。實(shí)施例11 INPROL促進(jìn)干細(xì)胞再集居能力-長期培養(yǎng)物起始來自患CML的病人的細(xì)胞慢性髓性白血病(CML)是造血干細(xì)胞的一種致死性的惡性疾病。CML的治療在慢性期采用單一藥物化療、聯(lián)合化療、脾切除或脾臟照射可以控制臨床病癥和癥狀，但是不能有效地延長存活。隨著CML由慢性期進(jìn)展到加速期時(shí)標(biāo)準(zhǔn)的治療方法不起作用。采用不相關(guān)供體骨髓移植治療是困難的由于組織不相容性的問題。然而，不足40％適宜CML病人會有一個(gè)合適的相關(guān)供體匹配。因此，更喜歡自體移植?；剌斪泽w骨髓移植及能夠從ph陽性病人在長期培養(yǎng)(LTC)中生長的髓樣前體細(xì)胞中選擇非白血病(ph陰性)的髓樣前體細(xì)胞的體內(nèi)外條件提高正常干細(xì)胞的潛在自體資源具有攻擊性及對慢性白血病的有效治療。
在骨髓移植的上下文中，造血干細(xì)胞從廣義講可以被定義為具有產(chǎn)生成熟血細(xì)胞能力的細(xì)胞。我們已采用C.Eaves和A.Eaves建立的人長期培養(yǎng)系統(tǒng)用于定量計(jì)數(shù)干細(xì)胞數(shù)目和作為處理干細(xì)胞用于治療的一種方法。這包括接種細(xì)胞到預(yù)先建已照射過的人骨髓貼壁層上，然后這些培養(yǎng)物繼續(xù)培養(yǎng)5周，5周后收集全部克隆生成細(xì)胞成分(貼壁與非貼壁)。在這些條件下克隆生成細(xì)胞的產(chǎn)量與初始加入的前體細(xì)胞的數(shù)量呈線性相關(guān)的(Long Term Culture Cell(LTC-IC))單個(gè)人LTC-IC的平均產(chǎn)量是每個(gè)LTC-IC產(chǎn)生4個(gè)克隆生成前體細(xì)胞。以前的結(jié)果表明，當(dāng)患有CML病人的骨髓放在相似的條件下，白血病克隆生成細(xì)胞(ph陽性)迅速下降。通過定量分析殘留正常LTC-IC，在患有CML病人中，選擇那些可能從由移植培養(yǎng)的自體移植物支持的加強(qiáng)治療中獲益是可能的(Phillups et al.，Bone Marrow Transplantation 8477-487，1991)。
下面的方法被用于檢測INPROL對建立于CML病人外周血骨髓遷移細(xì)胞中的克隆生成細(xì)胞(LTC-IC)的效應(yīng)。培養(yǎng)物被作為長期培養(yǎng)引入到預(yù)先照射的基質(zhì)上，健康供體以外周血被用作對照。來自CML病人的外周血細(xì)胞用或不用pINPROL(25ng/ml)預(yù)培養(yǎng)4小時(shí)，洗滌細(xì)胞，放在LTC-IC系統(tǒng)中培養(yǎng)5周以確定對照LTC-IC的數(shù)量。對于實(shí)驗(yàn)組，其它平行培養(yǎng)物建立10天，用或不用plNPROL預(yù)培養(yǎng)生長10天后培養(yǎng)物中的貼壁和非貼壁細(xì)胞混合物放到預(yù)先建立的滋養(yǎng)物上繼續(xù)培養(yǎng)8周。通過鋪制貼壁與非貼壁細(xì)胞在含有合適的生長因子的甲基纖維素平板上來估計(jì)每一實(shí)驗(yàn)組的培養(yǎng)物中LTC-IC的數(shù)目(Terry Fox Labaratories Vancouver，Canada)并計(jì)數(shù)集落形成細(xì)胞總數(shù)，用該方法獲得的LTC-IC值是由用公式評價(jià)總克隆生成細(xì)胞(CFC)含量衍化來的。
#LTC-IC＝#CFC/4圖14提供的資料表明，來自健康供體骨髓頭10天培養(yǎng)期間沒有LTC-IC的丟失。經(jīng)5周培養(yǎng)后，大約有注入的30％仍然存在。CML病人的LTC-IC的數(shù)目在10天培養(yǎng)期間急劇下降到大約8％，進(jìn)一步培養(yǎng)的過程中不見恢復(fù)。而用INPROL預(yù)培養(yǎng)的細(xì)胞LTC-IC的水平增加到初始數(shù)目的30％并維持8周。
通過這些初步的資料預(yù)計(jì)INPROL的臨床相關(guān)應(yīng)用包括策略地用于選擇性促進(jìn)新鮮或培養(yǎng)骨髓移植物的正常干細(xì)胞成分；策略地用于增強(qiáng)殘留正常干細(xì)胞在體內(nèi)的再循環(huán)也包括轉(zhuǎn)移新的基因材料到人骨髓干細(xì)胞中進(jìn)一步移植給病人的方案。實(shí)施例12A 從骨髓制備物中分離干細(xì)胞增殖免疫活性抑制因子的方法從豬肋骨分離骨髓，來自豬尸體的肋骨被分離，清除肌肉纖維和脂肪，切成碎塊，通過用Biophyzpribor制造的水壓榨機(jī)提取骨髓。通過離心2000rpm，20分鐘分離骨髓細(xì)胞。提取上清相繼易于通過超濾Amicon USA膜XM 100，PM 30，PM 50。根據(jù)電泳分析，產(chǎn)物的主要組成是白蛋白(見圖1)。生化純化骨髓提取物和組分的蛋白成分在純化的每一步都用10％聚丙烯酰胺凝膠分電泳分析，含0.1％SDS，直到7％SDS和0.5-1％巰基乙醇加至樣品。上樣前樣品在70℃溫育5分鐘。
電泳在20cm的膠進(jìn)行5小時(shí)，然后在20℃用0.25％考馬斯亮蘭CBBC250乙醇∶水∶乙酸5∶5∶1混合液中染色1小時(shí)，用7％乙酸洗膠，換洗液幾次。通過用造血干細(xì)胞增殖抑制的方法測定產(chǎn)物的活性。此后是該方法的詳述。第一階段 用硫酸銨沉淀純化根據(jù)表5中的結(jié)果選用飽和度為40-80％硫酸銨沉淀純化的蛋白活性是在25％。
表5硫酸飽和0-4040-60 60-80 80-100度(％)活性(％)37.2-35.4 37.2-1.8 37.2-12.8 37.2-26.1＝1.8％＝35.4％ ＝24.4％ ＝11.1％每步純化后用于檢測的樣品量是根據(jù)純化水平?jīng)Q定的而且相當(dāng)于初始產(chǎn)物量的2×10-2mg通過公式?jīng)Q定活性。
改變(％)＝％Sa-％Sb其中 ％Sa是對照組中％S％Sb是用于測定組分溫育后的S％為了降低硫酸銨濃度20倍，在每次活性測前及下一步純化前實(shí)驗(yàn)組分要除鹽。第二階段來自第一階段的抑制因子除鹽后使用，而且部分用于離子交換層析，這里用DEAE 23纖維素。然后用梯度醋酸鈉緩沖液洗脫(pH＝6.0)抑制因子活性洗脫在3-5mM之間。
柱體積是1ml，洗脫流速是4ml/小時(shí)通過Millichrome色譜儀在230和280nm進(jìn)行檢測。級分1(見圖2)表現(xiàn)最高活性被分離并洗脫在5mM醋酸鈉緩沖液中(見表6)。
表6級分 1 2 3 4 5活性 46.3-0 46.3-14.1 46.3-42.1 46.3-19.6 46.3-45.1＝46.3％ ＝32.2％＝4.2％ ＝26.7％＝1.2％電泳結(jié)果表明，主要蛋白污染物-白蛋白(見圖3)被從該組分除去。這可使純度另外提高4倍。第三階段來自第二階段部分純化的抑制因子被直接用在G-75Sephadex柱柱體積是20ml(20×1)，洗脫率是2ml/小時(shí)，洗脫緩沖液是50mM NaCl，10mM Tris-HCl，pH7.5在色譜儀Millichrome在230和280nm進(jìn)行監(jiān)測。具有最高活性的組分5被分離。
表7組分1 2 3 4 5活性42.2-19.1 42.2-35.2 42.2-21.5 42.2-38.8 42.2-0＝23.1％ ＝7.0％ ＝20.7％ ＝3.4％ ＝42.2％第四階段 應(yīng)用pro-REC柱的反向?qū)游?Phamacia FPLCSystem)在Ultraslera基質(zhì)上進(jìn)行。用0.1％三氟醋酸在乙腈梯度洗脫液洗脫蛋白。
分子量16-17kD的產(chǎn)物同質(zhì)性等于90％，正如在分析丙烯酰胺/SDS膠所示的結(jié)果(見圖6)。結(jié)果見圖4，對組分5測定活性，產(chǎn)物的終產(chǎn)量是5％。結(jié)果純化后分子量16kD的蛋白總量是初始產(chǎn)物的650ng/ml。純化過程中產(chǎn)物經(jīng)受熱浴70℃幾分鐘，但經(jīng)測定生物學(xué)活性不喪失。實(shí)施例12B 分離較大量INPROL的可選方法初步分離取新鮮死豬的肋骨清除肌纖維和脂肪，然后切成碎塊以1∶1(重量/體積)比率浸泡于磷酸鹽緩沖液。為從固體骨中分離骨髓獲得的混合物被用水壓擠碎。通過4層奶酪布濾出固體顆粒收集骨髓細(xì)胞懸液，濾出物在56℃溫育40分鐘然后在冰浴中冷卻到4℃，在4℃10000g離心30分鐘，去除最終沉淀并棄掉。
清亮的上清液中在30分鐘內(nèi)滴加10倍體積攪拌的冰冷的丙酮含1％的濃鹽酸，混合物放置4℃，16小時(shí)完全形成沉淀。然后沉淀物在4℃ 20,000g離心30分鐘，用冷丙酮洗沉淀團(tuán)塊，干燥。高壓液相純化沉淀團(tuán)塊用高壓液相緩沖液A溶解，至最終蛋白濃度8-10mg/ml，緩沖液A含5％乙腈和0.1％三氟醋酸。這種溶液(0.5～0.6ml)被加在250×4.6mm裝有Polisil ODS-300(10mcm)的高壓液相柱上，用相同的緩沖液A平衡柱。
用緩沖液B(9％乙腈，0.1％三氟醋酸)在緩沖液A中根據(jù)下列程序以1ml/分鐘的流率完成液脫。
時(shí)間，分鐘 緩沖液B的百分比％0 04 05252590在重新平衡柱前，用100％的緩沖液B沖洗柱5分鐘。然后再平衡柱回到初始狀態(tài)，下一份蛋白溶液才可以上柱，典型的層析圖見圖5。
分離過程中為了測定蛋白峰，在280nm監(jiān)測柱子流出物，收集含有蛋白質(zhì)的組分，相應(yīng)的峰匯集到一起，30℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)干燥，獲得的殘留物溶于蒸餾水用于生物活性測定和SDS-PAGE(14％膠，降低條件)電泳分析。含有活性物質(zhì)的峰被洗脫在70-80％的B緩沖液中，含有16kD的主要蛋白帶和痕量的快速移動蛋白象以前通過SDS-PAGE分析的那樣。
通過收集高壓液相的第二峰所獲得材料分析顯示在圖15(A和C)。含有兩個(gè)峰的材料(即圖5)這里被稱作pINPROL制品1和只含有第二個(gè)峰組成的材料被稱之為pINPROL制品2。500μg這種有活性的純化的pINPROL制品2上C4反向?qū)游鲋?vydac)并用59.5％的乙腈在0.1％三氟醋酸的線性梯度洗脫。該物質(zhì)在53％乙腈中洗脫出一個(gè)單一的峰(圖15A)。然而，在相同的條件下跑250μg的MIP-1α(R & D System)，它在43.9％乙腈中洗脫出來(圖15B，注意14％乙腈前一點(diǎn)的早期峰是人為造成的由于有氣泡在檢測儀中)。天然INPROL在這些條件下基本上比MIP-1α更疏水。TGFβ被認(rèn)為在這些條件下比對pINPROL觀察到的洗脫濃度更低(Miyazona et al.，J.Biol Chem.2636407-15，1988)。
圖15C所示洗脫的pINPROL材料的電泳膠。第一道是粗材料；第2道是分子量標(biāo)記；第3道是純化的材料；有兩條主要帶，一條在大約14kD；另一條在大約35kD認(rèn)為35kD的帶是一個(gè)14kD帶的多聚體形式。實(shí)施例13A 活性INPROL制備物含血紅蛋白β鏈pINPROL被制備如圖5所示(即pINPROL制品1(見例12B))該物質(zhì)跑SDS-PAGE電泳并用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)用ABI 477A蛋白序列儀帶有120A Online PTH-AA分析器易于對該物質(zhì)的N端序列進(jìn)行分析。獲得了下面N端序列VHLSAEEKEAVLGLWGKVNVDEV... ... ... ...計(jì)算機(jī)查詢蛋白數(shù)據(jù)庫揭示該序列與豬血紅蛋白β鏈N端序列一致(圖16C)。實(shí)施例13B 活性INPROL制備物含血紅蛋白α鏈如圖15C所示，通過收集第二個(gè)主要峰純化的蛋白顯示在圖5(pINPROL制品2)結(jié)果2個(gè)主要帶附和大約15kD和30kD的分子量以及幾個(gè)小帶，用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)SDS-PAGE膠被轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。切下單個(gè)帶，象例13A一樣易于N端序列分析。15kD帶N端序列如下VLSAADKANVKAAWGKVGGQ... ...
30kD帶易被限制性蛋白水解酶消化，獲得如下的內(nèi)部序列**FPHFNLSHGSDQVK... ...
第一個(gè)序列顯示與豬血紅蛋白α鏈N端序列一致。而第二個(gè)序列顯示與豬血紅蛋白α鏈的43-56氨基酸殘基一致(見圖16C人、鼠、豬α、β血紅蛋白鏈的序列比較)這些帶及一些小帶的重復(fù)序列不斷地產(chǎn)生一定比例的α球蛋白序列。那么圖15C中觀察到的各種帶即代表豬血紅蛋白α鏈的片段又代表集合物。實(shí)施例13C 豬INPROL的進(jìn)一步表征為了進(jìn)一步比較pINPROL與豬血紅蛋白。二次結(jié)晶的豬血紅蛋白從Sigma化學(xué)公司獲得，使之經(jīng)過反向高壓液相層析。如例12B中對圖15所描述的那樣。正如圖17所顯示的那樣，完整的血紅蛋白的高壓液相色譜圖與pINPROL制品1所見的色譜圖一樣。在進(jìn)一步的直接比較中，圖17A(源于圖5的第二個(gè)峰)顯示的pINPROL制品2被看到與豬血紅蛋白(圖17B)兩個(gè)峰的第二個(gè)峰相互迭蓋。對于主要峰分別有52.51和52.25分鐘的滯留時(shí)間。應(yīng)該注意到血紅素與血紅蛋白中第一個(gè)主要峰共遷移，這種情況下在49.153分鐘，因此，血紅素是pINPROL制品1的組分而不是制品2的組分。這被證明通過pINPROL制品在575nm缺少吸收。一個(gè)對血紅素存在的診斷波長。
豬血紅蛋白α和β鏈的預(yù)計(jì)分子量分別是15038道爾頓和16034道爾頓。正如圖18中SDS-PAGE色譜所見。頭兩個(gè)峰由較高分子量組成，第二個(gè)的兩個(gè)峰由較低分子量鏈組成。那么頭兩峰出現(xiàn)表示血紅蛋白β鏈，第二個(gè)的兩個(gè)峰表示血紅蛋白α鏈。
此外，用淺洗脫梯度進(jìn)行豬血紅蛋白的分離(圖21)。這些峰的N端分析表明第一個(gè)峰是豬的α鏈而第二個(gè)峰是豬的β鏈。生物分析結(jié)果證實(shí)分離的兩種血紅蛋白鏈?zhǔn)怯猩飳W(xué)活性的(實(shí)施例14和例15)。
為了進(jìn)一步比較pINPROL制品2和血紅蛋白β鏈進(jìn)行雙向電泳(圖19)。作為第一向，等電聚焦在玻璃管中用2％pH4-8的兩性電解質(zhì)進(jìn)行9600伏特小時(shí)。用原肌球蛋白(分子量33kD，等電點(diǎn)5.2)作為內(nèi)參照，它的位置用箭頭標(biāo)在最終的2D膠。膠管在緩沖液中平衡并封在12％丙烯酰胺板膠上面的濃縮膠的上面。SDS板膠電泳在12.5mA/膠中進(jìn)行4小時(shí)。用銀染膠并干膠。
比較2D電泳模型揭示，只有1或2個(gè)較小的斑點(diǎn)不同與高壓液相純化的血紅蛋白β鏈和pINPROL制品2。用抗豬血紅蛋白抗體的Western分析，不論1D和2D電泳證實(shí)在制品中存在β血紅蛋白。因此，按照例12B制備活性pINPROL制品2基本上是豬血紅蛋白的β鏈。實(shí)施例14 血紅蛋白α、血紅蛋白β鏈或完整的血紅蛋白顯示干細(xì)胞抑制活性為了證明血紅蛋白β鏈有INPROL活性，用例1描述的方法及象例12B純化的材料進(jìn)行來自睪酮處理小鼠的骨髓細(xì)胞的自殺分析。如表8所示，正常小鼠骨髓細(xì)胞的15％被殺死而相對與睪酮處理小鼠為36％。正如所希望的，這表明睪酮處理提高了進(jìn)入細(xì)胞周期細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)(因此，表示它們對殺死更敏感-實(shí)施例1)。相反，來自睪酮處理動物的細(xì)胞與pINPROL或純化血紅蛋白β鏈以40ng/ml培養(yǎng)表現(xiàn)出在細(xì)胞周期細(xì)胞的急劇下降，分別從36％降到0％和7％。對這兩個(gè)蛋白劑量高達(dá)200ng就不那么有效了。作為陽性對照，以前特征化的干細(xì)胞抑制因子MIP-1α減少細(xì)胞周期細(xì)胞至13％。
在體外能進(jìn)行相似的分析。用進(jìn)入細(xì)胞周期狀態(tài)CFU-mix代替CFU-S。這種分析除阿糖胞苷(AraC，30mg/ml)被用作細(xì)胞周期特異毒性藥物代替高劑量3H-TdR和帶有高內(nèi)源性細(xì)胞周期率的小鼠種系(Balb/c)用來代替睪酮處理BDF1小鼠外象以上對CFU-S分析描述的那樣進(jìn)行(見B.I.Lord，Haemopoiesis-APractical Approach.，N.G.Testa and G.Molineux(Eds.)，IRLPress 1993；Pragnell et al.，Culture of Hematopoietic Cells，R.I.Freshney，I.B.Pragnell and M.G.Freshney(Eds.)，Wiley Liss1994)。如圖9所示，高度純化的豬β鏈或α鏈在這一分析中均是有活性的。在該分析中應(yīng)注意，用pINPROL處理的細(xì)胞的細(xì)胞周期水平偶然有相反的數(shù)目。這意味著在阿糖胞苷處理池中有比在非處理池中更多的集落。
如例2所述，在3H-TdR攝入分析中pINPROL抑制鼠干細(xì)胞系FDCP-Mix的增殖。圖20表明用這一分析方法純化的血紅蛋白α或β鏈均是有活性的，所見到抑制性＜2mg/ml。
前文提供的證據(jù)豬血紅蛋白β鏈顯示INPROL活性。其它資料(表9，圖20)表明，分離到的α鏈，以及完整的血紅蛋白作為干細(xì)胞抑制因子也是有活性的，活性制品也包括α和β鏈的混合物(圖5)。
觀察分離的α球蛋白鏈和/或β球蛋白鏈?zhǔn)怯谢钚缘?。表明此處描述的活性不需要一個(gè)完整的三維空間結(jié)構(gòu)的血紅蛋白。α和β鏈的片段作為干細(xì)胞增殖抑制因子也是有活性的。
表8處 理 殺死(％)WBM115TPBM236pINPROL 200ng/ml2340ng/ml 0Hbg3200ng/ml2540ng/ml 7MIP-1α 200ng/ml131NBM＝正常骨髓2TPBM＝睪酮處理小鼠骨髓3Hbg＝C4反向純化豬血紅蛋白β鏈(來自兩次結(jié)晶的豬血紅蛋白)
表9處 理 殺死(％)對照143豬α鏈2-4豬β鏈2-141對照-來自Balb/c小鼠骨髓2100ng/ml(如圖21純化的)實(shí)施例15純化的INPROL、純化的豬α血紅蛋白或純化的豬β血紅蛋白在體內(nèi)是有活性的為了測定純化的豬血紅蛋白在體內(nèi)起作用的能力，如例1所述BDF1小鼠注射睪酮丙酸化物。24小時(shí)后，小鼠靜脈注射500ng、pINPROL或豬血紅蛋白α鏈(如圖21，從豬處周血紅細(xì)胞純化的)或相當(dāng)量的載體。48小時(shí)后收集每只鼠骨髓按例14所述進(jìn)行CFU-Mix分析。如表10所示pINPROL、豬α鏈和豬β鏈在體內(nèi)均有活性。降低細(xì)胞周期中的CFU-Mix的百分?jǐn)?shù)至基礎(chǔ)水平。
表10處 理 殺死(％)對照145pINPROL25豬α鏈25豬β鏈2-5基質(zhì)341對照-來自睪酮處理BDF1小鼠的骨髓2100ng/ml3基質(zhì)-來自未處理BDF1小鼠骨髓實(shí)施例16 純化的人血紅蛋白α鏈、生物素化的人血紅蛋白α鏈、生物素化的人血紅蛋白β鏈、人血紅蛋白γ和人血紅蛋白δ鏈在體外均顯示干細(xì)胞抑制活性從Sigma生化公司或用標(biāo)準(zhǔn)方法從成人外周血或臍帶血分離獲得人血紅蛋白。通過反向高壓液相用一個(gè)象上面描述的對豬α和β鏈相似的方法分離各個(gè)單獨(dú)的鏈。(見B.Masala and Manca，Methodsin Enzymology Vol.231 pp21-24，1994)得到了純化的α、β、γ和δ鏈。對于生物素化的α和β鏈用37μg的NHSLC生物素(Pierce)處理成人血紅蛋白1mg通過象上面的反向液相層析分離各鏈。
如圖1、12和13所示，純化的人α鏈、生物素化的人α鏈、生物素化的人β鏈、人γ鏈和人δ血紅蛋白鏈在CFU-Mix周期分析中所有的鏈均是有活性的。
表11處 理 殺死(％)對照149人α鏈2-1人β鏈241人γ鏈 -631對照-來自Balb/c小鼠骨髓2100ng/ml表12處 理 殺死(％)對照147人y鏈212人δ鏈2-4
1對照-來自Balb/c小鼠骨髓2100ng/ml表13處 理殺死(％)對照168人α鏈219生物素化的α鏈27人β鏈255生物素化的β鏈2251對照-來自Balb/c小鼠骨髓2100ng/ml實(shí)施例17 純化的人α鏈、α-β二聚物或血紅蛋白在體內(nèi)是有活性的純化的人α鏈、α-β二聚物或血紅蛋白在一個(gè)象例15中描述的體內(nèi)分析方法中被檢測。如表14所示，在每只小鼠500ng的濃度時(shí)這些成分的每一個(gè)都是有活性的。
表14處 理殺死(％)對照149人α鏈 -22人α-β二聚物 14人血紅蛋白 -311對照-來自睪酮處理BDF1小鼠的骨髓實(shí)施例18 豬INPROL在體外對人單核或CD34+臍帶血細(xì)胞是有活性的為了調(diào)查來自豬骨髓純化的INPROL影響人祖細(xì)胞周期的能力，臍帶血細(xì)胞被獲得。不論是用Ficoll分離后獲得的單核細(xì)胞組分還是用CD34親和柱分離后獲得的CD34+組分被應(yīng)用于該實(shí)驗(yàn)。為了確保早期干細(xì)胞處于細(xì)胞周期，細(xì)胞在體外有IL-3和干細(xì)胞因子(SCF)(100ng/ml每種細(xì)胞因子)存在的情況下培養(yǎng)48小時(shí)。經(jīng)預(yù)培養(yǎng)后，按例14中描述的方法除了鋪板后第18天計(jì)數(shù)CFU-GEMM(代替CFU-Mix)外進(jìn)行細(xì)胞周期分析。如表15所示，豬INPROL抑制CFU-GEMM的細(xì)胞周期無論是在大量的單核細(xì)胞還是在CD34+組分中。
表15處 理 殺死(％)單核細(xì)胞對照 93pINPROL116CD34+細(xì)胞 對照 41pINPROL1211100ng/ml實(shí)施例19 純化的人α血紅蛋白對人CFU-GEMM是有活性的人臍帶血單核細(xì)胞被獲得并在IL-3和SCF存在的條件下培養(yǎng)，并用于例18所述的細(xì)胞周期分析。圖16所示，從骨髓中純化的豬INPROL和從外周血純化的人α血紅蛋白兩者在本分析中均是有活性的。
表16處 理 殺死(％)對照100pINPROL1-6人α鏈1-232100ng/ml實(shí)施例20 從人α血紅蛋白和人β血紅蛋白序列獲得的肽類是有活性的為了鑒定活性肽序列，用計(jì)算機(jī)模型程序把肌紅蛋白的三維結(jié)構(gòu)(在這一分析中肌紅蛋白是無活性的)放在人血紅蛋白α鏈的天然三維結(jié)構(gòu)上。兩個(gè)肽(代表氨基酸43-55和64-82區(qū)域，這些區(qū)域在結(jié)構(gòu)上不同與肌紅蛋白三維空間結(jié)構(gòu))被鑒定在CFU-MIX周期分析中作為有活性的肽類。為了更緊密接近于在天然α鏈中發(fā)現(xiàn)的環(huán)狀物，一個(gè)43-55肽的環(huán)行衍生物(c43-55)(用二硫鍵)也被合成并發(fā)現(xiàn)是有活性的。這些肽類的序列如下43-55 Phe-Pro-His-Phe-Phe-Asp-Leu-Ser-His-Gly-Ser-Ala-Gln-Valc(43-55)Cys-Phe-Pro-His-Phe-Phe-Asp-Leu-Ser-His-Gly-Ser-Ala-Gln-Val-Cys(其中兩個(gè)Cys殘基是二硫鍵)64-82 Asp-Ala-Leu-Thr-Asn-Ala-Val-Ala-His-Val-Asp-Asp-Met-Pro-Asn-Ala-Leu-Ser-Ala兩個(gè)hemorphin序列，Hemorphin 10(β鏈序列的32-41位氨基酸)和Hemorphin 7(33-40位氨基酸)被檢測并且發(fā)現(xiàn)具有活性。
序列如下Hemorphin 10 Leu-Val-Val-Tyr-Pro-Try-Thr-Gln-Arg-PheHemorphin 7 Val-Val-Tyr-Pro-Trp-Thr-Gln-Arg
為了檢測這些序列的活性，按例14所述進(jìn)行CFU-MIX細(xì)胞周期分析，如表l7-19所示，在這個(gè)分析中這些肽類都是有活性的。
表17處 理殺死(％)對照47pINPROL10肽(43-55)100ng/ml 210ng/ml181ng/ml11100ng/ml表18處 理殺死(％)對照43肽(43-55)15肽(64-82)19Hemorphin 1011Hemorphin 7101所有肽類以100ng/ml測定表19處 理殺死(％)對照47環(huán)形肽43-55101在100ng/ml濃度雖然按優(yōu)選的實(shí)施方案描述了本發(fā)明，應(yīng)理解本領(lǐng)域的技術(shù)人員會知道各種變化和變更。因此，所附權(quán)力要求包括所要保護(hù)的本發(fā)明的范圍內(nèi)所有等價(jià)的變化。
權(quán)利要求
1.一種藥物組合物，它包含血紅蛋白和藥用載體。
2.一種藥物組合物，它包含(a)選自血紅蛋白α鏈、血紅蛋白β鏈、血紅蛋白γ鏈、血紅蛋白δ鏈、血紅蛋白ε鏈和血紅蛋白ζ鏈的多肽，和(b)藥用載體。
3.一種藥物組合物，它包含血紅蛋白α鏈和藥用載體。
4.一種藥物組合物，它包含血紅蛋白β鏈和藥用載體。
5.權(quán)利要求3的藥物組合物，它還包含血紅蛋白β鏈。
6.一種藥物組合物，它包含至少一種選自權(quán)利要求2中所列的多肽。
7.權(quán)利要求6的藥物組合物，其中所說的組合物是兩個(gè)多肽。
8.權(quán)利要求7的藥物組合物，其中所說的兩個(gè)多肽是二聚物，它包含選自血紅蛋白α鏈、血紅蛋白β鏈、血紅蛋白γ鏈、血紅蛋白δ鏈、血紅蛋白ε鏈和血紅蛋白ζ鏈的兩個(gè)多肽。
9.權(quán)利要求8的藥物組合物，它選自血紅蛋白α鏈-血紅蛋白β鏈、血紅蛋白α鏈-血紅蛋白γ鏈、血紅蛋白o(hù)鏈-血紅蛋白δ鏈和血紅蛋白δ鏈-血紅蛋白δ鏈。
10.一種肽，它具有序列Phe-Pro-His-Phe-Phe-Asp-Leu-Ser-His-Gly-Ser-Ala-Gln-Val。
11.一種環(huán)狀肽，它具有序列Cys-Phe-Pro-His-Phe-Phe-Asp-Leu-Ser-His-Gly-Ser-Ala-Gln-Val-Cys，其中兩個(gè)Cys殘基形成二硫鍵。
12.一種肽，它具有序列Asp-Ala-Leu-Thr-Asn-Ala-Val-Ala-His-Val-Asp-Asp-Met-Pro-Asn-Ala-Leu-Ser-Ala。
13.權(quán)利要求1-12的藥物組合物，其為單位劑量形式。
14.權(quán)利要求13的藥物組合物，它包含0.1mg到6g一或兩種選自血紅蛋白α、β、γ、δ、ε和ζ鏈的化合物。
15.一種抑制干細(xì)胞增殖的方法，它包括用干細(xì)胞增殖抑制量的INPROL接觸造血細(xì)胞。
16.權(quán)利要求15的方法，其中所說的INPROL選自血紅蛋白α鏈、血紅蛋白β鏈、血紅蛋白γ鏈、血紅蛋白δ鏈、血紅蛋白ε鏈、血紅蛋白ζ鏈。
17.權(quán)利要求15的方法，其中所說的INPROL選自具有下列序列的肽類Phe-Pro-His-Phe-Phe-Asp-Leu-Ser-His-Gly-Ser-Ala-Gln-Val，Cys-Phe-Pro-His-Phe-Phe-Asp-Leu-Ser-His-Gly-Ser-Ala-Gln-Val-Cys(其中兩個(gè)半胱氨酸殘基形成一個(gè)二硫鍵)，Asp-Ala-Leu-Thr-Asn-Ala-Val-Ala-His-Val-Asp-Asp-Met-Pro-Asn-Ala-Leu-Ser-Ala，Leu-Val-Val-Tyr-Pro-Trp-Thr-Gln-Arg-Phe，Leu-Val-Val-Tyr-Pro-Trp-Thr-Gln-Arg，Leu-Val-Val-Tyr-Pro-Trp-Thr-Gln，Leu-Val-Val-Tyr-Pro-Trp-Thr，Leu-Val-Val-Tyr-Pro-Trp，Leu-Val-Val-Tyr-Pro，Val-Val-Tyr-Pro-Trp-Thr-Gln，Tyr-Pro-Trp-Thr-Gln-Arg-Phe，Tyr-Pro-Trp-Thr-Gln-Arg，Tyr-Pro-Trp-Thr-Gln，和Tyr-Pro-Trp-Thr。
18.一種抑制干細(xì)胞增殖的方法，它包括用一種能結(jié)合阿片受體的化合物接觸造血細(xì)胞。
19.權(quán)利要求18的方法，其中的化合物對阿片受體的μ亞類有選擇性。
20.權(quán)利要求18的方法，其中的化合物選自具有下列序列的肽類Leu-Val-Val-Tyr-Pro-Trp-Thr-Gln-Arg-Phe，Leu-Val-Val-Tyr-Pro-Trp-Thr-Gln-Arg，Leu-Val-Val-Tyr-Pro-Trp-Thr-Gln，Leu-Val-Val-Tyr-Pro-Trp-Thr，Leu-Val-Val-Tyr-Pro-Trp，Leu-Val-Val-Tyr-Pro，Val-Val-Tyr-Pro-Trp-Thr-Gln，Tyr-Pro-Trp-Thr-Gln-Arg-Phe，Tyr-Pro-Trp-Thr-Gln-Arg，Tyr-Pro-Trp-Thr-Gln，和Tyr-Pro-Trp-Thr。
21.一種刺激B細(xì)胞生長的方法，它包括用生長刺激量的INPROL接觸造血細(xì)胞。
22.一種治療哺乳動物癌癥的方法，它包括如下步驟a)實(shí)施放療或化療，和b)施用干細(xì)胞增殖抑制量的INPROL。
23.權(quán)利要求22的方法，其中步驟a和b被重復(fù)一次或多次。
24.權(quán)利要求22的方法，其中步驟a在步驟b之后進(jìn)行。
25.權(quán)利要求22的方法，其中步驟b在步驟a之前或之后24小時(shí)內(nèi)進(jìn)行。
26.一種治療哺乳動物癌癥的方法，它包括a)從所說的哺乳動物中移出造血細(xì)胞，b)用INPROL間接體內(nèi)地處理造血細(xì)胞，c)用化療或輻射處理步驟b中的造血細(xì)胞，d)對所說的哺乳動物進(jìn)行成髓治療，和e)將步驟c的造血細(xì)胞移植給所說的哺乳動物。
27.權(quán)利要求26的方法，其中所說的癌癥是白血病。
28.抑制暴露于損傷或破壞干細(xì)胞藥物的哺乳動物中的干細(xì)胞分裂的方法，它包括施用干細(xì)胞增殖抑制量的INPROL。
29.權(quán)利要求28的方法，其中所說的藥物是一種抗病毒藥物。
30.間接體內(nèi)地維持哺乳動物造血干細(xì)胞的方法，它包括用干細(xì)胞增殖抑制量的INPROL接觸造血細(xì)胞。
31.權(quán)利要求30中的方法，其中所說的造血細(xì)胞選自骨髓細(xì)胞、外周血細(xì)胞、活化的外周血細(xì)胞和臍帶血細(xì)胞。
32.一種治療患有髓增殖性疾病或自身免疫疾病、上皮干細(xì)胞過度增殖的哺乳動物的方法，它包括施用過度增殖降低量的INPROL。
33.權(quán)利要求32的方法，其中所說的髓增殖性疾病是一種骨髓發(fā)育不良綜合癥。
34.一種有區(qū)別地保護(hù)化療或放療哺乳動物中的正常干細(xì)胞而不保護(hù)癌細(xì)胞的方法，它包括施用干細(xì)胞保護(hù)量的INPROL。
35.權(quán)利要求34的方法，其中所說的INPROL是在正常干細(xì)胞通過暴露于細(xì)胞毒藥物或輻射而被誘導(dǎo)增殖后施用的。
36.一種接種哺乳動物的方法，它包括在疫苗接種前、疫苗接種期間或疫苗接種后施用作為一種輔助藥物的INPROL。
37.一種純化干細(xì)胞增殖抑制因子的方法，所述抑制因子基本上沒有其它蛋白物質(zhì)，該方法包括以下步驟a)分離骨髓并從提取物中去除顆粒物質(zhì)；b)加熱提取物并去除沉淀；c)對提取物進(jìn)行酸沉淀并收集沉淀物；和d)通過反相層析分離所說的抑制因子。
38.一種純化的干細(xì)胞增殖抑制因子，其中該抑制因子按權(quán)利要求37的方法被純化為表觀上均一。
39.一種治療因干細(xì)胞過度增殖而引起哺乳動物免疫抑制的方法，它包括給所說的哺乳動物施用過度增殖回復(fù)量的INPROL。
40.一種在哺乳動物中進(jìn)行基因治療的方法，它包括a)從所說的哺乳動物中移出造血細(xì)胞；b)用一個(gè)預(yù)先確定的基因轉(zhuǎn)染該造血細(xì)胞；c)間接體內(nèi)地用INPROL接觸轉(zhuǎn)染的造血細(xì)胞；d)將步驟c的造血細(xì)胞移植給所說的哺乳動物。
41.權(quán)利要求40的方法，其進(jìn)一步包括在步驟(a)之后用至少一種刺激性細(xì)胞因子處理所說的造血細(xì)胞，以誘導(dǎo)干細(xì)胞增殖。
42.權(quán)利要求40的方法，其進(jìn)一步包括在步驟(d)之后在體內(nèi)用INPROL治療哺乳動物。
43.一種間接體內(nèi)地進(jìn)行干細(xì)胞擴(kuò)增的方法，它包括用INPROL和至少一種刺激性細(xì)胞因子接觸造血細(xì)胞。
44.權(quán)利要求43的方法，其中所說的造血細(xì)胞選自骨髓細(xì)胞、臍帶細(xì)胞、外周血細(xì)胞、活化的外周血細(xì)胞。
45.一種藥物組合物，它包含(a)INPROL和(b)至少一種抑制性化合物，該化合物選自MIP-1α、TGFβ、TNFα、INFα、INFβ、INFγ、五肽pyroGlu-Glu-Asp-Cys-Lys，四肽N-乙酰-Ser-Asp-Lys-Pro和三肽谷胱甘肽(Gly-Cys-γGlu)。
46.一種藥物組合物，它包含(a)INPROL和(b)至少一種刺激性化合物，該化合物選自IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-9、IL-11、IL-13、IL-14、IL-15、G-CSF、GM-CSF、M-CSF、紅細(xì)胞生成素、血小板生成素、干細(xì)胞因子和flk2/flt3配基。
全文摘要
本發(fā)明公開并要求保護(hù)的是用于調(diào)節(jié)異常干細(xì)胞周期和加速化療后外周血細(xì)胞恢復(fù)的干細(xì)胞抑制因子的分離及其應(yīng)用。同時(shí)公開并要求保護(hù)的是干細(xì)胞增殖抑制因子。
文檔編號A61K48/00GK1168695SQ95196555
公開日1997年12月24日 申請日期1995年9月29日 優(yōu)先權(quán)日1994年9月30日
發(fā)明者V·K·科茲洛夫, I·楚爾洛娃, S·D·沃爾帕 申請人:普羅神經(jīng)細(xì)胞有限公司