專利名稱：：免疫佐劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及新穎的疫苗佐劑?？乖欢x為外來(lái)物質(zhì)，當(dāng)給予時(shí)，如經(jīng)非胃腸道給予時(shí)，會(huì)引發(fā)免疫反應(yīng)，包括引發(fā)抗體產(chǎn)生。抗體是包含于血液和其它體液和組織中的物質(zhì)，它與抗原結(jié)合而使之變?yōu)闊o(wú)害。抗體構(gòu)成了身體的天然防御機(jī)制之一。它們具有很高的特異性，并可殺死、結(jié)合或使引發(fā)抗體形成的抗原變?yōu)闊o(wú)害?？乖c免疫系統(tǒng)接觸時(shí)會(huì)激活一系列復(fù)雜的細(xì)胞相互作用以消除抗原和/或再建立原先的平衡?？乖膬蓚€(gè)特征是它們的免疫原性，即它們能在體內(nèi)引發(fā)免疫反應(yīng)(包括形成特異性的抗體)和它們的抗原性，即，它們能被起源于該抗原的抗體選擇性地識(shí)別。已知能通過(guò)疫苗來(lái)給予特異性抗原而故意刺激免疫反應(yīng)。該方法使機(jī)體發(fā)生免疫記憶狀態(tài)，這保證了機(jī)體與其后抗該原接觸時(shí)更為迅速和有效地產(chǎn)生反應(yīng)。但是，有些抗原只有微弱的免疫原性，它們引發(fā)的免疫反應(yīng)不足以獲得對(duì)機(jī)體的有效保護(hù)?？赏ㄟ^(guò)給予抗原與稱為佐劑的物質(zhì)的混合物來(lái)增加抗原的免疫原性，佐劑可通過(guò)直接對(duì)免疫系統(tǒng)的作用或通過(guò)修飾抗原的藥動(dòng)學(xué)特征來(lái)增加對(duì)抗原的反應(yīng)，這樣增加抗原與免疫系統(tǒng)的相互作用時(shí)間。最廣泛使用的佐劑一種是Freund佐劑，它是一種乳劑，包括在礦物油內(nèi)的鹽水中的死的分枝桿菌，另一種是Freund不完全佐劑，它不含分枝桿菌。這些佐劑或者能增加對(duì)抗原的免疫反應(yīng)的強(qiáng)度，或者能使免疫系統(tǒng)非特異性地激活。但是，使用這些佐劑有這些缺陷，如在注射部位形成刺激或膿腫。另外，為了使這些佐劑有效，所用的濃度必須大于50％注射體積，這限制了一次能注射的抗原的有效負(fù)荷。這些基于油和水的標(biāo)準(zhǔn)佐劑的高粘度使之不能實(shí)用，因?yàn)樗鼈冸y以引入注射器并難以注射人動(dòng)物體內(nèi)。另一類佐劑包括聚丙烯酸溶液(Diamanstein等，Z.Klin.Chem.Klin.Biochem.，第8卷，632-636頁(yè)(1970)和Diamanstein等，歐洲免疫雜志，第1卷，335-339頁(yè)(1971))。該類佐劑的優(yōu)點(diǎn)在于其粘度比基于礦物油和水的常規(guī)佐劑的粘度小。因此可更簡(jiǎn)單地操作和注射。但是，這些佐劑的效果不可與基于礦物油包水(w/o)的佐劑相比。本發(fā)明的目的是提出一種疫苗佐劑，它在低濃度下有效，且元礦物油。該目的通過(guò)一種疫苗佐劑而達(dá)到，所述的疫苗佐劑包括具有陰離子組成重復(fù)單元和疏水性組成重復(fù)單元的聚合物的水溶液。在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)陰離子組成重復(fù)單元是指構(gòu)成聚合物的單體單元，它含有能離解于水而形成陰離子的基團(tuán)。用于本發(fā)明形成陰離子組成重復(fù)單元的這類單體單元的例子是(選自)丙烯酸、甲基丙烯酸、馬來(lái)酸、富馬酸、亞乙基二磺酸、乙烯基硫酸、苯乙烯磺酸、乙烯基苯基硫酸、2-甲基丙烯酰氧基乙烷磺酸、3-甲基丙烯酰氧基-2-羥基丙烷磺酸、2-丙烯酰-2-甲基丙烷磺酸、3-丙烯酰胺基-3-甲基丁酸、3-甲基丙烯酰胺基-3-甲基丁酸、乙烯基磷酸、4-乙烯基苯甲酸、3-乙烯基氧基丙烷-1-磺酸和N-乙烯基丁二亞胺酸。較好的是，該類型的單體單元選自丙烯酸、甲基丙烯酸、馬來(lái)酸、富馬酸、亞乙基二磺酸、乙烯基硫酸和苯乙烯磺酸。該類型單體單元優(yōu)選地選自丙烯酸、甲基丙烯酸、馬來(lái)酸和富馬酸。該類型單體單元特別優(yōu)選的是丙烯酸單元。在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)疏水性組成重復(fù)單元是指構(gòu)成聚合物的單體單元，它含有也稱為親脂性的完全疏水的基團(tuán)，它在水中不發(fā)生離解。用于本發(fā)明形成疏水組成重復(fù)單元的這類單體單元的例子是(選自)上述酸(丙烯酸、甲基丙烯酸、馬來(lái)酸、富馬酸、亞乙基二磺酸、乙烯基硫酸、苯乙烯磺酸、乙烯基苯基硫酸、3-甲基丙烯酰氧基-2-羥基丙烷磺酸、2-甲基丙烯?；趸彝榛撬帷?-丙烯酰-2-甲基丙烷磺酸、3-丙烯酰胺基-3-甲基丁酸、3-甲基丙烯酰胺基-3-甲基丁酸、乙烯基磷酸、4-乙烯基苯甲酸、3-乙烯基氧基丙烷-1-磺酸或N-乙烯基丁二亞胺酸)的烷基酯、環(huán)烷基酯和羥基烷基酯和醚(如，甲氧基甲基、乙氧基乙基、烯丙基氧基甲基、2-乙氧基乙氧基甲基、芐氧基甲基、環(huán)己基甲基、1-乙氧基乙基、2-乙氧基乙基、2-丁氧基乙基、甲氧基甲氧基乙基、甲氧基乙氧基乙基、1-丁氧基丙基、1-乙氧基丁基、四氫糠基或糠基醚)。較好的是，該類型的單體單元選自丙烯酸、甲基丙烯酸、馬來(lái)酸、富馬酸、亞乙基二磺酸、乙烯基硫酸或苯乙烯磺酸的烷基酯。更好的是，該類型的單體單元選自丙烯酸、甲基丙烯酸、馬來(lái)酸或富馬酸的烷基酯，其中烷基含4-8個(gè)碳原子。該類型的單體單元特別好的是丙烯酸的線型烷基酯，其中烷基含4-8個(gè)碳原子。用于本發(fā)明的特別優(yōu)選的佐劑是聚合物的水溶液，它的用來(lái)形成陰離子組成重復(fù)單元的單體單元是丙烯酸，用來(lái)形成疏水性組成重復(fù)單元的單體單元選自丙烯酸線型烷基酯，它的烷基含4-8個(gè)碳原子。對(duì)包括具有陰離子組成重復(fù)單元和疏水性組成重復(fù)單元的聚合物水溶液的疫苗產(chǎn)生的體液反應(yīng)，比由只有完全陰離子性組成重復(fù)單元，如聚丙烯酸的聚合物引發(fā)的反應(yīng)大。確實(shí)，本發(fā)明佐劑的效果可與基于礦物油包水的標(biāo)準(zhǔn)佐劑的效果進(jìn)行類比，而總的來(lái)說(shuō)，它們的毒性卻低得多。因?yàn)闃?biāo)準(zhǔn)乳劑總是對(duì)諸如鹽濃度、溫度等的穩(wěn)定因子十分敏感，而對(duì)本發(fā)明的佐劑來(lái)說(shuō)不是這樣，因此不象基于水包油(o/w)或油包水(w/o)的乳劑的標(biāo)準(zhǔn)佐劑，本發(fā)明的佐劑沒(méi)有任何不穩(wěn)定的問(wèn)題。標(biāo)準(zhǔn)佐劑的穩(wěn)定性原則上與只含陰離子組成重復(fù)單元的聚合物，如聚丙烯酸的穩(wěn)定性相對(duì)應(yīng)。本發(fā)明佐劑的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是劑量很低時(shí)仍有效，因此能增加每一注射體積的抗原負(fù)載。在基于油包水的疫苗中，礦物油約占疫苗體積的50％，而本發(fā)明佐劑(如，基于連接于烴鏈的聚丙烯酸)占據(jù)的體積可下降到疫苗體積的約10％。根據(jù)第一個(gè)有利的實(shí)例，聚合物的分子量為10-10,000千道爾頓。有利的是，疏水性組成重復(fù)單元和陰離子組成重復(fù)單元的摩爾比是0.05-1.00，較好的是0.10-0.40。較好的是，聚合物在水中的溶解度至少為1克/升。根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)特征，它揭示了得到聚合物的方法?？赏ㄟ^(guò)下列方法之一得到聚合物1.陰離子單體和疏水單體共聚，2.聚合物的部分接枝，3.聚合物的部分水解，和4.用中間體酐。根據(jù)另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)例，建議的疫苗是聚合物的濃度為1-40毫克/毫升的疫苗，較好的是4-24毫克/毫升，最好的是8-16毫克/毫升。根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，疫苗包括新城疫病毒(NDV)和/或傳染性支氣管炎病毒(IBV)的滅活抗原，它可用來(lái)給家畜接種。包括基于連接于烴鏈的聚丙烯酸的佐劑的疫苗比包括基于w/o或o/w乳劑的佐劑或基于水/礦物油/水(w/o/w)的佐劑的疫苗的穩(wěn)定性大得多，因?yàn)榍罢叩淖魟┦侨芤?。本發(fā)明的另一個(gè)特征是使用聚合物的水溶液，它具有陰離子組成重復(fù)單元和疏水性組成重復(fù)單元作為疫苗的佐劑。本發(fā)明的另一個(gè)特征提供了制備溶液型疫苗的方法，其特征在于使抗原水溶液與具有陰離子組成重復(fù)單元和疏水性組成重復(fù)單元的聚合物混合。實(shí)施例1通過(guò)使分子量450,000道爾頓的聚丙烯酸(Carbopol907(PAA)，Goodrich，Cleveland，美國(guó)俄亥俄州)部分酯化來(lái)合成本發(fā)明的各種水溶性聚合物。在本申請(qǐng)中，術(shù)語(yǔ)“PAA”是指“Carbopol907”。該聚丙烯酸根據(jù)Cohen，H.L.在J.Poly.Sci.，第14卷，7-22頁(yè)(1976)中所述的方法用各種羥基烷進(jìn)行酯化。所得的聚合物，下面稱為“烷基-PAA”(參見(jiàn)表I)，含丙烯酸的單體單元和烷基丙烯酸化類型的單體單元。將1克PAA溶于50毫升相應(yīng)的鏈烷醇中，將溶液加熱到135℃。加入50微升H2SO4，將反應(yīng)混合物保持在135℃。通過(guò)將反應(yīng)混合物迅速冷卻和加入一體積蒸餾水來(lái)停止反應(yīng)。然后，將溶液的pH調(diào)節(jié)到pH＝6，在80℃下減壓(10-6巴)蒸發(fā)溶劑。這樣得到的產(chǎn)物溶于蒸餾水，對(duì)蒸餾水滲析，然后凍干。合成下列化合物，它們的主要性質(zhì)列于表I癸基-PAA(C10-PAA)、辛基-PAA(C8-PAA)、丁基-PAA(C4-PAA)和甲基-PAA(C1-PAA)。用NMR分析確定這些化合物的酯化程度，以摩爾％表示。將烷基-PAA溶于磷酸鹽緩沖液(pH＝7.5)，必要時(shí)稍加熱，將一體積佐劑溶液與一體積含抗原的溶液混合。表I合成的烷基-PAA的主要性質(zhì)實(shí)施例2給四周齡的母雞肌肉注射包括滅活的NDV(新城病病毒)(Kimber株)和滅活的IBV(傳染性支氣管炎病毒)病毒(包括M41和D274株)(iNDB/iIBV)而沒(méi)有佐劑的疫苗0.5毫升使母雞免疫，然后在七周齡時(shí)用含有佐劑的相同抗原肌注免疫。陰性對(duì)照組的動(dòng)物接受磷酸鹽緩沖的鹽水(PBS)溶液來(lái)代替佐劑，陽(yáng)性對(duì)照組的動(dòng)物接種包括基于油包水的標(biāo)準(zhǔn)佐劑的疫苗。第二次接種后的三周讓母雞放血，在一些實(shí)驗(yàn)中于數(shù)周后再收集第二次血樣。將血樣在室溫下培育，2小時(shí)后消除血凝塊，通過(guò)離心(2700G下離心10分鐘)除去剩余的細(xì)胞，收集每只動(dòng)物的血清樣品，在-20℃下儲(chǔ)藏至使用時(shí)。96孔微量滴定板用純NDV飽和，后者在37℃下已在碳酸鹽緩沖溶液(pH＝9.6；0.1M)中滅活和稀釋2小時(shí)。板用5％(重量/體積)脫脂奶的碳酸鹽緩沖液(SKM)在4℃下飽和過(guò)夜。母雞血清通過(guò)1體積血清加4體積25％(重量/體積)高嶺土在硼酸鹽緩沖液中的懸浮液(ICNBiomedicals，Inc.，CostaMesa，美國(guó))培育30分鐘進(jìn)行處理。然后離心除去高嶺土。母雞的血清用含1％(重量/體積)牛血清白蛋白的PBS(PBS/BSA)稀釋100倍。在同一96孔板上，以相同的溶液對(duì)血清樣本進(jìn)行系列2倍稀釋，將板在37℃下培養(yǎng)1-2小時(shí)。加入山羊產(chǎn)生的并與過(guò)氧化酶偶合的抗雞IgG的抗體，在PBS/SKM中的1/1000的稀釋液，然后將板在37℃下培養(yǎng)1-2小時(shí)。板上的過(guò)氧化物酶量通過(guò)加入ABTS+H2O2底物溶液(Kirkegaard&amp;PerryLabs.，美國(guó))，在405nm下用multiscanTitertek測(cè)量吸光度進(jìn)行定量?？贵w滴度以2-光密度對(duì)稀釋因子的倒數(shù)標(biāo)繪的回歸系數(shù)的對(duì)數(shù)值的形式表示。也可以這些平均數(shù)(2平均)的幾何平均值(2-log+/-SEM)和反對(duì)數(shù)值表示抗體滴度。這些佐劑的活性用如下算得的增加百分?jǐn)?shù)表示增加％＝[反對(duì)數(shù)(樣品)-反對(duì)數(shù)(陰性對(duì)照)]/[反對(duì)數(shù)(陽(yáng)性對(duì)照)-反對(duì)數(shù)(陰性對(duì)照)]×100。進(jìn)行Student的t試驗(yàn)以分析這些結(jié)果的統(tǒng)計(jì)意義，值p＞0.05被認(rèn)為是顯著的。在四個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)中，將一個(gè)或多個(gè)部分酯化的聚丙烯酸的佐劑的效果與未酯化的PAA佐劑的效果、與沒(méi)有佐劑(PBS)的陰性對(duì)照組的效果以及與具有礦物油包水(w/o)陽(yáng)性對(duì)照組的效果進(jìn)行比較。用上述的間接ELISA方法測(cè)定抗體滴度。這些實(shí)驗(yàn)的結(jié)果于表II。表II用間接ELISA對(duì)不同的烷基-PAA制劑對(duì)于母雞對(duì)HDV/IBV的免疫反應(yīng)的作用</tables>n＝每組母雞數(shù)SEM＝平均值的標(biāo)準(zhǔn)偏差(平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤)*＝C4叔在四個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)中陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照組得到了重現(xiàn)的抗體滴度，陽(yáng)性對(duì)照組的抗體滴度比陰性對(duì)照組高2-log單位3-4個(gè)(8-16倍)。(未修飾)的PAA使抗-iNDV抗體的滴度增加了6％-32％(實(shí)驗(yàn)I-IV)，這樣的增加似乎取決于劑量(實(shí)驗(yàn)IV)。劑量40毫克/毫升時(shí)得到最佳效果(實(shí)驗(yàn)II)。烷基-PAA所得的反應(yīng)明顯高于未經(jīng)修飾的PAA。辛基-PAA和丁基-PAA產(chǎn)生的滴度高于癸基-PAA、叔丁基-PAA或甲基-PAA產(chǎn)生的滴度。劑量8-40毫克/毫升的辛基-PAA或丁基-PAA得到最大的反應(yīng)。該反應(yīng)與基于水和油的用作陽(yáng)性對(duì)照的標(biāo)準(zhǔn)佐劑所得的反應(yīng)一樣高。實(shí)驗(yàn)IV顯示反應(yīng)取決于所用的修飾的PAA劑量，至少對(duì)于丁基-PAA，其劑量范圍為1-16毫克/毫升是這樣。即使極低劑量(1-2毫克/毫升)的丁基-PAA也可明顯增加體液反應(yīng)。這樣得到了可與劑量高得多的未修飾PAA相類比的抗體滴度。體液反應(yīng)隨著所用的修飾PAA劑量的增加而增加，并達(dá)到與基于水和油的標(biāo)準(zhǔn)佐劑所得的反應(yīng)相等的最大值。24-40毫克/毫升丁基-PAA和辛基-PAA偶爾會(huì)引發(fā)比劑量8毫克/毫升弱的反應(yīng)，這表明這些化合物的最佳濃度為8-24毫克/毫升。實(shí)施例3用市售的抗-iNDVELISA試劑盒(Flockcheck新城疫抗體試驗(yàn)試劑盒；IDEXXLabs，Inc.，美國(guó)緬因州)根據(jù)方案也測(cè)定了各個(gè)體血清樣本中的抗-NDV抗體滴度。分析結(jié)果如表III所示。表III通過(guò)IDEXXELISA試劑盒對(duì)母雞進(jìn)行不同PAA制劑對(duì)抗-iNDV抗體滴度的作用的測(cè)量<tablesid="table5"num="005"><tablewidth="842">佐劑[mg/ml]n抗NDV抗體的滴度佐劑2-log的平均值SEM反對(duì)數(shù)增加％PAA[40]20NTC8-PAA[8]2012.41.1540436C8-PAA[40]20NTC8-PAA[8]2012.31.5504231C8-PAA[40]2012.41.2540436C8-PAA[8]2012.51.0579336C8-PAA[40]2012.01.9409625實(shí)驗(yàn)IIIw/o4013.11.38780100PBS408.21.82940PAA[8]20NTPAA[24]20NTC8-PAA[8]2013.51.011585133C8-PAA[8]2012.81.1713281C8-PAA[24]2013.51.311585133C8-PAA[8]2013.70.613308153C8-PAA[8]2012.51.1579365C8-PAA[24]20NTC8-PAA[8]2013.71.213308158C8-PAA[24]2014.20.818820218C8-PAA[8]20NTC8-PAA[24]20NT實(shí)驗(yàn)IVw/o4012.91.0388100PBS407.51.1370PAA[1]20NTPAA[2]20NTPAA[4]20NTPAA[8]20NTPAA[16]20NTC4-PAA[1]20NT</table></tables></tables>n＝每組母雞數(shù)SEM＝平均值的標(biāo)準(zhǔn)偏差(平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤)NT＝未經(jīng)試驗(yàn)*＝C4叔在四個(gè)實(shí)驗(yàn)中，陰性對(duì)照組平均值之間的差很小。在四個(gè)實(shí)驗(yàn)中，陽(yáng)性對(duì)照的平均值的差也很小。修飾的PAA佐劑為23-218％、丁基-PAA和辛基-PAA佐劑比甲基-PAA或癸基-PAA的更有效。該方法所得的結(jié)果證實(shí)了第一種方法的分析結(jié)果，它是這些試驗(yàn)的特定發(fā)展。實(shí)施例4在96孔板上，抗血清一系列呈級(jí)數(shù)的稀釋液與106KimberNDV株的感染顆粒(PFU)一起在37℃下培養(yǎng)18小時(shí)。向每個(gè)孔中加入105予鳥(niǎo)QT35系細(xì)胞，并把板放好。覆蓋這些板并在37℃下再培養(yǎng)48小時(shí)。使感染顆粒數(shù)減少50％的血清稀釋液被認(rèn)為是抗體滴度。這些實(shí)驗(yàn)的結(jié)果如表IV所示。表III通過(guò)病毒中和(VN)對(duì)母雞進(jìn)行不同PAA制品對(duì)于抗-iNDV抗體滴度的作用的測(cè)量佐劑[mg/ml]n抗NDV抗體的滴度佐劑2-log的平均值SEM反對(duì)數(shù)增加％實(shí)驗(yàn)Iw/o4016.32.180684100PBS408.11.82740PAA[8]2011.62.031044C8-PAA[8]2015.12.43512043C6-PAA[40]2014.02.31638420實(shí)驗(yàn)IIw/o4016.02.065536100PBS4011.12.021940PAA[8]2011.51.828961PAA[40]2013.02.281929C8-PAA[8]2015.21.83764156C8-PAA[40]2011.42.927021C8-PAA[8]2013.82.21426319C8-PAA[40]2014.72.02661638C8-PAA[8]2015.61.64966775C8-PAA[40]2013.73.01330818實(shí)驗(yàn)IIIw/o4016.21.075281100PBS4010.41.913510PAA[8]2012.62.262088PAA[24]2014.81.22852637C8-PAA[8]2015.41.74323757C8-PAA[8]2014.61.42483432C8-PAA[24]2015.90.86114781C8-PAA[8]2016.00.66553687C8-PAA[8]2015.51.44634161C8-PAA[24]2015.90.86114781C8-PAA[8]2016.10.67024093C8-PAA[24]2016.22.475281100C8-PAA[8]2013.31.71008612</table>n＝每組母雞數(shù)SEM＝平均值的標(biāo)準(zhǔn)偏差(平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤)*＝C4叔陰性和陽(yáng)性對(duì)照組的動(dòng)物在四個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)中有重現(xiàn)的抗體滴度。作為所用的PAA劑量的函數(shù)，未經(jīng)修飾的PAA的增加百分?jǐn)?shù)是4-37％。所有烷基-PAA引發(fā)的反應(yīng)比未經(jīng)修飾的PAA的反應(yīng)高。烷基-PAA引發(fā)的反應(yīng)的數(shù)量根據(jù)所用的烷基鏈的類型和PAA的酯化程度而異。對(duì)于丁基-PAA，觀察到佐劑的劑量和體液反應(yīng)之間有密切的關(guān)系(實(shí)驗(yàn)IV)，而對(duì)于辛基-PAA，40毫克/毫升劑量的反應(yīng)并不總是比低劑量的反應(yīng)高，這表明，辛基-PAA的最佳用量為24-40毫克/毫升。用病毒中和(VN)試驗(yàn)評(píng)價(jià)的抗體的生物功能，結(jié)果顯示ELISA試驗(yàn)和VN試驗(yàn)之間有密切的相關(guān)關(guān)系。實(shí)施例5對(duì)小鼠進(jìn)行PAA佐劑的試驗(yàn)。用25微升包括1體積抗原溶液和1體積佐劑的疫苗對(duì)每組6只小鼠的幾組小鼠進(jìn)行接種，每毫升抗原溶液由10微克滅活的流感病毒(MRC-11株)和1毫克卵白蛋白(OVA)(SIGMA，美國(guó))組成。注射后三周用如實(shí)施例1所述的間接的ELISA法測(cè)定抗體滴度。鼠的血清在5％脫脂奶的PBS溶液(PBS/SKM)預(yù)稀釋。在96孔板上，用相同的溶液將血清樣本兩倍稀釋成-系列溶液，將板在37℃下培養(yǎng)1-2小時(shí)。加入由山羊產(chǎn)生并經(jīng)與過(guò)氧化物酶偶合的抗小鼠IgG的抗體在PBS/BSA中的1/300稀釋液，將板在37℃下培養(yǎng)1-2小時(shí)。用ABTS+H2O2的底物溶液(Kirkegaard&amp;PerryLabs.，美國(guó))定量板上的過(guò)氧化物酶的量，用multiscanTitertek在405nm處測(cè)量吸光度。這些實(shí)驗(yàn)的結(jié)果如表V所示。表V給小鼠使用烷基-PAA的佐劑</tables>n＝每組母雞(病人，小鼠)的數(shù)目SEM＝平均值的標(biāo)準(zhǔn)偏離(平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤)在小鼠中只是部分證實(shí)了通過(guò)加入脂族鏈可增加PAA的佐劑功能，因?yàn)?個(gè)獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生了不同的效果。實(shí)施例6除了佐劑功能之外，其它性質(zhì)在評(píng)價(jià)疫苗中也是重要的這包括局部反應(yīng)，這也是重要的方面，雖然一般來(lái)說(shuō)一些動(dòng)物種類可接受注射部位的一定水平的反應(yīng)。通過(guò)將疫苗注入小鼠爪墊后監(jiān)測(cè)小鼠爪的腫脹試驗(yàn)了體內(nèi)的局部毒性。現(xiàn)已顯示該方法極為敏感。將25微升+/-5微升含1體積佐劑的疫苗(皮下)注入每組6個(gè)小鼠的左后足內(nèi)，該佐劑已被在每毫升0.9％(w/v)NaCl中含10微克MRC-11和1mg卵白蛋白的抗原溶液1體積稀釋。用荷蘭的StateUniversityofUtrecht特別為本目的設(shè)計(jì)的半電子設(shè)備在注射前一天和注射后不同的間隔時(shí)間測(cè)量爪的厚度。現(xiàn)顯示該設(shè)備的準(zhǔn)確性幾乎接近0.02mm。通過(guò)得到的處理前后爪的厚度差別來(lái)計(jì)算爪的腫脹，以0.01mm表示。這些實(shí)驗(yàn)的結(jié)果如表VI所示。表VI小鼠中PAA和烷基-PAA的反應(yīng)性實(shí)驗(yàn)I</tables>實(shí)驗(yàn)IIPAA對(duì)小鼠僅有中度局部毒性；在數(shù)天后小鼠爪的腫脹達(dá)到最大，然后在2或3周后逐漸減少。給PAA加上烷基鏈增加了局部反應(yīng)，但根據(jù)注射量在2-5周后消失。辛基的局部反應(yīng)比丁基的強(qiáng)?？深惐鹊氖牵⑸浠谟秃退淖魟┊a(chǎn)生的腫脹更厲害，它要持續(xù)8周以上。權(quán)利要求1.一種疫苗用佐劑，包括一種具有陰離子組成重復(fù)單元和疏水性組成重復(fù)單元的聚合物的水溶液。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的佐劑，其特征在于形成陰離子組成重復(fù)單元的單體單元選自丙烯酸、甲基丙烯酸、馬來(lái)酸、富馬酸、亞乙基二磺酸、乙烯基硫酸、苯乙烯磺酸、乙烯基苯基硫酸、2-甲基丙烯酰氧基乙烷磺酸、3-甲基丙烯酰氧基-2-羥基丙烷磺酸、2-丙烯酰-2-甲基丙烷磺酸、3-丙烯酰胺基-3-甲基丁酸、3-甲基丙烯酰胺基-3-甲基丁酸、乙烯基磷酸、4-乙烯基苯甲酸、3-乙烯基氧基丙烷-1-磺酸和N-乙烯基丁二亞胺酸。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的佐劑，其特征在于形成陰離子組成重復(fù)單元的單體單元選自丙烯酸、甲基丙烯酸、馬來(lái)酸、富馬酸、亞乙基二磺酸、乙烯基硫酸和苯乙烯磺酸。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的佐劑，其特征在于形成陰離子組成重復(fù)單元的單體單元選自丙烯酸、甲基丙烯酸、馬來(lái)酸和富馬酸。5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的佐劑，其特征在于形成陰離子組成重復(fù)單元的單體單元是丙烯酸單元。6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的佐劑，其特征在于形成疏水性組成重復(fù)單元的單體單元選自丙烯酸、甲基丙烯酸、馬來(lái)酸、富馬酸、亞乙基二磺酸、乙烯基硫酸、苯乙烯磺酸、乙烯基苯基硫酸、3-甲基丙烯酰氧基-2-羥基丙烷磺酸、2-甲基丙烯酰氧基乙烷磺酸、2-丙烯基-2-甲基丙烷磺酸、3-丙烯酰胺基-3-甲基丁酸、3-甲基丙烯酰胺基-3-甲基丁酸、乙烯基磷酸、4-乙烯基苯甲酸、3-乙烯基氧基丙烷-1-磺酸或N-乙烯基丁二亞胺酸的烷基酯、環(huán)烷基酯和羥基烷基酯和醚類。7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的佐劑，其特征在于形成疏水性組成重復(fù)單元的單體單元選自丙烯酸、甲基丙烯酸、馬來(lái)酸、富馬酸、亞乙基二磺酸、乙烯基硫酸或苯乙烯磺酸的烷基酯。8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的佐劑，其特征在于形成疏水性組成重復(fù)單元的單體單元選自丙烯酸、甲基丙烯酸、馬來(lái)酸或富馬酸的烷基酯，其中烷基含4-8個(gè)碳原子。9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的佐劑，其特征在于形成疏水性組成重復(fù)單元的單體單元選自丙烯酸的線型烷基酯，其中烷基含4-8個(gè)碳原子。10.根據(jù)權(quán)利要求1-9之一所述的佐劑，其特征在于疏水性組成重復(fù)單元與陰離子組成重復(fù)單元的摩爾比為0.05-1.00。11.根據(jù)權(quán)利要求1-10之一所述的佐劑，其特征在于疏水構(gòu)成重復(fù)單元與陰離子構(gòu)成重復(fù)單元的摩爾比為0.10-0.40。12.根據(jù)權(quán)利要求1所述的佐劑，其特征在于，聚合物的分子量為10-10,000千道爾頓。13.根據(jù)權(quán)利要求1-12之一所述的佐劑，其特征在于液體介質(zhì)是水性溶液、懸浮液或乳劑。14.根據(jù)權(quán)利要求1-13之一所述的佐劑，其特征在于聚合物是水溶性的。15.一種疫苗，包括致免疫的量的抗原和前述權(quán)利要求之一所述的佐劑。16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的疫苗，其特征在于佐劑的濃度為1-40mg/ml，較好的是4-24mg/ml。17.根據(jù)權(quán)利要求15所述的疫苗，其特征在于除了佐劑外，它還包括滅活的新城疫病毒(NDV)和/或傳染性支氣管炎病毒(IBV)供家畜接種。18.具有疏水性組成重復(fù)單元和陰離子組成重復(fù)單元的聚合物在疫苗中用作佐劑的應(yīng)用。19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的應(yīng)用，其特征在于聚合物具有如權(quán)利要求2-5所述的疏水性組成重復(fù)單元，和如權(quán)利要求6-9所述的陰離子組成重復(fù)單元。20.一種制備溶液型疫苗的方法，其特征在于使抗原水性混合物和一種具有疏水性組成重復(fù)單元和陰離子組成重復(fù)單元的聚合物進(jìn)行混合。全文摘要一種疫苗佐劑,包括具有陰離子組成重復(fù)單元和疏水性組成重復(fù)單元的聚合物的一種液體介質(zhì)。有利的是,所述的佐劑是部分酯化的聚丙烯酸的水溶液。新穎的佐劑極為穩(wěn)定、有效,且局部毒性相對(duì)較低。此外,本發(fā)明也揭示了包括這類佐劑的疫苗和制備這類佐劑的方法。文檔編號(hào)A61K39/39GK1171053SQ95197100公開(kāi)日1998年1月21日申請(qǐng)日期1995年12月21日優(yōu)先權(quán)日1994年12月27日發(fā)明者L·希爾格斯,M·斯特雷貝爾申請(qǐng)人:迪米那科股份有限公司