專利名稱：：多核苷酸組合物的制作方法本申請是美國申請08/342,209(1994年11月18日提出申請，標(biāo)題是“多核苷酸組合物”)的部分繼續(xù)，該文獻(xiàn)在此引入作為參考。本發(fā)明涉及多核酸聚合物的組合物，諸如RNA或DNA聚合物和通過共價鍵或非共價鍵與烷基醚的嵌段共聚物連接的聚陽離子。在一個優(yōu)選的實施方案中，將多核酸與一種聚陽離子復(fù)合。通過復(fù)合使多核酸保持穩(wěn)定，并且多核酸(在復(fù)合物中)增加了通過細(xì)胞膜的滲透性。因此，這種復(fù)合物非常適于用作將核酸輸送入細(xì)胞的載體。利用“反義”多核酸治療遺傳疾病、細(xì)胞突變(包括引起或增加突變的癌癥)和病毒感染已經(jīng)得到了普遍關(guān)注。人們認(rèn)為這種治療手段通過以下方式起作用，一方面，通過結(jié)合編碼一種蛋白質(zhì)(人們認(rèn)為它與導(dǎo)致試圖治療的疾病有關(guān))的mRNA的“有義”鏈，從而終止或抑制mRNA翻譯成不需要的蛋白質(zhì)；另一方面(例如)，用反義多核苷酸靶向結(jié)合基因組DNA(形成三股螺旋)來抑制轉(zhuǎn)錄，見Helene，《抗癌藥設(shè)計》，6569(1991)。一旦已知所試圖結(jié)合的mRNA的序列，那么根據(jù)Watson-Crick堿基配對原則，就可以將反義分子用于結(jié)合有義鏈，從而形成一種類似于雙螺旋DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)(基因調(diào)節(jié)《反義RNA和DNA生物學(xué)》，Erikson和Ixzant編，Raven出版社，紐約，1991；Helene，《抗癌藥設(shè)計》，6569(1991)；Crooke，《抗癌藥設(shè)計》，6609(1991))。充分利用這一技術(shù)的一個嚴(yán)重障礙是以下這個難題，即將足量的反義分子有效地引入細(xì)胞，從而有效地干擾靶向mRNA的翻譯或DNA的功能。已經(jīng)應(yīng)用于克服這一難題的一種方法是用疏水取代基以共價鍵方式修飾反義多核酸分子的5′或3′末端。這些修飾的核酸一般可以高效率地進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部，見，例如，Kabanov等，F(xiàn)EBSLett.，259327(1990)；Boutorin等，F(xiàn)EBSLett.，231382-1390，1989；Shea等，《核酸研究》，183777-3783，1990。此外，已將反義分子的磷酸主鏈進(jìn)行修飾以去除負(fù)電荷(見，例如，Agris等，《生物化學(xué)》，256268(1986)；Cazenave和Helene，《反義核酸和蛋白質(zhì)原理和應(yīng)用》，Mol和Vanderkrol編，47頁后，MarcelDekker，紐約，1991)或?qū)⑧堰驶蜞奏A基進(jìn)行修飾(見，例如，《反義核酸和蛋白質(zhì)原理和應(yīng)用》，，Mol和Vanderkrol編，47頁后，MarcelDekker，紐約，1991；Millingan等，《腫瘤疾病的基因治療》，Huber和Laso編，228頁后，紐約科學(xué)院，紐約，1994)。其它用來克服細(xì)胞穿透障礙的嘗試包括將反義多核酸序列引入一種能夠以低拷貝數(shù)插入細(xì)胞的表達(dá)載體中，但如果這種表達(dá)載體在細(xì)胞中可以指導(dǎo)細(xì)胞機(jī)制合成更多基本量的反義多核分子。見，例如，F(xiàn)arhood等.，Ann，紐約科學(xué)院，71623(1994)。這種方法包括使用具有引入反義序列的一種表達(dá)位點(diǎn)的重組病毒，見，例如，Boris-Lawrie和Temin，Ann，紐約科學(xué)院，71659(1994)。其它的方法是通過用聚陽離子中和反義分子或其它核酸分子上的負(fù)電荷來增加膜的滲透性，見，例如，Kabanov等，《蘇聯(lián)科學(xué)綜述》，11卷第2部分，1992；Kabanov等，《生物共軛化學(xué)》4448(1993)；Wu和Wu，《生物化學(xué)》27887-892，1988；Behr等，《美國國家科學(xué)院學(xué)報》866982-6986，1989。當(dāng)然，反義多核酸分子不是可用于更好地穿透細(xì)胞膜的唯一類型的多核酸分子。為了制備重組蛋白質(zhì)表達(dá)系統(tǒng)，必須將指導(dǎo)表達(dá)的核酸轉(zhuǎn)運(yùn)通過膜并進(jìn)入將產(chǎn)生所需蛋白質(zhì)的真核或原核細(xì)胞中。對于基因療法來說，醫(yī)務(wù)工作者設(shè)法將一種DNA載體引入一種或多種細(xì)胞型的生物體中，所述的DNA載體能夠指導(dǎo)細(xì)胞中缺少的蛋白質(zhì)的合成并將它用于大量表達(dá)時的細(xì)胞或生物體。將引入DNA而導(dǎo)致細(xì)胞產(chǎn)生一種新蛋白質(zhì)、核酶或大量蛋白質(zhì)或核酶的方法稱作“轉(zhuǎn)染”法。(一般地參閱，《腫瘤疾病》，Huber和Lazo編，紐約科學(xué)院，紐約，1994；Feigner，《藥物釋放綜述報告》，5163(1990)；McLachlin等，《分子生物學(xué)的核酸研究進(jìn)展》3891(1990)；Karlsson，S.B1ood，782481(1991)；Einerhand和Valerio，Curr.Top.Microbiol.Immunol.，177217-235(1992)；Makdisi等，《肝臟疾病的研究進(jìn)展》，101(1992)；Litzinger和Huang，《生物化學(xué)生物物理學(xué)進(jìn)展》，1113201(1992)；Morsy等，J.A.M.A.2702338(1993)；Dorudi等，《英國外科雜志》，80566(1993)。大量上述討論的用反義多核酸增加細(xì)胞透入的方法一般是將各種多核酸引入細(xì)胞的可應(yīng)用方法。其它的常規(guī)方法包括多核酸的磷酸鈣沉淀和用靶細(xì)胞培養(yǎng)法(Graham和VanderEb，《病毒學(xué)》，52456，1983)，多核酸、DEAE葡聚糖和細(xì)胞的共培養(yǎng)法(Sompayrac和Danna，《國家科學(xué)院學(xué)報》127575，1981)，在有多核酸的情況下細(xì)胞的電穿孔法(Potter等，《(國家科學(xué)院學(xué)報》，817161-7165，1984)，將核酸引入病毒包被以產(chǎn)生轉(zhuǎn)染載體的方法(Giman等，《美國國家科學(xué)院學(xué)報》，827309-7313，1985)和用引入脂質(zhì)體的多核酸培養(yǎng)細(xì)胞的方法(Wang和Huang，《美國科學(xué)院學(xué)報》，847851-7855，1987)。將多核酸送入細(xì)胞中的另一個難題是多核酸(特別是核糖核酸)對核酸酶活性的極端敏感性。這一難題特別與將核糖核酸用作反義寡核苷酸的嘗試有關(guān)。因此，我們需要保護(hù)多核酸免受核酸酶活性干擾的方法。發(fā)明概述本發(fā)明參照由Hansch和Leo建立的片段常數(shù)進(jìn)行如下描述(見Hansch和Leo，《化學(xué)和生物學(xué)中用于相關(guān)分析的取代基常數(shù)》，Wiley，紐約，pp320～325)。建立這些常數(shù)是用來估計分子的一部分在由辛醇-水混合物形成的相間出現(xiàn)分子分配傾向中的情況。一般將這些常數(shù)稱作Hansch-Leo片段分配常數(shù)(下文稱“Hansch-Leo片段常數(shù)”)。在第一實施方案中，本發(fā)明涉及一種多核苷酸組合物，它包括(a)一種多核苷酸或衍生物；和(b)一種含有A型片段和B型片段的聚醚嵌段共聚物，其中A型片段含有一種相對親水性的線性聚合片段，它的重復(fù)單元具有的平均Hansch-Leo片段常數(shù)是約小于或等于-0.4且具有的分子量在約30和約500之間，其中B型片段含有一種相對疏水性的線性聚合片段，它的重復(fù)單元具有的平均Hansch-Leo片段常數(shù)是約大于或等于-0.4且具有的分子量在約30和約500之間，其中至少約80％的鍵用來連接各個含有醚鍵的聚合片段的重復(fù)單元。在優(yōu)選的第一實施方案中，聚醚嵌段共聚物選自以下通式的聚合物A-B-A′，A-B，-B-A-B′，或L(R1)(R2)(R3)(R4)(I)(II)(III)(IV)其中A和A′是A型線性聚合片段，B和B′是B型線性聚合片段，且R1，R2，R3和R4是通式(I)、(II)或(III)的嵌段共聚物或氫，且L是一種連接基團(tuán)，條件是R1、R2、R3或R4中不超過兩個是氫。在另一個優(yōu)選的本發(fā)明的第一實施方案中，多核苷酸組合物進(jìn)一步包含一種含有許多陽離子重復(fù)單元的聚陽離子聚合物。該組合物提供了一種將多核苷酸引入細(xì)胞的有效載體。因此，本發(fā)明還涉及一種利用本發(fā)明第一實施方案的多核苷酸組合物將多核酸插入細(xì)胞的方法。在第二實施方案中，本發(fā)明提供了一種多核苷酸組合物，它包括(a)一種多核苷酸或衍生物；(b)一種具有聚醚片段和聚陽離子片段的嵌段共聚物，其中聚醚片段包含至少一種A型嵌段，且聚陽離子片段包含許多陽離子重復(fù)單元。在一個優(yōu)選的實施方案中，嵌段共聚物進(jìn)一步包含一種B型嵌段。在另一個優(yōu)選的第二實施方案中，共聚物包含一種以下通式的聚合物B-A-R，A-R，A-R-A′，和R-A-R′，(V-a)(VI-a)(VII)(VIII-a)A-B-R，A-R-B，R-A-B(V-b)(VI-b)(VIII-b)其中A，A′和B如上所述，其中R和R′是含有許多陽離子重復(fù)單元的聚合片段，其中在片段中的每種陽離子重復(fù)單元可以與片段中的另一種單元相同或不同?？梢詫⒃搶嵤┓桨傅木酆衔锓Q作“聚醚/聚陽離子”聚合物。可以將R和R′嵌段稱作“R型”聚合片段或嵌段。第二實施方案的多核苷酸組合物提供了一種將多核苷酸引入細(xì)胞的有效載體。因此，本發(fā)明還涉及利用本發(fā)明第二實施方案的組合物將多核酸插入細(xì)胞的一種方法。在第三實施方案中，本發(fā)明提供了一種包含多核苷酸衍生物的多核苷酸組合物，所述的多核苷酸衍生物包含一種多核苷酸片段和一種連接多核苷酸5′和3′末端之一或同時連接兩者的聚醚片段，其中聚醚片段含有一種A型聚醚片段。在一個優(yōu)選的第三實施方案中，衍生物包含至少三種嵌段，它們中的至少兩種是A型或B型嵌段。在另一個優(yōu)選的第三實施方案中，衍生物包含以下通式的嵌段共聚物A-pN，pN-A，A-pN-A′，pN-A-B，B-A-pN(IX-a)(X-a)(XI)(XII)(XIII)A-pN-R，R-A-pN，A-R-pN，pN-A-R，R-pN-A，pN-R-A(IX-b)(IX-c)(IX-d)(X-b)(X-c)(X-d)pN-A-B-A′，A-B-A′-pN，pN-B-A′-B′，B-A′-B′-pN(X-e)(X-f)(x-g)(X-h)pN-A-B-A′-pN，pN-B-A′-B′-pN(X-i)(x-j)其中pN代表一種具有5′和3′方向的多核苷酸，且A、A′、B和B′是如上所述的聚醚片段。在另一個優(yōu)選的第三實施方案中，多核苷酸復(fù)合物包含一種聚陽離子聚合物。還可以將通式(I)、(II)、(III)或(IV)的聚合物相互混合或可以將它們另外或可選地與一種或多種通式(V-a或b)，(VI-a或b)，(VII-a或b)和(VIII-a或b)的聚合物混合和/或與通式(IX-a，b，c或d)，(X-a，b，c或d)，(XI)，(XII)或(XIII)的多核苷酸衍生物混合，從而提供一種將多核酸送入細(xì)胞內(nèi)部的高效載體。第三實施方案的多核苷酸組合物提供了一種將多核苷酸送入細(xì)胞的高效載體。相應(yīng)地，本發(fā)明還涉及一種利用本發(fā)明第三實施方案的組合物將多核酸插入細(xì)胞的方法。在一個優(yōu)選的第三實施方案中，本發(fā)明提供了一種多核苷酸衍生物，它含有一種多核苷酸片段，一種R型片段和A型和B型片段中的至少一種。本發(fā)明的第四實施方案涉及一種聚醚-聚陽離子共聚物，它包含一種聚合物，一種聚醚片段和一種含有許多通式為-NH-Ro的陽離子重復(fù)單元的聚陽離子片段，其中Ro是一種2至6個碳原子的直鏈脂族基團(tuán)，它可以被取代，其中所述的聚醚片段包括A型或B型片段中的至少一種。在一個優(yōu)選的第四實施方案中，聚陽離子聚合物包含一種根據(jù)以下通式的聚合物B-A-R，A-R，A-R-A′，和R-A-R′，(V)(VI)(VII)(VIII)其中A、A′是B如上所述，其中R和R′是含有許多通式為-NH-Ro-的陽離子重復(fù)單元的聚合片段，其中Ro是具有2至6個碳原子的直鏈脂族基團(tuán)，它可以被取代。R型片段中的每個-NH-Ro-重復(fù)單元可以與片段中的另一個-NH-Ro-重復(fù)單元相同或不同。優(yōu)選的第四實施方案進(jìn)一步包含一種多核苷酸或衍生物。在第五實施方案中，本發(fā)明提供了一種含有許多以下通式的重復(fù)單元的聚陽離子聚合物其中R8是(1)-(CH2)n-CH(R13)-，其中n是從0至約5的整數(shù)，R13是氫，具有3-8個碳原子的環(huán)烷基，具有1-6個碳原子的烷基，或(CH2)mR14，其中m是從0至約12的整數(shù)且R14是一種6至20個碳原子的親脂取代基；(2)一種具有3-8個環(huán)碳原子的碳環(huán)基團(tuán)，其中基團(tuán)可以是，例如，環(huán)烷基或芳香基，且它可以包含具有1-6個碳原子的烷基，具有1-6個碳原子的烷氧基，具有1-6個碳原子的烷基氨基，二烷基氨基，其中每個烷基都獨(dú)立地具有1-6個碳原子、氨基、磺?；⒘u基、羧基、氟或氯取代基；或(3)一種具有3-8個環(huán)原子的雜環(huán)基，它可以包括雜環(huán)烷基或芳香雜環(huán)基，它可以包含1至4個雜原子，它們選自氧、氮、硫和其混合物，且它可以包含具有1-6個碳原子的烷基，具有1-6個碳原子的烷氧基，具有1-6個碳原子的烷基氨基，二烷基氨基，其中每個烷基都獨(dú)立地具有1-6個碳原子、氨基、磺?；?、羥基、羧基、氟或氯取代基。R9是一種1至12個碳原子的直鏈脂族基團(tuán)，且R10、R11和R12獨(dú)立地是氫，一種1-4個碳原子的烷基。R9優(yōu)選地含有2-10個碳原子，更優(yōu)選3-8個碳原子。R14優(yōu)選地包含一種嵌入基團(tuán)，它優(yōu)選地是一種吖啶或溴乙錠。聚合物中這樣的重復(fù)單元數(shù)優(yōu)選在約3和50之間，更優(yōu)選在約5和20之間?？梢詫⑦@種聚合物結(jié)構(gòu)引入本發(fā)明其它的實施方案中作為一種R型片段或聚陽離子聚合物。可以用一種脂質(zhì)取代基來修飾這種聚合物的末端。如下所述，用于合成該實施方案聚合物的單體適合用作送入DNA合成儀的單體。所以，能夠非常特異性地合成這種聚合物。此外，使用先進(jìn)的用于多核苷酸合成的自動儀，可以額外摻入多核苷酸序列、聚醚嵌段和親脂取代基。第五實施方案還包括合成一種聚陽離子聚合物的方法。發(fā)明詳述與本申請的母申請同時提出的是一個名稱為“連接生物制劑的聚合物”的申請(序列號是08/342,079，1994年11月18日提交，發(fā)明人是AlexanderVictorovichKabanov和ValeryYulievichAlakhov)。與本申請同時提出的是案號313257-101A的申請，它是序列號為08/342,089的專利申請的部分繼續(xù)。將08/342,079的全部內(nèi)容和它的部分繼續(xù)(案號313257-101A)引入本文作為參考。通式(I)-(XIII)的親水(A型)嵌段或疏水(B型)嵌段的聚合度優(yōu)選在約5和約400之間。更優(yōu)選的是，聚合度在約5和約200之間，更優(yōu)選的是，聚合度在約5和約80之間。R型聚陽離子嵌段的聚合度優(yōu)選在約2和約300之間，更優(yōu)選的是，聚合度在約5和約180之間，更優(yōu)選的是，聚合度在約5和約60之間。聚陽離子聚合物的聚合度優(yōu)選在約10和約10000之間，更優(yōu)選的是，聚合度在約10和約1000之間，更優(yōu)選的是，聚合度在約10和約100之間。含有嵌段(對于A型、B型和R型嵌段來說)的重復(fù)單元一般具有的分子量在約30和約500之間，優(yōu)選在約30和約100之間，更優(yōu)選在約30和約60之間。一般來說，在每一A型或B型嵌段中，重復(fù)單元之間至少約80％的鍵是醚鍵，優(yōu)選的是，至少約90％的鍵是醚鍵，更優(yōu)選的是，至少約95％的鍵是醚鍵。對于本申請的目的來說，醚鍵包括配糖鍵(即糖鍵)。然而，一方面，優(yōu)選簡單的醚鍵。優(yōu)選的是，所有含A型嵌段的重復(fù)單元具有的Hansch-Leo片段常數(shù)小于約-0.4，更優(yōu)選小于約-0.5，更優(yōu)選小于約-0.7。另一種優(yōu)選的情況是，所有含B型嵌段的重復(fù)單元具有的Hansch-Leo片段常數(shù)是約大于或等于-0.30，更優(yōu)選約大于或等于-0.20。通式(IX)至(XIII)的多核苷酸組分(pN)優(yōu)選含有約5至約1,000,000個堿基，更優(yōu)選含有約5至約100,000個堿基，更優(yōu)選含有約10至約10,000個堿基。在生理pH時，聚陽離子聚合物和R型嵌段具有幾個陽離子基團(tuán)和一個凈正電荷。還可以將通式(V)-(VIII)的聚醚/聚陽離子聚合物用作聚陽離子聚合物。優(yōu)選的是，在生理pH值時，聚陽離子聚合物和R型嵌段帶有至少約3個正電荷，更優(yōu)選帶有至少約6個正電荷，更優(yōu)選帶有至少約12個正電荷。同樣優(yōu)選的是，在生理pH時，帶正電荷的聚合物或嵌段具有的電荷間距是約3至約10。最優(yōu)選的是由氨基丙烯重復(fù)單元或由氨基丙烯和氨基丁烯重復(fù)單元的混合物形成的間距。因此，例如，優(yōu)選的是應(yīng)用一種(NHCH2CH2CH2)重復(fù)單元的聚陽離子片段，或一種(NHCH2CH2CH2)和(NHCH2CH2CH2)重復(fù)單元的混合物的聚陽離子片段。同樣優(yōu)選的是含有-NH-Ro-重復(fù)單元的通式(V)-(VIII)的聚醚/聚陽離子聚合物。Ro優(yōu)選亞乙基、亞丙基、亞丁基或亞戊基(pentylene)，它可以被修飾。在一個優(yōu)選的實施方案中，在重復(fù)單元中的至少一種中，Ro包含一種諸如溴乙錠這樣的DNA嵌入基團(tuán)。這樣的嵌入基團(tuán)能夠增加聚合物對核酸的親合力。Ro上優(yōu)選的取代基包括1-6個碳的烷基、羥基、羥烷基(其中烷基具有1-6個碳原子)、具有1-6個碳原子的烷氧基、具有2-7個碳原子的烷基羰基、烷氧基羰基(其中烷氧基具有1-6個碳原子)、烷氧基羰基烷基(其中烷氧基和烷基各自獨(dú)立地具有1-6個碳原子)、烷基羧基烷基(其中各烷基具有1-6個碳原子)、氨基烷基(其中烷基具有1-6個碳原子)、烷基氨基或二烷基氨基(其中烷基各自獨(dú)立地具有1-6個碳原子)、單或二烷基氨基烷基(其中烷基各自獨(dú)立地具有1-6個碳原子)、氯、氯代烷基(其中烷基具有1-6個碳原子)、氟、氟代烷基(其中烷基具有1-6個碳原子)、氰基、或氰烷基(其中烷基具有1-6個碳原子或一個羧基)。更優(yōu)選的是，Ro是亞丙基或亞丁基。以具有下列通式的嵌段共聚物來例示本發(fā)明第一實施方案的聚合物或或，或，其中x，y，z，i和j的值是約5至約400，優(yōu)選約5至約200，更優(yōu)選約5至約80，且其中對于每個R1、R2對來說，一個是氫且另一個是甲基。通式(XIV)至(XVI)過于簡化，實際上，B嵌段中異丙烯基的方向是任意的。將這種任意的方向用通式(XVII)表示是更完整的。這類聚(氧乙烯)-聚(氧丙烯)化合物已經(jīng)由Santon在《美國香料化妝品》72(4)54-58(1958)；Schmolka在上述引文82(7)25-30(1967)；《非離子表面活性劑》，Schick編輯(Dekker，NY，1967)；300-371頁中進(jìn)行了描述。許多這類的化合物以諸如“Poloxamers”，“pluronics”和“synperonics”這樣的商品名稱大批供應(yīng)。通常將B-A-B通式中的pluronic聚合物稱作“反向”pluronics，“pluronicR”或“meroxapl”。通式(XVII)的“聚乙二胺”(polyoxamine)聚合物由BASF(Wyandotte，M1)提供，商品名是TetronicTM。可以將通式(XVII)中所代表的聚氧乙烯和聚氧丙烯的次序顛倒，從而產(chǎn)生TetronicRTM(也由BASF提供)。見Schmolka，《美國油類協(xié)會雜志》，59110(1979)。還可以將聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段共聚物設(shè)計成帶有含任意混合的環(huán)氧乙烷和氧化丙烯重復(fù)單元的親水嵌段。為了保持這種嵌段的親水特性，環(huán)氧乙烷將起主要作用。同樣，疏水嵌段可以是一種環(huán)氧乙烷和氧化丙烯重復(fù)單元的混合物。這類嵌段共聚物由BASF提供，商品名是PluradotTM。通式(XVII)的以二胺連接的pluronic還可以是以下通式的以二胺連接的聚氧乙烯-聚氧丙烯聚合物族中的組成部分其中虛線代表延伸出第二個氮的聚醚的對稱拷貝，R*是2至6個碳的亞烷基，5至8個碳的環(huán)亞烷基或亞苯基，對于R1和R2來說，(a)兩者都是氫或(b)一個是氫且另一個是甲基，對于R3和R4來說，(a)兩者都是氫或(b)一個是氫且另一個是甲基，如果R3和R4兩者都是氫，那么R5和R6中的一個是氫且另一個是甲基，且如果R3和R4中的一個是甲基，那么R5和R6兩者都是氫。根據(jù)本文中的討論，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將認(rèn)識到，如果將本發(fā)明的實際應(yīng)用限制在(例如)聚(氧化乙烯)-聚(氧化丙烯)的化合物，那么上述典型的通式則太受限制。一個重要特征是A型嵌段中單體的平均Hansch-Leo片段常數(shù)是約小于或等于-0.4。所以，組成一級嵌段的單元不需單獨(dú)由環(huán)氧乙烷組成。同樣，不是所有的B型嵌段都需單獨(dú)由氧化丙烯單元組成。而只要保持第一個實施方案的參數(shù)，嵌段就能夠結(jié)合除通式(XIV)-(XVII)中定義的物質(zhì)以外的單體。因此，在最簡單的實例中，用一種如前所述的側(cè)鏈基團(tuán)可以取代嵌段A中的至少一種單體。另一方面，本發(fā)明涉及一種含有通式(I)-(XIII)中至少一種的嵌段共聚物的多核苷酸復(fù)合物，其中A型和B型嵌段基本上由通式-O-R5的重復(fù)單元組成，其中R5是(1)-(CH2)n-CH(R6)-，其中n是從0至約5的整數(shù)且R6是氫、具有3-8個碳原子的環(huán)烷基、具有1-6個碳原子的烷基、苯基、烷基苯基(其中烷基具有1-6個碳原子)、羥基、羥烷基(其中烷基具有1-6個碳原子)、具有1-6個碳原子的烷氧基、具有2-7個碳原子的烷基羰基、烷氧基羰基(其中烷氧基具有1-6個碳原子)、烷氧基羰基烷基(其中每個烷氧基和烷基都獨(dú)立地具有1-6個碳原子)、烷基羧基烷基(其中每個烷基都具有1-6個碳原子)、氨基烷基(其中烷基具有1-6個碳原子)、烷基胺或二烷基氨基(其中每個烷基都獨(dú)立地具有1-6個碳原子)、單或二烷基氨基烷基(其中每個烷基都獨(dú)立地具有1-6個碳原子)、氯、氯代烷基(其中烷基具有1-6個碳原子)、氟、氟代烷基(其中烷基具有1-6個碳原子)、氰基或氰烷基(其中烷基具有1-6個碳原子或羧基)；(2)一種具有3-8個環(huán)碳原子的碳環(huán)基，其中基團(tuán)可以是，例如，環(huán)烷基或芳香基，且基團(tuán)可以包括具有1-6個碳原子的烷基、具有1-6個碳原子的烷氧基、具有1-6個碳原子的烷基氨基、二烷基氨基(其中每個烷基都獨(dú)立地具有1-6個碳原子)、氨基、磺?；?、羥基、羧基、氟或氯的取代基，或(3)一種具有3-8個環(huán)原子的雜環(huán)基，它可以包括雜環(huán)烷基或芳香雜環(huán)基，可以包括1至4個雜原子，它們選自氧、氮、硫和其混合物，且它可以包括具有1-6個碳原子的烷基、具有1-6個碳原子的烷氧基、具有1-6個碳原子的烷基氨基、二烷基氨基(其中每個烷基都獨(dú)立地具有1-6個碳原子)、氨基、磺?；⒘u基、羧基、氟或氯的取代基。優(yōu)選的是，n是從1至3的整數(shù)。含有R5的碳環(huán)或雜環(huán)基優(yōu)選具有4-7個環(huán)原子，更優(yōu)選5-6個環(huán)原子。雜環(huán)優(yōu)選包括1-2個雜原子，更優(yōu)選雜環(huán)具有一個雜原子。另外優(yōu)選的是，雜環(huán)是一種碳水化合物或碳水化合物的類似物。普通技術(shù)人員將認(rèn)識到制備這些聚合物所需的單體是從合成獲得的。在有些情況中，正如本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所認(rèn)識到的，單體的聚合需要應(yīng)用合適的保護(hù)基團(tuán)。一般來說，A型和B型嵌段有至少約80％由-OR5-組成的重復(fù)單元，更優(yōu)選至少是約90％，更優(yōu)選至少是約95％。另一方面，本發(fā)明涉及一種含有通式(I)-(XIII)之一的嵌段共聚物的多核苷酸復(fù)合物，其中A型和B型嵌段基本上由通式-O-R7-的重復(fù)單元組成，其中R7是C1至C6的烷基。對于一個有機(jī)分子來說，用下列公式計算辛醇一水分配系數(shù)(P)的Hansch-Leo近似值LogP＝∑anfn+∑bmFm其中fn值是分子中不同基團(tuán)的片段常數(shù)，an值是分子中任何類基團(tuán)的數(shù)量，對于某些諸如單鍵或雙鍵這樣的分子特征來說，F(xiàn)m值是因子，且bm值是任何這樣的分子特征數(shù)。例如，環(huán)氧乙烷重復(fù)單元(-CH2CH2O-)的Hansch-Leo片段常數(shù)是2fC+4fH+fO+(4-1)Fb＝2(0.20)+4(0.23)+(-1.82)+3(-0.12)＝-0.86氧化丙烯(-CH2CHCH3)O-)重復(fù)單元的Hansch-Leo片段常數(shù)是2fC+fCH3+3fH+fO+(4-1)Fb=2(0.2)+0.89+3(0.23)+(-1.82)+3(-0.12)=-0.2]]>本領(lǐng)域普通技術(shù)人員認(rèn)為估算分配常數(shù)的Hansch-Leo近似法(其中所應(yīng)用的是近似的Hansch-Leo片段常數(shù))不會精確地提供實驗分配常數(shù)。(見，Hansch和Leo，《化學(xué)和生物學(xué)中用于相關(guān)分析的取代基常數(shù)》，Wiley，紐約，1979；James，《溶解性和相關(guān)特性》，Wiley，紐約，1979)。然而，這種近似值是精確的，它足以確定聚合輸送載體的疏水性特征。各種各樣的多核酸分子可以是組合物的多核酸組分。它們包括天然和合成的DNA或RNA分子和已經(jīng)通過共價鍵修飾的核酸分子(以便結(jié)合以下基團(tuán)親脂基團(tuán)、光誘導(dǎo)的交聯(lián)基團(tuán)、烷基化的基團(tuán)、有機(jī)金屬基團(tuán)、嵌入基團(tuán)、親脂基團(tuán)、生物素、熒光和放射性基團(tuán)，和修飾磷酸主鏈的基團(tuán))。這類的核酸分子(除了其它分子以外)還可以是反義核酸分子、編碼基因的DNA(通常包括一種合適的啟動子序列)、核酶、寡核苷酸α-端基異構(gòu)體、乙基磷酸三酯類似物、烷基膦酸酯、硫代磷酸酯和二硫代磷酸酯寡核苷酸以及類似物。實際上，核酸組分可以是具有以下特性的任意核酸，所述的特性有能夠有助于將這些任意的核酸高效率地轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞中，或保持它們的穩(wěn)定而避免降解過程，或在將它們給予動物后，改進(jìn)它們的生物分布。應(yīng)用的依據(jù)通式(V)-(VIII)的聚合物實例包括下列通式的聚(氧化乙烯)-聚-L-賴氨酸)二嵌段共聚物其中i是從約5至約100的整數(shù)，且j是從約4至約100的整數(shù)。第二個實例是下列通式的聚(氧化乙烯)-聚-(L-丙氨酸-L-賴氨酸)二嵌段共聚物其中i是從約5至約100的整數(shù)且j是從約4至約100的整數(shù)。第三個實例是下列通式的聚(氧化乙烯)-聚(丙烯亞胺/丁烯亞胺)二嵌段共聚物其中i是從約5至約200的整數(shù)且j是從1至約10的整數(shù)。第四個實例是下列通式的聚(氧化乙烯)-聚(N-乙基-4-乙烯基溴乙錠)(“pOE-pEVP-Br”)其中i是從約5至約100的整數(shù)且j是從約10至約500的整數(shù)。還有另外一個實例是下列通式的聚合物CH3O-(CH2CH2O)iCO[(NH(CH2)3)2NH(CH2)4]j-(NH(CH2)3)2-NHCO-O-(CH2CH2O)k·CH3(XXII)其中i是從約10至約200的整數(shù)，j是從約1至約8的整數(shù)，且k是從約10至約200的整數(shù)。還有另外一個實例是下列通式的聚合物H-Gj-(NH(CH2)3)2-N-NH-CO-O-(CH2CH2O)iCO-Gm-(NH(CH2)3)2-NH2(XXIII)其中“G”含有-(NH(CH2)3)3-CH2NH2-，i和j如通式(XVIII)所定義，且m是從約1至約8的整數(shù)。在某些情況下，本發(fā)明中應(yīng)用的嵌段共聚物一般形成直徑是約10nm至約100nm的膠束。膠束是某些由于兩親物非極性部分的微相分離而在水溶液中形成的兩親分子的超分子復(fù)合物。對于一個給定的溫度來說，當(dāng)兩親物濃度達(dá)到兩親物所特有的臨界膠束濃度(“CMC”)時，膠束形成。這類的膠束一般包括約10至約300個嵌段共聚物。通過改變嵌段共聚物親水和疏水部分的大小，能夠改變共聚物在生理條件下形成膠束的傾向。膠束具有由B嵌段和中和了電荷的核酸的水溶性重復(fù)單元形成的密芯，并且具有由A嵌段形成的親水殼。膠束在溶液中具有平移和旋光的自由度，且含有膠束的溶液具有類似于水的較低粘性。一般在共聚物濃度是約0.001至5％(W/V)時出現(xiàn)膠束形成。一般來說，在多核苷酸組合物中，聚陽離子聚合物和多核酸的濃度小于共聚物的濃度，優(yōu)選至少小于約10倍，更優(yōu)選至少小于約50倍。在高濃度時，本發(fā)明中應(yīng)用的有些嵌段共聚物將形成凝膠。這些凝膠是粘性系統(tǒng)，其中共聚物分子的平移和旋光自由度明顯地受到共聚物分子中相互作用的連續(xù)網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的限制。在凝膠中，B嵌段重復(fù)單元的微偏析可以出現(xiàn)，或者也可以不出現(xiàn)。為了避免形成凝膠，聚合物的濃度(對于嵌段共聚物和聚醚/聚陽離子聚合物來說)優(yōu)選低于約15％(W/V)，更優(yōu)選低于約10％，更優(yōu)選低于約5％。在本發(fā)明的第一個實施方案中，更優(yōu)選的是避免了凝膠的形成。如果多核苷酸組合物包括陽離子組分，那么陽離子與多核苷酸的磷酸基團(tuán)連接，同時中和磷酸基上的電荷并給予多核苷酸組分更強(qiáng)的疏水性。優(yōu)選由R型聚合片段或聚陽離子聚合物上的陽離子提供中和作用。然而，通過化學(xué)修飾或通過與一種諸如N-[1-(2，3-二油氧基)-N，N’-3-甲基銨氯化物]這樣的疏水陽離子連接，也可以中和磷酸電荷。在水溶液中，我們認(rèn)為中和了電荷的多核苷酸參與了超分子(稱作“多核苷酸復(fù)合物”的膠束樣顆粒)的形成。疏水芯或復(fù)合物含有中和了電荷的多核苷酸和B型共聚物嵌段。親水外殼含有A型共聚物嵌段。這種復(fù)合物的大小一般在約10nm至約100nm的直徑間變化。在有些文章中，實際上是將復(fù)合物與未結(jié)合的組分分離。例如，通過凝膠過濾色譜法，已經(jīng)進(jìn)行了這一過程。多核苷酸組合物的組分的比率是一個優(yōu)選組合物中多核苷酸有效跨膜滲透性的重要指數(shù)。將這種比率確定為比率φ，在生理pH時，它是組合物中帶電荷的基團(tuán)與帶負(fù)電荷的基團(tuán)之比。如果φ＜1，那么復(fù)合物含有來自多核苷酸的未中和的磷酸。我們認(rèn)為鄰近未中和電荷的多核苷酸的部分是多核苷酸復(fù)合物的部分外殼。相應(yīng)的，如果φ＞1，那么聚陽離子聚合物或R型片段具有未中和的電荷，并且未中和的部分將會折疊，使得它們形成復(fù)合物的部分外殼。一般來說，φ在約0(其中沒有陽離子基團(tuán))至約100之間變化，優(yōu)選φ在約0.01和約50的范圍內(nèi)，更優(yōu)選在約0.1和約20之間。可以將φ改變來增加跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)的效率并且(如果組合物含有多核苷酸復(fù)合物)增加復(fù)合物的穩(wěn)定性。在對動物進(jìn)行給藥后，φ的變化還可以影響復(fù)合物的生理分布。除了其它許多因素外，最佳的φ還取決于(1)本文中所應(yīng)用的多核苷酸組合物，(2)所應(yīng)用的特殊聚合物和寡核苷酸，(3)靶向的細(xì)胞或組織，和(4)給藥的方式。在有些優(yōu)選的實施方案中，我們認(rèn)為共軛物形成膠束的能力與某些諸如在水和非水介質(zhì)中增溶能力這樣的所需特征有關(guān)，溶解度特征有利于跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)。我們認(rèn)為嵌段共聚物形成膠束的能力與存在的疏水和親水聚合嵌段有關(guān)。疏水嵌段由B型嵌段和用以下物質(zhì)進(jìn)行電荷中和的多核苷酸片段提供，所述的物質(zhì)有聚陽離子聚合物，R型嵌段或某些疏水的非聚合物陽離子。親水嵌段由A型嵌段和(在某種程度上)不完全由提供疏水性的離子類物質(zhì)中和的多核苷酸片段提供。本發(fā)明的嵌段共聚物優(yōu)選包括一種用作增加溶解度和減少非靶分子和細(xì)胞間相互作用的A型嵌段。在有些情況中，我們需要的是結(jié)合(通過非共價鍵連接)靶向分子。見，例如，Kabanov等，《受控釋放雜志》，22141(1992)?？梢耘c這種組合物連接的靶向分子一般具有一種對細(xì)胞位點(diǎn)和疏水基有親合性的靶向基團(tuán)。靶向分子自發(fā)地與多核苷酸復(fù)合物連接并通過疏水基將這種靶向分子“固定”在所述的復(fù)合物中。在組合物中這些靶向加合物一般含有約小于或等于10％的共聚物。在靶向分子中，除了其它基團(tuán)外，疏水基還可以是諸如脂?；@樣的脂質(zhì)基。另一方面，它可以是一種嵌段共聚物或另一種天然合成的聚合物。靶向分子的靶向基團(tuán)常含有一種抗體，這種抗體一般具有對一定細(xì)胞表面抗原的特異性。它也可以是(例如)一種具有與細(xì)胞表面受體特異性相互作用的激素，或一種具有細(xì)胞表面受體的藥物。例如，可以將糖脂用于靶向多糖受體。我們應(yīng)注意的是可以將靶向分子與本文中確定的任何聚合物嵌段(包括“R型”聚合嵌段)和聚陽離子聚合物連接。例如，可以將靶向分子以共價鍵方式與下列基團(tuán)連接，這些基團(tuán)有通式XVIII，XIX，XX和XXI的聚合物的末端-OH，通式XVIII(優(yōu)選末端賴氨酰殘基的6-氨基)，XX或XXIII的聚合物的末端-NH2，或通式XXIII和XIX聚合物的末端-COOH。注意(例如)通過用下述物質(zhì)作為靶向分子，可以將靶向分子用于促進(jìn)多核苷酸組合物的細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)(例如，向細(xì)胞核內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn))，所述的物質(zhì)有融合肽(由Soukchareun等在《生物共軛體化學(xué)》，6，43，1995或Arar等在《(生物共軛體化學(xué)》，6，43，1995中描述)，細(xì)胞內(nèi)有的肽，或其它可提供向細(xì)胞內(nèi)定點(diǎn)轉(zhuǎn)運(yùn)(特別是從核內(nèi)體的區(qū)室進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，或向細(xì)胞核輸送)的生物特異性基團(tuán)。本發(fā)明組合物的多核苷酸組分可以是任何多核苷酸，但優(yōu)選多核苷酸帶有至少約3個堿基，更優(yōu)選至少帶有約5個堿基。在合適的多核苷酸中所包括的是病毒基因組和病毒(包括脂質(zhì)或蛋白質(zhì)病毒包被)。病毒特別適合與本發(fā)明的第一，第三或第五個實施方案一起應(yīng)用。名詞“多核酸”和“多核苷酸”可交替使用。一種寡核苷酸是一種多核苷酸。DNA和RNA是多核苷酸。多核苷酸衍生物是一種具有一個或多個基元的多核苷酸，其中所具有的基元有以下特征(i)其中的基元被裂解、鈍化或反向轉(zhuǎn)化，使得所得的物質(zhì)能夠起多核苷酸的作用；(ii)其中的基元不妨礙衍生物起多核苷酸的作用。多核苷酸的功能包括下列一種或多種結(jié)合另一種影響轉(zhuǎn)染的多核苷酸，受阻抑，指導(dǎo)蛋白質(zhì)的合成，摻入RNA或DNA或基因組，起核酶的作用以及諸如此類。對于聚環(huán)氧乙烷-聚環(huán)氧丙烷共聚物來說，在某種程度上，親水/疏水特性以及嵌段共聚物的膠束形成特性與比值n有關(guān)。這個比值n的定義是n＝(|B|/|A|)×(b/a)＝(|B|/|A|)×1.32其中|B|和|A|是共聚物的疏水和親水嵌段中的重復(fù)單元數(shù)，相應(yīng)的，b和a是相應(yīng)重復(fù)單元的分子量。n值一般在約0.2和約9.0之間，更優(yōu)選在約0.2和約1.5之間。如果使用的是嵌段共聚物的混合物，那么以共聚物組分的重量部分的平均值為基準(zhǔn)，n是每個參與共聚物的n的加權(quán)平均數(shù)。如果使用的是除聚環(huán)氧乙烷-聚環(huán)氧丙烷共聚物以外的共聚物，那么可以將相似的計算法進(jìn)行改進(jìn)，用來表示聚合物類中一個部分的疏水/親水特性與聚合物類中另一個部分的疏水/親水特性的關(guān)系?？梢詫⒈景l(fā)明的多核苷酸組合物通過以下方式進(jìn)行給藥，這些方式有口服給藥，局部給藥，直腸給藥，陰道給藥，利用氣霧劑經(jīng)肺通道給藥，或胃腸外給藥，即肌肉給藥，皮下給藥，腹膜給藥或靜脈給藥?？梢詫⒍嗪塑账峤M合物單獨(dú)進(jìn)行給藥，或者根據(jù)實用藥物標(biāo)準(zhǔn)，將它與一種藥物上可接受的載體或賦形劑結(jié)合。對于口服形式的給藥來說，可以將多核苷酸組合物用于片劑、膠囊劑、糖錠、錠劑、粉劑、糖漿劑、酏劑、水溶液和懸浮液以及類似物。就片劑來說，可應(yīng)用的載體包括乳糖、檸檬酸鈉和磷酸鹽。在片劑中通常使用的是諸如淀粉這樣的各種崩解劑和諸如硬脂酸鎂，十二烷基硫酸鈉和滑石這樣的潤滑劑。對用于口服給藥的膠囊劑來說，所用的稀釋劑是乳糖和高分子量的聚乙二醇。如果需要將水的懸浮液用于口服，那么可以將多核苷酸組合物與乳化劑和懸浮劑結(jié)合。如果需要，可以加入一定的增甜劑和/或調(diào)味劑。對于胃腸外給藥來說，通常制備共軛物的無菌溶液，且將溶液的pH進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整和緩沖。對于靜脈使用來說，應(yīng)控制溶質(zhì)的總濃度以得到等滲制劑。對于眼部給藥來說，可以通過諸如涂藥器或滴眼管這樣本領(lǐng)域公知的眼部釋放系統(tǒng)來輸送軟膏或滴眼液，這類的組合物可以包括諸如透明質(zhì)酸、硫酸軟骨素、羥丙基甲基纖維素或聚(乙烯醇)這樣的mucomimetics，諸如山梨酸、EDTA或芐基氯化鉻這樣的防腐劑以及常用量的稀釋劑和/或載體。對于肺部給藥來說，選擇合適的稀釋劑和/或載體來制成氣霧劑。實施例1轉(zhuǎn)染率-第一實施方案的復(fù)合物本實驗試圖將質(zhì)粒pβ-Gal引入NIH3T3細(xì)胞(一種小鼠乳腺瘤細(xì)胞系)。質(zhì)粒pβ-Gal含有已引入一種真核轉(zhuǎn)錄單位與E.coliβ-半乳糖苷酶雜交體的質(zhì)粒pUC19(由俄羅斯科學(xué)院基因生物研究所提供)。由于有這種質(zhì)粒，通過測定從所處理細(xì)胞中提取出的β-半乳糖苷酶活性，就可以測定細(xì)胞的攝取率。應(yīng)用的共聚物是通式(XIX)的三嵌段共聚物，其中X加Z是51且Y是39(下文稱作“PluronicA”)。用一種含10mg/mlpluronicA和45μg/mlpEVP-Br的PBS溶液來制備10μg/ml的pβ-Gal(主要是超螺旋的)溶液。計算這些量，從而得到聚陽離子的堿性基與質(zhì)粒的磷酸基之比，約是10。pluronicA與DNA之比是約104。將這種標(biāo)準(zhǔn)制劑進(jìn)行過濾滅菌，并將一部分用不含血清的Dulbecco改進(jìn)的Eagle培養(yǎng)基(“DMEM”)稀釋10倍，使得pβ-Gal的濃度是1μg/ml。這種溶液就是“PluronicA轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基”。使用含有2mM的谷氨酰胺和10％的胎牛血清(“FCS”)的DMEM培養(yǎng)基，在37°和5％的CO2中，用單層培養(yǎng)的方式使NIH3T3細(xì)胞生長。用新鮮的培養(yǎng)基洗滌三次，刮取用單層培養(yǎng)生長的細(xì)胞并準(zhǔn)備將它們用于反式作用法。將等份的用本發(fā)明方法轉(zhuǎn)化的洗滌過的細(xì)胞懸浮在濃度是106細(xì)胞/ml的PluronicA轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基中。在37℃時和5％的CO2中，將懸浮的細(xì)胞培養(yǎng)2小時。然后用新鮮的培養(yǎng)基將細(xì)胞洗滌并重新用平板固定。正如PrommegaofMadison，Wisconsin在他們的手稿ProfoectionMammalianTransfectionSystems，《技術(shù)手冊》1990中介紹的，將等份的用磷酸鈣沉淀法轉(zhuǎn)染的細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染。特別是，將pβ-Gal與0.25M的CaCl2混合。將該混合物與等體積的2×HBS(Hanks緩沖鹽，由GIBCO，GrandIsland，NY提供)混合，從而產(chǎn)生一種含有1μg/mlpβ-Gal的混合物。在室溫時，將這種不透光的混合物保溫10分鐘，然后將它用于細(xì)胞。在37℃時和5％的CO2中，將懸浮的細(xì)胞培養(yǎng)2小時。然后用新鮮的培養(yǎng)基將細(xì)胞洗滌并用平板重新固定。將重新用平板固定的細(xì)胞在含有10％的FCS的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)48小時，培養(yǎng)過程中，在16個小時時，用新鮮培養(yǎng)基取代原培養(yǎng)基。在培養(yǎng)48小時后，通過刮取來收集每次培養(yǎng)的細(xì)胞，將它們用PBS洗滌，并將它們重新懸浮在100μl的0.2MTris-HCl(pH7.4)中。通過幾個冷凍/融化循環(huán)，將細(xì)胞裂解，并在超過6000×/g時將細(xì)胞離心。從每個裂解液試管中分離出50μl的上層液，并將它與50μl的0.1mM4-甲基-umbelliferril-β-D-galactopiraniside(底物)和0.1M的磷酸鈉(pH7.4)溶液混合。在37℃時，將每個混合物保溫20分鐘，使得任何β-半乳糖苷酶出現(xiàn)以便在底物上起作用。將50μl的0.4M甘氨酸(pH10.5)加入來終止β-半乳糖苷酶反應(yīng)。由存在的methylbelliferon來表示β-半乳糖苷酶的活性，它可以通過熒光光譜學(xué)來測定(λ＝365nm，λ＝450nm)。結(jié)果是</tables>實施例2轉(zhuǎn)染率-第一實施方案的復(fù)合物在這些實驗中，檢測用MDCK細(xì)胞(來源于犬的腎)的轉(zhuǎn)染率。此外，pβ-Gal是指示多核苷酸。多核苷酸的聚陽離子組分含有一種N-乙基-4-乙烯吡啶鎓溴化物和N-鯨蠟基-4-乙烯吡啶鎓溴化物的共聚物，相應(yīng)的，它與引入的單體的摩爾比是97∶3(下文稱作“pEVP-co-pCVP-Br”)。這種嵌段共聚物含有一種通式(XIV)的三嵌段共聚物，其中x+z是18且y是23(下文稱作“PluronicB”)。用實施例1的方法制備由1μg/mlpβ-Gal，3μg/mlpEVP-co-pCVP-Br和1％(W/V)PluronicB組成的PluronicB轉(zhuǎn)染溶液。聚陽離子堿性基與核苷酸的磷酸之比是約7。PluronicB與pβ-Gal的重量比是約5×103。按每個平板有8×105個細(xì)胞的方式，將MDCK細(xì)胞固定在90mm的平板上并在含血清的生長培養(yǎng)基上將細(xì)胞培養(yǎng)過夜。用不含血清的培養(yǎng)基取代含血清的培養(yǎng)基，在37℃時和5％的CO2中，將細(xì)胞培養(yǎng)24小時。對于用多核苷酸復(fù)合物處理的細(xì)胞來說，用5mlPluronicB轉(zhuǎn)染溶液取代培養(yǎng)基。在37℃時和5％的CO2中，通過輕微的振動，將細(xì)胞培養(yǎng)2小時。在對照實驗中，使用如上所述的磷酸鈣法將細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染(除了將平板固定的細(xì)胞轉(zhuǎn)染外，不懸浮細(xì)胞)。在用PluronicB轉(zhuǎn)染溶液或磷酸鈣處理后，用新鮮的培養(yǎng)基將細(xì)胞洗滌5-6次。然后在37℃時和5％的CO2中，將它們在含有10％的FCS的DMEM中進(jìn)行培養(yǎng)。在這次培養(yǎng)的第一個16小時后，更換培養(yǎng)基。在培養(yǎng)后，將細(xì)胞用PBS洗滌，通過胰蛋白酶消化使細(xì)胞從其平板上釋放，并再一次用PBS洗滌細(xì)胞。如實施例1所述測定β-半乳糖苷酶。結(jié)果如下實施例3轉(zhuǎn)染實驗-第一實施方案的復(fù)合物在這些實驗中，檢測用中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞的轉(zhuǎn)染率。多核苷酸復(fù)合物的多核苷酸組分是pβ-Gal。聚陽離子組分含有pEVP-Br。嵌段共聚物含有一種通式(XVII)的八嵌段共聚物，其中i等于10且j等于12(下文的由BASF提供的“PluronicC”)。如實施例1中所述制備一種由1μg/mlpβ-Gal，4μg/mlpEVP-Br和1％(W/V)PluronicC組成的PluronicC轉(zhuǎn)染溶液。堿性基與核苷酸的磷酸之比是10。PluronicC與pβ-Gal的重量比是103。轉(zhuǎn)染流程與實施例2中所用的相同。結(jié)果如下處理方法相對β-半乳糖苷酶活性±SEM(n＝4)PluronicB法910±45磷酸鈣沉淀法81±17</table></tables>實施例4細(xì)菌轉(zhuǎn)化-第二實施方案的復(fù)合物在這些實驗中，檢測使用枯草芽孢桿菌的MC5菌株的轉(zhuǎn)化率。多核苷酸復(fù)合物的多核苷酸組分是質(zhì)粒pBC16(一種編碼抗四環(huán)素的質(zhì)粒)。應(yīng)用通式(VI)的嵌段共聚物。特別是，嵌段共聚物是一種通式(XXI)的聚(氧化乙烯)-聚(N-乙基-4-乙烯吡啶鎓溴化物)，其中i是44，且j是20。按照上述轉(zhuǎn)染溶液的制備方法來制備第二個實施方案的多核苷酸復(fù)合物標(biāo)準(zhǔn)溶液。溶液中共聚物的堿性基與DNA的磷酸之比是0.2。將細(xì)菌懸浮在SpizienII(一種轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基，見Spizien，F(xiàn).N.A.S.，U.S.A.441072(1958))中，在不同濃度的多核苷酸復(fù)合物或游離的pBC16中培養(yǎng)等份的細(xì)胞。在37℃時，將細(xì)胞用復(fù)合物或游離DNA進(jìn)行培養(yǎng)1小時。培養(yǎng)后，將細(xì)胞固定在含有10mg/ml的四環(huán)素的瓊脂培養(yǎng)基上。結(jié)果如下(由每種實驗條件下抗四環(huán)素的菌落數(shù)測定DNA濃度(ng/ml)轉(zhuǎn)化(106克隆/ngDNA)多核苷酸復(fù)合物游離的多核苷酸5300(±15)010450(±22)3(±1)20400(±26)3(±4)50220(±17)20(±5)</table></tables>實施例5防止硫酸酶的影響對于本實施例來說，形成一種質(zhì)粒pTZ19和通式(XXI)的二嵌段共聚物(聚(氧化乙烯)-聚(N-乙基-乙烯吡啶鎓溴化物，其中i是44且j是20)的復(fù)合物。將多核苷酸復(fù)合物的溶液溶于含有約4μg/ml質(zhì)粒和20μg/ml二嵌段共聚物的PBS中。這些數(shù)據(jù)導(dǎo)致聚陽離子嵌段中的堿性基團(tuán)與DNA的磷酸基團(tuán)之比是5。對于對照培養(yǎng)來說，將等量的游離質(zhì)粒溶于緩沖液。將PVUII核酸酶加入到含有游離DNA或多核苷酸復(fù)合物的樣品溶液中，并在不同的消化時間后，用聚丙烯酰胺凝膠電泳來測定未消化的量(環(huán)狀質(zhì)粒DNA)。見，Kabanov等，《生物聚合物》，311437-1443(1991)。</tables>實施例6寡核苷酸的穩(wěn)定作用對于本實施例來說，使用通式(XIX)的二嵌段共聚物(聚氧乙烯-聚(L-丙氨酸-L-賴氨酸)，其中i是44且j是8)來制備一種含有一種與HIV-1tat基因(“抗-tat，它含有GGCTCCATTTCTTGCTC)的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)互補(bǔ)的寡核苷酸的復(fù)合物。在PBS緩沖液中(pH7.0)制備寡核苷酸復(fù)合物，濃度是0.75OD260/μl寡核苷酸。聚陽離子的亞氨基和氨基與多核苷酸的磷酸基之比是約50。在室溫時，將混合物保溫1小時，使得復(fù)合物形成。然后，用凝膠過濾色譜法將復(fù)合物純化，其中使用SephadexG25柱并使用0.05MNaCl作為洗脫液。所得復(fù)合物溶液的濃度是0.11OD260/μl寡核苷酸。制備一種未復(fù)合的寡核苷酸對比溶液。將等分的鼠血漿(10μl)與等體積的寡核苷酸復(fù)合物溶液或一種游離寡核苷酸的溶液混合。在37℃時，將樣品保溫不同的時間期限。為了終止血漿中寡核苷酸與酶的反應(yīng)，將樣品用水稀釋并用苯酚∶氯仿(1∶1)的水飽和的混合物將樣品進(jìn)行萃取。將萃取物的水相分離，并且用3％的高氯酸鋰將其中的寡核苷酸沉淀。將沉淀物用丙酮洗滌，然后將它溶于100μl水中。用高效液相色譜法來測定存在的未降解的寡核苷酸，其中使用C18-Silasorb柱(4×90mm，Gilson，法國)并使用溶于0.05M三乙銨乙酸酯(pH7.0)的梯度濃度的乙腈作為洗脫液。結(jié)果如下實施例7寡核苷酸的穩(wěn)定作用當(dāng)檢驗了與通式(XX)的二嵌段共聚物(聚氧乙烯-聚丙烯亞胺/丁烯亞胺，其中i是44且j是4-8)復(fù)合的寡核苷酸時，本實施例也就檢驗了如實施例6中所述寡核苷酸的穩(wěn)定性。將在實施例6中應(yīng)用的相同方法用于本實施例(除了寡核苷酸的濃度是約0.13OD260/μl以外)。如果如下實施例8反義細(xì)胞的結(jié)合率本實施例檢驗了“抗-MDR”在改變SKVLB細(xì)胞中多抗藥性方面的效率，其中“抗-MDR”是一種含有序列是CCTTCAAGATCCATCCC的17鏈寡核苷酸的反義分子，所述的序列與編碼MDR1基因產(chǎn)品的mRNA的422-438位互補(bǔ)。SKVLB是來源于卵巢癌細(xì)胞系的多抗藥性細(xì)胞。已經(jīng)確定MDR1基因是導(dǎo)致SKVLB細(xì)胞中多抗藥性的原因(Endicott和Ling，《生物化學(xué)綜述年鑒》，58137(1989))。特別是，將本發(fā)明多核苷酸復(fù)合物中的寡核苷酸抗MDR的效率與它在游離狀態(tài)時抗MDR的效率進(jìn)行比較。作為對照組來說，也應(yīng)用如上所述游離和復(fù)合形式的抗-tat寡核苷酸。用通式(XX)的二嵌段共聚物(聚氧乙烯-聚丙烯亞胺/丁烯亞胺，其中i是44且j是9-10)來構(gòu)成多核苷酸復(fù)合物。通過實施例6中所述的步驟來制備該復(fù)合物。寡核苷酸在復(fù)合物中或在游離狀態(tài)時的濃度是0.17OD260/μl。共聚物的濃度足以確定聚陽離子嵌段的亞氨基和氨基與寡核苷酸的磷酸基之比是10。在37℃，5％的CO2中和有游離或復(fù)合的寡核苷酸(以寡核苷酸的含量為基準(zhǔn)的濃度是20μM)的情況下，將SKVLB細(xì)胞培養(yǎng)3天。每12小時加入包括游離或復(fù)合的寡核苷酸的新鮮培養(yǎng)基。用Alley等，《癌癥研究》48589-601的方法來測定如上所述處理的細(xì)胞的道諾霉素細(xì)胞毒性(IC50)。結(jié)果如下</tables>實施例9反義寡核苷酸用于抑制皰疹病毒本實驗采用12鏈寡核苷酸，在它的5′末端用十一烷基磷酸取代基以共價鍵方式修飾并在它的3′末端用一種吖啶基以共價鍵方式修飾。這種寡核苷酸修飾已由Cho-Chung等在《國際生物化學(xué)》，25767-773(1991)中進(jìn)行了描述。應(yīng)用的寡核苷酸序列(CGTTCCTCCTGU)與單純皰疹病毒1(“HSV-1”)的983-994處剪接位點(diǎn)互補(bǔ)。作為對照組，應(yīng)用的是與流感病毒產(chǎn)生的RNA互補(bǔ)的以相同方式修飾的序列(AGCAAAAGCAGG)。將復(fù)合或游離狀態(tài)的寡核苷酸用于HSV-1感染的細(xì)胞。如果應(yīng)用一種復(fù)合物，那么用通式(XIX)的二嵌段共聚物(聚氧乙烯-聚(L-丙氨酸-L-賴氨酸)，其中i等于44且j等于8)來形成該復(fù)合物。如實施例6中所述來形成寡核苷酸復(fù)合物。如Vinogradov等在BBRC，203959(1994)中所述，用HSV-1病毒(菌株L2，從病毒菌株保藏館獲得，D.I.Ivanovskii，病毒學(xué)研究所，俄羅斯聯(lián)邦)感染非洲絨猴的腎細(xì)胞(“Vero”細(xì)胞)。將感染的細(xì)胞用PBS洗滌。洗滌后，向細(xì)胞中加入含有10％胎牛血清和游離或復(fù)合的寡核苷酸的新鮮RPMI-1640培養(yǎng)基。然后，在37℃時和5％的CO2中，將細(xì)胞培養(yǎng)24小時。使用(《病毒學(xué)》，實際應(yīng)用，Mahy編輯，IRL出版社，華盛頓特區(qū)，1985)中描述的膜片生成法來測定細(xì)胞培養(yǎng)基的HSV-1的感染性。結(jié)果(使用不同的寡核苷酸濃度)如下</tables>實施例10反義寡核苷酸用于抑制劑皰疹病毒除非另有注解，本實施例應(yīng)用的步驟與實施例9中所用的步驟相同。應(yīng)用的細(xì)胞是BHK細(xì)胞(一種中國倉鼠的腎細(xì)胞系)。如果使用的是復(fù)合形式的寡核苷酸，那么用實施例6中所述的步驟，用通式(XVII)的二嵌段共聚物(聚氧乙烯-聚-L-賴氨酸，其中i是44且j是30)來形成復(fù)合物。復(fù)合物標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度是0.09OD260/μl。聚陽離子嵌段的亞氨基和氨基與寡核苷酸的磷酸之比是10。將寡核苷酸(復(fù)合或游離形式)以30μM的濃度用于細(xì)胞。結(jié)果如下實施例11HSV的體內(nèi)抑制用實施例9中概述的方法來形成通式(XVII)的嵌段共聚物(聚氧乙烯-聚-L-賴氨酸，其中i是44且j是30)與抗-HSV和抗流感寡核苷酸的多核苷酸復(fù)合物。復(fù)合物標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度是0.9OD260/μl。聚陽離子嵌段的亞氨酸和氨基與寡核苷酸的磷酸之比是10。通過腹膜內(nèi)注射30μl的病毒懸浮液(滴度10-7LD50/ml)，用HSV-1(來自明斯克的白俄羅斯流行病與微生物研究院的菌株C1)感染近交的白鼠(體重6至7g)。將抗HSV復(fù)合物，抗流感復(fù)合物，游離的抗HSV寡核苷酸或游離的抗流感寡核苷酸分別在感染后的每2，12，24，48或72小時注射入給定小鼠的尾靜脈。結(jié)果如下實施例12多核苷酸復(fù)合物的血漿壽命本實施例中所應(yīng)用的是一種由32P標(biāo)記的與HIV-1tat基因的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)互補(bǔ)的17鏈寡核苷酸(GGCTCCATTTCTTGCTC)。如Boutorin等在《生物共軛體化學(xué)》，2350-356(1990)中所述，將寡核苷酸在其5′-末端用膽固醇修飾。用通式(XX)的嵌段共聚物(聚氧乙烯-聚(丙烯亞胺/丁烯亞胺)，其中i是44且j是9至10)來形成寡核苷酸的多核苷酸共軛物。復(fù)合物標(biāo)準(zhǔn)溶液(溶于PBS)的濃度是0.18OD260/μl。聚陽離子嵌段的亞氨基和氨基與寡核苷酸的磷酸之比是50。給雄性C57/B1/6小鼠(重20-24g，從莫斯科的俄羅斯分子診斷學(xué)和治療學(xué)研究中心獲得)靜脈注射50μl，濃度是0.18OD260/μl(溶于PBS)的抗HIV共軛物或游離的抗HIV寡核苷酸。在注射后的確定時間時，從尾靜脈取血樣并將動物處死。通過液體閃爍計數(shù)來測定血樣或組織樣品中放射性物質(zhì)的量(在適當(dāng)增溶后)。結(jié)果如下<tablesid="table12"num="012"><tablewidth="848">注射后的時間(分鐘)血漿水平(注射劑量的％)肝臟水平(注射劑量的％)抗HIV共軛物游離的抗HIV寡核苷酸制劑A制劑B01001000059558371091405191584337262079279303075201035</table></tables>實施例13陽離子嵌段共聚物的合成將1，4-二溴代丁烷(5.4g，25毫摩爾，來自Milwaukee，WI的AldrichCo.)加入到一種溶于100ml1，4-二噁烷的N-(3-氨丙基)-1，3-丙二胺(6.55g，50毫摩爾，來自AldrichCo.)中。在20℃時，將這種反應(yīng)混合物攪拌16小時。這種反應(yīng)的產(chǎn)物以氫溴酸鹽的形式自發(fā)地從溶液中沉淀出來。收集這種沉淀的一級中間產(chǎn)物，并通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)將中間產(chǎn)物從10％的三乙胺甲醇溶液中干燥兩次。這種蒸發(fā)步驟可有效地除去基本量的溴酸鹽。將這種一級中間產(chǎn)物溶于50ml的1，4-二噁烷并將它與2.7g(12.5毫摩爾)的1，4-二溴代丁烷反應(yīng)。此外，在20℃時，將該反應(yīng)繼續(xù)進(jìn)行16小時，并回收所得的二級中間產(chǎn)物并如上所述將它進(jìn)行干燥。用乙酸將二級中間產(chǎn)物中和至pH為7-8并使用SephadexG-25的凝膠過濾(用水作洗脫液)將二級中間產(chǎn)物純化。從而分別得到三種主要的聚亞胺餾分(具有的表觀分子量分別是1060，700和500)。將聚(氧化乙二醇)(1.5g，M.W.1500，來自Fluka)溶于8ml的1，4-二噁烷，并在20℃時，將它與0.17g(1毫摩爾)的N，N’-羰基咪唑(AldrichCo.)反應(yīng)3小時。將反應(yīng)混合物分成兩部分。將每個部分與4ml10％(W/V)的1060或700MW的聚亞胺餾分溶液混合(溶液進(jìn)一步含有0.01N的NaOH)。在20℃時，將混合物攪拌16小時。通過凝膠過濾，將通式(XX)和不同MW范圍的嵌段共聚物從這種混合物中分離。實施例14陽離子嵌段共聚物的合成將0.5g的甲氧基-PEG(MW5000，Shearwater聚合物，Inc.，USA)的碳酸琥珀酸亞胺酯溶于1，4-二噁烷。將這種二噁烷溶液加入到含有如上所述的0.2g1060MW的聚亞胺聚合物的一種水溶液中，該水溶液進(jìn)一步包括0.01N的NaOH。在20℃時，將這種反應(yīng)混合物攪拌16小時。通過凝膠過濾將通式(XXII)的聚合物從反應(yīng)中分離。實施例15陽離子嵌段共聚物的合成將1.5g的聚(氧化乙二醇)(MW8000，F(xiàn)luka)溶于8ml的1，4-二噁烷。將0.34g(2毫摩爾)的N，N’-羰基咪唑(AldrichCo.)加入到上述溶液中并在20℃時，將它們反應(yīng)3小時。然后，將8ml含有0.01NNaOH的如實施例13中所述15％(W/V)500MW的聚亞胺聚合物的一種水溶液加入到第一次的反應(yīng)混合物中，在20℃時，將所得混合物通過攪拌反應(yīng)16小時。通過凝膠過濾，從第二次的反應(yīng)混合物中分離出通式(XXIII)的聚合物。實施例16與寡核苷酸的共軛合成用一種380B-02DNA合成儀(應(yīng)用的生物系統(tǒng)，CA)來合成一種12鏈的寡核苷酸(與單純皰疹病毒1型(“HSV-1”)早期mRNA剪接位點(diǎn)(病毒基因組上的983-994位置)互補(bǔ)的5′-CGTTCCTCCTGU(“OligoA”))。合成儀應(yīng)用的是亞磷酰胺化學(xué)和8分鐘的合成循環(huán)。如應(yīng)用生物系統(tǒng)介紹的來制備粗制品制劑并制定循環(huán)條件。使用丙酮(2ml)將從合成中獲得的粗OligoA從1MLiCl溶液(0.5ml)中沉淀出來。將沉淀物溶于三乙銨乙酸酯，用反相高效液相色譜法將上述沉淀物進(jìn)行純化，其中使用SilasorbC18柱(9×250mm，Gilson，法國)并使用溶于20mMTEAA緩沖液(pH8.5)中梯度濃度的乙腈作為展開劑。用高碘酸將純化OligoA的3′末端進(jìn)行氧化以產(chǎn)生一種醛，并通過還原性烷基化作用將上述OligoA的3′-末端與六亞甲基二胺接頭連接(產(chǎn)生一種胺的衍生物)。見Che-Chung等，《國際生物化學(xué)》，25767(1991)；Vinogradov等，BBRC，203959(1994)。將“PluronicA”(一種通式(XIV)的嵌段共聚物(x＝25，y+38，z＝25))進(jìn)行類似的氧化以產(chǎn)生末端醛。將胺的衍生物(1mg)溶于100μl的0.1M硼酸緩沖液(pH9.0)，并將它與2mg的PluronicA衍生物混合。將1.5mg的氰基硼氫鈉加入到上述混合物中，從而減少在胺和醛基之間形成的希夫堿。在4℃時，使該反應(yīng)繼續(xù)進(jìn)行12小時。使用凝膠過濾色譜法分離該反應(yīng)的聚合產(chǎn)物，其中使用SephadexLH-20柱并使用90％的含水異丙醇作為洗脫液。將這樣獲得的共軛物稱作下文的“OligoA共軛物”。實施例17OligoA共軛物對病毒生成的作用將OligoA和Oligo共軛物分別溶于RPMI1640培養(yǎng)基(ICN生物醫(yī)學(xué)公司，CostaMesta，CA)，使最終濃度是0.2mM(以寡核苷酸的吸收度為基準(zhǔn))。然后通過0.22μm的濾器將這些標(biāo)準(zhǔn)溶液過濾，從而除去任何可能的細(xì)菌或真菌污染。在37℃時，將單層Vero細(xì)胞與不同濃度的OligoA或OligoA共軛物一起在不含血清的RPMI1640中培養(yǎng)1小時。然后，用每個HSV-1(菌株L2(來自D.I.Ivanovskii病毒學(xué)研究所的病毒菌株保藏館，俄羅斯科學(xué)院，俄羅斯聯(lián)邦))。培養(yǎng)細(xì)胞的1個噬斑形成單位來感染上述單層細(xì)胞(同時仍受寡核苷酸影響)。該感染法已由Vinogradov等在BBRC，203959(1994)中進(jìn)行了描述。在病毒和寡核苷酸處于試驗條件下8小時后，用含有10％FCS的新鮮培養(yǎng)基取代細(xì)胞上的培養(yǎng)基。在感染培養(yǎng)后的22和39小時，收集來自細(xì)胞的培養(yǎng)基，并且如(《病毒學(xué)》，實用方法，Mahy編輯，IRL出版社，牛津大學(xué)出版社，華盛頓特區(qū)，1985))中所述來測定所收集培養(yǎng)基中的病毒滴度。結(jié)果如下實施例18一種膦酸酯單體的合成在20℃時，將溶于50ml無水吡啶(Aldrich)的40毫摩爾丁二醇-1，3(Merck)與20毫摩爾的4，4-二對甲氧三苯甲基氯(Sigma)反應(yīng)1.5小時。使用氯仿∶甲醇(95∶5)展開的硅膠板薄層色譜法來監(jiān)測該反應(yīng)。產(chǎn)品的Rf是0.6。將反應(yīng)混合物加入到200ml8％的碳酸氫鈉水溶液中，并將產(chǎn)品用氯仿萃取。在真空中蒸發(fā)氯仿萃取物，將所得含油的一級中間產(chǎn)物用于下一步的合成。將12毫摩爾的一級中間產(chǎn)物溶于30ml的無水1，4-二噁烷(含有3.14ml(18毫摩爾)的二異丙基乙胺(Aldrich))中。在惰性氬氣中，將溶于10ml的無水1，4-二噁烷中的18毫摩爾的水楊基氯代亞磷酸酯(Sigma)加入到小量的二異丙基乙胺中。在20℃時，將反應(yīng)混合物保溫1小時。用如上所述的薄層色譜法檢測該反應(yīng)。產(chǎn)品的Rf是0.05。將10ml水加入到反應(yīng)混合物中。30分鐘后，蒸發(fā)溶劑。將產(chǎn)品溶于100ml的氯仿，并將獲得的溶液用下列溶液進(jìn)行分步洗滌(1)100ml的8％碳酸氫鈉水溶液，(2)100ml的0.2M三乙胺乙酸酯溶液(pH7.2)和(3)100ml的水。將有機(jī)溶劑蒸發(fā)，并使用(1)氯仿，(2)3％的甲醇氯仿溶液和(3)6％的甲醇氯仿溶液這樣的階式梯度方式，通過硅膠柱色譜法來純化含膦酸酯單體的油性殘余物。單體的產(chǎn)量是4.1g(＝7.3毫摩爾，63％)。產(chǎn)品具有下列結(jié)構(gòu)其中DMT代表二甲氧基三苯甲基，稱該產(chǎn)品為“膦酸酯單體A”。實施例19聚陽離子BDP的合成將溶于無水吡啶∶乙腈混合物(1∶1)的0.05M膦酸酯單體A溶液放入DNA合成儀(型號380-B02，應(yīng)用的生物系統(tǒng)，CA)的第6位置上。將溶于乙腈∶吡啶(95∶5)混合物的2％adamantoilchloride(Sigma)溶液用作縮合劑。使用改進(jìn)的程序?qū)⒑铣蛇M(jìn)行H-膦酸酯循環(huán)(Sinha和Striepeke《寡核苷酸和類似物》實用方法，Eckstein編輯，牛津，紐約-東京的IRL出版社，185頁，1991)，并在合成完成后將DMT基進(jìn)行保護(hù)。將固定在一種標(biāo)準(zhǔn)CPG-500固相支持物上的腺苷(4μmoles)用作聚合物合成中的一級單元(Vinogradov等，BBRC，203，959(1994))。合成儀按規(guī)定程序?qū)?5個膦酸酯單體A重復(fù)單元加入到腺苷單體中。下面是所有的合成步驟在20℃時，用溶于無水吡啶∶CCl4(5∶1)混合物的104mg六亞甲基二胺的溶液使固定在底物上的H-膦酸酯基氧化15分鐘，然后，用吡啶∶乙腈混合物(1∶1)洗滌載體。通過氨解作用進(jìn)行解封和除去封端劑(《寡核苷酸和類似物》實用方法，Eckstein編輯，牛津，紐約-東京的IRL出版社，1991)。通過HPLC將產(chǎn)物純化，其中使用SilasorbC16柱(9×250mm，Gilson，法國)并使用梯度濃度的乙腈(0-80％)。選擇含有二甲氧基三苯甲基化產(chǎn)物的峰，將溶劑蒸發(fā)并將殘余物用80％的乙酸處理(20分鐘)。將乙酸蒸發(fā)并再次用HPLC將聚陽離子純化。15-鏈(以膦酸酯單體A為單位計)的產(chǎn)量是50％(2.2μmoles)。這樣就產(chǎn)生了通式A的一種聚合物。稱該聚合物為下文的“BDP”。實施例20聚氧乙烯-BDP二嵌段共聚物的固相合成使用聚乙二醇(1500M.W.，來自Fluka)(而不用丁二醇-1，3)，如實施例18中所述來合成二甲氧基三苯甲基-聚環(huán)氧乙烷-H-膦酸酯。除了將二甲氧基三苯甲基-聚環(huán)氧乙烷-H-膦酸酯用作最后的結(jié)構(gòu)單元(在最后的鏈增長步驟時)以外，如實施例19中所述來合成聚陽離子。使用四亞甲基二胺(Sigma)(而不用六亞甲基二胺)來氧化嵌段共聚物的H-膦酸酯基，從而導(dǎo)致二胺和主鏈磷酸之間形成磷酰胺鍵。實施例21寡核苷酸-BDP二嵌段共聚物的固相合成在DNA合成儀中合成一種含有12鏈寡核苷酸和BDP聚合物的二嵌段共聚物，其中所述的12鏈寡核苷酸即5’-GGTTCCTCCTGU(OligoA，它與單純皰疹病毒1型)HSV-1(的早期mRNA剪接位點(diǎn)互補(bǔ)，見Vinogradov等，BBRC，203，959(1994))。首先，如實施例19中所述來合成BDP聚合物(除了不將它從支持物中分離以外)，然后，使用如Vinogradov等在BBRC，203，959(1994)中所述的標(biāo)準(zhǔn)亞磷酰胺化學(xué)法，在與固態(tài)支持物連接的BDP聚陽離子聚合物上逐級合成寡核苷酸鏈。用四亞甲基二胺(Sigma)(而不用六亞甲基二胺)，如實施例19中所述來氧化二嵌段共聚物的H-膦酸酯基。實施例22寡核苷酸-BDP二嵌段共聚物對病毒生長的作用除了使用(1)實施例21的寡核苷酸-BDP共聚物和(2)單一的寡核苷酸-BDP共聚物(共軛物)濃度(4μM)以外，本實驗完全如實施例17所述的進(jìn)行</tables>實施例23HSV感染的增強(qiáng)用實施例9中所述的病毒，按0.1PFU/細(xì)胞感染復(fù)數(shù)來感染單層Vero細(xì)胞。將不同濃度的聚陽離子BDP(如實施例19中所述合成)加入到感染前的病毒中。在感染后24小時，在單層Vero細(xì)胞上測定病毒的感染滴度(PFU/ml)(實施例9)。將所有實驗都做三份。所測定感染滴度中的差異小于25％。本實驗的結(jié)果如下表示。細(xì)胞培養(yǎng)基中BDP的濃度，μM感染滴度，PFU/ml0(不含聚陽離子的病毒)2×10712×10722×10741×10887×108152×109權(quán)利要求1.一種多核苷酸組合物，其包含(a)多核苷酸或多核苷酸衍生物；和(b)高達(dá)約15％(w/v)的聚醚嵌段共聚物，它包含含有線性聚合片段的A型聚合片段和含有線性聚合片段的B型聚合片段，其中A型聚合片段的重復(fù)單元具有的平均Hansch-Leo片段常數(shù)約小于或等于-0.4具有的分子量在約30和約500之間，B型聚合片段具有的平均Hansch-Leo片段常數(shù)約大于或等于-0.4且具有的分子量在約30和約500之間，在上述聚醚嵌段共聚物中，至少約80％連接各聚合片段的重復(fù)單元的鍵含有醚鍵。2.權(quán)利要求1的多核苷酸組合物，其中所述的嵌段共聚物選自嵌段共聚物A-B-A′，A-B，-B-A-B′和L(R1)(R2)(R3)(R4)(I)(II)(III)(IV)和其混合物，其中A和A′是A型線性聚合片段，B和B′是B型線性聚合片段，且其中R1，R2，R3和R4是(1)通式(I)、(II)或(III)的嵌段共聚物或(2)氫，且L是一種連接基團(tuán)，條件是R1、R2、R3或R4中不超過兩個是氫。3.權(quán)利要求1的多核苷酸組合物，其中90％連接各聚合片段的重復(fù)單元的鍵含有醚鍵。4.權(quán)利要求1的多核苷酸組合物，其中各聚合片段的重復(fù)單元具有的分子量在約30和約100之間。5.權(quán)利要求4的多核苷酸組合物，其中90％連接各聚合片段的重復(fù)單元的鍵含有醚鍵。6.權(quán)利要求5的多核苷酸組合物，其中95％連接各聚合片段的重復(fù)單元的鍵含有醚鍵。7.權(quán)利要求6的多核苷酸組合物，其中所有含嵌段B或B′的重復(fù)單元具有的Hansch-Leo片段常數(shù)約大于或等于-30。8.權(quán)利要求7的多核苷酸組合物，其中所有含嵌段A或A′的重復(fù)單元具有的Hansch-Leo片段常數(shù)約小于或等于-0.4。9.權(quán)利要求1的多核苷酸組合物，其中各聚合片段的重復(fù)單元基本上由通式為-0-R5的重復(fù)單元組成，其中n是從0至約5的整數(shù)且R5是(1)-(CH2)n-CH(R6)-，其中n是從0至約5的整數(shù)且R6是氫；具有3-8個碳原子的環(huán)烷基；具有1-6個碳原子的烷基；苯基；烷基苯基，其中烷基具有1-6個碳原子；羥基；羥烷基，其中烷基具有1-6個碳原子；具有1-6個碳原子的烷氧基；具有2-7個碳原子的烷基羰基；烷氧基羰基，其中烷氧基具有1-6個碳原子；烷氧基羰基烷基，其中烷氧基和烷基各自獨(dú)立地具有1-6個碳原子；烷基羧基烷基，其中每個烷基具有1-6個碳原子；氨烷基，其中烷基具有1-6個碳原子；烷基胺或二烷基氨基，其中烷基各自獨(dú)立地具有1-6個碳原子；單或二烷基氨基烷基，其中烷基各自獨(dú)立地具有1-6個碳原子；氯；氯代烷基，其中烷基具有1-6個碳原子；氟；氟代烷基，其中烷基具有1-6個碳原子；氰基；氰烷基，其中烷基具有1-6個碳原子或羧基；(2)一種具有3-8個環(huán)碳原子的碳環(huán)基團(tuán)，它可以包括具有1-6個碳原子的烷基，具有1-6個碳原子的烷氧基，具有1-6個碳原子的烷基氨基，其中烷基各自獨(dú)立地具有1-6個碳原子的二烷基氨基，氨基，磺?；u基，羧基，氟或氯取代基；或(3)一種具有3-8個環(huán)原子的雜環(huán)基團(tuán)，它可以包括雜環(huán)烷基或芳香雜環(huán)基，可以包括1-4個選自氧、氮、硫和其混合物的雜原子，還可以包括具有1-6個碳原子的烷基，具有1-6個碳原子的烷氧基，具有1-6個碳原子的烷基氨基，其中烷基各自獨(dú)立地具有1-6個碳原子的二烷基氨基，氨基，磺?；u基，羧基，氟或氯取代基。10.權(quán)利要求9的多核苷酸組合物，其中所有含嵌段B或B′的重復(fù)單元具有的Hansch-Leo片段常數(shù)約大于或等于-30。11.權(quán)利要求10的多核苷酸組合物，其中所有含嵌段A或A′的重復(fù)單元具有的Hansch-Leo片段常數(shù)約小于或等于-0.4。12.一種多核苷酸組合物，其包含(a)多核苷酸或多核苷酸衍生物；和(b)具有聚醚片段和聚陽離子片段的共聚物，其中聚醚片段包括含有線性聚合片段的A型聚合片段，聚陽離子片段含有多個陽離子重復(fù)單元，所述A型聚合片段的重復(fù)單元具有的平均Hansch-Leo片段常數(shù)約小于或等于-0.4且具有的分子量在約30和約500之間，其中至少約80％連接聚醚片段的重復(fù)單元的鍵含有醚鍵。13.權(quán)利要求12的多核苷酸組合物，其中所述的共聚物含有以下通式的聚合物B-A-R，A-R，A-R-A′和R-A-R′，(V)(VI)(VII)(VIII)其中A和A′是A型線性聚合片段，B和B′是線性聚合片段，它們的單體具有的平均Hansch-Leo片段常數(shù)約大于或等于-0.4且具有的分子量在約30和約500之間，其中對于各聚合片段來說，至少約80％的單體間的鍵含有醚鍵，且在上述通式中，R和R′是含有多個陽離子重復(fù)單元的聚合片段。14.權(quán)利要求13的多核苷酸組合物，其中R和R′在生理pH下含有至少3個帶正電荷的基團(tuán)。15.權(quán)利要求14的多核苷酸組合物，其中R和R′在生理pH下含有至少12個帶正電荷的基團(tuán)。16.權(quán)利要求15的多核苷酸組合物，其中R和R′在生理pH下含有多個間隔為約3埃至約12埃的帶正電荷的基團(tuán)。17.權(quán)利要求16的多核苷酸組合物，其中多個陽離子重復(fù)單元是通式-NH-Ro-，其中Ro是2至6個碳原子的直鏈脂族基團(tuán)，它可以被取代。18.一種多核苷酸組合物，其包含一種含有線性聚合物的多核苷酸衍生物，所述的線性聚合物含有核苷酸片段和聚醚片段，其中聚醚片段包括含有線性聚合片段的A型聚合片段，它的重復(fù)單元具有的平均Hansch-Leo片段常數(shù)約小于或等于-0.4且具有的分子量在約30和約500之間，其中至少約80％連接聚醚片段的重復(fù)單元的鍵含有醚鍵。19.權(quán)利要求18的多核苷酸組合物，其中所述的多核苷酸衍生物含有以下通式的聚合物A-pN，pN-A，A-pN-A′，pH-A-B，B-A-pN(IX-a)(X-a)(XI)(XII)(XIII)A-pN-R，R-A-pN，A-R-pN，pN-A-R，R-pN-A，pN-R-A(IX-b)(IX-c)(IX-d)(X-b)(X-c)(X-d)pN-A-B-A′，A-B-A′-pN，pN-B-A′-B′，B-A′-B′-pN(X-e)(X-f)(X-g)(X-h)pN-A-B-A′-pN，pN-B-A′-B′-pN(X-i)(X-j)其中pN代表一種具有5′至3′取向的多核苷酸，其中A和A′是A型線性聚合片段，其中B和B′是B型線性聚醚片段，它們的重復(fù)單元具有的平均Hansch-Leo片段常數(shù)約大于或等于-0.4且具有的分子量是在約30和約500之間，其中至少約80％連接聚醚片段的重復(fù)單元的鍵含有醚鍵，且在上述通式中，R和R′是含有多個陽離子重復(fù)單元的聚合片段。20.權(quán)利要求18的多核苷酸組合物，其中多核苷酸衍生物包含至少一種第二聚醚片段，它可以包括含有線性聚合片段的A型聚醚片段或B型聚醚片段，它們的重復(fù)單元具有的平均Hansch-Leo常數(shù)約大于或等于-0.4且具有的分子量在約30和約500之間，其中至少約80％連接B型聚醚片段的重復(fù)單元的鍵含有醚鍵。21.一種聚陽離子聚合物，其包含含有聚醚片段和聚陽離子片段的嵌段共聚物，其中所述的聚醚片段包括(a)(1)含有線性聚合片段的A型聚合片段或(2)含有線性聚合片段的B型聚合片段中的至少一種，其中A型聚合片段的重復(fù)單元具有的平均Hansch-Leo片段常數(shù)約小于或等于-0.4且具有的分子量在約30和約500之間，B型聚合片段的重復(fù)單元具有的平均Hansch-Leo片段常數(shù)約大于或等于-0.4且具有的分子量在約30和約500之間，其中至少約80％連接上述兩種聚合片段中任何一種的重復(fù)單元的鍵含有醚鍵，和(b)一種聚陽離子片段，它含有多個通式為-NH-Ro-的陽離子重復(fù)單元，其中Ro是2至6個碳原子的直鏈脂族基團(tuán)，它可以被取代。22.權(quán)利要求21的含有一種嵌段共聚物的聚陽離子聚合物，它包含以下通式的嵌段共聚物B-A-R，A-R，A-R-A′和R-A-R′，(V)(VI)(VII)(VIII)其中A和A′是A型線性聚合片段，B是B型線性聚合片段，且R和R′是含有多個通式為-NH-Ro-的陽離子重復(fù)單元的聚陽離子片段，其中Ro是2至6個碳原子的直鏈脂族基團(tuán)，它可以被取代。23.一種聚陽離子聚合物，其包含多個以下通式的重復(fù)單元其中R8是(1)-(CH2)n-CH(R13)-，其中n是0至約5的整數(shù)且R13是氫，具有3-8個碳原子的環(huán)烷基，具有1-6個碳原子的烷基，或(CH2)mR14，其中m是從1至約12的整數(shù)且R14是6至20個碳原子的親脂取代基；(2)一種具有3-8個環(huán)碳原子的碳環(huán)基團(tuán)，它可以包括具有1-6個碳原子的烷基，具有1-6個碳原子的烷氧基，具有1-6個碳原子的烷基氨基，其中烷基各自獨(dú)立地具有1-6個碳原子的二烷基氨基，氨基，磺?；?，羥基，羧基，氟或氯取代基；或(3)一種具有3-8個環(huán)原子的雜環(huán)基團(tuán)，它可以包括雜環(huán)烷基或芳香雜環(huán)基，可以包括1至4個選自氧、氮、硫和其混合物的雜原子，還可以包括具有1-6個碳原子的烷基，具有1-6個碳原子的烷氧基，具有1-6個碳原子的烷基氨基，其中烷基各自獨(dú)立地具有1-6個碳原子的二烷基氨基，氨基，磺?；?，羥基，羧基，氟或氯取代基；R9是一種1至12個碳原子的直鏈脂族基團(tuán)，且R10，R11和R12獨(dú)立地是氫，1-4個碳原子的烷基基團(tuán)。全文摘要本發(fā)明提供了用于穩(wěn)定多核酸并增加多核酸通過細(xì)胞膜且在細(xì)胞內(nèi)起作用的能力的組合物。一方面,本發(fā)明提供了一種多核苷酸與某些聚醚嵌段共聚物之間形成的多核苷酸復(fù)合物。優(yōu)選地,多核苷酸復(fù)合物進(jìn)一步包括一種聚陽離子聚合物。另一方面,本發(fā)明提供了一種多核苷酸與含有一種聚醚嵌段和一種聚陽離子嵌段的嵌段共聚物之間形成的多核苷酸復(fù)合物。另一方面,本發(fā)明提供了在5′或3′末端共價修飾以結(jié)合聚醚聚合物片段的多核苷酸。另一方面,本發(fā)明提供了某些優(yōu)選的聚陽離子聚合物。文檔編號A61K31/70GK1173128SQ95197357公開日1998年2月11日申請日期1995年11月17日優(yōu)先權(quán)日1994年11月18日發(fā)明者A·V·卡巴諾夫,V·Y·阿拉科夫,S·V·維諾格拉斗夫申請人:休普拉特克藥品有限公司