專利名稱：肽p277類似物及含有它們的診斷和治療糖尿病的藥物組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及新的肽類，它們是人60KDa熱休克蛋白(hsp60)的抗原決定基的變異型。本發(fā)明還涉及含有它們的藥物組合物和用這種肽類診斷和治療胰島素依賴性糖尿病(IDDM)的方法。
I型糖尿病，或IDDM，是一種自身免疫性疾病。它是由攻擊和破壞胰島素生成β-細(xì)胞的T細(xì)胞引起的。該產(chǎn)生胰島素的β-細(xì)胞位于胰島中(Castano和Eisenbarth，1990)。該自身免疫發(fā)展到高峰時胰島素依賴性糖尿病的開始和發(fā)展不伴隨有任何癥狀。這種疾病只有當(dāng)β-細(xì)胞的累積損失超載了殘余β-細(xì)胞提供胰島素的能力時才在臨床上顯現(xiàn)出來。事實上，葡萄糖體內(nèi)平衡的失控以及IDDM臨床癥狀的產(chǎn)生被認(rèn)為是在80-90％的β-細(xì)胞被免疫系統(tǒng)失活之后發(fā)生的。因而，被確診為患有IDDM的病人其β-細(xì)胞被自身免疫破壞的程度一定相當(dāng)嚴(yán)重。而且，通過檢測β-細(xì)胞自身免疫的免疫學(xué)標(biāo)記而進(jìn)行的對初期患者，即無臨床癥狀的糖尿病患者的診斷只有當(dāng)自身免疫過程開始以后才能進(jìn)行。因而，治療方法的探索就是去尋找一種安全、有特異性并且有效的方法來阻止已相當(dāng)嚴(yán)重的自身免疫過程。
本發(fā)明人以前通過研究NOD品系的小鼠中產(chǎn)生的自發(fā)性糖尿病已研究過這一問題。NOD品系小鼠中產(chǎn)生的這種糖尿病被認(rèn)為是人IDDM精確的模型(Castano和Eisebarth，1990)。NOD小鼠在約4周齡產(chǎn)生胰島炎，開始為輕微的胰島周圍浸潤，然后發(fā)展為嚴(yán)重的胰島內(nèi)炎癥。表明胰島素不足的高血糖癥在這種雌性小鼠中約14-17周齡時開始出現(xiàn)。到35-40周齡時幾乎所有的雌性NOD小鼠都產(chǎn)生了嚴(yán)重的糖尿病，并在不進(jìn)行胰島素治療的情況下全部死亡。雄性NOD小鼠的發(fā)病率較低，其原因尚不清楚。已證明NOD小鼠的糖尿病是由自身免疫性T細(xì)胞引起的(Bendelac等，1987)。
針對各種抗原的T細(xì)胞反應(yīng)性和自身抗體已在IDDM病人以及NOD小鼠中進(jìn)行了檢測(Elias，1994)，但并不清楚對可能的靶抗原中任何單一的一種的免疫性是否該疾病的主要原因。除了對病因的探討之外就是對治療方法的探討。
已經(jīng)證實，NOD小鼠自身免疫過程的起始可通過將小鼠在糖尿病發(fā)作前進(jìn)行各種處理來阻止。這種處理包括例如限制飲食、病毒感染或?qū)γ庖呦到y(tǒng)的非特異性刺激(Bowman等，1994)。NOD糖尿病也可以通過在糖尿病發(fā)作前的小鼠中誘導(dǎo)對抗原谷氨酸脫羧酸(GAD)的免疫耐受來進(jìn)行預(yù)防(Kaufman等，1997；Tisch等，1993)。
本發(fā)明人以前已發(fā)現(xiàn)，NOD小鼠的糖尿病可通過用T細(xì)胞免疫接種來預(yù)防。該T細(xì)胞免疫接種使用的是特異于人hsp60分子的p277肽序列的T細(xì)胞(Elias等，1991)。該蛋白質(zhì)以前被稱為hsp65，但由于已得到了其更準(zhǔn)確的分子量，現(xiàn)在被命名為hsp60。雖然名稱不同，但表示同一種蛋白質(zhì)。
p277肽為與IDDM相關(guān)的人hsp60的抗原決定簇，相應(yīng)于人hsp60序列的437-460位序列。它被首次描述于本發(fā)明申請人的以色列專利申請No.9421中以及Elias和，Cohen，1997的文章中，其序列如下Val-Leu-Gly-Gly-Gly-Cys-Ala-Leu-Leu-Arg-Cys-Ile-Pro-Ala-Leu-Asp-Ser-Leu-Thr-Pro-Ala-Asn-Glu-Asp(SEQ ID NO1)在胰島炎發(fā)作時施用p277肽本身也顯示可阻止糖尿病的發(fā)展。這可能是向下調(diào)節(jié)抗-p277免疫性引起的，而抗-p277的免疫性對NOD糖尿病來說是必須的(Elias)等，1991；以色列專利申請No.94241)。最近的研究表明，p277肽也可用于逆轉(zhuǎn)已相當(dāng)嚴(yán)重的β-細(xì)胞自身免疫性(Elias和Cohen，1994)。本發(fā)明人的研究小組最近報道了一種自身免疫性糖尿病可在C57BL/KsL品系的小鼠中誘發(fā)。這是通過施用非常低劑量的β-細(xì)胞毒素鏈脲佐菌素(STZ)進(jìn)行的(Elias等，1994)。以日用量為40mg/kg的標(biāo)準(zhǔn)低劑量，將STZ施用5天通常在3周內(nèi)誘發(fā)臨床糖尿病。而以30mg/kg的劑量施用5天只有在約3個月的滯后期才誘發(fā)出臨床糖尿病。誘發(fā)糖尿病的這一現(xiàn)象伴隨著對胰島素的自身抗體、對胰島素自身抗體的抗特異型抗體以及對hsp60的自身抗體的前癥狀期的出現(xiàn)。這種小鼠也表現(xiàn)出對hsp60和對其p277肽的自發(fā)性T-細(xì)胞反應(yīng)性(Elias等，1994)。因而，比標(biāo)準(zhǔn)低劑量更低的STZ所誘發(fā)的自身免疫過程好象與NOD小鼠產(chǎn)生的自發(fā)性糖尿病中所觀察到的自身免疫過程相同(Elias等，1990)。
本發(fā)明的一個目的是提供變異型的肽p277，這種變異型肽可用于診斷和治療IDDM。
在一個對肽p277的片段和變異型的研究中，我們意外地發(fā)現(xiàn)，其中唯一的蘇氨酸殘基被賴氨酸殘基取代和/或一個或兩個半胱氨酸殘基被纈氨酸殘基取代的這種肽在糖尿病的治療中同p277一樣具有活性。由于半胱氨酸殘基被絲氨酸殘基替換常引起肽的失活，這一結(jié)果更使人感到意外。
因而本發(fā)明涉及含有序列I的肽6 11Val-Leu-Gly-Gly-Gly-X1-Ala-Leu-Leu-Arg-X2-Ile-Pro-(I)19Ala-Leu-Asp-Ser-Leu-X3-Pro-Ala-Asn-Glu-Asp(SEQ ID NO2)其中X1和X2每一個是一個Cys或Val殘基，和X3是一個Thr或Lys殘基，但當(dāng)X3是一個Thr殘基時，X1和X2不能均為Cys殘基。
在本發(fā)明的特定實施例中，該肽由序列I組成，其中X1和X2均為Cys和X3為Lys，本文中的p277(Lys19)(SEQ ID NO3)或X1是Val，X2是Cys和X3是Thr或Lys，分別為本文中的p277(Val6)(SEQ ID NO4)和p277(Val6-Lys19)(SEQ ID NO5)；或者X1是Cys，X2是Val和X3是Thr或Lys，分別為本文中的p277(Val11)(SEQ ID NO6)和p277(Val11-Lys19)(SEQ IDNO7)；或者X1和X2均為Val和X3是Thr或Lys，分別為本文中的p277(Val6-Val11)(SEQ ID NO8)和p277(Val6，11-Lys19)(SEQ ID NO9)。本文中也將p277(Val6-Val11)肽稱為p277(V)。
本發(fā)明的另一個目的是提供使用序列I的肽對IDDM進(jìn)行早期診斷的方法和試劑盒。動物在IDDM的發(fā)展過程中表達(dá)hsp60分子或與其交叉反應(yīng)的分子，這些分子可發(fā)現(xiàn)于動物的血液和尿中。它們也表達(dá)特異地針對于這些分子的抗體和T細(xì)胞。因而，在血液或尿中hsp60(或與其交叉反應(yīng)的分子)或與它們具有特異性的抗體或T細(xì)胞的存在可以用作在β-細(xì)胞被完全破壞前和個體被注定為終生糖尿病前檢測IDDM進(jìn)程的測試指標(biāo)。
病人是否患有或開始患有IDDM可通過檢測所說患者的血液或尿中抗-hsp60抗體的存在或與人hsp60具有免疫反應(yīng)性的T細(xì)胞的存在來進(jìn)行診斷。所使用的是作為抗原的本發(fā)明的序列I的肽。實際上，上文所述的可用肽p277操作的任一種方法(例如PCT國際申請公開號NO.WO90/10449所述的方法，引入本文作為參考)也可用本發(fā)明序列I的肽替換p277來進(jìn)行操作。
因而，本發(fā)明提供了一種診斷病人是否患有或開始患有IDDM的方法，包括檢測所說病人是否存在抗-hsp60抗體或是否存在與hsp60進(jìn)行免疫反應(yīng)的T細(xì)胞。其中表明抗-hsp60存在、表明與hsp60免疫反應(yīng)的T細(xì)胞存在、或表明一種T細(xì)胞或與hsp60免疫反應(yīng)的T細(xì)胞存在的陽性結(jié)果即表明病人很有可能患有或開始患有IDDM。
在診斷IDDM的方法中可對病人檢測抗-hsp60抗體的存在，其中所說的檢測方法可包括放射免疫檢測或ELISA檢測。
也可對病人檢測與hsp60免疫反應(yīng)的T細(xì)胞的存在。在有關(guān)這方面的一個實施例中該檢測方法包括T細(xì)胞繁殖檢測，包括以下步驟(i)從病人體中抽取血液樣品，制備含有T細(xì)胞的單核細(xì)胞組群。
(ii)向該單核細(xì)胞組群中加入一種抗原，該抗原選自本發(fā)明的序列I的肽。
(iii)在所說抗原的存在下將該細(xì)胞組群在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)條件下溫育適當(dāng)長的時間。
(iv)在所說溫育時間結(jié)束前適當(dāng)時間向(iii)的細(xì)胞培養(yǎng)物中加入一種標(biāo)記的核苷酸，從而使所說標(biāo)記的核苷酸摻入到增殖中的T細(xì)胞的DNA中；和(v)通過分析標(biāo)記核苷酸摻入到所說T細(xì)胞中的量來確定增殖的T細(xì)胞的量。
在上述步驟(iv)中，所說標(biāo)記核苷酸優(yōu)選為3H-胸苷。增殖T細(xì)胞量的確定是通過用標(biāo)準(zhǔn)方法計算T細(xì)胞的刺激指數(shù)(Stimulation index)來進(jìn)行的。
在本發(fā)明這一方面的另一個實施例中，該檢測方法包括T細(xì)胞細(xì)胞分裂素(Cytokine)響應(yīng)測試，其中步驟(i)至(iii)與上述T細(xì)胞增殖檢測相同，在第四(iv)步驟中，由響應(yīng)性淋巴細(xì)胞分泌至培養(yǎng)基中的細(xì)胞分裂素例如IFN-γ，IL-2，IL-4，IL-6，IL-10，TNFα或TGFβ的存在通過標(biāo)準(zhǔn)方法用商品試劑盒進(jìn)行檢測。
另一方面，本發(fā)明提供了一種體內(nèi)方法，其中將一種選自序列I肽的抗原皮下注射給病人，并觀察可檢測性皮膚反應(yīng)(DTH)的發(fā)生。
本發(fā)明也涉及進(jìn)行這種測試的方法，以及進(jìn)行這種測試所用的試劑盒。該試劑盒可制備成可進(jìn)行本發(fā)明中任意一種測試方法的形式。每一個這種試劑盒包括進(jìn)行單個的測試或一定數(shù)目的多個測試所需的全部材料。例如，用于確定抗-hsp60是否存在的試劑盒可含有固相固定化的序列I的肽和一種可識別待測抗-hsp60抗體恒定區(qū)域的標(biāo)記抗體，如標(biāo)記的抗-人Fab抗體。該試劑盒也包括使用這種試劑盒的說明書和盛裝試劑盒材料的容器?？墒褂萌我环N常規(guī)的標(biāo)記物，如放射性同位素，酶，發(fā)色團(tuán)或發(fā)熒光團(tuán)。典型的放射性同位素是碘-125或硫-35。用于這一目的的典型的酶包括辣根過氧化物酶，β-半乳糖苷酶和堿性磷酸酶。
通過檢測抗-hsp60抗體來診斷IDDM的試劑盒包括(i)一種抗原，它選自序列I的肽，和(ii)一種標(biāo)記抗體，它可識別所說待測抗-hsp60抗體的恒定區(qū)。
通過檢測與hsp60免疫反應(yīng)的T細(xì)胞來診斷IDDM的試劑盒包括(i)一種抗原，它選自序列I的肽；(ii)一種培養(yǎng)淋巴細(xì)胞(T細(xì)胞)的適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基；和(iii)一種用于T細(xì)胞增殖檢測的標(biāo)記核苷酸，或一種用于細(xì)胞分裂素檢測的試劑盒，細(xì)胞分裂素，如，IFN-γ，IL-2，IL-4，IL-6，IL-10，TNFα或TGFβ。
對于體內(nèi)檢測來說，該試劑只包括適當(dāng)形式的用于注射的序列I肽。
本發(fā)明還涉及用于預(yù)防或治療IDDM的方法。用本發(fā)明的序列I的肽抗原免疫接種可特異性地向下調(diào)節(jié)對該抗原的自身免疫性，并可有效地產(chǎn)生對IDDM自身免疫過程的抵抗力。用特異于這種抗原的T細(xì)胞接種可以達(dá)到同樣效果。這種T細(xì)胞可以其減毒的或非毒性形式，或以為提高其免疫原性的處理后形式，或其碎片或活性部分的形式使用。如果病人已顯示患有臨床前的早期IDDM，用這種抗原或T細(xì)胞(或其部分)注射可向下調(diào)節(jié)對該抗原的自身免疫性，從而在嚴(yán)重的、永久性的損害產(chǎn)生前阻止該自身免疫過程。該肽也可用作治療劑，即使在該自身免疫性已相當(dāng)嚴(yán)重時阻止它的發(fā)展，正如最近本發(fā)明的發(fā)明人用肽p277治療NOD小鼠時所顯示的那樣(Elias和Cohen，1994)。
因而，本發(fā)明提供了一種預(yù)防或治療胰島素依賴性糖尿病(IDDM)的制劑，包括選自下組的T細(xì)胞產(chǎn)物(a)顯示出對人hsp60的p277序列具有特異性的人T細(xì)胞，該細(xì)胞已在所說序列I的肽存在下溫育而被活化；(b)(a)的所說人T細(xì)胞，它們已被照射過或減毒過；(c)(a)的所說人T細(xì)胞，它們已被用靜水壓壓力處理過，用化學(xué)交聯(lián)劑處理過和/或用細(xì)胞骨架交聯(lián)劑處理過；(d)(a)、(b)或(c)中的T細(xì)胞的碎片或其上脫落的表面蛋白質(zhì)；或(e)基本上由特異于所說蛋白質(zhì)的(a)的受體的可變區(qū)組成的肽，或它的鹽、功能衍生物、前體或活性部分。
在本發(fā)明的一個最佳實施例中，該制劑含有從待治療IDDM病人獲得的自體人T細(xì)胞，該T細(xì)胞已通過在體外與所說序列I的肽相接觸而被活化。然后將這些特異的和活化的T細(xì)胞施用于它們來源的同一個病人。
本發(fā)明也提供了一種預(yù)防和治療IDDM的藥物組合物，包括藥用可接受的載體以及作為活性組分的有效量的序列I的肽、其鹽或活性衍生物。該藥用可接受的載體優(yōu)選為油載體，例如被稱為不完全佛氏佐劑(IFA)的礦物油乳劑。然而，IFA以及完全佛氏佐劑(CFA；一種含有不同量的殺死的分枝桿菌生物體的礦物油制劑)不能用于人類，因為礦物油是不可代謝的，不能被身體降解。
本發(fā)明人現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，一些多年來一直用于人類患者靜脈內(nèi)營養(yǎng)物的脂肪乳劑也可用作用本發(fā)明肽進(jìn)行肽治療的載體。這種乳劑的兩個例子是可通過商業(yè)途徑獲得的乳劑，被稱為Intralipid和Lipofundin?！癐ntralipid”是瑞典Kabi Pharmacia的注冊商標(biāo)，其產(chǎn)品是一種用作靜脈內(nèi)營養(yǎng)物的脂肪乳劑，描述于美國專利No.3169094?！癓ipofundin”是德國B.Braun Melsungen的注冊商標(biāo)。這兩種產(chǎn)品均含有作為脂肪的大豆油(100ml蒸餾水中含有100或200g分別為10％或20％)。在Introlipid中，卵黃磷脂被用作乳化劑(12g/L蒸餾水)，在Lipofundin中用的是卵黃卵磷脂(12g/L蒸餾水)。在Introlipid和Lipofundin中加入甘油(25g/L)后產(chǎn)生等滲性。
本發(fā)明還涉及預(yù)防和治療IDDM的方法，包括給需要進(jìn)行預(yù)防和治療的病人施用一種組合物，該組合物含有序列I的肽或一種制劑，該制劑含有與本發(fā)明的所說序列I的肽具有特異性的T細(xì)胞。
附圖簡要說明

圖1表明p277和p277(Val6-Val11)穩(wěn)定性。實心圓圈代表使用p277的結(jié)果，空心圓圈代表p277(Val6-Val11)的結(jié)果。大圓圈代表貯存一周后的結(jié)果，中等圓圈代表9周以后，最小的圓圈代表20周以后。
圖2表明致糖尿病的NOD T細(xì)胞克隆C9在對肽p277(實心圓圈)和p277(Val6-Val11)(實心圓圈)所做出相應(yīng)反應(yīng)時的增殖。
圖3表明NOD脾T細(xì)胞在肽p277(Lys19)存在時的增殖。在每一周齡組測試了5只雌雄NOD小鼠的脾的T細(xì)胞在響應(yīng)肽p277(Lys19)(實心圓圈)，p277(空心圓圈)和對照肽p278(實心方塊)時的增殖。
圖4表明致糖尿病的NOD T細(xì)胞克隆C9在響應(yīng)肽p277(Lys19)時的增殖。
圖5表明用IFA中的p277(v)預(yù)處理來預(yù)防STZ-誘導(dǎo)的糖尿病與對照處理或用GADp34處理相比的有效性。
本發(fā)明的內(nèi)容詳細(xì)描述如下，本發(fā)明中所述的“序列I的肽”，只要這些肽保持其與糖尿病相關(guān)的生物活性，它們的鹽和功能性衍生物也一并加以考慮。
本發(fā)明所說的肽I的“鹽”是生理上可接受的有機(jī)和無機(jī)鹽。
本文所述的肽I的“功能衍生物”包括可用現(xiàn)有技術(shù)的方法從功能基團(tuán)制備的衍生物，這些功能基團(tuán)位于殘基的側(cè)鏈上或N-或C-未端基團(tuán)上。這些“功能衍生物”只要它們保持藥物可接受性，包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)，即它們不被壞該肽的活性(是指與已知的p277活性具有的相似性而言)，不使包含它的組合物產(chǎn)生毒害性質(zhì)并且對其抗原性質(zhì)沒有不良影響。這樣“功能衍生物”不包括在效果上為一種氨基酸轉(zhuǎn)變成另一種氨基酸的變化。
根據(jù)上述定義的標(biāo)準(zhǔn)，這些衍生物可包括例如羧基脂肪酯，與氨或伯胺或仲胺反應(yīng)而生成的羧基的酰胺，通過與?；鶊F(tuán)(如烷?；鶊F(tuán)或碳環(huán)芳酰基團(tuán))發(fā)應(yīng)形成的氨基酸殘基自由氨基的N-?；苌?，或與?；鶊F(tuán)反應(yīng)而形成的自由羧基的O-酰基衍生物。
本發(fā)明序列I的肽在藥物組合物中可用作免疫原，尤其是在用于減輕或治療IDDM的疫苗中，也在用于診斷IDDM的診斷性組合物中用作抗原。用現(xiàn)有技術(shù)已知的方法制備的這些藥物和診斷性組合物也屬于本發(fā)明的范圍。
當(dāng)本發(fā)明的肽用于治療或用于預(yù)防疫苗時，它優(yōu)選與促進(jìn)自身免疫T細(xì)胞進(jìn)行TH1-TH2轉(zhuǎn)變的生物活性載體一起施用。CD4輔助類型的T細(xì)胞根據(jù)激活時它們分泌的細(xì)胞分裂素被分成兩個組群(Mosmann和Coffman，1989)TH1細(xì)胞分泌IL-2和IFN-γ，而TH2細(xì)胞分泌IL-4和IL-10。這樣的載體優(yōu)選為一種脂肪乳劑，含有10-20％的植物和/或動物來源的甘油三酯，1.2-2.4％的植物和/或動物來源的磷脂，2.25-4.5％的滲透調(diào)節(jié)劑，0-0.5％的抗氧化劑，加無菌水至100％。這樣的載體最優(yōu)選為Intralipid或Lipofundin。這種載體的用法描述于以色列專利申請(本發(fā)明人的案號為9523)，其申請日與本發(fā)明(本發(fā)明人的案號為9451A)的以色列專利申請日相同，其申請人與本發(fā)明為同一申請人。該申請的內(nèi)容全部引入本文作為參考。
本發(fā)明的治療用組合物可口服施用，也可腸胃外施用，例如皮下、肌肉、靜脈內(nèi)、鼻內(nèi)或直腸內(nèi)施用。
本文的實施例確立了用本發(fā)明的化合物或組合物對科學(xué)上可接受的人IDDM的動物模型進(jìn)行治療的有效性。實施例材料和方法(i)小鼠NOD/Lt品系近親交配的雌性小鼠是由Animal BreedingCenter of Weizman Institute of Science，rehovot，Israel提供的。這些小鼠在14至17周齡自發(fā)產(chǎn)生自身免疫性糖尿病，該病與人IDDM相仿。
(ii)肽肽是通過標(biāo)準(zhǔn)Fmoc化學(xué)方法用ABIMED合成儀(FRG)合成并用反相層析在HPLC上進(jìn)行了純化。用氨基酸分析法確證其序列。合成了下列肽p277肽；對照肽p278，其序列為Asn-Glu-Asp-Gln-Lys-Ile-Gly-Ile-Glu-Ile-Ile-Lys-Arg-Thr-Leu-Lys-Ile(SEQ ID NO10)，相應(yīng)于人hsp60分子的第458-474位序列；p277的片段p277的氨基側(cè)半分子(p277.N)，p277的羧基側(cè)半分子(p277.C)，和p277C與p278的組合(p277.C-p278)；肽p277(Lys19)；和對兩個半胱氨酸殘基具有不同氨基酸替換的肽p277，其序列如下具有橋聯(lián)(bridged)-SH基團(tuán)的p277(p277(橋聯(lián)Cys-Cys))；兩個半胱氨酸殘基均被纈氨酸取代(p277(Val6-Val11))或者均被絲氨酸取代(p277(Ser6-Ser11))的p277。
(iii)治療和隨后的觀察用p277、其它的肽或者小牛血清(BSA，購自Sigma，St.Louis，MO，USA)的乳液以0.1ml的體積從背部皮下注射的方式來處理小鼠。將該抗原用PBS稀釋，并用等體積的礦物油(不完全弗氏佐劑(IFA)；Sigma)或10％Intralipid乳化。以Elias等1991描述的方式，在非禁食狀態(tài)下，在上午10點檢測小鼠的血液葡萄糖水平。檢測時間為治療(7，12，15或17周齡)的時間，對于那些幸存的小鼠是在40周齡時。顯著的高血糖癥被認(rèn)為是在葡萄糖濃度為11.1mM/L或更高些，因為這一血葡萄糖濃度比在100個健康小鼠中測量到的平均血葡萄糖濃度高3個標(biāo)準(zhǔn)偏差(未提供數(shù)據(jù))。胰島的組織學(xué)檢查是在蘇木精和曙紅染色的切片上進(jìn)行的。這些切片由獨立的兩位觀測者計分，他們都不知道這些切片來自哪些小鼠。用X2檢測來確定各治療組之間的統(tǒng)計偏差。
(iv)T-細(xì)胞增殖檢測將C9克隆的細(xì)胞和得自雌性NOD小鼠的脾細(xì)胞懸浮液用前述方法(Elias等，1991)進(jìn)行T-細(xì)胞增殖檢測。簡言之，將1×105克隆細(xì)胞/ml或1×106脾細(xì)胞/ml在0.2ml培養(yǎng)基中并在5μg/ml的不同抗原存在或不存在情況下培養(yǎng)地微滴板小孔中，每種平行培養(yǎng)4份，培養(yǎng)時間為72小時。增殖情況通過在培養(yǎng)的最后12小時DNA中[3H]-胸苷的摻入量來測定。用刺激指數(shù)(Stimulation index)來計算結(jié)果在抗原存在時的平均測試cpm與沒有抗原時的平均對照cpm的比率。平行的四份樣品間平均cpm的標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于10％。在脾細(xì)胞實驗中對照cpm小于1000，在用C9細(xì)胞時小于200cpm。每個小鼠的脾是分別進(jìn)行檢測的。每組小鼠的結(jié)果以平均±SD表示。實施例1用p277或其片段治療NOD小鼠為檢測單獨的或組合在一起的p277肽的兩種12個氨基酸的半分子在NOD小鼠中是否像p277肽同樣有效，將雌性NOD小鼠在7周齡用50μg存在于油中的各種肽進(jìn)行皮下接種。確定小鼠在40周齡時的狀況。
結(jié)果示于表1。可以看出，對照hsp60肽p278對疾病的發(fā)展沒有影響在40個被處理的小鼠中，均患有糖尿病，在40周齡90％已死亡。相比之下，p277肽完全阻止了死亡的發(fā)生并治愈了20個被治療小鼠的60％。p277的片段效果稍差p277的氨基側(cè)半分子(p277.N)，p277的羧基側(cè)半分子(p277.C)及這兩種分子的混合物(p277.N，p277.C)的效果相當(dāng)于完整p277的一半。將肽p277.C通過合成與肽p278連接在一起以產(chǎn)生一個較長的肽；然而，p277.C-p278的效果并不比單獨的p277.C好。因而，可以斷定，完整的治療效果需要完整的p277肽。
表1用p277或其片段治療NOD小鼠40周齡時的糖尿病狀況。
*與用對照肽p278治療的組相比p＜0.01。實施例2用p277替換肽治療NOD小鼠用NOD小鼠檢測了下列肽p277，p277(橋聯(lián)Cys-Cys)，p277(Val6-Val11)和p277(Ser6-Ser11)。
用存在于0.2ml礦物油(IFA)乳液中的100μg肽通過皮下施用治療NOD雌性小鼠。這一治療是在12周齡時進(jìn)行的，在30周齡時計算糖尿病發(fā)生率。
如表2所示，p277(Val6-Val11)在治療糖尿病上與p277同樣有效。在沒有進(jìn)行治療的小鼠中，糖尿病的發(fā)生率為80％，而用p277和p277(Val6-Val11)治療的小鼠發(fā)病率分別為22％和23％。另一方面，無論是p277(橋聯(lián)Cys-Cys)或p277(Ser6-Ser11)均沒有治療效果。p277的另外兩種變異型，其中在第6位和第11位的半胱氨酸殘基被丙氨酸或γ-氨基丁酸殘基取代，當(dāng)用克隆C9細(xì)胞和NOD脾T-細(xì)胞進(jìn)行體外檢測時也均無效果。由于這兩種肽不被抗-p277特異性T細(xì)胞識別(未示出數(shù)據(jù))，沒有對它們進(jìn)行體內(nèi)治療效果的檢測。
表2用p277替代物對NOD小鼠治療
*與用單獨的佐劑處理的小鼠中糖尿病的發(fā)生率相比p＜0.01II與用單獨的佐劑處理的小鼠中糖尿病的發(fā)生率相比沒有顯著差異實施例3p277(Val6-Val11)的穩(wěn)定性由于對半胱氨酸進(jìn)行替換原因是p277肽的穩(wěn)定性差，在p277(Val6-Val11)合成后的不同時間對其進(jìn)行了穩(wěn)定性檢測。即在嚴(yán)格的條件下，p277肽也是不穩(wěn)定的并易被破壞(真空冷凍干粉，-20℃)。
為了對p277與其類似物p277(Val6-Val11)進(jìn)行穩(wěn)定性比較，將兩種肽在同一時間合成，并以干粉貯存于-20℃。在合成后的1、9和20周，稱取等量樣品，進(jìn)行溶解并測試。肽的穩(wěn)定性是用其刺激T細(xì)胞克隆C9的能力來體現(xiàn)的。圖1顯示了該試驗的結(jié)果。可以看出，雖然天然p277在合成后第9周喪失了其大部分效力并在第20周喪失了其全部效力，而p277(Val6-Val11)在貯存20周后其效力沒有變化。
由于p277的不穩(wěn)定性被認(rèn)為是由半胱氨酸殘基造成的，因而預(yù)期，保留p277生物活性的本發(fā)明的任一種它的類似物將具有比p277更好的穩(wěn)定性，這一改良是通過與本實施例中p277(Val6-Val11)所示的相類似的方式實現(xiàn)的。實施例4用p277或p277(Val6-Val11)治療NOD雌性小鼠逆轉(zhuǎn)了胰島炎。
用存在于0.1cc礦物油(不完全弗氏佐劑)乳液中的無修飾的p277或p277(Val6-Val11)，以100μg/小鼠的量在12周齡通過皮下注射治療NOD雌性小鼠。對照小鼠用的是PBS和礦物油的乳液。在6月齡時，每組殺死5只小鼠，取出胰臟，在布安氏液中固定，切片用蘇木精曙紅進(jìn)行染色。以雙盲方式對胰島炎進(jìn)行計分。由于對照小鼠發(fā)展成了嚴(yán)重的糖尿病，在5月齡將它們殺死。這時，對照小鼠的血葡萄糖水平在29-48mmol/L的范圍內(nèi)。結(jié)果示于表3。
表3用p277或p277(Val6-Val11)治療NOD雌性小鼠逆轉(zhuǎn)了胰島炎肽治療 胰島數(shù)目組織檢查(22周)清亮胰島周胰島炎 胰島內(nèi)胰島炎(12周) ％ ％％無8310 2367p277 4925 69 6p277(Val6-Val11)6252 3117在12周齡，即治療時，沒有治療的小鼠中約60％的胰島顯示出胰島內(nèi)胰島炎，約20％的胰島具有胰島周胰島炎，約20％的胰島沒有胰島炎。胰島內(nèi)浸潤被認(rèn)為是一種與β-細(xì)胞功能缺失相關(guān)的嚴(yán)重形式的胰島炎。如表3所示，與用單獨的油處理的對照小鼠相比，兩個治療組胰島表象的發(fā)展具有明顯的差異。用油處理的小鼠(對照)不受影響的胰島的比率呈漸進(jìn)性降低，到22周齡時只有10％正常胰島存在，這時所有的小鼠都明顯患有糖尿病。在22周齡時約67％的胰島顯示出胰島內(nèi)胰島炎，其余的23％的胰島顯示出胰島周胰島炎。相比之下，用p277或用p277(Val6-Val11)治療的小鼠顯示出正常胰島數(shù)量的上升(25％與52％之間)，并且具有胰島內(nèi)胰島炎的胰島的數(shù)量下降(6％與17％之間)。具有胰島周胰島炎的胰島的數(shù)量上升至約31％-69％。因而，p277和p277(Val6-Val11)治療是與組織學(xué)表象的改善相關(guān)的，并且與經(jīng)治療后持續(xù)了三個月以上的胰島炎嚴(yán)重程度的逆轉(zhuǎn)相一致。在雌性NOD小鼠中使用p277(V)的其它結(jié)果。
我們做了另外15個實驗，其中，將包括10只的NOD雌性小鼠的每個組在12-15周齡用油中的p277(V)或用單獨的油處理。在用單獨的油處理的總共150只小鼠中，90％發(fā)展成糖尿病并且在32周齡時85％已經(jīng)死亡。相比之下，用p277(V)治療的小鼠的糖尿病發(fā)生率僅為50％(P＜0.01)并且僅有20％因該病嚴(yán)重死亡(P＜0.01)。因而，用p277(V)的后期治療可有效地阻止致命的糖尿病的進(jìn)一步發(fā)展。實施例5用脂乳液中的p277(Val6-Val11)對I型糖尿病的肽治療胰臟中對產(chǎn)生胰島素β-細(xì)胞的自身免疫性破壞是由T-淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的。在胰島周圍的炎癥性侵潤在5-8周齡進(jìn)一步發(fā)展，導(dǎo)致胰島素缺失的β-細(xì)胞破壞以及明顯的糖尿病癥的出現(xiàn)發(fā)生于14-20周齡，到35-40周齡使幾乎100％的雌性NOD小鼠受到損害。
用存在于0.1ml PBS或10％脂乳液中的100μg的肽p277(Val6-Val11)的劑量通過皮下治療NOD每只雌性小鼠，該10％的脂乳液是由10％大豆油，1.2％卵磷脂和2.25％甘油組成的(Intralipid，Kabi Pharmacia AB，Sweden)。
在6月齡時對糖尿病發(fā)生率和抗-p277(Val6-Val11)抗體的產(chǎn)生進(jìn)行測定。持續(xù)的高血糖癥被診斷為糖尿病，即以一周的時間間隔用BeckmanGlucose Analyzer II至少兩次檢測到的血葡萄糖水平高于11.1mmol/L。由正常血葡萄糖濃度(低于11.1mmol/L)的維持、胰島內(nèi)胰島炎癥的減輕和作為TH2-型免疫應(yīng)答指示物的對該治療肽抗體的誘導(dǎo)來確定成功的肽治療。結(jié)果示于表4。
表4在6月齡時糖尿病的發(fā)病率治療 糖尿病發(fā)病率(％)死亡(％)p277(Val6-Val11)/PBS 9080p277(Val6-Val11)/Intralipid45* 20*無 100 90與沒有治療的NOD小鼠相比P＜0.01從表4可以看出，用存在于Intralipid中的本發(fā)明的肽治療可有效地降低糖尿病發(fā)病率和死亡率。另一方面，用存在于PBS中的肽進(jìn)行治療沒有效果。實施例6肽p277和p277(Val6-Val11)可發(fā)生免疫性交叉反應(yīng)。
將從糖尿病發(fā)病前的NOD小鼠中分離的T-細(xì)胞克隆C9的細(xì)胞與肽p277(實心圓)，p277(Val6-Val11)(空心圓)，p277(Ser6-Ser11)(實心方塊)和p277(橋聯(lián)Cys-Cys)(空心菱形)一起溫育。結(jié)果示于圖2。發(fā)現(xiàn)克隆C9只對肽p277和p277(Val6-Val11)顯示出增殖反應(yīng)。這證明了p277和p277(Val6-Val11)具有交叉反應(yīng)性，而治療效果稍差的肽p277(Ser6-Ser11)和p277(橋聯(lián)Cys-Cys)不具有免疫交叉反應(yīng)性。實施例7剛被確診為IDDM的患者顯示出對p277和p277(Val6-Val11)的T-細(xì)胞增殖反應(yīng)將剛被診斷(2-4周內(nèi))為IDDM的患者進(jìn)行增殖檢測試驗。從加有肝素的全血的ficol-hypaque上分離外周血淋巴細(xì)胞，并在體外篩查其被hsp60肽p277，p277(Val6-Val11)和對照肽p278所誘導(dǎo)的增殖性。這是用3H-胸苷摻入來測定的。T細(xì)胞的增殖反應(yīng)是用刺激指數(shù)(SI)來描述的由肽刺激的T細(xì)胞胸苷摻入與對照(不加入抗原時)T細(xì)胞胸苷摻入之比。
表5剛被診斷為IDDM的患者所顯示的對p277和p277(Val6-Val11)的T細(xì)胞增殖反應(yīng)患者T細(xì)胞增殖(SI)p277 p277(Val6-Val11) p278IDDM#68 3.53.2 0.8IDDM#69 2.55.0 0.5如表5所示，剛被診斷為IDDM的患者對p277(Val6-Val11)的反應(yīng)與對p277肽的反應(yīng)一樣好。因而，p277(Val6-Val11)與p277具有相同的免疫學(xué)性能。由于p277的治療效力是由其免疫識別性能介導(dǎo)的，因而p277(Val6-Val11)可與p277進(jìn)行免疫交叉反應(yīng)的事實表明了它可替代p277用于治療糖尿病。實施例8在IDDM和健康個體中對hap60和肽的T-細(xì)胞反應(yīng)將21個IDDM患者和14個健康供血者以實施例7的增殖檢測方法進(jìn)行抗-hsp60和p277(V)的篩查。表6和7顯示了每一個體對對照抗原(對照Ag)，即破傷風(fēng)類毒素和流感病毒-德克薩斯品系，對完整重組hsp60和對p277(V)的增殖T細(xì)胞響應(yīng)(刺激指數(shù)；SI)。SI值大于等于3時被認(rèn)為是陽性。
表6IDDM患者的增殖T細(xì)胞響應(yīng)患者年齡 確診后的時間 對下述物質(zhì)的T-細(xì)胞響應(yīng)(刺激指數(shù))(年)(周/月) 對照抗原 hsp60 p277(V)1. LM 32 3.5月+ + -2. G 25 24月 + + -3. H 23 6月 + + -4. DV 20 3周 + + -5周 + + +5. SD 15 6周 + + +6. P15 4周 + - -7. G60* 5周 + + +7周 + + +8. F45* 6周 + + +9. IS 53 2周 + + -10. T20 4周 + + +11. KK 21 4周 + + -12. RI 40 6周 + - -13. MS 5 1周 + - -14. KB 5 2月 + + +15. BI 11.33周 + - -16. YY 60 2月 + + -17. KA 12 4周 - - -18. ZA 12 4周 + + +19. A17.511.5年 + + +20. N17.57.5年+ + +21. A19.75.7年+ + +*抗-GAD抗體為陽性的患者，盡管是在高齡發(fā)病，是I型而不是II糖尿病表7健康血液供體的增殖T細(xì)胞響應(yīng)供體對下列物質(zhì)的T-細(xì)胞響應(yīng)(刺激指數(shù))對照抗原 hsp60p277(V)1 + --2 + --3 + nd +4 + --5 + ++6 + --7 + --8 + --9 + --10 + --11 + +-12 + --13 + +-14 + --nd沒做試驗表8總結(jié)了以上結(jié)果，顯示86％和52％的患者對hsp60和p277(V)響應(yīng)，相比之下對照為21％和14％(P＜0.05)。因而，IDDM對hsp60和p277(V)的響應(yīng)為顯著陽性?？傻贸龅慕Y(jié)論為在IDDM患者中hsp60和p277(V)反應(yīng)性個體的比率高于健康人群。
表8在IDDM和健康個體中陽性T-細(xì)胞反應(yīng)性的比率響應(yīng)者T-細(xì)胞響應(yīng)的比率(％)hsp60P277(V)IDDM 18/21(86)11/21(52)*健康人3/14(21) 2/14(14)*與健康血液供體中抗-p277(V)響應(yīng)者相比X2檢測P＜0.05實施例9對p277(Lys19)的NOD T-細(xì)胞增殖p277(Lys19)肽與p277相差一個氨基酸。為了證實p277(Lys19)是NODIDDM中的一個自身抗原，我們比較了對肽p277的T-細(xì)胞增殖和對肽p277(Lys19)的T-細(xì)胞增殖。圖3顯示了雌性NOD脾的T細(xì)胞對p277(Lys19)肽的增殖程度與p277相同。對對照肽p278沒有響應(yīng)。
用克隆C9證實了上述結(jié)果，一個致糖尿病NOD細(xì)胞被發(fā)現(xiàn)對人肽p277有響應(yīng)(Elias等，1991)。我們發(fā)現(xiàn)C9細(xì)胞對p277(Lys19)肽的增殖程度與對P277肽的相同(圖4)。實施例10用p277(Lys19)治療NOD雌性小鼠本發(fā)明人曾報道過，3月齡的老年雌性NOD小鼠所患的嚴(yán)重的胰島炎可被一次注射人p277對小鼠的治療而阻止；這些被治療的小鼠發(fā)展成為臨床上明顯的糖尿病的頻率和死于高血糖癥的頻率較低。為了檢測肽p277(Lys19)，小鼠自身的p277肽，是否也同樣有效，我們用存在于IFA中的100μg的人p277或p277(Lys19)治療3月齡老年雌性NOD小鼠。
將存在于磷酸緩沖液(PBS)中的濃度為2mg/ml的肽p277或p277(Lys19)用同等體積的不完全弗氏佐劑(IFA)乳化。將由10只雌性3月齡老年NOD小鼠的組通過皮下用0.1ml(100μg肽)含有兩種肽之一的乳液進(jìn)行注射。對照小鼠是用PBS和IFA的乳液進(jìn)行注射的。每4周將小鼠取血樣并用BeckmannGlucose AnalyzerII進(jìn)行血葡萄糖水平測定。在6月齡時對高血糖癥和由糖尿病而死亡的發(fā)生率進(jìn)行計分。如果小鼠的血葡萄水平高于11mmol/L則認(rèn)為它們患有糖尿病。
結(jié)果示于表9。在6月齡，90％的對照小鼠明顯患有高血糖癥并且60％死于糖尿病。相比之下，用p277或p277(Lys19)進(jìn)行治療可阻止糖尿病(分別為40％和50％發(fā)生率)和死亡(分別為10％和20％發(fā)生率)。因而，小鼠自身的肽p277(Lys19)在治療嚴(yán)重的胰島炎方面好象與外源的p277同樣有效。
表9用p277或p277(Lys19)治療糖尿病在3月齡時治療6月齡時的糖尿病高血糖癥(％)死亡率(％)p277(Lys19) 50* 20*p277 40* 10*PBS 90* 60*P＜0.05這些結(jié)果顯示，用人hsp60分子和其p277肽檢測的NOT T細(xì)胞的增殖應(yīng)答等同于對小鼠hsp60和對小鼠p277(Lys19)序列的自身免疫應(yīng)答。這一點被致糖尿病的C9 T細(xì)胞克隆以及具有糖尿病癥狀前的小鼠脾中正在發(fā)展的自發(fā)性響應(yīng)所證實。而且，p277(Lys19)與p277對治療NOD小鼠的糖尿病效果相同。周齡和性別相同的其它品系的小鼠的脾T細(xì)胞沒有顯示出對p277的自發(fā)性T-細(xì)胞增殖響應(yīng)(未示出數(shù)據(jù))。
由致糖尿病的T細(xì)胞靶擊的對小鼠hap60序列自身免疫性的這一發(fā)現(xiàn)支持了IDDM是由自身免疫過程造成的這一普遍認(rèn)識。實施例11用p277(V)治療STZ-誘發(fā)的糖尿病鏈脲佐菌素(STZ)是一種β-細(xì)胞特異性毒素，如果一次注射量為200mg/kg，它通過在24-48小時內(nèi)破壞β-細(xì)胞而造成毒性糖尿病。如果以小的亞毒性劑量給藥，它可誘發(fā)遺傳上敏感性小鼠的胰島炎而導(dǎo)致糖尿病。該炎癥病程依據(jù)STZ的用量可有20-30天。STZ誘發(fā)糖尿病的通常方案為，以每千克體重200mg STZ的用量，以40mg/kg的相同劑量連續(xù)5天給藥5次(Like和Rossini，1976)，這一模型被稱作低劑量STZ。我們發(fā)現(xiàn)，如果總用量降至150mg/kg(30mg/kg×5)在80-100天內(nèi)產(chǎn)生糖尿病。STZ-誘發(fā)糖尿病的這一慢速漸進(jìn)型模式可能更類似于人的自身免疫糖尿病，并且與NOD小鼠中自發(fā)性糖尿病的臨床前期病程相同(Castano和Eisenbarth，1990)。再者，當(dāng)劑量降低時，急性毒性效應(yīng)將會消失。
該60KDa的熱休克蛋白(hsp60)在NOD(Elias等，1990)和STZ誘發(fā)的(Elias等，1994)的糖尿病中都起一定作用。我們先前已經(jīng)證實，針對hsp60的抗體和T-細(xì)胞增殖響應(yīng)在明顯的糖尿病發(fā)作前均已存在。對hsp60具特異性的T細(xì)胞克隆來源于前糖尿病期的NOD小鼠，并且可被年幼的NOD(Elias等，1991)或τγσNOD小鼠接受并發(fā)作胰島炎和高血糖癥。該NOD致糖尿病的T細(xì)胞克隆識別hsp60序列437-460的24氨基酸的肽，我們稱之為p277。STZ誘發(fā)的糖尿病在前糖尿病期也伴隨有抗-p277T細(xì)胞響應(yīng)。
前述實施例顯示了p277(Val6-Val11)肽可保護(hù)NOD小鼠。本實驗檢測了p277(V)在低劑量STZ模型中的治療功效。
將每組10只的雄性小鼠用每天30mg/kg STZ的劑量處理5天。一周后，用100μg油中的p277(V)，一種由kanfman等1993描述的谷氨酸脫羧酶(GADp34)的肽，它參與NOD小鼠的糖尿病，或單獨的油對小鼠進(jìn)行治療。在第85天重復(fù)這一治療。在第100天，對小鼠取血樣，對血液檢測是否高血糖癥(葡萄糖濃度大于15mmol/L)。結(jié)果總結(jié)于圖5?？梢钥闯?，用GADp34治療和沒有治療的小鼠組的平均血葡萄糖水平處于高血糖的范圍內(nèi)。相比之下，用p277(V)治療的小鼠的平均血葡萄糖水平處于正常范圍內(nèi)。因而，p277(V)可有效地用于治療由STZ在雄性C57BL/ksj小鼠中誘發(fā)的糖尿病以及在遺傳上不相同的雌性NOD小鼠中產(chǎn)生的自發(fā)性糖尿病。p277(V)治療的應(yīng)用并不限于僅一種原因引起的糖尿病或僅一種基因型或性別。
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序列表(1)總信息表(i)申請人(A)名稱耶達(dá)研究與發(fā)展有限公司(B)街道P.O.Box95(C)城市Rehovot(E)國家以色列(F)郵編76100(A)名稱伊倫·R·科恩(B)街道11 Hankin Street(C)城市Rehovot(E)國家以色列(F)郵編76354(A)名稱戴娜·埃利亞斯(B)街道57 derech Yavne(C)城市Rehovot(E)國家以色列(F)郵編76344(A)名稱馬提蒂亞胡·弗里德金(B)街道23 Miller Street(C)城市Rehovot(E)國家以色列(F)郵編76284(ii)發(fā)明名稱肽p277類似物及含有它們的診斷和治療糖尿病的藥物組合物(iii)序列數(shù)目10(iv)計算機(jī)可讀形式(A)介質(zhì)類型軟盤(B)計算機(jī)IBM PC兼容(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件PatentIn Release#1.0，Version#1.30(EPO)(vi)在先申請資料(A)申請?zhí)朓L 112094(B)申請日21-DEC-1994(vi)在先申請資料(A)申請?zhí)朓L 114460(B)申請日05-JUL-1995(2)SEQ ID NO1的資料(i)序列特征(A)長度24個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO1Val Leu Gly Gly Gly Cys Ala Leu Leu Arg Cys Ile Pro Ala Leu Asp Ser Leu Thr Pro1 5 10 15 20Ala Asn Glu Asp(2)SEQ ID NO2的資料(i)序列特征(A)長度24個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ii)分子類型肽(ix)特點(A)名稱/關(guān)鍵詞肽(B)位置6，11，19(D)其它資料/注＝“在6/11位的Xaa＝Cys或Val；在19位的Xaa＝Thr或Lys；其中，當(dāng)19位的Xaa是Thr時，在6/11位的Xaa不都是Cys.”(xi)序列描述SEQ ID NO2Val Leu Gly Gly Gly Xaa Ala Leu Leu Arg Xaa Ile Pro Ala Leu Asp Ser Leu Xaa1 5 10 15Pro Ala Asn Glu Asp20(2)SEQ ID NO3的資料(i)序列特征(A)長度24個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO3Val Leu Gly Gly Gly Cys Ala Leu Leu Arg Cys Ile Pro Ala Leu Asp Ser Leu Lys Pro1 5 10 15 20Ala Asn Glu Asp(2)SEQ ID NO4的資料(i)序列特征(A)長度24個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ii)分子類型肽(ix)特點(A)名稱/關(guān)鍵詞肽(B)位置19(D)其它資料/注＝“在19位的Xaa是Thr或Lys”(ix)序列描述SEQ ID NO4Val Leu Gly Gly Gly Val Ala Leu Leu Arg Cys Ile Pro Ala Leu Asp Ser Leu Xaa Pro1 5 10 15 20Ala Asn Glu Asp(2)SEQ ID NO5的資料(i)序列特征(A)長度24個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO5Val Leu Gly Gly Gly Val Ala Leu Leu Arg Cys Ile Pro Ala Leu Asp Ser Leu Lys Pro1 5 10 15 20Ala Asn Glu Asp(2)SEQ ID NO6的資料(i)序列特征(A)長度24個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ii)分子類型肽(ix)特點(A)名稱/關(guān)鍵詞肽(B)位置19(D)其它資料/注＝“19位的Xaa是Thr或Lys”(xi)序列描述SEQ ID NO6Val Leu Gly Gly Gly Cys Ala Leu Leu Arg Val Ile Pro Ala Leu Asp Ser Leu Xaa Pro1 5 10 15 20Ala Asn Glu Asp(2)SEQ ID NO7的資料(i)序列特征(A)長度24個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO7Val Leu Gly Gly Gly Cys Ala Leu Leu Arg Val Ile Pro Ala Leu Asp Ser Leu Lys Pro1 5 10 15 20Ala Asn Glu Asp(2)SEQ ID NO8的資料(i)序列特征(A)長度24個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ii)分子類型肽(ix)特點(A)名稱/關(guān)鍵詞肽(B)位置19(D)其它資料/注＝“19位的Xaa是Thr或Lys”(xi)序列描述SEQ ID NO8Val Leu Gly Gly Gly Val Ala Leu Leu Arg Val Ile Pro Ala Leu Asp Ser Leu Xaa Pro1 5 10 15 20Ala Asn Glu Asp(2)SEQ ID NO9的資料(i)序列特征(A)長度24個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO9Val Leu Gly Gly Gly Val Ala Leu Leu Arg Val Ile Pro Ala Leu Asp Ser Leu Lys Pro1 5 10 15 20Ala Asn Glu Asp(2)SEQ ID NO10的資料(i)序列特征(A)長度17個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO10Asn Glu Asp Gln Lys Ile Gly Ile Glu Ile Ile Lys Arg Thr Leu Lys Ile1 5 10 1權(quán)利要求
1.一種序列I的肽和其鹽及其功能衍生物6 11Val-Leu-Gly-Gly-Gly-X1-Ala-Leu-Leu-Arg-X2-Ile-Pro-(I)19Ala-Leu-Asp-Ser-Leu-X3-Pro-Ala-Asn-Glu-Asp(SEQ ID NO2)其中X1和X2各自是Cys或Val殘基，而X3是Thr或Lys殘基，但當(dāng)X3是Thr時X1和X2不能均為Cys殘基。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的本文稱作p277(Val6)的肽，其中X1是Val，X2是Cys和X3是Thr。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的本文稱作p277(Val11)的肽，其中X1是Cys，X2是Val和X3是Thr。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的本文稱作p277(Val6-Val11)的肽，其中X1和X2均為Val和X3為Thr。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的本文稱作p277(Lys19)的肽，其中X1和X2均為Cys和X3為Lys。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的本文稱作p277(Val6-Lys19)的肽，其中X1是Val，X2是Cys和X3是Lys。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的本文稱作p277(Val11-Lys19)的肽，其中X1是Cys，X2是Val和X3是Lys。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的本文稱作p277(Val6，11-Lys19)的肽，其中，X1和X2均為Val和X3是Lys。
9.將根據(jù)權(quán)利要求1-8中任意一項的肽用于診斷胰島素依賴性糖尿病(下文稱作IDDM)。
10.一種診斷病人是否患有或開始患有IDDM的方法，包含將權(quán)利要求1-8中任意一項的肽用作抗原檢測所說病人的血液或尿中與人hsp60免疫反應(yīng)的抗體或T細(xì)胞的存在。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，包含對所說病人檢測抗-hsp60抗體或與hsp60免疫反應(yīng)的T細(xì)胞的存在，其中，表明抗-hsp60抗體或與hsp60免疫反應(yīng)的T細(xì)胞的存在為陽性的結(jié)果即表明很可能患有或開始患有IDDM。
12.根據(jù)權(quán)利要求10或11所述方法，其中對所說病人檢測的是抗-hsp60抗體的存在。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中該檢測方法包含放射免疫測定。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其中該檢測方法包含ELISA測定。
15.一種使用權(quán)利要求10至14中任意一項所述的方法檢測抗-hsp60抗體的存在進(jìn)行診斷是否患有IDDM的試劑盒，包含(i)一種權(quán)利要求1中所述序列(I)肽抗原；和(ii)一種可識別所說待測抗-hsp60抗體的恒定區(qū)域的標(biāo)記抗體。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的試劑盒，其中所說抗原是權(quán)利要求2至8中任意一項的肽。
17.根據(jù)權(quán)利要求15或16所述的試劑盒，其中所說抗原在一固相上固定化。
18.根據(jù)權(quán)利要求15至17中任意一項所述的試劑盒，還包括使用該試劑盒診斷IDDM的說明書。
19.根據(jù)權(quán)利要求15至18中任意一項所述的試劑盒，其中該標(biāo)記物選自下組放射性同位素，酶，發(fā)色團(tuán)和發(fā)熒光團(tuán)。
20.根據(jù)權(quán)利要求10或11所述的方法，其中對所說病人檢測的是與hsp60免疫反應(yīng)的T細(xì)胞的存在。
21.根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，其中，包含T細(xì)胞增殖檢測的檢測方法，包含下列步驟(i)從所說病人的血樣中制備含有T細(xì)胞的單核細(xì)胞群組；(ii)向所說單核細(xì)胞群組中加入一種選自權(quán)利要求1的肽抗原；(iii)將所說細(xì)胞群組在所說抗原的存在下并在適宜的培養(yǎng)條件下溫育一段適當(dāng)長的時間。(iv)在所說溫育時間結(jié)束前的適當(dāng)時間，向(iii)的溫育的細(xì)胞培養(yǎng)物中加入標(biāo)記的核苷酸，以使所說標(biāo)記的核苷酸可摻入增殖T細(xì)胞的DNA中；和(v)通過分析標(biāo)記核苷酸摻入所說T細(xì)胞的量來確定增殖T細(xì)胞的量。
22.根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，其中包含T細(xì)胞細(xì)胞分裂響應(yīng)檢測的檢測方法包含以下步驟(i)從所說病人的血樣中制備含有T細(xì)胞的單核細(xì)胞群組；(ii)向所說單核細(xì)胞群組中加入選自權(quán)利要求1的肽抗原；(iii)在適宜的培養(yǎng)條件下將所說細(xì)胞組群在所說抗原的存在下溫育一段適當(dāng)長的時間；和(iv)檢測響應(yīng)的淋巴細(xì)胞分泌至培養(yǎng)基中的細(xì)胞分裂素(Cytokine)的存在。
23.根據(jù)權(quán)利要求22所述的方法，其中，該細(xì)胞分裂素是IFN-γ，IL-2，IL-4，IL-6，IL-10，TNF-α，或TGFβ。
24.一種根據(jù)權(quán)利要求10，11和21中任意一項所述的方法檢測與hsp60免疫反應(yīng)的T細(xì)胞的存在來診斷IDDM的試劑盒，包含(i)一種根據(jù)權(quán)利要求1所述的肽抗原；(ii)一種標(biāo)記的核苷酸；和(iii)一種用于培養(yǎng)淋巴細(xì)胞的適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基。
25.一種根據(jù)權(quán)利要求10、11、22和23中任意一項的方法檢測與hsp60免疫反應(yīng)的T細(xì)胞的存在來診斷IDDM的試劑盒，包含(i)一種權(quán)利要求1所述肽抗原；(ii)一種用于培養(yǎng)淋巴細(xì)胞的適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基；和(iii)一種用于檢測由響應(yīng)的淋巴細(xì)胞分泌至培養(yǎng)基中的細(xì)胞分裂素的存在的檢測試劑盒。
26.根據(jù)權(quán)利要求22至25中任意一項所述試劑盒，還包括使用該試劑盒診斷IDDM的說明書。
27.根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，其中選自權(quán)利要求1肽的所說抗原是通過皮下注射給病人的，然后觀察可檢測的皮膚反應(yīng)的發(fā)生。
28.一種預(yù)防或治療IDDM的制劑，包含選自下組的T細(xì)胞產(chǎn)物(a)表現(xiàn)出對人hsp60的p277序列具有特異性的人T細(xì)胞，該細(xì)胞已在權(quán)利要求1所述序列I肽存在下進(jìn)行溫育而被活化；(b)已被照射或通過其它方式而減毒的人T細(xì)胞；(c)已經(jīng)受了靜水壓壓力處理、用化學(xué)交聯(lián)劑進(jìn)行的處理和/或用細(xì)胞骨架交聯(lián)劑進(jìn)行的處理的人T細(xì)胞；(d)(a)(b)或(c)中T細(xì)胞的碎片或從其表面脫落的表面蛋白質(zhì)；或(e)基本上由對所說蛋白質(zhì)具特異性的(a)的受體的可變區(qū)域組成的肽，或其鹽、功能衍生物、前體或活性片段。
29.根據(jù)權(quán)利要求28所述的制劑，其中(a)的所說人T細(xì)胞是得自被治療的IDDM病人的自體T細(xì)胞，并且該T細(xì)胞的所說特異性是通過在體外與所說序列I的肽相接觸而產(chǎn)生的。
30.根據(jù)權(quán)利要求28或29所述的制劑，其中所說T細(xì)胞在體外產(chǎn)生對權(quán)利要求1的序列I的肽的特異性。
31.一種藥物組合物，包含權(quán)利要求1的序列I肽和藥用可接受的載體。
32.根據(jù)權(quán)利要求31所述的藥物組合物，用于預(yù)防和治療IDDM。
33.根據(jù)權(quán)利要求31或32所述的藥物組合物，其中所說的肽是根據(jù)權(quán)利要求2至8中任意一項的肽。
34.根據(jù)權(quán)利要求1至8中任意一項所述的肽，用于制備治療IDDM的藥物組合物。
35.一種預(yù)防和治療IDDM的方法，包含給人個體施用有效量的存在于適當(dāng)載體中的根據(jù)權(quán)利要求1的序列I肽。
全文摘要
一種具有hsp60的p277序列結(jié)構(gòu)的肽,其中一個或兩個半胱氨酸殘基被纈氨酸殘基替換和/或其中Thr
文檔編號A61K38/00GK1175214SQ95197680
公開日1998年3月4日 申請日期1995年12月20日 優(yōu)先權(quán)日1994年12月21日
發(fā)明者伊倫·R·科恩, 戴娜·埃利亞斯, 馬提蒂亞胡·弗里德金 申請人:耶達(dá)研究與發(fā)展有限公司