專利名稱：鏈激酶基因及其分離與表達(dá)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種生物工程藥物，特別是鏈激酶的基因及其分離與表達(dá)。
鏈激酶(Streptokinase，簡稱SK)是由β-溶血性鏈球菌產(chǎn)生的一種分泌性蛋白，是體內(nèi)血纖維蛋白溶酶原最有效的活化劑之一。1992年古巴有人在大腸桿菌中表達(dá)了鏈激酶基因(M.P.Estracla et al.High level expression of streptokinase in Escherichia coli.Bio/Technology vol.10，1992；1138-1142)。其方法是從似馬鏈球菌染色體DNA中釣取分離到SK基因，并將其克隆至分泌性表達(dá)載體pEG-3中，誘導(dǎo)培養(yǎng)后，SK以分泌形式表達(dá)，重組蛋白約占菌體總蛋白的25％。菌體破碎后重組蛋白先后用親和層析和陰離子交換層析方法得到SK純品。此種方法的不足之處主要是表達(dá)水平低，給下游的純化帶來不少困難。
1993年國內(nèi)也有人在大腸桿菌中表達(dá)了SK基因，但所用的基因是從國外引進(jìn)的(丁皓 朱運松等，基因工程鏈激酶(r-SK)純化及其單克隆抗體制備和鑒定，生物工程學(xué)報10(1)56-60，1994)。
本發(fā)明的目的是從中國人群分離的鏈球菌中釣取SK基因，提高其在大腸桿菌中的表達(dá)水平。
本發(fā)明的主要內(nèi)容是1、SK基因的分離從中國人群中分離得到化膿性鏈球菌，用乙醇沉淀法大量提取其染色體DNA，以所提取的染色體DNA為模板，通過PCR方法(POLYMERASECHAIN REACTION聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))大量擴增得到目的SK基因。2、SK基因的序列分析把分離到的SK基因插入M13mp19(單鏈?zhǔn)删w)中，根據(jù)相應(yīng)的酶切位點做四個測序亞克隆，然后對全長SK基因序列進(jìn)行序列分析。3、高效表達(dá)載體的構(gòu)建把獲得的SK基因和表達(dá)載體pBV220分別用EcoR I和BamH I雙酶切消化，再用T4DNA連接酶把酶切回收后的pBV220和SK基因定向連接起來，獲得有SK基因定向插入的重組表達(dá)載體，并命名為pBV-SK。4、SK基因的表達(dá)用熱誘導(dǎo)方法誘導(dǎo)SK基因在大腸桿菌中表達(dá)。采用SDS-PAGE蛋白電泳法及薄層掃描法測定其表達(dá)水平。
本發(fā)明從中國人群中分離到的化膿性鏈球菌中釣取SK基因，SK基因在大腸桿菌中的表達(dá)水平占菌體總蛋白的60％以上。序列同源性比較表明其活性部位十分保守，但在非活性部位V1區(qū)(第522-732堿基)和V2區(qū)(第810-870堿基)有較大變異。重組蛋白的純化產(chǎn)物具有溶解血塊的生物學(xué)活性。
實施例1、SK基因的分離用乙醇沉淀法從中國人群中分離的化膿性鏈菌中大量提取染色體DNA，設(shè)計并合成一對特異性引物，引物序列如下上游引物5’-GGAATTCAATGCAAGCTATTGCCGGGACTG-3’下游引物5’-CGGGATCCAGAAGATCGTGGCTATTCATC-3’以所提取的染色體為模板，通過PCR方法大量擴增得到目的SK基因，PCR反應(yīng)條件如下模板DNA 10μl上游引物1μl下游引物1μldNTP2μl10×Buffer 10μl滅菌水 75.5μl95℃，10分鐘后加入0.5μlTag DNA聚合酶，然后循環(huán)30次，每個循環(huán)包括94℃ 1’→50℃ 30”→72℃ 70”。2、SK全長序列分析把得到的SK基因定向插入M13mp19(單鏈?zhǔn)删w)方法如下雙酶消化SK基因M13mp19Ecok1 1μl 1μlBamH1 1μl 1μl10×Buffer 2μl 2μlSK的PCR產(chǎn)物16μl M13mp19 2μl滅菌水14μl20μl 20μl37℃反應(yīng)2小時，然后用低熔點瓊脂糖的方法分別回收酶切片斷。再用T4DNA連接酶把回收后的M13mp19和SK基因連接起來，反應(yīng)如下回收后的SK基因 7μl回收后的M13mp19 1μl10×T4DNA連接酶緩沖液1μlT4DNA連接酶 1μl10μl16℃溫浴過夜。把反應(yīng)完全的連接液轉(zhuǎn)化，用氯化鈣制備的新鮮大腸桿菌(JM101)的感受態(tài)細(xì)胞中，(方法參見J.Sambriik et al，Molecu-lar cloning a laboratory Mannual，2nd Edition 1989，CSH)。
挑取無色噬菌斑，篩選有SK基因插入的重組質(zhì)粒，用Backman自動測序儀對全長SK基因進(jìn)行序列分析。
序列分析表明與國外報道的基本一致。但有一小部分堿基發(fā)生變異。同源性比較表明，我們所獲得的SK基因與古巴研究組獲得的SK基因的同源性為87％，差異性主要集中在V1區(qū)(第522-732堿基)和V2區(qū)(第810-870堿基)。
r-SK編碼區(qū)核苷酸序列如表1。表1r-SK編碼區(qū)核苷酸序列***** SequenceSKSP1 *****Sequence length 1245 Residues10 20 30 40 50 60ATTGCTGGGT ATGGGTGGCT ACCAGACCGT CCACCTATCA ATAACAGCCA GTTAGTTGTG70 80 90100110120AGTATGGCAG GTATCGTTGA AGGTACCGAT AAAAAAGTTT TTATAAATTT TTTTGAAATC130140150160 170 180GATCTAACAT CACAACATGC TCACGGAGGA AAGACAGAGC AGGGCTTAAG TCCAAAATCA190200210220 230 240GAACCATTTG CTACAGATAA TGGCGCAATG CCACATAAAC TTGAAAAAGC TGACTTATTA250260270280 290 300ACAGCTATTC AAAAACAGCT GATCGCTAAC GTTCACAGTA ACGACGGCTA CTTTGAGGTC310320330340 350 360ATTGATTTTG CAAGCGATGC AACCATTACT GATCGAAACG GCAAGGTCTA CTTTGCTGAC370380390400 410 420AAAGATGGTT CGGTAACCTT GCCGACCCAA CCTGTCCAAG AATTTTTGCT AAGCGGGCAT430440450460 470 480GTGCGCGTTA GACCATATAA AGAAAAACCA GTACAAAATC AAGCGAAATC TGTTGATGTG490500510520 530 540AAATATACTG TACAGTTTAC TCCTTTAAAC CCTGATGACG ATTTCAGACC AGGTCTCAAA550560570580 590 600GATACTAAGC TATTGAAAAC ACTAGCTATC GGTGACACCA TCACATCTCA AGAATTACTA610620630640 650 660GCTCAAGCAC AAAGCATTTT AAACAAAACC CACCCAGGCT ATACGATTTA TGAACGTGAC670680690700 710 720TCTCATTGGC GGTTGACATT TTTCCCGGAC GATTTTTACC CGAGTGGAAT CCAAGAGTTT730740750760 770 780ACTTTACCGT TTCCAAAGAC CGGGAAACAA GCTTATGGGA TCAATAAAAA ATCTGGTCTG790800810820 830 840AATAAAGAAG GAAACAACAC TGACCTTATC TCTGAGAAAT ATTACATCCT TAAAAAAGGA850860870880 890 900GAGTCTCCGT ATGATCCCTT TGATCGCAGT CACTTGAAAC TGTTCACCAT CAAATACGTT910920930940 950 960GATGTCAACA CCAACGAATT GCTAAAAAGC GAGCAGCTCT TAACAGCTAG CGAACGTAAC970980990 1000 1010 1020TTAGACTTCA GAGATTTATA CGATCCTCGT GATAAGGCTA AACTACTCTA CAACAATCTT1030 1040 1050 1060 1070 1080GATGCTTTTG ATATCATGGA CTATACCTTA ACTGGAAAAG TAGAGGATAA TCACGATAAG1090 1100 1110 1120 1130 1140AATAATCGTG TCGTCACAGT TTATATGGGT AAGCGCCCTA AAGGGGCAAA GGGTAGCTAT1150 1160 1170 1180 1190 1200CATTTAGCTT ATGATAAAGA TCTCTATACC GAAGAAGAAC GAAAAGCTTA CAGCTACCTG1210 1220 1230 1240 1250 1260CGTTATACAG AGACACCTAT ACCTGATAAC CCTAAAGACA AATAA3、高效表達(dá)載體的構(gòu)建把獲得的SK基因和載表達(dá)載體pBV220用Ecok1和BamH1雙酶切消化。步驟如下外源SK基因 pBV220Ecok1 1μl1μlBamH1 1μl1μl10×Buffer 2μl2μlSKPCR產(chǎn)物 16μl pBV220 2μl滅菌水 14μl20μl 20μl37℃酶切2小時，然后用低熔點瓊脂糖的方法回收酶切片段，再用T4連接酶把酶切回收后的pV220和SK基因定向連接起來，連接反應(yīng)如下回收后的SK基因 7μl回收后的pBV220 1μl10×T4DNAligase buffer 1μlT4DNAligase buffer 1μl20μl
混合液溫育過夜。把反應(yīng)完全的反應(yīng)物轉(zhuǎn)化用氯化鈣制備的新鮮大腸桿菌(DH5α)的感受態(tài)細(xì)胞中，(方法參見J.Sambriik et al，Molecular cloning a laboratory Mannual，2nd Edition 1989，CSH)。用氨芐青霉素作為篩選標(biāo)志。爾后提取抗性菌落中的質(zhì)粒DNA，用Ecok1和BamH1雙酶切作進(jìn)一步的鑒定，獲得有SK基因插入的重組質(zhì)粒，并命名為pBV-SK。4、SK基因的誘導(dǎo)表達(dá)包含有重組質(zhì)粒pBV-SK的重組克隆用LB培養(yǎng)基活化后以1％的比例接種于加有氨芐青霉素的新鮮MacA培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)至對數(shù)中期(其OD值為0.4-0.6)，然后立刻轉(zhuǎn)入42℃水浴中繼續(xù)培養(yǎng)4-5小時。離心用TE懸浮沉淀，加入等體積的加樣緩沖液，SDS-PAGE蛋白電泳。在分子量47KD處出現(xiàn)一特異帶，對照菌中此位置無相應(yīng)帶。薄層掃描表明SK基因的表達(dá)量大于60％。
權(quán)利要求
1.生物工程藥物鏈激酶(r-SK)，其特征為，該藥物是從中國人群中分離到的鏈球菌中釣取的基因表達(dá)而得。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的鏈激酶，其核苷酸編碼序列如下***** SequenceSKSP1 *****Sequence length 1245 Residues10 20 30 40 50 60ATTGCTGGGT ATGGGTGGCT ACCAGACCGT CCACCTATCA ATAACAGCCA GTTAGTTGTG70 80 90100110120AGTATGGCAG GTATCGTTGA AGGTACCGAT AAAAAAGTTT TTATAAATTT TTTTGAAATC130140150160170180GATCTAACAT CACAACATGC TCACGGAGGA AAGACAGAGC AGGGCTTAAG TCCAAAATCA190200210220230240GAACCATTTG CTACAGATAA TGGCGCAATG CCACATAAAC TTGAAAAAGC TGACTTATTA250260270280290300ACAGCTATTC AAAAACAGCT GATCGCTAAC GTTCACAGTA ACGACGGCTA CTTTGAGGTC310320330340350360ATTGATTTTG CAAGCGATGC AACCATTACT GATCGAAACG GCAAGGTCTA CTTTGCTGAC370380390400410420AAAGATGGTT CGGTAACCTT GCCGACCCAA CCTGTCCAAG AATTTTTGCT AAGCGGGCAT430440450460470480GTGCGCGTTA GACCATATAA AGAAAAACCA GTACAAAATC AAGCGAAATC TGTTGATGTG490500510520530540AAATATACTG TACAGTTTAC TCCTTTAAAC CCTGATGACG ATTTCAGACC AGGTCTCAAA550560570580590600GATACTAAGC TATTGAAAAC ACTAGCTATC GGTGACACCA TCACATCTCA AGAATTACTA610620630640650660GCTCAAGCAC AAAGCATTTT AAACAAAACC CACCCAGGCT ATACGATTTA TGAACGTGAC670680690700710720TCTCATTGGC GGTTGACATT TTTCCCGGAC GATTTTTACC CGAGTGGAAT CCAAGAGTTT730740750760770780ACTTTACCGT TTCCAAAGAC CGGGAAACAA GCTTATGGGA TCAATAAAAA ATCTGGTCTG790800810820830840AATAAAGAAG GAAACAACAC TGACCTTATC TCTGAGAAAT ATTACATCCT TAAAAAAGGA850860870880890900GAGTCTCCGT ATGATCCCTT TGATCGCAGT CACTTGAAAC TGTTCACCAT CAAATACGTT910920930940950960GATGTCAACA CCAACGAATT GCTAAAAAGC GAGCAGCTCT TAACAGCTAG CGAACGTAAC970980990 1000 1010 1020TTAGACTTCA GAGATTTATA CGATCCTCGT GATAAGGCTA AACTACTCTA CAACAATCTT1030 1040 1050 1060 1070 1080GATGCTTTTG ATATCATGGA CTATACCTTA ACTGGAAAAG TAGAGGATAA TCACGATAAG1090 1100 11101120 11301140AATAATCGTG TCGTCACAGT TTATATGGGT AAGCGCCCTA AAGGGGCAAA GGGTAGCTAT1150 1160 11701180 11901200CATTTAGCTT ATGATAAAGA TCTCTATACC GAAGAAGAAC GAAAAGCTTA CAGCTACCTG1210 1220 12301240 12501260CGTTATACAG AGACACCTAT ACCTGATAAC CCTAAAGACA AATAA
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的鏈激酶基因的分離，其特征為所用特異性引物序列如下上游引物5’-GGAATTCAATGCAAGCTATTGCCGGGACTG-3’下游引物5’-CGGGATCCAGAAGATCGTGGCTATTCATC-3’
全文摘要
本發(fā)明涉及生物工程鏈激酶基因及其分離與表達(dá)。本發(fā)明從中國人群中分離得到的化膿性鏈球菌中提取其染色體DNA，通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(POLYMERASECHAINREACTION)大量擴增得到目的SK基因。SK基因在大腸桿菌中的表達(dá)水平占菌體總蛋白的60％以上，序列同源性比較表明其活性部位十分保守，但在非活性部位V1區(qū)(第522-732堿基)和V2區(qū)(第810-870堿基)有較大變異。
文檔編號A61K38/43GK1161376SQ9610336
公開日1997年10月8日 申請日期1996年4月4日 優(yōu)先權(quán)日1996年4月4日
發(fā)明者周俐梅, 王嘉璽, 鄒民吉 申請人:北京埃爾法生物醫(yī)學(xué)技術(shù)有限公司, 北京四環(huán)醫(yī)學(xué)技術(shù)貿(mào)易公司