專利名稱：可促進(jìn)人肺腺癌細(xì)胞分化的cDNA及其真核表達(dá)載體及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種能促進(jìn)人肺腺癌細(xì)胞分化的cDNA，包含該cDNA的真核表達(dá)載體以及該cDNA在制備治療腫瘤的制劑中的應(yīng)用。所述的cDNA是從維甲酸處理的人肺腺癌細(xì)胞系中分離得到。
肺癌對(duì)人類生命、健康的威脅日趨嚴(yán)重，在工業(yè)發(fā)達(dá)國(guó)家和地區(qū)，男性肺癌發(fā)病率高居各類腫瘤之首，女性肺癌發(fā)病率僅次于乳腺癌而居第二位。在我國(guó)，肺癌發(fā)病率有超過胃癌而躍居第一位的趨勢(shì)。肺癌患者預(yù)后很差。其五年生存率僅為10-15％，其中小細(xì)胞肺癌五年生存率低于5％。20余年來(lái)，盡管對(duì)某些腫瘤的治療取得了成功或取得重大進(jìn)展，但傳統(tǒng)的手術(shù)、放療和化療三大療法并未能改善大多數(shù)肺癌患者的預(yù)后，降低死亡率。近20年來(lái)，腫瘤分子生物學(xué)研究取得了重大進(jìn)展?，F(xiàn)已明確，癌的發(fā)生是細(xì)胞增殖失控和分化障礙的結(jié)果，細(xì)胞癌基因的激活和抑癌基因的失活是造成細(xì)胞生長(zhǎng)與分化調(diào)控紊亂的根本原因。因此，應(yīng)用各種方法分離腫瘤抑制基因或促分化基因，對(duì)于闡明腫瘤發(fā)生的內(nèi)在機(jī)制和設(shè)計(jì)有效防治措施都具有重要意義。
維甲酸(Retinoic Acid.，RA)是維生素A的代謝產(chǎn)物，對(duì)人體的正常形態(tài)發(fā)生、發(fā)育和細(xì)胞分化起重要調(diào)節(jié)作用。近10多年的研究結(jié)果表明，RA對(duì)某些完全轉(zhuǎn)化的、具有轉(zhuǎn)移性的腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生增生抑制或誘導(dǎo)終末分化作用，能夠使某些腫瘤的惡性程度降低或去惡性化。盡管并不是各種腫瘤都對(duì)RA有這樣的反應(yīng)，然而，這些發(fā)現(xiàn)無(wú)疑對(duì)腫瘤治療提供了一個(gè)新線索。在很多情況下，惡性腫瘤是一種細(xì)胞異常分化的疾病，對(duì)于那些具有侵襲性的細(xì)胞可以通過調(diào)節(jié)其細(xì)胞分化而不是應(yīng)用細(xì)胞毒藥物殺死細(xì)胞的方法得到控制。由此為RA的腫瘤分化治療作用提供了理論依據(jù)。
由于RA對(duì)多種腫瘤的增殖抑制和/或分化誘導(dǎo)作用，使其成為某些惡性腫瘤的分化誘導(dǎo)劑和化學(xué)預(yù)防劑。中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤研究所林培中等(中華腫瘤雜志10(3)161-166，1988；中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院學(xué)報(bào)12(4)235-245，1990)從80年代初即開始用我國(guó)新研制的維甲類化合物在食管癌高發(fā)區(qū)進(jìn)行食管癌的阻斷性研究，使有食管粘膜重度增生者的癌變率明顯降低；黃萌茸等(Huang ME，Ye YuChen et al，Blood 73567-572，1988)在國(guó)際上首次用全反式維甲酸治療急性早幼粒白血病患者取得成功。但RA對(duì)細(xì)胞增殖分化調(diào)節(jié)的分子機(jī)制一直是個(gè)謎。近10年來(lái)，隨著維甲酸受體基因的克隆，對(duì)這個(gè)問題的認(rèn)識(shí)發(fā)生了質(zhì)的飛躍。目前認(rèn)為，維甲酸作用的機(jī)制是維甲酸與細(xì)胞核內(nèi)的維甲酸受體結(jié)合后作為轉(zhuǎn)錄因子與特異性順式作用DNA序列結(jié)合，調(diào)節(jié)靶基因的轉(zhuǎn)錄活性。雖然受調(diào)控基因的具體數(shù)量和順序尚未弄清，但一般認(rèn)為維甲酸是啟動(dòng)了級(jí)聯(lián)(Cascade)式的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)，導(dǎo)致一系列分化基因的激活和增殖基因的受抑。至今已有越來(lái)越多的RA靶基因得到認(rèn)識(shí)，也分離、克隆出了一些引起細(xì)胞分化的新基因。這不僅使腫瘤細(xì)胞分化治療的理論認(rèn)識(shí)深化了一步，也有可能成為一類惡性腫瘤基因治療的目的基因。80年代末，本室在發(fā)現(xiàn)RA可引起食管癌細(xì)胞系生長(zhǎng)的抑制及終末分化的基礎(chǔ)上，應(yīng)用cDNA消減雜交技術(shù)，已從誘導(dǎo)分化的食管癌細(xì)胞系中分離出一個(gè)具有抑癌作用的cDNA片段(見中國(guó)專利申請(qǐng)95101293.2)。
因此，本發(fā)明的第一個(gè)目的在于提供一種可促進(jìn)人肺腺癌細(xì)胞分化的cDNA，所述的cDNA是從維甲酸處理的人肺腺癌細(xì)胞系中分離得到，其對(duì)人肺腺癌細(xì)胞等腫瘤細(xì)胞具有明顯的生長(zhǎng)抑制作用。
本發(fā)明的第二個(gè)目的在于提供包含所述的cDNA的真核表達(dá)載體。
本發(fā)明的第三個(gè)目的在于該cDNA在制備治療腫瘤的制劑中的應(yīng)用。
相應(yīng)地，根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，本發(fā)明涉及一種可促進(jìn)人肺腺癌細(xì)胞分化的cDNA，其全長(zhǎng)為709bp，核苷酸序列見序列表(SEQ ID NO1)。所述的cDNA是通過用全反式維甲酸誘導(dǎo)人肺腺癌細(xì)胞系GLC-82使其發(fā)生分化，從其cDNA文庫(kù)中利用cDNA消減雜交分離得到。
cDNA消減雜交是在mRNA水平分離兩種狀態(tài)下特異表達(dá)或抑制表達(dá)基因的策略。在正常細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞分化過程中，涉及一些分化相關(guān)基因的表達(dá)，本發(fā)明人所在科室已用該方法從RA誘導(dǎo)分化的食管癌細(xì)胞系中分離出具有抑癌活性的cDNA-RA538，開辟了一條從誘導(dǎo)分化的腫瘤細(xì)胞中分離促分化基因的新途徑(中國(guó)專利申請(qǐng)95101293.2)。Steinman等(Steinman RA，et al，Oncogene，93389-3396)對(duì)黑色素瘤細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)分化，用消減雜交方法也得到一些差異表達(dá)的cDNA，稱為黑色素瘤分化相關(guān)基因(mda)，而其中的一個(gè)cDNA恰巧是p21，WAF/CIPI(野生型p53激活因子)，該基因在RA，DMSO誘導(dǎo)分化的HL-60細(xì)胞中呈即刻快速表達(dá)。Schraml等(Schraml P，et al，Cancer Res.，545236-5240，1994)用正常肺組織與非小細(xì)胞肺癌組織的cDNA作消減雜交，分離出17個(gè)差異表達(dá)的cDNA克隆，其中六個(gè)在非小細(xì)胞肺癌中表達(dá)缺失，表明它們可能與非小細(xì)胞肺癌的發(fā)生有關(guān)。
基于RA作用的分子機(jī)制，根據(jù)cDNA消減雜交原理，本發(fā)明人采用肺腺癌細(xì)胞誘導(dǎo)分化與cDNA-cDNA消減雜交相結(jié)合的策略，首先構(gòu)建了未經(jīng)RA誘導(dǎo)及RA誘導(dǎo)不同時(shí)間細(xì)胞的cDNA文庫(kù)，通過cDNA文庫(kù)消減雜交，獲取分化啟動(dòng)階段和分化早期細(xì)胞基因表達(dá)變化的信息。其次，采用cDNA文庫(kù)間直接比較(cDNA文庫(kù)消減雜交)的策略，通過按比例加大靶DNA、即RA誘導(dǎo)文庫(kù)單鏈DNA的投入量，增加了獲取由低豐度mRNA轉(zhuǎn)錄的cDNA的機(jī)率，因而可望發(fā)現(xiàn)在RA誘導(dǎo)不同時(shí)間，即細(xì)胞分化的不同階段被激活而特異表達(dá)的基因。RA特異性cDNA消減文庫(kù)的建立，使細(xì)胞分化過程中基因表達(dá)變化的信息得到富集，使反映細(xì)胞分化過程中基因表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化特征成為可能，這為進(jìn)一步篩選分化相關(guān)基因提供了方便。
經(jīng)一系列篩選，本發(fā)明人從RA誘導(dǎo)表達(dá)的cDNA消減文庫(kù)中分離到一個(gè)在RA誘導(dǎo)后呈早期持續(xù)表達(dá)的cDNA克隆(命名為RA42)。經(jīng)查詢美國(guó)國(guó)家生物信息中心(NCBI)的最新(1995.8)核苷酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)(Nucleotide Sequence Database)，未見同源序列，表明RA42是新發(fā)現(xiàn)的cDNA序列。
根據(jù)本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明還涉及包含所述的cDNA的真核表達(dá)載體，在本發(fā)明的實(shí)施例中采用的真核表達(dá)載體為pMSG(7.6kb，購(gòu)自Pharmacia)，將RA42克隆cDNA兩端各加銜接頭(adaptor)，使其兩端均為SalI位點(diǎn)，直接與經(jīng)SalI酶切的pMSG連接，利用限制酶切反應(yīng)鑒定插入片段的正反向，并將正向重組質(zhì)粒命名為pMSG-RA42，即GLC-ada-RA42，根據(jù)布達(dá)佩斯條約，該質(zhì)粒已于1996年4月5日在中國(guó)典型培養(yǎng)物中心保藏(CCTCC，中國(guó)武漢)，保藏號(hào)為CCTCC M96005。
根據(jù)本發(fā)明的再一方面，本發(fā)明還涉及所述的cDNA序列在制備基因治療人肺腺癌的制劑中的應(yīng)用。
附圖的簡(jiǎn)要說明

圖1為本發(fā)明采用的cDNA定向克隆技術(shù)的示意圖。
圖2示出用菌落原位雜交/加-減法差異篩選cDNA消減克隆，圖中(a)為消減克隆與RA誘導(dǎo)文庫(kù)總cDNA探針雜交的結(jié)果，(b)為消減克隆與未誘導(dǎo)文庫(kù)總cDNA探針雜交的結(jié)果。
圖3為Northern雜交分析，示出本發(fā)明的RA42克隆在RA誘導(dǎo)的GLC-82細(xì)胞中持續(xù)表達(dá)。
以下結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的描述。實(shí)施例1用全反式維甲酸處理人肺腺癌細(xì)胞系GLC-82A.材料來(lái)源人肺腺癌細(xì)胞系GLC-82得自昆明醫(yī)學(xué)院，其是一株來(lái)自終末小支氣管的肺腺癌細(xì)胞，1982年建株。供體為云南個(gè)舊一48歲女性，該細(xì)胞倍增時(shí)間為48小時(shí)，體外培養(yǎng)呈堆疊性生長(zhǎng)，細(xì)胞在雙層軟瓊脂中形成集落的能力強(qiáng)，接種裸鼠第8天便有形成，呈結(jié)節(jié)狀浸潤(rùn)生長(zhǎng)，是一株惡性程度很高的瘤細(xì)胞。
全反式維甲酸(RA)、二甲亞砜(DMSO)為Sigma公司產(chǎn)品。
RPMI 1640培養(yǎng)基、異硫氰酸胍購(gòu)自GIBCO-BRL公司。
克隆載體pSPORT1購(gòu)自BRL公司。
B.方法細(xì)胞培養(yǎng)及RA誘導(dǎo)于80ml培養(yǎng)瓶中接種5×104細(xì)胞，加入8ml RPMI 1640培養(yǎng)液(含10％小牛血清，100u/ml青、鏈霉素)于37℃、5％CO2條件下培養(yǎng)傳代。于使用前溶于少量DMSO，用小牛血清稀釋至10-3mol/L，細(xì)胞培養(yǎng)液中RA終濃度為10-5mol/L，每日換液，未處理細(xì)胞培養(yǎng)液中僅含相應(yīng)量(0.02％)的DMSO。實(shí)施例2GLC-82細(xì)胞的cDNA文庫(kù)的建立及消減雜交在用10-5mol/L全反式維甲酸(RA)誘導(dǎo)人肺腺癌細(xì)胞系分化的基礎(chǔ)上，應(yīng)用定向克隆方法分別構(gòu)建了未經(jīng)RA誘導(dǎo)和RA誘導(dǎo)1天及4天細(xì)胞的3個(gè)cDNA文庫(kù)。通過cDNA文庫(kù)消減雜交，建立了RA特異性cDNA消減文庫(kù)，進(jìn)而篩選到細(xì)胞分化過程中由RA激活而特異表達(dá)的cDNA序列。
cDNA定向克隆和細(xì)菌轉(zhuǎn)化用異硫氰酸胍-鹽酸胍分級(jí)沉淀法(Instructio n manualmRNAisolation system，BRL life technologies Inc.USA，1990)提取細(xì)胞RNA，進(jìn)而用Oligo-dT纖維素柱分離mRNA。以未經(jīng)RA誘導(dǎo)及RA誘導(dǎo)1天和4天的GLC-82細(xì)胞mRNA為模版，采用銜接頭-引物(adaptor-primer)法合成具有不同粘末端的cDNA，定向克隆進(jìn)噬菌粒載體pSPORT1(GIBCO-BRL，美國(guó))，TFB法制備高轉(zhuǎn)化率的DH5αF′IQ感受態(tài)菌并進(jìn)行轉(zhuǎn)化和作cDNA插入片段的限制性內(nèi)切酶分析。
cDNA文庫(kù)消減雜交用M13K07輔助噬菌體(Pharmacia，瑞士)感染RA誘導(dǎo)文庫(kù)提取單鏈重組DNA(Shweinfst CW，et al，Genet.Annal.Tech.Appl.764-70，1990)，經(jīng)羥基磷灰石柱層析(Sambrook J.etal，Molecular Cloning，A LaboratoryManual，2nd Edition，Cold Spring Harbor Laboratory，19 89，ColdApring Harbor，New York，USA)和限制性內(nèi)切酶消化純化后，取10μg與經(jīng)Southern轉(zhuǎn)印共價(jià)結(jié)合于APT膜(Sigma，美國(guó))上的80μg未誘導(dǎo)文庫(kù)cDNA進(jìn)行雜交。回收經(jīng)6輪雜交后仍未被結(jié)合的RA誘導(dǎo)文庫(kù)的單鏈DNA，純化后將25μl模板/引物反應(yīng)液(10μl消減雜交富集的單鏈DNA，5μl 5×Taq DNA聚合酶緩沖液和25ng經(jīng)Not1/Sal1酶切的線性載體pSPORT1 DNA)于92℃變性7min，55℃退火40分鐘，加入5μl預(yù)熱的5×Taq DNA聚合酶緩沖液，5μl(2mmol/L)dNTP混合液，0.5μl(2u/ml)Taq DNA聚合酶，14.5μl去離子滅菌水，55℃繼續(xù)反應(yīng)2分鐘后，于70℃延伸40分鐘。反應(yīng)產(chǎn)物純化后作細(xì)菌轉(zhuǎn)化，用含X-gal/IPTG/AMP的LB培養(yǎng)基篩選陽(yáng)性克隆。
菌落原位雜交-加/減法差異篩選取RA誘導(dǎo)前后細(xì)胞的mRNA各10μg，隨機(jī)引物法合成[α-32P]-dCTP標(biāo)記的總cDNA探針，分別與消減雜交后得到的克隆作菌落原位雜交。
應(yīng)用cDNA定向克隆技術(shù)(圖1)，分別構(gòu)建了未經(jīng)RA誘導(dǎo)及RA誘導(dǎo)1天和4天細(xì)胞的3個(gè)cDNA文庫(kù)，主要技術(shù)參數(shù)如下表。3個(gè)cDNA文庫(kù)的主要技術(shù)參數(shù)Lib.GLC-82 Lib.GLC-82.RA1 Lib.GLC-82.RA4RA濃度 0 10-5mol/L 10-5mol/L誘導(dǎo)天數(shù)0 1 4克隆載體pSPORT1 pSPORT1 pSPORT1重組子數(shù)5.8×1055.43×1055.8×105重組效率97％98％98％cDNA分布0.5-9kb 0.5-9kb 0.5-9kbRA特異性cDNA消減文庫(kù)的建立和鑒定將經(jīng)消減雜交富集的RA特異性單鏈DNA回復(fù)為雙鏈后轉(zhuǎn)化感受態(tài)菌，得到143個(gè)克隆。與RA誘導(dǎo)前后細(xì)胞的總cDNA探針作加/減(plus-minus)法雜交差異篩選，見143個(gè)克隆全都與RA誘導(dǎo)后細(xì)胞的總cDNA探針結(jié)合，出現(xiàn)很強(qiáng)的雜交信號(hào)(圖2a)，而與未誘導(dǎo)細(xì)胞的總cDNA探針雜交，也有19個(gè)克隆出現(xiàn)較強(qiáng)的雜交信號(hào)(圖2b)，說明這19個(gè)克隆為RA誘導(dǎo)前后文庫(kù)共有，而其余124個(gè)克隆應(yīng)為RA特異性cDNA消減克隆。
根據(jù)同源性分析結(jié)果并按cDNA大小對(duì)消減克隆分組后，依次與文庫(kù)總cDNA作Southern印跡雜交，以判斷消減克隆的存在狀態(tài)，去除共存于RA誘導(dǎo)前后三個(gè)文庫(kù)中的非特異性序列，選取僅存在于RA誘導(dǎo)文庫(kù)中的克隆作進(jìn)一步分析。
經(jīng)過文庫(kù)總cDNA的Southern印跡雜交篩選，選取僅存在于RA誘導(dǎo)文庫(kù)中的cDNA克隆作RNA Northern印跡雜交，見42號(hào)克隆cDNA在RA誘導(dǎo)早期(12小時(shí))的即在細(xì)胞中持續(xù)表達(dá)(圖3)，而在未誘導(dǎo)細(xì)胞中無(wú)表達(dá)，將該克隆命名為RA42克隆。酶切RA42克隆的質(zhì)粒DNA，分出約0.7kb的cDNA插入片段，對(duì)該片段(序列1)進(jìn)行進(jìn)一步的分析。實(shí)施例3序列1的核苷酸序列測(cè)定按T7測(cè)序試劑盒(Pharmacia)說明用雙脫氧終止法測(cè)序，序列1的核苷酸序列如序列表所述。實(shí)驗(yàn)例1cDNA序列1的生物學(xué)功能鑒定材料和方法細(xì)胞系肺腺癌細(xì)胞系GLC-82由昆明醫(yī)學(xué)院梁明達(dá)教授惠贈(zèng)。培養(yǎng)條件為RPMI1640培養(yǎng)基，15％小牛血清，37℃，5％CO2。真核表達(dá)載體的構(gòu)建用SalI及NotI雙酶切從克隆載體中得到RA42的全長(zhǎng)cDNA約0.7kb，選擇的表達(dá)載體為pMSG(7.6kb，Pharmacia)，其適于表達(dá)插入鼠乳腺瘤病毒LTR啟動(dòng)子下游多克隆位點(diǎn)的cDNA序列。在激素效應(yīng)細(xì)胞中可以用糖皮質(zhì)激素對(duì)上述啟動(dòng)子進(jìn)行誘導(dǎo)。將RA42克隆cDNA兩端各加銜接頭(adaptor)，使其兩端均為SalI位點(diǎn)，直接與經(jīng)SalI酶切的pMSG連接，利用限制酶切反應(yīng)鑒定插入片段的正反向，并將正向重組質(zhì)粒命名為pMSG-RA42，根據(jù)布達(dá)佩斯條約，該質(zhì)粒已于1996年4月5日在中國(guó)典型培養(yǎng)物中心保藏(CCTCC，中國(guó)武漢)，保藏號(hào)為CCTCC M96005。Lipofectin介導(dǎo)的DNA轉(zhuǎn)染GLC-82細(xì)胞接種于50ml培養(yǎng)瓶中(約5×104個(gè)細(xì)胞)，37℃培養(yǎng)至50％的覆蓋率。將10μg pMSG、pMSG-RA42分別與40μg Lipofectin混合，加入3ml培養(yǎng)基中，37℃、5％CO2孵育12小時(shí)后，換等體積含20％胎牛血清的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48小時(shí)，15傳代，加入篩選培養(yǎng)基(含霉酚酸25μg/ml，次黃嘌呤5μg/ml，黃嘌呤5μg/ml，胸腺嘧啶10μg/ml，氨基喋呤2μg/ml，谷氨酰胺29.2μg/ml)。一般在篩選14-20天出現(xiàn)明顯的轉(zhuǎn)化集落。RT-PCR反應(yīng)檢測(cè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞中谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶(TGase)基因的表達(dá)變化提取經(jīng)DM處理的轉(zhuǎn)染細(xì)胞的總RNA，取1μgRNA，在20μl反應(yīng)體積內(nèi)，用M-MLV H-RT(Gibco，BRL)合成第一鏈cDNA。TGase引物為跨第6、7外顯子片段，長(zhǎng)度為180bp；用于內(nèi)對(duì)照的管蛋白(α-tubulin)引物跨第1、2外顯子，擴(kuò)增長(zhǎng)度410bP。 PCR反應(yīng)為50μl體積內(nèi)，取逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物5μl，引物各50pmol，2.5mM dNTP 2μl，10x緩沖液5μl，Taq酶(中科院遺傳所)1單位。94℃40秒，50℃40秒，72℃2分鐘，循環(huán)35次，1.8％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。結(jié)果GLC-82細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化轉(zhuǎn)染pMSG-RA42的GLC-82細(xì)胞，經(jīng)篩選培養(yǎng)基篩選出抗性集落后，用DM誘導(dǎo)RA42的表達(dá)。結(jié)果表明，DM誘導(dǎo)后細(xì)胞生長(zhǎng)速度明顯減慢，5-6天后，集落周邊細(xì)胞體積增大，細(xì)胞扁平，形狀不規(guī)則。這些變化逐漸累及集落內(nèi)部細(xì)胞，至2周左右，大多數(shù)細(xì)胞的細(xì)胞連接被破壞，細(xì)胞成片脫落、死亡，只見一些殘留的網(wǎng)絡(luò)狀支架。而空載體pMSG的轉(zhuǎn)化集落經(jīng)DM作用后無(wú)明顯變化，培養(yǎng)8周以后，集落從內(nèi)部細(xì)胞開始自然死亡脫落。RA42對(duì)GLC-82細(xì)胞中TGase基因表達(dá)的影響RA42在GLC-82細(xì)胞中表達(dá)1天后，即出現(xiàn)TGase基因的表達(dá)并持續(xù)至第6天。
因此，由上述實(shí)驗(yàn)可以看出RA42克隆是肺腺癌細(xì)胞分化過程中由維甲酸激活而特異表達(dá)的基因。將其亞克隆進(jìn)真核表達(dá)載體pMSG，轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)親本細(xì)胞誘導(dǎo)表達(dá)后，在分化標(biāo)志基因-TGase被激活并持續(xù)表達(dá)的同時(shí)，細(xì)胞生長(zhǎng)受到明顯抑制，表明這個(gè)克隆是人肺腺癌細(xì)胞分化相關(guān)基因的cDNA序列。這個(gè)基因的cDNA可用于肺癌的分化治療和基因治療研究，并有可能作為肺癌基因治療的目的基因在肺癌的臨床治療研究中加以應(yīng)用。
序列表序列1序列長(zhǎng)度709bp鏈型單鏈分子型cDNA特征沒有明顯的閱讀框來(lái)源人性質(zhì)具有促進(jìn)人肺腺癌細(xì)胞分化功能的cDNAGTCGACCCAC GCGTCCGGAA ATCTCCAAGT CATAAGACGA AGAGGACTTC CTGCTCACGT 60TAAGAGTCAG AACACCCCAC AGGCCTGACT CCCTTCCTGT CTGGCTTGGG TGGCCTTTAC 120AAGTACCCTG TCTAAGCTCG GGAGGGACCC GCCCGTTTCT CAGCTACTCC CTTGAGCCCC 180TCACCGGCCA CGGCGGTCTC CGAGGCTATC TACGGGTTTT TTTCAGGACA AATGATGCGA 240AGGTTGGTAC ATTAGTGGGG GAAGACAATA TGGAAACAAA TACTATGAAG ACAACAAGCA 300ATTTTTTTGG CGTCACCGAT GGGTTGTATA TACTACTGAA ATGAATGGGC AAAAACACAT 360TCTGGGATGT GGATGGAAGC ATGGTGCCTC CTGAATGGCA TCGTTGGCTT CACAGTATGA 420CTGATGATGC TCCAACAACA AAACCACTTA CTGCTCGTAA ATTCATTTGG ACGAACCATA 480AATTCAACGT GACTGGGCCC CAGAACAATA TGTACCTTAT TCTACCACTA GAAAGAAGAT 540TCAGGAGTGG ATCCCACCTT CAACACCTTA CAAGTAAAGA CAATGAAGAA CAGTTGAAAC 600ATGCAAAATA TGGAGCTTTT CATGTAATTA CTCTTTTACT GTTTACCATT CACTATAATT 660CACAATTAAA ATTGTGTGAC TAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAA 709
權(quán)利要求
1.一種促進(jìn)人肺腺癌細(xì)胞分化的cDNA，其特征是所述的cDNA的序列為GTCGACCCAC GCGTCCGGAA ATCTCCAAGT CATAAGACGA AGAGGACTTC CTGCTCACGT 60TAAGAGTCAG AACACCCCAC AGGCCTGACT CCCTTCCTGT CTGGCTTGGG TGGCCTTTAC 120AAGTACCCTG TCTAAGCTCG GGAGGGACCC GCCCGTTTCT CAGCTACTCC CTTGAGCCCC 180TCACCGGCCA CGGCGGTCTC CGAGGCTATC TACGGGTTTT TTTCAGGACA AATGATGCGA 240AGGTTGGTAC ATTAGTGGGG GAAGACAATA TGGAAACAAA TACTATGAAG ACAACAAGCA 300ATTTTTTGGG CGTCACCGAT GGGTTGTATA TACTACTGAA ATGAATGGGC AAAAACACAT 360TCTGGGATGT GGATGGAAGC ATGGTGCCTC CTGAATGGCA TCGTTGGCTT CACAGTATGA 420CTGATGATGC TCCAACAACA AAACCACTTA CTGCTCGTAA ATTCATTTGG ACGAACCATA 480AATTCAACGT GACTGGGCCC CAGAACAATA TGTACCTTAT TCTACCACTA GAAAGAAGAT 540TCAGGAGTGG ATCCCACCTT CAACACCTTA CAAGTAAAGA CAATGAAGAA CAGTTGAAAC 600ATGCAAAATA TGGAGCTTTT CATGTAATTA CTCTTTTACT GTTTACCATT CACTATAATT 660CACAATTAAA ATTGTGTGAC TAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAA 709
2.如權(quán)利要求1所述的cDNA，其特征是所述的序列是從全反式維甲酸誘導(dǎo)的人肺腺癌細(xì)胞系GLC-82中分離得到。
3.一種含有如權(quán)利要求1所述的cDNA的真核表達(dá)載體。
4.如權(quán)利要求3所述的真核表達(dá)載體，其為含所述的cDNA的質(zhì)粒GLC-ada-RA42，該質(zhì)粒已根據(jù)布達(dá)佩斯條約，于1996年4月5日在中國(guó)典型培養(yǎng)物中心保藏，保藏號(hào)為CCTCC M96005。
5.如權(quán)利要求1所述的cDNA在制備基因治療人肺腺癌的制劑中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種能促進(jìn)人肺腺癌細(xì)胞分化的cDNA,包含該cDNA的真核表達(dá)載體以及該cDNA在制備治療腫瘤的制劑中的應(yīng)用。所述的cDNA是從維甲酸處理的人肺腺癌細(xì)胞系中分離得到。
文檔編號(hào)A61K48/00GK1172162SQ9610914
公開日1998年2月4日 申請(qǐng)日期1996年7月25日 優(yōu)先權(quán)日1996年7月25日
發(fā)明者黎伯銓, 王秀琴, 吳旻 申請(qǐng)人:中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院腫瘤研究所