專(zhuān)利名稱(chēng)：Fgf粗提多肽生長(zhǎng)因子混合物及其提取工藝的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及肽的分離CO7K1/14，關(guān)于分子生物學(xué)領(lǐng)域中的修復(fù)細(xì)胞及提取工藝。
創(chuàng)傷修復(fù)是醫(yī)學(xué)中一個(gè)重要待深入研究的課題之一。近十年來(lái)隨著分子生物學(xué)的不斷發(fā)展，創(chuàng)傷修復(fù)的研究有了新的進(jìn)展，突出表現(xiàn)在探討各種生長(zhǎng)因子在創(chuàng)傷修復(fù)中的作用。
九十年代以來(lái)，美國(guó)等發(fā)達(dá)國(guó)家投入大量經(jīng)費(fèi)對(duì)表皮生長(zhǎng)因子EGF、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)等在創(chuàng)傷修復(fù)中的作用進(jìn)行了研究，并逐漸向臨床應(yīng)用過(guò)渡。但是至今仍未見(jiàn)有關(guān)臨床應(yīng)用的報(bào)導(dǎo)。
國(guó)內(nèi)近幾年中在少數(shù)軍事醫(yī)學(xué)院校開(kāi)展了這方面的研究工作。主要是bFGF，EGF等生長(zhǎng)因子對(duì)創(chuàng)傷愈合的實(shí)驗(yàn)研究，但均是對(duì)單一的一種生長(zhǎng)因子的作用觀察，并且是基因重組而獲取的因子。
纖維母細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF，包括aFGF，bFGF)，是一種廣譜的促有絲分裂劑，對(duì)源于中胚葉的細(xì)胞，如成纖維細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、成肌細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞均有促有絲分裂、增殖作用。FGF通過(guò)促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增生，新血管生成，成纖維細(xì)胞增生，膠原形成而促進(jìn)肉芽組織和基質(zhì)的形成。而創(chuàng)傷修復(fù)的基本過(guò)程是肉芽組織形成，基質(zhì)形成與重塑(瘢痕形成)，所以FGF在創(chuàng)傷修復(fù)中將起重要作用。
以往的研究均系單一的一種純化生長(zhǎng)因子FGF，且系基因重組產(chǎn)物，而在生物體內(nèi)創(chuàng)傷修復(fù)過(guò)程中是多種生長(zhǎng)因子共同作用參與修復(fù)的結(jié)果，并且在組織損傷過(guò)程中FGF在損傷局部組織中的濃度很低，外源性加入FGF就顯得更加重要。EGF促進(jìn)上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞，成纖維細(xì)胞增生；TGF-β促進(jìn)成纖維細(xì)胞增生、基質(zhì)形成，因此研究FGF與其它生長(zhǎng)因子協(xié)同作用就顯得更加重要。而目前還未見(jiàn)有關(guān)FGF與多種生長(zhǎng)因子共存參與損傷修復(fù)的研究報(bào)道。
本發(fā)明的目的是提供一種FGF粗提多肽生長(zhǎng)因子混合物及其提取工藝。
FGF粗提多肽生長(zhǎng)因子混合物為粉白色粉末，無(wú)味，其特征是含有纖維母細(xì)胞生長(zhǎng)因子(aFGF，bFGF)、表皮生長(zhǎng)因子(EGF)，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF-β)選用新鮮牛腦為原料，提取工藝如下在4℃環(huán)境中操作，把牛腦去掉小腦、破碎、加NaCl、試PH值、勻漿；進(jìn)磁力攪拌器中攪拌，進(jìn)低溫離心機(jī)，收集上清液并加入硫酸鏈霉素，攪拌均勻再次進(jìn)離心機(jī)；收集上清液在液氮中速凍、冷凍干燥、低溫保存。
ECGF是美國(guó)學(xué)者于1979年首先從牛下丘腦提職物中獲取的，分子量為75000，具有明顯促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞(EC)增殖的作用。后來(lái)有文獻(xiàn)證實(shí)ECGF即是FGF的一種，對(duì)熱醋酸敏感，胰酶和還原劑可將其滅活。在培養(yǎng)中必須是有ECGF存在的條件下，EC才能在體外長(zhǎng)期生長(zhǎng)，并且由于肝素的存在而作用增強(qiáng)。單獨(dú)肝素存在對(duì)EC不顯示增生作用。本發(fā)明人在實(shí)驗(yàn)中證實(shí)FGF混合物用生理鹽水稀釋?zhuān)?00μg/ml，配肝素100μg/ml，對(duì)EC顯示明顯而穩(wěn)定的增生作用。
目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于FGF生長(zhǎng)促進(jìn)劑的研究還處在動(dòng)物試驗(yàn)階段，作為商品也只有試劑。國(guó)際市場(chǎng)售階15mg/85
而用本發(fā)明工藝提取該混合物不需通用的純化手段、不需經(jīng)過(guò)柱層析的分離、也不需基因重組的操阼，工藝簡(jiǎn)便，易于工業(yè)化生產(chǎn)，成本僅為進(jìn)口價(jià)格的1/100。并且本發(fā)明的FGF混合物含有aFCF、bFGF、EGF和TGF-β1，是多種生豆長(zhǎng)因子混合物，更適用于臨床創(chuàng)傷修復(fù)的應(yīng)用，是目前創(chuàng)傷修復(fù)的理想制劑。
實(shí)施例本發(fā)明的FGF粗提多肽生長(zhǎng)因子混合物為粉白色粉末，無(wú)味，其特征是含有纖維母細(xì)胞生長(zhǎng)因子(aFGF，bFGF)、表皮生長(zhǎng)因子(FGF)，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF-β)；提取所需設(shè)備包括磁力攪拌器、勻漿器、高速低溫離心機(jī)、冷凍干燥機(jī)、抽濾滅菌器等，選用新鮮牛腦為原料，提取工藝如下在4℃環(huán)境中操作，把牛腦去掉小腦、破碎、加生理鹽水、調(diào)試PH值、將物料送勻漿器內(nèi)勻漿化；然后進(jìn)磁力攪拌器中攪拌一定時(shí)間、進(jìn)低溫離心機(jī)中進(jìn)行離心處理、收集上清液并加入硫酸鏈霉素，攪拌均勻再次進(jìn)離心機(jī)，收集上清液，經(jīng)0.2μ濾膜抽濾滅菌、在液氮中速凍、在-60℃下冷凍干燥、收取粉末；細(xì)胞培養(yǎng)檢驗(yàn)進(jìn)行細(xì)菌、支原體、霉菌缺乏試驗(yàn)；裝瓶檢驗(yàn)每15mgFGF混合物中含352mgSM(硫酸鏈霉素)、7.52mE NaCl，于20-30℃冷凍保存。-30℃中長(zhǎng)期保存，有效期可達(dá)5年以上。
用本發(fā)明方法提取的FGF混合物是外用藥，對(duì)所有外傷致組織缺損性損傷均有效。使用前如生理鹽水配成工作液200-300μg/ml在FGF粗提液中加100-150μg/ml肝素混合，抽濾滅菌，即可外用，涂于創(chuàng)面。經(jīng)對(duì)動(dòng)物和部分臨床試驗(yàn)證明，它對(duì)各種創(chuàng)傷有顯著的修復(fù)作用，如大面積的軟組織損傷、燒傷、褥瘡、慢性經(jīng)久不愈的潰瘍、放射性損傷、鼓膜穿孔、角膜潰瘍、穿孔等。
權(quán)利要求
1.一種FGF粗提多肽生長(zhǎng)因子混合物，為粉白色粉末，無(wú)味，其特征是含有纖維母細(xì)胞生長(zhǎng)因子(aFGF，bFGF)、表皮生長(zhǎng)因子EGF，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子TGF-β；使用前加生理鹽水配成工作液200-300μg/ml，并在FGF粗提液中加100-150μg/ml肝素，混合、抽濾滅菌、即可外用，涂于創(chuàng)面。
2.一種FGF粗提多肽生長(zhǎng)因子混合物的提取工藝，采用設(shè)備包括磁力攪拌器、勻漿器、高速低溫離心機(jī)、冷凍干燥機(jī)，在4℃環(huán)境下作業(yè)，選用新鮮牛腦為原料，其特征是提取工藝如下把牛腦去掉小腦、破碎、加生理鹽水、調(diào)PH值、勻漿后進(jìn)磁力攪拌器中攪拌、進(jìn)低溫離心機(jī)離心、收集上清液并加入硫酸鏈霉素，攪拌均勻再次進(jìn)離心機(jī)；收集上清液、抽濾滅菌，用0.2μ濾模、在液氮中速凍、在冷凍干燥機(jī)中干燥，-60℃、細(xì)胞培養(yǎng)檢驗(yàn)做細(xì)菌、支原體、霉菌缺乏試驗(yàn)；裝瓶、于20-30℃中冷凍保存。
3.根據(jù)權(quán)利要求1和2所述的FGF粗提混多肽因子混合物及提取工藝，其特征是瓶裝提取物的含量比例是每15mg FGF中含3.52mg硫酸鏈霉素SM和7.52mg NaCl。
全文摘要
FGF粗提多肽生長(zhǎng)因子混合物及其提取工藝,混合物為粉白色粉末、無(wú)味,其特征是含有纖維母細(xì)胞生長(zhǎng)因子(aFGF,bFGF)、表皮生長(zhǎng)因子EGF,轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子TGF－β;提取工藝是:把牛腦破碎、勻漿、攪拌、進(jìn)低溫離心機(jī)、收集上清液并加入硫酸鏈霉素,拌勻再次進(jìn)離心機(jī);收集上清液速凍、干燥、冷凍保存。FGF混合物是外用藥,經(jīng)對(duì)動(dòng)物和部分臨床試驗(yàn)證明,對(duì)所有外傷致組織缺損性損傷均有效,有顯著的修復(fù)作用。適用于大面積的軟組織損傷、燒傷、褥瘡、慢性經(jīng)久不愈的潰瘍、放射性損傷、鼓膜穿孔、角膜潰瘍、穿孔等。
文檔編號(hào)A61K38/18GK1184673SQ9611461
公開(kāi)日1998年6月17日 申請(qǐng)日期1996年12月13日 優(yōu)先權(quán)日1996年12月13日
發(fā)明者董玉蘭 申請(qǐng)人:中國(guó)醫(yī)科大學(xué)