專利名稱：牛乙肝病毒的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)——預(yù)防醫(yī)學(xué)——微生物與免疫學(xué)領(lǐng)域，尤其涉及一種牛乙肝病毒及其表達產(chǎn)物在制備人乙肝疫苗、乙肝免疫球蛋白及其表達產(chǎn)物與相關(guān)產(chǎn)品中的應(yīng)用。
乙型肝炎病毒(HBV，Hepatitis B virus)感染是人類面臨的難題之一，全世界每年用于治療HBV感染所致疾病的醫(yī)療費用高達數(shù)十億美元。
中國是HBV感染的高度流行區(qū)域，推廣應(yīng)用乙型肝炎疫苗是全世界及中國的重要衛(wèi)生措施。
對HBV感染的預(yù)防不僅可減少乙型肝炎病人，且可降低肝硬化及原發(fā)性肝癌的發(fā)病率，因而對每個家庭都具有重要的社會效益和顯著的經(jīng)濟效益。
已有技術(shù)中，用于預(yù)防和控制HBV感染的有效制品是人血源乙型肝炎疫苗和乙型肝炎免疫球蛋白(HBIG，Hepatitis B Immuno-globulin)類產(chǎn)品，都需要從HBV攜帶者人群中采血，為確保安全性，制備疫苗和HBIG的過程采取了異常嚴(yán)格的技術(shù)措施。因而已有技術(shù)存在來源困難，設(shè)備要求高和成本高等缺陷。
本發(fā)明的發(fā)明目的，是為上述免疫制劑提供一種新的來源——用牛血源代替人血源，即直接從攜帶牛乙型肝炎病毒(OHBV，Oxenhepatitis B virus)的牛血清中提取相關(guān)的抗乙型肝炎病毒表面抗原抗體(抗-HBs，Anti to hepatitis B surface antigen)或用OHBV及其表達產(chǎn)物，免疫牛或其它動物，以獲取、制備用于人的，阻斷HBV感染的HB疫苗和HBIG。
使上述免疫制劑的生產(chǎn)，開拓新的廣泛來源，安全性高并可大幅度降低成本和設(shè)備要求。
本發(fā)明的目的是通過如下技術(shù)方案實施的設(shè)計一種利用感染了OHBV的牛血清中OHBV及其表達產(chǎn)物，包括牛乙型肝炎病毒核心抗原(OHBcAg，Oxen hepatitis B coreantigen)、牛乙型肝炎病毒中間抗原(OHBeAg，Oxen hepatitis B“e”antigen)、牛乙型肝炎病毒表面抗原(OHBsAg，Oxen hepatitisB surfaee anfigen)及其它相關(guān)產(chǎn)物和抗原等，其提取、純化及濃縮可利用沉淀法、離心法、平衡法、層析法、離子交換法和/或其綜合法，在制備用于人類的，阻斷HBV感染的HB疫苗和HBIG，及其表達產(chǎn)物與其相關(guān)產(chǎn)品中的應(yīng)用，其特征是在制備應(yīng)用中a、采用完整OHBV及OHBV的各種表達產(chǎn)物如OHBcAg、OHBeAg、OHBsAg及其它相關(guān)產(chǎn)物和抗原。
b、從感染了OHBV牛血清中分離OHBV，進一步分析其基因序列及相應(yīng)表達產(chǎn)物的氨基酸序列，采用OHBV的各個不同核酸序列及相應(yīng)表達產(chǎn)物，包括OHBcAg、OHBeAg和/或OHBsAg及其它相關(guān)產(chǎn)物和抗原等的應(yīng)用與開發(fā)。
上述的應(yīng)用包括乙肝疫苗及其相關(guān)產(chǎn)品如高效價HBIG，也包括制備新的HBV動物模型等。
上述的應(yīng)用中，所述的在相關(guān)產(chǎn)品中的應(yīng)用是指利用牛血清及含OHBV牛血清用于檢測、鑒定及提高質(zhì)量為目的，與HBV感染標(biāo)志物相關(guān)的各種試劑盒(例如，乙肝酶聯(lián)試劑盒、放射免疫試劑盒、血凝試劑盒等)中的應(yīng)用，及用牛血清及含OHBV的牛血清作被檢測物等。
上述的應(yīng)用中，所述的在相關(guān)產(chǎn)品中的應(yīng)用，是指牛血清及含OHBV牛血清在制備除已有技術(shù)中的鴨HBV及土撥鼠HBV感染模型外新的OHBV感染動物模型(如羊)中的應(yīng)用。以用于抗病毒試驗、發(fā)病機理等方面的研究。
以上技術(shù)方案的依據(jù)是用只是感染動物的引起動物病變的病原體，用于人類疾病預(yù)防的事例已有非常成功的先例——牛天花病毒制備的疫苗去預(yù)防人類天花病毒感染，在人類戰(zhàn)勝天花的過程中立下了不可磨滅的功勛。
在牛血清中可以檢測到HBV感染的相關(guān)指標(biāo)，包括HBsAg及抗乙肝病毒表面抗原抗體(抗-HBs，Anti to Hepatitis B surfaceantigen)，但未檢測到HBeAg及抗乙肝病毒核心抗原抗體(抗——HBc，Anti to Hepatitis B core antigen)。提示牛血清中的OHBV與HBV有同源基因，主要在表面抗原抗體(S基因)系統(tǒng)，但不涉及到核心部分，即有相同點，又無傳播OHBV給人的危險。
用人血清中HBV的HBsAg可以抑制牛血清中檢測到的抗——HBs。
用牛血清中檢測到的抗——HBs可抑制人血清中的HBsAg。
用人血清中抗——HBs可以抑制牛血清中的HBsAg。
從牛血清分離OHBV，進一步分析其基因序列及相應(yīng)表達物的氨基酸序列，同時與HBV及其相應(yīng)表達產(chǎn)物序列比較，則可以具有下列用途，進一步了解HBsAg的主要功能基因，進而提取該基因去用于制備乙肝疫苗及HBIG。
目前，用不同品牌的乙肝試劑盒測牛血清，某種指標(biāo)例如e抗體結(jié)果大部分不同，問題在于試劑盒的生產(chǎn)制備中使用了牛血清或牛血清白蛋白，故一方面要求生產(chǎn)中不得使用牛血清；另一方面應(yīng)將牛血清(特別是感染了OHBV的牛血清)作為一種鑒定(檢定)HBV各類試劑盒的一個標(biāo)準(zhǔn)物，即在加樣中應(yīng)留出牛血清待測孔，而不僅只是目前的人血源陽性或陰性血清。采集感染了OHBV的牛血清，標(biāo)定劑量或滴度用于檢測標(biāo)準(zhǔn)物。在檢測試劑盒質(zhì)量時加入該標(biāo)準(zhǔn)物作為檢測指標(biāo)的一種，結(jié)果該標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)陰性，其結(jié)果陽性應(yīng)視為該試劑盒不合格，如此將有效提高目前市售乙肝檢測試劑盒的質(zhì)量。
制備乙肝疫苗時，為獲取大量OHBV，可用完整的OHBV去感染?；蚱渌麆游铮缘玫街苽湟腋我呙绲脑?。
提取、純化及濃縮OHBV及其表達產(chǎn)物，(例如，HBIG及OHBsAg等)可采用下列方法，例如密度梯度率離心法(速率區(qū)帶法、等密度區(qū)帶法、區(qū)帶轉(zhuǎn)頭技術(shù))、聚乙二醇沉淀法、氯化銫密度梯度離心法及改良法、氯化銫同密度沉降沉淀平衡法、區(qū)帶離心沉淀法、四步綜合法、胃酶消化親和層析法、單純親和層析法、超速離心法、低溫超(高)速離心法、各濃度飽和硫酸銨沉淀法、胃蛋白酶消化—DEAE纖維素(Diethylamine ethyl cellulose)離子交換層析——親和層析——凝膠過濾法、胃蛋自酶消化——DEAE纖維素離子交換層析——區(qū)帶離心法、硫酸銨提純——DEAE纖維素層析法、硫酸銨提純——葡聚糖凝膠G200層析和/或上述方法的綜合利用。
用目前已有技術(shù)生產(chǎn)人血源乙肝疫苗的方法制備牛血清OHBsAg性質(zhì)乙肝疫苗。
制備HBIG時，免疫未感染OHBV的牛或其他動物(例如羊)，同時加免疫佐劑，測定牛血中HBIG含量至達有效、有價值濃度后，采血，用前述方法提取、濃縮HBIG。
綜上所述，采用本發(fā)明用OHBV及其表達產(chǎn)物，在制備人乙肝疫苗HBIG及其表達產(chǎn)物與相關(guān)產(chǎn)品中的應(yīng)用，具有明顯的積極效果，例如1、用牛血清制備抗——HBs以替代目前的人血源HBIG，達到安全、經(jīng)濟、高產(chǎn)的效果。
2、用OHBV或其OHBsAg替代目前的人血源乙肝疫苗，不僅安全，且可使產(chǎn)量提高成本大幅度下降。
3、HBIG可以用于HBV暴露高危人群預(yù)防，前景廣闊。
4、對乙肝疫苗及HBIG的研究與開發(fā)提供了新的思路。
以下結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步闡述實施例材料與方法1、待測牛血清采自當(dāng)?shù)啬程幣Ｈ?。其?～10月齡小牛10只，3～12年齡成年牛20只。
2、試劑盒10只小牛曾用上海傳醫(yī)試劑盒檢測抗-HBc(目測)。其余各項試劑盒均系上海實業(yè)科華生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品(立可讀，EIA-TMB)，其中檢測HBsAg(批號951018)；檢測抗-HBs(批號951210)；檢測HBeAg(批號951226)；檢測抗-HBe(批號951215)。
3、實驗方法嚴(yán)格按照說明書操作及判讀結(jié)果。OD450nm測定用南京產(chǎn)DG3022酶聯(lián)儀。
4、對照及抑制試驗用血清均系各試劑盒原配備，混合后重新確認(rèn)。
結(jié)果與分析1、抗-HBc測定檢測10份小牛血清，均為陰性(目測法)。
2、HBeAg測定檢測30份牛血清，均為陰性(OD450nm范圍0.00～0.07。兩份陰性對照均為0.00，兩份陽性對照分別為1.34和1.55。
3、抗-HBe測定3.1檢測結(jié)果兩份陽性對照OD450nm值均為0.00，兩份陰性對照OD450nm值分別為0.58和0.69。按照說明書方法計算COV值并判斷結(jié)果。
(標(biāo)本OD值≥COV為陰性，<COV為陽性>
據(jù)上標(biāo)準(zhǔn)，有三份標(biāo)本≥0.3175；15份標(biāo)本OD值0.11～0.3174；8份標(biāo)本為0.05～0.10；4份標(biāo)本≤0.04。即90％的牛血清抗——HBe抗體檢測陽性。
3.2抑制試驗取OD值最低的3份牛血清用HBeAg陽性對照按1∶1加入，37℃，30min，離心取上清；同時對HBeAg陽性對照也按1∶2稀釋。檢測結(jié)果見表1表13份抗-HBe陽性牛血清用HBeAg抑制試驗結(jié)果(OD450nm)牛血清 對照人血清血清號 未稀釋 1∶2稀釋 HBeAg抑制 血清號1∶2稀釋110.030.33 0.490.570.63(-)0.780.75150.040.38 0.390.640.61(+)0.040.00200.040.46 0.550.780.68
據(jù)表1.結(jié)果，可見經(jīng)1∶2稀釋后No.20血清轉(zhuǎn)陰，該份血清經(jīng)HBeAg抑制后OD值明顯高于另兩份血清；另兩份血清抑制后均轉(zhuǎn)陰。此試驗初步證實在牛血清中可檢測到抗-HBe抗體。
4、HBsAg測定共檢出陽性血清5份，陽性率16.67(5/30)。同前法選出3份血清用抗-HBs陽性血清作抑制試驗，抑制率分別為15.38(No.12)，42.86％(No.15)及0.00％(No.18)。
用HRP-HBe及HRP-抗HFRS抗體分別替代HRP-抗HBs，結(jié)果發(fā)現(xiàn)HRP-抗HFRS組均陰性，但HRP-抗HBe組則有1份血清出現(xiàn)陽性，1份處于臨界值，另1份則為陰性。這一結(jié)果提示了兩個可能存在的問題，即①牛血清中的牛乙型肝炎病毒的核酸序列(氨基酸序列)可能與人乙型肝炎病毒有重疊，但也有差異；②試劑盒的特異性問題——是否是封閉液中采用了牛血清而非牛血清白蛋白？！5、抗-HBs檢測5.1.抗-HBs抗體檢出率13.33％(4/30)5.2.抑制試驗如同前法，用HBsAg與HBeAg雙陽性血清及基因重組HBcAg作抑制試驗，結(jié)果見表2。
表2.4份抗-HBs陽性牛血清用HBsAg+HBeAg及HBcAg抑制試驗結(jié)果(OD450m)血清號 未稀釋 1∶2稀釋 HBeAg+HBsAg抑制 抑制率(％) HBcAg抑制抑制率(％)7 0.230.13 0.10 0.04 0.03-69.570.16 0.20 +56.52121.410.75 0.79 0.74 0.61-12.341.64 1.56 +107.79210.200.07 0.04 0.00 0.00-100.00 0.16 0.21 +236.36300.420.21 0.18 0.00 0.01-97.440.52 0.45 +148.72注陽性對照1.85，1.79；陰性對照0.02，0.01；空白對照0.00。
表2、結(jié)果提示，用HBsAg和HBeAg雙陽性血清可以抑制牛血清中抗-HBs抗體(抑制率12.34～100.00％)，抑制率與牛血清中抗-HBs抗體OD值成反比關(guān)系；但基因重組HBcAg不僅不能抑制，反而卻增強了原反應(yīng)，對此問題值得進一步探討。
5.3.替代試驗用HRP-抗HBe及HRP-抗HFRS分別替代HRP-HBsAg，結(jié)果均陰性(未用HRP-抗HBs替代)。
5.4.用牛抗-HBs陽性血清抑制人血清HBsAg試驗血清處理方法同前，采用檢測HBsAg的方法。結(jié)果見表3。
表3、4份抗-HBs陽性牛血清抑制人血清HBsAg試驗結(jié)果(OD450nm)血清號 上清液 抑制率(％)沉淀抑制率(％) 牛血清抗-HBsOD值7 0.82 0.86 39.350.90 0.7938.99 0.2312 0.85 0.78 41.160.58 0.6854.51 1.4121 1.07 1.28 15.161.37 1.313.25 0.2030 0.89 0.99 32.130.81 0.9038.27 0.42注人血清HBsAg未稀釋前OD值為1.43.1.51；1∶2稀釋后為1.39.1.38，平均1.385。
表3、結(jié)果進一步提示了在牛血清中可以檢測到抗-HBs抗體；抗-HBs抗體陽性牛血清抑制人血清HBsAg的能力與其OD值基本呈正相關(guān)。
*HRP辣根過氧化物酶。
抗HFRS抗流行性出血熱病毒抗體。
權(quán)利要求
1.一種牛血清中牛乙型肝炎病毒及其表達產(chǎn)物，其提取、純化及濃縮可利用沉淀法、離心法、平衡法、層析法、離子交換法和/或其綜合法，在制備用于人類的，阻斷乙型肝炎病毒感染的牛血源性和/或基因工程性人乙型肝炎疫苗和乙型肝炎免疫球蛋白及其表達產(chǎn)物與相關(guān)產(chǎn)品中的應(yīng)用，其特征在于制備應(yīng)用中a、采用完整的牛乙肝病毒及其各種表達產(chǎn)物，b、采用牛乙肝病毒的各個不同核酸序列及其表達產(chǎn)物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征是所述的牛乙肝病毒的各種表達產(chǎn)物包括牛乙肝病毒核心抗原、牛乙肝病毒中間抗原和/或牛乙肝病毒表面抗原及其它相關(guān)產(chǎn)物和抗原。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征是所述的牛乙肝病毒的各個不同核酸序列的各種表達產(chǎn)物，包括牛乙肝病毒核心抗原、牛乙肝病毒中間抗原和/或牛乙肝病毒表面抗原及其它相關(guān)產(chǎn)物和抗原。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征是所述的在相關(guān)產(chǎn)品中的應(yīng)用，是指牛血清及含牛乙肝病毒牛血清在制備與人乙肝病毒感染標(biāo)志物相關(guān)的各種試劑盒中的應(yīng)用。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征是所述的在相關(guān)產(chǎn)品中的應(yīng)用，是指牛血清及含牛乙肝病毒牛血清在制備牛乙肝病毒感染動物模型中的應(yīng)用。
全文摘要
一種牛血清中OHBV及其表達產(chǎn)物在制備用于人類的，阻斷HBV感染的牛血源性和/或基因工程性人HB疫苗、HBIG及其表達產(chǎn)物與相關(guān)產(chǎn)品中的應(yīng)用。在制備應(yīng)用中采用完整的OHBV或OHBV的各個不同核酸序列或它們的各種表達產(chǎn)物如OHBcAg、OHBeAg、OHBsAg及其它相關(guān)產(chǎn)物和抗原等。亦可應(yīng)用于與HBV感染標(biāo)志物相關(guān)的各種試劑盒與動物模型。用牛血清制備抗-HBs替代人血源HBIG和OHBV或OHBsAg替代人血源性HB疫苗，安全、經(jīng)濟、高產(chǎn)、低成本。
文檔編號A61K39/29GK1164423SQ9611580
公開日1997年11月12日 申請日期1996年5月8日 優(yōu)先權(quán)日1996年5月8日
發(fā)明者張東海 申請人:張東海