專利名稱：青蒿素衍生物的新組合物及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及萜類化合物，更具體地說涉及青蒿素衍生物的組合物及它的應(yīng)用。
自1981年發(fā)現(xiàn)第一例艾滋病(AIDS)患者以來，全世界受艾滋病毒感染者越來越多，發(fā)病者已近800萬，我國(guó)自1985年從美國(guó)游客身上發(fā)現(xiàn)艾滋病以來，艾滋病毒感染者也呈上升趨勢(shì)。艾滋病在世界上逐步蔓延，大大影響了人民的身體健康及社會(huì)的穩(wěn)定，全世界的科學(xué)家對(duì)其的發(fā)病原因，傳播途徑等等進(jìn)行了深入研究并取得了較大的進(jìn)展，艾滋病的治療也有了進(jìn)一步的發(fā)展。自第一個(gè)報(bào)道用于治療艾滋病的藥物蘇拉明(Suramin)后又發(fā)現(xiàn)疊氮脫氧胸苷(AZT)等藥物在體外抗艾滋病毒具有活性，并進(jìn)行了臨床研究，1987年FDA批準(zhǔn)了AZT作為治療艾滋病藥物上市，至今正在研究的新化合物和復(fù)方組合物已有幾百種，希望從中能找到較為理想的治療艾滋病的臨床應(yīng)用藥物。
雙脫氧肌苷(DDI)，雙脫氧胞苷(DDC)亦先后被批準(zhǔn)臨床試用。但由于它們的毒副作用較為嚴(yán)重，而且最近又發(fā)現(xiàn)抗AZT的艾滋病毒，故第11屆國(guó)際艾滋病研討會(huì)發(fā)布新的治療準(zhǔn)則，第一步應(yīng)停止單用AZT療法，代之以更為有效的藥物聯(lián)合治療(包括AZT與DDC、DDI或與3T℃伍用)。雖然這一復(fù)方給艾滋病患者帶來希望，但仍存在有聯(lián)合的耐藥性和相似的毒副反應(yīng)，并且治療費(fèi)用昂貴，因此尋找新型結(jié)構(gòu)、有效、價(jià)格低廉的治療艾滋病藥物乃是當(dāng)務(wù)之急。
1994年Jung等對(duì)青蒿素類衍生物進(jìn)行抗艾滋病毒的研究，認(rèn)為青蒿素(I)脫羰青蒿素(II)對(duì)艾滋病毒無效，蒿乙醚(IIIc)和高脫羰青蒿素(IV)有一定作用，而12-正丁基脫羰青蒿素(V)顯示出較好的抗艾滋病毒的活性，但比AZT還差得多。
IIIa R＝OHIIIb R＝CH3IIIc R＝C2H5IIId R＝COCH2CH2COOHIIIe R＝CONHCH3IIIf R＝CH2CN
國(guó)內(nèi)曾毅等篩選了不少青蒿素衍生物，發(fā)現(xiàn)化合物青蒿琥酯(IIId)，青蒿素甲氨基甲酸酯(IIIe)等有抗艾滋病毒HIV-1的作用。(中國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)?3108651.5，申請(qǐng)?zhí)?3108650.7)。
本發(fā)明目的從天然產(chǎn)物青蒿素出發(fā)合成腈代蒿甲醚(IIIf)，通過篩選、劑型改進(jìn)、復(fù)方組合、尋找出更有效且無毒付作用的新型抗艾滋病藥物。
本發(fā)明的主要活性成分腈代蒿甲醚(IIIf)是由下列步驟合成獲得I→IIIa→IIIf1、雙氫青蒿素(IIIa)的制備可參照已知文獻(xiàn)進(jìn)行(專利CN1132207A)將青蒿素溶于甲醇，用鉀硼氫在0-5℃還原，反應(yīng)完全后，用酸中和，然后倒入鹽水，濾出固體，即得粗制品，產(chǎn)率95％。
2、將上述制備的干燥的雙氫青蒿素(284mg，1mmol)溶入氯代烷的溶劑中，加入乙醇腈(300mg，2.6mmol)和酸性催化劑，反應(yīng)完全后，用水洗，有機(jī)層用無水硫酸鎂干燥、濃縮后殘留物用層析法純化(硅膠，石油醚∶乙酸乙酯＝9∶1)，重結(jié)晶后得194mg針狀結(jié)晶(產(chǎn)率60％)，熔點(diǎn)150-2℃。元素分析C H N理論值63.147.794.33實(shí)測(cè)值63.098.004.23核磁共振(CDCl3，400MHz)，δ0.92(3H，d，J＝3.0Hz)，0.94(3H，d，J＝1.8Hz)，1.42(3H，s)，4.36，4.42(2H，AB系J＝5.7Hz)，4.90(1H，d，J＝3.5HZ)，5.38(1H，s)[歐洲專利EP0362730(1989年)只報(bào)道了該化合物的11％產(chǎn)率和熔點(diǎn)]。
腈代蒿甲醚(IIIf)對(duì)艾滋病毒的體外篩選實(shí)驗(yàn)材料腈代蒿甲醚溶于二甲基亞砜(DMSO)，配制成原液濃度為1mg/1ml，在實(shí)驗(yàn)時(shí)再以無血清培基稀釋不同濃度1×10-1，1×10-2，1×10-3若1×10-3仍有抑制病毒作用則不斷進(jìn)行10倍釋釋。
陽性對(duì)照AZT細(xì)胞MT4艾滋病毒HIV-1(由法國(guó)巴斯特研究所蒙特利亞教授贈(zèng)送)實(shí)驗(yàn)所用病毒量是為100TCID50/ml，在藥物抑制實(shí)驗(yàn)前，進(jìn)行病毒滴度測(cè)定，按Reed及Muench法計(jì)算TCID50。
實(shí)驗(yàn)方法a.將新鮮培養(yǎng)的MT4細(xì)胞(5×105ml)與病毒液(100TCID50/ml)共同培育，CO2培養(yǎng)箱中37℃作用1-1.5小時(shí)，以PBS洗滌，離心吸去上清液，反復(fù)洗三次，加帶血清培基校正濃度備用。
實(shí)驗(yàn)于96孔板中進(jìn)行，每孔中加入0.1ml上述感染病毒的MT4細(xì)胞懸液，然后加入0.1ml不同濃度的藥液。另設(shè)陽性藥AZT對(duì)照組，同時(shí)還設(shè)無藥液的病毒對(duì)照(僅有病毒感染的MT4細(xì)胞)，每個(gè)濃度的藥液設(shè)兩孔。試驗(yàn)組和對(duì)照組于37℃下CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，三天后換藥液，六天后進(jìn)行下列實(shí)驗(yàn)觀察；b.細(xì)胞生長(zhǎng)情況觀察，以胎芬蘭染色法(Trypan blue dye)觀察各組活細(xì)胞量；c.病毒P24抗原表達(dá)的測(cè)定以免疫酶法檢查病毒抗原表達(dá)，即用帶圓孔的載玻片各組細(xì)胞分別涂于孔內(nèi)，每個(gè)藥物濃度涂?jī)煽?，冷丙酮固定，并滴加抗HIV陽性血清，在37℃下CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30分鐘后，以PBS洗三次，再滴加酶標(biāo)SPA與上述同樣條件培育30分鐘，以PBS洗三次，然后置于顯色液中染色2-3分鐘，蒸餾水洗清玻片，在顯微鏡下觀察，正常細(xì)胞為無色，帶有病毒的細(xì)胞呈桃紅色。
結(jié)果判定“-”表示全孔未見陽性細(xì)胞，“+”表示全孔僅有2-3個(gè)陽性細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)重復(fù)二至三次，以完全抑制病毒的最小濃度判斷藥物效價(jià)濃度 10-110-210-310-410-5(50μg/ml) (5μg/ml) (0.5μg/ml) (0.05μg/ml) (0.005μg/ml)IIIf- -- - +AZT - -- - /IIIf完全抑制病毒所需最小濃度為0.05μg/ml(即0.15μm)。
腈代蒿甲醚(IIIf)預(yù)防治療SIV感染猴模型的效果試驗(yàn)試驗(yàn)方法1、動(dòng)物恒河猴5-7公斤，雄性，實(shí)驗(yàn)前體檢無異常，經(jīng)血清學(xué)檢查無猴免疫缺陷病毒(SIV)，猴逆轉(zhuǎn)錄D型病毒(SRV)和猴T細(xì)胞性I型病毒(STLV-1)抗體。
2、感染毒株和劑量用美國(guó)Aaron Diamond艾滋病研究中心Marx博士贈(zèng)的SIVmac251病毒液1∶50釋釋，相當(dāng)于2MID100(2個(gè)100％猴感染劑量)，1ml靜脈注射。
3、實(shí)驗(yàn)治療方案腈代蒿甲醚與花生油配制混懸液，每猴每次口服2-2.5ml，動(dòng)物共分三組對(duì)照組(以花生油代藥)，小劑量組(5毫克/公斤/日)和大劑量組(25毫克/公斤/日)。各組3只猴。
大劑量組、小劑量組、對(duì)照組于SIV感染的當(dāng)日先給藥15分鐘然后感染病毒，以后每天上午定時(shí)給藥一次，連續(xù)3周停藥觀察，直至感染3個(gè)月結(jié)束實(shí)驗(yàn)。
4、感染前、后觀察感染前除一般體檢外、秤體重、淋巴結(jié)活檢、感染和治療后繼續(xù)作一般觀察和檢查、并按程序定時(shí)采血測(cè)定血漿病毒滴度和抗體滴度，最后處死動(dòng)物取淋巴結(jié)和脾臟作病理組織學(xué)檢查。
血漿病毒滴度的測(cè)定動(dòng)物感染SIV后間隔一定時(shí)間連續(xù)采血， 血漿用于分離病毒，每標(biāo)本接4-6個(gè)濃度即20μl；4μl；8μl；1.6μl；0.32μl和0.064μl，各相當(dāng)于每毫升血漿SIV-5、25、125、625、3125或15625 TCID，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組各時(shí)期猴的病毒滴度平均值和標(biāo)準(zhǔn)差見表1和

圖1。
圖1顯示IIIf小劑量組、大劑量組和對(duì)照組血漿病毒水平的動(dòng)態(tài)變化。
其中-●-小劑量組，-▲-大劑量組，-○-對(duì)照組表1 治療組對(duì)照組各階段血漿病毒滴度的平均值血漿病毒血癥水平(TCID/ml ±SD)7 101418 22 30 52 90(天)IIIf 08.3± 1291± 5218.3±225± 211.6± 0 0(5mg/kg) 14.4 1607.39062.4 346.4 358IIIf 0 05416.6± 258.3± 10.0± 18.3±0 0(25mg/kg)8846.2321.5 13.211.5對(duì)照組0250.5± 1291.6± 1051.6± 5425± 210.0± 41.6± 1.6±330.7 1607.31795.6 8838.5 359.472.22.9從病毒學(xué)檢測(cè)結(jié)果表明IIIf小劑量組(5mg/kg)和大劑量組(25mg/kg)均有降低血漿病毒血癥水平作用，尤以大劑量組較為明顯。
從淋巴結(jié)和脾臟的病理組織學(xué)改變比較淋巴系統(tǒng)細(xì)胞反應(yīng)表明IIIf大劑量組的反應(yīng)較強(qiáng)。小劑量組次之，對(duì)照組較弱，這顯示IIIf對(duì)SIV感染的細(xì)胞組織有激活作用。
綜合上述結(jié)果表明，IIIf在猴體實(shí)驗(yàn)中有一定抑制SIV作用和激活機(jī)體免疫細(xì)胞功能作用。
本發(fā)明的組合物由一定量的腈代蒿甲醚組成單方組合物也可與青蒿琥酯(IIId)或與青蒿素甲氨基甲酸酯(IIIe)或與青蒿琥酯和青蒿素甲氨基甲酸酯組成復(fù)方組合物，它們的配制，加不同的輔料，按不同劑型的要求，采用各種方法配制而成，供動(dòng)物或臨床的應(yīng)用。包括固體形式的片劑，膠囊、栓劑、微型膠囊、粉劑、顆粒散、透皮軟膏、臍敷膏等。腈代蒿甲醚(IIIf)單方的組合物中，IIIf占組合物重量的0.1％-10％，優(yōu)選范圍為1％-3％，按照不同劑型的要求根據(jù)主要活性成分的比例加入不同比例的輔料，使之成為百分之百，例如片劑中加入羧甲基纖維素，淀粉，硬脂酸鎂等與水配制成顆粒然后壓片。
腈代蒿甲醚復(fù)方的組合物中，活性成份占組合物重量的0.1％-10％。
復(fù)方的配比如下腈代蒿甲醚∶青蒿琥酯＝1∶1～0.1按照不同劑型要求，根據(jù)主要活性成分的比例，加入不同比例的輔料，使之成為百分之百，例如栓劑的制備，活性成分加入聚氧乙烯(40)單硬酸酯，吐溫-80，加熱使之熔化，然后注模，即成栓劑。
腈代蒿甲醚∶青蒿素甲氨基甲酸酯＝1∶1～0.1。
按照不同劑型要求，根據(jù)主要活性成分的比例，加入不同比例的輔料，使之成為百分之百，例如膠囊的制備，活性成分加入淀粉，聚乙烯基吡咯烷酮混合均勻，過篩，按劑量要求分裝入膠囊。
腈代蒿甲醚∶青蒿琥酯∶青蒿素甲氨基甲酸酯＝1∶1～0.1∶1～0.1。將三種有效成分混合在一起，按上法配制成各種所需的制劑。
用以下實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明。
最佳實(shí)施例1.栓劑制法腈代蒿甲醚(IIIf)14克，聚氧乙烯(40)單硬酸酯(代號(hào)為S40)127.9克，吐溫-80 2.1克，將S40和吐溫80置于容器中在60～90℃水浴中加熱熔化，再將腈代蒿甲醚(IIIf)的細(xì)粉，分批加入混勻注模即成。
2.取石蠟20克放置容器中，水浴中加熱熔化石蠟，加入可可豆油200克，并調(diào)勻，用綢布過濾去除不溶的雜質(zhì)，冷卻到38～40℃時(shí)，加入已研細(xì)的腈代蒿甲醚24克，混勻，混勻后注模即成。
3.片劑制法取腈代蒿甲醚80克，青蒿素甲氨基甲酸酯20g、粉碎、過篩、加入羧甲基纖維素20克，淀粉20克，硬脂酸鎂10克，攪拌均勻，加水制成顆粒，然后壓成片劑，每片含50毫克的活性物質(zhì)。
4.膠囊制法
取腈代蒿甲醚80克，青蒿素甲氨基甲酸酯10g，青蒿琥酯10g、粉碎、過篩、加入淀粉50克、聚乙烯基吡咯烷酮20g，混合均勻、過篩，然后裝入4000個(gè)膠囊，每個(gè)膠囊含有25毫克的活性物質(zhì)。
權(quán)利要求
1.一種含有如下結(jié)構(gòu)式的活性物質(zhì)腈代蒿甲醚(IIIf)、青蒿琥酯(IIId)與青蒿素甲氨基甲酸酯(IIIe)的組合物，其特征在于由腈代蒿甲醚組成的單方組合物也可由腈代蒿甲醚與青蒿琥脂，或與青蒿素甲氨基甲酸酯，或與青蒿素甲氨基甲酸酯和青蒿琥酯組成復(fù)方組合物，按不同劑型要求加入不同輔料配制而成。
IIId R＝COCH2CH2COOHIIIe R＝CONHCH3IIIf R＝CH2CN
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其特征在于腈代蒿甲醚含量為0.1％～10％，優(yōu)先范圍為1％～3％制成單方組合物。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其特征在于腈代蒿甲醚∶青蒿琥酯為1∶1～0.1制成復(fù)方組合物。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其特征在于腈代蒿甲醚∶青蒿素甲氨基甲酸酯為1∶1～0.1制成復(fù)方組合物。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其特征在于腈代蒿甲醚∶青蒿琥酯∶青蒿素甲氨基甲酸酯為1∶1～0.1∶1～0.1，配成復(fù)方組合物。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的單方組合物，其特征在于生物活性物質(zhì)腈代蒿甲醚按照不同的劑型加入不同的輔料制成片劑，膠囊、微型膠囊、栓劑、粉劑、顆粒散及貼敷膏、透皮軟膏。
7.根據(jù)權(quán)利要求3所述的復(fù)方組合物，其特征在于活性物質(zhì)腈代蒿甲醚和青蒿琥酯按不同劑型加入不同輔料制成片劑、膠囊、微型膠囊、栓劑、粉劑、顆粒散及貼敷膏，透皮軟膏。
8.根據(jù)權(quán)利要求4所述的組合物， 其特征在于活性物質(zhì)腈代蒿甲醚和青蒿素甲氨基甲酸酯按不同劑型加入不同輔料制成片劑、膠囊、微型膠囊、栓劑、粉劑、顆粒散及貼敷膏、透皮軟膏。
9.根據(jù)權(quán)利要求5所述的復(fù)方組合物，其特征在于活性物質(zhì)腈代蒿甲醚、青蒿琥酯、青蒿素甲氨基甲酸酯按不同劑型加入不同輔料制成片劑、膠囊、微型膠囊、栓劑、粉劑、顆粒散及貼敷膏、透皮軟膏。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其特征在于它在預(yù)防、治療艾滋病藥物中應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明采用幾種有抗艾滋病毒作用的青蒿毒衍生物作為活性物質(zhì),按照不同劑型加入不同輔料制成片劑、膠囊、粉劑、顆粒散、微型膠囊、栓劑及貼敷膏、透皮軟膏。它們可在治療、預(yù)防艾滋病藥物中應(yīng)用。
文檔編號(hào)A61K31/35GK1186661SQ96116649
公開日1998年7月8日 申請(qǐng)日期1996年12月30日 優(yōu)先權(quán)日1996年12月30日
發(fā)明者李英, 曾毅, 李澤琳, 姜洪建, 吳光韶 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院上海藥物研究所