專(zhuān)利名稱(chēng)：基于煙草及其燃燒副產(chǎn)物中存在的高級(jí)糖基化終產(chǎn)物的測(cè)定和處理方法
方法本發(fā)明的技術(shù)領(lǐng)域概括地說(shuō)，本發(fā)明涉及使用煙草產(chǎn)品、諸如香煙與高級(jí)糖基化終產(chǎn)物(AGEs)(advanced glycosylationendproduct)的存在之間的相關(guān)性，并涉及可有助于涉及這一觀察結(jié)果和關(guān)系的診斷、治療和工業(yè)化應(yīng)用。更具體地說(shuō)，本發(fā)明本身涉及這樣一種觀察結(jié)果，即煙草產(chǎn)品的消耗可增加體內(nèi)AGEs的量，伴隨的情況是與吸煙和AGE蓄積相關(guān)的疾病的危害和發(fā)病率增加，且本發(fā)明涉及煙草、煙草的煙霧及其提取物中、以及煙草使用者體內(nèi)AGEs的檢測(cè)，包括檢測(cè)不需要的過(guò)量AGE水平和評(píng)價(jià)商業(yè)化規(guī)模的煙草和發(fā)煙物質(zhì)。本發(fā)明還涉及AGEs形成抑制劑在各種范圍內(nèi)的應(yīng)用以便治療或防止不需要的過(guò)量AGE水平、以及改進(jìn)商業(yè)化規(guī)模的煙草和發(fā)煙物質(zhì)。
本發(fā)明的背景吸煙對(duì)人體健康的有害作用已經(jīng)廣泛地得到了證明。在其它情況中，就吸煙者來(lái)說(shuō)，這類(lèi)疾病、諸如癌癥和冠狀動(dòng)脈疾病在發(fā)病率和嚴(yán)重性上顯著地增加，且這類(lèi)病人在脂蛋白分布和氧化LDLs升高方面同樣表現(xiàn)出顯著的改變。在其它情況中，在高級(jí)糖基化終產(chǎn)物(AGEs)水平升高的病人中還觀察到冠狀動(dòng)脈疾病和dyslipidemia的發(fā)病率和嚴(yán)重性增加，且這些觀察結(jié)果的一致性為構(gòu)成本發(fā)明基礎(chǔ)的這一發(fā)現(xiàn)提供了舞臺(tái)。
葡萄糖與蛋白質(zhì)之間的非酶反應(yīng)已經(jīng)得到確認(rèn)許多年了，而這些反應(yīng)的分子詳圖、以及體內(nèi)非酶糖化的生物和醫(yī)學(xué)后果目前依然顯現(xiàn)。最早確認(rèn)的非酶糖化表現(xiàn)形式是在烹調(diào)食品過(guò)程中出現(xiàn)褐色色素，這是由美拉德(maillard)在1912年確定的，并將術(shù)語(yǔ)“褐變”用于這門(mén)食品化學(xué)。美拉德觀察到葡萄糖或其它還原糖自發(fā)地與含有氨基的化合物、諸如氨基酸和肽反應(yīng)而形成原始的希夫堿加合物。然后這種冷縮產(chǎn)物進(jìn)行一系列另外的自發(fā)脫水、重排和其它反應(yīng)而形成各種類(lèi)的褐色色素、目前稱(chēng)作高級(jí)糖基化終產(chǎn)物(或AGEs)。
在這一最初發(fā)現(xiàn)以后的幾年中，食品化學(xué)家具體地研究了美拉德反應(yīng)且確定儲(chǔ)存和經(jīng)熱處理的食品可進(jìn)行非酶褐變而作為葡萄糖與多肽鏈間原始反應(yīng)的改進(jìn)，并確定作為結(jié)果，蛋白質(zhì)交聯(lián)且蛋白質(zhì)相應(yīng)地表現(xiàn)出降低的生物利用度。在這點(diǎn)上，確定導(dǎo)致蛋白質(zhì)糖基化(或高級(jí)糖化)中褐色顯現(xiàn)的色素還具有特征吸收光譜和熒光特性。
近年來(lái)發(fā)現(xiàn)上述討論的還原糖和食品組分之間的反應(yīng)在體內(nèi)平行進(jìn)行。因此，通過(guò)向蛋白質(zhì)上的游離氨基添加葡萄糖而形成的原始希夫堿的非酶重排可形成穩(wěn)定的氨基，1-脫氧酮糖基(ketosyl)加合物，將該加合物稱(chēng)作Amadori產(chǎn)物。(涉及還原酮糖而不是醛糖的平行反應(yīng)生成稱(chēng)作Heyns重排產(chǎn)物的早期糖化產(chǎn)物)。已經(jīng)證明發(fā)生了這種早期糖化加合物與血紅蛋白的蓄積，其中在與葡萄糖的原始反應(yīng)后，血紅蛋白β-鏈氨基末端的重排形成修飾的血紅蛋白、稱(chēng)作血紅蛋白Aic，它是一種臨床上用于糖尿病葡萄糖對(duì)照的重要標(biāo)記物。還發(fā)現(xiàn)發(fā)生了與各種其它的體蛋白、諸如晶狀體晶體蛋白、膠原神經(jīng)蛋白、和低密度脂蛋白以及DNA和氨基磷脂的糖化反應(yīng)。
美拉德褐變過(guò)程生成大量不同數(shù)量的高級(jí)糖基化產(chǎn)物，它們中的每一種都呈現(xiàn)很低的收率。這種多樣性使具體AGEs的確定和結(jié)構(gòu)測(cè)定成為疑難問(wèn)題。在美國(guó)專(zhuān)利4,665,192中，從某些變褐的多肽、諸如牛血清白蛋白和聚-L-賴(lài)氨酸中分離并識(shí)別了熒光發(fā)色團(tuán)2-(2-糠酰)-4(5)-2(呋喃基)-1H-咪唑。這一成功促進(jìn)了隨后另外的高級(jí)糖基化終產(chǎn)物的識(shí)別并促使了更多的試圖理解蛋白質(zhì)老化過(guò)程的化學(xué)和識(shí)別所涉及的特殊反應(yīng)物、中間產(chǎn)物和產(chǎn)物的研究，從而改進(jìn)了用于抑制糖化的方法和試劑。
近來(lái)，已經(jīng)確認(rèn)了其它高級(jí)糖基化產(chǎn)物，諸如AFGP(Farmar等，美國(guó)專(zhuān)利5,017,696,1991年5月21日授權(quán))；pyrraline(Hayase等，“蛋白質(zhì)的老化葡萄糖誘導(dǎo)的體內(nèi)美拉德反應(yīng)過(guò)程中形成的吡咯的免疫檢測(cè)”，《生物化學(xué)雜志》263:3758-3764(1989))，和pentosidine(Sell,D.和Monnier V.“來(lái)自人體胞外基質(zhì)老化交聯(lián)物的結(jié)構(gòu)說(shuō)明”,《生物化學(xué)雜志》264:21597-21602(1989))。
已經(jīng)收集到的大量證據(jù)證明作為一個(gè)整體的美拉德產(chǎn)物構(gòu)成在體內(nèi)AGEs蓄積時(shí)發(fā)生的各種正常和致病活性和反應(yīng)的基礎(chǔ)。這類(lèi)活性可以是直接的，例如糖化產(chǎn)物和加合物化學(xué)反應(yīng)性的結(jié)果；或非直接的，它通過(guò)AGE特異性結(jié)合蛋白或受體由糖化加合物的細(xì)胞識(shí)別介導(dǎo)。
盡管描述體內(nèi)AGE蓄積的致病作用的多數(shù)研究集中在AGE-蛋白質(zhì)和AGE-肽上，但是已經(jīng)確認(rèn)脂、且特別是低密度脂蛋(LDL)與葡萄糖之間形成脂-AGEs的反應(yīng)在(例如)動(dòng)脈粥樣化形成中起致病作用，其中泡沫細(xì)胞的形成表明動(dòng)脈粥樣硬化斑的蓄積。低密度脂蛋白(LDL)的蛋白質(zhì)和脂成分的氧化和糖化導(dǎo)致細(xì)胞LDL受體無(wú)法識(shí)別apo B成分，同時(shí)借助于巨噬細(xì)胞“清除劑”受體、AGE受體、和其它特殊細(xì)胞機(jī)理延長(zhǎng)了這種LDL的循環(huán)半衰期并導(dǎo)致更好地?cái)z取氧化的LDL(ox-LDL)或另外修飾的LDL。增加的ox-LDL經(jīng)血管壁巨噬細(xì)胞胞吞作用與它們轉(zhuǎn)化入表明具有早期動(dòng)脈粥樣硬化損害的滿(mǎn)載脂的泡沫細(xì)胞有關(guān)。上述研究還證明LDLs的AGE修飾增加了脂氧化的潛力。
AGEs“族”包括可以被分離且特征在于化學(xué)結(jié)構(gòu)的相對(duì)穩(wěn)定的種類(lèi)，而其它的種類(lèi)是不穩(wěn)定或反應(yīng)性的且它們的結(jié)構(gòu)測(cè)定由此已經(jīng)成為疑難問(wèn)題。通過(guò)特殊的化學(xué)試劑可以“捕捉”不穩(wěn)定或反應(yīng)性的AGEs，且對(duì)于治療目的來(lái)說(shuō)，這類(lèi)反應(yīng)和捕捉過(guò)程不僅用于深入了解結(jié)構(gòu)而且用于抑制糖化過(guò)程。AGE-脂還可以是穩(wěn)定的、不穩(wěn)定的或反應(yīng)性的。
對(duì)AGEs致病潛在性的評(píng)價(jià)提示干擾(或抑制)高級(jí)糖化的化學(xué)過(guò)程可以具有巨大的療效。在這方面，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了一系列試劑，以氨基胍(也稱(chēng)Pimagedine)為典型實(shí)例，它們是有用的糖化抑制劑。理論上推斷這種化合物(和類(lèi)似它的其它化合物)可與靶蛋白(或其它生物分子)早期糖基化產(chǎn)物的羰基部分反應(yīng)，所述的靶蛋白在與葡萄糖或另一種還原糖的原始非酶反應(yīng)之后形成，且由此防止了進(jìn)一步形成高級(jí)糖基化終產(chǎn)物的反應(yīng)。
高級(jí)糖化反應(yīng)的各種其它抑制劑也是公知的，認(rèn)為在對(duì)由氨基胍及其類(lèi)似物產(chǎn)生的抑制作用最敏感的階段之外的美拉德反應(yīng)階段特別有效。例如，具有活性醛取代基的某些化合物(諸如乙醛)、或其組合物是高級(jí)糖化途徑的有效抑制劑。認(rèn)為這種活性是通過(guò)這類(lèi)活性醛試劑與美拉德反應(yīng)初始階段中形成的糖化產(chǎn)物的糖基-氨基部分反應(yīng)而產(chǎn)生的，即這些試劑與Amadori和Heyns重排產(chǎn)物(它們是早期的糖化產(chǎn)物)進(jìn)行反應(yīng)?？梢跃哂蓄?lèi)似能力的其它試劑是那些包括保守結(jié)合基元的物質(zhì)，所述的保守結(jié)合基元含有共有的17-18氨基酸半胱氨酸結(jié)合的親水肽環(huán)區(qū)，這是最初在抗菌蛋白質(zhì)溶菌酶和乳鐵蛋白中發(fā)現(xiàn)并確定的。更具體地說(shuō)，典型的試劑包括具有親水環(huán)區(qū)的分子，該親水環(huán)區(qū)具有符合R1Z1XaanZ2R2(SEQ ID NOS:1-6)的結(jié)構(gòu)，其中Z1和Z2是能夠形成交聯(lián)物的殘基；R1和R2是獨(dú)立的多肽，C1-C12的烷基，芳基，雜烷基，或雜芳基，或氫；Xaa是任意的L-或D-氨基酸；且n=13-18。這類(lèi)試劑及其應(yīng)用出現(xiàn)在國(guó)際申請(qǐng)WO96/31537中，該申請(qǐng)于1996年10月10日公開(kāi)，將該文獻(xiàn)引入本文作為參考。而通過(guò)與晚期糖化產(chǎn)物反應(yīng)，其它試劑、諸如某些噻唑化合物對(duì)防止高級(jí)糖化特別有效，且甚至可使高級(jí)糖化終產(chǎn)物和相關(guān)交聯(lián)部分的形成可逆。
認(rèn)為本發(fā)明中應(yīng)用的化合物(及其組合物)與早期糖基化產(chǎn)物反應(yīng)，由此防止來(lái)自晚期的相同物質(zhì)形成高級(jí)糖基化終產(chǎn)物，這些高級(jí)糖基化終產(chǎn)物可導(dǎo)致交聯(lián)并由此導(dǎo)致分子或蛋白質(zhì)老化和其它有害的分子影響。
與早期和晚期糖化產(chǎn)物反應(yīng)的所有這類(lèi)不同的糖化途徑抑制劑和其它化合物(單獨(dú)或以結(jié)合方式)可應(yīng)用于改善蓄積在體內(nèi)的AGEs的致病潛在性。
AGEs可以通過(guò)以下方式蓄積通過(guò)與外源AGEs接觸(例如通過(guò)吸煙)在體內(nèi)重新形成、在體內(nèi)由細(xì)胞活性釋放的AGEs的重新結(jié)合(reattachment)、或作為由申請(qǐng)人在本文中所公開(kāi)的方式。因此，AGEs反應(yīng)途徑的意義以及在煙草和煙霧中所觀察到的它們的存在對(duì)需要監(jiān)測(cè)個(gè)體吸煙習(xí)慣、以及對(duì)于減少通過(guò)使用煙草而轉(zhuǎn)化的AGEs的有效試劑和裝置的有效技術(shù)的建立都具有進(jìn)一步的重要性和促進(jìn)性。這類(lèi)監(jiān)測(cè)技術(shù)可用于收集這類(lèi)吸煙者的吸煙史，且還用于監(jiān)測(cè)他們的內(nèi)科疾病且特別是這些與升高的AGEs水平相關(guān)的疾病的素因。在煙草中測(cè)定AGEs可促進(jìn)對(duì)煙草作物的評(píng)價(jià)、以及提供在消耗由上述作物制備的發(fā)煙物質(zhì)的過(guò)程中轉(zhuǎn)移到吸煙者中的AGEs量的指標(biāo)；在這方面，還可以在煙霧中估測(cè)AGEs。在這方面有效的治療策略、方法和試劑提及抑制煙草中(發(fā)煙物質(zhì)中)的AGEs、且包括改善用于吸煙、或在防止或治療吸煙或接觸吸煙或接觸煙霧群體的個(gè)體的過(guò)濾裝置和類(lèi)似物質(zhì)。本發(fā)明所涉及的所有上述目的趨于實(shí)現(xiàn)。
本發(fā)明的概括本發(fā)明來(lái)源于這樣一種發(fā)現(xiàn)，即煙草及其燃燒副產(chǎn)物、諸如煙霧含有高級(jí)糖基化終產(chǎn)物(AGEs)，這些AGEs作為一組與含有胺(amine)的生物分子(特別是蛋白質(zhì))進(jìn)行反應(yīng)，且因此吸煙或另外使用煙草的個(gè)體一般表現(xiàn)出整個(gè)血液和組織中AGE水平的增加。這樣的水平升高與病理性發(fā)病率增加有關(guān)，諸如冠狀動(dòng)脈疾病、動(dòng)脈粥樣化形成和其它疾病所增加的危害，這些疾病與AGEs的蓄積有關(guān)。
因此，本發(fā)明確認(rèn)AGEs存在于煙草、作為通過(guò)吸煙和煙草燃燒副產(chǎn)物而使用的煙草產(chǎn)品以及取自吸煙者的生物樣品中。在第一個(gè)方面中，本發(fā)明涉及測(cè)定煙草發(fā)煙物質(zhì)中、煙草燃燒副產(chǎn)物中、和取自吸煙者的生物樣品中的AGEs，從而確定AGE水平并由此便利對(duì)吸煙過(guò)程中個(gè)體接觸這類(lèi)AGEs的可能性或歷史的判斷，或?qū)煵莼驘煵莓a(chǎn)品的狀況、包括(例如)估測(cè)煙草作物的期限、氣味和/或貯存情況(新鮮性)提供信息。
更具體地說(shuō)，對(duì)吸煙者的測(cè)定和評(píng)價(jià)可用于對(duì)任何病理性疾病的病人和從業(yè)者進(jìn)行評(píng)價(jià)，所述的疾病可以具有很高的發(fā)作可能性，或如果這樣的疾病出現(xiàn)，它需經(jīng)歷周密的定期監(jiān)測(cè)和/或表明需要治療措施，對(duì)吸煙者的測(cè)定和評(píng)價(jià)又可用于評(píng)價(jià)吸煙者根據(jù)吸煙習(xí)慣而耐受的程度和隨后的危害。后者的見(jiàn)解將會(huì)補(bǔ)充到對(duì)作為用于戒煙目的步驟中的參與者的病人的評(píng)價(jià)中，既評(píng)價(jià)檢測(cè)受試者的吸煙史的長(zhǎng)短，又評(píng)價(jià)安全性或類(lèi)似的研究目的，從而證實(shí)停止使用煙草(或因其缺乏)。
通過(guò)處理煙草樣品以形成懷疑其中存在AGEs的提取物的方式可以進(jìn)行AGEs的測(cè)定，隨后對(duì)該提取物進(jìn)行這類(lèi)目的的分析。在一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)燃燒以形成煙霧來(lái)處理樣品，然后對(duì)煙霧進(jìn)行AGEs的存在和量的檢驗(yàn)。另一方面，該提取物可以通過(guò)對(duì)煙草單獨(dú)進(jìn)行化學(xué)處理而產(chǎn)生。還可以檢驗(yàn)吸煙者的體液和組織以測(cè)定因吸煙而出現(xiàn)的AGEs的水平和程度。將這些結(jié)果和從與非吸煙的然而共有同樣醫(yī)學(xué)分布圖的待檢病人的個(gè)體建立的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行比較。
本發(fā)明包括制備用于特異性識(shí)別與煙草相關(guān)的AGEs的試劑，諸如特異性抗煙草和煙霧中發(fā)現(xiàn)的AGEs的抗體，從而有助于與煙草相關(guān)的AGEs的檢測(cè)和吸煙者醫(yī)療情況的評(píng)價(jià)。將這類(lèi)試劑引入檢驗(yàn)試劑盒和類(lèi)似物中而用于進(jìn)行這樣的評(píng)價(jià)。
在相關(guān)的方面中，使用保留和承載糖化靶分子(諸如含有胺(amine)的部分)的底物或載體來(lái)制造劑量器，所述的糖化靶分子固定化與底物或載體結(jié)合、并能夠與存在于樣品中的AGEs反應(yīng)，所述的樣品是環(huán)境空氣樣品或取自病人的生物樣品?？梢詫┝科鬟B同本文所列的診斷方案和檢驗(yàn)試劑盒一起使用。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及用于檢測(cè)和測(cè)定吸煙個(gè)體中高級(jí)糖基化終產(chǎn)物水平的方法，該方法通過(guò)以下步驟進(jìn)行收集來(lái)自這類(lèi)個(gè)體的生物樣品，此后對(duì)這些樣品進(jìn)行高級(jí)糖基化終產(chǎn)物的存在和量的檢驗(yàn)。所收集的樣品可以涉及細(xì)胞，組織，血清，唾液，尿或糞便，且以前依據(jù)AGEs已經(jīng)對(duì)檢測(cè)和測(cè)定技術(shù)進(jìn)行了改進(jìn)和應(yīng)用。
在另一個(gè)方面中，本發(fā)明涉及制備拮抗劑，諸如特別抗煙草和煙霧中發(fā)現(xiàn)的AGEs的抗體、結(jié)合基元和高級(jí)糖化的化學(xué)抑制劑。
本發(fā)明還涉及用于治療煙草使用者或吸煙者個(gè)體中的疾病的方法和相關(guān)試劑，包括將這類(lèi)方法和試劑用于抑制蛋白質(zhì)的老化，且特別是這類(lèi)試劑能夠與糖基化產(chǎn)物反應(yīng)，從而阻止它們的形成和/或這類(lèi)AGEs的有害活性。
特別地，用于抑制因高級(jí)糖基化終產(chǎn)物形成導(dǎo)致的蛋白質(zhì)老化的試劑可以選自以下物質(zhì)組成的組氨基胍，拮抗劑，類(lèi)似物，同類(lèi)物，同源物(cognate)及其模擬物，和它們的混合物。
這類(lèi)試劑還可以包括并可以選自能夠與早期糖基化產(chǎn)物(也稱(chēng)作Amadori和Heyns產(chǎn)物)的糖基-氨基部分反應(yīng)的物質(zhì)，所述的早期糖基化產(chǎn)物通過(guò)葡萄糖(或其它反應(yīng)糖)與提供糖化敏感部分(諸如蛋白質(zhì)上的氨基)的生物分子反應(yīng)而形成，由此使這種早期糖基化產(chǎn)物穩(wěn)定，并防止其進(jìn)一步反應(yīng)形成高級(jí)糖基化終產(chǎn)物。因此，例如，具有活性醛取代基的化合物或組合物、且更具體地說(shuō)諸如乙醛這樣的化合物是穩(wěn)定的。認(rèn)為這種活性是由這類(lèi)活性醛試劑與美拉德反應(yīng)起始階段中形成的糖化產(chǎn)物的糖基-氨基部分反應(yīng)而產(chǎn)生的，即這些試劑與Amadori和Heyns重排產(chǎn)物反應(yīng)，Amadori和Heyns重排產(chǎn)物是早期糖化產(chǎn)物。
更具體地說(shuō)，這些試劑可以含有參與具有通式Ⅰ或Ⅱ的產(chǎn)物形成的化合物
其中R是含有氨基的肽或蛋白質(zhì)的殘基，它們通過(guò)早期糖基化產(chǎn)物(也稱(chēng)作Amadori或Heyns產(chǎn)物)的糖基-氨基部分與含有活性醛基的試劑反應(yīng)來(lái)制備，所述的早期糖基化產(chǎn)物通過(guò)葡萄糖(或其它反應(yīng)糖)與蛋白質(zhì)反應(yīng)所而形成。臨時(shí)申請(qǐng)順序號(hào)為60/006,752(“抑制蛋白質(zhì)老化的改進(jìn)方法和試劑”,1995年11月15日申請(qǐng))中描述了這類(lèi)典型試劑，將該文獻(xiàn)引入本文作為參考。
通過(guò)與晚期糖化產(chǎn)物的反應(yīng)，其它試劑、諸如某些噻唑化合物對(duì)防止高級(jí)糖化特別有效，且甚至可逆轉(zhuǎn)高級(jí)糖化終產(chǎn)物和相關(guān)交聯(lián)部分的形成。認(rèn)為有效抵抗預(yù)先存在或晚期糖化加合物的典型化合物和組合物通過(guò)與存在于AGEs中的α-二羰基片段、特別是在形成分子間或分子內(nèi)交聯(lián)的AGE結(jié)構(gòu)中出現(xiàn)的這類(lèi)α-二羰基片段反應(yīng)、并導(dǎo)致裂解它們而起作用。這種基于噻唑的化合物優(yōu)選以一種再生原始的、活性噻唑衍生物的催化方式在這方面起作用，所述的噻唑衍生物可以催化另外存在的AGE部分的裂解。這類(lèi)典型試劑可以含有具有下列結(jié)構(gòu)通式的噻唑化合物
其中R1和R2獨(dú)立選自以下基團(tuán)組成的組氫，羥基(低級(jí))烷基，乙酸基(低級(jí))烷基，低級(jí)烷基，低級(jí)鏈烯基，或R1和R2連同其環(huán)碳可以是一種芳香稠環(huán)，它可任意被一個(gè)或多個(gè)氨基，鹵或亞烷基二氧(alkylenedioxy)取代；Z是氫或氨基；Y是氨基，一種下列通式的基團(tuán)
其中R是低級(jí)烷基，烷氧基，羥基，氨基或芳基，所述的芳基可任意被一個(gè)或多個(gè)低級(jí)炕基，低級(jí)烷氧基，鹵，二烷氨基，羥基，硝基或亞烷基二氧取代；一種下列通式的基團(tuán)-CH2R’其中R’是氫，或低級(jí)烷基，低級(jí)炔基，或芳基；或一種下列通式的基團(tuán)
其中R”是氫且R”’是低級(jí)烷基、可任意被芳基取代，或芳基，所述的芳基可任意被一個(gè)或多個(gè)低級(jí)烷基，鹵，或烷氧基羰基取代；或R”和R”’兩者均為低級(jí)烷基；X是鹵化物，甲苯磺酸鹽，甲磺酸鹽或磺酸鹽的離子；及其混合物。
認(rèn)為本發(fā)明中應(yīng)用的化合物(及其組合物)與早期糖基化產(chǎn)物反應(yīng)，由此阻止其后形成高級(jí)糖基化終產(chǎn)物，這些高級(jí)糖基化終產(chǎn)物可導(dǎo)致交聯(lián)(并由此)導(dǎo)致分子或蛋白質(zhì)老化和其它有害的分子影響。此外，認(rèn)為所述的化合物和組合物與已經(jīng)形成的高級(jí)糖基化終產(chǎn)物反應(yīng)以減少這類(lèi)產(chǎn)物的量。在申請(qǐng)順序號(hào)為08/375,155中更具體地描述了這些試劑，將該文獻(xiàn)引入本文作為參考。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及特別在吸煙者或另外消耗煙草產(chǎn)品的個(gè)體中減少高級(jí)糖基化終產(chǎn)物蓄積的方法，該方法通過(guò)以下步驟進(jìn)行使用公知用來(lái)抑制高級(jí)糖基化終產(chǎn)物形成的試劑、諸如那些上文所列的試劑來(lái)治療這類(lèi)個(gè)體。所述的試劑特別應(yīng)用于發(fā)病率或嚴(yán)重性與煙草的消耗、特別是吸煙有關(guān)的幾種疾病和病理情況，諸如心血管、腦血管和外周血管的疾病，它們包括、例如心臟和冠狀動(dòng)脈疾病，心律失常，動(dòng)脈粥樣硬化，中風(fēng)，高血壓，肺部感染，閉塞性血栓性脈管炎，外周閉塞性血管病，雷諾病，跛行和腎衰竭；肺部疾病，諸如慢性阻塞性肺部疾病，慢性支氣管炎，肺氣腫，哮喘，和肺嗜曙紅細(xì)胞肉芽腫；各種癌癥包括、但不限于肺癌，口腔、頭部和頸部的癌，間皮瘤，食管、膀胱、頸、子宮內(nèi)膜、胰和腎細(xì)胞的癌；消化性、胃和食管潰瘍；高血脂和dyslipidemia；骨質(zhì)疏松；硬皮病，鼻煙引起的(snuff)角化病和口腔粘膜白斑?。幻庖咭种?；以及牙和皮膚染色。
除直接治療個(gè)體外，本方法還涉及處理煙草物質(zhì)本身以減少這類(lèi)AGEs的對(duì)消費(fèi)者或旁觀者生成和通過(guò)。因此，在第一種情況中，本方法包括通過(guò)化學(xué)方法或其它方法處理煙草物質(zhì)本身，從而減少高級(jí)糖基化終產(chǎn)物的形成或存在。當(dāng)用糖處理某些煙草時(shí)，這類(lèi)方法可涉及處理所處理的煙草以便完成降低本文所定義的AGEs或其前體的糖化毒素(glycotoxins)含量的步驟。
處理煙草物質(zhì)的另一個(gè)實(shí)施方案包括制備用于與煙草終產(chǎn)物或香煙一起使用的合適過(guò)濾介質(zhì)，將這種過(guò)濾介質(zhì)用諸如本文所列的、公知作為高級(jí)糖基化的抑制劑的那些試劑進(jìn)行處理。然后將這類(lèi)試劑分布在過(guò)濾介質(zhì)內(nèi)，以這樣的方式便于在煙霧通過(guò)濾器時(shí)與它進(jìn)行表面接觸和液體滯留，從而捕捉和/或防止高級(jí)糖基化終產(chǎn)物的形成。在這后一方面中，本發(fā)明涉及包括多孔介質(zhì)的濾器，它由纖維或其它類(lèi)似的合適材料來(lái)制備，在其活性表面上已經(jīng)包含了一定量的、公知用于抑制高級(jí)糖基化或能夠通過(guò)與存在于煙草的煙流中的AGEs反應(yīng)而捕捉的試劑。這類(lèi)衍生的濾嘴和過(guò)濾介質(zhì)不僅可以應(yīng)用于減少或消除在通過(guò)吸煙而直接消耗煙草產(chǎn)品生成的最初煙流中的AGEs，而且當(dāng)已經(jīng)指出旁觀者吸入附近其它人吸煙活動(dòng)中產(chǎn)生的煙霧時(shí)，所述的濾嘴和過(guò)濾介質(zhì)可以減少或消除與煙草煙霧接觸的環(huán)境中、諸如在“二次吸煙”中的周?chē)腁GEs。用于制備這類(lèi)過(guò)濾介質(zhì)的技術(shù)也是公知的，且它們本身不構(gòu)成本發(fā)明的部分。當(dāng)然，就使本發(fā)明應(yīng)用的試劑進(jìn)入這類(lèi)過(guò)濾介質(zhì)上的活性位置這一特定過(guò)程來(lái)說(shuō)，實(shí)際上這類(lèi)技術(shù)是本文的一部分。
本發(fā)明的一個(gè)特殊和重要的方面是這樣一種發(fā)現(xiàn)，即煙草及其燃燒副產(chǎn)物含有非常類(lèi)似于那些在其它食物中以及在體液和組織中觀察到的反應(yīng)糖，這些反應(yīng)糖對(duì)吸煙者和間接吸收煙霧者的身體系統(tǒng)具有毒性作用。當(dāng)在可導(dǎo)致反應(yīng)糖形成的條件下進(jìn)行煙草的處理時(shí)，本發(fā)明者檢驗(yàn)并隨后確認(rèn)煙草和煙草煙霧含有并傳播這些公知用來(lái)增加體內(nèi)AGE形成的反應(yīng)物質(zhì)。本文將這些反應(yīng)物質(zhì)稱(chēng)作“糖化毒素(glycotoxins)”。將本文中所用術(shù)語(yǔ)“糖化毒素(glycotoxins)”定義為可以參與美拉德反應(yīng)過(guò)程、或可以在美拉德反應(yīng)過(guò)程中形成的反應(yīng)物質(zhì)，它們由單獨(dú)的碳水化合物、或碳水化合物與含有氨基的物質(zhì)的加合物組成，例如蛋白質(zhì)，DNA，脂，和所有這類(lèi)物質(zhì)。
作為本文所證明的，糖化毒素(glycotoxins)與蛋白質(zhì)反應(yīng)、表現(xiàn)出特殊的熒光、交聯(lián)蛋白質(zhì)且是致突變的。本文后面所列的數(shù)據(jù)證明煙草煙霧含有顯著量的糖化毒素(glycotoxins)，該糖化毒素(glycotoxins)可以進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)并與血清和組織蛋白反應(yīng)而形成AGEs。與糖化毒素(glycotoxins)接觸的增加可使吸煙者中動(dòng)脈粥樣硬化增加且癌癥非常普遍，且作為本文所列的，認(rèn)為有效的療法是保持使用并給予高級(jí)糖化的抑制劑、諸如氨基胍。
因此，本發(fā)明以高級(jí)糖基化終產(chǎn)物的形成與煙草的制造和消耗之間的關(guān)系為基礎(chǔ)。煙草和煙草煙霧中伴隨存在的糖化反應(yīng)物、諸如其中的反應(yīng)糖和它們進(jìn)入吸煙者和旁觀者體內(nèi)這一情況為各種應(yīng)用打下了基礎(chǔ)，所述的應(yīng)用包括但不限于診斷和評(píng)價(jià)應(yīng)用、與抑制高級(jí)糖基化終產(chǎn)物的蓄積及其有害后遺癥相關(guān)的治療應(yīng)用、以及處理煙草物質(zhì)以加強(qiáng)其器官感覺(jué)特性和貯存情況，且更重要的是減少它們應(yīng)用的有害作用。從本發(fā)明者詳細(xì)研究的高級(jí)糖基化現(xiàn)象中得到的主要研究結(jié)果和經(jīng)驗(yàn)以及本文公開(kāi)的特殊發(fā)現(xiàn)和觀察結(jié)果均有助于實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的機(jī)理。
因此，本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供一種用于測(cè)定煙草及其副產(chǎn)物中、以及消耗這類(lèi)產(chǎn)品的個(gè)體中高級(jí)糖基化終產(chǎn)物形成的程度和水平的方法。
本發(fā)明的進(jìn)一步目的是提供一種上述能夠用于診斷目的的方法，以便監(jiān)測(cè)吸煙者和其它煙草使用者的病史并由此防止伴隨高級(jí)糖基化終產(chǎn)物蓄積和吸煙的嚴(yán)重病理性并發(fā)癥的發(fā)展，。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種上述涉及評(píng)價(jià)煙草以測(cè)定其貯存情況和器官感覺(jué)潛能的方法。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供診斷試驗(yàn)法和相關(guān)的物質(zhì)，它們可有效地識(shí)別與煙草相關(guān)的高級(jí)糖基化終產(chǎn)物和它們?cè)谔厥鉄煵莓a(chǎn)品中的存在并且同樣可以識(shí)別它們?cè)谙M(fèi)者體內(nèi)的類(lèi)似的蓄積。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是改進(jìn)對(duì)煙草和煙草產(chǎn)品的改良方法，這些改良方法用于減少高級(jí)糖基化終產(chǎn)物對(duì)煙草產(chǎn)品消費(fèi)者的形成和傳播。
本發(fā)明的進(jìn)一步目的是提供抑制、捕捉或另外中和AGEs、且特別是存在于煙草煙霧中的糖化毒素(glycotoxins)(包括反應(yīng)AGEs)的濾器。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供用于評(píng)價(jià)危害程度的方法和相關(guān)的物質(zhì)，如果可能，個(gè)體可以作為環(huán)境中AGEs水平的函數(shù)，從而實(shí)現(xiàn)或調(diào)整這類(lèi)個(gè)體的治療方法以防止或減少這類(lèi)個(gè)體接觸AGE的有害作用。
本發(fā)明另一個(gè)目的是提供上述用于在所述環(huán)境中調(diào)節(jié)所述AGEs水平的方法和相關(guān)的物質(zhì)。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供用于在煙草使用者、吸煙者或與煙接觸個(gè)體中抑制AGEs和蛋白質(zhì)老化的試劑，從而在所述個(gè)體和群體中防止AGEs的有害蓄積。
由于考慮到參照下面的說(shuō)明性附圖繼續(xù)進(jìn)行后面的具體描述，所以其它目的和優(yōu)點(diǎn)對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是顯而易見(jiàn)的。
附圖的簡(jiǎn)要說(shuō)明附

圖1是表示香煙煙草水提取物AGE含量的示意圖。按照標(biāo)準(zhǔn)化競(jìng)爭(zhēng)性AGE免疫測(cè)定法對(duì)香煙樣品的磷酸鹽緩沖液提取物中的AGE水平進(jìn)行定量并將其計(jì)算為總AGE單位/香煙。香煙的牌號(hào)是Gau,Gauloises；Mar,Marlboro；ML,Marlboro Light；Par,Parliament；Sal,Salem Ultra Lights。
附圖2是表示在實(shí)驗(yàn)上與煙草煙霧接觸的血清中AGE水平的示意圖。按照標(biāo)準(zhǔn)化競(jìng)爭(zhēng)性AGE免疫測(cè)定法對(duì)香煙煙霧鼓泡通過(guò)的血清樣品中的AGE水平進(jìn)行定量并將其計(jì)算為AGE單位/ml血清。對(duì)照品=僅與氣流接觸的類(lèi)似血清樣品(不含煙草的煙霧)。
附圖3是表示存在于煙草煙霧冷凝物水溶液中的糖化毒素(glycotoxins)、以及反應(yīng)糖和AGEs在體外與蛋白質(zhì)反應(yīng)的示意圖。將用膠原包被的測(cè)定平板與磷酸鹽緩沖液增溶的香煙煙霧冷凝物進(jìn)行接觸，并通過(guò)一種免疫度量法來(lái)測(cè)定在膠原處理的測(cè)定平板孔上形成的AGEs，由此最終吸收度(光密度或OD)的增加反映出與測(cè)定平板的膠原基質(zhì)交聯(lián)并在測(cè)定平板的膠原基質(zhì)上蓄積的AGE增加。
附圖4是表示Pimagedine(氨基胍)抑制體外香煙煙霧冷凝物提取物與蛋白質(zhì)反應(yīng)的示意圖。在有或沒(méi)有不同濃度Pimagedine的情況下將由膠原包被的測(cè)定平板與香煙煙霧冷凝物的水提取物進(jìn)行接觸。通過(guò)一種免疫度量法來(lái)測(cè)定在膠原處理的測(cè)定平板孔上形成的AGEs，由此最終吸收度(光密度或OD)的增加反映出與測(cè)定平板的膠原基質(zhì)交聯(lián)并在測(cè)定平板的膠原基質(zhì)上蓄積的AGE增加。
附圖5是表示在煙草和煙草煙霧的水提取物中發(fā)現(xiàn)的糖化毒素(glycotoxins)(反應(yīng)AGEs或糖化中間產(chǎn)物)的示意圖。按照競(jìng)爭(zhēng)性AGE測(cè)定法(A)和定向結(jié)合免疫測(cè)定法(B)在煙草的水提取物中測(cè)定糖化毒素(glycotoxins)。將來(lái)自四個(gè)不同牌號(hào)的美國(guó)香煙的煙草樣品在PBS中提取24小時(shí)、進(jìn)行無(wú)菌過(guò)濾并按照上述競(jìng)爭(zhēng)性AGE ELISA檢測(cè)樣品的AGE含量。每個(gè)條形框代表不同牌號(hào)的香煙(A)。將總AGE單位/香煙計(jì)算為提取物AGE含量的指標(biāo)。將煙草樣品在PBS中提取1小時(shí)、無(wú)菌過(guò)濾并利用固定在96孔微量滴定平板中的鼠尾腱膠原來(lái)檢測(cè)樣品中的反應(yīng)糖(糖化毒素(glycotoxins))含量(B)。
附圖6是另一系列表示在煙草煙霧中發(fā)現(xiàn)的糖化毒素(glycotoxins)的坐標(biāo)圖。
(A)按照體外AGE形成測(cè)定法在香煙煙霧冷凝物中測(cè)定糖化毒素(glycotoxins)。將連續(xù)稀釋的香煙煙霧添加到用膠原預(yù)包被的孔中并用PBS/0.05％吐溫-20進(jìn)行封閉。使用一種兔抗AGE多克隆血清來(lái)顯示AGE的形成。
(B)借助于煙霧通過(guò)氨基胍可以去除糖化毒素(glycotoxins)。使新制的香煙煙霧通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)濾器(黑色條)、標(biāo)準(zhǔn)濾器+500mg硫酸鈉(帶紋條的條)和標(biāo)準(zhǔn)濾器+500mg氨基胍(白色條)。
(C)來(lái)自主流煙霧的糖化毒素(glycotoxins)可以以共價(jià)鍵的方式交聯(lián)RNA酶A蛋白(且氨基胍可抑制這種交聯(lián))。將RNA酶A與主流香煙煙霧接觸0,5,8,24和72小時(shí)。為了估測(cè)形成的二聚物，將樣品在還原條件下進(jìn)行SDS PAGE，隨后使用一種與HRP共軛的兔抗RNA酶A抗體將上述樣品轉(zhuǎn)而進(jìn)行硝酸纖維素和蛋白質(zhì)印跡法。圓圈=單獨(dú)的RNA酶A；正方形=用香煙煙霧培養(yǎng)后的RNA酶A；三角形=用香煙煙霧和5mM氨基胍培養(yǎng)后的RNA酶A；菱形=用香煙煙霧和50mM氨基胍培養(yǎng)后的RNA酶A。
(D)糖化毒素(glycotoxins)具有自身熒光。將RNA酶A與主流香煙煙霧接觸0,5,8,24和72小時(shí)，然后通過(guò)在370nm激發(fā)時(shí)在440 nm處測(cè)定發(fā)射情況來(lái)檢測(cè)糖化毒素(glycotoxins)的特異性熒光。圓圈=單獨(dú)的RNA酶A；正方形=與香煙煙霧培養(yǎng)后的RNA酶A；三角形=與香煙煙霧和5mM氨基胍培養(yǎng)后的RNA酶A；菱形=與香煙煙霧和50mM氨基胍培養(yǎng)后的RNA酶A。
附圖7是證明誘變糖化毒素(glycotoxins)是的示意圖。以通過(guò)氨基胍的香煙煙霧為對(duì)照(白色條)，用連續(xù)稀釋的香煙煙霧冷凝物將沙門(mén)菌屬菌株TA98培養(yǎng)1小時(shí)(黑色條)，然后進(jìn)行平板固定。48小時(shí)后對(duì)每個(gè)平板上的菌落數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)。每個(gè)條框代表三個(gè)平板的平均值+/-標(biāo)準(zhǔn)偏差。
附圖8是表示吸煙導(dǎo)致體內(nèi)apoB-AGE和血清AGE的水平增加的一系列示意圖。在工作于Picower Institute的健康的非糖尿病吸煙者和健康的、非糖尿病的非吸煙者中測(cè)定血清apoB-AGE(A)和總AGE水平(B)。吸煙者中的apoB-AGE水平(324+/-140U/ml,n=9)顯著高于(p＜0.01，非配對(duì)Student氏t檢驗(yàn))非吸煙者(177+/-33,n=10)。[糖尿病病人中apoB-AGE＞300U/ml]吸煙者中的血清AGE水平(202+/-76 AGE U/ml,n=23)顯著高于(p＜0.02)非吸煙者中的血清AGE水平(146+/-31 AGE U/ml)。(糖尿病患者中血清AGE水平=200-400)。以AGE-BSA標(biāo)準(zhǔn)為基準(zhǔn)表示AGE單位。受試者的年齡、性別或吸煙年數(shù)不受限制。
附圖9是表示通過(guò)使用一定范圍濃度的氨基胍進(jìn)行噴霧而處理的煙草的檢驗(yàn)結(jié)果的示意圖，目的是確定對(duì)AGEs形成的這類(lèi)處理方法的效果。這種檢驗(yàn)參照附圖6所述的體外AGE形成測(cè)定法來(lái)進(jìn)行。
本發(fā)明的具體描述本發(fā)明來(lái)源于消耗煙草與改進(jìn)這類(lèi)個(gè)體中高級(jí)糖基化終產(chǎn)物水平增加之間已確定的關(guān)系。最初的觀察結(jié)果來(lái)自對(duì)特殊試驗(yàn)群體中高級(jí)糖基化終產(chǎn)物水平的研究且特別是這類(lèi)群體中apoB-AGE水平的增加與冠心病同時(shí)發(fā)生以及對(duì)與表現(xiàn)出這樣增加的水平的個(gè)體一般是煙草產(chǎn)品消費(fèi)者這樣一個(gè)事實(shí)的相關(guān)性或關(guān)系的發(fā)現(xiàn)。最初的觀察結(jié)果促使了對(duì)煙草產(chǎn)品本身的研究，這產(chǎn)生了這樣一個(gè)發(fā)現(xiàn)，即這類(lèi)產(chǎn)品、包括燃燒副產(chǎn)物(煙霧)含有高濃度的高級(jí)糖基化終產(chǎn)物和促使它們形成的糖化毒素(glycotoxins)。這些最初發(fā)現(xiàn)的結(jié)果已經(jīng)促進(jìn)了進(jìn)一步的研究并已經(jīng)導(dǎo)致了涉及依據(jù)煙草、煙霧、吸煙者、和AGEs的測(cè)定和處理方式的本發(fā)明各方面的進(jìn)展。
更具體地說(shuō)，本發(fā)明在第一個(gè)方面中涉及對(duì)有吸煙史的受試者進(jìn)行檢驗(yàn)以便更好地確定他們的吸煙史，這一過(guò)程通過(guò)以下方式進(jìn)行以來(lái)源于在其他方面具有類(lèi)似或相同醫(yī)學(xué)狀況的非吸煙群體的定量為基準(zhǔn)來(lái)測(cè)定高級(jí)糖基化終產(chǎn)物的增加。通過(guò)檢驗(yàn)試驗(yàn)受試者的各種身體組織和體液(諸如血液、尿和糞便)可以實(shí)施這類(lèi)方法。此外，測(cè)定AGEs和糖化毒素(glycotoxins)的存在和水平對(duì)幫助預(yù)測(cè)試驗(yàn)受試者對(duì)至少部分以AGEs和糖化毒素(glycotoxins)的公知致突變特性為基礎(chǔ)的疾病的敏感性是有用的。
在類(lèi)似的方式中，可以檢驗(yàn)并評(píng)價(jià)煙草產(chǎn)品本身以確定它們?cè)跓煵菔褂谜咧写龠M(jìn)AGE和糖化毒素(glycotoxins)水平增加的潛能。在這種情況下，可以對(duì)煙草產(chǎn)品本身及其燃燒副產(chǎn)物檢驗(yàn)這類(lèi)高級(jí)糖基化終產(chǎn)物和/或形成它們的糖化毒素(glycotoxins)的存在。在一個(gè)相關(guān)的方面中，可以檢驗(yàn)相同的產(chǎn)品并標(biāo)記高級(jí)糖基化終產(chǎn)物的水平以便測(cè)定所得煙草作物的儲(chǔ)存穩(wěn)定性和潛在的氣味。作為可能的情況，根據(jù)取自類(lèi)似樣品或群體的某些基準(zhǔn)或標(biāo)準(zhǔn)來(lái)改進(jìn)這類(lèi)測(cè)定方法。
在這方面，蛋白質(zhì)褐變測(cè)定法的各種特殊裝置和捕捉AGE的濾器可以根據(jù)本發(fā)明來(lái)制造，它們提供并例舉了主要的部件，要求這些部件是便于測(cè)量個(gè)體與環(huán)境煙霧(特別是煙草的煙霧)接觸的煙霧接觸劑量器，基于檢測(cè)將與蛋白質(zhì)的氨基或其它敏感性化學(xué)糖化靶物交聯(lián)的AGEs。申請(qǐng)人認(rèn)為使用為利用發(fā)生在與煙草煙霧相關(guān)的糖化毒素(glycotoxins)、AGEs和蛋白質(zhì)或其它帶有游離氨基或其它起糖化靶分子作用的取代基的分子間的共價(jià)反應(yīng)而制造的劑量裝置可以估測(cè)空氣中煙草煙霧的稀釋度，，由此所述的糖化靶分子對(duì)與和煙草相關(guān)的AGEs和糖化毒素(glycotoxins)的化學(xué)反應(yīng)是敏感的，導(dǎo)致所述的AGEs和糖化毒素(glycotoxins)與所述的糖化靶分子以共價(jià)鍵方式進(jìn)行交聯(lián)并因此可通過(guò)本文所述的方式檢出。
使用本發(fā)明的劑量器可以估測(cè)接觸環(huán)境煙草煙霧的危害，所述本發(fā)明的劑量器可將糖化靶分子與需要監(jiān)測(cè)煙霧含量的大氣環(huán)境接觸，其中所述的劑量器用于來(lái)源于煙草煙霧的所述反應(yīng)性氣載AGEs和糖化毒素(glycotoxins)的自發(fā)性與呈現(xiàn)在基質(zhì)上的AGE靶分子的結(jié)合，由此構(gòu)成了劑量器的收集部件。通過(guò)本領(lǐng)域眾所周知的任意許多識(shí)別AGE的方法、包括(但不限于)應(yīng)用上文所述抗AGE抗體的AGE ELISA法、按照構(gòu)成劑量器顯示部件的步驟可以定性地、半定性地或定量地觀察到與劑量器顯示氨基的基質(zhì)結(jié)合的AGEs。用于引入劑量器顯示部件的合適靶分子不僅包括眾所周知為AGE敏感性靶分子的各種蛋白質(zhì)、諸如BSA、RNA酶、膠原和聚賴(lài)氨酸，而且包括帶有對(duì)與AGEs反應(yīng)敏感的氨基的任意其它生物分子或有機(jī)化合物。
優(yōu)選將這類(lèi)糖化靶分子固定化在有助于將它們遞呈至所監(jiān)測(cè)空氣中的底物的表面上；諸如一種為顯示氨基而衍生的紙表面，一種類(lèi)似衍生的硝酸纖維素膜的表面，一種同樣為提供氨基作為糖化靶物而衍生的聚苯乙烯濾膜的表面，或提供糖化靶分子且放置于與所監(jiān)測(cè)環(huán)境空氣相互作用的任何其它相對(duì)惰性的基質(zhì)。通過(guò)促使空氣流過(guò)收集部件的任何方式(諸如使用一種風(fēng)扇)可以被動(dòng)地(例如通過(guò)對(duì)流)、或主動(dòng)地影響待測(cè)煙霧的空氣與基質(zhì)固定的糖化靶分子之間的接觸過(guò)程以及所述空氣流過(guò)所述收集部件的循環(huán)過(guò)程。另一方面，可以將提供氨基的靶分子分散在一種液體中，且可以將來(lái)自所監(jiān)測(cè)環(huán)境的空氣抽過(guò)所述的液體、例如通過(guò)發(fā)泡。在兩種情況中，均通過(guò)任何合適的AGE檢測(cè)法、諸如上文公開(kāi)用于檢測(cè)AGEs的普通AGE ELISA測(cè)定法的特殊裝置來(lái)檢驗(yàn)已經(jīng)與需監(jiān)測(cè)的環(huán)境空氣接觸的糖化靶分子(無(wú)論是放置在基質(zhì)上還是在液相中)，使得對(duì)與糖化靶分子反應(yīng)的AGEs或糖化毒素(glycotoxins)的檢測(cè)表明了帶有煙霧的環(huán)境空氣的污染程度。這類(lèi)劑量器的應(yīng)用相應(yīng)地表明個(gè)體接觸了環(huán)境中的間接煙霧。
可以將類(lèi)似的測(cè)定方法用于監(jiān)測(cè)煙草產(chǎn)品中糖化毒素(glycotoxins)的存在和量，并由此評(píng)價(jià)和判斷它們對(duì)同樣的煙草消費(fèi)者和旁觀者有害作用的傾向性。例如，對(duì)于這類(lèi)目的來(lái)說(shuō)，可以使用本文所列的體外AGE形成測(cè)定法來(lái)測(cè)定煙草提取物中的糖化毒素(glycotoxins)。
可以將上述劑量器和相應(yīng)的測(cè)定方法用于一定的治療范圍，以便監(jiān)測(cè)和評(píng)價(jià)特殊病人的治療過(guò)程，這些特殊病人疾病的特征在于體液和組織中的AGEs水平升高。因此，可以將取自病人的樣品進(jìn)行檢驗(yàn)以確定存在于樣品中的AGEs的反應(yīng)程度(例如通過(guò)AGE ELISA或類(lèi)似檢驗(yàn)方法來(lái)進(jìn)行)，以便通告主治醫(yī)生病人在治療中的進(jìn)展。然后醫(yī)生可以選擇謹(jǐn)慎地修改治療方式，但要以檢驗(yàn)結(jié)果為基礎(chǔ)。同樣相關(guān)的是，對(duì)取自病人的樣品和病人絕大部分時(shí)間處于其中的環(huán)境空氣的測(cè)定結(jié)果提示應(yīng)對(duì)環(huán)境進(jìn)行改造以減少病人與AGEs或糖化毒素(glycotoxins)的其它來(lái)源、不管是來(lái)自煙草的煙霧還是其它外界的來(lái)源的接觸，因此，這種結(jié)果進(jìn)一步幫助醫(yī)生護(hù)理病人。
伴隨上述內(nèi)容，通過(guò)制備定向于在煙草和煙草副產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)的高級(jí)糖基化終產(chǎn)物和糖化毒素(glycotoxins)的抗體，可以制定各種診斷試驗(yàn)法、制成試劑盒和類(lèi)似物，它們?cè)诒景l(fā)明中是特別有用的。由此可生成這類(lèi)抗體并將它們用作診斷試驗(yàn)中以及與煙草相關(guān)的AGE和糖化毒素(glycotoxins)化學(xué)結(jié)構(gòu)特征中的標(biāo)準(zhǔn)。
就本發(fā)明涉及的治療策略和試劑而論，高級(jí)糖基化終產(chǎn)物的增加與發(fā)煙物質(zhì)的應(yīng)用之間的相關(guān)性促使應(yīng)用已依據(jù)所治療疾病而確定的治療方法，在所述的疾病中，認(rèn)為高級(jí)糖基化終產(chǎn)物的增加起一定的作用。所以，如果特殊個(gè)體有煙草產(chǎn)品的消費(fèi)史、且如果因此治療方法包括對(duì)這類(lèi)個(gè)體給予高級(jí)糖基化終產(chǎn)物的抑制劑，那么在這種情況下上述這類(lèi)方法是可以應(yīng)用的。
合適的高級(jí)糖化抑制劑已經(jīng)在以前確定，且它們包括、例如氨基胍(Pimagedine)，其類(lèi)似物，拮抗劑，同類(lèi)物，同源物和模擬物，和其中合適的它們的混合物。其它合適的抑制劑可以選自活性醛、或具有相應(yīng)活性醛取代基的化合物(如上文所確定的，它們與美拉德反應(yīng)的早期Amadori和Heyns產(chǎn)物的糖基-氨基部分反應(yīng))、和其中合適的它們的混合物和組合。另外合適的抑制劑可以選自上文確定的那些噻唑衍生物和其它化合物及其組合物(它們與存在的AGEs中的α-二羰基片段反應(yīng))，特別是在自動(dòng)再生、催化方式中促使或引起所述α-二羰基片段在所述存在的AGEs中裂解的這類(lèi)化合物。給藥的確切方式要由有經(jīng)驗(yàn)的醫(yī)生來(lái)決定。
另一個(gè)針對(duì)吸煙者的策略是直接處理所消耗的發(fā)煙物質(zhì)。這類(lèi)物質(zhì)可以通過(guò)類(lèi)似的抑制劑來(lái)處理，使得接受這樣處理的煙草產(chǎn)品具有的AGEs的數(shù)量降低(且特別是糖化毒素(glycotoxins)和反應(yīng)AGEs的數(shù)量降低)、或使得促進(jìn)消費(fèi)者體內(nèi)形成這類(lèi)AGEs的能力降低。
另一方面，本發(fā)明涉及制備煙草產(chǎn)品、諸如香煙包含的過(guò)濾物質(zhì)，使得這種過(guò)濾物質(zhì)本身能夠抑制、捕捉、或者中和可促使高級(jí)糖基化終產(chǎn)物(例如糖化毒素(glycotoxins))的形成和傳播增加的與煙草相關(guān)的AGEs或相關(guān)的化學(xué)本體。過(guò)濾物質(zhì)是那些按常規(guī)提供的物質(zhì)且用于香煙的，且它們通常是相互成束狀的纖維質(zhì)材料并在最終制成的香煙中為圓筒形。這類(lèi)纖維質(zhì)材料(其中有代表性的是纖維素纖維)在其表面上可以含有用作捕捉AGEs或結(jié)合或中和其它糖化產(chǎn)物、諸如糖化毒素(glycotoxins)的一種合適的抑制劑或反應(yīng)劑，以便防止在使用時(shí)形成AGEs。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，可以制備起到抑制、捕捉、或另外中和可促使高級(jí)糖化終產(chǎn)物形成和傳播增加的與煙草或煙霧有關(guān)的AGEs或相關(guān)本體的作用的濾器而用于一般的或環(huán)境空氣的凈化，例如減少或消除環(huán)境空氣的AGEs和/或糖化毒素(glycotoxins)，它們以非直接的、被動(dòng)的或“間接的”吸煙方式被不需要地吸收。無(wú)論是通過(guò)接觸環(huán)境空氣、還是通過(guò)直接對(duì)樣品(生物的或其它形式的)施用這類(lèi)物質(zhì)或底物，制備這類(lèi)濾器或類(lèi)似物質(zhì)以便能夠?qū)Νh(huán)境進(jìn)行抽樣檢驗(yàn)，其中AGEs或可形成它們的糖化毒素(glycotoxins)的濃度受到懷疑；目的是制定降低這類(lèi)AGE水平的測(cè)定方法。這類(lèi)測(cè)定方法可以包括對(duì)環(huán)境進(jìn)行合適的處理以改造AGE水平不期望升高的區(qū)域、或制定或調(diào)整處于那種環(huán)境中的個(gè)體的治療方法以降低這類(lèi)個(gè)體體內(nèi)AGE的水平或含量。特殊的這類(lèi)療法包括給予諸如本文所涉及的試劑，它們起到AGE形成的抑制劑的作用、或起到促使或?qū)崿F(xiàn)AGEs從身體中去除的作用。
在一般方式和各種具體的實(shí)施中，本發(fā)明的蛋白質(zhì)褐變測(cè)定法和抑制AGE、捕捉AGE或中和AGE的濾器還提供并例舉了主要的部件，要求這些部件是便于估測(cè)個(gè)體與環(huán)境煙霧(特別是煙草的煙霧)接觸的煙霧接觸劑量器，基于檢測(cè)與蛋白質(zhì)的氨基或其它敏感性化學(xué)糖化靶物交聯(lián)的AGEs。申請(qǐng)人認(rèn)為通過(guò)為利用發(fā)生在與煙草煙霧相關(guān)的AGEs和/或糖化毒素(glycotoxins)、以及蛋白質(zhì)或其它帶有游離氨基或其它起糖化靶分子作用的取代基的分子間的共價(jià)反應(yīng)而制造的劑量裝置可以估測(cè)大氣中煙草煙霧的稀釋度，由此所述的糖化靶分子對(duì)與和煙草相關(guān)的AGEs的化學(xué)反應(yīng)是敏感的，導(dǎo)致所述的AGEs與所述的糖化靶分子以共價(jià)鍵方式進(jìn)行交聯(lián)并因此可通過(guò)本文所述的方式檢出。
所提供的下列實(shí)施例用于對(duì)確定這種關(guān)系和促進(jìn)上述發(fā)明的實(shí)施方案實(shí)現(xiàn)的實(shí)驗(yàn)進(jìn)行解釋。
實(shí)施例1為了確定AGEs是否存在于煙草產(chǎn)品中，在0.02M磷酸鹽緩沖液(pH7.4)中制備來(lái)自幾種市售可得的香煙牌號(hào)的煙草樣品，煙草的濃度為66.7mg/ml在室溫下培養(yǎng)過(guò)夜后，通過(guò)離心使煙草沉淀并將煙草的水提取物進(jìn)行無(wú)菌過(guò)濾，按1∶800進(jìn)行稀釋?zhuān)⒂糜诜治鯝GE的含量。應(yīng)用抗AGE單克隆抗體、按照標(biāo)準(zhǔn)化競(jìng)爭(zhēng)性AGE免疫測(cè)定法對(duì)稀釋的煙草水提取物的AGE含量進(jìn)行檢測(cè)(參見(jiàn)下述內(nèi)容)，該檢測(cè)試驗(yàn)可測(cè)定AGE免疫反應(yīng)性的單位，以AGE修飾的牛血清白蛋白(AGE-BSA)參比標(biāo)準(zhǔn)競(jìng)爭(zhēng)劑制劑為基準(zhǔn)。從該檢測(cè)結(jié)果中可以看出，將總AGE單位/香煙計(jì)算為煙草AGE含量的指標(biāo)，并且如附圖1中所示，所提取的這些煙草樣品的AGE含量在約50,000-150,000AGE單位/香煙的范圍。從這一證據(jù)中，申請(qǐng)人得出結(jié)論煙草的水提取物中存在極高的AGE類(lèi)免疫反應(yīng)性。這一結(jié)論提示申請(qǐng)人煙草產(chǎn)品、包括(例如)鼻煙和咀嚼煙或來(lái)自可燃形式的煙、諸如雪茄煙、香煙或煙斗煙的消費(fèi)者通過(guò)他們消費(fèi)煙草可以與大量AGEs接觸。此外，由于公知AGEs以溫度和糖依賴(lài)性方式蓄積了一段時(shí)間，且由于公知AGEs具有味道和氣味，所以這一信息還提示申請(qǐng)人將煙草在商業(yè)上加工成各種消費(fèi)產(chǎn)品和隨后的銷(xiāo)售過(guò)程中特殊批量的煙草或作物的AGE含量可以是煙草潛在氣味以及貯存和加工史的一種有用的指示劑。
根據(jù)本領(lǐng)域常規(guī)的普通免疫測(cè)定法程序來(lái)進(jìn)行對(duì)AGEs的競(jìng)爭(zhēng)性ELISA。簡(jiǎn)要地說(shuō)，通過(guò)在37℃下、封閉管內(nèi)的0.5M葡萄糖中按50mg/ml將BSA培養(yǎng)(經(jīng)過(guò)SDS-PAGE,Calbiochem,Cat.#12657，級(jí)分V，純度＞99％)8周來(lái)制備AGE修飾的BSA(AGE-BSA)的主原料(Master Stock)，其中所述的0.5M葡萄糖在含有1.0mM EDTA、pH為7.4的磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)中制備并向其中通氮?dú)?。用?biāo)準(zhǔn)抗原包被市售可得的96孔微量滴定檢測(cè)平板(NUNC Maxisorp)，這一過(guò)程通過(guò)以下方式進(jìn)行4℃下，在每個(gè)孔內(nèi)的包被緩沖液(0.1M NaHCO3/0.02％疊氮化物，pH9.6)中按30μg/ml的濃度培養(yǎng)100μl AGE-BSA溶液過(guò)夜、并覆蓋。然后使用自動(dòng)ELISA平板洗滌器、用200μl洗滌緩沖液(含有0.05％吐溫20的三氨基甲烷緩沖鹽水)將檢測(cè)孔沖洗6次、反轉(zhuǎn)并吸干。每個(gè)孔裝入200μl封閉緩沖液(PBS/2％正常山羊血清/0.2％BSA/0.02％疊氮化物，pH7.4)并在37℃時(shí)將平板進(jìn)行培養(yǎng)、覆蓋1小時(shí)。在如上所述進(jìn)行沖洗后，即準(zhǔn)備好用于競(jìng)爭(zhēng)性ELISA的標(biāo)準(zhǔn)AGE-BSA修飾的檢測(cè)平板。
通過(guò)向AGE-BSA包被的檢測(cè)平板的每個(gè)孔中添加50μl等份的樣品或AGE-BSA標(biāo)準(zhǔn)競(jìng)爭(zhēng)劑而開(kāi)始進(jìn)行本實(shí)施例的檢測(cè)方法，隨后立即添加50μl適當(dāng)?shù)味ǖ目笰GE抗體制劑。然后在室溫下將平板進(jìn)行培養(yǎng)、覆蓋2小時(shí)，在此期間試驗(yàn)樣品(或AGE-BSA標(biāo)準(zhǔn)物)中的AGEs與抵抗固定在形成AGE-BSA的檢測(cè)平板上的AGEs的初級(jí)或抗AGE抗體競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合。最終，在這種競(jìng)爭(zhēng)性的免疫測(cè)定形式中，樣品中較高量的AGEs反應(yīng)出對(duì)帶有最終讀出信號(hào)相應(yīng)減少的包被AGE-BSA具有較高的競(jìng)爭(zhēng)性，其強(qiáng)度反應(yīng)出初級(jí)抗AGE抗體與AGE-BSA包被的孔的結(jié)合程度。本實(shí)施例中，在不含競(jìng)爭(zhēng)劑的孔中與顯色底物最終培養(yǎng)2小時(shí)后，將抗AGE單克隆抗體(命名為4G9)在具有約1.5光密度(OD)單位的稀釋度下使用。通過(guò)將AGE-BSA主原料(Master Stock)稀釋成具有范圍在約0.1-2μg AGE-BSA/孔的系列濃度來(lái)制備一系列稀釋的AGE-BSA標(biāo)準(zhǔn)競(jìng)爭(zhēng)劑，且從這種標(biāo)準(zhǔn)競(jìng)爭(zhēng)曲線中可以?xún)?nèi)推符合每個(gè)樣品孔的最終OD的AGE-BSA標(biāo)準(zhǔn)競(jìng)爭(zhēng)劑的相應(yīng)濃度。在使用上將一個(gè)AGE單位定義為要求在這種競(jìng)爭(zhēng)性AGE ELISA形式中有50％抑制作用的標(biāo)準(zhǔn)競(jìng)爭(zhēng)劑AGE-BSA的濃度(以BSA mg/ml計(jì))。
在初級(jí)抗體與競(jìng)爭(zhēng)劑(樣品或標(biāo)準(zhǔn)物)的這種培養(yǎng)后，將孔用洗滌緩沖液洗滌6次、反轉(zhuǎn)并吸干。然后根據(jù)生產(chǎn)者的建議添加并培養(yǎng)市售可得的二級(jí)抗體-酶共軛物(例如，山羊體內(nèi)升高的抗鼠IgG抗體與堿性磷酸酶偶合)制劑，一般是在37℃下將100μl等份樣品按1∶1200稀釋45分鐘。當(dāng)然，根據(jù)本領(lǐng)域眾所周知的一般免疫測(cè)定機(jī)理，在這一過(guò)程中可以替換各種初級(jí)(抗AGE)抗體(多克隆或單克隆或其混合物)以及各種檢測(cè)這些初級(jí)抗體結(jié)合的方法。
在本實(shí)施例中，如上所述沖洗平板并按照由生產(chǎn)者建議的濃度添加100μl等份的底物發(fā)色團(tuán)(在這種情況中是對(duì)硝基苯磷酸(PNPP))并將它們進(jìn)行培養(yǎng)(一般是在37℃下1-2小時(shí))，從而在沒(méi)有任何競(jìng)爭(zhēng)劑的情況下在所檢測(cè)的對(duì)照孔中具有的OD為1.5-1.7單位。使用商品微量滴定平板讀數(shù)器可以簡(jiǎn)便地讀出每個(gè)孔中的吸收度(OD)，在這種情況下，確定在410nm處讀取，以參考波長(zhǎng)570nm為對(duì)照。然后可以將任何樣品中的AGE水平從標(biāo)準(zhǔn)競(jìng)爭(zhēng)曲線中內(nèi)推為相應(yīng)濃度的標(biāo)準(zhǔn)競(jìng)爭(zhēng)劑AGE-BSA(以BSA mg/ml計(jì))，并一般將該值轉(zhuǎn)化成AGE單位，其中1個(gè)AGE單位是在這種競(jìng)爭(zhēng)性AGE ELISA法中產(chǎn)生50％抑制作用的標(biāo)準(zhǔn)競(jìng)爭(zhēng)劑AGE-BSA的濃度。
實(shí)施例2為了確定存在于煙草煙霧中的糖化毒素(glycotoxins)(反應(yīng)糖，AGEs等)是否與身體的蛋白質(zhì)反應(yīng)，使用一種由小玻璃側(cè)頸燒瓶構(gòu)建的“水煙筒”或水管發(fā)煙裝置將香煙煙霧抽過(guò)1ml正常人血清樣品，所述的小玻璃側(cè)頸燒瓶不僅用于或使通過(guò)所含血清樣品的煙流發(fā)泡、而且可使煙霧蓄積在上述樣品上并與之接觸，這種接觸在接觸的自動(dòng)“發(fā)煙”相以后的培養(yǎng)期間受到維持。將濾嘴從所用香煙中去除，并將香煙裝在穿過(guò)燒瓶塞使管頭末端浸入血清樣品中的巴斯德吸管上。一旦安裝完畢，則通過(guò)使用連接在側(cè)頸上的注射器的吸取而將這種裝置反復(fù)用于將來(lái)自五支(5)香煙的煙霧抽過(guò)血清樣品。對(duì)于對(duì)照反應(yīng)來(lái)說(shuō)，除香煙煙霧不通過(guò)側(cè)頸以外，使用同樣的裝置將約相同體積的空氣抽過(guò)單獨(dú)的血清樣品。然后通過(guò)上述標(biāo)準(zhǔn)化競(jìng)爭(zhēng)性AGE ELISA(參見(jiàn)實(shí)施例1)來(lái)測(cè)定這些經(jīng)實(shí)驗(yàn)處理的血清樣品中的AGE水平。將本實(shí)驗(yàn)獨(dú)立地進(jìn)行兩次，每次情況中的比較結(jié)果如附圖2中所示。因此，當(dāng)對(duì)照血清樣品的平均值為小于25AGE單位/ml時(shí)，與煙霧接觸的血清樣品表現(xiàn)為約150AGE單位/ml。從這一證據(jù)中，申請(qǐng)人得出結(jié)論在吸煙期間(主動(dòng)的或被動(dòng)的)存在于煙草煙霧中的AGEs是反應(yīng)性的并且可能與人體蛋白質(zhì)結(jié)合，這增加了吸煙者和旁觀者的AGE含量，并以來(lái)自非吸煙群體的合適對(duì)照樣品為參照而提供了近期吸煙活動(dòng)、或近期在環(huán)境中與煙草煙霧接觸的強(qiáng)度的簡(jiǎn)易標(biāo)記物。
實(shí)施例3在進(jìn)一步的試驗(yàn)中，為了確定反應(yīng)糖、糖化毒素(glycotoxins)等是否存在于煙草的煙霧中且為了確定這類(lèi)糖化毒素(glycotoxins)是否可以與蛋白質(zhì)反應(yīng)而形成AGEs，如下所述來(lái)評(píng)價(jià)煙草煙霧冷凝物的反應(yīng)AGE的含量。給側(cè)頸燒瓶安上與連有一短段橡皮管的巴斯德吸管連接的塞。將裝在側(cè)頸上的注射器反復(fù)用于將來(lái)自總計(jì)3-5支香煙的煙霧抽入該燒瓶中，在收集煙霧的冷凝物期間將該燒瓶浸入丙酮/干冰浴中。香煙的煙霧在冷卻的燒瓶壁上凝聚，并通過(guò)用5mls、0.02M的磷酸鹽緩沖液沖洗燒瓶?jī)?nèi)部而將這種冷凝物增溶并將他們萃取入溫?zé)岬闹行运芤褐?。將這種冷凝提取物進(jìn)行無(wú)菌過(guò)濾并用另外的磷酸鹽緩沖液按1∶5進(jìn)行稀釋。
然后按照使用抗AGE抗體檢測(cè)與固定的膠原層共價(jià)結(jié)合AGEs的AGE形成測(cè)定法來(lái)評(píng)價(jià)這些提取物中糖化毒素(glycotoxins)的存在。簡(jiǎn)單地說(shuō)，在室溫下將含有固定在孔表面上的鼠尾腱膠原的市售可得的96孔微量滴定平板(合作研究)與上述稀釋的煙霧冷凝提取物進(jìn)行接觸并培養(yǎng)過(guò)夜、覆蓋。按照上述概括的用于競(jìng)爭(zhēng)性AGE檢測(cè)的免疫度量程序來(lái)檢測(cè)通過(guò)與鼠尾腱膠原相互作用而固定在表面上的AGEs依次沖洗煙霧提取物處理的膠原包被的平板、使它們與4G9單克隆抗AGE抗體接觸、沖洗、與市售可得的山羊抗鼠IgG/堿性磷酸酶共軛物接觸、沖洗、并用合適的顯色底物(例如PNPP)補(bǔ)充，從而產(chǎn)生由410nm處的光密度確定的信號(hào)，該信號(hào)定量地反映出以不用煙霧冷凝提取物處理的對(duì)照品為基準(zhǔn)、通過(guò)與煙草煙霧的冷凝提取物接觸而蓄積在平板上的AGE類(lèi)免疫反應(yīng)的量。
如附圖3所示，孔中有更多AGE類(lèi)免疫反應(yīng)的量與煙草煙霧的冷凝提取物接觸，并且來(lái)自這些與煙霧有關(guān)的AGEs的信號(hào)與稀釋的提取物一起衰變，這一過(guò)程嚴(yán)格依照體外形成、稀釋的葡萄糖誘導(dǎo)的AGEs作為這類(lèi)比較的標(biāo)準(zhǔn)物來(lái)進(jìn)行。這提示申請(qǐng)人接觸煙草煙霧會(huì)相應(yīng)地使受試者接觸與天然蛋白質(zhì)反應(yīng)的糖化毒素(glycotoxins)。
在一系列補(bǔ)充實(shí)驗(yàn)中，在鼠尾腱膠原處理的平板內(nèi)煙草煙霧冷凝提取物的過(guò)夜培養(yǎng)過(guò)程中包括不同濃度的在其它情況中起抑制AGE交聯(lián)形成作用的Pimagedine(氨基胍)(一種AGE抑制劑)。如附圖4中所示，Pimagedine減少了在約50mM Pimagedine處具有50％抑制作用的劑量依賴(lài)性方式中按免疫度量檢測(cè)的AGEs的量。作為存在的這種抑制AGE藥理劑結(jié)果的最終AGE信號(hào)的抑制或減弱是進(jìn)一步的證明、即用煙霧冷凝物對(duì)尾腱膠原進(jìn)行實(shí)驗(yàn)性處理后明顯的AGE類(lèi)免疫反應(yīng)性在分子詳圖上與體外和體內(nèi)接觸還原糖而在蛋白質(zhì)上自發(fā)形成的AGEs類(lèi)似，即來(lái)自所有這些來(lái)源的AGEs可共用免疫化學(xué)決定子且它們的形成和/或交聯(lián)活性受到Pimagedine的特別抑制。存在于煙草煙霧中的反應(yīng)AGEs可以受到Pimagedine抑制這一證據(jù)還提示申請(qǐng)人通過(guò)處理煙草、煙草煙霧、或治療吸煙者而產(chǎn)生的相應(yīng)抗AGE措施可用于降低吸煙者通過(guò)消費(fèi)煙草而自身接觸的過(guò)量的AGE含量。
實(shí)施例4進(jìn)行一系列的實(shí)驗(yàn)以進(jìn)一步研究并證明煙草及其燃燒副產(chǎn)物(煙草煙霧)與形成的AGEs升高的發(fā)生率之間的關(guān)系。特別是、且作為本文所列的，這些實(shí)驗(yàn)證實(shí)煙草及其副產(chǎn)物含有顯著量的可溶性反應(yīng)糖化中間產(chǎn)物(本文稱(chēng)作糖化毒素(glycotoxins))，該中間產(chǎn)物可促進(jìn)AGE的形成并產(chǎn)生與衰老和糖尿病中AGE蓄積相關(guān)的全部二級(jí)分子和生理性并發(fā)癥，并且它們是誘變的，且隨后它們可以參與引起疾病、諸如癌癥。這一方案和隨后的實(shí)驗(yàn)如下。材料和方法煙草水提取物的準(zhǔn)備在PBS中按360mg/ml的濃度通過(guò)振搖將煙草樣品提取1小時(shí)并通過(guò)0.45μm Millex-HA濾器裝置(微孔，Bedford,MA)進(jìn)行無(wú)菌過(guò)濾。香煙煙霧冷凝物的制備將“水管”發(fā)煙裝置用于并操作以使煙流與水溶液接觸。將水溶液(3mls)放入25ml帶有側(cè)頸的玻璃愛(ài)倫美氏(erhlemeyer)燒瓶中，將香煙裝在穿過(guò)燒瓶塞中的孔的500μl吸管管頭上。將500μl吸管頭部向下延續(xù)到通過(guò)燒瓶側(cè)頸的開(kāi)口，但不要進(jìn)入水溶液。一旦將裝置安裝完畢則將真空(約20mmHg)通入燒瓶的側(cè)頸并點(diǎn)燃香煙。在某些實(shí)驗(yàn)中改變吸管的管頭將一片2×2mm的商品香煙濾嘴用于塞住吸管頭部，然后將500mg氨基胍氫氯化物或硫酸鈉放在小片濾嘴與香煙之間或在它們之間不放任何物質(zhì)。在任何實(shí)驗(yàn)中從香煙中去除預(yù)先連接的商業(yè)上制備的濾嘴。將5支香煙點(diǎn)燃并將煙霧吸入3ml等份的PBS中。使用前將香煙煙霧的水冷凝物通過(guò)0.45μm Millex-HA濾器裝置(微孔)進(jìn)行過(guò)濾。體外AGE形成的檢測(cè)將含有固定的鼠尾腱膠原的微量滴定平板(合作研究，Cambridge,HA)用TBS(PBS/0.05％吐溫-20)培養(yǎng)1小時(shí)，然后在37℃下用連續(xù)稀釋的煙草提取物或煙霧接觸的PBS溶液培養(yǎng)18小時(shí)，用TBS洗滌5次，用兔多克隆抗AGE血清(在TBS/0.1％山羊血清中稀釋的pAb RU 9.9.93)培養(yǎng)1小時(shí)、用TBS洗滌5次并用與堿性磷酸酶(Sigma)共軛的抗兔IgG培養(yǎng)并用TBS洗滌5次。隨后，通過(guò)在100mM、pH為9.5的二乙醇胺中用250mg/ml對(duì)硝基苯磷酸培養(yǎng)45分鐘而使結(jié)合的AGEs顯色并且在ELISA平板讀數(shù)器(Dynatech,MR 5000)上在405nm處對(duì)平板進(jìn)行讀數(shù)。將Biolynx2.0用于生成標(biāo)準(zhǔn)曲線和數(shù)據(jù)外推法。糖化毒素(glycotoxins)交聯(lián)活性如上所述將含有2mM EDTA的PBS溶液與煙草煙霧接觸。將溶于含有0、5或50mM氨基胍的PBS/EDTA的40mg RNA酶A與相同的8支香煙接觸并于37℃時(shí)在暗處培養(yǎng)0、5、8、24、48和72小時(shí)。使用Centricon 10濃縮器(Amicon,Beverly,MA)去除未結(jié)合的和低分子量的物質(zhì)。為了評(píng)價(jià)RNA酶二聚物的形成，使用5％的積層膠和12％的分離膠[《自然》227:680-685,1970]、在還原條件下將樣品進(jìn)行不連續(xù)的SDS-PAGE并將它們轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素紙上。在20℃下，用封閉溶液(PBS/5％不含脂肪的牛奶/1％BSA/0.2％吐溫-20)將印跡封閉1小時(shí)、用與在封閉溶液中稀釋的辣根過(guò)氧化物酶共軛的兔抗核糖核酸酶A抗體(BiodesignInternational,Kennebunkport,ME)培養(yǎng)45分鐘、用PBS/0.2％吐溫-20徹底地洗滌并根據(jù)生產(chǎn)者的說(shuō)明書(shū)將它展開(kāi)。使用AdobePhotoshop和用NIH圖象程序測(cè)定的圖象(平滑的，尖銳的和反差增強(qiáng)的)的光密度測(cè)定法將所得的熒光顯影圖進(jìn)行加工處理。熒光檢測(cè)為了評(píng)價(jià)AGE特異性熒光，在接觸香煙煙霧冷凝物(如上所述制備)的RNA酶樣品中測(cè)定用LS 50B熒光分光計(jì)(Perkin-Elmer)在370nm處激發(fā)時(shí)在440nm處的發(fā)射情況。以0.5mg/ml的蛋白濃度測(cè)定熒光值。致突變性研究如Ames等[]所述進(jìn)行致突變性檢測(cè)試驗(yàn)。簡(jiǎn)單地說(shuō)，在Oxoid營(yíng)養(yǎng)肉湯(Difco)中于37℃下將沙門(mén)菌屬菌株TA98、TA100、TA1535和TA1537(由B.N.Ames博士提供的贈(zèng)品)培養(yǎng)過(guò)夜，將它們?cè)?.1M磷酸鈉緩沖液(pH7.4)中用連續(xù)稀釋的香煙煙霧冷凝物培養(yǎng)1小時(shí)、平行做三份，然后將它們按0.1ml/平板的濃度固定在最小葡萄糖平板上。在37℃下將該平板培養(yǎng)過(guò)夜并對(duì)每個(gè)平板上的回復(fù)突變體數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)。血清AGE-apoB的測(cè)定使用如上所述的單克隆抗AGE捕捉抗體和抗apoB-HRP共軛物(JBC,267:5133-5138,1992)、通過(guò)夾心式ELISA在人體血清中測(cè)定AGE修飾的apoB(AGE-apoB)的量。從標(biāo)準(zhǔn)曲線上給予樣品一個(gè)值并以apoB-AGE U/ml血清為單位來(lái)表示。將一個(gè)單位的apoB-AGE定義為1μg apoB(LDL)的活性。AGE的測(cè)定使用如(PNAS USA 90:6434-6438和上文)中所述產(chǎn)生葡萄糖衍生的AGE表位的AGE特異性單克隆抗體(IgG1亞類(lèi))、通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性ELISA來(lái)測(cè)定人體血清中的AGEs。對(duì)于連續(xù)稀釋成屬于本檢測(cè)試驗(yàn)線性范圍的樣品的孔來(lái)說(shuō)，以平行做三份的方式來(lái)測(cè)定AGE免疫反應(yīng)性。以合成的AGE-BSA標(biāo)準(zhǔn)物為基準(zhǔn)計(jì)算AGE單位。本試驗(yàn)的敏感度為5 U AGE/ml且試驗(yàn)內(nèi)和試驗(yàn)間的變異系數(shù)分別為5％和8％。結(jié)果含有促進(jìn)體內(nèi)AGE形成的糖化毒素(glycotoxins)的煙草和香煙煙霧的水提取物開(kāi)始，通過(guò)浸入PBS的方式從香煙煙草樣品中提取水溶性反應(yīng)糖化毒素(glycotoxins)。為了檢測(cè)煙草中的糖化毒素(glycotoxins)是否能夠誘導(dǎo)AGE形成，將該水提取物添加到膠原包被的平板中、持續(xù)18小時(shí)。使用特異性抗AGE多克隆抗體檢測(cè)膠原分子上最新形成的AGEs的存在。附圖5A表示由8種牌號(hào)的美國(guó)香煙誘導(dǎo)的AGE形成的比較情況。來(lái)自所有接受檢測(cè)牌號(hào)的提取物促使了AGE部分的形成。值得注意的是牌號(hào)E(“柔和”量的香煙牌號(hào)D)比牌號(hào)D具有更高的這類(lèi)形成AGE的活性。這一發(fā)現(xiàn)(當(dāng)將其它“普通”和“柔和”牌號(hào)的進(jìn)行配對(duì)比較時(shí)持續(xù)重現(xiàn))很可能反應(yīng)出煙草加工過(guò)程中的差異并表明焦油的含量和香煙“強(qiáng)度”的其它測(cè)定方法不依賴(lài)于糖化毒素(glycotoxins)含量。
為了確定是否可以將煙草衍生的糖化毒素(glycotoxins)揮發(fā)，我們?cè)贏GE形成試驗(yàn)中檢測(cè)了香煙煙霧冷凝物。為了收集任何揮發(fā)性糖化毒素(glycotoxins)，我們安裝了一種發(fā)煙裝置，其中將來(lái)自燃燒香煙的煙霧抽入裝有PBS溶液的燒瓶中。在一種更接近地模擬將肺組織接觸香煙煙霧的方式的嘗試中，使實(shí)驗(yàn)的煙霧在燒瓶底部與PBS接觸，但是不通過(guò)溶液發(fā)泡。制備后立即將煙霧接觸的PBS(香煙煙霧冷凝物)添加到用膠原包被的微量滴定孔中并使它們反應(yīng)過(guò)夜。象煙葉提取物一樣，香煙煙霧冷凝物能夠快速誘導(dǎo)由兔抗AGE多克隆抗血清識(shí)別的AGEs的形成。由香煙煙霧產(chǎn)生的AGEs依賴(lài)于濃度(附圖5B)和時(shí)間(未列出數(shù)據(jù))，且通過(guò)將可溶性AGE抑制劑(氨基胍)直接添加到孔中(未列出數(shù)據(jù))或借助于使煙霧通過(guò)氨基胍結(jié)晶柱(附圖5C)可以在劑量依賴(lài)性方式中抑制由香煙煙霧產(chǎn)生的AGEs。通過(guò)硫酸鈉對(duì)照柱的煙霧對(duì)煙霧含有的煙草衍生的糖化毒素(glycotoxins)在靶物上形成AGEs的能力沒(méi)有影響(附圖5C)。香煙煙霧冷凝物在促使AGE形成上的活性比煙草水提取物低10倍，這提示通過(guò)燃燒過(guò)程會(huì)使某些糖化毒素(glycotoxins)受到破壞或用于捕捉揮發(fā)性糖化毒素(glycotoxins)和AGEs的系統(tǒng)是無(wú)效的。在煙葉提取物和香煙煙霧冷凝物中發(fā)現(xiàn)的AGE形成活性是不穩(wěn)定的如果在-20℃時(shí)冷凍該溶液并在檢測(cè)前融化、或遺留在冰上或在室溫下保持5小時(shí)以上，則AGE形成活性是無(wú)法檢測(cè)的。
通過(guò)在接觸香煙煙霧冷凝物的RNA酶A上測(cè)定AGEs特征性熒光樣式也可以評(píng)價(jià)香煙煙霧糖化毒素(glycotoxins)誘導(dǎo)AGE形成的能力。如附圖6A所示，對(duì)于增加的時(shí)間來(lái)說(shuō)，接觸香煙煙霧冷凝物的RNA酶A表現(xiàn)出AGE型熒光依賴(lài)于時(shí)間增加，(即在370nm處激發(fā)后在410nm處發(fā)射)，這種增加在24小時(shí)后達(dá)到飽和并且在培養(yǎng)過(guò)程中受到存在的氨基胍的抑制。糖化毒素(glycotoxins)可以交聯(lián)蛋白質(zhì)反應(yīng)還原糖的特征之一是它們可促使敏感性官能基之間分子內(nèi)和分子間交聯(lián)的形成。為了證明煙草和煙霧中的反應(yīng)性糖化毒素(glycotoxins)也具有這一特性，我們檢測(cè)了糖化毒素(glycotoxins)與RNA酶交聯(lián)的能力。用香煙煙霧冷凝物將RNA酶A的樣品培養(yǎng)不同的時(shí)間，通過(guò)SDS-PAGE凝膠上的分子量將它們分離，然后用抗RNA酶A抗血清使它們顯色。使用這種技術(shù)，申請(qǐng)人能夠確定RNA酶A-RNA酶A二聚物的形成依賴(lài)于時(shí)間并在24小時(shí)內(nèi)達(dá)到飽和。在一種劑量依賴(lài)性方式中，二聚物的形成可以受到氨基胍的抑制，這表明交聯(lián)過(guò)程取決于含有羰基的糖化毒素(glycotoxins)(附圖6B)。糖化毒素(glycotoxins)是誘變的上述研究已經(jīng)證明還原糖可以在體外與DNA反應(yīng)并在細(xì)菌和哺乳動(dòng)物細(xì)胞中誘導(dǎo)突變。大腸桿菌中高胞內(nèi)濃度的還原糖(葡糖-6-磷酸)導(dǎo)致突變率增加。同樣，接觸因母體糖尿病而導(dǎo)致的高血糖的鼠胎表現(xiàn)出加倍的突變率。
在本實(shí)驗(yàn)中，將大量鼠傷寒桿菌菌株(TA98,TA100和TA1537)在典型的Ames誘變?cè)囼?yàn)方式中與香煙煙霧冷凝物接觸。在菌株TA98中注意到了活潑的突變活性，但在其它菌株中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)。如附圖7中可觀察到的，TA98與最新制備的增加量的香煙煙霧冷凝物接觸導(dǎo)致劑量依賴(lài)性的突變?cè)黾?。?dāng)TA98與能夠在組氨酸操縱子中導(dǎo)致移碼突變并由此使原始突變回復(fù)的誘變劑接觸時(shí)，它會(huì)在缺乏組氨酸的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。在與PBS接觸前通過(guò)氨基胍干燥柱的煙霧(顯著去除或中和了含有羰基的糖化毒素(glycotoxins)分子)減少了回復(fù)突變體的數(shù)量。在DNA與上述還原糖的反應(yīng)中已經(jīng)觀察到了類(lèi)似的誘變活性。這是本申請(qǐng)人意識(shí)到香煙煙霧中的誘變活性不需要通過(guò)P450系統(tǒng)進(jìn)行代謝性激活的首次報(bào)導(dǎo)。在過(guò)去可能還沒(méi)有觀察到這種活性，例如以前的工作者主要在有機(jī)溶劑中制備了煙霧提取物并在值得注意的時(shí)間期限后分析了誘變活性。水提取物中糖化毒素(glycotoxins)的不穩(wěn)定性要求快速分析誘變活性。要求在室溫下或冰上培養(yǎng)5小時(shí)以上的水香煙煙霧冷凝物不再是誘變性的。糖化毒素(glycotoxins)在體內(nèi)促使AGEs在血清蛋白質(zhì)上形成下面研究在接觸香煙煙霧后將反應(yīng)糖化毒素(glycotoxins)或AGEs在體內(nèi)吸收的可能性，這一過(guò)程通過(guò)檢驗(yàn)在作為總體含量的替代標(biāo)記物的血清蛋白質(zhì)上形成的AGEs的量來(lái)進(jìn)行。來(lái)自另外健康吸煙者和非吸煙者的血液樣品在本研究中，檢測(cè)AGE血清蛋白質(zhì)水平和蛋白apoB-AGE。吸煙者中AGE-apoB水平(324+/-140U/ml,n=9)顯著高于(p＜0.01,非配對(duì)Student氏t-檢驗(yàn))非吸煙者(177+/-33,n=10)且吸煙者中的血清AGE水平(202+/-76 AGE U/ml,n=23)顯著高于(p＜0.02)非吸煙者中的血清AGE水平(146+/-31 AGE U/ml)。吸煙組中的所有個(gè)體每天吸1包以上的煙，但不限定他們的吸煙史。類(lèi)似的研究涉及與存在于血液中apoB或其它血清蛋白結(jié)合的AGE的量與接觸香煙煙霧程度的關(guān)系。這種接觸的總數(shù)要可用于直接和間接接觸煙霧情況的分析。實(shí)際上，這種試驗(yàn)類(lèi)似于接觸前30天期限得到的血液葡萄糖總量的血紅蛋白AIC試驗(yàn)。值得注意的是吸煙者中AGE血清蛋白和AGE-apoB的水平幾乎與在患糖尿病的病人中觀察到的情況相同[AGE血清蛋白200-400U/ml；AGE-apoB 300U/ml]。
實(shí)施例5為了確定在所明確的接觸煙草煙霧后是否可以測(cè)定AGE類(lèi)免疫反應(yīng)性的提高，從習(xí)慣吸煙的受試者中取血液樣品，首先在間隔吸煙行為18小時(shí)后取血液樣品，然后在18小時(shí)間隔結(jié)束時(shí)受試者又連續(xù)不斷地吸5支香煙后取血液樣品。使用標(biāo)準(zhǔn)化夾心型ELISA程序在來(lái)自這些血液樣品的LDL級(jí)分中比較apoB的AGE修飾程度以便檢測(cè)AGE-apoB。在進(jìn)行這種標(biāo)準(zhǔn)化檢測(cè)試驗(yàn)中，將抗AGE抗體固定在檢測(cè)孔的表面上以捕捉樣品的AGE修飾成分，并將市售可得的抗apoB單克隆抗體/辣根過(guò)氧化物酶(HRP)共軛物用于檢測(cè)通過(guò)與所固定的抗AGE抗體的特異性相互結(jié)合而固定的任何AGE修飾的apoB。
簡(jiǎn)單地說(shuō)，通過(guò)以下步驟來(lái)制備低密度脂蛋白(LDL)富集的血清級(jí)分用900μl 6.66％的聚乙二醇(分子量為8000)將100μl血清樣品處理15分鐘，離心(14,000rpm,10分鐘)并在μl 0.5％SDS中將所得沉淀增溶過(guò)夜。為了構(gòu)建試驗(yàn)平板，通過(guò)在所滴定的稀釋度下培養(yǎng)而將抗AGE抗體(在這種情況中是單克隆抗體4G9)固定在微量滴定平板的表面上，此后通過(guò)用1％的BSA溶液取代捕捉抗體溶液來(lái)阻斷非特異性結(jié)合。然后以緩沖液中的最終濃度為0.05％的SDS在試驗(yàn)平板中將LDL富集的血清級(jí)分(或適當(dāng)?shù)味ǖ腖DL標(biāo)準(zhǔn)物稀釋液)平行培養(yǎng)三份并將它們培養(yǎng)1小時(shí)，此時(shí)將平板進(jìn)行沖洗并添加市售可得的抗apoB單克隆抗體/酶的共軛物(在這種情況中是購(gòu)自并按1∶500稀釋使用的BiodesignInternational的抗apoB/辣根過(guò)氧化物酶(HRP)共軛物)以檢測(cè)任何結(jié)合的apoB。經(jīng)1小時(shí)的培養(yǎng)后洗滌平板并添加合適的顯色HRP底物(諸如鄰苯二胺(o-phenyline diamine)(OPD))，且在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)期后以570nm的參考波長(zhǎng)為對(duì)照在450nm處讀取OD。一般根據(jù)本領(lǐng)域眾所周知的原理，將各種試劑(例如包被抗體和檢測(cè)抗體)的最佳濃度和最佳pH、去污劑濃度、緩沖液組成、培養(yǎng)期、和其它特殊的特性彼此對(duì)照著進(jìn)行改變以便在這種用于apoB的AGE修飾的夾心型免疫度量測(cè)定法中使樣品信號(hào)最大化并將干擾的非特異性背景“噪聲”降到最低限度。在本實(shí)驗(yàn)中，吸煙前的AGE-apoB值為218±1且吸煙后的值為241±3 apoB-AGE單位/mg apoB(其中將apoB-AGE單位定義為1μg/ml市售可得的LDL標(biāo)準(zhǔn)物(例如購(gòu)自Cappel)的活性)。申請(qǐng)人研究了這一證據(jù)、即吸煙可以劇烈地增加特殊血液成分(LDL的apoB)的AGE修飾。這提示樣品成分上AGE水平的測(cè)定可以提供有關(guān)受試者近期吸煙史的信息。此外，由于LDL的AGE修飾與有害影響人體健康的病理學(xué)機(jī)理相關(guān)，所以這進(jìn)一步提示申請(qǐng)人吸煙者可以得益于限制作為煙草消費(fèi)結(jié)果發(fā)生的過(guò)量接觸的AGE的措施。
實(shí)施例6為了發(fā)現(xiàn)易抽樣的組織或液體區(qū)是否反應(yīng)出吸煙史，申請(qǐng)人檢驗(yàn)了來(lái)自在North Shore University Hospital,Manhasset,NY篩選的預(yù)先進(jìn)行了手術(shù)的順序病人。這些病人中的某些(偶然)是吸煙者(第1組)，其它人是非吸煙者(第2組)。在這種觀察試驗(yàn)中，將病人的群體分成幾個(gè)層次或另外對(duì)可以導(dǎo)致血清AGE水平的某些可變性的吸煙強(qiáng)度、性別、年齡、健康情況、或其它特征進(jìn)行控制。使用單克隆抗AGE抗體、通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性AGE ELISA法來(lái)測(cè)定血清AGE水平，以便以AGE-BSA標(biāo)準(zhǔn)化制劑為基準(zhǔn)檢測(cè)AGEs(如上述實(shí)施例1中具體所述)。第1組(N=16)的平均血清AGE水平為200±80，與此對(duì)比的第2組(N=13)為150±30。這些數(shù)據(jù)的比較結(jié)果經(jīng)獨(dú)立方法的t-檢驗(yàn)表明在0.05的概率水平上有顯著性差異。
實(shí)施例7煙草和煙草產(chǎn)物、包括(例如)煙草煙霧的AGEs還用作抗原或半抗原，以便引導(dǎo)抗體特別定向于與煙草相關(guān)的AGE結(jié)構(gòu)。這類(lèi)抗體(與本發(fā)明相同)依次用于識(shí)別和抑制與依次與煙草相關(guān)的AGE結(jié)構(gòu)。例如，通過(guò)構(gòu)建應(yīng)用本發(fā)明抗煙草相關(guān)AGE抗體的免疫測(cè)定法，可以測(cè)定由與煙草相關(guān)的AGEs修飾蛋白質(zhì)的程度。如上述所討論的，并且取決于如此修飾的蛋白質(zhì)的半衰期，AGE表位在蛋白質(zhì)樣品(諸如血清蛋白)上的免疫化學(xué)測(cè)定提供了近期煙草消費(fèi)(例如通過(guò)吸煙)的指標(biāo)。同樣，可以將AGE表位在循環(huán)和/或組織蛋白上的免疫化學(xué)檢測(cè)用于監(jiān)測(cè)用本發(fā)明試劑的治療過(guò)程，通過(guò)與煙草或煙草煙霧中的AGEs反應(yīng)，這些試劑涉及抑制通過(guò)使用煙草而產(chǎn)生的AGEs的過(guò)量蓄積。
通過(guò)從煙草中或從煙霧中分離與煙草相關(guān)的AGEs、例如通過(guò)制備煙草或煙草煙霧冷凝物的含有AGE的水提取物(如上所述)，可以簡(jiǎn)便地制備符合本發(fā)明與煙草相關(guān)的AGEs的各種半抗原、抗原、和共軛的免疫原?？梢詫⑦@種提取物用作一種可增加識(shí)別特異性表位或其分子特征的抗體的各種免疫原，該免疫原可在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，將提取物的AGEs看作半抗原，根據(jù)本領(lǐng)域廣泛使用的方案、使用任意大量眾所周知的二價(jià)偶合試劑、諸如象EDC這樣的碳二亞胺，將這些半抗原相應(yīng)地與任意幾種優(yōu)選的載體蛋白偶合，所述優(yōu)選的載體蛋白包括、例如匙孔血藍(lán)蛋白(KLH)，甲狀腺球蛋白，且最優(yōu)選牛血清白蛋白。不管來(lái)源如何，可以將與煙草相關(guān)的AGEs、無(wú)論是單獨(dú)的還是與載體蛋白偶合的且無(wú)論是純的還是部分純的形式用于確認(rèn)良好的免疫方案，從而生成在大量應(yīng)用中是有用的抗體和相關(guān)的免疫試劑，這歸因于用于與煙草相關(guān)產(chǎn)物的分子特征的抗體的特異性。
下面是一個(gè)優(yōu)選的方案，對(duì)任意幾種動(dòng)物種類(lèi)進(jìn)行免疫接種以產(chǎn)生定向于與煙草相關(guān)的AGE的蛋白質(zhì)共軛物的多克隆抗血清，所述的動(dòng)物包括、例如小鼠，大鼠，倉(cāng)鼠，山羊，家兔，和雞。上述動(dòng)物種類(lèi)的前三種是特別需要的選擇，因它們可用于隨后產(chǎn)生可分泌半抗原特異性單克隆抗體的雜交瘤。通過(guò)本領(lǐng)域普遍實(shí)施的任意幾種方案可以簡(jiǎn)便地完成來(lái)自免疫接種動(dòng)物脾細(xì)胞的所述雜交瘤的產(chǎn)生，且所述的方案描述了適于通過(guò)與合適的細(xì)胞系(例如骨髓瘤細(xì)胞系)融合產(chǎn)生的免疫接種脾細(xì)胞的無(wú)限增殖化的條件。用于產(chǎn)生雜交瘤的所述方案還提供了一些方法，這些方法可用于選擇和克隆免疫脾細(xì)胞/骨髓瘤細(xì)胞的雜交瘤且用于識(shí)別穩(wěn)定地分泌定向于所需表位的抗體的雜交瘤克隆。將諸如家兔和山羊這樣的動(dòng)物種類(lèi)更普遍地用于生成多克隆抗血清，但不管最終是否需要多克隆抗血清或單克隆抗體，一般開(kāi)始將半抗原修飾的載體蛋白與一種佐劑、諸如完全Freund’s佐劑(Complete Freund’s Adjuvant)一同進(jìn)行給藥。通過(guò)任何途徑可以給予免疫接種，一般通過(guò)腹膜內(nèi)、肌內(nèi)或真皮內(nèi)的途徑；在本領(lǐng)域中根據(jù)所免疫接種的種類(lèi)和最終產(chǎn)生抗體的類(lèi)型來(lái)優(yōu)選某些途徑。隨后，一般與一種佐劑、諸如礬或不完全Freund’s佐劑(Incomplete Freund’s Adjuvant)一起給予加強(qiáng)免疫。在原始免疫接種后每隔一段時(shí)間給予加強(qiáng)免疫；一般1個(gè)月是合適的間隔，在每次加強(qiáng)免疫后的1-2周之間取血液樣品。另一方面，有時(shí)將各種所謂的超免疫方案(一般以及時(shí)的相互間隔較近的加強(qiáng)免疫為特征)用于產(chǎn)生優(yōu)于抗載體蛋白抗體內(nèi)的抗半抗原抗體的一種嘗試。
對(duì)于在任意幾種簡(jiǎn)便的方式、包括(例如)Ouchterlony擴(kuò)散凝膠和直接ELISA方案中的半抗原特異性免疫滴度來(lái)說(shuō)，可以比較血液樣品中升高后的抗體滴度。在一種典型的直接ELISA中，將一種確定的抗原固定在檢測(cè)孔的表面上(一般在96孔或微量滴定平板中)，隨后通過(guò)沖洗檢測(cè)孔而分離一系列培養(yǎng)物以去除未結(jié)合的結(jié)合配體。作為非限制性的實(shí)施例，檢測(cè)平板的孔可以容納一種半抗原/載體共軛物的稀釋、緩沖的水溶液，優(yōu)選的情況是其中載體蛋白不同于用于免疫接種所檢測(cè)的產(chǎn)生抗體動(dòng)物的所用蛋白；例如可以對(duì)用免疫接種的與煙草相關(guān)的AGE/BSA共軛物修飾的檢測(cè)孔檢測(cè)來(lái)自與煙草相關(guān)的AGE/KLH共軛物免疫接種動(dòng)物的血清。另一方面，通過(guò)單獨(dú)用半抗原培養(yǎng)可以修飾檢測(cè)表面。一般來(lái)說(shuō)，將檢測(cè)孔的表面與一種無(wú)關(guān)蛋白質(zhì)(諸如酪蛋白)的溶液進(jìn)行接觸以封閉塑料表面上未占用的部位。在用一般含有一種將非特異性相互作用減至最低程度的鹽和去污劑的中性緩沖溶液沖洗后，將孔與由有意義的血液樣品制備的連續(xù)稀釋的一系列抗血清之一進(jìn)行接觸(初級(jí)抗血清)。再次沖洗后，通過(guò)用市售可得的酶-抗體共軛物培養(yǎng)可以估測(cè)通過(guò)與所需半抗原或半抗原/載體共軛物相互作用而固定在檢測(cè)孔上的檢測(cè)抗體的數(shù)量，其中這種二級(jí)共軛物的抗體部分直接定向于用于產(chǎn)生初級(jí)抗血清的種類(lèi)；例如，如果初級(jí)抗血清在家兔體內(nèi)增加，那么可以將在山羊體內(nèi)增加并與幾種酶(諸如辣根過(guò)氧化物酶)共軛的抗兔抗體的商品制劑作為二級(jí)抗體使用。在生產(chǎn)者規(guī)定的程序后，在比色檢測(cè)法中通過(guò)相關(guān)共軛酶的活性可以定量地估測(cè)這種二級(jí)抗體的量?？梢匀我庹{(diào)換許多相關(guān)的ELISA或放射免疫度量方案(諸如競(jìng)爭(zhēng)性ELISAs或夾心式ELISAs)，所有這些均是本領(lǐng)域眾所周知的，從而確定所需高滴度的抗血清；即特殊的抗血清在高稀釋度時(shí)提供正確的陽(yáng)性結(jié)果(例如大于1/1000且更優(yōu)選大于1/10,000)。
可以將類(lèi)似的免疫度量方案用于估測(cè)來(lái)自由免疫接種動(dòng)物脾細(xì)胞制備的雜交瘤的培養(yǎng)物上清液。在如此特性化的抗血清或雜交瘤上清液中，要求使用相關(guān)而結(jié)構(gòu)不同的半抗原或抗原的各種對(duì)照培養(yǎng)物(例如與不同的載體蛋白一起)，且省略免疫度量過(guò)程中的各種試劑以便將檢測(cè)試驗(yàn)中的非特異性信號(hào)減至最低并識(shí)別來(lái)自錯(cuò)誤陽(yáng)性結(jié)果和錯(cuò)誤陰性結(jié)果的抗體特異性和滴度的可靠的測(cè)定結(jié)果。在這方面使用的對(duì)照培養(yǎng)物的種類(lèi)是眾所周知的。此外，將相同的普通免疫度量方案隨后與由上述過(guò)程所識(shí)別的抗血清一起使用(即所發(fā)現(xiàn)的抗體是具有高滴度且涉及與煙草相關(guān)的AGEs的特異性結(jié)構(gòu)決定因素)?？梢詫⑦@類(lèi)后者應(yīng)用的所需抗煙草相關(guān)AGE抗體(無(wú)論是多克隆的還是單克隆的)與說(shuō)明書(shū)并任意與其它有用的試劑(包括、但不限于一組與煙草相關(guān)的AGES的分子標(biāo)準(zhǔn)物)和稀釋劑一起裝入方便操作者的試劑盒劑型中。
如上所述生成的抗煙草相關(guān)AGE抗體(且特別是這類(lèi)單克隆抗體)還可用于識(shí)別、分離、富集和純化與煙草相關(guān)的AGE表位。這一過(guò)程可以通過(guò)本領(lǐng)域公知的技術(shù)來(lái)完成，例如通過(guò)以下步驟將公知含有有意義表位的制劑與特別用于所述表位的固定抗體接觸、沖洗掉未結(jié)合的物質(zhì)、然后洗脫特異性結(jié)合的物質(zhì)并分析其化學(xué)結(jié)構(gòu)以便測(cè)定與煙草相關(guān)的AGEs的特異性分子形式。
實(shí)施例8為了進(jìn)一步證明應(yīng)用本發(fā)明AGE抑制劑和AGE回復(fù)劑防止蛋白質(zhì)在一種表面(諸如發(fā)生在吸煙者的牙齒表面上或皮膚或粘膜表面)上脫色這一情況，進(jìn)行下面的表面褐變實(shí)驗(yàn)。作為一種皮膚、粘膜或菌膜覆蓋的牙齒表面的替代物，將未曝光并展開(kāi)的照相紙用于承載一種簡(jiǎn)易紙裱褙材料上的固定蛋白(明膠，即膠原)表面。將這類(lèi)照相紙打成5mm的圓片物，并將這些圓片物中的幾個(gè)浸入煙草提取物或煙草煙霧冷凝物的溶液(如上所述制備)中，已經(jīng)用或不用本發(fā)明的AGE抑制劑或AGE回復(fù)劑將所述的煙草提取物或煙草煙霧冷凝物在一種合適的水緩沖液(如上所述)中進(jìn)行了適當(dāng)?shù)叵♂?。一般通過(guò)在暗處、控制的溫度在20℃-60℃之間將這類(lèi)實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)物維持合適的時(shí)間期限，該期限可以在幾小時(shí)至幾周的范圍內(nèi)。在培養(yǎng)開(kāi)始后不同的時(shí)間處，回收?qǐng)A片物，觀察褐變的顏色并拍照以用于保存記錄。在一種類(lèi)似于煙草使用者的皮膚、粘膜表面或牙齒菌膜的染色的方式中，來(lái)自煙草或煙霧提取物的反應(yīng)AGEs的吸附作用導(dǎo)致蛋白質(zhì)表面變成帶有黃色和褐色的AGE色素的顏色。作為由以未用檢測(cè)試劑培養(yǎng)的對(duì)照?qǐng)A片物為參照的黃色/褐色色素蓄積防止法所證明的，AGEs蓄積的防止法確定AGE抑制劑可用于本發(fā)明的范圍。
在另一個(gè)用于AGE回復(fù)活性的檢測(cè)試驗(yàn)中，通過(guò)用上文所述的稀釋煙草提取物或煙草煙霧冷凝提取物培養(yǎng)將蛋白質(zhì)覆蓋的圓片物進(jìn)行“預(yù)褐變”，并將本發(fā)明選擇的AGE回復(fù)劑添加到培養(yǎng)溶液中另一個(gè)時(shí)間期限。以未用檢測(cè)試劑培養(yǎng)的對(duì)照?qǐng)A片物為參照，由本發(fā)明檢測(cè)試劑產(chǎn)生的黃色/褐色色素蓄積的抑制和回復(fù)作用確定了特別適于用作本發(fā)明范圍內(nèi)的AGE回復(fù)劑的選擇物。如此確定的AGE抑制劑和AGE回復(fù)劑特別適用于配成口腔沖洗劑或牙粉，它們可防止和回復(fù)其它口腔表面的不需要的牙齒染色和色素形成，所述不需要的牙齒染色和色素形成與使用煙草一起發(fā)生，無(wú)論是口腔使用的是咀嚼煙和鼻煙還是通過(guò)吸香煙、雪茄和煙斗。還可以將這種蛋白質(zhì)褐變測(cè)定法中帶有活性的檢測(cè)試劑配制成用在吸煙者染色的手和手指上的乳油、乳化劑或類(lèi)似物。本方法還作為用于監(jiān)測(cè)接觸環(huán)境煙霧的劑量測(cè)定法的范例。
實(shí)施例9盡管普遍接受吸煙是導(dǎo)致心臟、肺、血管、腫瘤及其它疾病的一種危害因素這一事實(shí)，但是構(gòu)成這種因果關(guān)系基礎(chǔ)的分子機(jī)理仍然沒(méi)有完全了解。已經(jīng)提示慢性和急性過(guò)程先于對(duì)使用煙草的病理反應(yīng)，但申請(qǐng)人第一次證實(shí)煙草消費(fèi)(特別是通過(guò)吸煙)可以導(dǎo)致血液和組織中AGE水平升高。在使用抗AGE抗體的免疫化學(xué)染色的實(shí)驗(yàn)中注意到的情況顯示AGEs密集地布滿(mǎn)了患有血管疾病的吸煙者的冠狀動(dòng)脈，申請(qǐng)人還試圖證實(shí)體內(nèi)慢性接觸煙霧可以導(dǎo)致控制良好的動(dòng)物模型體內(nèi)血液和組織AGEs升高。
使用全身吸入接觸室，將生長(zhǎng)6周的雄性和雌性大鼠(例如實(shí)驗(yàn)室菌株F344)與載有經(jīng)稀釋主流煙霧產(chǎn)生的固定含量的香煙煙霧微粒的過(guò)濾空氣的氣體接觸幾周至2年范圍內(nèi)不同的時(shí)間期限。例如，按照250mg總微粒物質(zhì)(TPM)/立方米的水平接觸這類(lèi)攜帶煙草煙霧的空氣，每天接觸6小時(shí)，每周接觸5天，這一過(guò)程導(dǎo)致煙草煙霧沉積物與每天吸5包香煙的人的氣道中的物質(zhì)相同。如公開(kāi)程序中更完整描述的(例如J.Chen等，1989，《吸入毒理學(xué)》(Inhalation Toxicol.)1∶331-347)，使用連續(xù)發(fā)煙機(jī)、從類(lèi)型為IR3的無(wú)濾嘴研究用香煙(煙草健康研究院(Tobacco HealthReaserch Institute)；Lexington,KY)中產(chǎn)生主流煙霧。將同樣的對(duì)照動(dòng)物裝入而僅接觸過(guò)濾的氣流(不含香煙煙霧)。通過(guò)參照取自接觸室的過(guò)濾樣品的重量分析來(lái)測(cè)定煙霧接觸的水平。已經(jīng)具體地描述了這種接觸煙霧空氣的化學(xué)和物理特征(參見(jiàn)上文和J.Chen等，1992,《氣溶膠藥劑》(Aerosol Med.)5∶19-30)。
在所要求的接觸期限后，處死試驗(yàn)動(dòng)物并收集各種器官和組織、包括(例如)全血并將它們抽樣用于解剖、顯微、和諸如AGE水平定量這樣的生物化學(xué)分析。在一種優(yōu)選的方法中，將血清在磷酸緩沖鹽水中按1∶5進(jìn)行稀釋并將蛋白酶K添加至樣品中總血清蛋白量的1/100。然后在37℃時(shí)通過(guò)培養(yǎng)使血清蛋白消化，并通過(guò)生溫至70℃ 1小時(shí)而將蛋白酶K滅活。在簡(jiǎn)單離心使之澄清后，收集上清液并在通過(guò)上文所述AGE ELISA來(lái)分析AGE含量前將其移至1mM苯甲基磺酰氟(phenymethylsulfonyl fluoride)(PMSF)中。
在根據(jù)這種程序進(jìn)行的初步研究中，來(lái)自與香煙煙霧接觸6-85周期限大鼠的血清蛋白消化物顯示出采集的平均(±標(biāo)準(zhǔn)偏差)AGE水平為22.0±4.9AGE單位/ml血清(N=13)，而沒(méi)有與香煙煙霧接觸的對(duì)照大鼠表現(xiàn)出的平均血清蛋白AGE水平為13.5±2.9 AGE單位/ml血清(N=7)。上述方法還提供了一種簡(jiǎn)便的測(cè)定法，使用該測(cè)定法估測(cè)本發(fā)明試劑和過(guò)濾裝置在抑制、防止或回復(fù)因消費(fèi)煙草導(dǎo)致的AGEs蓄積上的活性，例如按照本發(fā)明，可以處理煙草本身、原始或主流的煙草煙霧、載有煙霧的空氣、或接觸煙霧的動(dòng)物，并檢驗(yàn)試驗(yàn)動(dòng)物的組織和血液以便測(cè)定通過(guò)與未處理或未接觸的對(duì)照樣品比較已由此減少、防止或回復(fù)的AGE蓄積的程度。
實(shí)施例10下面的實(shí)施例證明去除糖化毒素(glycotoxins)的濾嘴還增加了香煙的器官感覺(jué)潛能，且特別是去除了來(lái)自產(chǎn)生“較柔和煙霧”的香煙煙草煙霧味道的“刺激”。
為了安裝用于本試驗(yàn)的香煙，將下列物質(zhì)放入一種標(biāo)準(zhǔn)手動(dòng)煙草滾壓機(jī)中一種標(biāo)準(zhǔn)商品濾嘴(從Marlboro柔和型香煙中截下)，500mg氨基胍或等量的氯化鈉以及在其原始紙上的3cm長(zhǎng)的商品香煙。使用一張滾壓紙將這些物質(zhì)包在一起。通過(guò)觀察或觸摸難以相互區(qū)分帶有另外過(guò)濾物質(zhì)的再滾壓的香煙。
為了進(jìn)行本試驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)者配對(duì)安裝、包括每類(lèi)香煙之一(即氨基胍或鹽)并用黃色斑點(diǎn)標(biāo)注該對(duì)中的一個(gè)。然后將香煙放入#10包裝以及含有標(biāo)記(即香煙帶有黃色斑點(diǎn))的更小密封包裝中。將包裝內(nèi)的一半帶有氨基胍內(nèi)置濾嘴的香煙用黃色斑點(diǎn)標(biāo)注并將另一半帶有氯化鈉內(nèi)置濾嘴的香煙用黃色斑點(diǎn)標(biāo)注。
對(duì)10個(gè)受試者(包括大量吸煙者和偶然吸煙者)的每一個(gè)體給予上述包裝之一的香煙并要求他們陳述兩種香煙的感覺(jué)。由實(shí)驗(yàn)者記錄受試者的反應(yīng)，然后實(shí)驗(yàn)者打開(kāi)內(nèi)部包裝以顯示標(biāo)記。
所有10個(gè)受試者均認(rèn)為兩種香煙“品起來(lái)象一種香煙”。10個(gè)受試者中的8個(gè)能夠區(qū)分出兩種香煙間細(xì)微的差異且所有的人均感覺(jué)含有氨基胍內(nèi)置濾嘴的香煙產(chǎn)生的煙霧幾乎不帶有“刺激”或是一種“柔和煙霧”。1個(gè)受試者描述到“柔和得就象陳年紅酒比新酒還柔和一樣”。所有能夠區(qū)分出兩種香煙間差異的8個(gè)受試者均更喜歡帶有氨基胍內(nèi)置濾嘴的香煙。
實(shí)施例11本實(shí)施例證明糖化毒素(glycotoxins)(AGE)去除濾嘴能夠防止香煙煙霧染色蛋白包被表面。在本實(shí)施例中，使用由膠原包被的微量滴定平板，而將發(fā)現(xiàn)的結(jié)果用于任何蛋白包被的表面，諸如牙齒、指甲或皮膚。
在實(shí)施例4中描述了10只帶氨基胍或氯化鈉過(guò)濾嘴的香煙的制備，在設(shè)備中發(fā)煙。5毫升PBS加入25毫升帶側(cè)臂的玻璃燒杯中，20只帶有兩種過(guò)濾嘴之一的香煙順次放入插在瓶塞的孔中的500微升吸頭中，且點(diǎn)燃。向燒瓶的側(cè)臂施加20毫米汞柱，以將煙霧吸入燒瓶，與PBS接觸。20只香煙燃燒完后，加入5毫升新鮮的PBS,將2毫升混合物加入到6孔板的每3孔中。每一6孔板有3孔有暴露于帶氨基胍過(guò)濾嘴香煙煙霧的PBS,3孔有暴露于帶氯化鈉過(guò)濾嘴香煙煙霧的PBS。板避光于37度溫孵48小時(shí)。用含有0.05％吐溫20的PBS洗滌6遍，比較孔底的顏色。孔中殘存的顏色是著色的AGE，它是糖化毒素和或反應(yīng)性AGE與膠原包被的孔反應(yīng)的結(jié)果。
實(shí)施例12用氨基胍噴霧煙草可消除糖化毒素(glycotoxins)在本實(shí)施例中，將煙葉用氨基胍(一種AGE形成抑制劑)處理，并觀察到糖化毒素(glycotoxins)不能夠促使體內(nèi)AGE分子的形成。用含有下列濃度氨基胍的5mls溶液噴霧與5支香煙的量相等的疏松煙葉10mg/ml,1mg/ml,0.1mg/ml噴霧后，將煙葉用鋁箔捆扎并在37℃下培養(yǎng)7天。然后將煙葉滾壓成香煙并在實(shí)施例3和4的水管裝置中點(diǎn)燃(上文所述)。使用上文所述體外AGE形成測(cè)定法測(cè)定糖化毒素(glycotoxins)含量。如附圖9中所示，觀察到了糖化毒素(glycotoxins)含量的劑量依賴(lài)性降低。
討論上述公開(kāi)內(nèi)容和實(shí)施例證明了先前闡明的蛋白質(zhì)糖化的生物和化學(xué)關(guān)系和作用，依據(jù)的是器官感覺(jué)特性和煙草處理和消耗的藥物動(dòng)力學(xué)。因此，由于在具有高循環(huán)和組織結(jié)合AGE水平的糖尿病病人中還觀察到了與吸煙有關(guān)的許多血管并發(fā)癥，所以本文研究了吸煙促使AGE形成的可能性。更具體地說(shuō)，本文所列數(shù)據(jù)包括最新的內(nèi)容，該內(nèi)容證明并例舉了本文定義為糖化毒素(glycotoxins)的一組試劑的存在和活性。煙草和香煙煙霧的水提取物含有糖化毒素(glycotoxins)、顯著反應(yīng)性的還原糖或糖化中間產(chǎn)物，它們?cè)隗w外和體內(nèi)可以快速誘導(dǎo)AGE在蛋白質(zhì)上形成并在體外產(chǎn)生DNA突變。通過(guò)使煙霧經(jīng)過(guò)氨基胍(一種AGEs形成的有效和特異性抑制劑)干燥柱可以從樣品中去除這些活性。
來(lái)自香煙煙霧的糖化毒素(glycotoxins)具有許多獨(dú)特的特性，這些特性可將糖化毒素(glycotoxins)與上述研究的還原糖、葡萄糖和葡糖-6-磷酸區(qū)分開(kāi)。最主要的是它們的極端反應(yīng)性與所記錄的已報(bào)導(dǎo)服用葡萄糖或葡糖-6-磷酸數(shù)天至數(shù)周以誘導(dǎo)可測(cè)定的AGE形成相反，煙草衍生的糖化毒素(glycotoxins)可以在數(shù)小時(shí)內(nèi)誘導(dǎo)AGE形成。當(dāng)多數(shù)還原糖(諸如葡萄糖)需要轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)時(shí)，可認(rèn)為糖化毒素(glycotoxins)輕易地通過(guò)細(xì)菌細(xì)胞的細(xì)胞膜。此外，在健康人中，來(lái)自香煙煙霧的糖化毒素(glycotoxins)可以通過(guò)肺被吸收并依次與血清蛋白反應(yīng)。盡管我們沒(méi)有測(cè)定糖化毒素(glycotoxins)的化學(xué)結(jié)構(gòu)，但是我們可以推斷它們帶有羰基并可能帶有二羰基，這是因?yàn)橛冒被铱梢匀コ鼈兓蚴顾鼈凅E冷。糖化毒素(glycotoxins)可能是煙草處理過(guò)程中引發(fā)的美拉德反應(yīng)中形成的產(chǎn)物重排的一種產(chǎn)物。分離過(guò)程中糖化毒素(glycotoxins)的不穩(wěn)定性意味著當(dāng)處理煙草且當(dāng)它老化時(shí)，可恒定地形成并消耗它們和其它美拉德產(chǎn)物(可能是導(dǎo)致煙霧香味的原因)。
體內(nèi)由煙草糖化毒素(glycotoxins)形成的AGEs可以部分導(dǎo)致吸煙者中動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)病率增加。體外和體內(nèi)有大量證據(jù)表明AGEs在動(dòng)脈粥樣硬化的病理上起一定作用(1)已經(jīng)證明AGEs與用于增加相關(guān)組織剛性的相關(guān)組織膠原交聯(lián)。(2)膠原交聯(lián)的AGEs用作以共價(jià)鍵方式捕捉循環(huán)血清蛋白、諸如脂蛋白的反應(yīng)“病灶”。(3)內(nèi)皮細(xì)胞AGE受體的結(jié)合會(huì)增加血管的通透性、減少抗促凝劑凝血調(diào)節(jié)蛋白的合成并增加前促凝劑組織因子的合成。(4)組織結(jié)合的AGEs可以以化學(xué)方式使細(xì)胞衍生的氧化氮驟冷，由此抑制氧化氮依賴(lài)性血管舒張。(5)已經(jīng)證明含有胺的磷脂的AGE修飾可引起脂的氧化。細(xì)胞LDL受體不會(huì)識(shí)別氧化的LDL,且巨噬細(xì)胞清除劑受體可去除氧化的LDL。脂載的血管壁巨噬細(xì)胞是通常在脂肪劃線和其它類(lèi)早期動(dòng)脈粥樣硬化損害中發(fā)現(xiàn)的特征性泡沫細(xì)胞。(6)顯著升高的血管組織的和循環(huán)的AGEs與糖尿病腎衰竭疾病末段的加速血管病相關(guān)。(7)經(jīng)血管內(nèi)注入正常未成熟大鼠和家兔的外源AGE修飾的白蛋白可產(chǎn)生類(lèi)似于在患有與衰老和糖尿病相關(guān)的血管疾病的動(dòng)物體內(nèi)觀察到的血管改變。用外源AGE白蛋白注射的動(dòng)物表現(xiàn)出血管壁通透性增加、內(nèi)皮下和動(dòng)脈周(periarteriolar)空間內(nèi)單核細(xì)胞遷移活性和在用乙酰膽堿和硝化甘油攻擊后檢測(cè)的血壓反應(yīng)增加。[Vlassara等PNAS 89∶12043-12047,1992]。理想的是期望通過(guò)糖化毒素(glycotoxins)與血清和組織蛋白反應(yīng)形成的AGEs具有與上述AGEs相同的活性。
糖化毒素(glycotoxins)還可以使吸煙者中癌癥的發(fā)病率增加。除與蛋白質(zhì)和脂上的氨基反應(yīng)外，還原糖還可以與核酸的氨基反應(yīng)。體外用還原糖培養(yǎng)DNA或單核苷酸可產(chǎn)生類(lèi)似于對(duì)與蛋白質(zhì)和脂結(jié)合的AGE化合物所觀察到的的吸收度和熒光改變。用葡萄糖或葡糖-6-磷酸培養(yǎng)的細(xì)菌質(zhì)粒DNA或哺乳動(dòng)物穿梭載體DNA的培養(yǎng)表現(xiàn)出值得注意的突變率增加。(Bucala等，1984,PNAS,81∶105-109；Bucala 1985,PNAS82∶8439-8442；Lee AT和Cerami,A.1987,PNAS84∶8311-8314)。由于上述研究的還原糖能夠通過(guò)細(xì)菌細(xì)胞膜，所以盡管可將它們添加到細(xì)菌生長(zhǎng)培養(yǎng)基中，但是它們不會(huì)產(chǎn)生細(xì)菌內(nèi)的突變。然而，已經(jīng)證明葡糖-6-磷酸可誘導(dǎo)大腸桿菌(DF40和DF2000)糖酵解突變體內(nèi)的突變，所述的突變體可在其細(xì)胞質(zhì)內(nèi)蓄積葡糖-6磷酸。所有這些研究結(jié)果中的普遍特征在于由還原糖產(chǎn)生的大部分突變是插入體或缺失體。
哺乳動(dòng)物中還原糖致突變性的最令人信服的證據(jù)來(lái)自由Lee等所做的工作((1994)FASEB雜志8∶545-550)，即母體高血糖環(huán)境對(duì)小鼠體內(nèi)胚胎生長(zhǎng)的影響。象眼睛的晶狀體和紅細(xì)胞一樣，胚胎細(xì)胞不需要胰島素將葡萄糖轉(zhuǎn)移通過(guò)其膜。將含有細(xì)菌基因(lacI，一種特征明顯的誘變標(biāo)記物)整合復(fù)制物的轉(zhuǎn)基因鼠胚胎植入鏈尿菌素誘導(dǎo)的糖尿病和對(duì)照替代母體中。在來(lái)自植入糖尿病母體的胚胎的DNA中，lacI突變率顯著高于來(lái)自植入對(duì)照小鼠的情況。
盡管患有糖尿病的哺乳類(lèi)動(dòng)物具有升高的血清葡萄糖水平，但是沒(méi)有可證實(shí)的證據(jù)證明任何類(lèi)癌癥在它們體內(nèi)增加。葡萄糖不會(huì)自由地進(jìn)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞；它需要胰島素存在以刺激其遷移。因此在成熟哺乳類(lèi)動(dòng)物體內(nèi)，胞內(nèi)葡萄糖濃度依賴(lài)于血清葡萄糖水平。然而，重要的是要注意糖化毒素(glycotoxins)遠(yuǎn)比葡萄糖更有效。象葡萄糖和葡糖-6-磷酸一樣，它們可以在一種氨基胍依賴(lài)性方式中產(chǎn)生插入和/或缺失突變體，但不象這些其它的還原糖，糖化毒素(glycotoxins)可以輕易地通過(guò)細(xì)胞膜。
總之，我們的發(fā)現(xiàn)表明糖化毒素(glycotoxins)(在香煙煙霧中發(fā)現(xiàn)的)可部分導(dǎo)致吸煙者中觀察到的動(dòng)脈粥樣化血管疾病和癌癥的增加率。在吸煙過(guò)程中，將高濃度的糖化毒素(glycotoxins)吸入肺泡，在肺泡中，可以將它們吸入血流并吸入肺實(shí)質(zhì)細(xì)胞。一旦處于血流中，則糖化毒素(glycotoxins)可以誘導(dǎo)在血清和血管壁蛋白上形成AGE的部分并由此加速動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)展。糖化毒素(glycotoxins)還可以與肺實(shí)質(zhì)細(xì)胞核中的核酸反應(yīng)，從而誘導(dǎo)突變和可能的癌癥。
本發(fā)明可以概括在其它形式中或以其它方式進(jìn)行而不會(huì)脫離其實(shí)質(zhì)或基本特征。因此將本說(shuō)明書(shū)的公開(kāi)內(nèi)容在所有方面看作是說(shuō)明性的而非限制性的，本發(fā)明的范圍由所附的權(quán)利要求來(lái)表示，且在相同的目的和范圍內(nèi)的所有改變均包括在其中。
權(quán)利要求
1．一種用于在人類(lèi)受試者體內(nèi)測(cè)定如果可能的近來(lái)有吸煙史的方法，包括以下步驟在所述的受試者體內(nèi)測(cè)定高級(jí)糖基化終產(chǎn)物(AGEs)的血清水平，將此測(cè)定結(jié)果與取自具有在其他方面有類(lèi)似病史的非吸煙個(gè)體的數(shù)據(jù)庫(kù)標(biāo)準(zhǔn)相比較。
2．一種用于估測(cè)吸煙過(guò)程中個(gè)體對(duì)高級(jí)糖基化終產(chǎn)物(AGEs)接觸可能性的方法，包括以下步驟在煙草及其揮發(fā)的燃燒產(chǎn)物(或煙霧)中測(cè)定這類(lèi)AGEs。
3．一種用于測(cè)定煙草的器官感覺(jué)潛能的方法，包括以下步驟在所述的煙草中測(cè)定高級(jí)糖基化終產(chǎn)物(AGEs)的存在及其量。
4．一種用于測(cè)定煙草的期限和貯存情況的方法，包括以下步驟在煙草中測(cè)定高級(jí)糖基化終產(chǎn)物(AGEs)的存在及其量。
5．一種用于測(cè)定煙草的器官感覺(jué)潛能的方法，包括以下步驟在由所述煙草燃燒產(chǎn)生的煙霧中測(cè)定高級(jí)糖基化終產(chǎn)物(AGEs)的存在及其量。
6．一種用于測(cè)定煙草的期限和貯存情況的方法，包括以下步驟在由所述煙草燃燒產(chǎn)生的煙霧中測(cè)定高級(jí)糖基化終產(chǎn)物(AGEs)的存在及其量。
7．一種用于測(cè)定特殊煙草作物的商業(yè)價(jià)值的方法，包括以下步驟測(cè)定煙草的器官感覺(jué)潛能并測(cè)定其期限和貯存情況，這一步驟通過(guò)在其樣品中測(cè)定高級(jí)糖基化終產(chǎn)物(AGEs)及的存在其量來(lái)進(jìn)行。
8．權(quán)利要求2-7的方法，其中所述的AGEs通過(guò)以下步驟來(lái)測(cè)定A．處理所述煙草的樣品以形成懷疑含有所述AGEs或相應(yīng)的前體的糖化毒素(glycotoxins)的提取物；和B．分析所述的提取物以檢測(cè)其中含有的任何糖化毒素(glycotoxins)或AGEs的存在和量。
9．權(quán)利要求8的方法，其中通過(guò)燃燒以從中形成煙霧來(lái)處理所述的樣品，并將所述的煙霧用于檢驗(yàn)其中含有的AGEs的和相關(guān)的糖化毒素(glycotoxins)的存在和量。
10．一種用于檢測(cè)吸煙個(gè)體體內(nèi)高級(jí)糖基化終產(chǎn)物(AGEs)的存在及其量的方法，包括以下步驟A．從所述的個(gè)體中收集生物樣品，所述的生物樣品選自由血清，唾液，尿和糞便組成的組；和B．將所述的樣品用于檢驗(yàn)所述AGEs的存在及其量。
11．一種用于生成富集用于與存在于煙草及其燃燒副產(chǎn)物、包括煙草的煙霧中的高級(jí)糖基化終產(chǎn)物(AGEs)樣部分反應(yīng)的抗體的方法，包括以下步驟用免疫原對(duì)動(dòng)物進(jìn)行免疫接種，所述的免疫原選自煙草；煙草的煙霧；其提取物；用上述任何一種物質(zhì)衍生的載體蛋白；及其半抗原，非強(qiáng)制性使用一種雙官能交聯(lián)橋接反應(yīng)。
12．與權(quán)利要求11抗體結(jié)合的與煙草相關(guān)的高級(jí)糖基化終產(chǎn)物。
13．一種用于降低使用煙草或吸煙個(gè)體體內(nèi)高級(jí)糖基化終產(chǎn)物(AGEs)蓄積的方法，包括以下步驟通過(guò)給予抑制量的試劑來(lái)對(duì)個(gè)體進(jìn)行治療，所述的試劑能夠與糖基化產(chǎn)物反應(yīng)以阻止所述AGEs的形成和/或有害活性。
14．一種用于抑制使用這類(lèi)煙草個(gè)體體內(nèi)與使用煙草或吸煙相關(guān)的高級(jí)糖基化終產(chǎn)物(AGEs)蓄積的方法，包括以下步驟使用抑制量的一種試劑來(lái)對(duì)煙草進(jìn)行處理，所述的試劑能夠與糖基化產(chǎn)物反應(yīng)以阻止它們的形成和/或所述AGEs的有害活性。
15．權(quán)利要求13或14的方法，其中所述的試劑與早期糖基化產(chǎn)物反應(yīng)，所述的試劑選自以下物質(zhì)組成的組氨基胍，拮抗劑，類(lèi)似物，同類(lèi)物，同源物及其模擬物，和它們的混合物。
16．權(quán)利要求13或14的方法，其中所述的試劑含有一種參與通式Ⅰ或Ⅱ的產(chǎn)物形成的化合物
其中R是含有氨基的肽、蛋白質(zhì)、或其它生物分子的殘基，該殘基通過(guò)早期糖基化產(chǎn)物(也稱(chēng)作Amadori或Heyns產(chǎn)物)的糖基-氨基部分的反應(yīng)而產(chǎn)生，所述的早期糖基化產(chǎn)物通過(guò)葡萄糖(或其它反應(yīng)糖)與所述的生物分子反應(yīng)而形成，其中所述的試劑含有一種反應(yīng)醛基。
17．權(quán)利要求13或14的方法，其中所述的試劑含有一種具有下列結(jié)構(gòu)通式的噻唑化合物
其中R1和R2獨(dú)立選自以下基團(tuán)組成的組氫，羥基(低級(jí))烷基，乙酸基(低級(jí))烷基，低級(jí)烷基，低級(jí)鏈烯基，或R1和R2連同環(huán)碳可以是一種芳香稠環(huán)，可任意被一個(gè)或多個(gè)氨基，鹵或亞烷基二氧取代；Z是氫或氨基；Y是氨基，一種下列通式的基團(tuán)
其中R是低級(jí)烷基，烷氧基，羥基，氨基或芳基，所述的芳基可任意被一個(gè)或多個(gè)低級(jí)烷基，低級(jí)烷氧基，鹵，二烷氨基，羥基，硝基或亞烷基二氧取代；一種下列通式的基團(tuán)-CH2R’其中R’是氫，或低級(jí)烷基，低級(jí)炔基，或芳基；或一種下列通式的基團(tuán)
其中R”是氫且R”’是低級(jí)烷基、可任意被芳基取代，或芳基，所述的芳基可任意被一個(gè)或多個(gè)低級(jí)烷基，鹵，或烷氧基羰基取代；或R”和R”’兩者均為低級(jí)烷基；X是鹵化物，甲苯磺酸鹽，甲磺酸鹽或磺酸鹽的離子；及其混合物。
18．權(quán)利要求14的方法，其中通過(guò)與試劑接觸來(lái)處理所述的煙草或發(fā)煙物質(zhì)。
19．權(quán)利要求18的方法，其中所述的接觸過(guò)程發(fā)生在所述煙草或發(fā)煙物質(zhì)燃燒之前。
20．權(quán)利要求18的方法，其中所述的接觸過(guò)程發(fā)生在所述煙草或發(fā)煙物質(zhì)燃燒過(guò)程中和之后。
21．權(quán)利要求19的方法，其中所述的接觸過(guò)程通過(guò)在收集所述煙草發(fā)煙物質(zhì)前直接將所述試劑應(yīng)用于所述煙草而發(fā)生。
22．權(quán)利要求21的方法，其中所述的接觸過(guò)程經(jīng)將燃燒產(chǎn)生的所述煙草發(fā)煙物質(zhì)的煙霧穿過(guò)含有所述試劑的過(guò)濾介質(zhì)的通道而發(fā)生。
23．權(quán)利要求22的方法，其中所述的過(guò)濾介質(zhì)包括多孔材料，該多孔材料中均勻地含有一定量的所述試劑，且所述的試劑傾向于與從其中通過(guò)的煙霧接觸。
24．一種作為劑量器用于測(cè)定和監(jiān)測(cè)存在于或來(lái)源于煙草和/或其副產(chǎn)物的AGEs或其前體的糖化毒素(glycotoxins)或糖化中間產(chǎn)物的存在和水平的裝置，所述的裝置包括一種底物或載體相，一定量糖化靶分子在此固定化結(jié)合，且適于與任何存在于被懷疑含有AGEs、糖化毒素(glycotoxins)或其它反應(yīng)糖化中間產(chǎn)物的樣品中的AGEs、糖化毒素(glycotoxins)或其它反應(yīng)糖化中間產(chǎn)物反應(yīng)。
25．權(quán)利要求24的裝置，其中所述的樣品物質(zhì)包括懷疑含有來(lái)源于煙霧的AGEs或其它AGE前的糖化毒素(glycotoxins)的大氣。
26．權(quán)利要求24的裝置，其中所述的底物是具有適合于與所述樣品物質(zhì)接觸的表面的一種固體，且將所述的AGE靶分子固定在所述的表面上。
27．權(quán)利要求24的裝置，其中所述的載體相包括一種液體且其中容納有所述的AGE靶分子，由此可以使所述的樣品物質(zhì)通過(guò)所述的液體，使得任何存在的AGEs能夠與所述的AGE靶分子進(jìn)行反應(yīng)。
28．一種用于捕捉并去除存在于從中通過(guò)的煙草煙霧中的AGEs或其它AGE前體的糖化毒素(glycotoxins)的濾器，包括一種其中均勻地含有一定量試劑而用于與所述的煙霧接觸的多孔材料，其中所述的試劑能夠與糖基化產(chǎn)物反應(yīng)而阻止AGE形成和/或所述AGEs的有害活性。
29．一種用于過(guò)濾煙草煙霧以抑制高級(jí)糖基化終產(chǎn)物形成并降低其量和活性的系統(tǒng)，所述的系統(tǒng)包括與所述煙草煙霧的發(fā)生器(source)連接的、根據(jù)權(quán)利要求28的一種濾器。
30．權(quán)利要求29的系統(tǒng)，其中所述的煙霧發(fā)生器是一種香煙，且所述的系統(tǒng)包括一種固定地連接所述發(fā)生器并在其中直立排列的一種濾器。
31．權(quán)利要求29的系統(tǒng)，其中所述的煙草煙草煙霧發(fā)生器是一種管，且所述的系統(tǒng)包括放置在液體滯留處中的一種濾器，所述儲(chǔ)器(bowl)的干(stem)放置在煙嘴口與裝有所述煙草的儲(chǔ)器之間。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了用于測(cè)定高級(jí)糖基化終產(chǎn)物(AGEs)的蓄積、和用于降低高級(jí)糖基化終產(chǎn)物蓄積的方法,這些方法基于這樣一種發(fā)現(xiàn),即AGEs及其前體的糖化毒素(glycotoxins)存在于煙草及其副產(chǎn)物中。更具體地說(shuō),這些方法基于這樣一種觀察結(jié)果,即相對(duì)于非吸煙個(gè)體來(lái)說(shuō),吸煙或另外使用煙草的個(gè)體的AGEs水平已經(jīng)增加。本方法涉及在兩種個(gè)體中和煙草及其副產(chǎn)物(煙霧)中測(cè)定AGE水平、并涉及使用能夠與糖基化產(chǎn)物反應(yīng)的試劑治療這樣的個(gè)體以避免或減少AGEs在體內(nèi)的累積。本發(fā)明還公開(kāi)了用于評(píng)價(jià)煙草產(chǎn)物以測(cè)定其貯存情況和器官感覺(jué)能力和潛能的方法、用于處理環(huán)境空氣以降低AGE水平的方法、和用于處理煙草產(chǎn)物和燃燒副產(chǎn)物以降低其中AGE水平的方法。例如,使用一種劑量器或類(lèi)似裝置可以吸入并評(píng)價(jià)空氣或其它樣品,從而測(cè)定AGE水平是否超過(guò)正常值,此后可以完成測(cè)定以改善環(huán)境條件。同樣,本發(fā)明公開(kāi)了用于從煙草的煙霧中去除AGEs的濾器和類(lèi)似裝置。本發(fā)明關(guān)注并包括所有這類(lèi)方法和相應(yīng)的材料。
文檔編號(hào)A61P9/00GK1211321SQ96180126
公開(kāi)日1999年3月17日 申請(qǐng)日期1996年12月23日 優(yōu)先權(quán)日1995年12月26日
發(fā)明者A·瑟拉米, R·J·布卡拉, H·維拉薩拉, H·W·富恩德斯, C·J·瑟拉米 申請(qǐng)人:皮考瓦醫(yī)療研究院, 奧爾頓有限公司