專利名稱：編程性細(xì)胞死亡誘導(dǎo)分子Ⅱ的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及TNF-配基超家族的一個(gè)新成員。具體地說(shuō)，本發(fā)明提供了編碼人編程性細(xì)胞死亡誘導(dǎo)分子Ⅱ(Apoptosis Inducing MolecularⅡ,AIMⅡ)的分離的核酸分子。本發(fā)明還提供了AIMⅡ多肽，以及生產(chǎn)該多肽的載體、宿主細(xì)胞和重組方法。本發(fā)明還涉及鑒定AIMⅡ活性的激動(dòng)劑和拮抗劑的篩選方法。本發(fā)明也提供了治療淋巴結(jié)病、自身免疫疾病、移植物抗宿主疾病以及抑制腫瘤如腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的治療方法。
背景技術(shù)：
人腫瘤壞死因子α(TNF-α)和β(TNF-β，或淋巴細(xì)胞毒素)是一個(gè)多肽介導(dǎo)分子大類中的相關(guān)成員，該類多肽介導(dǎo)分子包括干擾素、白細(xì)胞介素和生長(zhǎng)因子，總稱為細(xì)胞因子(Beutler B.和Cerami A.,Annu.Ret.Immunol.,7:625-655(1989))。
腫瘤壞死因子(TNF-α和TNF-β)最初是由于其抗腫瘤活性效果而被發(fā)現(xiàn)的，然而目前它被看作是一種多效細(xì)胞因子，具有多種生物學(xué)活性，包括參與一些轉(zhuǎn)化細(xì)胞系的編程性細(xì)胞死亡、介導(dǎo)細(xì)胞的活化和增殖，并在免疫調(diào)控和炎癥中也有重要作用。
迄今為止，TNF-配基超家族的已知成員有TNF-α、TNF-β(淋巴細(xì)胞毒素-α)、LT-β、OX40L、Fax配基、CD30L、CD27L、CD40L以及4-IBBL。TNF配基超家族的配基是酸性的、類似TNF的分子，在胞外結(jié)構(gòu)域有大約20％(范圍，12％-36％)的序列同源性，并主要以膜結(jié)合形式存在，其具生物活性的類型是三聚體/多聚體復(fù)合物。目前僅從TNF、LTα和Fas配基鑒定出TNF配基超家族的可溶性形式(一般綜述見Gruss H.和Dower S.K.,血液，85(12):3378-3404(1995))。此處全文引入此文獻(xiàn)作為參考。
這些蛋白質(zhì)參與細(xì)胞增殖、活化和分化過(guò)程的調(diào)控，包括通過(guò)編程性細(xì)胞死亡或細(xì)胞毒性控制細(xì)胞的存活或死亡(Armitage R.J.,Curr.Opin.Immunol.,6:407(1994)及Smith C.A.,細(xì)胞，75:959(1994))。
哺乳動(dòng)物的發(fā)育依賴于細(xì)胞的增殖和分化，以及在編程性細(xì)胞死亡過(guò)程中發(fā)生的細(xì)胞程序性死亡(Walker等，Methods Achiev.Exp.Pathol.,13:18(1988)。編程性細(xì)胞死亡在識(shí)別自身抗原的免疫胸腺細(xì)胞的破壞過(guò)程中起著非常重要的作用。正常排除過(guò)程的失效可能在自身免疫疾病中具有一定作用(Gammon等，今日免疫學(xué)，12:193(1991))。
Itoh等(細(xì)胞，66:233(1991))描述了一種細(xì)胞表面抗原-Fas/CD95。它介導(dǎo)編程性細(xì)胞死亡，參與T-細(xì)胞的克隆缺失。Fas在已活化的T-細(xì)胞、B-細(xì)胞和嗜中性白細(xì)胞以及胸腺、肝、心臟、肺中都有表達(dá)。Fas除了在已活化的T-細(xì)胞、B-細(xì)胞和嗜中性白細(xì)胞中表達(dá)外，它還在成年小鼠卵巢中表達(dá)(Watanate-Fukunaga等，免疫學(xué)雜志，148:1274(1992))。在將Fas的單克隆抗體與Fas交聯(lián)的實(shí)驗(yàn)中，會(huì)引發(fā)編程性細(xì)胞死亡(Yonehara等，實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，169:1747(1989)；Trauth等，科學(xué)，245:301(1989))。另外，有例子表明，單克隆抗體與Fas的結(jié)合有可能在一定條件下刺激T-細(xì)胞(Alderson等，實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，178:2231(1993))。
Fas抗原是一種細(xì)胞表面蛋白，共相對(duì)分子量為45kd。人和鼠的Fas基因已由Watanabe-Fukunaga等(免疫學(xué)雜志，148:1274(1992)和Itoh等(細(xì)胞，66:233(1991)克隆。兩種基因所編碼的蛋白質(zhì)均為跨膜蛋白，與神經(jīng)生長(zhǎng)因子/腫瘤壞死因子受體超家族具有結(jié)構(gòu)上的同源性，所述超家族包括兩種TNF受體、低親和性神經(jīng)生長(zhǎng)因子受體及LTβ受體CD40、CD27、CD30和OX40。
近來(lái)Fas配基已有描述(Suda等，細(xì)胞75:Ⅱ69(1993))。其氨基酸序列表明Fas配基是屬于TNF家族的Ⅱ型跨膜蛋白。Fas配基在脾細(xì)胞和胸腺細(xì)胞中表達(dá)，經(jīng)純化的Fas配基分子量為40kd。
近來(lái)，已經(jīng)證明Fas/Fas配基間的相互作用是T細(xì)胞激活后的編程性細(xì)胞死亡過(guò)程所必需的(Ju等，自然，373:444(1995)；Brunner等，自然，373:441(1995))。T細(xì)胞的活化可誘導(dǎo)細(xì)胞表面上的這兩種蛋白質(zhì)，隨后配基與受體間的相互作用導(dǎo)致了細(xì)胞的編程性細(xì)胞死亡。由此證明，在正常免疫反應(yīng)中，F(xiàn)as/Fas配基相互作用所誘導(dǎo)的編程性細(xì)胞死亡過(guò)程可能具有一定的調(diào)控作用。
根據(jù)結(jié)構(gòu)和生物學(xué)上的相似性，本發(fā)明的多肽已被鑒定為TNF配基超家族的一個(gè)新成員。
顯然，應(yīng)該存在一些因子，它們可調(diào)控正常和異常細(xì)胞的活化和分化。因此，有必要鑒定和表征在正常和疾病狀態(tài)下調(diào)控正常和異常細(xì)胞的活化和分化的這類因子。具體地說(shuō)，有必要分離和鑒定控制編程性細(xì)胞死亡以治療自身免疫疾病、移植物抗宿主疾病及淋巴結(jié)病的其它的Fas配基。
發(fā)明概述本發(fā)明提供了含有編碼AIMⅡ多肽的多核苷酸的分離的核酸分子，所述AIMⅡ多肽具有

圖1A-C(SEQ ID NO:2)所示氨基酸序列或由保藏于細(xì)菌宿主的cDNA克隆所編碼的氨基酸序列，該細(xì)菌宿主于1996年8月22日以ATCC保藏號(hào)97689進(jìn)行了保藏。
本發(fā)明也涉及含有本發(fā)明的分離核酸分子的重組載體、含有所述重組載體的宿主細(xì)胞，以及通過(guò)重組技術(shù)制備所述載體和宿主細(xì)胞并利用它們生產(chǎn)AIMⅡ多肽或肽的方法。
本發(fā)明還提供了具有由本文所述多核苷酸編碼的氨基酸序列的分離的AIMⅡ多肽。
本文所用術(shù)語(yǔ)“AIMⅡ”多肽包括保留了AIMⅡ多肽活性的膜結(jié)合蛋白質(zhì)(含有一個(gè)細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域、一個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，以及一個(gè)胞外結(jié)構(gòu)域)及其截短的蛋白質(zhì)。在一個(gè)實(shí)施方案中，可溶性AIMⅡ多肽含有AIMⅡ蛋白全部或部分胞外結(jié)構(gòu)域，但缺乏能將所述多肽保留于細(xì)胞膜上的跨膜區(qū)。只要可溶性AIMⅡ蛋白能分泌出來(lái)，它也可含有部分跨膜區(qū)或部分胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域或其它序列?？蓪⒁欢萎愒葱盘?hào)肽融合于可溶性AIMⅡ多肽的N-末端，以使該可溶性AIMⅡ多肽在表達(dá)時(shí)能分泌出來(lái)。
本發(fā)明也提供了可用于治療淋巴結(jié)病、自身免疫疾病及移植物抗宿主疾病的AIMⅡ多肽，特別是人AIM多肽，所述AIMⅡ多肽可用于刺激周邊耐受性、破壞一些轉(zhuǎn)化細(xì)胞系、介導(dǎo)細(xì)胞活化和增殖，在功能上也可作為免疫調(diào)節(jié)和炎癥反應(yīng)的初級(jí)介導(dǎo)分子。
本發(fā)明還提供了含有AIMⅡ多核苷酸或AIMⅡ多肽的組合物，所述組合物可施用于體外細(xì)胞、離體(ex vivo)細(xì)胞和體內(nèi)細(xì)胞，或可施用于多細(xì)胞生物體。在本發(fā)明此方面某些特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，該組合物中含有AIMⅡ多核苷酸，以便在宿主生物中表達(dá)用于治療疾病的AIMⅡ多肽。就此而言，特別優(yōu)選在病人體內(nèi)進(jìn)行表達(dá)，以便治療與AIMⅡ內(nèi)源活性異常相關(guān)的疾病。
本發(fā)明也提供了鑒定可增強(qiáng)或抑制由AIMⅡ所誘導(dǎo)的細(xì)胞反應(yīng)的化合物的篩選方法，該篩選方法包括將表達(dá)AIMⅡ的細(xì)胞與候選化合物接觸、測(cè)試細(xì)胞反應(yīng)以及將該細(xì)胞反應(yīng)與標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞反應(yīng)相比較，所述標(biāo)準(zhǔn)是在無(wú)該候選化合物的接觸下測(cè)定的；由此，細(xì)胞反應(yīng)比標(biāo)準(zhǔn)增強(qiáng)則表明該化合物是激動(dòng)劑，細(xì)胞反應(yīng)比標(biāo)準(zhǔn)降低則表明該化合物是拮抗劑。
另一方面，本發(fā)明提供了AIMⅡ激動(dòng)劑和拮抗劑的篩選試驗(yàn)。拮抗劑可用于預(yù)防敗血癥性休克、炎癥、腦型瘧、HIV病毒的活化、移植物-宿主排斥反應(yīng)、骨吸收、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎及惡病質(zhì)(消瘦或營(yíng)養(yǎng)不良)。
本發(fā)明另一方面涉及需要更高水平的體內(nèi)AIMⅡ活性的個(gè)體的治療方法，所述方法包括對(duì)這類個(gè)體施用含有治療有效劑量的本發(fā)明的分離AIMⅡ多肽或其激動(dòng)劑的組合物。
本發(fā)明另一方面還涉及需要更低水平的體內(nèi)AIMⅡ活性的個(gè)體的治療方法，所述方法包括對(duì)這類個(gè)體施用含有治療有效劑量的AIMⅡ拮抗劑的組合物。
附圖簡(jiǎn)述圖1A-C示AIMⅡ的核苷酸序列(SEQ ID NO:1)及推斷的氨基酸序列(SEQ ID NO:2)。該蛋白質(zhì)推斷的分子量大約為26.4kDa。AIMⅡ蛋白推測(cè)的跨膜結(jié)構(gòu)域用下劃線表示。
圖2A-F示AIMⅡ蛋白和人TNF-α(SEQ ID NO:3)、人TNF-β(SEQ ID NO:4)、人淋巴細(xì)胞毒素(SEQ ID NO:5)及人Fas配基(SEQ ID NO:6)的氨基酸序列之間的相似區(qū)。
圖3A-F示AIMⅡ氨基酸序列分析。圖中示意了α、β、轉(zhuǎn)角和卷曲區(qū)；親水性和疏水性；兩親區(qū)、柔性區(qū)；抗原性指數(shù)和表面可能性。在“抗原性指數(shù)-Jameson-Wolf”圖表中，圖1A-C中大約第13-20、23-36、69-79、85-94、167-178、184-196、221-233位氨基酸對(duì)應(yīng)于AIMⅡ蛋白中顯示出高抗原性的區(qū)域。
發(fā)明詳述本發(fā)明提供了含有編碼AIMⅡ多肽的多核苷酸的分離核酸分子，該核酸分子通過(guò)對(duì)克隆的cDNA進(jìn)行測(cè)序而測(cè)定，所述AIMⅡ多肽具有圖1A-C所示氨基酸序列(SEQ ID NO:2)。本發(fā)明的AIMⅡ蛋白與人TNF-α(SEQ ID NO:3)、人TNF-β(SEQ ID NO:4)、人淋巴細(xì)胞毒素(SEQ ID NO:5)和人Fas配基(SEQ ID NO:6)有序列同源性(圖2A-F)。圖1A-C中所示核苷酸序列得自于cDNA克隆的測(cè)序結(jié)果，所述cDNA克隆于1996年8月22日保藏于美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，12301 Park Lawn Drive,Rockville,Maryland 20852,保藏號(hào)為97689。該保藏克隆包含于pBluescript SK(-)質(zhì)粒(Stratagene,La Jolla,CA)中。
除非特別指出，本文由DNA分子測(cè)序確定的所有核苷酸序列都是利用自動(dòng)化DNA測(cè)序儀(如Applied Biosystems,Inc.的373型)測(cè)定的，由本文所測(cè)定的DNA分子所編碼的多肽的所有氨基酸序列都是對(duì)上述所測(cè)定的DNA序列進(jìn)行翻譯而推測(cè)的。因此，如同本領(lǐng)域?qū)τ纱俗詣?dòng)化途徑測(cè)定的任何DNA序列所知的那樣，本文所測(cè)定的任何核苷酸序列都可能存在一些差錯(cuò)。通過(guò)自動(dòng)化所測(cè)定的核苷酸序列與測(cè)序DNA分子的真實(shí)核苷酸序列之間通常至少有約90％同一性、更通常是至少有約95％至至少約99.9％同一性。通過(guò)其它途徑可更準(zhǔn)確地測(cè)定真實(shí)序列，這些途徑包括本領(lǐng)域所熟知的手工DNA測(cè)序。本領(lǐng)域亦知，與真實(shí)序列相比，在測(cè)定的核苷酸序列內(nèi)單一插入或缺失可造成核苷酸序列翻譯時(shí)的移框，因此導(dǎo)致由測(cè)定的核苷酸序列所編碼的推測(cè)氨基酸序列與由測(cè)序DNA分子真實(shí)編碼的氨基酸序列從這類插入或缺失點(diǎn)處開始完全不同。
利用本文所提供的信息，如圖1A-C中的核苷酸序列，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)的克降和篩選方法，如使用mRNA作為起始材料克隆cDNA時(shí)所使用的方法，有可能獲得編碼AIMⅡ多肽的本發(fā)明的核酸分子。如本發(fā)明所述，圖1A-C中所述核酸分子(SEQ ID NO:1)發(fā)現(xiàn)于來(lái)自人巨噬細(xì)胞ox LDL(HMCCB64)的cDNA文庫(kù)中。在來(lái)自活化T細(xì)胞(HT4CC72)的cDNA文庫(kù)中也鑒定到此基因。圖1A-C中AIMⅡ cDNA測(cè)出的核苷酸序列(SEQ ID NO:1)含有編碼240個(gè)氨基酸殘基的蛋白質(zhì)的開放閱讀框，其具有的起始密碼子位于圖1A-C(SEQ ID NO:1)中核苷酸序列第49-51位，胞外結(jié)構(gòu)域含有圖1A-C(SEQ ID NO:2)中約第60至約第240位的氨基酸殘基，跨膜結(jié)構(gòu)域含有圖1A-C(SEQ ID NO:2)中約第37至約第59位的氨基酸殘基，胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域含有圖1A-C(SEQ ID NO:2)中由約第1至約第36位的氨基酸殘基，推斷其分子量大約26.4kDa。圖1A-C(SEQ ID NO:2)所示AIMⅡ蛋白與人Fas配基(圖2A-F)的氨基酸序列具有大約27％同一性和大約51％相似性，與人TNF-α(圖2A-F)的氨基酸序列具有大約26％同一性和大約47％相似性。
作為一名普通技術(shù)人員，應(yīng)能理解由于存在上面所討論的測(cè)序錯(cuò)誤的可能性，由保藏的cDNA所編碼的推測(cè)AIMⅡ多肽含有大約240個(gè)氨基酸，但氨基酸數(shù)可能是230-250個(gè)。進(jìn)一步應(yīng)理解，根據(jù)所使用的標(biāo)準(zhǔn)，AIMⅡ多肽的胞外、胞內(nèi)和跨膜結(jié)構(gòu)域的確切位點(diǎn)可能有微小差異。比如，圖1A-C(SEQ ID NO:2)中AIMⅡ胞外結(jié)構(gòu)域的確切位點(diǎn)可能會(huì)由于用來(lái)限定該區(qū)域的標(biāo)準(zhǔn)而會(huì)有微小不同(如具體位點(diǎn)可能在約第1至5位殘基間“漂移”)。
如上所述，本發(fā)明的核酸分子可以是RNA形式，如mRNA，或DNA形式，包括如通過(guò)克隆或合成產(chǎn)生的cDNA和基因組DNA。DNA可以是雙鏈或單鏈。單鏈DNA或RNA可以是編碼鏈(也稱被為有義鏈)，也可以是非編碼鏈(也被稱為反義鏈)。
“分離”的核酸分子意指從其天然環(huán)境中分離出的核酸分子-DNA或RNA。例如，為了本發(fā)明目的，將包含于載體中的重組DNA分子也看作是“分離的”。分離的DNA分子的其它例子包括存在于異源宿主細(xì)胞內(nèi)的重組DNA分子或以溶液狀態(tài)存在的已純化(部分或基本上)DNA分子。分離的RNA分子包括本發(fā)明的DNA分子的體內(nèi)或體外RNA轉(zhuǎn)錄本。根據(jù)本發(fā)明，分離的核酸分子還包括合成生產(chǎn)的此類分子。
本發(fā)明的分離核酸分子包括含有圖1A-C(SEQ ID NO:1)所示開放閱讀框(ORF)的DNA分子；含有圖1A-C(SEQ ID NO:2)所示AIMⅡ蛋白編碼序列的DNA分子；以及含有與上述序列基本上不同、但由于遺傳密碼簡(jiǎn)并性而仍編碼AIMⅡ蛋白的序列的DNA分子。當(dāng)然，遺傳密碼在本領(lǐng)域是眾所周知的。因此，對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，產(chǎn)生這類簡(jiǎn)并性變體的方法是很常規(guī)的。
另一方面，本發(fā)明提供了編碼AIMⅡ多肽的分離核酸分子，所述AIMⅡ多肽具有cNDA克隆所編碼的氨基酸序列，該cDNA克隆位于1996年8月22日以ATCC保藏號(hào)97689保藏的質(zhì)粒中。優(yōu)選地，該核酸分子編碼由上述保藏cDNA克隆所編碼的多肽。本發(fā)明還提供了具有圖1A-C(SEQ ID NO:1)所示核苷酸序列或具有上述保藏克隆所含AIMⅡcDNA的核苷酸序列的分離核酸分子，或具有與上述序列之一互補(bǔ)的序列的核酸分子。這類分離的分子，尤其是DNA分子，可有效用作探針，通過(guò)染色體原位雜交進(jìn)行基因作圖，以及通過(guò)如Northern印跡分析檢測(cè)人組織中AIMⅡ基因的表達(dá)。
本發(fā)明也涉及本文所述的分離核酸分子的片段。具有保藏cDNA的核苷酸序列或具有圖1A-C(SEQ ID NO:1)所示核苷酸序列的分離核酸的片段意指如本文所述可有效用作診斷探針和引物的長(zhǎng)度至少大約15nt、更優(yōu)選至少約20nt、更更優(yōu)選至少約30nt、甚至更優(yōu)選至少約40nt的片段。當(dāng)然，按照本發(fā)明，50-1500nt長(zhǎng)度的更大片段也是有用的，與保藏cDNA或圖1A-C(SEQ ID NO:1)所示的核苷酸序列絕大部分(如果不是全部的話)一致的片段同樣是有用的。例如，長(zhǎng)度至少約20nt的片段意指含有保藏cDNA的核苷酸序列或圖1A-C(SEQ ID NO:1)所示的核苷酸序列來(lái)源的20或更多個(gè)連續(xù)堿基的片段。
優(yōu)選本發(fā)明的核酸片段包括編碼AIMⅡ蛋白中含表位的區(qū)域的核酸分子。具體地說(shuō)，本發(fā)明的這類核酸片段包括編碼下述多肽的核酸分子含有圖1A-C(SEQ ID NO:2)中約第13位至約第20位氨基酸殘基的多肽；含有圖1A-C(SEQ ID NO:2)中約第23位至約第36位氨基酸殘基的多肽；含有圖1A-C(SEQ ID NO:2)中約第69位至約第79位氨基酸殘基的多肽；含有圖1A-C(SEQ ID NO:2)中約第85位至約第94位氨基酸殘基的多肽；含有圖1A-C(SEQID NO:2)中約第167位至約第178位氨基酸殘基的多肽；含有圖1A-C(SEQ ID NO:2)中約第184位至約第196位氨基酸殘基的多肽；以及含有圖1A-C(SEQ ID NO:2)中的第221位至約第233位氨基酸殘基的多肽。本發(fā)明人已測(cè)出上述多肽片段都是AIMⅡ蛋白的抗原性區(qū)域。下面詳述測(cè)定AIMⅡ蛋白其它的含表位的區(qū)域的方法。
根據(jù)本發(fā)明，AIMⅡ多核苷酸可用于多種應(yīng)用中，尤其是利用了AIMⅡ的化學(xué)和生物學(xué)特性的應(yīng)用中。這些應(yīng)用涉及自身免疫疾病和異常細(xì)胞增殖。其它一些應(yīng)用涉及細(xì)胞、組織和生物體異常的診斷和治療。
本發(fā)明也涉及將AIMⅡ多核苷酸用于檢測(cè)互補(bǔ)性多核苷酸鏈的用途，例如用作診斷試劑。對(duì)與機(jī)能障礙相關(guān)的AIMⅡ突變形式的檢測(cè)將提供一種診斷工具，這種診斷工具可增強(qiáng)或限定起因于AIMⅡ過(guò)低表達(dá)、過(guò)高表達(dá)或異常表達(dá)的疾病或疾病敏感性(如自身免疫疾病)的診斷中。由于AIMⅡ基因存在于多種腫瘤細(xì)胞系中，包括胰腺腫瘤、睪丸腫瘤、子宮內(nèi)膜腫瘤和T細(xì)胞淋巴結(jié)瘤，因此，編碼AIMⅡ的多核苷酸也可用作診斷標(biāo)記以檢測(cè)本發(fā)明多肽的表達(dá)。
另一方面，本發(fā)明提供了含有某種多核苷酸的分離核酸分子，該多核苷酸在嚴(yán)格雜交條件下與本發(fā)明的上述核酸分子(如ATCC保藏號(hào)97689所含cDNA克隆)中的多核苷酸區(qū)段能雜交?！皣?yán)格雜交條件”意指在含有下述成分的溶液中于42℃保溫過(guò)夜50％甲酰胺，5×SSC(150mM NaCl,15mM檸檬酸三鈉)，50mM磷酸鈉(pH7.6),5×Denhardt’s溶液，10％硫酸葡聚糖及20g/ml變性的經(jīng)剪切的鮭精DNA，隨后在0.1×SSC中于大約65℃下洗滌濾膜。
能與一個(gè)多核苷酸的“區(qū)段”雜交的多核苷酸意指一個(gè)與標(biāo)準(zhǔn)多核苷酸中至少大約15個(gè)核苷酸(nt)、更優(yōu)選至少約20nt、更更優(yōu)選至少約30nt、甚至更優(yōu)選大約30-70nt的區(qū)段能雜交的多核苷酸(DNA或RNA)。如上文和下文詳細(xì)論述，它們可有效用作診斷探針和引物。
例如，“長(zhǎng)度至少為20nt”的多核苷酸的區(qū)段意指來(lái)源于標(biāo)準(zhǔn)多核苷酸(如保藏的cDNA或圖1A-C(SEQ ID NO:1)所示核苷酸序列)的核苷酸序列中20個(gè)或更多個(gè)連續(xù)核苷酸。
當(dāng)然，僅與poly A序列〔如圖1A-C(SEQ ID NO:1)所示AIMⅡcDNA的3′末端poly(A)區(qū)〕或T(或U)殘基的互補(bǔ)延伸鏈能雜交的多核苷酸并不包括在用于與本發(fā)明核酸區(qū)段的雜交中的本發(fā)明多核苷酸內(nèi)，這是由于這種多核苷酸分子與含有poly(A)延伸鏈或其互補(bǔ)區(qū)段的任何核酸分子(如實(shí)際中的任何雙鏈cDNA克隆)都能雜交上。
如本文所述，編碼AIMⅡ多肽的本發(fā)明的核酸分子可包括但并不限于下述核酸分子編碼所述多肽的氨基酸序列的那些核酸分子；多肽編碼序列和其它序列，如編碼前導(dǎo)序列或分泌序列(如前蛋白或蛋白原或前蛋白原序列)的序列；含有或不含有前述的其它編碼序列的多肽編碼序列，所述多肽編碼序列還含有其它的非編碼序列，包括但不局限于如內(nèi)含子、5′和3′非編碼序列(如在轉(zhuǎn)錄和mRNA剪切中具有如結(jié)合核糖體、穩(wěn)定mRNA等功能的轉(zhuǎn)錄、但不翻譯的序列，包括剪切和聚腺苷酸化信號(hào))；編碼其它氨基酸如提供其它功能的氨基酸的其它編碼序列。因此，編碼該多肽的序列可與標(biāo)記序列融合，所述標(biāo)記序列例如是編碼能簡(jiǎn)化融合多肽的純化的多肽的序列。在本發(fā)明此方面的某些優(yōu)選實(shí)施方案中，標(biāo)記氨基酸序列是六-組氨酸肽，如pQE載體(Qiagen,Inc.)上提供的標(biāo)記，這類肽中多數(shù)可商購(gòu)。例如，如同Gentz等，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)，86:821-824(1989)所述，六-組氨酸的存在便于對(duì)融合蛋白進(jìn)行純化?！癏A”標(biāo)記是另一個(gè)可有效用于純化的肽，此“HA”標(biāo)記對(duì)應(yīng)于流感血凝素蛋白來(lái)源的表位，該表位已被記載于Wilson等，細(xì)胞，37:767(1984)。如下文所述，其它這類融合蛋白包括在N末端或C末端與Fc融合的AIMⅡ。
本發(fā)明的核酸分子還包括編碼缺乏N-末端甲硫氨酸的全長(zhǎng)AIM-Ⅱ多肽的核酸分子。
本發(fā)明還涉及本發(fā)明的核酸分子的變體，這些變體編碼AIMⅡ蛋白的區(qū)段、類似物或衍生物。變體可以是天然存在的，如天然的等位基因變體。一個(gè)“等位基因變體”意指位于某種生物體中某條染色體上特定位點(diǎn)的某基因的若干種變體形式之一(基因Ⅱ,Lewin B.編，JohnWiley&Sons,New York(1985))。非天然存在的變體可利用本領(lǐng)域已知的致突技術(shù)產(chǎn)生。
這類變體包括可涉及一個(gè)或多個(gè)核苷酸的核苷酸取代、缺失或添加而產(chǎn)生的核酸分子。這些變體可以在編碼區(qū)、非編碼區(qū)或兩種區(qū)域中都發(fā)生了改變。編碼區(qū)內(nèi)的改變可產(chǎn)生保守的或非保守的氨基酸取代、缺失或添加。這些改變中特別優(yōu)選沉默取代、添加和缺失，它們并不改變AIMⅡ蛋白或其區(qū)段的性質(zhì)和活性。就此而言，也特別優(yōu)選保守取代。
本發(fā)明的另一實(shí)施方案中包括含有某種多核苷酸和分離核酸分子，該多核苷酸與下述核苷酸序列之一的同一性至少為90％、更優(yōu)選至少為95％、96％、97％、98％或99％:(a)編碼具有圖1A-C(SEQ IDNO:2)中全部氨基酸序列的AIMⅡ多肽的核苷酸序列；(b)編碼具有cDNA克隆所編碼的全部氨基酸序列的AIMⅡ多肽的核苷酸序列，該cDNA克隆包含于ATCC保藏號(hào)97689中；(c)編碼AIMⅡ多肽胞外結(jié)構(gòu)域的核苷酸序列；(d)編碼AIMⅡ多肽跨膜結(jié)構(gòu)域的核苷酸序列；(e)編碼AIMⅡ多肽胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的核苷酸序列；(f)編碼可溶性AIMⅡ多肽的核苷酸序列，該可溶性AIMⅡ多肽具有胞外和胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域，但缺乏跨膜結(jié)構(gòu)域；以及(g)與上述(a)、(b)、(c)、(d)、(e)或(f)中任一種核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列。
例如，含有與編碼AIMⅡ多肽的標(biāo)準(zhǔn)核苷酸序列具有至少95％“同一性”的核苷酸序列的多核苷酸意指所述多核苷酸的核苷酸序列與標(biāo)準(zhǔn)序列大致上是相同的，只是該多核苷酸序列在編碼AIMⅡ多肽的標(biāo)準(zhǔn)核苷酸序列中每100個(gè)核苷酸內(nèi)可含有不超過(guò)5個(gè)點(diǎn)突變。換句話說(shuō)，為了獲得含有與標(biāo)準(zhǔn)核苷酸序列具有至少95％同一性的核苷酸序列的多核苷酸，標(biāo)準(zhǔn)序列內(nèi)不超過(guò)5％的核苷酸可缺失或由其它核苷酸所取代；或者是，在標(biāo)準(zhǔn)序列內(nèi)可插入占標(biāo)準(zhǔn)序列總核酸數(shù)不超過(guò)5％的數(shù)目的核苷酸。標(biāo)準(zhǔn)序列的這些突變可發(fā)生在標(biāo)準(zhǔn)核苷酸序列的5′或3′末端位置，也可發(fā)生在這些末端位置之間的任何地方，它們或者是在標(biāo)準(zhǔn)序列內(nèi)核苷酸序列之間分散存在，或者是在標(biāo)準(zhǔn)序列內(nèi)以一個(gè)或數(shù)個(gè)連續(xù)組的形式存在。
作為一項(xiàng)實(shí)際工作，任一特定核酸分子與如圖1A-C所示的核苷酸序列或保藏cDNA克隆的核苷酸序列是否具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性可常規(guī)地利用如Bestfit程序(Wisconsin Sequence Analysis Package,575 Science Drive,Madison,WI 53711)等已知計(jì)算機(jī)程序進(jìn)行測(cè)定。Bestfit程序使用了Smith和Waterman，應(yīng)用數(shù)學(xué)進(jìn)展，2:482-489(1981)的局部同源性算法以尋找兩序列間具同源性的最佳區(qū)段。利用Bestfit或其它任何一種序列比較程序確定某一特定序列與本發(fā)明的標(biāo)準(zhǔn)序列是否具有至少如95％同一性時(shí)，參數(shù)的設(shè)置當(dāng)然是為了確保同一性百分比是相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)核苷酸序列的全長(zhǎng)計(jì)算的，并且也允許存在占標(biāo)準(zhǔn)序列的核苷酸總數(shù)不超過(guò)5％的同源性缺口。
本專利申請(qǐng)涉及與圖1A-C(SEQ ID NO:1)所示核酸序列或與保藏cDNA的核酸序列具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的核酸分子，并且毋需要求這些核酸分子是否編碼具有AIMⅡ活性的多肽。這是因?yàn)榧词鼓骋惶囟ê怂岱肿硬痪幋a具有AIMⅡ活性的多肽，本領(lǐng)域技術(shù)人員也應(yīng)知道如何利用這些核酸分子，如用作雜交探針或聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)引物。本發(fā)明中不編碼具有AIMⅡ活性的多肽的核酸分子包括如下應(yīng)用(1)從cDNA文庫(kù)中分離AIMⅡ基因或其等位基因變體；(2)如Verma等，《人類染色體基礎(chǔ)技術(shù)手冊(cè)》，Pergamon出版社，紐約(1988)所述，與中期染色體進(jìn)行原位雜交(如“FISH”)以進(jìn)行AIMⅡ基因的準(zhǔn)確染色體定位；以及Northern印跡分析以檢測(cè)特異組織中AIM mRNA表達(dá)情況。
然而，優(yōu)選的核酸分子是具有與圖1A-C(SEQ ID NO:1)所示的核酸序列或保藏cDNA的核酸序列之間存在至少90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列并且確實(shí)編碼具有AIMⅡ蛋白活性的多肽的核酸分子?！熬哂蠥IMⅡ活性的多肽”意指通過(guò)特定生物學(xué)測(cè)試，具有與本發(fā)明AIMⅡ蛋白活性相似的、但毋需完全相同的活性的多肽。例如，如同Zarres等，細(xì)胞，70:31-46(1992)所述，AIMⅡ蛋白細(xì)胞毒活性可通過(guò)propidium iodide染色分析編程性細(xì)胞死亡情況而進(jìn)行測(cè)定?；蛘?，也可通過(guò)Gavierli等，細(xì)胞生物學(xué)雜志，119:493-501(1992)所述的TUNEL染色測(cè)定AIMⅡ誘導(dǎo)的編程性細(xì)胞死亡。
簡(jiǎn)要地說(shuō)，propidium iodide染色的操作如下將組織或培養(yǎng)物來(lái)源的細(xì)胞在甲醛中固定，制成冰凍切片，再用propidium iodide進(jìn)行染色。利用共集點(diǎn)熒光顯微鏡通過(guò)propidium iodide可觀察到細(xì)胞核。通過(guò)固縮核(染色體凝集、皺縮和/或核的片段化)可示出細(xì)胞死亡情況。
當(dāng)然，由于遺傳密碼的簡(jiǎn)并性，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員很快會(huì)明白，含有與保藏cDNA的核酸序列或圖1A-C(SEQ ID NO:1)所示的核酸序列具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列的大量核酸分子也編碼“具有AIMⅡ蛋白活性”的多肽。事實(shí)上，由于這些核苷酸序列的簡(jiǎn)并性變體都編碼同樣的蛋白質(zhì)，即使不進(jìn)行上述對(duì)比測(cè)試，本領(lǐng)域技術(shù)人員也清楚這一點(diǎn)。本領(lǐng)域技術(shù)人員還明白，對(duì)于那些不是簡(jiǎn)并性變體的核酸分子，相當(dāng)一部分也能編碼具有AIMⅡ蛋白活性的多肽。這是由于本領(lǐng)域技術(shù)人員完全了解那些極少可能或不大可能顯著影響蛋白質(zhì)活性的氨基酸取代(例如，一種脂肪族氨基酸被另一種脂肪族氨基酸所取代)。
例如，Bowie J.U.等，“解譯蛋白質(zhì)序列內(nèi)的信息氨基酸取代的耐受性”，科學(xué)，247:1306-1310(1990)中記載了有關(guān)如何進(jìn)行無(wú)表型變化的氨基酸取代的規(guī)則，其中作者指出蛋白質(zhì)出人意料地能耐受氨基酸取代。載體和宿主細(xì)胞本發(fā)明也涉及含有本發(fā)明的分離DNA分子的載體、利用該重組載體進(jìn)行了遺傳學(xué)操作的宿主細(xì)胞，以及通過(guò)重組技術(shù)進(jìn)行的AIMⅡ多肽或其片段的生產(chǎn)。
該多核苷酸可與含有選擇性標(biāo)記以在宿主中進(jìn)行增殖的載體連接起來(lái)。通常質(zhì)粒載體可通過(guò)沉淀物如磷酸鈣沉淀物或具有帶電脂類的復(fù)合物導(dǎo)入宿主。如果載體是一種病毒，利用適當(dāng)?shù)陌b細(xì)胞系可在體外將其包裝起來(lái)，再轉(zhuǎn)導(dǎo)至宿主細(xì)胞中。
DNA插入片段應(yīng)與適當(dāng)?shù)膯?dòng)子有效連接，如噬菌體λPL啟動(dòng)子、大腸桿菌lac、trp和tac啟動(dòng)子、SV40早期和晚期啟動(dòng)子、逆轉(zhuǎn)錄病毒LTR啟動(dòng)子等。本領(lǐng)域技術(shù)人員也熟知適當(dāng)?shù)钠渌鼏?dòng)子。表達(dá)構(gòu)建體還含有轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)、終止點(diǎn)，以及轉(zhuǎn)錄區(qū)內(nèi)用于翻譯的核糖體結(jié)合位點(diǎn)。由此構(gòu)建體表達(dá)的成熟轉(zhuǎn)錄本的編碼區(qū)段優(yōu)選地在起始處含有翻譯起始序列，在待翻譯的多肽末端適當(dāng)位置處含有終止密碼子(UAA、UGA或UAG)。
如上所述，表達(dá)載體優(yōu)選地含有至少一個(gè)選擇性標(biāo)記。這類標(biāo)記包括用于真核細(xì)胞培養(yǎng)的新霉素抗性基因、二氫葉酸還原酶基因，用于大腸桿菌和其它細(xì)菌培養(yǎng)的四環(huán)素或氨芐青霉素抗性基因。適當(dāng)宿主的代表性例子有細(xì)菌細(xì)胞如大腸桿菌、鏈霉菌和鼠傷寒沙門氏菌細(xì)胞；真菌細(xì)胞，如酵母細(xì)胞；昆蟲細(xì)胞，如果蠅S2和Spodoptera Sf9細(xì)胞；動(dòng)物細(xì)胞，如CHO、COS和Bowes黑素瘤細(xì)胞；以及植物細(xì)胞，但并不局限于上述細(xì)胞。本領(lǐng)域熟知上述宿主細(xì)胞的適當(dāng)培養(yǎng)介質(zhì)和培養(yǎng)條件。
用于細(xì)菌的優(yōu)選載體包括可以Qiagen獲得的pQE70、pQE60和pEQ-9；可從Stratagene獲得的pBS載體、Phageseript載體、Bluescript載體、pNH8A、pNH16a、pNH18A和pNH46A；以及可從Pharmacia獲得的ptrc99a、pKK223-3、pKK233-3、pDR540和pRIT5；等等。優(yōu)選的真核生物載體有可從Stratagene獲得的pWLNEO、pSV2CAT、pOG44、pXT1和pSG；以及可從Pharmacia獲得的pSVK3、pBPV、pMSG和pSVL；等。對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，適宜的其它載體也是顯而易見的。
可通過(guò)下列方法將構(gòu)建體導(dǎo)入宿主細(xì)胞磷酸鈣沉淀轉(zhuǎn)染、DEAE-葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、陽(yáng)離子類脂介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、電擊法、轉(zhuǎn)導(dǎo)、感染或其它方法。這些方法已記載于多種標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)手冊(cè)中，如Davis等，《分子生物學(xué)基本方法》(1986)。
多肽可以修飾形式如融合蛋白形式表達(dá)，并且不僅可含有分泌信號(hào)，還可含有其它的異源性功能區(qū)。例如，可在多肽的N-末端添加含其它氨基酸特別是帶電氨基酸的區(qū)域，以便在宿主細(xì)胞內(nèi)、在純化過(guò)程中或在隨后的使用和貯存過(guò)程中提供穩(wěn)定性和持續(xù)性。另外，也可將小肽添加到多肽中以便于純化，并可在多肽的終制備前去除這類區(qū)域。將小肽添加到多肽中以分泌去除這類區(qū)域。將小肽添加到多肽中以分泌和排出多肽、提高多肽穩(wěn)定性、方便純化多肽的技術(shù)是本領(lǐng)域的熟練和常規(guī)技術(shù)。優(yōu)選的融合蛋白含有有助于蛋白質(zhì)溶解的來(lái)源于免疫球蛋白的異源區(qū)域。例如，EP-A-O 464 533(加拿大對(duì)應(yīng)號(hào)2045869)公開了含有免疫球蛋白分子恒定區(qū)的各種區(qū)段以及其它人類蛋白質(zhì)或其部分的融合蛋白。在多種情形下，融合蛋白中的Fc部分在治療和診斷中是非常有應(yīng)用價(jià)值的，并能提高如藥物動(dòng)力學(xué)特性(EP-A 0 232 262)。另一方面，在有些應(yīng)用中，最好是在通過(guò)已述的較好方法表達(dá)、檢測(cè)并純化該融合蛋白后去除其中的Fc部分。當(dāng)Fc區(qū)段被證實(shí)對(duì)于融合蛋白在治療和診斷中的應(yīng)用具有不良作用如融合蛋白用作免疫抗原時(shí)，就是如此。例如，在藥物的發(fā)掘中，人類蛋白質(zhì)如hIL-5就與Fc區(qū)段融合以達(dá)到鑒定hIL-5拮抗物的篩選試驗(yàn)的高容量目的。參見D.Bennett等，分子識(shí)別雜志，第8卷52-58(1995)和K.Johanson等，生物化學(xué)雜志，第270卷，16期9459-9471(1995)。
通過(guò)眾所周知的方法，包括硫酸銨或乙醇沉淀、酸提取、陰離子或陽(yáng)離子交換層析、磷酸纖維素層析、疏水性相互作用層析、親和層析、羥磷灰石層析及外源凝集素層析等方法，可從重組細(xì)胞培養(yǎng)物中回收和純化AIMⅡ多肽。在純化過(guò)程中，最優(yōu)選使用高效液相層析方法(“HPLC”)。本發(fā)明的多肽包括天然純化產(chǎn)物、化學(xué)合成途徑產(chǎn)生的產(chǎn)物以及從原核生物或真核生物宿主包括如細(xì)菌、酵母、更高等的植物、昆蟲和哺乳動(dòng)物細(xì)胞等通過(guò)重組技術(shù)產(chǎn)生的產(chǎn)物。根據(jù)在重組生產(chǎn)方法中應(yīng)用的宿主類型，本發(fā)明的多肽可能被糖基化，也可能未被糖基化。另外，本發(fā)明的多肽也可能含有已修飾的起始甲硫氨酸殘基，在有些情形下這是由于宿主介導(dǎo)的過(guò)程產(chǎn)生的。AIMⅡ多肽和片段本發(fā)明還提供了具有保藏cDNA所編碼的氨基酸序列或圖1A-C(SEQ ID NO:2)中的氨基酸序列的分離AIMⅡ多肽，或含有上述多肽的一個(gè)區(qū)段的肽或多肽。
本領(lǐng)域深知可改變AIMⅡ多肽的一些氨基酸序列而不顯著影響此蛋白的結(jié)構(gòu)或功能。如能仔細(xì)分析這類序列差異，應(yīng)能清楚蛋白質(zhì)中存在決定其活性的重要區(qū)域。
因此，本發(fā)明還包括具有顯著的AIMⅡ多肽活性或含有AIMⅡ蛋白區(qū)域(如下述的蛋白質(zhì)區(qū)段)的AIMⅡ多肽的變體。這類突變體包括缺失、插入、轉(zhuǎn)換、重復(fù)和類型取代。如上所述，有關(guān)何種氨基酸變化有可能無(wú)表型差異的規(guī)則可見于Bowie J.U.等，“解譯蛋白質(zhì)序列中的信息對(duì)氨基酸替換的耐受性”，科學(xué)，247:1306-1310(1990)。
因此，圖1A-C(SEQ ID NO:2)的多肽或由保藏cDNA所編碼的多肽的片段、衍生物或類似物可以是(ⅰ)其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基被保守的或非保守的氨基酸殘基(優(yōu)選保守的氨基酸殘基)所取代，這種取代的氨基酸殘基可以是、也可以不是由該遺傳密碼所編碼的氨基酸；或(ⅱ)其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基含有取代基；或(ⅲ)其中成熟多肽與另一種化合物如能提高此多肽半衰期的化合物(如聚乙二醇)相融合；或(ⅳ)其中成熟多肽中融合了其它的氨基酸，如IgG Fc融合區(qū)肽、前導(dǎo)序列、分泌性序列或可用于成熟多肽純化的序列，或蛋白原序列。這類片段、衍生物和類似物也在本文所教導(dǎo)的本領(lǐng)域技術(shù)人員的范圍之內(nèi)。
尤其引人注目的是帶電氨基酸被另一種帶電氨基酸、中性或帶負(fù)電的氨基酸所取代，后者能產(chǎn)生帶更少正電荷的蛋白質(zhì)，因而能改進(jìn)AIMⅡ蛋白的特性。極有必要能避免凝集現(xiàn)象。蛋白質(zhì)的凝集不僅會(huì)破壞活性，而且在制備藥物制劑時(shí)也會(huì)由于具有免疫原性而帶來(lái)大問題(Pinckard等，臨床實(shí)驗(yàn)免疫學(xué)，2:331-340(1967)；Robbins等，糖尿病，36:838-845(1987))；Cleland等，Crit.Rev.Therapeutic Drug CarrierSystems,10:307-377(1993))。
氨基酸的置換也可改變多肽與細(xì)胞表面受體的選擇性結(jié)合。Ostade等，自然，361:266-268(1993)中描述了某些突變能導(dǎo)致TNF-α僅與TNF受體的兩種已知類型中的一種選擇性結(jié)合。因此，本發(fā)明的AIMⅡ受體可含有一個(gè)或多個(gè)氨基酸取代、缺失或添加，這類改變可以是天然突變或人工操作的結(jié)果。
如所述，優(yōu)選影響較小的改變，如不顯著影響蛋白質(zhì)折疊或活性的保守氨基酸取代(見表1)。
表1保守氨基酸取代

通過(guò)本領(lǐng)域已知方法，如位點(diǎn)特異性誘變方法或丙氨酸掃描誘變方法(Cunningham和Wells，科學(xué)，244:1081-1085(1989))，可鑒定出本發(fā)明的AIMⅡ蛋白內(nèi)對(duì)其功能是必不可少的氨基酸。后一方法是在分子內(nèi)任何一個(gè)殘基處引入單一丙氨酸突變，然后測(cè)定由此獲得的突變體分子的生物學(xué)活性，如受體結(jié)合力，或體內(nèi)或體外增殖活性。也可通過(guò)結(jié)構(gòu)分析，如結(jié)晶過(guò)程、核磁共振或光親和標(biāo)記(Smith等，分子生物學(xué)雜志，224:899-904(1992)和deVos等，科學(xué)，255:306-312(1992))測(cè)定出對(duì)配基-受體的結(jié)合至關(guān)重要的位點(diǎn)。
優(yōu)選以分離形式提供本發(fā)明的多肽?！胺蛛x的多肽”意指從其天然環(huán)境中提取的多肽。因此，為了本發(fā)明目的，重組宿主細(xì)胞內(nèi)生產(chǎn)和包含的多肽也被認(rèn)為是“分離的”?！胺蛛x的多肽”還指已從重組宿主內(nèi)部分或基本上純化的多肽。例如，可通過(guò)Smith和Hohnson，基因，67:31-40(1988)所述的一步法基本純化重組生產(chǎn)型AIMⅡ多肽。
本發(fā)明的多肽包括由保藏cDNA編碼的多肽、圖1A-C(SEQ ID NO:2)的多肽、缺乏N-末端甲硫氨酸的圖1A-C(SEQ ID NO:2)的多肽、胞外結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域、胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域、含有全部或部分胞外和胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域但缺乏跨膜結(jié)構(gòu)域的可溶性多肽，以及與保藏cDNA編碼的多肽或圖1A-C(SEQ IDNO:2)的多肽間的同一性至少為80％、更優(yōu)選至少為90％或95％、更更優(yōu)選至少為96％、97％、98％或99％的多肽，還包括含有至少30個(gè)氨基酸、更優(yōu)選至少50個(gè)氨基酸的此類多肽的區(qū)段。
含有與AIMⅡ多肽的標(biāo)準(zhǔn)氨基酸序列具有至少如95％“同一性”的氨基酸序列的多肽意指此多肽的氨基酸序列與標(biāo)準(zhǔn)序列基本相同，只是此多肽序列在AIMⅡ多肽的標(biāo)準(zhǔn)氨基酸中每100個(gè)氨基酸可含有不多于5個(gè)氨基酸的改變。換句話說(shuō)，為了獲得含有與標(biāo)準(zhǔn)氨基酸序列具有至少95％同一性的氨基酸序列的多肽，可對(duì)標(biāo)準(zhǔn)序列中不超過(guò)5％的氨基酸殘基進(jìn)行缺失或由其它的氨基酸所取代；或者是，可將占標(biāo)準(zhǔn)序列內(nèi)總氨基酸殘基不超過(guò)5％數(shù)量的氨基酸插入至標(biāo)準(zhǔn)序列中。標(biāo)準(zhǔn)序列的這些改變可位于標(biāo)準(zhǔn)氨基酸序列的氨基或羧基末端位置，可這些末端位置之間的任何部位，它們或者單獨(dú)分散于標(biāo)準(zhǔn)序列的殘基中，或以一個(gè)或多個(gè)連續(xù)群組的形式存在于標(biāo)準(zhǔn)序列內(nèi)。
作為一項(xiàng)實(shí)際工作，可利用如Bestfit程度(WisconsinSequence analysis Package,575 Science Drive,Madison,WI53711)等已知計(jì)算機(jī)程序常規(guī)地測(cè)定任一特定多肽與如圖1A-C(SEQ ID NO:2)所示的氨基酸序列或保藏cDNA克隆所編碼的氨基酸序列是否具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性。利用Bestfit或其它任何一種序列比較程序分析某一特定序列與本發(fā)明的標(biāo)準(zhǔn)序列間是否具有至少如95％同一性時(shí)，參數(shù)的設(shè)置當(dāng)然是為了確保同一性百分比是相對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)氨基酸序列的全長(zhǎng)計(jì)算的，并且也允許存在占標(biāo)準(zhǔn)序列的氨基酸總數(shù)達(dá)5％的同源性缺口。
本文所用術(shù)語(yǔ)“AIMⅡ”多肽包括膜結(jié)合性蛋白(含有胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域及胞外結(jié)構(gòu)域)，以及保留有AIMⅡ多肽活性的截短蛋白質(zhì)。在一個(gè)實(shí)施方案中，可溶性AIMⅡ多肽含有AIMⅡ蛋白胞外結(jié)構(gòu)域的全部或部分，但缺乏能將多肽滯留于細(xì)胞膜上的跨膜區(qū)段。只要可溶性AIMⅡ能被分泌出來(lái)，它也可含有部分跨膜結(jié)構(gòu)域或部分細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域或其它序列?？稍诳扇苄訟IMⅡ多肽的N-末端融合一段異源信號(hào)肽，以便在表達(dá)可溶性AIMⅡ多肽后將其分泌出來(lái)。
利用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法，可將本發(fā)明的多肽用作SDS-PAGE凝膠或分子篩凝膠過(guò)濾柱上的分子量標(biāo)記。
另一方面，本發(fā)明提供了含有本發(fā)明多肽的含表位的區(qū)段的肽或多肽。此多肽區(qū)段的表位是本文所述多肽的免疫原性或抗原性表位。“免疫原性表位”是指整個(gè)蛋白質(zhì)作為免疫時(shí)能引發(fā)抗體反應(yīng)的蛋白質(zhì)部分，而能與抗體結(jié)合的蛋白質(zhì)分子中的區(qū)域則被稱為“抗原性表位”。蛋白質(zhì)內(nèi)免疫原性表位的數(shù)目一般比抗原性表位少。參見如Geysen等，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)，81:3998-4002(1983)。
至于含有抗原性表位的肽或多肽(即含有蛋白質(zhì)分子中能與抗體結(jié)合的區(qū)域的肽或多肽)的選擇，本領(lǐng)域熟知與部分蛋白南序列極為相似的相對(duì)較短的合成肽一般能刺激產(chǎn)生可與該部分相似的蛋白質(zhì)發(fā)生反應(yīng)的抗血清。參見如Sutcliffe H.G.,Shinnick T.M.,Green N.和Learner R.A.(1983)，“可與蛋白質(zhì)中預(yù)定位點(diǎn)發(fā)生反應(yīng)的抗體”，科學(xué)，219:660-666。能引發(fā)產(chǎn)生蛋白質(zhì)反應(yīng)性血清的肽多以蛋白質(zhì)的一級(jí)序列表示，它們可通過(guò)一套簡(jiǎn)單的化學(xué)規(guī)則確定，并且不局限于完整蛋白質(zhì)的免疫顯性區(qū)域(即免疫原性表位)或者其氨基或羧基末端。
因此，本發(fā)明中含有抗原性表位的肽和多肽可有效用于制備能與本發(fā)明多肽特異性結(jié)合的抗體，包括單克隆抗體。參見如Wilson等，細(xì)胞，37:767-778(1984)，于777頁(yè)。
本發(fā)明攜有抗原性表位的肽和多肽所含的一段序列是本發(fā)明的多肽的氨基酸序列內(nèi)所含的優(yōu)選至少7個(gè)、更優(yōu)選至少9個(gè)、最優(yōu)選至少15個(gè)左右至30個(gè)左右的氨基酸。
能用于制備AIMⅡ特異性抗體的抗原性多肽或肽的例子包括但并不局限于如下含有圖1A-C(SEQ ID NO:2)中大約第13位至大約第20位氨基酸殘基的多肽；含有圖1A-C(SEQID NO:2)中大約第23位至大約第36位氨基酸殘基的多肽；含有圖1A-C(SEQ ID NO:2)中大約第69位至大約第79位氨基酸殘基的多肽；含有圖1A-C(SEQ ID NO:2)中大約第85位至大約第94位氨基酸殘基的多肽；含有圖1A-C(SEQ IDNO:2)中大約第167位至大約第178位氨基酸殘基的多肽；含有圖1A-C(SEQ ID NO:2)中大約第184位至大約第196位氨基酸殘基的多肽；以及含有圖1A-C(SEQ ID NO:2)中大約第221位至大約第233位氨基酸殘基的多肽。如上所述，本發(fā)明人已確定上述多肽片段是AIMⅡ蛋白的抗原性區(qū)域。
可通過(guò)任何傳統(tǒng)途徑生產(chǎn)本發(fā)明攜有表位的肽和多肽。Houghten R.A.(1985)，“快速固相合成大量多肽的一般方法抗原-抗體反應(yīng)在單個(gè)氨基酸水平上的特異性”，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)，82:5131-5135。這種“多個(gè)多肽同時(shí)合成(SMPS)”途徑被進(jìn)一步描述于Houghten等的美國(guó)專利號(hào)4,631,211中。
可將本發(fā)明的AIMⅡ多肽用于治療誘發(fā)淋巴結(jié)病的淋巴組織增生性疾病。由于AIMⅡ可通過(guò)刺激T-細(xì)胞的克隆缺失進(jìn)而介導(dǎo)編程性細(xì)胞死亡，因而，可將AIMⅡ應(yīng)用于治療自身免疫疾病、刺激周邊耐受性和T-細(xì)胞介導(dǎo)的具細(xì)胞毒性的編程性細(xì)胞死亡過(guò)程。也可將AIMⅡ用作研究工具，以闡明自身免疫紊亂和過(guò)敏反應(yīng)的生物學(xué)機(jī)制，并治療移植物抗宿主疾病，所述自身免疫紊亂包括系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)、免疫增生性疾病、淋巴結(jié)病(IPL)、血管免疫增生性淋巴結(jié)病(AIL)、淋巴母細(xì)胞性淋巴結(jié)病(IBL)、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、糖尿病和多發(fā)性硬化癥。
也可將本發(fā)明的AIMⅡ多肽用來(lái)抑制腫瘤，如腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)。AIMⅡ多肽可能通過(guò)編程性細(xì)胞死亡和對(duì)某些細(xì)胞的細(xì)胞毒作用而對(duì)腫瘤的破壞起著一定的作用。由于AIMⅡ能刺激內(nèi)皮來(lái)源細(xì)胞的增殖，因而也可將AIMⅡ用于治療一些需生長(zhǎng)促進(jìn)活性的疾病，如再狹窄性疾病。并且，AIMⅡ也可用于調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)育過(guò)程中的造血功能。
本發(fā)明還提供了鑒定能與AIMⅡ結(jié)合的分子如受體分子的方法。通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的眾多方法，如配基選擇和FACS分類，可鑒定出編碼能與AIMⅡ結(jié)合的蛋白質(zhì)如受體蛋白的基因。在許多實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)如Coligan等，免疫學(xué)現(xiàn)代方法，1(2)第5章(1991)中，都記載有這類方法。
例如，為了此目的，可使用表達(dá)克隆法。為達(dá)此目的，首先從對(duì)AIMⅡ具有反應(yīng)的細(xì)胞中制備聚腺苷酸化的RNA，從此RNA構(gòu)建cDNA文庫(kù)，將文庫(kù)分成幾組，再分別轉(zhuǎn)化對(duì)AIMⅡ無(wú)反應(yīng)的細(xì)胞。然后將轉(zhuǎn)化細(xì)胞與標(biāo)記AIMⅡ混合處理。(AIMⅡ的標(biāo)記可通過(guò)多種熟知技術(shù)，包括放射性碘處理或包含位點(diǎn)特異性蛋白激酶識(shí)別位點(diǎn)等標(biāo)準(zhǔn)方法。)處理后，固定細(xì)胞，并測(cè)定AIMⅡ的結(jié)合率。此方法可在載玻片上簡(jiǎn)便進(jìn)行。
鑒定出含有能產(chǎn)生AIMⅡ結(jié)合性細(xì)胞的cDNA的各組。將這些陽(yáng)性組分成亞組，再按上述方法轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞并進(jìn)行篩選。通過(guò)這種重復(fù)性亞分組-重新篩選(sub-pooling and re-screening)過(guò)程，可分離出編碼推定的結(jié)合分子如受體分子的一個(gè)或多個(gè)單克隆。
或者是將經(jīng)標(biāo)記的配基與細(xì)胞提取物如膜或膜提取物進(jìn)行光親合性連接，這種細(xì)胞提取物是從能表達(dá)可與該配基結(jié)合的分子如受體分子的細(xì)胞中制備的。通過(guò)聚丙烯酰胺凝膠電泳(“PAGE”)分離交聯(lián)物質(zhì)，再對(duì)X-光膠片進(jìn)行曝光。切下含有配基-受體的標(biāo)記復(fù)合物，將其裂解為肽片段，再進(jìn)行蛋白質(zhì)微量測(cè)序。利用從微量測(cè)序結(jié)果中獲得的氨基酸序列，可設(shè)計(jì)出特異性或簡(jiǎn)并性寡核苷酸探針，以對(duì)cDNA文庫(kù)進(jìn)行篩選，鑒定出編碼推定的受體分子的基因。
也可將本發(fā)明的受肽用于驗(yàn)證細(xì)胞或無(wú)細(xì)胞制備物中的AIMⅡ結(jié)合性分子如受體分子結(jié)合AIMⅡ的能力。
本領(lǐng)域技術(shù)人員深知，可將本發(fā)明的AIMⅡ多肽或上述的其含表位的片段與免疫球蛋白(IgG)恒定結(jié)構(gòu)域的一部分相組合產(chǎn)生嵌合多肽。這類融合蛋白可便于純化，并在體內(nèi)具有更長(zhǎng)的半衰期。如含有人CD4多肽前兩個(gè)結(jié)構(gòu)域和哺乳動(dòng)物免疫球蛋白重鏈或輕鏈的恒定區(qū)內(nèi)各個(gè)結(jié)構(gòu)域的嵌合蛋白就體現(xiàn)了上述特點(diǎn)(EPA394,827；Traunecker等，自然，331:84-86(1988))。由于IgG部分而具有二硫鍵連接的雙體結(jié)構(gòu)的融合蛋白與單體AIMⅡ蛋白或單獨(dú)的蛋白片段相比，前者也能更有效結(jié)合和中和其它分子(Fountoulakis等，生物化學(xué)雜志，270:3958-3964(1995))。
本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)AIMⅡ在脾臟、胸腺和骨髓組織中都有表達(dá)。對(duì)一系列紊亂如敗血癥性休克、炎癥、腦型瘧、HIV病毒的活化、移植物-宿主排斥性、骨吸收、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和惡病質(zhì)而言，在具有這類紊亂的個(gè)體的某些組織(如脾臟、胸腺和骨髓組織)或體液(如血清、細(xì)胞液、尿液、滑液或脊柱液)中，能檢測(cè)到明顯高于或低于“標(biāo)準(zhǔn)”AIMⅡ基因表達(dá)水平的AIMⅡ基因的表達(dá)，其中“標(biāo)準(zhǔn)”AIMⅡ基因表達(dá)水平即為不具有這類紊亂的個(gè)體的組織或體液中AIMⅡ的表達(dá)水平。因此，本發(fā)明提供了一種在紊亂診斷過(guò)程中非常有用的診斷方法，這種方法包括(a)測(cè)定個(gè)體的細(xì)胞或體液中AIMⅡ基因表達(dá)水平；(b)將測(cè)得的AIMⅡ基因表達(dá)水平與標(biāo)準(zhǔn)AIMⅡ基因表達(dá)水平進(jìn)行比較，其中測(cè)得的AIMⅡ基因表達(dá)水平高于或低于標(biāo)準(zhǔn)表達(dá)水平都表明存在某種紊亂。AIMⅡ激動(dòng)劑和拮抗劑本發(fā)明也提供了篩選化合物以鑒定出能增強(qiáng)或阻抑AIMⅡ?qū)?xì)胞的作用如與AIMⅡ結(jié)合性分子(如受體分子)的相互作用的化合物的方法。激動(dòng)劑是能增強(qiáng)AIMⅡ天然生物學(xué)功能或以類似于AIMⅡ的方式發(fā)揮作用的化合物；而拮抗劑則能降低或消除這類功能。
例如，從表達(dá)可結(jié)合AIMⅡ的分子如由AIMⅡ通過(guò)信號(hào)或調(diào)節(jié)途徑調(diào)控的分子的細(xì)胞中可制備細(xì)胞組分，如膜制備物。在缺乏或存在待測(cè)分子(該待測(cè)分子可能是AIMⅡ的激動(dòng)劑或拮抗劑)的情況下將制備物與已標(biāo)記的AIMⅡ一起保溫。標(biāo)記配基結(jié)合力的降低水平反映了待測(cè)分子與結(jié)合性分子或AIMⅡ本身相結(jié)合的能力。能“無(wú)償”結(jié)合即與AIMⅡ結(jié)合性分子結(jié)合時(shí)不會(huì)誘導(dǎo)AIMⅡ反應(yīng)的分子最有可能是好的拮抗劑。能很好結(jié)合并且作用效果與AIMⅡ相同或密切相關(guān)的分子是好的激動(dòng)劑。
例如，通過(guò)潛在激動(dòng)劑或拮抗劑與細(xì)胞或適當(dāng)?shù)募?xì)胞制備物間的相互作用而測(cè)定第二信使系統(tǒng)的活性，并與AIMⅡ或具有與AIMⅡ相同功能的分子的活性相比較，可測(cè)出待測(cè)分子的AIMⅡ相似性活性。在這方面，有效的第二信使系統(tǒng)包括但不限于AMP鳥苷酸環(huán)化酶、離子通道或磷酸肌醇水解第二信使系統(tǒng)。
AIMⅡ拮抗劑測(cè)試法的另一個(gè)例子是競(jìng)爭(zhēng)性測(cè)試法，這種測(cè)試方法是在適于競(jìng)爭(zhēng)抑制測(cè)試的適當(dāng)條件下，將AIMⅡ和潛在拮抗劑與膜結(jié)合的AIMⅡ受體分子或重組AIMⅡ受體分子相組合?？赏ㄟ^(guò)如放射性活性等對(duì)AIMⅡ進(jìn)行標(biāo)記，以便能準(zhǔn)確測(cè)定與受體分子結(jié)合的AIMⅡ分子的數(shù)量，從而估計(jì)該潛在拮抗劑的效果。
潛在的拮抗劑包括能與本發(fā)明的多肽結(jié)合從而能抑制或消除其活性的一些小的有機(jī)分子、肽、多肽和抗體。潛在的拮抗劑也可以是能與結(jié)合性分子如受體分子的相同位點(diǎn)結(jié)合而不誘導(dǎo)出AIMⅡ誘導(dǎo)性活性、因而通過(guò)阻止AIMⅡ的結(jié)合而抑制AIMⅡ的作用的一些小的有機(jī)分子、肽或多肽，如密切相關(guān)的蛋白質(zhì)或抗體。
其它潛在的拮抗劑包括反義分子?？赏ㄟ^(guò)反義DNA或反義RNA或通過(guò)三聯(lián)體螺旋形成而利用反義技術(shù)控制基因表達(dá)。反義技術(shù)已被記載于如Okano，神經(jīng)化學(xué)雜志，56:560(1991)；《用作基因表達(dá)反義抑制劑的寡脫氧核苷酸》，CRC Press,BocaRaton,RL(1988)。三聯(lián)體螺旋形成記載于如Lee等，核酸研究，6:3073(1979)；Cooney等，科學(xué)，241:456(1988)；以及Dervan等，科學(xué)，251:1360(1991)。這些方法都是基于多核苷酸與互補(bǔ)性DNA或RNA的結(jié)合。例如，可利用編碼本發(fā)明成熟多肽的多核苷酸的5′編碼區(qū)，設(shè)計(jì)長(zhǎng)度約10～40個(gè)堿基對(duì)的反義RN寡核苷酸。DNA寡核苷酸設(shè)計(jì)為與參與轉(zhuǎn)錄的基因區(qū)互補(bǔ)，因而可抑制AIMⅡ的轉(zhuǎn)錄和生成。反義RNA寡核苷酸與體內(nèi)mRNA雜交，從而阻斷mRNA分子翻譯為AIMⅡ多肽的過(guò)程。也可將上述寡核苷酸導(dǎo)入至細(xì)胞內(nèi)以便在體內(nèi)表達(dá)該反義RNA或DNA，從而抑制AIMⅡ的生成。
可將拮抗劑與藥用載體(如后述)一起制成組合物進(jìn)行應(yīng)用。
例如，可將拮抗劑用于治療惡病質(zhì)，這種病是由于脂蛋白脂肪酶的系統(tǒng)性缺乏導(dǎo)致的類脂清除缺陷，據(jù)稱這種脂蛋白脂肪酶可被AIMⅡ抑制。也可將AIMⅡ拮抗劑用于治療腦型瘧，AIMⅡ可能在此病中具有病理學(xué)作用。也可應(yīng)用此拮抗劑治療是類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，這是通過(guò)抑制AIMⅡ誘導(dǎo)的炎癥因子如滑膜細(xì)胞內(nèi)的IL1的產(chǎn)生而進(jìn)行的。在治療關(guān)節(jié)炎時(shí)，優(yōu)選將AIMⅡ拮抗劑注入關(guān)節(jié)內(nèi)。
也可利用AIMⅡ拮抗劑，通過(guò)阻止免疫系統(tǒng)的刺激而預(yù)防移植物存在時(shí)發(fā)生的移植物-宿主排斥反應(yīng)。
也可利用AIMⅡ拮抗劑抑制骨吸收，因而治療和/或預(yù)防骨質(zhì)疏松癥。
也可將拮抗劑用作抗炎癥試劑，并治療內(nèi)毒素性休克。這種危險(xiǎn)狀態(tài)起因于對(duì)細(xì)菌或其它類型感染作出的超常反應(yīng)。癌癥預(yù)測(cè)與相應(yīng)的“正?！辈溉閯?dòng)物相比，患有癌癥的哺乳動(dòng)物的某些組織表達(dá)AIMⅡ蛋白和編碼AIMⅡ蛋白的mRNA的水平顯著降低。正常哺乳動(dòng)物即是指與患癌哺乳動(dòng)物屬同一種類的不患癌癥的個(gè)體。另外，與屬同一種類但不患癌癥的哺乳動(dòng)物的血清相比，在患有癌癥的哺乳動(dòng)物的某些體液(如血清、胞質(zhì)、尿液和脊柱液)中測(cè)到的AIMⅡ水平明顯降低。因此，本發(fā)明提供了可在腫瘤診斷中有效應(yīng)用的診斷方法，這種方法包括測(cè)定哺乳動(dòng)物細(xì)胞或體液中編碼AIMⅡ蛋白的基因的表達(dá)水平，并將測(cè)得的基因表達(dá)水平與標(biāo)準(zhǔn)AIMⅡ基因表達(dá)水平相比較，如果測(cè)得的基因表達(dá)水平低于標(biāo)準(zhǔn)即表明患有某種腫瘤。
按照常規(guī)方法已能進(jìn)行腫瘤診斷時(shí)，本發(fā)明可有效用作預(yù)測(cè)指示劑，其中具有強(qiáng)化AIMⅡ基因表達(dá)的病人比基因表達(dá)水平更低的病人的臨床效果可能要更好一些。
“測(cè)定編碼AIMⅡ蛋白的基因的表達(dá)水平”意指直接地(如通過(guò)測(cè)定或估計(jì)蛋白質(zhì)水平或mRNA水平的絕對(duì)量)或相對(duì)地(如通過(guò)與第二種生物樣品的AIMⅡ蛋白水平或mRNA水平相比較)定性或定量地測(cè)定或估計(jì)第一種樣品中AIMⅡ蛋白水平或編碼AIMⅡ蛋白的mRNA的水平。
優(yōu)選地，測(cè)定或估計(jì)第一種生物樣品內(nèi)AIMⅡ蛋白水平或mRNA水平并與標(biāo)準(zhǔn)AIMⅡ蛋白水平或mRNA水平相比較，此標(biāo)準(zhǔn)值是從得自未長(zhǎng)癌的個(gè)體的第二種生物樣品中測(cè)得的。本領(lǐng)域深知，一旦已測(cè)得標(biāo)準(zhǔn)AIMⅡ蛋白水平或mRNA水平，即可將該值重復(fù)用作比較標(biāo)準(zhǔn)。
“生物樣品”意指得自含有AIMⅡ蛋白或mRNA的個(gè)體、細(xì)胞系、組織培養(yǎng)物或其它來(lái)源的任何生物樣品。生物樣品包括含有分泌的成熟AIMⅡ蛋白的哺乳動(dòng)物體液(如血清、胞質(zhì)、尿液、滑液和脊柱液)，以及卵巢、前列腺、心臟、胎盤、胰臟、肝、脾、肺、胸和臍組織。
本發(fā)明可有效用于哺乳動(dòng)物的癌癥診斷中。本發(fā)明尤其可有效用于哺乳動(dòng)物內(nèi)下列各類器官的癌癥的診斷中胸、卵巢、前列腺、骨、肝、肺、胰和脾。優(yōu)選的哺乳動(dòng)物包括猴、猿、貓、狗、牛、豬、馬、兔和人類。尤其優(yōu)選人類。
利用Chomczynski和Sacchi，生物化學(xué)年鑒(Anal.Biochem.),162:156-159(1987)記載的硫氰酸胍-苯酚-氯仿一步法可從生物樣品中分離總細(xì)胞RNA。然后利用適當(dāng)?shù)姆椒y(cè)定編碼AIMⅡ蛋白的mRNA的水平。這些方法包括Northern印跡分析(Harada等，細(xì)胞，63:303-312(1990))、S1核酸酶作圖(Fujita等，細(xì)胞，49:357-367(1987))、聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)、逆轉(zhuǎn)錄與聚合酶鏈反應(yīng)的組合(RT-PCR)(Makino等，技術(shù)，2:295-301(1990))，以及逆轉(zhuǎn)錄與連接酶鏈反應(yīng)的組合(RT-LCR)。
利用基于抗體的技術(shù)可測(cè)定生物樣品中AIMⅡ蛋白的水平。例如，通過(guò)傳統(tǒng)的免疫組織學(xué)方法(Jalkanen M.等，細(xì)胞生物學(xué)雜志，101:976-985(1985)；Jalkanen M.等，細(xì)胞生物學(xué)雜志，105:3087-3096(1987))，可研究組織中AIMⅡ蛋白的表達(dá)情況。
其它可有效用于AIMⅡ蛋白基因表達(dá)測(cè)定的基于抗體的方法包括免疫測(cè)定，如酶連免疫吸附測(cè)定(ELISA)和放射免疫測(cè)定(RIA)。
本領(lǐng)域熟知各種適用標(biāo)記，它們包括酶標(biāo)記如葡萄糖氧化酶，放射性同位素如碘(125I、121I)、碳(14C)、硫(35C)、氚(3H)、銦(112In)和锝(99mTc)，以及熒光標(biāo)記如熒光素、若丹明和生物素。療法可將AIMⅡ多肽尤其是人AIMⅡ多肽用于治療瘤形成、淋巴結(jié)病、自身免疫疾病、移植物抗宿主疾病。另外，本發(fā)明的AIMⅡ多肽也可用于抑制瘤生成，如腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。AIMⅡ多肽可能通過(guò)編程性細(xì)胞死亡和對(duì)某些細(xì)胞的細(xì)胞毒作用而參與破壞腫瘤。由于AIMⅡ?qū)?nèi)皮來(lái)源的細(xì)胞具有增殖效果，故也可將AIMⅡ用于需生長(zhǎng)促進(jìn)活性的疾病治療中，如再狹窄。因此，也可將AIMⅡ用于調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)育過(guò)程中的造血功能。給藥方式應(yīng)該明白，上述病癥可通過(guò)服用AIMⅡ蛋白而得到治療。因此，本發(fā)明還提供了治療需提高AIMⅡ活性水平的個(gè)體的方法，這種方法包括給這類個(gè)體服用含有有效量的本發(fā)明的分離AIMⅡ多肽、特別是AIMⅡ的成熟形式的藥用組合物，以有效提高這種個(gè)體體內(nèi)的AIMⅡ活性水平。
盡管如上所述可根據(jù)治療需要靈活掌握用量，但作為一般建議，經(jīng)胃腸外服用的AIMⅡ多肽的總治療有效量每劑為大約1μg/kg病人體重/天～10mg/kg病人體重/天。此劑量更加優(yōu)選為至少0.01mg/kg/天，對(duì)人類最優(yōu)選此激素服用劑量為大約0.01～1mg/kg/天。如果持續(xù)給藥，通常可通過(guò)每天1～4次注射或連續(xù)性皮下輸液(如利用微型泵)完成，其中AIMⅡ多肽服用的劑量速率為大約1μg/kg/hour～50μg/kg/hour。也可使用靜脈內(nèi)包溶液。
含有本發(fā)明的AIMⅡ的藥用組合物可通過(guò)口服給藥、直腸內(nèi)給藥、胃腸外給藥、腦池內(nèi)給藥、陰道內(nèi)給藥、腹膜內(nèi)給藥、局部給藥(通過(guò)粉末、軟膏、滴劑或表皮貼片)、頰部(bucally)給藥或通過(guò)口腔或鼻腔噴霧劑給藥。“藥用載體”意指無(wú)毒的固體、半固體或液體配方、稀釋劑、膠囊類物質(zhì)或任何類型的制劑輔劑。本文所用術(shù)語(yǔ)“胃腸外的”意指包括靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、腹膜內(nèi)、胸骨內(nèi)、皮下和關(guān)節(jié)內(nèi)注射和輸液等的給藥方式。
除可使用可溶性AIMⅡ多肽外，也可使用通過(guò)加入去污劑如曲拉通X-100和緩沖液而適當(dāng)溶解了的含有跨膜區(qū)的AIMⅡ多肽。染色體檢測(cè)本發(fā)明的核酸分子在染色體鑒定工作中也是很有價(jià)值的。此序列可特異性導(dǎo)向至人個(gè)體染色體的特定位點(diǎn)并與其雜交。按照本發(fā)明，將DNA定位于染色體上是在聯(lián)系序列與疾病相關(guān)基因時(shí)非常重要的首要步驟。
在這方面的某些優(yōu)選實(shí)施方案中，可利用本文所公開的cDNA克隆AIMⅡ蛋白的基因組DNA。利用本領(lǐng)域熟知的多種技術(shù)和文庫(kù)即可完成此項(xiàng)工作。這些文庫(kù)一般可商購(gòu)。然后，通過(guò)本領(lǐng)域熟知的可進(jìn)行原位染色體作圖的技術(shù)，利用此基因組DNA進(jìn)行原位染色體作圖。
另外，在某些情況下，通過(guò)從cDNA制備PCR引物(優(yōu)選15-25bp)可將序列定位在染色體上。通過(guò)計(jì)算機(jī)分析該基因的3′非翻譯區(qū)，可快速挑選出并不跨越基因組DNA中一個(gè)以上外顯子的引物，因而可使擴(kuò)增過(guò)程復(fù)雜化。然后，利用這些引物，對(duì)含有人個(gè)體染色體的體細(xì)胞雜合體進(jìn)行PCR篩選。
利用cDNA克隆對(duì)中期染色體進(jìn)行熒光原位雜交(“FISH”)可一步提供精確的染色體定位。該項(xiàng)技術(shù)中可使用來(lái)自cDNA的短至50或60bp的探針。有關(guān)該技術(shù)的綜述參見Verma等，人類染色體基礎(chǔ)技術(shù)手冊(cè)，Pergamon Press，紐約(1988)。
一旦一個(gè)序列已定位于染色體上某一精確位點(diǎn)時(shí)，即可將此序列在染色體上的物理位置與遺傳圖譜數(shù)據(jù)聯(lián)系起來(lái)。這類數(shù)據(jù)可見于如V.McKusick，《人類孟德爾遺傳》，通過(guò)與Johns HopkinsUniversity,Welch Medical Library聯(lián)機(jī)獲得。再通過(guò)連鎖分析(物理上鄰接基因的共遺傳)對(duì)已定位于同一染色體區(qū)的基因和疾病之間的關(guān)系進(jìn)行鑒定。
接著，有必要對(duì)感染個(gè)體與未感染個(gè)體的cDNA或基因組序列之間的差異進(jìn)行分析測(cè)定。若在一些或全部感染個(gè)體內(nèi)觀察到突變的存在，而在任何正常個(gè)體中均未發(fā)現(xiàn)突變，那么，這種突變很可能是該病的病因。
上面已對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了一般性描述，下述實(shí)施例將有助于更好地理解本發(fā)明，這些實(shí)施例是以舉例方式提供的，但并不用來(lái)限制本發(fā)明。實(shí)施例實(shí)施例1在大腸桿菌內(nèi)表達(dá)和純化AIMⅡA．帶有N-末端HA標(biāo)記的AIMⅡ的表達(dá)利用特異于AIMⅡ蛋白氨基末端序列及此基因的3′側(cè)的載體序列的PCR寡核苷酸引物，擴(kuò)增出保藏cDNA克隆內(nèi)編碼AIMⅡ蛋白的DNA序列。分別在5′和3′序列中添加了含有便于克隆的限制性位點(diǎn)的額外的核苷酸。
利用下述引物可表達(dá)一個(gè)22kDa的AIMⅡ蛋白片段(缺乏N-末端和跨膜區(qū))5′寡核苷酸引物的序列為5′GCGGGATCCGGAGAGATGGTCACC3′(SEQ ID NO:3)，它對(duì)應(yīng)于圖1A-C(SEQ ID NO:1)中AIMⅡ蛋白編碼序列內(nèi)第244-258位核苷酸，并在其中含有一個(gè)由下劃線標(biāo)出的BamHⅠ限制性位點(diǎn)；3′引物的序列為5′CGCAAGCTTCCTTCACACCATGAAAGC3′(SEQ ID NO:8)，它含有一個(gè)由下劃線標(biāo)出的HindⅢ限制性位點(diǎn)及緊隨其后的圖1A-C中所示第756-783位核苷酸。
通過(guò)下述引物可表達(dá)完整AIMⅡ蛋白5′寡核苷酸引物的序列為5′GACCGGATCC ATG GAG GAGAGT GTC GTA CGG C3′(SEQ ID NO:9)，它對(duì)應(yīng)于圖1A-C(SEQ ID NO:1)中AIMⅡ蛋白編碼序列內(nèi)22個(gè)核苷酸，并在其中含有一個(gè)由下列劃線標(biāo)出的BamHⅠ限制性位點(diǎn)；3′引物的序列為5′CGCAAGCTT CCT TCA CAC CAT GAAAGC3′(SEQ ID NO:10)，它含有一個(gè)由下劃線標(biāo)出的HindⅢ限制性位點(diǎn)及緊隨其后的圖1A-C中所示第756-783位核苷酸。
這些限制性位點(diǎn)與細(xì)菌表達(dá)載體pQE9內(nèi)的限制性酶切位點(diǎn)是相匹配的，可在這些實(shí)施例中用于細(xì)菌的表達(dá)。(Qiagen,Ine.9259 Eton Avenue,Chatsworth,CA,91311)。pQE9編碼氨芐青霉素抗生素抗性(“Ampr”)，并含有一個(gè)細(xì)菌復(fù)制起點(diǎn)(“ori”)，一個(gè)IPTG誘導(dǎo)型啟動(dòng)子、一個(gè)核糖體結(jié)合位點(diǎn)(“RBS”)、一個(gè)6-His標(biāo)記以及一些限制性酶切位點(diǎn)。
利用BamHⅠ和HindⅢ消化經(jīng)擴(kuò)增的AIMⅡ DNA和載體pQE9，然后將這些已消化的DNA連接在一起。在已經(jīng)限制性切割的pQE9載體內(nèi)插入AIMⅡ蛋白DNA后，AIMⅡ蛋白編碼區(qū)被置于載體內(nèi)IPTG誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的下游，并與其有效相連，而且，AIMⅡ蛋白編碼區(qū)的插入位置使其與適當(dāng)放置以便于AIMⅡ蛋白翻譯的起始AUG密碼子讀框一致。B．具有C-末端HA標(biāo)記的AIMⅡ的表達(dá)本實(shí)施例中使用細(xì)菌表達(dá)載體pQE60進(jìn)行細(xì)菌表達(dá)。(QIAGEN,Inc..9259 Eton Avenue,Chatsworth,CA,91311)。pQE60編碼氨芐青霉素抗生素抗性(“Ampr”)，并含有一個(gè)細(xì)菌復(fù)制起點(diǎn)(“ori”)、一個(gè)IPTG誘導(dǎo)型啟動(dòng)子、一個(gè)核糖體結(jié)合位點(diǎn)(“RBS”)、編碼組氨酸殘基的六個(gè)密碼子，以及適當(dāng)?shù)膯我幌拗菩悦盖形稽c(diǎn)，其中所述的組氨酸殘基可允許通過(guò)利用QIAGEN公司(公司地址同前)所售鎳-次氮基三乙酸(“Ni-NTA”)親和樹脂進(jìn)行親和純化。這些元件排列的方式能保證編碼多肽的DNA片段插入后所表達(dá)的多肽在其羧基末端可共價(jià)連接6個(gè)組氨酸殘基(即“6×His標(biāo)記”)。
利用分別可與所需的AIMⅡ蛋白區(qū)段的氨基末端序列及保藏構(gòu)建體中cDNA編碼序列的3′側(cè)的序列可退火的PCR寡核苷酸引物，從保藏cDNA克隆中擴(kuò)增編碼所需的AIMⅡ蛋白區(qū)段的DNA序列。在5′和3′序列中分別添加了含有可便于克隆至pQE60載體的限制性位點(diǎn)的額外核苷酸。
為了克隆蛋白質(zhì)，所用5′引物的序列為5′GACGC CCATGGAG GAG GAG AGT GTC GTA CGC C3′(SEQ ID NO:17)，此序列中含有由下劃線標(biāo)出的NcoⅠ限制性位點(diǎn)，其后為可與圖1A-C中AIMⅡ序列的氨基末端編碼序列互補(bǔ)的核苷酸。當(dāng)然，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員深知，可改變蛋白質(zhì)編碼序列內(nèi)5′引物起始位點(diǎn)，以擴(kuò)增編碼完整蛋白質(zhì)中任何所需區(qū)段的DNA片段(更短或更長(zhǎng))。3′引物的序列為5′GACC GGATCC CAC CAT GAA AGCCCC GAA GTA AG3′(SEQ ID NO:18)，此序列中含有由下劃線標(biāo)出的BamHⅠ限制性位點(diǎn)，其后為可與圖1A-C中AIMⅡDNA序列內(nèi)終止密碼子前的編碼序列3′-末端互補(bǔ)的核苷酸，編碼序列與限制性位點(diǎn)排列的方式能確保其讀框與pQE60載體內(nèi)6個(gè)His密碼子的讀框一致。
利用BamHⅠ和NcoⅠ消化擴(kuò)增的AIMⅡ DNA片段及載體pQE60，然后將已消化的DNA連接在一起。將AIMⅡ DNA插入于已限制性消化的pQE60載體中使AIMⅡ蛋白編碼區(qū)置于IPTG誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的下游，并與起始密碼子AUG和其中的6個(gè)組氨酸密碼子讀框一致。
利用標(biāo)準(zhǔn)方法，將上述A或B中制成的含有HA標(biāo)記的表達(dá)構(gòu)建體的連接混合物轉(zhuǎn)化至感受態(tài)大腸桿菌細(xì)胞中。Sambrook等，《分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》，第二版，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，冷泉港，紐約(1989)中記載了這類方法。將含有多拷貝質(zhì)粒pREP4的大腸桿菌M15/rep4菌株用于進(jìn)行本文所述的實(shí)施例，其中，所述質(zhì)粒pREP4可表達(dá)lac阻遏子，并賦予卡那霉素抗性(“Kanr”)。該菌株僅是可適用于表達(dá)AIMⅡ蛋白的多種菌株中的一種，它可購(gòu)自Qiagen公司。
通過(guò)在含有氨芐青霉素和卡那霉素的LB平板上的生長(zhǎng)能力鑒定出轉(zhuǎn)化體。從抗性菌落中提取質(zhì)粒DNA，再通過(guò)限制性酶切分析確證克隆DNA的同一性。
在添加有氨芐青霉素(100μg/ml)和卡那霉素(25μg/ml)的液體LB培養(yǎng)基中過(guò)夜(“O/N”)培養(yǎng)含有所需構(gòu)建體的克隆。
按約1∶100至1∶250的衡釋度，將O/N培養(yǎng)物接種至大量培養(yǎng)物中。培養(yǎng)細(xì)胞至600nm處的光密度值(“OD600”)為0.4～0.6，然后加入異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(“IPTG”)至終濃度為1mM，以通過(guò)滅活lacⅠ阻遏子而誘導(dǎo)從lac阻遏子敏感性啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄。隨后進(jìn)一步培養(yǎng)細(xì)胞3至4小時(shí)。然后，通過(guò)離心收集細(xì)胞，并通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)方法裂解細(xì)胞。利用常規(guī)收集技術(shù)從裂解細(xì)胞內(nèi)純化包涵體，再將包涵體內(nèi)的蛋白質(zhì)溶解于8M尿素中。在2×磷酸緩沖鹽溶液(“PBS”)中將含有已溶解的蛋白質(zhì)的8M尿素溶液過(guò)一個(gè)PD-10柱，由此去除尿素，更換緩沖液，并使蛋白質(zhì)重新折疊。再通過(guò)另一個(gè)步驟-層析，對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)一步純化以除去內(nèi)毒素。然后，進(jìn)行無(wú)菌過(guò)濾。將無(wú)菌過(guò)濾的蛋白質(zhì)制備液以95μ/ml的濃度保存于2×PBS中。C．不含有HA標(biāo)記的AIMⅡ蛋白的表達(dá)和純化本實(shí)施例中使用細(xì)菌表達(dá)載體pQE60進(jìn)行細(xì)菌表達(dá)。(QIAGEN,Inc..9259 Eton Avenue,Chatsworth,CA,91311)。pQE60編碼氨芐青霉素抗生素抗性(“Ampr”)，并含有一個(gè)細(xì)菌復(fù)制起點(diǎn)(“ori”)、一個(gè)IPTG誘導(dǎo)型啟動(dòng)子、一個(gè)核糖體結(jié)合位點(diǎn)(“RBS”)、編碼組氨酸殘基的六個(gè)密碼子，以及適當(dāng)?shù)膯我幌拗菩悦盖形稽c(diǎn)，其中所述的組氨酸殘基可允許通過(guò)利用QIAGEN公司(公司地址同前)所售鎳-次氮基三乙酸(“Ni-NTA”)親和樹脂進(jìn)行親和純化。這些元件排列的方式能保證編碼多肽的DNA片段插入后所表達(dá)的多肽在其羧基末端可共價(jià)連接6個(gè)組氨酸殘基(即“6×His標(biāo)記”)。然而，此實(shí)施例中，該多肽編碼序列的插入方式使這六個(gè)組氨酸密碼子不能被翻譯，因而產(chǎn)生的多肽并不含有6×His標(biāo)記。
利用分別可與所需的AIMⅡ蛋白區(qū)段的氨基末端序列及保藏構(gòu)建體中cDNA編碼序列的3′側(cè)的序列退火的PCR寡核苷酸引物，從保藏cDNA克隆中擴(kuò)增編碼所需的缺乏疏水性前導(dǎo)序列的AIMⅡ蛋白區(qū)段的DNA序列。在5′和3′序列中分別添加了含有可便于克隆至pQE60載體的限制性位點(diǎn)的額外核苷酸。
為了克隆蛋白質(zhì)，所用5′引物的序列為5′GACGC CCATGGAG GAG GAG AGT GTC GTA CGC C3′(SEQ ID NO:17)，此序列中含有由下劃線標(biāo)出的NcoⅠ限制性位點(diǎn)，其后為可與圖1A-C中AIMⅡ序列的氨基末端編碼序列互補(bǔ)的核苷酸。當(dāng)然，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員深知，可改變蛋白質(zhì)編碼序列內(nèi)5′引物起始位點(diǎn)，以擴(kuò)增編碼完整蛋白質(zhì)中任何所需區(qū)段的DNA片段(更短或更長(zhǎng))。3′引物的序列為5′CGC AAGCTT CCTT CAC ACC ATGAAA GC3′(SEQ ID NO:19)，此序列中含有由下劃線標(biāo)出的HindⅢ限制性位點(diǎn)，其后為可與圖1A-C中AIMⅡ DNA序列內(nèi)3′末端非編碼序列互補(bǔ)的核苷酸。
利用HindⅢ和NcoⅠ消化擴(kuò)增獲得的AIMⅡ DNA片段及載體pQE60，然后將已消化的DNA連接在一起。將AIMⅡ DNA插入于已限制性消化的pQE60載體中使AIMⅡ蛋白編碼區(qū)及其終止密碼子一起置于IPTG誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的下游并與起始密碼子AUG讀框一致。該終止密碼子能阻止插入位點(diǎn)下游的6個(gè)組氨酸密碼子的翻譯。
利用標(biāo)準(zhǔn)方法，如Sambrook等，《分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》，第二版，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，冷泉港，紐約(1989)中所記載的那些方法，將連接混合物轉(zhuǎn)化至感受態(tài)大腸桿菌細(xì)胞中。將含有多拷貝質(zhì)粒pREP4的大腸桿菌M15/rep4菌株用于進(jìn)行本文所述的實(shí)施例，其中，所述質(zhì)粒pREP4可表達(dá)lac阻遏子，并賦予卡那霉素抗性(“Kanr”)。此菌株僅是可適用于表達(dá)AIMⅡ蛋白的多種菌株中的一種，它可購(gòu)自Qiagen公司(地址同前)。通過(guò)在含有氨芐青霉素和卡那霉素的LB平板上的生長(zhǎng)能力鑒定出轉(zhuǎn)化體。從抗性菌落中提取質(zhì)粒DNA，再通過(guò)限制性酶切分析、PCR和DNA測(cè)序確證克隆DNA的同一性。
在補(bǔ)加有氨芐青霉素(100μg/ml)和卡那霉素(25μg/ml)的液體LB培養(yǎng)基中過(guò)夜(“O/N”)培養(yǎng)含有所需構(gòu)建體的克隆。再按大約1∶25至1∶250的稀釋度，將O/N培養(yǎng)物接種至大量培養(yǎng)物中。培養(yǎng)細(xì)胞至600nm處的光密度值(“OD600”)為0.4～0.6，然后加入異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(“IPTG”)至終濃度為1mM，以通過(guò)滅活lacⅠ阻遏子而誘導(dǎo)從lac阻遏子敏感性啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄。隨后進(jìn)一步培養(yǎng)細(xì)胞3至4小時(shí)，再通過(guò)離心收集細(xì)胞。
然后，在6M鹽酸胍、pH8中，于4℃將細(xì)胞勻漿3-4小時(shí)。通過(guò)離心去除細(xì)胞碎片，在添加有200mM NaCl的50mM乙酸鈉緩沖液pH6中透析含有AIMⅡ的上清液。或者，通過(guò)在含有蛋白酶抑制劑的500mM NaCl、20％甘油、25mM Tris·HCl pH7.4中透析上清液，可成功地對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行重新折疊。復(fù)性后，蛋白質(zhì)可通過(guò)離子交換、疏水性相互作用和尺寸排阻層析進(jìn)行純化?；蛘?，可通過(guò)親和層析步驟，如利用抗體柱以獲得純的AIMⅡ蛋白。將已純化的蛋白質(zhì)貯于4℃，或凍于-80℃。實(shí)施例2在桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)內(nèi)克隆和表達(dá)AIMⅡ蛋白利用對(duì)應(yīng)于AIMⅡ基因5′和3′序列的PCR寡核苷酸引物擴(kuò)增保藏克隆中編碼全長(zhǎng)AIMⅡ蛋白的cDNA序列5′引物的序列為5′GCT CCA GGA TCC GCC ATC ATG GAGGAG AGT GTC GTA CGG C3′(SEQ ID NO:1)，它含有由下劃線標(biāo)出的BamHⅠ限制性酶切位點(diǎn)及隨后的圖1A-C中AIMⅡ蛋白序列內(nèi)的22個(gè)堿基。如下所述，插入至表達(dá)載體后，編碼AIMⅡ的擴(kuò)增片段的5′末端提供了一種有效的信號(hào)肽。如KozakM.，分子生物學(xué)雜志，196:947-950(1987)所記載的在真核細(xì)胞內(nèi)用于翻譯起始的有效信號(hào)被置于構(gòu)建體中載體區(qū)段內(nèi)的適當(dāng)位置；3′引物的序列為5′GA CGC GGT ACC GTC CAA TGC ACCACG CTC CTT CCT TC3′(SEQ ID NO:12)，它含有由下劃線標(biāo)出的Asp 718限制性位點(diǎn)及隨后的與圖1A-C中AIMⅡ內(nèi)769-795位核苷酸互補(bǔ)的核苷酸。
利用可商購(gòu)的試劑盒(“Geneclean”,BIO 101 Inc.,La Jolla,Ca.)，從1％瓊脂糖凝膠中分離擴(kuò)增片段。然后利用BamHⅠ和Asp 718消化該片段，再在1％瓊脂糖凝膠上對(duì)它進(jìn)行純化。此處將該片段命名為F2。
如Summers等，桿狀病毒載體方法和昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)手冊(cè)，Texas Agricultural Experimental Station Bulletin No.1555(1987)所述，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)方法，利用載體pA2-GP在桿狀病毒表達(dá)載體中表達(dá)AIMⅡ蛋白。此表達(dá)載體中含有苜蓿銀紋夜蛾(Autoarapha californica)核型多角體病毒(AcMNPV)的強(qiáng)多角體蛋白基因啟動(dòng)子，其后還含有便利的限制性位點(diǎn)。包括N-末端甲硫氨酸在內(nèi)的AcMNPVgp67的信號(hào)肽恰好位于BamHⅠ位點(diǎn)上游。此載體中還使用了猴病毒40(“SV40”)的聚腺苷酸化位點(diǎn)以有效完成聚腺苷酸化。為能簡(jiǎn)單進(jìn)行重組病毒的篩選，此載體中還與多角體蛋白基因啟動(dòng)子方向一致地插入了大腸桿菌來(lái)源的β-半乳糖苷酶基因，隨后是多角體蛋白基因的多聚腺苷酸化信號(hào)。多角體蛋白基因序列的兩側(cè)都含有病毒序列，以便與野生型病毒DNA進(jìn)行細(xì)胞介導(dǎo)的同源重組，從而產(chǎn)生能表達(dá)此克隆多核苷酸的活性病毒。
如本領(lǐng)域技術(shù)人員所知，只要構(gòu)建過(guò)程能提供所需的恰當(dāng)排列的用于轉(zhuǎn)錄翻譯、運(yùn)輸?shù)鹊男盘?hào)，如讀框一致的AUG和信號(hào)肽，則可利用其它多種桿狀病毒載體代替pA2-GP。這類載體與其它載體一起記載于Luckow等，病毒學(xué)，170:31-39。
通過(guò)本領(lǐng)域常規(guī)技術(shù)，利用限制性酶BamHⅠ和Asp 718消化該質(zhì)粒，再利用小牛腸道磷酸酯酶對(duì)其進(jìn)行去磷酸化。接著利用可商購(gòu)的試劑盒(“Geneclean”BIO 101 Inc.,La Jolla,Ca)，從1％瓊脂糖凝膠分離此DNA。此處將該載體DNA命名為“V”。
通過(guò)T4 DNA連接酶將片段F2和已去磷酸化的質(zhì)粒V2連接在一起。利用連接混合物轉(zhuǎn)化大腸桿菌HB101細(xì)胞，再平鋪于培養(yǎng)平板上。經(jīng)XbaⅠ消化各個(gè)菌落來(lái)源的DNA，再經(jīng)凝膠電泳分析消化產(chǎn)物，鑒定出含有攜帶人AIMⅡ基因的質(zhì)粒的細(xì)菌。通過(guò)DNA測(cè)序確證克隆片段的序列。此處將該質(zhì)粒命名為pBac AIMⅡ。
利用Felgner等，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)，84:7413-7417(1987)所述的脂質(zhì)轉(zhuǎn)染法，將5μg質(zhì)粒pBac AIMⅡ與1.0μg可商購(gòu)的線性化桿狀病毒DNA(“Baculo GoldTMbaculovirusDNA”,Pharmingen,San Diego,CA.)一起進(jìn)行共轉(zhuǎn)染。在微滴定板上含有50μl無(wú)血清的Grace’s培養(yǎng)基(Life Technologies Inc.,Gaithersburg,MD)的無(wú)菌孔中，混合1μg BaculoGoldTM病毒DNA和5μg質(zhì)粒pBac AIMⅡ，然后加入10μl Lipofectin和90μlGrace’s培養(yǎng)基，混合后于室溫放置15分鐘。然后將轉(zhuǎn)染混合物逐滴加入至接種于含有1ml不含血清的Grace’s培養(yǎng)基的35mm組織培養(yǎng)板上的Sf9昆蟲細(xì)胞(ATCC CRL 1711)。前后搖動(dòng)此板以混合新加入的溶液，然后將板在27℃培養(yǎng)5小時(shí)。5小時(shí)后，從板中除去轉(zhuǎn)染溶液，再加入1ml補(bǔ)充有10％胎牛血清的Grace’s昆蟲培養(yǎng)基。將板放回至培養(yǎng)箱中，于27℃繼續(xù)培養(yǎng)4天。
4天后，收集上清，并按照上文列舉的Summers和Smith所述的方法進(jìn)行噬斑測(cè)定。利用含有“Blue Gal”(Life technologiesInc.,Gaithersburg)的瓊脂糖凝膠以便對(duì)表達(dá)半乳糖苷酶的克隆進(jìn)行簡(jiǎn)便的鑒定和分離，其中該表達(dá)半乳糖苷酶的克隆能產(chǎn)生染成藍(lán)色的噬斑(在Life Technologies Inc.,Gaithersburg所提供的昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)和桿狀病毒學(xué)使用說(shuō)明第9-10頁(yè)中也可見到此類“噬斑測(cè)定”的詳細(xì)說(shuō)明)。
連續(xù)稀釋4天后，將病毒加入至細(xì)胞中。進(jìn)行適當(dāng)培養(yǎng)后，利用Eppendorf取液器的吸頭挑出染成藍(lán)色的噬斑，然后將含有重組病毒的瓊脂重新懸浮于含有200μl Grace’s培養(yǎng)基的Eppendorf管中。通過(guò)輕微離心去除其中的瓊脂，再利用含有重組桿狀病毒的上清液感染接種于35mm板的Sf9細(xì)胞。4天后，收集這些培養(yǎng)板的上清液，將它們貯于4℃。通過(guò)限制性酶譜測(cè)定和測(cè)序等DNA分析方法鑒定出含有正確插入的hESSBⅠ、Ⅱ和Ⅲ的克隆。本文中將此克隆命名為Ⅴ-AIMⅡ。
在補(bǔ)充有10％加熱滅活FBS的Grace’s培養(yǎng)基中培養(yǎng)Sf9細(xì)胞。利用重組桿狀病毒Ⅴ-AIMⅡ，以2左右(1左右～3左右)的感染復(fù)數(shù)(“MOI”)感染該細(xì)胞。6小時(shí)后，除去培養(yǎng)基，再換入無(wú)甲硫氨酸和半胱氨酸的SF900Ⅱ培養(yǎng)基(可從LifeTechnologies Inc.,Gaithersburg獲得)。42小時(shí)后，加入5μCi35S-甲硫氨酸和5μCi35S-半胱氨酸(可從Amersham獲得)。繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞16小時(shí)，然后經(jīng)離心收集細(xì)胞，進(jìn)行細(xì)胞裂解，并通過(guò)SDS-PAGE和放射自顯影觀察已被標(biāo)記的蛋白質(zhì)。實(shí)施例3哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的克隆和表達(dá)用于在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)瞬時(shí)表達(dá)AIMⅡ蛋白的絕大部分載體都應(yīng)攜有SV40復(fù)制起始點(diǎn)。這有助于在能表達(dá)病毒DNA合成起始所需的T抗原的細(xì)胞(如COS細(xì)胞)內(nèi)確保載體復(fù)制至高拷貝數(shù)。為達(dá)此目的，也可使用其它任何的哺乳動(dòng)物細(xì)胞系。
一個(gè)典型的哺乳動(dòng)物表達(dá)載體含有可介導(dǎo)mRNA轉(zhuǎn)錄起始的啟動(dòng)子元件、蛋白質(zhì)編碼序列，以及轉(zhuǎn)錄終止、轉(zhuǎn)錄本聚腺苷酸化所需的信號(hào)。其它的元件包括增強(qiáng)子、Kozak序列及側(cè)翼含有RNA剪接所需的供體和受體位點(diǎn)的間插序列。利用SV40的早期、晚期啟動(dòng)子、逆轉(zhuǎn)錄病毒如RSⅤ、HTLⅥ、HIⅥ的長(zhǎng)末端重復(fù)區(qū)(LTRs)及巨細(xì)胞病毒(CMV)的早期啟動(dòng)子，可獲得高效轉(zhuǎn)錄。然而，也可使用細(xì)胞信號(hào)(如人肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子)?？捎糜谕瓿杀景l(fā)明的適當(dāng)表達(dá)載體包括pSVL、pMSG(Pharmacia,Uppsala,Sweden)、pRSVcat(ATCC 37152)、pSV2dhfr(ATCC37146)和pBC12MI(ATCC 67109)等載體?？捎玫牟溉閯?dòng)物細(xì)胞包括人Hela細(xì)胞、283細(xì)胞、H9細(xì)胞和Jurkart細(xì)胞、小鼠NIH3T3細(xì)胞和C127細(xì)胞，Cosl細(xì)胞，Cos7細(xì)胞和CV1細(xì)胞，非洲綠猴細(xì)胞、鵪鶉QC1-3細(xì)胞，小鼠L細(xì)胞和中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞。
或者，也可在染色體內(nèi)整合了該基因的穩(wěn)定細(xì)胞系中表達(dá)該基因。通過(guò)與選擇性標(biāo)記如dhfr、gpt、新霉素、潮霉素基因一起共轉(zhuǎn)染可鑒定和分離出已轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。
也可通過(guò)擴(kuò)增轉(zhuǎn)染基因以大量表達(dá)它所編碼的蛋白質(zhì)。在開發(fā)攜有數(shù)百或甚至數(shù)千拷貝的感興趣基因的細(xì)胞系時(shí)，DHFR(二氫葉酸還原酶)是一個(gè)很有用的標(biāo)記。另一種有效的選擇性標(biāo)記是谷氨酰胺合成酶(GS)(Murphy等，生物化學(xué)雜志，227:277-279(1991)；Bebbington等，Bio/Technology 10:169-175(1992))。利用這些標(biāo)記，在選擇性培養(yǎng)基中培養(yǎng)這些哺乳動(dòng)物細(xì)胞，篩選出具有最高抗性的細(xì)胞。這些細(xì)胞系中含有已整合至染色體內(nèi)的擴(kuò)增基因。中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞常被用來(lái)生產(chǎn)蛋白質(zhì)。
表達(dá)載體pC1和pC4含有添加了CMV增強(qiáng)子片段(Boshart等，細(xì)胞，41:521-530(1985))的勞氏肉瘤病毒強(qiáng)啟動(dòng)子(LTR)(Cullen等，分子和細(xì)胞生物學(xué)，438-447(1985年3月))。多克隆位點(diǎn)，如含有BamHⅠ、XbaⅠ和Asp 718限制性酶切位點(diǎn)等，可便于克隆感興趣基因。載體中還含有3′內(nèi)含子，大鼠前胰島素原基因的多聚腺苷酸化和終止信號(hào)。實(shí)施例3(a):COS細(xì)胞內(nèi)的克隆和表達(dá)通過(guò)將編碼AIMⅡ的cNDA克隆至表達(dá)載體pcDNAⅠ/Amp(可從Invitrogen Inc.獲得)中可制成表達(dá)質(zhì)粒pAIMⅡHA。
此表達(dá)載體pcDNAⅠ/amp含有(1)可有效用于大腸桿菌和其它原核細(xì)胞內(nèi)擴(kuò)增的大腸桿菌復(fù)制起點(diǎn)；(2)可用于含有質(zhì)粒的原核細(xì)胞篩選的氨芐青霉素抗性基因；(3)可用于真核細(xì)胞內(nèi)擴(kuò)增的SV40復(fù)制起點(diǎn)；(4)CMV啟動(dòng)子、多位點(diǎn)接頭、SV40內(nèi)含子和聚腺苷酸化信號(hào)，這些序列的排列方式可保證通過(guò)多位點(diǎn)接頭內(nèi)的限制性位點(diǎn)便利地將cDNA置于CMV啟動(dòng)子的表達(dá)調(diào)控下，并與SV40內(nèi)含子和聚腺苷酸化信號(hào)有效相連。
將編碼AIMⅡ蛋白及在其3′末端讀框一致地融合了HA標(biāo)記的DNA片段克隆于載體的多位點(diǎn)接頭區(qū)，以便在CMV啟動(dòng)子的指導(dǎo)下進(jìn)行重組蛋白質(zhì)表達(dá)。此HA標(biāo)記對(duì)應(yīng)于Wilson等，細(xì)胞，37:767(1984)所述的來(lái)源于流感血凝素蛋白的一個(gè)表位。靶蛋白內(nèi)HA標(biāo)記的融合可便于通過(guò)識(shí)別HA表位的抗體簡(jiǎn)便地檢測(cè)重組蛋白質(zhì)。
質(zhì)粒構(gòu)建的策略如下。與上述構(gòu)建在大腸桿菌內(nèi)表達(dá)AIMⅡ的表達(dá)載體的過(guò)程相似，利用含有便利的限制性位點(diǎn)的引物，擴(kuò)增出保藏克隆內(nèi)的AIMⅡ cDNA。為便于對(duì)表達(dá)的AIMⅡ進(jìn)行檢測(cè)、純化和鑒定，引物之一含有上述的血凝素標(biāo)記(“HA標(biāo)記”)。
適當(dāng)?shù)囊镉写藢?shí)施例中所使用的下述引物含有下劃線標(biāo)出的BamHⅠ位點(diǎn)和AUG起始密碼子的5′引物，其序列如下5′G CTC GGA TCC GCC ATC ATG3′(SEQ ID NO:13)；含有下劃線標(biāo)出的XbaⅠ位點(diǎn)、終止密碼子、可形成血凝素HA標(biāo)記的9個(gè)密碼子以及31bp的3′編碼序列(在其3′末端)的3′引物，其序列如下5′GAT GTT CTA GAA AGC GTA GTC TGG GAC GTC GTATGG GTA CAC CAT GAA AGC CCC GAA GTA AGA CCG GGTAC3′(SEQ ID NO:14)。
通過(guò)HindⅢ和XhoⅠ消化PCR擴(kuò)增DNA片段和載體pcDNAⅠ/Amp，再將它們連接起來(lái)。將連接混合物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌SURE菌株(可從Stratagene Cloning Systems,11099 North Torrey PinesRoad,La Jolla,CA92037獲得)中，將已轉(zhuǎn)化的培養(yǎng)物鋪板于含氨芐青霉素培養(yǎng)基的平板上，再培養(yǎng)這些板以確保氨芐青霉素抗性菌落的生長(zhǎng)。從抗性菌落中分離質(zhì)粒DNA，并通過(guò)限制性分析和凝膠電泳檢測(cè)質(zhì)粒DNA中AIMⅡ編碼片段的存在。
為了表達(dá)重組AIMⅡ，可利用如Sambrook等，《分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，冷泉港，紐約(1989)所述的DEAE-DEXTRAN，通過(guò)上述的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染COS細(xì)胞。在適于載體表達(dá)AIMⅡ的條件下培養(yǎng)細(xì)胞。
利用如Harlow等，《抗體實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》，第二版，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，冷泉港，紐約(1988)中所記載的方法，通過(guò)放射性標(biāo)記和免疫沉淀測(cè)定AIMⅡ HA融合蛋白的表達(dá)。為達(dá)此目的，轉(zhuǎn)染2天后，通過(guò)在含有35S-半胱氨酸的培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞而對(duì)其進(jìn)行標(biāo)記。收集細(xì)胞和培養(yǎng)基，洗滌細(xì)胞，再按照Wilson等(出處同前)所述的方法，利用含有去污劑的RIPA緩沖液150mM NaCl,1％NP-40,0.1％SDS,1％NP-40,0.5％DOC,50mM Tris,pH7.5裂解細(xì)胞。利用HA特異性單克隆抗體，從細(xì)胞裂解物和組織培養(yǎng)基中沉淀蛋白質(zhì)。再通過(guò)SDS-PAGE凝膠和放射顯影分析已沉淀的蛋白質(zhì)。在細(xì)胞裂解物中可觀察到預(yù)期大小的表達(dá)產(chǎn)物，這在負(fù)對(duì)照中是不存在的。實(shí)施例3(b):CHO細(xì)胞內(nèi)的克隆和表達(dá)利用載體pC4表達(dá)AIMⅡ蛋白。質(zhì)粒pC1是質(zhì)粒pSV2-dhfr[ATCC保藏號(hào)37146]的衍生物。兩種質(zhì)粒都含有在SV40早期啟動(dòng)子控制下的小鼠DHFR基因。通過(guò)在補(bǔ)充有化療劑氨甲喋呤的選擇性培養(yǎng)基(alpyha minus MEM,Life Technologies)中培養(yǎng)細(xì)胞可篩選出轉(zhuǎn)染有這些質(zhì)粒的無(wú)二氫葉酸活性的中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞或其它細(xì)胞?？拱奔奏┻?MTX)呤的細(xì)胞內(nèi)DHFR基因的擴(kuò)增已有很好的記載(參見如Alt F.W.,Kellems R.M.,Bertino J.R.和Schimke R.T.,1978，生物化學(xué)雜志，253:1357-1370；Hamlin J.L.和Ma C.,1990,Biochem et Biophys.Acta,1097:107-143；Page M.J.和Sydenham M.A.,1991，生物技術(shù)，第9卷64-68)。生長(zhǎng)于更高濃度的MTX的細(xì)胞能通過(guò)DHFR基因的擴(kuò)增、過(guò)量表達(dá)靶酶DHFR而增強(qiáng)其對(duì)此藥物的抗性。如果DHFR基因連接了另一個(gè)基因，通常它也被共擴(kuò)增和過(guò)量表達(dá)。培育出含有1000多個(gè)拷貝的基因的細(xì)胞系是本領(lǐng)域的重要工作。因此，撤去氨甲喋呤后，細(xì)胞系中仍含有已整合至染色體中的擴(kuò)增基因。
質(zhì)粒pC4中含有用于表達(dá)目的基因的勞氏肉瘤病毒長(zhǎng)末端重復(fù)區(qū)(LTR)的強(qiáng)啟動(dòng)子(Cullen等，分子和細(xì)胞生物學(xué)，1985年3月438-447)以及從人巨細(xì)胞病毒(CMV)立即早期基因的增強(qiáng)子中分離出的一個(gè)片段(Boshart等，細(xì)胞，41:521-530(1985))。該啟動(dòng)子下游含有可允許基因插入的BamHⅠ、XbaⅠ和Asp 718限制性酶切位點(diǎn)。此質(zhì)粒在這些克隆位點(diǎn)后還含有大鼠前胰島素原基因的3′內(nèi)含子和聚腺苷酸化位點(diǎn)。也可使用其它高效啟動(dòng)子進(jìn)行表達(dá)，如人β-肌動(dòng)蛋白基因啟動(dòng)子、SV40的早期或晚期啟動(dòng)子，或其它逆轉(zhuǎn)錄病毒如HIV和HTLVI的長(zhǎng)末端重復(fù)區(qū)?？衫肅lontech公司的Tet-Off和Tet-On基因表達(dá)系統(tǒng)在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)以調(diào)控方式表達(dá)AIMⅡ(Gossen M.和BujardH.,1992，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)，89:5547-5551)。至于該mRNA的聚腺苷酸化，也可使用其它的信號(hào)，如來(lái)源于人生長(zhǎng)激素或珠蛋白基因的信號(hào)。通過(guò)與選擇性標(biāo)記如gpt、G418或潮霉素共轉(zhuǎn)化，也可篩選出攜有已整合至染色體內(nèi)的目的基因的穩(wěn)定細(xì)胞系。最好是開始時(shí)使用多個(gè)選擇性標(biāo)記，如同時(shí)使用G418和氨甲喋呤。
利用限制性酶BamHⅠ和Asp 718消化質(zhì)粒pC4，然后通過(guò)本領(lǐng)域已知方法，利用小牛腸道磷酸酶對(duì)其進(jìn)行去磷酸化處理。再通過(guò)1％瓊脂糖凝膠分離該載體。
利用分別對(duì)應(yīng)于該基因的5′和3′序列的PCR寡核苷酸引物擴(kuò)增編碼完整AIMⅡ蛋白及其前導(dǎo)序列的DNA序列。該5′引物的序列為5′GCT CCA GGA TCC GCC ATC ATG GAG GAG AGTGTC GTA CGG C3′(SEQ ID NO:15)，其中含有下劃線表示的BamHⅠ限制性酶切位點(diǎn)和其后的如Kozak M.,分子生物學(xué)雜志，196:947-950(1987)所述的真核生物內(nèi)用于翻譯起始的有效信號(hào)，以及圖1A-C(SEQ ID NO:1)所示的AIMⅡ編碼序列內(nèi)的22個(gè)堿基。3′引物的序列為5′GA CGC GGTACC GTC CAA TGC ACC ACG CTC CTT CCT TC3′(SEQ IDNO:16)，其中含有下劃線表示的Asp 718限制性位點(diǎn)及其后的與圖1A-C(SEQ ID NO:1)所示AIMⅡ基因第769-795位核苷酸互補(bǔ)的核苷酸。
該擴(kuò)增片段經(jīng)內(nèi)切核酸酶BamHⅠ和Asp 718消化后，再在1％瓊脂糖凝膠上重新純化。然后通過(guò)T4 DNA連接酶將該分離片段和去磷酸化載體連接起來(lái)，再轉(zhuǎn)化大腸桿菌HB101或XL1-Blue細(xì)胞，并通過(guò)如限制性酶切分析鑒定出含有已插入至質(zhì)粒pC4的該片段的細(xì)菌。
使用缺乏活性DHFR基因的中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)化。利用Lipofectin(Felgner等，出處同前)，將5μg表達(dá)質(zhì)粒pC4與0.5μg質(zhì)粒pSV2-neo一起進(jìn)行共轉(zhuǎn)化。質(zhì)粒pSV2 neo含有一個(gè)顯性選擇性標(biāo)記，即Tn5來(lái)源的neo基因，該neo基因編碼可賦予對(duì)包括G418在內(nèi)的一組抗生素的抗性的酶類。將該細(xì)胞接種于補(bǔ)加了1mg/ml G418的alpha minus MEM培養(yǎng)基中。2天后，通過(guò)胰蛋白酶消化該細(xì)胞，并將其接種于含有同時(shí)補(bǔ)加了10.25或50ng/ml氨甲喋呤和1mg/ml G418的alpha minus MEM培養(yǎng)基的雜交瘤克隆板(Greiner,Germany)中。大約10-14天后，經(jīng)胰蛋白酶消化單個(gè)克隆，然后將它們接種于6-孔培養(yǎng)皿或10ml錐形瓶中，并使用不同濃度的氨甲喋呤(50nM、100nM、200nm、400nM、800nM)。將在最高濃度氨甲喋呤中生長(zhǎng)的克隆轉(zhuǎn)移至含有更高濃度氨甲喋呤(1μM、2μM、5μM、10mM、20mM)的新6-孔板上。重復(fù)此步驟直至獲得能在100～200μM濃度下生長(zhǎng)的克隆。通過(guò)如SDS-PAGE、Western雜交或反相HPLC分析等方法，對(duì)目的基因產(chǎn)物的表達(dá)進(jìn)行分析。實(shí)施例4:AIMⅡ蛋白表達(dá)的組織分布利用Sambrook等人(出處同前)及其它文獻(xiàn)所記載的方法進(jìn)行Northern印跡分析，以研究人組織中AIMⅡ基因的表達(dá)。按照生產(chǎn)商說(shuō)明，利用rediprimeTMDNA標(biāo)記系統(tǒng)(Amersham LifeScience)對(duì)含有AIMⅡ蛋白全部核苷酸序列(SEQ ID NO:1)的cDNA探針進(jìn)行32P標(biāo)記。標(biāo)記后，按照生產(chǎn)商PT 1200-1號(hào)技術(shù)，利用CHROMA SPIN-100TM柱(Clontech Laboratories公司)對(duì)該探針進(jìn)行純化。然后利用該經(jīng)純化的標(biāo)記探針分析各種人組織中AIMⅡ mRNA的水平。
從Clontech獲得含有多種人組織(H)或人免疫系統(tǒng)組織(IM)的多組織Northern(Multiple Tissue Northern,MTN)印跡，并按照生產(chǎn)商的PT 1190-1號(hào)技術(shù)方案，利用ExpressHybTM雜交溶液(Clontech)，通過(guò)標(biāo)記探針對(duì)這些印跡進(jìn)行分析。雜交和洗滌后，固定印跡并在-70℃對(duì)膠片曝光過(guò)夜，再按照標(biāo)準(zhǔn)方法對(duì)膠片進(jìn)行顯影。
顯然，可通過(guò)除本文詳細(xì)敘述的說(shuō)明書和實(shí)施例外的其它方式操作本發(fā)明。
在上文的指導(dǎo)下，可對(duì)本發(fā)明進(jìn)行多種改進(jìn)和改變，因此，它們也在本文附加權(quán)利要求的范圍內(nèi)。
本文所列舉的所有出版物(包括專利、專利申請(qǐng)、雜志文章、實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)、書籍或其它文件)的全部公開內(nèi)容均引入本文作為參考。
序列表(1)一般信息(ⅰ)申請(qǐng)人人類基因組科學(xué)公司941 0Key West AvenueRockville,MD 20850美國(guó)申請(qǐng)人/發(fā)明Ebner,Reinhard人 Yu,Guo-LiangRu ben,Steven M.
(ⅱ)發(fā)明名稱編程性細(xì)胞死亡誘導(dǎo)分子Ⅱ(ⅲ)序列數(shù)19(ⅳ)通訊地址(A)收件人Sterne,Kessler,Goldstein & Fox,P.L.L.C(B)街道1100 New York Ave..Suite 600(C)城市Washington(D)州DC(E)國(guó)家美國(guó)(F)郵編20005-3934(ⅴ)計(jì)算機(jī)可讀形式(A)介質(zhì)類型Floppy disk(B)計(jì)算機(jī)IBM PC兼容機(jī)(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件Patent In Release#1.0,Version#1.30(ⅵ)目前的申請(qǐng)信息(A)申請(qǐng)?zhí)朤BA(B)申請(qǐng)日本文所附(C)分類(ⅶ)在先申請(qǐng)信息(A)申請(qǐng)?zhí)?0/013,923(B)申請(qǐng)日1996年3月22日(C)分類(ⅷ)代理人/代理機(jī)構(gòu)信息
(A)姓名 Goldstein,Jorge A.
(B)登記號(hào)29,021(C)資料/文檔號(hào)1488.065 PC 01/JAG/EKS/KMT(ⅸ)通訊信息(A)電話 202-371-2600(B)電傳 202-371-2540(2)SEQ ID NO:1信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度1169個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型DNA(基因組)(ⅸ)特性(A)名稱/關(guān)鍵詞CDS(B)位置49..768(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:1:GAGGTTGAAG GACCCAGGCG TGTCAGCCCT GCTCCAGAGA CCTTGGGC ATG GAG GAG 57Met Glu Glu1AGT GTC GTA CGG CCC TCA GTG TTT GTG GTG GAT GGA CAG ACC GAC ATC 105Ser Val Val Arg Pro Ser Val Phe Val Val Asp Gly Gln Thr Asp Ile5 10 15CCA TTC ACG AGG CTG GGA CGA AGC CAC CGG AGA CAG TCG TGC AGT GTG 153Pro Phe Thr Arg Leu Gly Arg Ser His Arg Arg Gln Ser Cys Ser Val20 25 30 35GCC CGG GTG GGT CTG GGT CTC TTG CTG TTG CTG ATG GGG GCT GGG CTG 201Ala Arg Val Gly Leu Gly Leu Leu Leu Leu Leu Met Gly Ala Gly Leu40 45 50GCC GTC CAA GGC TGG TTC CTC CTG CAG CTG CAC TGG CGT CTA GGA GAG 249Ala Val Gln Gly Trp Phe Leu Leu Gln Leu His Trp Arg Leu Gly Glu55 60 65ATG GTC ACC CGC CTG CCT GAC GGA CCT GCA GGC TCC TGG GAG CAG CTG 297Met Val Thr Arg Leu Pro Asp Gly Pro Ala 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Leu Leu Val Met Phe Phe Met Val Leu Val Ala Leu Val Gly85 90 95Leu Gly Leu Gly Met Phe Gln Leu Phe His Leu Gln Lys Glu Leu Ala100 105 110Glu Leu Arg Glu Ser Thr Ser Gln Met His Thr Ala Ser Ser Leu Glu115 120 125Lys Gln Ile Gly His Pro Ser Pro Pro Pro Glu Lys Lys Glu Leu Arg130 135 140Lys Val Ala His Leu Thr Gly Lys Ser Asn Ser Arg Ser Met Pro Leu145 150 155 160Glu Trp Glu Asp Thr Tyr Gly Ile Val Leu Leu Ser Gly Val Lys Tyr165 170 175Lys Lys Gly Gly Leu Val Ile Asn Glu Thr Gly Leu Tyr Phe Val Tyr180 185 190Ser Lys Val Tyr Phe Arg Gly Gln Ser Cys Asn Asn Leu Pro Leu Ser195 200 205His Lys Val Tyr Met Arg Asn Ser Lys Tyr Pro Gln Asp Leu Val Met210 215 220Met Glu Gly Lys Met Met Ser Tyr Cys Thr Thr Gly Gln Met Trp Ala225 230 235 240Arg Ser Ser Tyr Leu Gly Ala Val Phe Asn Leu Thr Ser Ala Asp His245 250 255Leu Tyr Val Asn Val Ser Glu Leu Ser Leu Val Asn Phe Glu Glu Ser260 265 270Gln Thr Phe Phe Gly Leu Tyr Lys Leu275 280(2)SEQ ID NO:7信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度24個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型cDNA(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:7:
GCGGGATCCG GAGAGATGGT CACC 24(2)SEQ ID NO:8信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度27個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型cDNA(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:8:
CGCAAGCTTC CTTCACACCA TGAAAGC 27(2)SEQ ID NO:9信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度32個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型cDNA(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:9:
GACCGGATCC ATGGAGGAGA GTGTCGTACG GC 32(2)SEQ ID NO:10信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度27個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型cDNA(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:10:
CGCAAGCTTC CTTCACACCA TGAAAGC 27(2)SEQ ID NO:11信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度40個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型cDNA(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:11:GCTCCAGGATCCGCCATCATGGAGGAGAGTGTCGTACGGC 40(2)SEQ ID NO:12信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度37個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型cDNA(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:12:GACGCGGTAC CGTCCAATGC ACCACGCTCC TTCCTTC 37(2)SEQ ID NO:13信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度19個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型cDNA(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:13:
GCTCGGATCC GCCATCATG 19(2)SEQ ID NO:14信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度71個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型cDNA(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:14:GATGTTCTAG AAAGCGTAGT CTGGGACGTC GTATGGGTAC ACCATGAAAG CCCCGAAGTA 60AGACCGGGTA C 71(2)SEQ ID NO:15信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度40個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型cDNA(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:15:GCTCCAGGATCCGCCATCATGGAGGAGAGTGTCGTACGGC 40(2)SEQ ID NO:16信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度37個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型cDNA(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:16:GACGCGGTAC CGTCCAATGC ACCACGCTCC TTCCTTC 37(2)SEQ ID NO:17信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度32個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型cDNA(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:17:
GACGCCCATG GAGGAGGAGA GTGTCGTACG GC 32(2)SEQ ID NO:18信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度33個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型cDNA(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:18:
GACCGGATCC CACCATGAAA GCCCCGAAGT AAG 33(2)SEQ ID NO:19信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度27個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型cDNA(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:19:
CGCAAGCTTC CTTCACACCA TGAAAGC 2權(quán)利要求
1．一種分離的核酸分子，其含有與選自下組的序列具有至少95％同一性的核苷酸序列的多核苷酸，所述組含有(a)編碼具有圖1A-C中全部氨基酸序列(SEQ ID NO:2)的AIMⅡ多肽的核苷酸序列；(b)編碼AIMⅡ多肽的核苷酸序列，所述多肽具有ATCC保藏號(hào)NO.97689所含cDNA克隆編碼的全部氨基酸序列；(c)編碼AIMⅡ多肽胞外結(jié)構(gòu)域的核苷酸序列；(d)編碼AIMⅡ多肽跨膜結(jié)構(gòu)域的核苷酸序列；(e)編碼AIMⅡ多肽胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的核苷酸序列；(f)編碼可溶性AIMⅡ多肽的核苷酸序列，所述可溶性AIMⅡ多肽含有胞外和胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域，但缺乏跨膜結(jié)構(gòu)域；和(g)與上述(a)、(b)、(c)、(d)、(e)或(f)中任何一種核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列。
2．權(quán)利要求1的核酸分子，其中所說(shuō)的多核苷酸具有圖1A-C中全部的核苷酸序列(SEQ ID NO:1)。
3．權(quán)利要求1的核酸分子，其中所說(shuō)的多核苷酸具有圖1A-C(SEQ ID NO:1)中編碼AIMⅡ多肽的核苷酸序列，所述AIMⅡ多肽具有圖1A-C中全部氨基酸序列(SEQ ID NO:2)。
4．權(quán)利要求1的核酸分子，其中所述多核苷酸具有ATCC保藏號(hào)97689中所含cDNA克隆的全部核苷酸序列。
5．權(quán)利要求1的核酸分子，其中所述多核苷酸具有編碼AIMⅡ多肽的核苷酸序列，該AIMⅡ多肽具有ATCC保藏號(hào)97689中所含cDNA克隆編碼的全部氨基酸序列。
6．一種分離的核酸分子，其含有的一段多核苷酸在嚴(yán)格雜交條件下可跟含有與權(quán)利要求1的(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)或(g)中一個(gè)核苷酸序列相同的核苷酸序列的多核苷酸雜交，其中所說(shuō)的多核苷酸在嚴(yán)格雜交條件下與僅含A殘基或僅含T殘基的核苷酸序列不能雜交上。
7．一種分離的核酸分子，其含有編碼AIMⅡ多肽中具有表位的區(qū)段的氨基酸序列的多核苷酸，所述AIMⅡ多肽具有權(quán)利要求1的(a)、(b)、(c)、(d、)(e)或(f)中的氨基酸序列。
8．權(quán)利要求7的分離的核酸分子，其編碼AIMⅡ多肽具有表位的區(qū)段，所述區(qū)段選自下述的組中含有圖1A-C(SEQ ID NO:2)中大約第13位至大約第20位氨基酸殘基的多肽；含有圖1A-C(SEQ IDNO:2)中大約第23位至大約第36位氨基酸殘基的多肽；含有圖1A-C(SEQ ID NO:2)中大約第69位至大約第79位氨基酸殘基的多肽；含有圖1A-C(SEQ ID NO:2)中大約第85位至大約第94位氨基酸殘基的多肽；含有圖1A-C(SEQ ID NO:2)中大約第167位至大約第178位氨基酸殘基的多肽；含有圖1A-C(SEQ ID NO:2)中大約第184位至大約第196位氨基酸殘基的多肽；含有圖1A-C(SEQ ID NO:2)中大約第221至大約第233位氨基酸殘基的多肽。
9．一種制備重組載體的方法，所述方法包括將權(quán)利要求1的分離的核酸分子插入至載體中。
10．按權(quán)利要求9的方法制備的重組載體。
11．一種制備重組宿主細(xì)胞的方法，所述方法包括將權(quán)利要求10的重組載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞中。
12．按權(quán)利要求11的方法制備的重組宿主細(xì)胞。
13．一種重組生產(chǎn)AIMⅡ多肽的方法，所述方法包括在所述多肽能表達(dá)的條件下培養(yǎng)權(quán)利要求12的重組宿主細(xì)胞；以及回收所述多肽。
14．一種分離的AIMⅡ多肽，其含有與選自下述組的一個(gè)序列具有至少95％同一性的氨基酸序列，該組含有(a)具有圖1A-C(SEQ ID NO:2)中全部氨基酸序列的AIMⅡ多肽的氨基酸序列；(b)具有ATCC保藏號(hào)NO.97689所含cDNA克隆所編碼的全部氨基酸序列的AIMⅡ多肽的氨基酸序列；(c)AIMⅡ多肽的胞外結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列；(d)AIMⅡ肽的跨膜結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列；(e)AIMⅡ多肽的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列；(f)可溶性AIMⅡ多肽的氨基酸序列，所述可溶性AIMⅡ多肽具有全部或部分胞外和胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域，但缺乏跨膜結(jié)構(gòu)域；和(g)(a)、(b)、(c)、(d)、(e)或(f)中任一種多肽的含有表位的區(qū)段的氨基酸序列。
15．一種含有AIMⅡ蛋白中具有表位的區(qū)段的分離的多肽，其中所述區(qū)段選自由下述組成之組含有圖1A-C(SEQ ID NO:2)中大約第13位至大約第20位氨基酸殘基的多肽；含有圖1A-C(SEQ IDNO:2)中大約第23位至大約第36位氨基酸殘基的多肽；含有圖1A-C(SEQ ID NO:2)中大約第69位至大約第79位氨基酸殘基的多肽；含有圖1A-C(SEQ ID NO:2)中大約第85位至大約第94位氨基酸殘基的多肽；含有圖1A-C(SEQ ID NO:2)中大約第167位至大約第178位氨基酸殘基的多肽；含有圖1A-C(SEQ ID NO:2)中大約第184位至大約第196位氨基酸殘基的多肽；以及含有圖1A-C(SEQ ID NO:2)中大約第221位至大約第233位氨基酸殘基的多肽。
16．一種分離的抗體，其能特異性結(jié)合權(quán)利要求14的AIMⅡ多肽。
17．一種治療選自由下述組成之組的狀態(tài)或疾病的方法淋巴結(jié)病、自身免疫疾病和移植物抗宿主疾病，所述方法包含對(duì)需相應(yīng)治療的病人服用有效量的權(quán)利要求14的(a)、(b)、(c)、(d)、(e)或(f)中的多肽。
18．一種抑瘤的方法，其包含對(duì)需相應(yīng)治療的病人服用有效量的權(quán)利要求14的(a)、(b)、(c)、(d)、(e)或(f)中的多肽。
19．一種預(yù)防選自由下述組成之組的狀態(tài)或疾病的方法敗血病性休克、感染、腦型瘧、HIV-病毒活化、骨吸收、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和惡病質(zhì)，所述方法包括對(duì)需相應(yīng)治療的病人服用有效量的權(quán)利要求14的多肽的拮抗物。
全文摘要
本發(fā)明涉及TNF－配基超家庭的一個(gè)新成員,編程性細(xì)胞死亡誘導(dǎo)分子Ⅱ(AIMⅡ)。具體地說(shuō),本發(fā)明提供了編碼人AIMⅡ蛋白的分離的核酸分子。本發(fā)明也提供了AIMⅡ多肽,以及生產(chǎn)該多肽的載體、宿主細(xì)胞和重組方法。本發(fā)明還涉及篩選用于鑒定AIMⅡ活性激動(dòng)劑和拮抗劑的方法。本發(fā)明還提供了治療淋巴結(jié)病,自身免疫疾病、移植物抗宿主疾病及抑制癌癥如腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的治療方法。
文檔編號(hào)A61P37/00GK1216994SQ96180284
公開日1999年5月19日 申請(qǐng)日期1996年10月31日 優(yōu)先權(quán)日1996年3月22日
發(fā)明者R·埃伯納, S·M·魯賓, 余國(guó)良 申請(qǐng)人:人類基因組科學(xué)公司