專利名稱：細胞因子調節(jié)劑及其在與改變的細胞因子水平相關的病理和狀態(tài)中的應用方法
技術領域：
本發(fā)明一般地涉及肽化學和分子病理學，更具體地說，涉及新的細胞因子調節(jié)劑和其在控制細胞因子調節(jié)的生理過程和病理中的應用。
背景信息細胞因子是一類可溶性分泌蛋白，由各種各樣的細胞在應答不同種類的誘導刺激如環(huán)境的，機械的和病理的脅迫的情況下產(chǎn)生。淋巴樣細胞，炎癥細胞和紅細胞生成細胞分泌各種各樣的細胞因子，這些細胞因子通過控制細胞增殖，分化和效應物功能來調節(jié)免疫反應。例如，在免疫反應中因應答T細胞刺激而產(chǎn)生的調節(jié)性細胞因子可以是免疫抑制的或免疫刺激的。與改變的細胞因子水平相關聯(lián)的免疫反應和急性期反應可以因，例如，與廢用性去適應，癌癥治療，膿毒休克和其它細菌相關病理導致的器官損壞，藥物負反應，氧化氮介導的組織損壞和糖尿病而發(fā)生。
正常狀態(tài)下，組織中的細胞因子濃度非常低，它們的作用是通過與特殊細胞類型上的高親和性受體相結合來介導的。諸如白介素(IL)，干擾素(IFN)，集落刺激因子(CSF)和腫瘤壞死因子(TNF)等的不同細胞因子在免疫，發(fā)炎，修復和急性期反應時產(chǎn)生，它們控制這些反應的不同方面。伴隨著這種免疫，發(fā)炎，修復或急性期反應的誘導，不同的細胞因子的濃度在不同的時間可以增加或降低。例如，增加的細胞因子水平與一系列諸如太空飛行，固定，脊索損傷和臥床休息等導致廢用性去適應的狀態(tài)相伴隨。在太空飛行中，例如，實驗對象一旦處于失重狀態(tài)時TNF，IL-6和IL-2水平即增加，從太空返回后恢復正常。
改變的細胞因子水平也與異常的骨骼代謝和在固定術，脊索損傷或長期臥床休息時發(fā)生的迅速脫鈣相關聯(lián)。與此相似，在諸如對器官損壞的修復和自身免疫反應，與器官移植，癌癥化療時使用環(huán)孢菌素相關聯(lián)的腎中毒等的長期狀態(tài)時和肥胖或患糖尿病，膿毒休克(內(nèi)毒性的)或腎小球性腎炎的個體中，細胞因子水平會發(fā)生改變。
包括TNF，CSF，干擾素和白介素等的細胞因子調節(jié)寄主防御反應，細胞調節(jié)和細胞分化。例如，這些細胞因子可以誘導患者發(fā)熱，可以引起T細胞，B細胞和巨噬細胞活化，可以影響其它細胞因子的水平從而導致級聯(lián)效應，藉此，其它細胞因子調節(jié)第一個細胞因子的生物學水平和活性。
細胞因子可通過免疫刺激或免疫抑制效應調節(jié)免疫反應。例如，IL-10可以封閉包括TNF，IL-1和IL-6在內(nèi)的很多炎癥細胞因子的活性，而增高諸如IL-12等的抗炎細胞因子。由巨噬細胞和其它細胞產(chǎn)生的IL-10也刺激肥大細胞和胸腺細胞的增殖，抑制單核細胞和巨噬細胞的各種功能。這種單核細胞和巨噬細胞被抑制的結果是T細胞的活性也被影響。在免疫系統(tǒng)中IL-10的全部作用只是剛剛開始被了解。
細胞因子具有多種生物學活性并與不止一種細胞相互作用。因此，選用某特定細胞因子或細胞類型來防止治療時的破壞性副作用是不可能的。防止由于非期望的和不可控制的細胞因子活性的過度抑制或過度刺激引起的損壞作用的更好方法是調節(jié)免疫反應中涉及的相關或控制性細胞因子的表達而不消除或過分表達任何其它的細胞因子。這樣的治療不會創(chuàng)建或加重某病理的或持續(xù)的免疫反應。以這種方法，可以防止諸如免疫抑制或自身免疫反應等的病理免疫介導的效應，保持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定。
皮質類固醇可以用于調整細胞因子表達。但是它們可引起完全的免疫抑制，并有其它非期望的諸如誘導“萎縮”綜合癥，糖尿病和骨質疏松癥的副作用。與此類似，諸如ketorolac(Toradol；Syntex)的非類固醇抗炎藥物(NSAID)，對治療炎癥和疼痛有效，但是，NSAID也通過抑制前列腺素的產(chǎn)生引起非期望的副作用，可以導致包括胃潰瘍，出血和腎衰竭在內(nèi)的潛在的嚴重并發(fā)癥。
為了防止由上述的細胞因子迷亂表達引起的病理狀態(tài)或對正常免疫介導的功能的干擾，精確操作和有效控制細胞因子水平將是有利的。因此，需要某種可以調整患者的細胞因子水平而不引起非期望的副作用的制劑。另外，還需要鑒定可以用于治療與改變的細胞因子水平相關的病理和狀態(tài)的制劑。本發(fā)明滿足了這些需要而且提供了相關的便利。
本發(fā)明概述本發(fā)明涉及為潛在的細胞因子調節(jié)劑的新肽。正如本文所披露的，這種細胞因子調節(jié)劑具有通用結構，X1-X2-His-(D)Phe-Arg-(D)Trp-X3，和X4-X5-(D)Phe-Arg-(D)-Trp-X3，其中X1，X2，X3，X4和X5可以是氨基酸或氨基酸類似物。本發(fā)明涉及具有Ac-His-(D)Phe-Arg-{(D)Trp(CH2)}-(NAc)Gly-NH2結構的細胞因子調節(jié)劑，其含有一個還原的(D)Trp類似物。
另外，本發(fā)明還涉及包括藥物可接受載劑和一種或多種細胞因子調節(jié)劑的藥物組合物。給予患者這樣一種細胞因子調節(jié)劑或其聯(lián)合使用可以修飾個體內(nèi)的不同細胞因子的水平，由此，根據(jù)所調節(jié)的特定細胞因子，將產(chǎn)生免疫刺激或免疫抑制。
本發(fā)明還提供了通過增強患者的細胞因子活性來調節(jié)的方法，和治療以改變的或迷亂的細胞因子活性為部分特征的狀態(tài)、病理或損傷的方法。這些狀態(tài)、病理或損傷包括廢用性去適應，氧化氮和細胞因子介導的疾病，糖尿病，肥胖，自身免疫疾病，膿毒休克(內(nèi)毒性的)，腎小球性腎炎，諸如移植時發(fā)生的器官損壞和諸如腎中毒的癌癥化療的副作用。
附圖的簡要描述

圖1a和1b顯示一種細胞因子調節(jié)劑能有效地抑制因環(huán)孢菌素誘導的腎中毒而發(fā)生的腎小球濾過率降低。
圖2顯示EX-2增強小鼠血漿中的IL-10水平。
圖3a和圖3b顯示EX-2增強人血漿中的IL-10水平。
圖4顯示用EX-2處理的肥胖大鼠(fa/fa)和正常(Fa/+)大鼠的體重。
本發(fā)明的詳細描述本發(fā)明涉及具有X1-X2-His-(D)Phe-Arg-(D)Trp-X3結構的新的細胞因子調節(jié)劑，其中X1是
，H或COCH3；
X2是
；和X3是
，或R5；其中Y是O，H2或S；R1是H，COCH3，C2H5，CH2Ph，COPh，COO-叔丁基，COOCH2Ph，CH2CO-(聚乙二醇)或A；R2是H或COCH3；R3是一個具有1到6個碳原子的線性的或分支的烷基基團或一個具有3到6個碳原子的環(huán)烷基團，R4是(CH2)m-CONH2，(CH2)m-CONHR1或(CH2)m-CONHA；R5是OH，OR3，NH2，SH，NHCH3，NHCH2Ph或A；和R6是H或R3；其中“Ph”是C6H5；“m”是1，2或3；“n”是0，1，2或3；和“A”是具有如下通式的碳水化合物
在本發(fā)明的一個實施方案中，肽的X1和X2具有上述的任何一種變化，特別是X3為OH(X3是R5，其中R5是OH)。在另外一個實施方案中，Y，R1，R2，R4，R5和R6可以是上述的任何一種變化，R3是一個具有3到6個碳原子的環(huán)烷基團。
由上面披露的結構式所涵蓋的肽的例子包括Nle-Gln-His-(D)Phe-Arg-(D)Trp-Gly-NH2；Ac-Nle-Gln-His-(D)Phe-Arg-(D)Trp-Gly-NH2和Ac-(環(huán)己基)Gly-Gln-His-(D)Phe-Arg-(D)Trp-Gly-NH2，其中每個肽都可以調節(jié)細胞因子活性。
本發(fā)明涉及具有X4-X5-(D)Phe-Arg-(D)Trp-X3結構的新的細胞因子調節(jié)劑，其中X4是
，H，COCH3，或無；
X5是His，H，或COCH3；和X3是
，或R5；其中Y是O，H2或S；R1是H，COCH3，C2H5，CH2Ph，COPh，COO-叔丁基，COOCH2Ph，CH2CO-(聚乙二醇)或A；R2是H或COCH3；R4是(CH2)m-CONH2，(CH2)m-CONHR1或(CH2)m-CONHA；R5是OH，OR3，NH2，SH，NHCH3，NHCH2Ph或A；和R6是H或R3；其中“Ph”是C6H5；“m”是1，2或3；“n”是0，1，2或3；和“A”是具有如下通式的碳水化合物
在本發(fā)明的一個實施方案中，肽是X4和X5具有上述的任何一種變化，特別是X3為OH(X3是R5，其中R5是OH)的3到5個氨基酸殘基的縮短的類似物。在另外一個實施方案中，X4不存在，X5是H或COCH3，X3是R5，細胞因子調節(jié)劑是(D)Phe-Arg-(D)Trp的三肽。優(yōu)選的肽包括可以調節(jié)細胞因子活性的His-(D)Phe-Arg-(D)Trp-Gly-NH2；Ac-His-(D)Phe-Arg-(D)Trp-NH2；His-(D)Phe-Arg-(D)Trp-OH；Ac-(D)Phe-Arg-Trp-NH2；和環(huán)(His-(D)Phe-Arg-(D)Trp)。
如本文所用到的，術語“調節(jié)”或“調節(jié)性的”意思是通過增強，限定，限制，遏制，調整或緩和來控制。這種調節(jié)包括因諸如細胞因子等的生物學制劑的活性而發(fā)生的多向性效應，冗余效應，協(xié)同效應或拮抗效應，這些效應可以直接或間接地通過級聯(lián)或生物學反饋機制影響一系列生物學功能。
如本文所用到的，術語“細胞因子調節(jié)劑”意思是通過增強，限定，限制，遏制，調整或緩和細胞因子的生物學活性來控制細胞因子活性的制劑。但是，應該認識到盡管細胞因子調節(jié)劑通?？烧{節(jié)細胞因子活性，但是沒有提出有關細胞因子調節(jié)劑是如何作用以影響以改變的或迷亂的細胞因子活性為特征的狀態(tài)的具體機制。
細胞因子是本領域所公知的，包括但不限于腫瘤壞死因子(TNFs)，集落刺激因子(CSFs)，干擾素(INFs)，白介素(IL-1，IL-2，IL-3，IL-4，IL-5，IL-6，IL-7，IL-8，IL-9，IL-10，IL-11，IL-12，IL-13，IL-14，和IL-15)，轉化生長因子(TGFs)，致癌蛋白M(OSM)，白血病抑制因子(LIF)，血小板激活因子(PAF)，和其它介導寄主防御反應，細胞調節(jié)和細胞分化的可溶性免疫調節(jié)肽(參見，例如，Kuby，Immunology2nd ed.(W.H.Freeman andCo.1994)；見13章，在本文作為參考文獻)。
本發(fā)明的細胞因子調節(jié)劑可以調節(jié)一或多種細胞因子的迷亂的或改變的表達，這種表達發(fā)生在包括如病理，免疫反應和炎癥反應的各種狀態(tài)中。這些狀態(tài)部分地以改變的或迷亂的細胞因子活性為特征，因此可以用一種或多種細胞因子調節(jié)劑來調節(jié)治療，本發(fā)明綜合考慮了這些狀態(tài)。
如本文所用到的，術語“以......為特征”意思是至少部分地貢獻或影響。盡管細胞因子的作用對這些狀態(tài)來說可以是唯一的、基本的、甚至是主要的因素，但是不是必定的。例如，本領域所公知的某感染具有改變的細胞因子水平，因此是一個以細胞因子活性為特征的狀態(tài)，但細胞因子活性只是此感染狀態(tài)的一部分。
如本文所用到的，術語“以改變的或迷亂的細胞因子活性為特征的狀態(tài)”包括所有細胞因子調節(jié)的或調整的病理或損傷，這些病理和損傷包括免疫、發(fā)炎和與損傷相關聯(lián)的痊愈過程。熟練技術人員可以通過鑒定與健康個體中的正常水平相比某特定細胞因子升高或降低的水平或活性來確認這種狀態(tài)。測定這種正常水平的方法是本領域所公知的。
以改變的或迷亂的細胞因子活性為特征的狀態(tài)包括，但不限于，廢用性去適應，諸如發(fā)生在器官移植時的器官損壞；與癌癥化療相伴的負反應；肥胖；諸如由自由基和氧化氮活動介導的糖尿病和動脈硬化癥的疾?。患毦鷥?nèi)毒性膿毒和相關休克；疼痛；惡?。怀扇撕粑щy綜合癥；和自身免疫或其它病理性免疫疾病或反應，如過敏性反應，關節(jié)炎，腸炎，腎小球性腎炎，系統(tǒng)狼瘡紅斑，移植體粥樣硬化和諸如Chagas氏病的寄生蟲介導的免疫機能障礙。
細胞因子調節(jié)劑可以是，例如，包括本文描述的氨基酸或氨基酸類似物的肽，除上面提供的例子外，其它細胞因子調節(jié)劑肽的代表例子包括1)Ac-Nle-Gln-His-(D)Phe-Arg-(D)Trp-Gly-OH；2)Ac-Nle-Gln-His-(D)Phe-Arg-(D)Trp-Gly-NH2；3)Ac-Nle-Gln-His-(D)Phe-Arg-(D)Trp-Gly-OC2H5；4)Ac-Nle-Gln-His-(D)Phe-Arg-(D)Trp-Gly-NH-NH2；5)Ac-Nle-Asn-His-(D)Phe-Arg-(D)Trp-Gly-NH2；6)Ac-Nle-Asn-His-(D)Phe-Arg-(D)Trp-Gly-OH；7)Ac-Nle-Gln-His-(D)Phe-Arg-(D)Trp-Gly-NHCH2CH2Ph；8)Ac-Nle-Gln-His-(D)Phe-Arg-(D)Trp-Gly-NHCH2Ph；
10)Ac-Gln-His-(D)Phe-Arg-(D)Trp-Gly-NH2；11)Ac-Nle-Gln-His-(D)Phe-Arg-(D)Trp-NH2；12)Ac-His-(D)Phe-Arg-(D)Trp-Gly-NH2；13)His-(D)Phe-Arg-(D)Trp-NH2；14)Ac-His-(D)Phe-Arg-(D)Trp-OH；和15)Ac-His-(D)Phe-Arg-{(D)Trp(CH2)}-(NAc)Gly-NH2，其中{(D)Trp(CH2)}是(D)Trp的類似物，在此H2替代了α-羰基氧，(NAc)Gly是帶有一個N-乙?；母拾彼嵫苌?。
上面描述的細胞因子調節(jié)劑肽部分地以一個具有(D)Phe-Arg-(D)Trp氨基酸序列或(D)Trp類似物的核心結構為特征，更優(yōu)選的是具有His-(D)Phe-Arg-(D)Trp核心氨基酸序列或(D)Trp的類似物。本文的氨基酸以通用的三字母代碼指示，(D)指明某氨基酸具有“D”構型，與自然產(chǎn)生的L-氨基酸相反。本領域熟練技術人員應該明白沒有給出具體構型的氨基酸均為(L)-氨基酸。在上面例舉的肽中，“Nle”是正亮氨酸的三字母代碼，“Ph”代表一個“苯基”基團(C6H5)。
諸如上面描述的細胞因子調節(jié)劑肽是根據(jù)Merrifield的固相肽合成方法(J.Am.Chem.Soc.，852149(1964)，在本文作為參考文獻)的改進方法合成的，或可以用本領域所公知的標準溶液方法合成(參見，例如，Bodanzsky，M.，Principles of PeptideSynthsis2nd revised ed.(Springer-Verlag，1988 and 1993)，在本文作為參考文獻)。由Merrifield的方法制備的肽可以用諸如Applied Biosystems 431A-01肽合成儀(Mountain View，CA)合成，或使用Houghten，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA825131(1985)描述的人工肽合成技術(引入本文作為參考文獻)。
肽用氨基酸或氨基酸類似物合成，其活性基團有必要用如t-丁基二碳酸酯(t-BOC)基團或芴甲氧羰基(FMOC)基團來保護。氨基酸和氨基酸類似物可以商購得到(Sigma ChemicalCo.；Advanced Chemtec)或用本領域所公知的方法合成。用固相方法合成的肽可以結合到包括4-甲基二苯甲基胺(MBHA)，4-(氧甲基)苯乙酰胺和4-(羥甲基)苯氧甲基-共聚(苯乙烯-1％二乙烯苯)(王氏樹脂)的樹脂上，所有樹脂均可從市場買到，或結合到p-硝基苯并酚肟聚合物(肟樹脂)上，此樹脂可以按De Grado and Kaiser，J.Org.Chem.473248(1982)的描述合成，引入本文作為參考文獻。
本領域熟練技術人員應該知道摻入肽的氨基酸或氨基酸類似物的選擇部分依賴于細胞因子調節(jié)劑所要求的特定物理、化學或生物學特性。這些特性部分地由細胞因子調節(jié)劑的給藥途徑或患者需要細胞因子調節(jié)劑發(fā)揮作用的部位所決定。
肽內(nèi)反應性基團的選擇性修飾還可以給予細胞因子調節(jié)劑附加的期望特性。當肽還與樹脂結合時就可以對其進行操作以獲得諸如乙?；牡腘-端修飾化合物，或用氟化氫或相當?shù)臄嗔言噭㈦膹臉渲弦谱卟⒌玫叫揎?。含有C-端羧基基團(王氏樹脂)的合成化合物從樹脂上斷裂下來后可以被修飾，在某些情況下可在液相合成之前修飾。修飾肽的N-端或C-端的方法是本領域所公知的，例如包括N-端的乙酰化方法或C-端的酰胺化方法。與此相似，氨基酸或氨基酸類似物側鏈的修飾方法對肽合成領域的熟練技術人員來說是公知的。肽上反應性基團修飾的選擇由熟練技術人員要求的細胞因子調節(jié)劑應具有的特性所決定。
特定的環(huán)狀肽也可以作為有效的細胞因子調節(jié)劑。環(huán)狀肽可以通過誘導，例如，肽的N-端氨基基團和C-端羧基基團之間共價鍵的形成來獲得。例如，環(huán)(His-(D)Phe-Arg-(D)Trp)肽，它可以通過誘導His和(D)Trp之間共價鍵的形成來產(chǎn)生，并具有細胞因子調節(jié)活性。作為一種選擇，通過在末端反應性基團和反應性氨基酸側鏈之間或在兩個反應性氨基酸側鏈之間形成共價鍵，也可以獲得環(huán)狀肽。本領域熟練技術人員應該知道特定環(huán)狀肽的選擇由肽上的反應性基團和肽的期望特性所決定。例如，環(huán)狀肽可以使細胞因子調節(jié)劑在體內(nèi)增強穩(wěn)定性，增加可溶性，降低免疫原性，或降低清除作用。
新合成的肽可以用諸如下面詳細描述(參見實施例1)的反相高效液相色譜(RP-HPLC)的方法純化，或用其它的基于肽的大小和電荷的分離方法。純化的肽可以用諸如下面詳細描述(參見實施例1)的氨基酸分析和質譜分析和其它公知的方法來定性。
本發(fā)明還涉及包括一種或多種細胞因子調節(jié)劑和一種藥物可接受載劑的藥物組合物。藥物可接受載劑是本領域所公知的，并且包括水溶液如生理緩沖鹽溶液或其它緩沖液，或者溶劑或載體如乙二醇、甘油、油類如橄欖油或者可注射的有機酯等。
一種藥物可接受載劑可以含有起，例如，穩(wěn)定細胞因子調節(jié)劑或者增加調節(jié)劑吸收作用的生理可接受化合物。這類生理可接受化合物包括，例如，碳水化合物，如葡萄糖、蔗糖或者葡聚糖，抗氧化劑，如抗壞血酸或者谷胱甘肽，螯合劑，低分子量蛋白或其它穩(wěn)定劑或者賦形劑。本領域熟練技術人員應該知道包括生理可接受化合物的藥物可接受載劑的選擇依賴于，例如，細胞因子調節(jié)劑的給藥途徑和特定細胞因子調節(jié)劑的特殊生理生化特性。
為了調節(jié)患者因病理而改變的細胞因子活性(包括降低和升高)，可以用上面描述的細胞因子調節(jié)劑或含有細胞因子調節(jié)劑的藥物組合物給患者用藥。例如，可以用此肽或組合物治療外傷，細菌膿毒和內(nèi)毒性休克，炎癥，疼痛，惡病，成年人呼吸困難綜合癥，移植體粥樣硬化，和諸如關節(jié)炎，腸炎，系統(tǒng)狼瘡紅斑的病理性免疫疾病和其它自身免疫機能障礙，每一種病變都是以病理性升高的炎癥細胞因子活性為特征。
如本文所用到的，術語“病理性升高的”意思是細胞因子活性升高至超過正常人群的活性水平，并與病理性反應相關。例如，某特定組織中的IL-1如IL-1β的正常水平可以通過在人群中大量采樣來測定。一個患有以細胞因子誘導的病理效應為特征的疾病的患者可以通過測定其細胞因子活性方法來容易地鑒定，其細胞因子活性病理性地升高至超過正常范圍并導致諸如發(fā)熱等的病理反應。
另外，正如下面所詳細描述的一樣，本發(fā)明的肽或藥物組合物還可以用于治療肥胖，廢用性去適應和氧化氮介導的疾病，如糖尿病和腎小球性腎炎，移植體粥樣硬化，復雜硬化，和降低癌癥化療試劑的副作用，保護器官免受由化療試劑，抗真菌試劑(兩性霉素)，抗細菌試劑(氨基糖苷抗菌素)，和抗病毒試劑(疊氮胸苷)誘導的損害，上述所有狀態(tài)都與病理性改變的細胞因子水平相關聯(lián)。廢用性去適應改變的細胞因子水平與一系列導致廢用性去適應的狀態(tài)相關聯(lián)，如太空飛行，固定術，脊索損傷，臥床休息，和外傷。導致廢用性去適應的其它狀態(tài)的例子有模擬失重，投擲，和神經(jīng)切除。
例如，太空飛行可改變很多免疫反應和免疫反應的調節(jié)成分，包括細胞因子系統(tǒng)。太空飛行和太空飛行的模擬系統(tǒng)影響包括白介素和TNF的各種細胞因子的產(chǎn)生和激活。在太空飛行的第一天，IL-6和IL-2的水平升高，從太空飛行返回后恢復正常。
細胞因子還調整造骨細胞的功能，IL-1和TNF與由固定術，臥床休息和脊索損傷造成的骨內(nèi)礦質密度快速脫鈣和損失有牽連。細胞因子表達和傷后增加的逆行性轉運的相關性暗示細胞因子在外周神經(jīng)損傷中起作用。臥床休息，當與口服類固醇結合時，對由細胞因子介導的急性期反應產(chǎn)生一個特定的快速系統(tǒng)效應。
本發(fā)明的一種細胞因子調節(jié)劑或含有此肽的組合物可以通過降低或改善與改變的細胞因子活性相關的廢用性去適應的副作用而用于治療廢用性去適應。副作用包括，例如，肌肉質量、骨密度、鍛煉能力和氧消耗的降低，和肌肉組織中諸如檸檬酸合成酶的氧化和抗氧化酶類水平的降低。器官保護細胞因子還在器官損害和器官保護中起重要作用。例如，細胞因子顯著地影響如下病理和狀態(tài)如器官移植，尤其是移植器官的排斥反應，移植體粥樣硬化，局部缺血-再灌注，環(huán)孢菌素誘導的腎中毒，心肌梗塞，和中風。
關于器官移植，細胞因子，尤其是腫瘤壞死因子(TNF)，是異源移植排斥反應的重要中介者?；寄I臟，肝臟和心臟異源移植排斥反應的患者中，血清TNF水平升高。在排斥大鼠心臟和腎臟異源移植體和人腎臟和肝臟移植體中已經(jīng)顯示出TNF存在的進一步證據(jù)。在腎臟移植患者中的劇烈排斥反應伴隨著血清IL-6水平的提高。Ray et al.，J.Am.Soc.Nephr.2(12)5214-5221(1992)報道在這種反應期間使用糖皮質激素可導致IL-6水平的迅速和顯著的下降，同時排斥反應的劇烈性降低。本發(fā)明的細胞因子調節(jié)劑在降低這種排斥反應的劇烈性和由此引起的損害方面有相似的作用。
給器官移植患者使用諸如環(huán)孢菌素的免疫抑制劑也影響細胞因子活性，引起導致腎臟損害的環(huán)孢菌素誘導的腎中毒。調節(jié)細胞因子的制劑，如本發(fā)明的細胞因子調節(jié)劑，可以有效地降低環(huán)孢菌素誘導的腎中毒。
另外，本發(fā)明的細胞因子調節(jié)劑可以保護器官免受與局部缺血-再灌注有關的損害，包括腎臟中腎小球濾過率的降低和血管抗性的增高。局部缺血-再灌注損害也與細胞因子的升高有關聯(lián)。IL-1和TNF介導心肌局部缺血，在骨骼肌局部缺血的再灌注期時IL-1的水平提高。增加的TNF釋放導致肝臟的中等和嚴重局部缺血損害。
因此，本發(fā)明提供了一種給器官移植患者使用細胞因子調節(jié)劑，以保護患者的器官免受損害的方法。要避免的器官損害可以是如下狀態(tài)或病理的結果，如器官移植、使用諸如環(huán)孢菌素的免疫抑制劑，局部缺血-再灌注，心肌梗塞，中風的結果等等。
本文用到的“損害”包括對整個器官的損害，如器官的機能障礙，或對器官的某一組織的損害。在很多例子中，這種損害不只牽涉細胞因子水平的增加，也與自由基的增加有關。例如，因局部缺血導致的激活的白細胞釋放氧自由基并釋放對白細胞有趨化性的諸如細胞因子和PAF的攻擊性因子。這導致一個循環(huán)，其中氧自由基和中介因子如細胞因子是局部缺血后損害加重的原因。
自由基和細胞因子可誘導的損害的類型包括，但不限于炎癥，粥樣硬化，血管壁通透性增加，纖維化和壞死。這些和其它類型的損害可以用本領域所公知的方法進行組織形態(tài)學評估。損害還可以用反映器官機能障礙的生理和生化參數(shù)的變化來證實，這些參數(shù)對某一特定的器官或組織是專一的，并可以用本領域所公知的技術進行常規(guī)測量。例如，指示腎臟損害的腎臟機能障礙可導致腎小球濾過率和腎臟血流量的降低，和腎臟血管抗性的增強。可用作組織和器官損害早期指標的生化參數(shù)的例子包括增加的氧化氮或丙二醛水平。丙二醛是脂類過氧化的副產(chǎn)物，因此可指示自由基水平。此外，也可以測定諸如細胞死亡的指示劑乳酸脫氫酶等酶類水平的增加。
可以使用本發(fā)明的細胞因子調節(jié)劑保護的器官包括，但不限于心臟，腎臟，肝臟，肺，大腦，肌肉，皮膚，或骨骼?？梢杂帽景l(fā)明來保護的器官內(nèi)組織的例子有皮膚內(nèi)的上皮。還包括可以移植的或因使用免疫抑制劑引起的副作用的器官，和遭受局部缺血-再灌注，梗塞，中風或其它可導致細胞損害或死亡的特定狀態(tài)或病理的器官。同時可以有超過一個的器官被保護。癌癥化療本發(fā)明的細胞因子調節(jié)劑或含有該制劑的組合物還可以用于癌癥化療，以降低癌癥化療制劑的腎中毒效應或其它副作用。
諸如順式氨鉑，Taxol和Adriamycin的癌癥化療制劑誘導和加強細胞因子的產(chǎn)生。Taxol，一種穩(wěn)定微管的抗贅生性制劑，誘導TNF和IL-1的表達并加強巨噬細胞中TNF的產(chǎn)生。接受順式氨鉑治療的患者中IL-6和TNF的濃度增加，同時在患腎臟或肝臟中毒的患者中細胞因子濃度特別地提高。在癌癥患者化學-體溫過高時細胞因子的產(chǎn)生也增加。當使用含有順式氨鉑的體溫過高-誘導加熱的溶液給藥時測量TNF和IL-6，治療開始后30分鐘IL-6顯著增加，TNF值只是稍稍提高。
如實施例中所示，在癌癥化療中使用本發(fā)明的細胞因子調節(jié)劑可以降低癌癥化療制劑的腎中毒效應。另外，可以給接受癌癥化療的患者使用此肽以降低化療藥物的其它副作用，包括但不限于，惡心，嘔吐，流鼻涕，厭食，疲勞，和其它器官功能障礙。
包括糖尿病和腎小球性腎炎的氧化氮和細胞因子介導的疾病細胞因子和氧化氮(NO)都是一系列疾病狀態(tài)的重要中介因子，包括，例如，糖尿病和腎小球性腎炎。在早期胰島素依賴型糖尿病中細胞因子和NO調節(jié)β-細胞損害。IL-1，干擾素γ和TNF誘導胰島NO。在NO產(chǎn)生的同時，IL-1，干擾素γ和TNF破壞胰島功能，降低葡萄糖水平和降低葡萄糖誘導的胰島素釋放。大多數(shù)由細胞因子引起的對胰島細胞的有害效應可以通過阻止NO的產(chǎn)生來避免。雖然一些研究顯示分離的人胰島對細胞因子和NO的抑制效應的抗性比分離的嚙齒動物胰島強。但是細胞因子可以抑制人胰島功能而與其對NO產(chǎn)生的效應無關。
細胞因子和NO還影響腎小球性腎炎引起的損害的程度。在腎炎中TNF和IL-1可增加腎小球損傷的嚴重性，因此在臨床中它們可能在調整腎小球損傷中是重要的。Karker etal.，Clin.Expt.Immunol.90(2)312-318(1992)報道在腎小球性腎炎中抑制細胞因子的制劑可有效地降低增高的白蛋白水平和組織損害。其它研究揭示誘導性氧化氮合成酶(iNOS)的體內(nèi)誘導發(fā)生在免疫復合體腎小球性腎炎中(Jansen et al.，Kid.Internat.45(4)1215-1219(1994))。
本發(fā)明的細胞因子調節(jié)劑可以用于治療患有由氧化氮和細胞因子介導的疾病的患者，如糖尿病和腎小球性腎炎。如本文所用到的，術語“治療”包括降低或緩解與由NO和細胞因子介導的特定疾病狀態(tài)相關的一或多種癥狀或狀態(tài)的方法。例如，治療糖尿病可以通過降低糖尿病患者的葡萄糖水平來表明。細胞因子調節(jié)劑對體重的效應細胞因子調節(jié)劑對降低患者的體重有用。特別是，細胞因子調節(jié)劑對降低肥胖患者的體重有用。肥胖與非胰島素依賴型糖尿病(NIDDM)之間的聯(lián)系是本領域所公知的(參見Hotamisligil and Spiegelman，Diabetes 431271-1278(1994a))。在肥胖患者的脂肪組織中鑒定出TNF-α的表達增加，TNF-α表達的增加暗示其在這些肥胖患者中出現(xiàn)NIDDM的情況中有作用(Hotamisligil et al.，J.Clin.Invest.952409-2415(1995))。但是，在一個大鼠肥胖/糖尿病模型，Zucker fa/fa大鼠模型中使用與TNF受體結合的抗體中和TNF活性的努力沒有產(chǎn)生明顯的體重降低(Hotamisligil et al.，J.Clin.Invest.941543-1549(1994b))。
引人注目的是，給正?；蚍逝执笫笫褂眉毎蜃诱{節(jié)劑EX-2，根據(jù)給藥劑量的不同，引起了體重增長率的顯著降低或體重的顯著降低(參見實施例20)。如本文所用到的，術語“體重的降低”廣泛地用于表示體重的現(xiàn)實降低或與一段時間內(nèi)預期的正常體重增加相比體重增加率的降低。如實施例20所示，EX-2對正常(非肥胖)大鼠的體重產(chǎn)生小的但明顯的降低。這些結果指示細胞因子調節(jié)劑可引起體重增加率的降低和體重的降低。
EX-2治療的大鼠中出現(xiàn)的體重降低與增加的新陳代謝率相關，新陳代謝率的增加由增加的靜止氧消耗決定。這些結果顯示細胞因子調節(jié)劑也對增加患者的靜止氧吸收有用。正如上面所討論的，細胞因子調節(jié)劑還可以減輕由于(例如)廢用性去適應而產(chǎn)生的最大氧消耗的降低。增加患者最大氧消耗的能力可對患者提供明顯的臨床優(yōu)勢，如，遭受充血性心力衰竭或其它以氧吸收不足為特征的狀態(tài)的患者，如在廢用性去適應期間發(fā)生的氧消耗降低(參見實施例13)。另外，廢用性去適應的結果顯示用細胞因子調節(jié)劑連續(xù)治療至少約兩個星期可以在患者內(nèi)產(chǎn)生積極的適應性變化，導致增強的需氧能力和鍛煉表現(xiàn)。因此，細胞因子調節(jié)劑可進一步地用于增加患者的氧消耗。如本文所用到的，術語“增加氧消耗”或“增加氧吸收”廣泛地用于表示正常的靜止或最大氧消耗基線水平以上的增加或期望的靜止或最大氧消耗損失的降低。人癌癥化療引起的副作用的治療細胞因子調節(jié)劑可以用于改良或降低癌癥化療制劑的副作用。在治療某癌癥期間或預防期間，一種細胞因子調節(jié)劑可以與一種癌癥化療制劑聯(lián)合用藥，例如，與用于降低乳腺癌再發(fā)生的Taxol聯(lián)合用藥。
實施例19披露了細胞因子調節(jié)劑EX-2對改良諸如順式氨鉑，Taxol和Adriamycin的癌癥化療制劑的副作用的用途，這些癌癥化療制劑可誘導和增強細胞因子的產(chǎn)生。
通過靜脈內(nèi)注射的方法，可以給正在進行或將要進行癌癥化療或癌癥化學預防期間的患者使用EX-2。例如，順式氨鉑，Taxol，Adriamycin或其它化療或放療制劑可以與一種細胞因子調節(jié)劑聯(lián)合用藥以降低或抑制化療或放療引起的副作用。增加哺乳動物內(nèi)的細胞因子水平本發(fā)明的細胞因子調節(jié)劑或含有該制劑的組合物，還可以用于增加一或多種細胞因子的生理水平。例如，某特定狀態(tài)可降低某細胞因子的水平和活性，從而全部或部分地抑制某免疫反應或免疫系統(tǒng)。以藥物有效劑量的一種細胞因子調節(jié)劑給藥可以增強細胞因子的的水平或活性，從而降低免疫抑制的水平。
細胞因子調節(jié)劑可以增加哺乳動物例如人體內(nèi)的IL-10水平(參見圖2和3)。IL-10可以封閉一些炎癥細胞因子的激活，包括TNF，IL-1和IL-6，而增量調節(jié)諸如IL-12的細胞因子。IL-10還刺激肥大細胞和胸腺細胞的增生。IL-10抑制幾種單核細胞和巨噬細胞的功能，例如包括，通過抑制II類MHC表達給T細胞提供抗原；IL-1，IL-6，IL-8，CSF，和TNF的合成；和抗微生物的活性。被抑制的抗微生物活性包括抑制氧化氮和殺微生物代謝物的產(chǎn)生。單核細胞和巨噬細胞IL-10介導的抑制的結果是一些類型的協(xié)助T細胞的活性被抑制。尤其是，諸如延遲型過敏細胞和細胞溶解T細胞的TH1細胞被抑制，這些細胞負責細胞介導的功能。TH1細胞抑制的進一步結果是TH2細胞活性增加，尤其是增加B細胞激活，細菌和驅蟲劑抗性和過敏反應的T細胞子集。如本文所披露的，使用細胞因子調節(jié)劑可增加哺乳動物血漿中IL-10水平(參見實施例17和18和圖2和3)，因此對調整，例如，患者的免疫反應有用。
細胞因子調節(jié)劑或含有該肽的藥物組合物可以用于治療上述任一種的病理和狀態(tài)。本領域熟練技術人員應該知道包括細胞因子調節(jié)劑的藥物組合物可以通過各種各樣的途徑給予細胞因子活性提高的患者，給藥途徑包括，例如，口服，陰道內(nèi)，直腸，或腸胃外，如靜脈內(nèi)，肌肉內(nèi)，皮下，眶內(nèi)，囊內(nèi)，腹膜內(nèi)，池內(nèi)或通過皮膚的被動或促進吸收，如使用皮膚貼片或透皮離子電滲療法。另外，組合物可以通過注射，插管法，口服或局部給藥，后者可以是被動的，例如，通過藥膏或粉末的直接使用，或是主動的，例如，使用鼻腔噴霧器或吸入器。細胞因子調節(jié)劑還可以用局部噴射給藥，其中本成分中的一個組成是一個適當?shù)耐七M劑。如果需要，本藥物組合物還可以與脂質體，微球體或其它多聚物基質合并使用(Gregoriadis，Liposome Technology，Vol.1(CRC Press，Boca Raton，F(xiàn)L1984)，在本文作為參考文獻列出)。例如，由磷脂或其它脂類組成的脂質體是易于制造和使用的無毒的、生理可接受的和可代謝的載劑。
細胞因子可以在局部表達，如在感染部位，或可以系統(tǒng)表達，例如，在廢用性去適應或某免疫反應中。細胞因子表達可以誘導患者的熱病(發(fā)燒)和痛覺過敏(對疼痛極度敏感)，和巨噬細胞和單核細胞的激活，這些細胞的激活使患者產(chǎn)生或進一步加強炎癥反應。因為細胞因子表達可以是局部的或系統(tǒng)的，所以本領域熟練技術人員應該根據(jù)患者體內(nèi)細胞因子的來源和分布來選擇細胞因子調節(jié)劑的特定給藥途徑和方法。例如，在遭受諸如廢用性去適應的系統(tǒng)狀態(tài)的患者中，由一種細胞因子調節(jié)劑組成的藥物組合物可以通過靜脈內(nèi)，口服或其它可以使細胞因子調節(jié)劑系統(tǒng)分布的方法給藥。但是，在遭受由細胞因子局部表達引起的病理的患者中，如急性呼吸困難綜合癥，可以將細胞因子懸浮或溶解在適當?shù)乃幬锟山邮茌d劑中，并用鼻腔噴霧器(例如)直接對肺給藥。
為了調節(jié)細胞因子的生物學活性，細胞因子調節(jié)劑必須以有效劑量給藥，有效劑量為每次注射每千克體重約0.0001至0.5mg，或另外給藥方式的有效劑量為每千克體重約0.0001至100mg。全部有效劑量可以在一段相當短的時間內(nèi)以一個單劑量給患者用藥，或者是丸劑或者是通過注射，或用分次治療方案給藥，即在一段更長的時間內(nèi)多次用藥。本領域熟練技術人員應該知道獲得患者所需的細胞因子調節(jié)劑濃度的用藥有效劑量依賴于很多因素，包括患者的年齡和健康狀況，還有給藥途徑和治療次數(shù)?？紤]到這些因素，熟練技術人員應該調整特定劑量以獲得有效調節(jié)細胞因子活性的有效劑量。
細胞因子調節(jié)劑的例子和細胞因子調節(jié)劑在阻止或減小或消除細胞因子介導的負生物學效應的療效的例子提供如下并總結如表I-V。如下面所描述的，諸如實施例2所描述的細胞因子調節(jié)劑肽可以有效調節(jié)小鼠體內(nèi)細胞因子的表達(實施例3和4)并減輕細胞因子介導的疼痛，腫脹，發(fā)熱和致死現(xiàn)象，這些作用是用本領域認可的小鼠，大鼠和兔模型系統(tǒng)來顯示，可作為是否對人有效的預測(實施例5至12)。
本文所描述的化合物可用作藥劑治療諸如炎癥，疼痛，惡病和病理性免疫疾病，如關節(jié)炎，腸炎，系統(tǒng)狼瘡紅斑和其它自身免疫機能障礙，這些疾病都是以改變的細胞因子活性為特征。另外，實施例提供了本發(fā)明的細胞因子調節(jié)劑如下用途的證據(jù)，這些用途包括緩解廢用性去適應的副作用方面(實施例13)，保護器官，尤其是在局部缺血-再灌注損傷和環(huán)孢菌素誘導的腎中毒后(實施例14)，降低癌癥化療的腎中毒效應(實施例15)，治療與氧化氮有關的疾病狀態(tài)，包括糖尿病和腎小球性腎炎(實施例16)和降低個體的體重(實施例20)。
還有進一步的證據(jù)由實施例17至19提供，這些證據(jù)證明本發(fā)明的制劑可調節(jié)細胞因子的表達，并因此對治療上面提到的狀態(tài)是有用的。使用細胞因子調節(jié)劑后，哺乳動物包括小鼠(例17)和人(例18)中增高的細胞因子水平提供了本發(fā)明的制劑調節(jié)細胞因子表達和活性的額外證據(jù)。
下面這些實施例意在描述而非限制本發(fā)明。實施例1 細胞因子調節(jié)劑肽的合成本實施例描述細胞因子調節(jié)劑肽的固相合成方法。A. Nle-Gln-His-(D)Phe-Arg-(D)Trp-Gly-NH2具有Nle-Gln-His-(D)Phe-Arg-(D)Trp-Gly(“EX-1”)氨基酸序列的一種細胞因子調節(jié)劑肽用Merrifield(1964)的固相肽合成方法的改進方法合成。簡而言之，含有t-BOC甘氨酸衍生物的MBHA樹脂(Advanced Chemtech；Louisville，KY)加到適于固相肽合成的反應容器中(參見Houghten(1985)，supra)。樹脂用亞甲基氯洗三次，t-BOC保護性基團在亞甲基氯中用含有1-2％苯甲醚的三氟乙酸(TFA)除去。然后樹脂用亞甲基氯洗滌并用二異丙基乙酰胺處理。
肽通過在二甲基甲酰胺中加入3.2當量的N-甲?；?BOC-保護的D-色氨酸和3.0當量的二環(huán)己基碳二亞胺來延伸。反應用茚三酮監(jiān)測并進行25分鐘，然后樹脂用亞甲基氯洗滌。用二-tolulyl-BOC-精氨酸重復上述步驟，然后用需要的被保護的氨基酸直到完整的七肽合成。
七肽合成后色氨酸殘基上的N-甲酰基保護基團用含20％六氫吡啶的DMF除去，樹脂用亞甲基氯洗滌。肽用含10％苯甲醚的無水氟化氫從樹脂上切下來，濃縮反應混合物并用含水的乙酸抽提殘余物。移走含有溶解樣品的乙酸部分，殘余物用水洗滌。將洗滌物加到乙酸部分中并將合并樣品濃縮。最終的肽粗提物用RP-HPLC純化(Vydac C-18柱，用1到60％溶液B梯度30分鐘(溶液A是0.1％TFA/水，溶液B是0.1％TFA/乙腈)。
RP-HPLC純化后測定肽純度為97％(Vydac C-18柱，用等權的24％溶液B；上述的溶液A和溶液B；在215nm處測定光吸收)。純化七肽的質量用BioIon 20 Mass Analyer的飛行檢波器的時間通過等離子體解吸附質譜分析來測定。測定的EX-1肽的質量為942.7，這實際上與期望的分子量(MS(M+1)＝942.2)相同。B.His-(D)-Phe-Arg-{(D)Trp(CH2)}-(NAc)Gly-NH2具有His-(D)-Phe-Arg-{(D)Trp(CH2)}-(NAc)Gly-NH2氨基酸序列的本發(fā)明的細胞因子調節(jié)劑按上面的描述合成并純化，但有下列改進。Boc-(D)Trp用甲基氯甲酸和鹽酸N，O-二甲基羥酰胺轉變成相應的N，O-二甲基氧肟酸。用氫化鋰鋁還原色氨酰胺產(chǎn)生Boc-(D)Trp醛。
Boc-(D)Trp醛的溶液和含氰基氫硼化鈉的DMF加到結合在Rink酰胺樹脂上的甘氨酸中，樹脂在含有1％乙酸的DMF中。當還原的氨基化完成后，第二個胺用乙酸酐乙?；?，樹脂用1∶1的三氟乙酸和亞甲基氯搖動以除去Boe基團。剩余的氨基酸的繼續(xù)連接在一個肽合成儀(applied Biosystems)上完成以產(chǎn)生His-(D)-Phe-Arg-{(D)Trp(CH2)}-(NAc)Gly-NH2肽。肽用上面描述的方法從樹脂上切下來并進行純化。實施例2 乙?；毎蜃诱{節(jié)劑肽的制備本實施例描述制備N-乙?；募毎蜃诱{節(jié)劑肽的方法。
七肽Nle-Gln-His-(D)Phe-Arg-(D)Trp-Gly-NH2按實施例1中A.的描述合成，但是在從樹脂上切下新合成的肽之前，通過用乙酸酐，二異丙基乙酰胺和亞甲基氯處理2小時將肽的氨基末端乙?；Ｒ阴；?，按上面描述的方法將七肽從樹脂上切下來，用RP-HPLC純化并用質譜分析定性。實施例2的乙?；唠?，本文命名為EX-2，測定純度為98％，測定質量為985.2道爾頓，與預期分子量相同。
與實施例1和實施例2描述的相似方法被用于合成本發(fā)明的其它細胞因子調節(jié)劑，包括Ac-(環(huán)己基)Gly-Gln-His-(D)Phe-Arg-(D)Trp-Gly-NH2(“EX-3”)；Ac-(D)Phe-Arg-(D)Trp-NH2(“EX-4”)；Ac-His-(D)Phe-Arg-(D)Trp-Gly-NH2(“EX-5”)；和Ac-His-(D)Phe-Arg-(D)Trp-NH2(“EX-6”)。用實施例1中B.描述的方法制備Ac-His-(D)-Phe-Arg-{(D)Trp(CH2)}-(NAc)Gly-NH2，只是在從樹脂上切下肽之前用過量的乙酸酐將肽乙酰化。實施例3 降低小鼠中脂多糖誘導的腫瘤死亡因子水平本實施例描述兩種細胞因子調節(jié)劑在降低脂多糖(LPS；內(nèi)毒素)處理的小鼠體內(nèi)腫瘤壞死因子(TNF)水平中的療效。
體重約為20g的Balb/c雌鼠分成兩組，一個對照組和一個處理組。通過腹腔內(nèi)注射給對照組小鼠使用溶于0.9％鹽水的5mg/kg的LPS。處理組小鼠首先用溶于鹽水的30μgEX-2或150μg EX-3注射，注射EX-2或EX-3后一分鐘，按對照組的描述給小鼠使用LPS。
在LPS使用后不同時間段從處理和對照小鼠的眶竇內(nèi)采血樣，直至使用LPS后4小時。3000g離心5分鐘分離血漿，然后用4倍體積的含有1％牛血清白蛋白的1X磷酸鹽緩沖液稀釋。100μl血清樣品用ELISA分析TNF-α(Genzyme；Cambridge MA)。
測定來自每組的六只小鼠中的平均(+/-SEM)TNF-α水平并計算TNF水平下降的百分數(shù)。如表I所示，用EX-2處理的小鼠與未處理的對照組小鼠相比TNF-α水平下降50％。用EX-3處理的小鼠與未處理的對照組小鼠相比TNF-α水平下降56％和用EX-4處理降低53％(表II)。這些結果指示本發(fā)明的肽可以抑制LPS誘導的細胞因子活性。
表I細胞因子調節(jié)劑EX-2的生物學數(shù)據(jù)生物學測試劑量療效TNF水平的下降 30μg/只小鼠 50％IL-6水平的下降 300μg/只小鼠 60％Carageenan誘導的爪腫脹的下降 1μg/只小鼠45％LPS誘導的致死性的抑制 11×300μg/只小鼠 83％IL-1誘導的痛覺過敏的下降 1μg/只小鼠125％LPS誘導的PMN計數(shù)的下降 100μg/kg 58％IL-1誘導的發(fā)熱的下降 50μg/kg 45％150μg/kg 52％花生四烯酸誘導的耳腫脹的下降 100μg/只小鼠 72％嗎啡誘導的呼吸抑制的下降 10+20+20μg/kg/兔 50％表II細胞因子調節(jié)劑EX-3和EX-4的生物學資料生物學測試劑量療效EX-3EX-4TNF水平的下降 150μg/小鼠 56％53％Carageenan誘導的爪腫脹的下降 1μg/小鼠 49％未測LPS誘導的致死性的抑制 11×300μg/小鼠 86％75％IL-1誘導的發(fā)熱的下降 150μg/kg 57％52％花生四烯酸誘導的耳腫脹的下降 100μg/k小鼠62％未測嗎啡誘導的呼吸抑制的下降 10+20+2065％未測μg/kg/兔實施例4 降低小鼠中脂多糖誘導的白介素-6水平本實施例描述細胞因子調節(jié)劑在降低LPS處理的小鼠體內(nèi)白介素-6(IL-6)水平中的療效。
將Balb/c小鼠分組并按上面實施例3的描述處理。在不同的時間段從眶竇采血樣直到6個小時，血清的收集和稀釋按上面的描述進行。100μl樣品用IL-6特異性ELISA測定IL-6水平，按Starnes et al.，J.Immunol.1454185-4194(1990)方法的改進方法進行。
測定來自每組的六只小鼠中的平均(+/-SEM)IL-6水平并計算IL-6水平下降的百分數(shù)。如表I所示，用EX-2處理的小鼠與未處理的對照組小鼠相比IL-6水平下降60％。實施例5 Carageenan誘導的爪腫脹本實施例描述兩種細胞因子調節(jié)劑在緩解炎癥和疼痛中的療效。
Carageenan誘導的爪腫脹用Hiltz and Lipton，Peptides11979-982(1990)；Vinegar et al.，F(xiàn)ed.Proc.46118-126(1987)；和Vinegar et al.，J.Pharmacol.Expt.Therap.16696-103(1969)描述方法的改進方法誘導，每個方法作為參考文獻在本文列出。簡要地說，用7mg/kg酮胺和0.6mg/kg rompun通過腹腔內(nèi)注射麻醉成年Balb/c雌鼠。用彈簧測微計(Swiss Precision Instruments)測定腳爪厚度。腳爪厚度以1/100英寸為單位表示。測量基線后，用0.2ml生理鹽水(對照)和溶于0.2ml的不同劑量的EX-2或EX-3(處理)注射小鼠的后腳墊。第一次注射后馬上注射0.02ml 0.15％K-carageenan(Sigma Chemical Co.；St.Louis，MO.)。
每小時測量一次后腳墊厚度到6小時，測定厚度的變化，計算因EX-2處理而引起的腫脹下降的百分率。如表I和表II所示，腹腔內(nèi)注射1μg EX-2和1μg EX-3使carageenan誘導的腫脹在2小時測量點相應地下降了45％或49％。實施例6 脂多糖誘導的致死性本實施例描述細胞因子調節(jié)劑EX-2，和EX-3和EX-4在降低LPS誘導的膿毒的致死性中的療效。
這些實驗是根據(jù)Rivier et al.，Endocrinology1252800-2805(1989)提供的信息來進行的，在本文作為參考文獻列出。成年Balb/c雌鼠根據(jù)其食欲提供食物和水。用30至300μg溶于0.2ml鹽水的EX-2，EX-3或EX-4(處理組)或只用0.2ml鹽水(對照組)，每4小時腹腔內(nèi)注射小鼠(每組10只小鼠)至40小時。第一次注射后馬上給每只小鼠注射溶于0.2ml鹽水的0.6mg LPS內(nèi)毒素。LPS注射后，給處理組小鼠或對照組小鼠相應地注射EX-2或鹽水。每4小時一次至36小時。
如表I和表II所示，與對照組小鼠相比使用3.3mg EX-2，EX-3，或EX-4(每次300μg，共注射11次)，小鼠的存活率相應地上升83％，86％，和75％。這些結果顯示腹腔內(nèi)注射本發(fā)明的細胞因子調節(jié)劑可以降低LPS誘導的膿毒的致死性。實施例7 白介素-1β誘導的痛覺過敏的下降本實施例描述細胞因子調節(jié)劑EX-2預防疼痛的療效。
這些實驗是按Poole et al.，Br.J.Pharmacol.106489-492(1992)；Follenfantet al.，Br.J.Pharmacol. 9841-43(1989)；和Randall and Sellito，Arch.Internatl.Pharmacodyn.111409-419(1957)描述的方法的改進方法進行的，在本文作為參考文獻列出。成年Sprague-Dawley雄性大鼠(175-275g)用各種各樣的壓力儀器(IITC LifeSciences；Woodland Hills，CA)通過爪壓力技術測量痛覺過敏。使大鼠適應室內(nèi)環(huán)境并在訓練開始前觸摸三天。在開始痛覺過敏實驗前一天，將每只大鼠裝入一個袋中，每隔15分鐘測量一次爪壓力，共兩次。第二天，測試每只大鼠表現(xiàn)出逃避反應(諸如全身掙扎和/或叫喊)的壓力(毫米汞柱)。約有5-10％的大鼠沒有反應并在接下來的實驗中排除這些大鼠。
對爪壓力有反應的大鼠用1ml/kg的體積不同濃度的EX-2(處理)或只用鹽水(對照)腹腔內(nèi)注射進行預處理。20分鐘后，通過足底內(nèi)注射100μl IL-1β(1單位/100μl)。IL-1注射后2小時，對大鼠進行另外兩次爪壓力測試，測定與對照組大鼠相比EX-2處理的大鼠適應的毫米汞柱壓力的上升。如表I所示，與對照組大鼠相比，用1μgEX-2處理增加了大鼠可忍受的壓力，增加幅度為125％。實施例8 成人呼吸困難綜合癥本實施例描述細胞因子調節(jié)劑EX-2在降低LPS處理的大鼠的呼吸困難綜合癥中的療效。
這些實驗用Ulich et al.，Am.J.Pathol.14161-68(1992)和Wheelden et al.，Lab.Animals2629-37(1992)描述的方法的改進方法進行。在本文作為參考文獻列出。成年Harlan Sprague-Dawley雄性大鼠用70mg/kg酮胺和6mg/kg rompun的混合物通過腹腔內(nèi)注射麻醉。在每只麻醉的大鼠的頸部切開一個2-3厘米的口，通過周圍軟組織解剖暴露其氣管。將大鼠懸于一塊近垂直平板上，通過在暴露的氣管喉頭后1厘米位置插入一根與1cc注射器連接的25G×1/2英寸針頭進行氣管內(nèi)注射。
每只大鼠通過緩慢的氣管內(nèi)注射得到0.5ml/kg的鹽水或0.5ml/kg的10mg/ml(5mg/kg)LPS內(nèi)毒素。LPS內(nèi)毒素注射后馬上腹腔內(nèi)注射1ml/kg的鹽水(對照)或含有不同濃度EX-2的鹽水(處理)。將大鼠放在升高的位置上1到2分鐘以有助于LPS和鹽水在肺內(nèi)的分布?？p合切口并讓大鼠蘇醒。氣管內(nèi)注射2和4小時后，再次以鹽水或EX-2腹腔內(nèi)注射相應的對照組和處理組大鼠。
氣管內(nèi)注射后6小時，將大鼠重新麻醉并通過心臟穿刺放空血液。收集并保藏血清。打開頸部和胸部以暴露氣管和肺，用一個27G×3/4英寸的針頭以6×5ml鹽水洗滌肺并收集洗滌液體。
計數(shù)EX-2處理大鼠的支氣管肺泡洗滌液體中的全部多形核白細胞(PMN；中性白細胞)并與對照大鼠中的數(shù)量比較。如表I所示，用100μg/kg EX-2處理抑制了LPS處理的肺中的PMN滲透的增加，抑制率為58％。實施例9 白介素-1β或脂多糖誘導的體溫升高的抑制本實施例描述細胞因子調節(jié)劑EX-2，EX-3和EX-4在大鼠中抑制兩種不同因子誘導的體溫升高中的療效。
雄性Wistar大鼠(45-75天齡)置于溫度為26℃的控溫室中，此溫度對大鼠的正常體溫來說是熱中性的，測試前，大鼠在可自由接近食物和水的房間內(nèi)放置24小時。在研究開始的早晨，將大鼠作好鑒別標記并稱重。將大鼠放入為減少壓力而設計的一個調節(jié)籠中，將溫度探針(YSI probe # 402)插入大鼠直腸3-5厘米測定每只大鼠的體溫。讀數(shù)穩(wěn)定后記錄溫度15秒。1小時后重復測量以建立每只大鼠的基線溫度。
建立基線溫度后，用鹽水，IL-1β或LPS內(nèi)毒素對大鼠進行腹腔內(nèi)注射。然后，用鹽水(對照)或不同濃度的EX-2，EX-3，或EX-4(處理)對大鼠進行腹腔內(nèi)注射。每一小時測定一次大鼠的體溫至6小時，測定EX-2，EX-3，或EX-4對由IL-1β或LPS引起的體溫升高的抑制。
如表I所示，用500μg/kg EX-2處理抑制了52％的IL-1誘導的發(fā)熱。另外，當LPS注射后6小時測定時，用50或150μg/kg EX-2處理相應地抑制了45％或52％的LPS誘導的發(fā)熱。還有，用150μg/kg EX-3或EX-4處理相應地抑制了57％或52％的LPS誘導的發(fā)熱(表II)。這些結果顯示本發(fā)明的不同細胞因子調節(jié)劑可以有效地降低發(fā)熱。實施例10 小鼠中花生四烯酸誘導的耳腫脹的下降本實施例顯示EX-2和EX-3可以降低小鼠中花生四烯酸誘導的耳腫脹。
實驗用體重為18-23g的雌性Balb/c小鼠進行。在局部使用花生四烯酸(AA)前30分鐘用鹽水或100μg EX-2或EX-3進行腹腔內(nèi)注射。用10μl吸管將10μl AA溶液(100mg/ml乙醇；Calbiochem-Novabiochem；San Diego CA)滴于每只小鼠右耳的內(nèi)表面和外表面。將10μl乙醇滴于每只小鼠左耳的內(nèi)表面和外表面。
在使用AA前和60分鐘后用手持式彈簧測徑器測定耳厚度。用在AA處理耳上觀察到的厚度變化減去在對照耳觀察到的變化來計算耳厚度的增加。每組(鹽水和對照)的值是每組中個體小鼠上觀察到的腫脹的平均值。腫脹下降的百分率是基于在鹽水對照組中觀察到的腫脹。如表I和表II所示，EX-2和EX-3相應地降低了72％和62％的AA誘導的耳腫脹。實施例11 嗎啡誘導的兔呼吸抑制的下降本實施例顯示EX-2和EX-3可以降低嗎啡誘導的兔呼吸抑制。
將雄性Shelton兔(3-4kg)束縛，將一個呼吸傳感器(Model F-RCT；Grass Instruments；Quincy MA)安裝在其前肢后的胸部。用EKG電纜將傳感器連接至一個Grass多路描記器上。用一個25G蝴蝶針插入耳部邊緣的靜脈中以建立靜脈內(nèi)給藥途徑。
待兔呼吸穩(wěn)定，然后靜脈內(nèi)注射嗎啡硫酸鹽(2mg/kg，溶于0.5ml鹽水)，監(jiān)視呼吸次數(shù)和呼吸深度10分鐘。注射第二個劑量的嗎啡，10分鐘后，靜脈內(nèi)注射EX-2或EX-3(10μg/kg，溶于0.5ml鹽水)并監(jiān)視20分鐘。以20分鐘的間隔注射兩個附加劑量的EX-2或EX-3(20μg/kg，溶于1.0ml鹽水)，如第一次注射后40和60分鐘。
結果以基線值變化的百分數(shù)計算，以在實驗結束后(80分鐘)處理組的平均值減對照組平均值的差異表示。如表I和表II所示，EX-2和EX-3相應地降低了50％和65％的嗎啡誘導的呼吸抑制。實施例12 口服的細胞因子調節(jié)劑在降低TNF-α水平和LPS誘導的致死性中的效果本實施例描述不同細胞因子調節(jié)劑在降低小鼠LPS誘導的TNF-α水平和致死性中的口服效果。
LPS誘導的致死性研究是根據(jù)Rivier et al.，supra，1989報道的信息來進行的。成年Balb/c雌性小鼠按需提供食物和水。每4小時給小鼠喂食一次溶于100μl鹽水的150μg或300μg EX-2，EX-3，EX-5或EX-6至40小時(總劑量1.65mg和3.3mg，相應地)。對照組小鼠只喂食100μl鹽水。第一次喂食細胞因子調節(jié)劑或鹽水后，馬上腹腔內(nèi)注射溶于0.2ml鹽水的0.6mg LPS。與對照組小鼠(0％)或喂食EX-2或EX-3(0％到11％)相比，在喂食3.3mg EX-5(63％)，1.65mg EX-6(68％)或3.3mg EX-5(44％)的小鼠中觀察到了存活率的統(tǒng)計顯著性上升。
口服細胞因子調節(jié)劑降低LPS誘導的TNF-α水平的能力也做了調查。雌性Balb/c小鼠喂食溶于100μl鹽水的150μg或300μg EX-2，EX-3，EX-5或EX-6。對照組小鼠只喂食100μl鹽水。1分鐘后，腹腔內(nèi)注射0.1mg LPS。按上面例III描述的方法收集樣品并測定TNF-α水平。
測定每組(n＝9-20)小鼠的平均TNF-α水平并計算TNF-α水平下降的百分數(shù)。與對照組小鼠(0％)和喂食EX-2(26％到28％)相比，在喂食150μg EX-3(49％)，300μg EX-3(40％)或300μg EX-5(44％)的小鼠中TNF-α水平顯著地下降了。這些結果顯示本發(fā)明的不同細胞因子調節(jié)劑口服時是有效的。實施例13 大鼠中的廢用性去適應本實施例描述細胞因子調節(jié)劑EX-2在改善大鼠中與14天廢用性去適應相關聯(lián)的副作用中的療效。
此研究使用成年Sprague-Dawley雄性大鼠(355-365g)。大鼠分只安排在標準鼠籠中并適應踏車運動4天。第二天，進行基線尾部放血，隨后于下一天進行最大踏車脅迫測試。脅迫測試后第二天，將大鼠分成適當?shù)奶幚斫M和對照組并通過其尾部將其懸于懸掛籠中，這樣做可以刺激失重并因此使大鼠脫離鍛煉狀態(tài)。另一組對照組大鼠置于有柵格地板的標準大鼠籠中，柵格地板與用在懸掛籠中的相似。所以的大鼠分成每籠一只并按需提供食物和水。每天測量體重和食物消耗。每天兩次腹腔內(nèi)注射1μg/kg或5μg/kg體重的EX-2(處理)，或1ml/kg體重的鹽水(對照)。在第10天，所有大鼠在踏車上進行脅迫測試直到它們耗盡體力。收集VO2最大值和鍛煉時間數(shù)據(jù)并與懸掛前的結果比較。第14天，處死所有大鼠并收集血液，組織和器官進行進一步分析。所有的步驟和測試均蒙眼進行以避免研究者的主觀性。用Student-Newman-Keuls測試的ANOVA來評價組與組之間的統(tǒng)計顯著性(p＜0.05)以進行多重對比。所有的數(shù)據(jù)以平均值±標準誤(SE)的形式報告。
不管處理與否，所有懸掛大鼠的體重均明顯下降。組與組之間的食物消耗沒有明顯差別。所有的大鼠均接受了脅迫測試，其中測量了鍛煉時間和最大VO2值。還有，測試了氧化酶soleus檸檬酸合成酶的水平和脛骨密度。
如表III所示，EX-2對與廢用性去適應相關的很多參數(shù)有明顯影響。每天兩次的低劑量EX-2注射(1或5μg/kg)顯著減弱了廢用性去適應對鍛煉時間，最大VO2，soleus檸檬酸合成酶水平和脛骨密度的影響。更精確地說，當比較鹽水對照組和懸掛組大鼠之間的降低時，EX-2顯著減弱了鍛煉性能參數(shù)，鍛煉時間和最大VO2的降低，減弱百分數(shù)相應為44％和80％。soleus檸檬酸合成酶的降低減弱了50％。脛骨密度測量顯示EX-2顯著減弱了懸掛誘導的骨骼脫礦質化作用50％。這些結果顯示使用本發(fā)明的細胞因子調節(jié)劑可降低廢用性去適應的副作用。
表III廢用性去適應變量％減弱度*鍛煉時間44％**最大VO280％**Soleus檸檬酸合成酶 50％**脛骨密度50％***-與對照組相比懸掛組懸掛誘導下降的％減弱度。
**-比懸掛對照的顯著性增大(p＜0.05)。實施例14 器官保護本實施例描述細胞因子調節(jié)劑EX-2在防止兩個大鼠模型中的腎臟損害中的療效，兩個大鼠模型分別為局部缺血-再灌注模型和環(huán)孢菌素誘導的腎中毒模型。A.局部缺血-再灌注損傷
這些實驗用來測定具有細胞因子調節(jié)特性的肽EX-2是否可以改善腎臟動脈被夾住引起的再灌注誘導的血管收縮作用和腎小球濾過率的下降。在同樣的模型中使用了NSAIDketorolac作為對比。
Sprague-Dawley大鼠(250-300g)用Inactin(120mg/kg)麻醉。確認深度麻醉后，將大鼠用聚乙烯(PE)套管(PE 240)套住氣管，用PE 50套住頸靜脈，股動脈和膀胱，用延伸的PE 50套住左輸尿管。套管完成后，在左腎上方切開一個2厘米的側面切口，暴露腎臟骨盆和血管竇。輕輕解剖并去除左腎動脈周圍的組織。用一個小的血管鉗夾住暴露的腎動脈1小時。
腎動脈夾住前，靜脈內(nèi)注射EX-2(50或500μg/kg)，ketorolac(KETO，1mg/kg)，或載劑。腎動脈夾住后1小時(局部缺血)，輕輕移走血管鉗，小心操作以避免腎動脈或神經(jīng)受損傷。以4μCi/hr的恒定速率開始注入3H標記的菊粉(NEN/Dupont；Wilmington，DE)，(0.6μCi/ml溶于磷酸緩沖鹽溶液(PBS)中)(2ml/hr)。60分鐘的再灌注后，在兩個30分鐘的收集階段中評測腎小球濾過率(GFR)，腎血漿流量(RPF)和腎血管抗性(RVR)。然后將腎臟摘除并進行分析。假操作的和夾住的大鼠用作上面實驗的對照。相對一側腎臟的功能用于確定測量階段的大鼠腎臟功能的穩(wěn)定性。結果顯示EX-2引起腎小球濾過率的增高和血管抗性的降低(表IV)。此數(shù)據(jù)證明本發(fā)明的細胞因子調節(jié)劑有效保護腎臟免受與局部缺血-再灌注相關的損害。
表IV腎臟局部缺血/再灌注(I/R)GFR RVRRPF(ml/mm)假操作 1.0±0.1 1.0±0.1 4.2±0.4I/R+PBS 0.2±0.1 6.6±2.1 0.8±0.2I/R+EX-2 0.5±0.1 1.8±0.2 2.3±0.3B.環(huán)孢菌素誘導的腎中毒本實驗用來證實EX-2是否可以緩解用環(huán)孢菌素A進行免疫抑制治療誘導的腎小球濾過率(GFR)和腎血流量的下降，還有體液和電解質紊亂。
在第一個研究中，將處于環(huán)孢菌素A(CsA)起始治療階段的體重為240-290g的Sprague-Dawley雄性大鼠(n＝43)分成4個體重相當?shù)慕M。分組情況如下(1)對照沒有CsA，沒有EX-2，只用CsA載劑(PBS)口服(PO)和EX-2載劑(也是PBS)腹腔內(nèi)注射處理；(2)CsA用CsA處理(50mg/kg溶于PBS，每天830被動口服9天)并腹腔內(nèi)注射PBS(EX-2載劑)；(3)CsA和50μgCsA處理與第2組相同，外加EX-2(溶于EX-2載劑，每天800和1700腹腔內(nèi)注射50μg/kg)；和(4)CsA和500μgCsA處理與第2和第3組相同，除了劑量為500μg/kg體重外，EX-2處理方案與第3組相似。確認深度麻醉后，將大鼠用PE 240套住氣管，用PE 50套住頸靜脈，股動脈和膀胱。在測量開始前50分鐘注入3H標記的菊粉以評測腎小球濾過率，腎血流量和血漿流量。通過菊粉抽提技術測定腎血流量。在研究的最后，將腎臟摘除以進行組織學分析。
在第二個研究中，將處于環(huán)孢菌素A(CsA)起始治療階段的體重為240-290g的Sprague-Dawley雄性大鼠(n＝43)分成4個體重相當?shù)慕M。此研究的時間進程和方案與第一個相似但有以下例外(1)CsA每日劑量降為30mg/kg并通過皮下給藥(SC)和(2)50μg/kg劑量的EX-2用每天兩次200μg/kg劑量的EX-2替代。500μg/kg劑量的EX-2在此研究中與第一次重復。測定腎臟的血液動力學并測定細胞外液體積。
因為數(shù)據(jù)的分散，此項研究中CsA處理沒有顯著降低腎臟血流量。但是，EX-2處理改進了血流量，其血流量的值不同于對照。在測量細胞外液體積(ECF)的第二個研究中，ECF在對照組和處理組間沒有差異(對照組為27.6±1.9，CsA和載劑組為27.5±1.7，CsA+200μg/kg EX-2組為26.2±0.9，CsA+500μg/kg EX-2組為25.7±1.4％)。
另外還測量了尿蛋白排泄，數(shù)據(jù)顯示與CsA處理大鼠相比盡管EX-2處理明顯增加了GFR但沒有增加尿蛋白排泄。與CsA和載劑對照相比，兩個研究中EX-2均顯著增加了GFR，并恢復血流量到了不同于對照的值。EX-2處理沒有改變ECF，但有降低作為腎小球濾過率標準的尿蛋白排泄的趨勢。兩個實驗的結果如圖1a和1b所示，這些結果證實本發(fā)明的細胞因子調節(jié)劑降低環(huán)孢菌素誘導的腎中毒和由此引起的損害。實施例15 癌癥化療本實施例描述細胞因子調節(jié)劑EX-2在降低癌癥化療制劑的腎中毒作用中的療效。
用Sprague-Dawley雄性大鼠測定EX-2對順式氨鉑(CDDP)使用后的腎臟功能的影響。所有的大鼠腹腔內(nèi)注射CDDP(4mg/kg)并分成3個處理組(n＝6/組)。分組情況如下(1)每天3次載劑和無菌PBS；(2)每天3次5μg/kg劑量的EX-2；和(3)每天3次50μg/kg劑量的EX-2。
在外科準備階段結束后注入3H標記的菊粉(0.6μCi/ml溶于PBS)(2ml/hr)。在腎臟功能測定前60分鐘連續(xù)灌注直到研究結束。在兩個30分鐘的時間段內(nèi)用菊粉清除技術測定腎小球過濾，并用菊粉抽提技術(動脈對腎靜脈的菊粉濃度)測定腎血流量(RBF)和腎血漿流量(RPF)，血樣在第二次腎小球濾過率測定階段時從左腎靜脈采集。還監(jiān)測了尿液輸出量以測定尿液流量和水的分部排泄。用火焰測光法(Model 51 Ca，Bacharch，Inc.；Pittsburgh，PA)測定尿電解質濃度(Na+和K+)并測定了尿液蛋白濃度。測定結束后，摘除腎臟用于組織學分析。不同處理劑量的EX-2對3只注射CDDP的大鼠(腹腔內(nèi)注射4mg/kg的CDDP)腎臟功能的影響總結如表V。數(shù)據(jù)顯示本發(fā)明的細胞因子調節(jié)劑增加腎小球濾過率，腎血漿流量和腎血流量，因此降低癌癥化療制劑的腎中毒作用。
表V癌癥化療GFR RPF RBF(ml/mm)CDDP+載劑 1.0±0.4 5.6±0.9 10.2±1.6CDDP+5μg/kg 0.8±0.2 6.5±1.0 12.1±2.0CDDP+50μg/kg 1.6±0.4 8.8±1.1 16.8±2.2實施例16 氧化氮和細胞因子介導的疾病的治療本實施例描述EX-2在抑制誘導性氧化氮合成酶(iNOS)，降低鏈脲佐菌素誘導的糖尿病中的葡萄糖和降低腎小球性腎炎中白蛋白水平中的療效。A.誘導性氧化氮合成酶(iNOS)用Gelsterfer et al.，Circ.Res.62749-756(1988)(在本文作為參考文獻)已發(fā)表的方法從雄性大鼠(325-350g)分離大鼠主動脈平滑肌細胞(RASMC)。通過用小鼠抗-α-肌動蛋白的抗體和抗-小鼠IgG的異硫氰酸熒光素(FITC)接合物對抗-α-肌動蛋白進行間接免疫熒光染色的方法鑒定平滑肌細胞。細胞在裝有補加10％牛血清，0.2g/l L-谷氨酸，青霉素(100單位/ml)和鏈霉素(0.1mg/ml)的50％F12和50％Delbelco’s Modified EagleMedium(DMEM)培養(yǎng)基的組織培養(yǎng)瓶(Corning Delbelco’s Glass，Inc.；Corning，NY)中生長。
通道1-5之間的細胞用下列試劑之一預處理6小時載劑，LPS(1μg/ml)，IL-1β(10單位/ml)，或TNF-α(100單位/ml)。在相似的其它組中，在加LPS，IL-1β或TNF-α之前10分鐘加入0.1或1μM的EX-2。6小時后，用Eagle’s平衡鹽溶液清洗細胞并與100μM載劑L-硝基精氨酸甲酯(L-NAME)保溫30分鐘。在有或沒有1mM L-精氨酸的情況下，接受0.3mM 3-異丙基-1-甲基黃嘌呤(IBMX)O處理后測定cGMP的積累。然后快速吸出培養(yǎng)基，每孔內(nèi)加入500μ 10.1N HCl以中止反應并抽提cGMP。30分鐘后，收集HCl抽提物，在孔內(nèi)加入1.0N熱的NaOH并用橡皮膠擦洗小孔以除去細胞殘渣。HCl抽提物用放射免疫測定法分析cGMP，溶于NaOH的細胞殘渣用來測定蛋白質。
Sprague-Dawley雄性大鼠腹腔內(nèi)注射55mg/kg戊巴比妥進行麻醉。將導管插入頸動脈和頸靜脈，相應地用于抽血和給藥。給一組6只大鼠使用EX-2或鹽水。1小時后，大鼠仍然處于麻醉狀態(tài)，將血液抽入一個肝素化的注射器中，離心收集血漿。將RASMC與對照或EX-2處理大鼠的血漿一起培養(yǎng)，按上面的方法測定血漿成分抑制LPS或IL-1 β對INOS誘導的能力。
用自由125I通過Hunter and GreenwoodNature，94495-496(1962)的方法(在本文作為參考文獻列出)制備放射性佐劑(125I-琥鉑酰cGMP-酪氨酸甲酯)。根據(jù)Patel andLindent，Anal. Biochem.168417-425(1988)提供的方案(在本文作為參考文獻列出)用RP-HPLC分離碘化反應產(chǎn)物。根據(jù)Brooker et al.，Science191270-276(1976)披露的方法(在本文作為參考文獻列出)，使用cGMP的單克隆抗體在GammaflowTM自動放射免疫分析系統(tǒng)上進行放射免疫分析。cGMP(20μM)標準貯液用0.1N HCl配制，溶液的吸收照例進行分光光度檢測(島津，UV 160U)。用貯液進行標準稀釋(0.63-80nM)。含cGMP的HCl抽提物直接用于放射免疫分析。結果總結于下面的表VI，結果顯示EX-2可以抑制誘導性氧化氮合成酶，因此可以降低NO產(chǎn)生，EX-2還可以抑制與諸如糖尿病和腎小球性腎炎的疾病相關的副作用。B.誘導性糖尿病通過尾部靜脈對Sprague-Dawley雄性大鼠靜脈內(nèi)注射65mg/kg鏈脲佐菌素(STZ)。將大鼠分成兩組。第一組每8小時注射150μg/kg EX-2至72小時，第二組為對照。在前72小時內(nèi)每8小時抽取乙醚麻醉狀態(tài)下大鼠的血樣，然后每12小時或24小時抽血一次直至觀察階段結束。用葡萄糖分析試劑盒(Trinder，Sigma Chemical Co.)分析血漿樣品中的葡萄糖。如下面的表VI所示EX-2造成血液中葡萄糖水平下降72％。C.遺傳性糖尿病正如Ward et al.，Ann.Clin.Lab.Sci.，24266-277，(1994)所描述的(在本文作為參考文獻列出)，Zucker雄性大鼠是一個研究遺傳性非胰島素依賴型糖尿病(NIDDM)的成熟的大鼠模型。18只Zucker雄性大鼠用來研究EX-2對慢性病NIDDM的影響。將大鼠分成兩組，每8小時注射一次鹽水或25μg/kg的EX-2，持續(xù)約3個月。通過剪尾收集血樣，并將大鼠置于代謝籠中24小時以收集尿樣。用放射免疫分析試劑盒(AmershamLife Sciences，Arlington Heights，IL)分析血漿中的胰島素。用蛋白分析試劑盒(Coomassie Plus，Pierce，Rockford，IL)分析尿液蛋白。體重測量用一個Mettler toledo高負荷天平。如表VI所示，EX-2造成胰島素下降39％，尿蛋白下降87％，和體重下降約100克(下降32％；參見實施例20)。
表VI糖尿病和腎小球性腎炎模型/分析測量變量％下降*iNOS cGMP(pmol/100mg/15min) 60％STZ糖尿病 血液葡萄糖(mg/dl)72％Zucker NIDDM糖尿病 胰島素(ng/ml)39％尿蛋白(mg/24 hr) 87％體重(克) 32％腎小球性腎炎 尿白蛋白(mg/天) 62％*使用EX-2后模型/分析中的因素誘導的測量變量上升的下降百分數(shù)。D.腎小球性腎炎用福氏完全佐劑(Sigma Chemical Co.)乳化的1mg正常兔IgG(Sigma Chemical Co.)通過皮下注射免疫Sprague-Dawley雄性大鼠(體重194-248g)。在整個實驗階段內(nèi)每天3次注射EX-2(每次注射100μg/kg)。7天后，通過背靜脈靜脈內(nèi)注射1.5ml腎中毒的血清。腎中毒的血清注射前4，6，24，48，和96小時時收集尿液，血漿，和血清。根據(jù)24小時白蛋白排泄顯示，所有的大鼠都出現(xiàn)急性腎小球性腎炎和蛋白尿，病癥從4到96小時逐漸嚴重。蛋白尿用免疫電泳定量。結果總結于表VI，結果顯示本發(fā)明的細胞因子調節(jié)劑減少腎小球性腎炎中出現(xiàn)的白蛋白水平上升，白蛋白水平指示病癥的發(fā)展。
總之，上述數(shù)據(jù)顯示本發(fā)明的細胞因子調節(jié)劑抑制誘導性氧化氮合成酶水平，因此降低NO的產(chǎn)生。細胞因子調節(jié)劑對治療氧化氮造成的諸如糖尿病，腎小球性腎炎，動脈硬化和多種硬化癥的特殊疾病也是有用的。實施例17 增加小鼠中IL-10的水平本實施例以EX-2使用后小鼠血漿中IL-10水平增加為示例描述EX-2在增加哺乳動物中IL-10水平中的療效。
圖2顯示EX-2對小鼠血漿中IL-10的誘導效應。對19只小鼠腹腔內(nèi)注射劑量范圍為1.0μg/只到1000.0μg/只的EX-2。結果顯示IL-10水平依劑量的升高而升高，范圍從5.0pg/ml到23.0pg/ml。實施例18 增加人IL-10的水平本實施例描述細胞因子調節(jié)劑EX-2對人的細胞因子的增強效應。
對8個健康的男性志愿者靜脈內(nèi)注射劑量200或500μg/kg的EX-2。使用200μg/kgEX-2的4個志愿者中有2個血漿IL-10水平升高(圖3a)，使用500μg/kg EX-2的4個志愿者血漿IL-10水平都升高(圖3b)。結果顯示在接受200μg/kg EX-2的患者中IL-10升高85％，接受500μg/kg EX-2的患者中IL-10升高230％。實施例19 治療人癌癥化療引起的副作用本實施例描述諸如EX-2的細胞因子調節(jié)劑在改善使用順式氨鉑，Taxol或Adriamycin進行癌癥化療時的副作用中的用途，這些癌癥化療制劑誘導和增強細胞因子的產(chǎn)生。
可以使用例如EX-2的細胞因子調節(jié)劑對正在進行和將要進行化療的患者進行靜脈內(nèi)注射。例如，可以安排患者接受順式氨鉑，Taxol或Adriamycin或其它適當?shù)幕熁蚍暖熤委?。EX-2的使用劑量可以在約1和100μg/kg之間，優(yōu)選注入劑量為500μg/kg。劑量的使用可以通過連續(xù)滴注或間歇丸劑。實施例20 因使用細胞因子調節(jié)劑而體重降低本實施例顯示使用細胞因子調節(jié)劑可以引起患者體重的降低。
將肥胖的成年Zucker大鼠(fa/fa；325-350g)或非肥胖Zucker大鼠(Fa/+；250-275g)都分成兩組。fa/fa大鼠的一組和Fa/+大鼠的一組每天3次腹腔內(nèi)注射250μg/kg(每次)的EX-2，持續(xù)86天，另外29天每天兩次注射。fa/fa和Fa/+的其它一組按同樣的時間表注射鹽水。
EX-2的使用引起fa/fa和Fa/+大鼠體重增加的明顯下降(見圖4)。確切地說，在105天的治療時間內(nèi)，鹽水處理的fa/fa大鼠增加約360g體重，而EX-2處理的fa/fa大鼠只增加275g體重，表明體重增加下降24％。這種體重的下降與皮下脂肪重量的下降明顯相關，說明使用EX-2后體重的下降是脂肪重量的下降而非肌肉物質的下降。在Fa/+大鼠中體重增加的下降稍少，但也是與脂肪物質相關而非肌肉物質。這些結果指示細胞因子調節(jié)劑可以通過降低脂肪的積累來降低正常和肥胖個體的體重增加。
在另外的實驗中，fa/fa大鼠接受每天兩次的0.5-10mg/kg的EX-2(1-20mg/天)，持續(xù)14天。每個組中都觀察到了體重增加的下降。另外，用20mg EX-2/天處理的大鼠體重下降10％。與對照相比，這種體重損失與EX-2處理的大鼠的消耗增加相關。這些結果指示細胞因子調節(jié)劑有益于降低體重。
雖然用上面的例子描述了本發(fā)明，但是應該知道本領域的熟練技術人員可以進行各種各樣的修飾而沒有與本發(fā)明偏離。因此，本發(fā)明提出以下權利要求。
權利要求
1.一種細胞因子調節(jié)劑，包括X1-X2-His-(D)Phe-Arg-(D)Trp-X3，其中X1是
，H或COCH3；X2是
；和X3是
，或R5；其中Y是O，H2或S；R1是H，COCH3，C2H5，CH2Ph，COPh，COOCH2Ph，COO-叔丁基，CH2CO-(聚乙二醇)或A；R2是H或COCH3；R3是一個具有1到6個碳原子的線性的或分支的烷基基團或一個具有3到6個碳原子的環(huán)烷基團；R4是(CH2)m-CONH2，(CH2)m-CONHR1或(CH2)m-CONHA；R5是OH，OR3，NH2，SH，NHCH3，NHCH2Ph或A；以及R6是H或R3；其中“Ph”是C6H5；“m”是1，2或3；“n”是0，1，2或3；和“A”是具有如下通式的碳水化合物
2.權利要求1的肽，其中氨基末端是修飾的。
3.權利要求1的肽，其中羧基末端是修飾的。
4.權利要求1的肽，其中R1選自C2H5和CH2Ph組成的一組，其中R1選自H和COCH3組成的一組。
5.權利要求1的肽，其中R1和R2是相同的基團，所說的基團選自H，C2H5和CH2Ph組成的一組。
6.權利要求1的肽，其中X1選自正亮氨酸，正纈氨酸，亮氨酸或異亮氨酸組成的一組。
7.權利要求1的肽，其中R5與X1共價結合，所說共價鍵形成一個環(huán)狀肽。
8.一種細胞因子調節(jié)劑，包括X4-X5-(D)Phe-Arg-(D)Trp-X3，其中X4是
，H，COCH3，或無；X5是His，H，或COCH3；和X3是
，或R5；其中Y是O，H2或S；R1是H，COCH3，C2H5，CH2Ph，COPh，COOCH2Ph，COO-叔丁基，CH2CO-(聚乙二醇)或A；R2是H或COCH3；R4是(CH2)m-CONH2，(CH2)m-CONHR1或(CH2)m-CONHA；R5是OH，OR3，NH2，SH，NHCH3，NHCH2Ph或A；以及R6是H或R3；其中“Ph”是C6H5；“m”是1，2或3；“n”是0，1，2或3；和“A”是具有如下通式的碳水化合物
9.權利要求8的肽，其中氨基末端是修飾的。
10.權利要求8的肽，其中羧基末端是修飾的。
11.權利要求8的肽，其中R1選自C2H5和CH2Ph組成的一組，R2選自H和COCH3組成的一組。
12.權利要求8的肽，其中R1和R2是相同的基團，所說的基團選自H，C2H5和CH2Ph組成的一組。
13.權利要求8的肽，其中R5與X4共價結合，所說共價鍵形成一個環(huán)狀肽。
14.具有選自如下一組的氨基酸順序的細胞因子調節(jié)劑(環(huán)己基)Gly-Gln-His-(D)Phe-Arg-(D)Trp-Gly；His-(D)Phe-Arg-(D)Trp-Gly；His-(D)Phe-Arg-(D)Trp；(D)Phe-Arg-(D)Trp；和His-(D)Phe-Arg-{(D)Trp(CH2)}-(NAc)Gly。
15.權利要求14的肽，其中羧基末端是經(jīng)酰胺化修飾的。
16.權利要求14的肽，其中所說肽的氨基末端是乙酰化的。
17.氨基酸序列為環(huán)(His-(D)Phe-Arg-(D)Trp)的細胞因子調節(jié)劑。
18.調節(jié)患者的細胞因子活性的方法，該患者具有以改變的或迷亂的細胞因子活性為特征的狀態(tài)，該方法包括給患者以有效劑量的權利要求1的細胞因子調節(jié)劑。
19.權利要求18的方法，其中所說的細胞因子調節(jié)劑增強所說細胞因子的活性。
20.權利要求19的方法，其中所說的細胞因子活性是IL-10活性。
21.權利要求19的方法，其中所說的狀態(tài)是炎癥反應。
22.權利要求19的方法，其中所說的狀態(tài)是惡病。
23.權利要求19的方法，其中所說的狀態(tài)是病理免疫反應。
24.權利要求19的方法，其中所說的狀態(tài)是成人呼吸困難綜合癥。
25.降低患者廢用性去適應的影響的方法，包括給患者以有效劑量的權利要求1的細胞因子調節(jié)劑。
26.保護患者的器官免受損害的方法，包括給患者以有效劑量的權利要求1的細胞因子調節(jié)劑。
27.權利要求26的方法，其中器官損害是選自由器官移植，免疫抑制劑的使用，和局部缺血-再灌注組成的一組的一種狀態(tài)的結果。
28.權利要求27的方法，其中免疫抑制劑是環(huán)孢菌素。
29.改善患者癌癥化療的副作用的方法，包括給患者以有效劑量的權利要求1的細胞因子調節(jié)劑。
30.權利要求29的方法，其中副作用是癌癥化療制劑的腎中毒效應。
31.權利要求30的方法，其中癌癥化療制劑選自順式氨鉑，Taxol和Adriamycin組成的一組。
32.治療患有氧化氮和細胞因子介導的疾病的患者的方法，包括給患者以有效劑量的權利要求1的細胞因子調節(jié)劑。
33.權利要求32的方法，其中的疾病選自糖尿病和腎小球性腎炎組成的一組。
34.降低患者體重的方法，包括給患者以有效劑量的權利要求1的細胞因子調節(jié)劑。
35.增加患者氧消耗的方法，包括給患者以有效劑量的權利要求1的細胞因子調節(jié)劑。
36.調節(jié)患者細胞因子活性的方法，該患者具有以改變的或迷亂的細胞因子活性為特征的狀態(tài)，該方法包括給患者以有效劑量的權利要求8的細胞因子調節(jié)劑。
37.權利要求36的方法，其中所說的細胞因子調節(jié)劑增強所說細胞因子的活性。
38.權利要求37的方法，其中所說的細胞因子活性是IL-10活性。
39.權利要求37的方法，其中所說的狀態(tài)是炎癥反應。
40.權利要求37的方法，其中所說的狀態(tài)是惡病。
41.權利要求37的方法，其中所說的狀態(tài)是病理免疫反應。
42.權利要求37的方法，其中所說的狀態(tài)是成人呼吸困難綜合癥。
43.降低患者廢用性去適應的影響的方法，包括給患者以有效劑量的權利要求8的細胞因子調節(jié)劑。
44.保護患者的器官免受損害的方法，包括給患者以有效劑量的權利要求8的細胞因子調節(jié)劑。
45.權利要求44的方法，其中器官損害是選自由器官移植，免疫抑制劑的使用，和局部缺血-再灌注組成的一組的一種狀態(tài)的結果。
46.權利要求45的方法，其中免疫抑制劑是環(huán)孢菌素。
47.改善患者癌癥化療的副作用的方法，包括給患者以有效劑量的權利要求8的細胞因子調節(jié)劑。
48.權利要求47的方法，其中副作用是腎中毒作用。
49.權利要求47的方法，其中化療包括使用選自順式氨鉑，Taxol和Adriamycin組成的一組的化療制劑。
50.治療患有氧化氮和細胞因子介導的疾病的患者的方法，包括給患者以有效劑量的權利要求8的細胞因子調節(jié)劑。
51.權利要求50的方法，其中的疾病選自糖尿病和腎小球性腎炎組成的一組。
52.降低患者體重的方法，包括給患者以有效劑量的權利要求8的細胞因子調節(jié)劑。
53.增加患者氧消耗的方法，包括給患者以有效劑量的權利要求8的細胞因子調節(jié)劑。
54.調節(jié)患者細胞因子活性的方法，該患者具有以改變的或迷亂的細胞因子活性為特征的狀態(tài)，該方法包括給患者以有效劑量的權利要求14的細胞因子調節(jié)劑。
55.調節(jié)患者細胞因子活性的方法，該患者具有以改變的或迷亂的細胞因子活性為特征的狀態(tài)，包括給患者以有效劑量的權利要求17的細胞因子調節(jié)劑。
56.降低患者廢用性去適應的影響的方法，包括給患者以有效劑量的具有Ac-Nle-Gln-His-(D)Phe-Arg-(D)Trp-Gly-NH2序列的細胞因子調節(jié)劑。
57.保護患者的器官免受損害的方法，包括給患者以有效劑量的具有Ac-Nle-Gln-His-(D)Phe-Arg-(D)Trp-Gly-NH2序列的細胞因子調節(jié)劑。
58.降低患者癌癥化療的副作用的方法，包括給患者以有效劑量的具有Ac-Nle-Gln-His-(D)Phe-Arg-(D)Trp-Gly-NH2序列的細胞因子調節(jié)劑。
59.治療患有氧化氮和細胞因子介導的疾病的患者的方法，包括給患者以有效劑量的具有Ac-Nle-Gln-His-(D)Phe-Arg-(D)Trp-Gly-NH2序列的細胞因子調節(jié)劑。
60.降低患者體重的方法，包括給患者以有效劑量的具有Ac-Nle-Gln-His-(D)Phe-Arg-(D)Trp-Gly-NH2序列的細胞因子調節(jié)劑。
61.增加患者氧消耗的方法，包括給患者以有效劑量的具有Ac-Nle-Gln-His-(D)Phe-Arg-(D)Trp-Gly-NH2序列的細胞因子調節(jié)劑。
62.增加患者細胞因子水平的方法，包括給患者以有效劑量的具有Ac-Nle-Gln-His-(D)Phe-Arg-(D)Trp-Gly-NH2序列的細胞因子調節(jié)劑。
63.權利要求62的方法，其中所說的細胞因子是IL-10。
全文摘要
本發(fā)明涉及為潛在的細胞因子調節(jié)劑的新的肽。另外，本發(fā)明還涉及包括藥物可接受載劑和細胞因子調節(jié)劑的藥物組合物。給予患者這樣的細胞因子調節(jié)劑可以增強或抑制細胞因子活性，因此，本發(fā)明提供了調節(jié)患者的細胞因子活性的方法，該患者具有以發(fā)生改變或迷亂的細胞因子活性為特征的狀態(tài)。本發(fā)明還提供了治療以下狀態(tài)的方法，包括，例如，廢用性去適應，氧化氮和細胞因子介導的疾病，藥物負反應，肥胖，膿毒休克，和癌癥化療引起的或器官移植時出現(xiàn)的副作用。
文檔編號A61P43/00GK1156965SQ96190451
公開日1997年8月13日 申請日期1996年3月5日 優(yōu)先權日1995年3月6日
發(fā)明者貝弗利·E·格爾坦, 阿里·安達里比, 阿馬雷什·巴蘇, 帕特里克·法甘, 理查特·A·霍頓, 科斯塔斯·C·盧利斯, 保羅·奧姆霍爾特, 馬克·J·蘇托, 帕特里夏·A·韋伯, 羅納德·R·圖托 申請人:霍頓藥品公司