專利名稱：抑制細胞－細胞粘連的方法
血管內(nèi)皮構(gòu)成一種主要器官，該器官作為血液凝集、炎癥的調(diào)節(jié)物起作用，并在血管內(nèi)和實體組織之間的液體和介質(zhì)的交換中發(fā)揮作用。因此，內(nèi)皮的適當?shù)墓δ茉谟谌淼捏w內(nèi)平衡。由重要的表面分子表達發(fā)生改變而引起的內(nèi)皮機能障礙，將導致凝集障礙、局部或全身性血管炎癥、以及動脈粥樣硬化斑的發(fā)展和破裂的增強。這些作用可進一步導致這樣一些病癥，比如心肌梗塞、深層靜脈栓塞、傳播性血管內(nèi)栓塞和中風。
某些細胞表面蛋白會因血管損傷或損害而改變，并可用作內(nèi)皮機能障礙的標記物。這些蛋白中的關鍵的一類是介導細胞-細胞粘連的受體/配體，包括粘連蛋白、選擇蛋白(例如ELAM)和免疫球蛋白超家族成員，如ICAM和VCAM。在不同的刺激物的作用下，這些分子增加，并且除了作為內(nèi)皮機能障礙的重要的標記物外，還在血栓形成、炎癥以及血管壁粥樣化過程中起關鍵作用。其他活性，比如表面抗凝血劑反應，也在內(nèi)皮機能障礙狀態(tài)下受到損害。能夠阻遏內(nèi)皮機能障礙的化合物，如通過測量其抑制細胞-細胞粘連的能力或前凝血劑活性的表達所確定的，能夠治療這樣一些病癥，比如膿毒癥、損傷(包括主要組織損害或創(chuàng)傷)、全身性炎癥反應綜合癥、膿毒癥綜合癥、膿毒性休克和多發(fā)性器官機能障礙綜合癥(包括DIC)以及動脈粥樣硬化斑破裂及其相關后遺癥。因為細胞-細胞粘連是廣泛的生物學重要方面的基本過程，因此特異性調(diào)節(jié)粘連蛋白的能力具有許多血管組織外臨床應用的潛力，包括用作抗炎藥。
本發(fā)明提供抑制細胞-細胞粘連的方法，包括給需要治療的人施用有效量的式I化合物及其藥用鹽和溶劑化物，
其中R1和R3獨立地是氫、-CH3，
(C1-C6烷基)或
Ar，其中Ar是任意取代的苯基；R2選自吡咯烷子基(pyrrolidino)、六亞甲基亞氨基和哌啶子基。
本發(fā)明涉及這樣一個發(fā)現(xiàn)，即一類特定的2-苯基-3-芳?；讲⑧绶?苯并噻吩)，也就是式I化合物，可以用于抑制細胞-細胞粘連，特別是血管細胞-細胞粘連。而且，這些化合物可用于抑制血管內(nèi)皮機能障礙。
本發(fā)明所提供的應用方法是通過向需要治療的人施用一定劑量的式I化合物或其藥用鹽或溶劑化物來完成的，所述劑量可以有效地抑制細胞-細胞粘連及其影響。術(shù)語“抑制”包括其通常被接受的含義，包括阻止、預防、遏制、減緩、終止或逆轉(zhuǎn)。如此，如果需要的話，本方法包括藥物治療和/或預防性施用。
雷洛昔芬是核調(diào)節(jié)分子，它是本發(fā)明式I化合物的鹽酸鹽，其中R1和R2是氫，R2是1-哌啶基。已表明雷洛昔芬結(jié)合雌激素受體，它起先被認為是一種具有抗雌激素功能和藥性的分子，能夠阻遏雌激素激活子宮組織和雌激素依賴性乳癌的能力。實際上，雷洛昔芬確實阻遏雌激素在一些細胞中的作用；但是，在其他細胞類型中，雷洛昔芬與雌激素激活同樣的基因，并表現(xiàn)出同樣的藥性，例如使骨質(zhì)疏松，血脂過高。結(jié)果，雷洛昔芬被認為是具有激動劑-拮抗劑混合特性的抗雌激素物質(zhì)。雷洛昔芬表現(xiàn)出的獨特的作用方式及其與雌激素的差異目前被認為是來自于雷洛昔芬-雌激素受體復合物對不同基因功能的獨特的激活和/或抑制作用，該作用與雌激素-雌激素受體復合物對基因的激活和/或抑制作用不同。因此，雖然雷洛昔芬和雌激素利用和競爭同一受體，但二者由基因調(diào)節(jié)所產(chǎn)生的藥理作用是難以預測的，而且是各自不同的。
一般說來，將本發(fā)明化合物與普通的賦形劑、稀釋劑或載體一起配制并壓成片劑，或制成適于口服的酏劑或溶液，或通過肌肉或靜脈內(nèi)途徑施用。該化合物可以透皮施用，也可以制成持續(xù)釋放的劑型等。
本發(fā)明方法所用的化合物可用已經(jīng)建立的方法來制備，如美國專利4,133,814、4,418,068和4,380,635所述，在此引入作為參考。一般說來，制備過程開始于一個帶有6-羥基和2-(4-羥苯基)基團的苯并[b]噻吩。起始化合物被保護、酰基化、去保護，形成式I化合物。這樣的化合物的制備實例見上述美國專利。術(shù)語“任意取代的苯基”包括苯基和被C1-C6烷基、C1-C4烷氧基、羥基、硝基、氯、氟或三(氯或氟)甲基取代一次或兩次的苯基。
本發(fā)明方法所用的化合物可以與多種有機和無機的酸和堿形成藥用酸和堿加成鹽，包括在藥物化學中經(jīng)常應用的生理可接受鹽。這樣的鹽也是本發(fā)明的一部分。用于形成這樣的鹽的典型無機酸包括鹽酸、氫溴酸、氫碘酸、硝酸、硫酸、磷酸、連二磷酸等。也可以使用從有機酸，比如脂肪族一或二羧酸、苯基取代的鏈烷酸、羥基鏈烷酸以及羥基鏈烷二酸、芳香族酸、脂肪酸和芳香族磺酸獲得的鹽。這樣的藥用鹽包括乙酸鹽、苯基乙酸鹽、三氟乙酸鹽、丙烯酸鹽、抗壞血酸鹽、苯甲酸鹽、氯代苯甲酸鹽、二硝基苯甲酸鹽、羥基苯甲酸鹽、甲氧基苯甲酸鹽、甲基苯甲酸鹽、鄰乙酰氧基苯甲酸鹽、萘-2-苯甲酸鹽、溴化物、異丁酸鹽、苯基丁酸鹽、β-羥基丁酸鹽、丁炔-1，4-二酸鹽、己炔-1，4-二酸鹽、癸酸鹽、辛酸鹽、氯化物、肉桂酸鹽、檸檬酸鹽、甲酸鹽、延胡索酸鹽、羥基乙酸鹽、庚酸鹽、馬尿酸鹽、乳酸鹽、蘋果酸鹽、馬來酸鹽、羥基馬來酸鹽、丙二酸鹽、杏仁酸鹽、甲磺酸鹽、尼克酸鹽、異尼克酸鹽、硝酸鹽、草酸鹽、鄰苯二甲酸鹽、對苯二甲酸鹽、磷酸鹽、磷酸一氫鹽、磷酸二氫鹽、偏磷酸鹽、焦磷酸鹽、丙炔酸鹽、丙酸鹽、苯基丙酸鹽、水楊酸鹽、癸二酸鹽、琥珀酸鹽、辛二酸鹽、硫酸鹽、硫酸氫鹽、焦硫酸鹽、亞硫酸鹽、亞硫酸氫鹽、磺酸鹽、苯磺酸鹽、對溴苯磺酸鹽、氯代苯磺酸鹽、乙烷磺酸鹽、2-羥基乙烷磺酸鹽、甲磺酸鹽、萘-1-磺酸鹽、萘-2-磺酸鹽、對甲苯磺酸鹽、二甲苯磺酸鹽、酒石酸鹽等。優(yōu)選的鹽是鹽酸鹽。
藥用酸加成鹽典型地是通過將式I化合物與等摩爾或過量的酸反應形成的。反應物一般于互溶劑如乙醚或苯中進行反應。鹽通常在大約1小時至10天內(nèi)從溶液中析出，并可通過過濾分離，或用常規(guī)方法去掉溶劑。
通常用于形成鹽的堿包括氫氧化銨、堿金屬及堿土金屬氫氧化物、碳酸鹽，以及脂肪族的伯、仲、叔胺、脂肪族二胺。在制備加成鹽中特別有用的堿包括氫氧化銨、碳酸鉀、甲胺、乙二胺、二乙胺和環(huán)己胺。
與形成它們的化合物相比，藥用鹽一般具有更強的溶解特性，因此更適于制成液體或乳劑。
藥物制劑可以用本領域已知的方法制備。例如，這些化合物可以與常用的賦形劑、稀釋劑或載體制成片劑、膠囊劑、懸液劑、粉劑等。適于這些制劑的賦形劑、稀釋劑和載體的例子包括填充劑和增量劑，如淀粉、糖、甘露醇和硅衍生物；結(jié)合劑，如羧甲基纖維素和其他纖維素衍生物、藻酸鹽、明膠、聚乙烯吡咯烷酮；保濕劑，如甘油；崩散劑，如碳酸鈣和碳酸氫鈉；阻滯溶解劑，如石蠟；吸收促進劑，如季銨化合物；表面活性劑，如十六烷醇、單硬脂酸甘油酯；吸附載體，如陶土和皂土；潤滑劑，如滑石、硬脂酸鈣和硬脂酸鎂，固體聚乙二醇。
這些化合物也可制成酏劑或溶液劑，使之適于口服，或制成適于胃腸外(如肌肉內(nèi)、皮下或靜脈內(nèi))給藥的溶液。此外，這些化合物也適于制成持續(xù)釋放的劑型等。這些制劑可以這祥制成，使得它們可能在一段時間內(nèi)，僅僅或優(yōu)選地在腸道的特定部位釋放出活性成分。包衣、包膜和保護性基質(zhì)可以由例如聚合物質(zhì)和蠟制成。
根據(jù)本發(fā)明，抑制細胞-細胞粘連或其作用，或本文所公開的任何其他應用所需的式I化合物的具體劑量，依賴于病惰的嚴重程度、施用途徑、以及由主治醫(yī)師決定的相關因素。一般說來，可接受的有效的日劑量為大約0.1至1000毫克/天，更典型的是大約50至200毫克/天。用這樣的劑量對患者施用，每天要進行一次至大約三次，如果需要，可以施用更多次，以有效地抑制細胞-細胞粘連或其作用，或本文所公開的任何其他應用。
如施用帶有堿性基團(如哌啶子基環(huán))的藥物時慣用其酸加成鹽一樣，通常優(yōu)選的是以酸加成鹽的形式施用式I化合物。通過口服途徑施用該化合物也是有利的。為此，下述口服劑型是適用的。
制劑在下述制劑中，“活性成分”指的是式I化合物。
制劑1明膠膠囊硬明膠膠囊以如下方式制備成分 量(毫克/膠囊)活性成分 0.1-1000淀粉，NF 0-650淀粉可流動粉末 0-650350厘斯聚硅氧烷流體0-15各成分混合后，通過45號篩孔的U.S.篩，填入硬明膠膠囊中。
已制成的具體的雷洛昔芬膠囊制劑包括以下這些制劑2雷洛昔芬膠囊成分 量(毫克/膠囊)雷洛昔芬 1淀粉，NF 112淀粉可流動粉末 225.3350厘斯聚硅氧烷流體1.7制劑3雷洛昔芬膠囊成分 量(毫克/膠囊)雷洛昔芬 1淀粉，NF 108淀粉可流動粉末 225.3350厘斯聚硅氧烷流體1.7制劑4雷洛昔芬膠囊成分 量(毫克/膠囊)雷洛昔芬 1淀粉，NF 103淀粉可流動粉末 225.3350厘斯聚硅氧烷流體1.7制劑5雷洛昔芬膠囊成分 量(毫克/膠囊)雷洛昔芬 50淀粉，NF 150淀粉可流動粉末 397350厘斯聚硅氧烷流體3.0上述具體的制劑可依照所提供的合理的變化而改變。用如下成分可以制備片劑
制劑6片劑成分 量(毫克/片)活性成分 0.1-1000微晶纖維素 0-650煅制二氧化硅 0-650硬脂酸 0-15將各成分混合，壓成片劑。
可選地，每片含有0.1-1000毫克活性成分的片劑可如下制成制劑7片劑成分 量(毫克/片)活性成分 0.1-1000淀粉 45微晶纖維素 35聚乙烯吡咯烷酮(10％水溶 4液)羧甲基纖維素鈉 4.5硬脂酸鎂 0.5滑石 1將活性成分、淀粉和纖維素通過45號篩孔的U.S.篩并充分混合。所得的粉末與聚乙烯吡咯烷酮溶液混合，然后通過14號篩孔的U.S.篩。所得顆粒在50°-60℃下干燥，通過18號篩孔的U.S.篩。將羧甲基淀粉鈉、硬脂酸鎂和滑石預先通過60號的U.S.篩，然后加入到顆粒中，混合后，用壓片機壓成片劑。
每5毫升劑量含有0.1-1000毫克藥物的懸液劑可如下制備制劑8懸液劑成分 量(毫克/5毫升)活性成分 0.1-1000毫克羧甲基纖維素鈉 50毫克糖漿 1.25毫升苯甲酸溶液 0.10毫升調(diào)味劑 q.v.
著色劑 q.v.
加純水至5毫升將藥物通過45號篩孔的U.S.篩，與羧甲基纖維素鈉和糖漿混合形成光滑的膏體。將苯甲酸溶液、調(diào)味劑、著色劑用一些水稀釋，邊攪動邊加到膏體中。再加入足量的水以達到所需的體積。
體外細胞粘連試驗人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVEC)或人主動脈內(nèi)皮(HAE)得自Clonetics(San Diego)并在Clonetics提供的EBM培養(yǎng)基中生長。將細胞置于96孔平板上，其密度使得在37℃下過夜培養(yǎng)后得到匯合的單層。加入受試化合物，在無血清的培養(yǎng)基中培養(yǎng)8-20小時。在總體積為75至100微升的，有受試化合物存在的結(jié)合試驗之前，將單層細胞在有或沒有2ng/mlIL-1或有20納克腫瘤壞死因子(TNF)的條件下培養(yǎng)4至24小時。培養(yǎng)后，加入50微升體積的氚標記的U937細胞，每孔1至3×10(6)細胞。U937細胞是通過加入3H-胸苷至終濃度每毫升1毫居里，然后培養(yǎng)18至20小時而被氚標記的。在使用之前用PBS洗細胞以除去過量的標記物。標記的U937細胞與內(nèi)皮細胞一起培養(yǎng)20分鐘之后，吸出每孔中的液體，用含鈣的PBS將孔洗四次。通過加入0.25％SDS/0.1N NaOH攪動5分鐘而將單層細胞和粘附的U937細胞溶解。通過對溶解的細胞進行閃爍計數(shù)而確定結(jié)合的水平。
抗凝血劑活性試驗將96孔平板中的用或未用IL-1(2ng/ml)處理的人內(nèi)皮細胞的匯合培養(yǎng)物用HBSS洗一次，以除去血清蛋白，用含有400nM重組人蛋白C和10nM人凝血酶的無血清培養(yǎng)基(DMEM/F-12培養(yǎng)基，20mM-HEPES，pH7.5，50mg/ml慶大霉素，1mg/ml人轉(zhuǎn)鐵蛋白和1mg/ml人牛胰島素)培養(yǎng)。將細胞在37℃下培養(yǎng)，在不同的時間移出培養(yǎng)基，加入等體積的下述溶液20mM Tris-Hcl，pH7.5，150mM NaCl，1mg/ml BSA和10U/ml水蛭素。將樣本在含水蛭素的緩沖液中培養(yǎng)5分鐘以抑制凝血酶活性。通過加入生色底物(S-2366)至終濃度0.75mM，用ThermoMax動態(tài)微滴定平板計數(shù)器(Molecular Devices)在405nm處測量每分鐘吸收單位的改變來測定所產(chǎn)生的活化蛋白C的量。在所有的實驗中，蛋白C/凝血酶溶液樣本是在沒有細胞的孔中培養(yǎng)的，以便測定蛋白C凝血酶催化活性的基礎水平。生成的活化蛋白C的量以每分鐘每微克細胞蛋白的吸收值(mOD)表示。
結(jié)果用化合物A處理人臍靜脈血內(nèi)皮細胞(HUVEC)，同時由TNF誘導粘連分子的表達，其中R1和R3是氫，R3是吡咯烷基。如表I所示，在本試驗中，100nM化合物A的存在將導致細胞-細胞粘連的水平降低大約40％。當細胞在用TNF誘導之前僅用10nM化合物A預處理大約20分鐘時，觀察到粘連大約減少65％(表2)。我們也用IL1同時處理了HUVEC和人主動脈表皮細胞(HAEC)，IL1是在10nM化合物A存在下誘導粘連分子表達的另一種炎癥介體。如表3所示，化合物A有效地抑制了兩種細胞系中IL1誘導的粘連。因此，化合物可以在靜脈和動脈細胞中阻遏由兩種獨立的方式介導的粘連分子表達的誘導。
作為該化合物調(diào)節(jié)內(nèi)皮基本特性的能力的進一步的證據(jù)，我們測量了內(nèi)皮細胞激活人蛋白C的能力，這個能力是在內(nèi)皮機能障礙狀態(tài)下進行向下調(diào)節(jié)的天然調(diào)節(jié)功能。如表4所示，細胞的IL1處理顯著地降低了內(nèi)皮支持蛋白C生成的能力。但是，在用化合物A處理細胞之后，IL1對該功能的抑制基本上消失。上面的數(shù)據(jù)表明化合物A保護細胞免于激活炎癥和前凝血活性。
表1.化合物A對U937細胞粘連TNF激活的人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVEC)的影響條件 結(jié)合活性百分比a未處理的對照 0±7.5用TNF處理的100±95TNF加化合物A(100nM)62±17a結(jié)合水平以用TNF誘導前后與內(nèi)皮結(jié)合的U937細胞數(shù)的百分比表示。
表2.用化合物A預處理對U937細胞粘連TNF激活的人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVEC)的影響條件 結(jié)合活性百分比a未處理的對照 0±20用TNF處理的100±16TNF加化合物A(100nM)34±8
a結(jié)合水平以用TNF誘導前后與內(nèi)皮結(jié)合的U937細胞數(shù)的百分比表示。
表3.用化合物A預處理對U937細胞粘連IL1激活的人主動脈內(nèi)皮細胞(HAEC)和人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVEC)的影響條件 與下列細胞的結(jié)合活性百分比aHUVEC HAECIL1處理的 100±14 100±8IL1加化合物A(1018±1354±7nM)a結(jié)合水平以用IL1誘導前后與內(nèi)皮結(jié)合的U937細胞數(shù)的百分比表示。
表4.化合物A對人蛋白C激活用IL-1處理的內(nèi)皮細胞的影響，所述激活是凝血酶催化的條件 結(jié)合活性百分比a未處理的對照 8.8±1.4用IL1處理的3.7±0.4IL1加化合物A 7.6±.權(quán)利要求
1.一種抑制細胞-細胞粘連的方法，其包括對需要治療的人施用有效量的下式化合物或其藥用鹽或溶劑化物
其中R1和R3獨立地是氫、-CH3，
(C1-C6烷基)或
Ar，其中Ar是任意取代的苯基；R2選自吡咯烷、六亞甲基亞氨基和哌啶子基。
2.權(quán)利要求1的方法，其中化合物是其鹽酸鹽。
3.權(quán)利要求1的方法，其中化合物是下式化合物或其鹽酸鹽
4.一種在患有血管內(nèi)皮病變的病人中抑制炎癥和異常凝血過程方法，其包括對需要治療的病人施用有效量的下式化合物或其藥用鹽或溶劑化物
其中R1和R3獨立地是氫、-CH3，
(C1-C6烷基)或
Ar，其中Ar是任意取代的苯基；R2選自吡咯烷、六亞甲基亞氨基和哌啶子基。
5.權(quán)利要求4的方法，其中化合物是其鹽酸鹽。
6.權(quán)利要求4的方法，其中化合物是下式化合物或其鹽酸鹽
全文摘要
一種抑制細胞－細胞粘連的方法,其包括對需要治療的人施用有效量的式Ⅰ化合物或其藥用鹽和溶劑化物,其中R
文檔編號A61K31/4523GK1173821SQ96191839
公開日1998年2月18日 申請日期1996年2月6日 優(yōu)先權(quán)日1995年2月9日
發(fā)明者B·W·格里勒爾 申請人:伊萊利利公司