專利名稱：茶的多酚提取物、其用途和含有它們的制劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及茶(Camellia sinensis)的新多酚提取物，其制備方法和用途，以及含有它們的制劑。
本發(fā)明的目的特別涉及不含咖啡因但主要含衍生自表?xiàng)攦翰杷氐奶烊槐壤喾拥奶崛∥铩?br> 已知咖啡因?qū)π难芟到y(tǒng)有不利的作用，還有致突變作用。一般通過(guò)在超臨界相用二氧化碳提取或用氯代溶劑提取來(lái)除去咖啡因，但所述步驟沒(méi)有著眼于保持這些具有有利生物效應(yīng)的多酚成分的標(biāo)準(zhǔn)含量。
最近這些茶植物特征物質(zhì)由于其強(qiáng)抗氧化作用而引起廣泛興趣，如文獻(xiàn)(1，2)中所述。這種作用顯然某種程度上與一些多酚(例如表?xiàng)攦翰杷?3-O-棓酸酯)能抑制實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物中人工誘發(fā)腫瘤形成有關(guān)(3，4)。
另外，最近的一些流行病學(xué)研究表明大量飲用綠茶與退化性慢性病(如一些癌和動(dòng)脈硬化)的低發(fā)病率相關(guān)(5-8)。
除上述抗氧化作用外，綠茶衍生物中所含物質(zhì)的作用機(jī)制迄今仍未完全闡明。在廣泛的研究過(guò)程中，申請(qǐng)人發(fā)現(xiàn)綠茶的多酚成分根據(jù)所研究細(xì)胞類型能夠起到差別細(xì)胞毒效應(yīng)，這種差異特別與選擇靶向有關(guān)，其中一些多酚分子作用于亞細(xì)胞位點(diǎn)(如線粒體)。
因此，能獲得有標(biāo)準(zhǔn)含量多酚物質(zhì)和低含量咖啡因的茶提取物的提取方法顯然是很重要的。
這一目的已通過(guò)包括以下步驟的方法達(dá)到a)用水-醇或水-酮混合物提取植物物料；b)全部或部分蒸發(fā)提取溶劑；c)將殘余物懸浮在30-60％(體積)的含水甲醇混合物中；d)用氯代溶劑萃取含水甲醇懸液；e)濾去不溶殘?jiān)?，濃縮含水甲醇相；
f)用有機(jī)酸酸化或不酸化；g)用選自脂肪酸酯、醇或酮的溶劑萃取酸化或未酸化的濃縮含水甲醇相，條件是所述溶劑要與含水甲醇混合物不溶混；h)加或不加芳烴或脂肪烴，然后用稀無(wú)機(jī)酸水溶液洗滌；i)濃縮水不溶混性有機(jī)相，用氯代溶劑稀釋；k)若不存在f)和h)步，則在干燥脂肪酮或醇(優(yōu)選醇)中用大分子強(qiáng)酸型陽(yáng)離子交換樹(shù)脂處理。
本發(fā)明方法的第一種實(shí)施方案是植物物料用水稀釋或不稀釋的脂肪醇和酮提取，優(yōu)選用含40-90％(體積)丙酮(特別是70％丙酮)的丙酮水混合物提取。根據(jù)所用溶劑不同，將所得提取物濃縮至小體積(原體積的約1/5到約1/15)或除去有機(jī)溶劑。
第一種情況是含水濃縮物用甲醇稀釋至50％(v/v)，第二種情況是將殘余物懸浮在含30-60％(優(yōu)選50％)甲醇的甲醇水混合物中。該含水甲醇混合物用氯代溶劑(優(yōu)選二氯甲烷)反萃取，直到除去沒(méi)有與植物物料中存在的寡聚多酚復(fù)合的非目的物諸如葉綠素、萜烯和咖啡因。棄去該氯代有機(jī)相，濃縮含水甲醇相直到除去甲醇，濾去鞣酸咖啡因復(fù)合物組成的不溶物。用不溶混溶劑如脂肪酮和醇或脂肪酸酯萃取該水溶液。所述有機(jī)溶劑的例子包括含鹽如氯化銨或硫酸銨(它能清除咖啡因的復(fù)合物，由于酸堿性將其保留在水中，同時(shí)使得可能選擇性萃取)的甲乙酮，各種異構(gòu)體形式的丁醇，甲酸乙酯或乙酸乙酯。在濃縮并用氯代溶劑(特別是二氯甲烷)稀釋后，這些溶劑(優(yōu)選乙酸乙酯)能夠選擇性地回收酚類物質(zhì)。所得萃取物仍含有一定量與1％以上多酚復(fù)合的殘余咖啡因，這可以通過(guò)在無(wú)水介質(zhì)中(使用諸如甲醇、乙醇或丙酮的溶劑)吸附在磺酸樹(shù)脂上而除去，從而得到含咖啡因不超過(guò)0.2％的提取物。
本發(fā)明方法的另一實(shí)施方案中，用40-50％(v/v)的甲醇或丙酮水溶液提取植物物料，濃縮提取物直到除去有機(jī)溶劑，優(yōu)選達(dá)到與被提取植物物料大約等重。濾去不溶物后，該濃縮物用氯代溶劑(優(yōu)選二氯甲烷)反萃取，以除去游離咖啡因和萜烯樣惰性物質(zhì)。該水溶液用有機(jī)酸酸化(優(yōu)選在檸檬酸銨存在下用檸檬酸酸化)，用脂肪酸酯(優(yōu)選乙酸乙酯)反萃取。向有機(jī)相中加入有機(jī)相總體積2-20％(體積)(優(yōu)選5％)的芳烴或脂肪烴，然后用稀無(wú)機(jī)酸(優(yōu)選1％硫酸)洗滌，直到除去咖啡因。
洗至中性后將該有機(jī)溶液濃縮至小體積，傾倒在足以回收多酚的二氯甲烷中。
茶葉，優(yōu)選研細(xì)的茶葉用作植物物料。在室溫下進(jìn)行提取(大約18-25℃)。藥物/溶劑比不太重要，但一般每次提取在1∶1到1∶5w/v之間。
按本方法所得產(chǎn)物中最重要的兒茶素衍生物的平均含量為50-65％表?xiàng)攦翰杷?3-O-棓酸酯，13-20％表兒茶素-3-O-棓酸酯，2-4％表兒茶素和1.5-3％表?xiàng)攦翰杷亍?br> 按所報(bào)道方法之一獲得的多酚成分的特征是其抗氧化力可與已知抗氧化劑相比或高出，這可以從下表中明顯看出。
該“體外”試驗(yàn)中，用一種實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蜋z查產(chǎn)物的抗脂過(guò)氧化作用，包括磷脂酰膽堿脂質(zhì)體在試管中的超聲化(Sonication)，用常規(guī)技術(shù)(9)測(cè)定氧化降解后的產(chǎn)物。
脂質(zhì)體在抗氧化劑存在下孵育使共軛雙烯的形成以劑量依賴性關(guān)系下降，共軛雙烯的形成是磷脂氧化降解的第一步。
表與表?xiàng)攦翰杷?3-O-棓酸酯、維生素E和維生素C對(duì)比，綠茶多酚提取物對(duì)超聲化磷脂酰膽堿脂質(zhì)體(增殖相)的抗氧化作用CI50(μM)綠茶多酚提取物*0.52表?xiàng)攦翰杷?3-O-棓酸酯0.50維生素E 1.25維生素C 無(wú)活性*假定分子量為表?xiàng)攦翰杷?3-O-棓酸酯的分子量。
數(shù)據(jù)用磷脂酰膽堿脂質(zhì)體超聲化后降低共軛雙烯形成50％所要求的產(chǎn)物濃度(μM)表示。
據(jù)信多酚的抗氧化作用對(duì)抗誘變作用也很重要，例如最近報(bào)道的諸如從葡萄種子中提取的(10)一些多酚。
令人驚異的是，在從葡萄種子提取的產(chǎn)物具有抗誘變作用的相同濃度下，從綠茶得到的多酚(盡管具有高抗氧化活性)卻沒(méi)有這種活性；但另一方面，它們以差別細(xì)胞毒作用(在有致命線粒體突變的細(xì)胞系中較高)為特征，且認(rèn)為這具有重要意義。
這種細(xì)胞毒作用根據(jù)所用細(xì)胞系而不同，例如在腫瘤卵巢細(xì)胞中本發(fā)明產(chǎn)物在約50μM濃度下起細(xì)胞毒效應(yīng)，而用正常卵巢細(xì)胞測(cè)定時(shí)則在很高的濃度(1000μM)下才測(cè)到這種效應(yīng)。
在現(xiàn)有技術(shù)狀態(tài)下，已提出了不同的假說(shuō)以闡明自發(fā)突變的機(jī)制，它們的基礎(chǔ)假定是細(xì)胞周期的一些代謝產(chǎn)物(特別是自由基)負(fù)責(zé)調(diào)節(jié)線粒體遺傳，即通過(guò)將線粒體DNA復(fù)制所依賴的膜系統(tǒng)過(guò)氧化(11，12)。
在此前提下，兩類化合物被認(rèn)為非常有益，盡管它們有至少部分類似的基本機(jī)制(在線粒體水平的抗氧化活性)，但它們作用于兩個(gè)不同的方面抗誘變(如葡萄種子衍生物)和差別細(xì)胞毒作用(如本發(fā)明產(chǎn)物)。因而兩類物質(zhì)都可用于預(yù)防性治療退化性疾病，如瘤形成，心血管疾病如動(dòng)脈硬化和關(guān)節(jié)炎及各種起因的關(guān)節(jié)病。
另外，本發(fā)明產(chǎn)物可單獨(dú)用于治療或與其他物質(zhì)聯(lián)合使用以產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)。例如在腫瘤學(xué)上，本發(fā)明產(chǎn)物可與常規(guī)化療結(jié)合，取得既降小一些治療(如用一些蒽環(huán)化合物或鉑復(fù)合物如順鉑治療)中常出現(xiàn)的氧化損傷，又摧毀一部分腫瘤細(xì)胞(通過(guò)差別細(xì)胞毒機(jī)制)的雙重優(yōu)勢(shì)。
在瘤形成的預(yù)防中，與飲食一起服用多酚提取物是摧毀癌前態(tài)突變細(xì)胞的有效方式。對(duì)于動(dòng)脈硬化等其他情形，本發(fā)明產(chǎn)物最好與其他抗氧化劑合用，如類胡羅卜素、特別是番茄紅素和玉米黃素，以保持生物抗氧化池的完整性。
在關(guān)節(jié)退變疾病中，本發(fā)明產(chǎn)物可與含硫氨基酸如甲硫氨酸、半脫氨酸或脯氨酸和羥脯氨酸合用，選擇性地與葡糖胺和透明質(zhì)酸(ialuronic acid)混合使用。本發(fā)明多酚提取物在所述組合中的作用是在協(xié)同物存在下對(duì)成軟骨細(xì)胞的抗氧化和抗衰退雙重作用，這是由于刺激了膠原和蛋白多糖的合成。
這些提取物的有效劑量是10-1000mg/天，1-4次/天，優(yōu)選50-300mg/天，1-2次/天。大鼠和小鼠中的口服DL50大于2000mg/kg。
這些產(chǎn)物可制成常規(guī)藥物形式，如軟或硬明膠膠囊、片劑、藥袋、糖漿、栓劑和注射小瓶。與其他活性成分組合時(shí)，本發(fā)明組合物可以適于單個(gè)活性成分的相繼或分開(kāi)給藥。
下列實(shí)施例進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明。
實(shí)施例I制備含標(biāo)準(zhǔn)量多酚的綠茶無(wú)咖啡因提取物研細(xì)的非發(fā)酵茶葉(Camellia sinensis)1kg每次用3升丙酮/水7∶3(v/v)混合物提取4次。合并提取物，真空下在不高于45℃溫度下濃縮至1kg。在濃縮過(guò)程中形成了大量粘性物，后者由葉綠素和其它無(wú)益的親脂物質(zhì)組成，但仍含有多酚。該濃縮液用1升甲醇和0.5升二氯甲烷稀釋。將粘性物溶解在這種介質(zhì)中，攪拌30分鐘后分離各相。重復(fù)三次二氯甲烷萃取操作，然后棄去二氯甲烷相。真空濃縮含水甲醇相直到除去甲醇，用0.5升乙酸乙酯萃取濃縮物3次。棄去水相，有機(jī)相用Na2SO4干燥，濃縮至小體積(0.22升)。在強(qiáng)烈攪拌下將濃縮物倒在1.2升二氯甲烷中，生成大量棕色沉淀，真空干燥沉淀后稱重，約0.12kg。該殘余物含1.6％的生物堿，按下述方法進(jìn)行最終純化。在氮?dú)夥障氯芙庠?.5升甲醇中，甲醇溶液用250ml磺酸樹(shù)脂Amberlyst處理直到咖啡因消失，用薄層層析檢查。將此甲醇溶液在不高于50℃的溫度下濃縮至于。按此方法得到0.11kg米色產(chǎn)物，其組成如下表?xiàng)攦翰杷?3-O-棓酸酯58.0％表兒茶素-3-O-棓酸酯 16.0％表兒茶素 3.0％表?xiàng)攦翰杷?.5％實(shí)施例II制備含標(biāo)準(zhǔn)量多酚的綠茶無(wú)咖啡因提取物研細(xì)的非發(fā)酵茶葉(Camellia sinensis)1kg每次用3升丙酮/水4∶6混合物提取4次。合并提取物，不高于45℃下真空濃縮至1kg。在濃縮過(guò)程中形成一些沉淀，分離并棄去。濃縮物用0.5升二氯甲烷萃取三次，棄去二氯甲烷相。水相在檸檬酸銨存在下用檸檬酸酸化至pH1.5，用0.5ml乙酸乙酯萃取3次。棄去水相，而有機(jī)相用75ml甲苯稀釋，用150ml(每次)1％H2SO4反萃取三次。用水洗至中性后用Na2SO4干燥，將有機(jī)相濃縮至300ml，將濃縮物倒入1.5ml二氯甲烷中。真空干燥過(guò)夜后，得到0.1kg米色粉末，其具有實(shí)施例I產(chǎn)物的特征。
實(shí)施例III制備含標(biāo)準(zhǔn)量多酚的綠茶無(wú)咖啡因提取物研細(xì)的無(wú)發(fā)酵茶葉(Camellia sinensis)1kg每次用3升甲醇/水1∶1混合物提取4次。合并提取物，不高于45℃下真空濃縮至1kg。在濃縮過(guò)程中形成一些沉淀，分離并棄去。濃縮物用0.5升二氯甲烷萃取三次，棄去二氯甲烷相。水相在檸檬酸銨存在下用檸檬酸酸化至pH1.5，用0.5ml乙酸乙酯萃取3次。棄去水相，而有機(jī)相用75ml甲苯稀釋，用150ml(每次)1％H2SO4反萃取三次。用水洗至中性后用Na2SO4干燥，將有機(jī)相濃縮至300ml，將混縮物倒入1.5ml二氯甲烷中。50℃下真空干燥過(guò)夜后，得到0.1kg米色粉末，其具有實(shí)施例I產(chǎn)物的特征。
實(shí)施例IV含有綠茶多酚提取物的明膠膠囊將50mg綠茶多酚提取物與88mg微晶纖維素(Avicel PH102)、3mg硅膠(Aerosil 200)、8mg交聯(lián)羧甲基纖維素鈉(Ac-Di-Sol)和1mg硬脂酸鎂混合。形成的混合物裝入硬明膠膠囊(3號(hào))中。
實(shí)施例V含有綠茶多酚提取物的明膠膠囊將150mg綠茶多酚提取物與264mg微晶纖維素(Avicel PH102)、9mg硅膠(Aerosil 200)、24mg交聯(lián)羧甲基纖維素鈉和3mg硬脂酸鎂混合。形成的混合物裝入硬明膠膠囊(0號(hào))中。
實(shí)施例VI含綠茶多酚提取物的包衣片劑將50mg綠茶多酚提取物與50mg微晶纖維素(Avicel PH101)33mg二價(jià)磷酸鈣(Emcompress A)、3mg硅膠(Aerosil 200)、12mg交聯(lián)羧甲基纖維素鈉(Ac-Di-Sol)和2mg硬脂酸鎂混合。將此粉末混合10分鐘，然后以150mg/片的劑量制片。形成的藥片(直徑7mm)用含4.5mg羥丙基甲基纖維素(Methocel E5)、0.9mg聚乙二醇6000(Carbowax 6000)、1.2mg二氧化鈦和0.9mg滑石的敷膜機(jī)包衣。
實(shí)施例VII含綠茶多酚提取物的包衣片劑將150mg綠茶多酚提取物與150mg微晶纖維素(Avicel PH101)、99mg二價(jià)磷酸鈣(Emcompress A)、9mg硅膠(Aerosil 200)、36mg交聯(lián)羧甲基纖維素鈉(Ac-Di-Sol)和6mg硬脂酸鎂混合。將此粉末混合10分鐘，然后以450mg/片的劑量制片。形成的藥片(直徑11mm)用含13.5mg羥丙基甲基纖維素(Methocel E5)、2.7mg聚乙二醇6000(Carbowax 6000)、3.6mg二氧化鈦和2.7mg滑石的敷膜機(jī)包衣。
實(shí)施例VIII含綠茶多酚提取物的注射小瓶將10mg多酚提取物與200mg葡萄糖混合，溶解在足量注射用水中至5ml。該溶液(pH4.5)然后用常規(guī)技術(shù)制成注射小瓶制劑。
參考文獻(xiàn)1.Zhao B.等，細(xì)胞生物物理學(xué)，14，175，1989。
2.Huang M.T.等，癌發(fā)生，13，947，1992。
3.Conney A.H.等，預(yù)防醫(yī)學(xué)，21，361，1992。
4.Mukhtar H.等，皮膚病調(diào)查雜志，102，3，1994。
5.Kono S.等，日本癌研究雜志，79，1067，1988。
6.Oguni I.等，農(nóng)業(yè)生物化學(xué)，52，1879，1988。
7.Kato I.等，日本癌研究雜志，81，1101，1990。
8.Kono S.等，預(yù)防醫(yī)學(xué)，21，526，1992。
9.Maffei-Facino R.等，Arzneim-forsch./藥物研究，44，592，1994。
10.Liviero L.等，F(xiàn)itoterapia LXV，203，1994。
11.Dujon B.“線粒體遺傳和功能”，Straton J.N.等(編)，紐約冷泉巷冷泉巷實(shí)驗(yàn)室，1981。
12.De Flora S.等，突變研究，214，153，1989。
權(quán)利要求
1.咖啡因含量不高于0.2％(重量)的綠茶多酚提取物的制備方法，該方法包括a)用水-醇或水-酮混合物提取植物物料；b)全部或部分蒸發(fā)提取溶劑；c)將殘余物懸浮在30-60％(體積)的含水甲醇混合物中；d)用氯代溶劑萃取含水甲醇懸??；e)濾去不溶殘?jiān)?，濃縮含水甲醇相；f)用有機(jī)酸酸化或不酸化；g)用選自脂肪酸酯、醇或酮的溶劑萃取酸化或未酸化的濃縮含水甲醇相，條件是所述溶劑要與含水甲醇混合物不溶混；h)加或不加芳烴或脂肪烴，然后用稀無(wú)機(jī)酸水溶液洗滌；i)濃縮水不溶混性有機(jī)相，用氯代溶劑稀釋；k)若不存在f)和h)步，則在干燥脂肪酮或醇中用磺酸型樹(shù)脂處理。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中在a)中使用40-90％(體積)的丙酮水溶液。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中使用70％(體積)的丙酮水溶液。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)的方法，其中c)步中使用50％(體積)的甲醇水溶液。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)的方法，其中d)步中使用二氯甲烷。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)的方法，其中f)步使用存在檸檬酸銨的檸檬酸。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)的方法，其中g(shù))步的溶劑選自乙酸乙酯、甲酸乙酯、甲乙酮、1-丁醇、叔丁醇、2-丁醇。
8.根據(jù)權(quán)利要求7的方法，其中溶劑為乙酸乙酯。
9.根據(jù)上述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其中h)步使用有機(jī)相總體積5％(體積)量的甲苯和1％(體積)的硫酸水溶液。
10.根據(jù)上述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其中i)步使用二氯甲烷。
11.根據(jù)權(quán)利要求1-10任一項(xiàng)的方法，其包括a)到e)、g)、i)和k)步。
12.根據(jù)權(quán)利要求1-10任一項(xiàng)的方法，其包括a)-i)步。
13.可按權(quán)利要求1-12的方法制得的咖啡因含量不高于0.2％的茶(Camellia Sinensis)多酚提取物。
14.一種綠茶多酚提取物，其含有50-65％表?xiàng)攦翰杷?3-O-棓酸酯、13-20％表兒茶素-3-O-棓酸酯、2-4％表兒茶素和1.5-3％表?xiàng)攦翰杷睾筒桓哂?.2％的咖啡因。
15.含有權(quán)利要求13或14的多酚提取物和與其混合的適當(dāng)載體或賦形劑的藥物組合物。
16.根據(jù)權(quán)利要求15的藥物組合物，其為片劑、明膠膠囊、藥袋、糖漿、注射小瓶形式。
17.根據(jù)權(quán)利要求15或16的藥物組合物，其還含有蒽環(huán)藥或順鉑和其衍生物，任意地為適于相繼或分開(kāi)給藥的形式。
18.含有權(quán)利要求13或14的多酚提取物和適當(dāng)載體或賦形劑的化妝品組合物。
19.含有權(quán)利要求13或14的多酚提取物和適當(dāng)載體或賦形劑的營(yíng)養(yǎng)組合物。
20.權(quán)利要求13或14的多酚提取物在制備具有差別細(xì)胞毒活性和抗氧化活性的藥物中的用途。
21.權(quán)利要求13或14的多酚提取物在制備用于治療腫瘤、心血管系統(tǒng)的慢性退化性疾病、關(guān)節(jié)病、動(dòng)脈硬化的藥物中的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及茶的新多酚提取物的制備方法,其用途和含有它們的制劑。本發(fā)明特別涉及不含咖啡因但含天然比例表?xiàng)攦翰杷匮苌亩喾犹崛∥锏闹苽洹＿@些提取物可單獨(dú)使用或與親脂抗氧化劑、含硫氨基酸和生化寡聚物及營(yíng)養(yǎng)要素一起使用。這些新提取物單獨(dú)或與其他活性成分結(jié)合的應(yīng)用對(duì)食品、藥品和化妝品領(lǐng)域都很有意義。
文檔編號(hào)A61K8/97GK1178467SQ96192504
公開(kāi)日1998年4月8日 申請(qǐng)日期1996年3月7日 優(yōu)先權(quán)日1995年3月14日
發(fā)明者E·泊姆巴德利, P·莫拉佐尼, C·穆斯逖克 申請(qǐng)人:因迪納有限公司