專利名稱：外流泵抑制劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及抗微生物劑領(lǐng)域和潛在抗微生物劑的辨別和鑒定方法。更具體地說(shuō)，本發(fā)明涉及這樣的抗微生物劑，其作用方式與細(xì)胞上的外流泵及外流泵的調(diào)節(jié)有關(guān)。背景下面的背景材料并不被認(rèn)為是未決權(quán)利要求的先有技術(shù)，僅僅是為讀者的理解提供幫助。
在上半個(gè)世紀(jì)，抗生素是治療感染性疾病的有效工具。由于抗生素治療的發(fā)展，到二十世紀(jì)八十年代后期，在發(fā)達(dá)國(guó)家?guī)缀蹩赏耆刂萍?xì)菌性感染。耐藥細(xì)菌的出現(xiàn)，尤其在二十世紀(jì)八十年代后期和九十年代前期，正在改變這一狀況。在主要的醫(yī)院和醫(yī)療中心，抗生素耐藥性菌株的增多已尤為普遍。耐藥性菌株增多的后果包括更高的發(fā)病率和死亡率，更長(zhǎng)的患者住院時(shí)間，和醫(yī)療費(fèi)用的提高。(B.Murray.1994.《新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志》(New Engl.J.Med.)330卷1229-1230頁(yè))。
抗生素在醫(yī)院環(huán)境下的經(jīng)常使用選擇出了對(duì)許多抗生素有耐藥性的細(xì)菌群體。這些群體包括那些毒性可能不強(qiáng)，但本身對(duì)許多抗生素有耐藥性的病原菌。這些細(xì)菌常常感染身體虛弱或免疫功能低下的患者。出現(xiàn)的耐藥群體也包括那些已熟知的病原體細(xì)菌菌株，它們以前對(duì)抗生素敏感。新獲得的耐藥性通常源于DNA突變，或源于從其它有機(jī)體轉(zhuǎn)入的耐藥性質(zhì)粒(R質(zhì)粒)或具有耐藥性的轉(zhuǎn)座子。具有天然耐藥性的病原體或抗生素耐藥性病原細(xì)菌中任何細(xì)菌群體的感染，用目前的抗生素治療是非常困難的，因而需要能克服耐藥機(jī)制的新的抗生素分子。
細(xì)菌具有一些不同的對(duì)抗抗生素作用的機(jī)制。這些耐藥機(jī)制可能對(duì)某一抗生素分子或家族是特異的，或者可能是非特異的，對(duì)不相關(guān)的抗生素耐藥性均有涉及。幾種耐藥機(jī)制可能存在于單個(gè)菌株中且這些機(jī)制可能獨(dú)立地起作用或協(xié)同作用對(duì)抗某種抗生素或一組抗生素的作用。具體的機(jī)制包括藥物的降解，酶促修飾導(dǎo)致藥物的滅活，以及藥物靶分子的改變(B.G.Spratt《科學(xué)》(Science)，264卷388頁(yè)，1994年)。然而，還存在著更普遍的耐藥性機(jī)制，即通過(guò)降低抗生素向細(xì)胞內(nèi)的運(yùn)輸或提高藥物從細(xì)胞向胞外介質(zhì)的外排而阻斷或降低抗生素與靶分子的接近。兩種機(jī)制均能降低藥物在靶位點(diǎn)的濃度從而使得細(xì)菌能在一種或多種抗生素存在下存活，否則這些抗生素將抑制或殺死這些細(xì)菌細(xì)胞。一些細(xì)菌可利用上述兩種機(jī)制并結(jié)合具有活躍的抗生素外排作用的細(xì)胞壁(包括膜)的低通透性(H.Nikaido，《科學(xué)》(Science)264卷382-388頁(yè)，1994年)。
在某些情況下，源于低通透性的抗生素耐藥性與細(xì)菌質(zhì)膜的結(jié)構(gòu)有關(guān)。通常，根據(jù)包裹著胞質(zhì)的質(zhì)膜的結(jié)構(gòu)，細(xì)菌可分為兩大類。革蘭氏陽(yáng)性(G+)細(xì)菌只有一層膜，即質(zhì)膜。相形之下，革蘭氏陰性(G-)細(xì)菌有兩層膜，一層質(zhì)膜和一層外膜。這些細(xì)菌的膜均為含蛋白質(zhì)的脂雙分子層并可與其它分子結(jié)合。細(xì)菌膜的通透性可影響對(duì)抗生素的敏感性/耐藥性，因?yàn)楸M管一些抗生素的靶分子，如青霉素結(jié)合蛋白，可從質(zhì)膜外層接觸到，但抗生素的大多數(shù)靶分子均位于胞質(zhì)中或在質(zhì)膜的內(nèi)層。因而對(duì)于靶分子在質(zhì)膜中的抗生素來(lái)說(shuō)，在革蘭氏陰性細(xì)菌中該抗生素需首先穿過(guò)外膜。若靶分子在胞質(zhì)中，抗生素在革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌中需穿過(guò)質(zhì)膜，在革蘭氏陰性細(xì)菌中則需穿過(guò)外膜和質(zhì)膜兩層膜。對(duì)所有兩種膜，抗生素可擴(kuò)散透過(guò)膜或利用膜轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)穿過(guò)膜。
對(duì)于革蘭氏陰性細(xì)菌，其外膜的脂成分構(gòu)成了一有效的通透性屏障。這個(gè)外膜的外層含有脂、脂多糖(LPS)，脂多糖只見(jiàn)于革蘭氏陰性細(xì)菌的外膜。外膜的脂層以準(zhǔn)晶體方式高度組織化并具有非常低的流動(dòng)性。由于外膜脂層的低流動(dòng)性，甚至親脂性的抗生素也不能快速擴(kuò)散透過(guò)脂層。這已為實(shí)驗(yàn)所證示，疏水性探針?lè)肿訕O少分配到LPS的疏水區(qū)，而且其透過(guò)外膜雙分子層的速率僅為透過(guò)普通磷脂雙分子層(如質(zhì)膜雙分子層)速率的五十分之一到百分之一。
一些抗生素可通過(guò)含水的孔蛋白通道或通過(guò)特異的運(yùn)輸系統(tǒng)透過(guò)膜。然而，許多孔蛋白通道直徑很窄，不能讓較大的抗生素分子有效地?cái)U(kuò)散。另外，許多孔蛋白通道為高度親水性環(huán)境，不能讓疏水性分子有效地通過(guò)。因此，外膜可作為小分子的分子?xùn)艡?，這可部分解釋，為什么革蘭氏陰性細(xì)菌通常比革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌對(duì)抗生素更不敏感，以及為什么革蘭氏陰性細(xì)菌通常對(duì)大的抗生素，如糖肽，更具抗藥性，因?yàn)樗鼈儾荒芡高^(guò)外膜。
對(duì)某些抗生素質(zhì)膜也提供了一個(gè)擴(kuò)散屏障。然而，由于質(zhì)膜脂層的流動(dòng)性大于革蘭氏陰性細(xì)菌外膜的流動(dòng)性，親脂性的藥物可透過(guò)脂層。其它一些藥物，如磷霉素或D-環(huán)絲氨酸，它們?cè)谟H脂環(huán)境中具有非常低的溶解性，可利用運(yùn)輸系統(tǒng)穿過(guò)質(zhì)膜，在這種情況下，如果運(yùn)輸系統(tǒng)沒(méi)有合成，細(xì)菌將對(duì)藥物產(chǎn)生耐藥性(Peitz等，1967年，《生物化學(xué)雜志》(Biochem.J.)6卷，2561頁(yè))。
通過(guò)減少孔蛋白的數(shù)目或減少某種孔蛋白的數(shù)目而降低外膜的通透性，可降低某一菌株對(duì)許多抗生素的敏感性，因?yàn)榻档土丝股剡M(jìn)入細(xì)胞的速率。然而，對(duì)于大多數(shù)抗生素，其半平衡期非常短，若不存在其它機(jī)制，這些抗生素能夠發(fā)揮其作用。外流泵就是這些其它機(jī)制中的一個(gè)實(shí)例。一旦進(jìn)入胞質(zhì)或周質(zhì)，藥物將被運(yùn)回外面的介質(zhì)。這種運(yùn)輸通過(guò)外流泵來(lái)介導(dǎo)，它們由蛋白質(zhì)組成。不同的泵可特異地外排一種或一組藥物，如NorA系統(tǒng)可運(yùn)輸喹諾酮，或TetA可運(yùn)輸四環(huán)素，或者它們能外排許多不同的分子，如綠膿桿菌上的某種外流泵。通常，外流泵含有胞質(zhì)成分且將分子運(yùn)出細(xì)胞需要能量。一些外流泵具有二級(jí)質(zhì)膜蛋白質(zhì)，它們伸至周質(zhì)。至少有綠膿桿菌的某些外流泵具有位于外膜的三級(jí)蛋白質(zhì)。
外流泵與抗生素耐藥性有關(guān)，因?yàn)樵谀承┣闆r下，它們能除去大部分設(shè)法進(jìn)入細(xì)胞的抗生素分子，從而維持非常低的細(xì)胞內(nèi)抗生素濃度。現(xiàn)舉例說(shuō)明，實(shí)驗(yàn)室誘導(dǎo)的綠膿桿菌突變株799/61。不能產(chǎn)生任何可測(cè)到的外流泵，其對(duì)四環(huán)素和環(huán)丙氟氯霉素的敏感性比其父本菌株綠膿桿菌799高8至10倍，而其父本菌株可合成外流泵。同樣，綠膿桿菌外流泵的胞質(zhì)成分的無(wú)效突變體mexA，比野生型對(duì)抗生素更敏感。
外流泵的生理功能還沒(méi)有弄清。它們與藥物的耐受性有關(guān)，也參與了細(xì)菌細(xì)胞的正常生理活動(dòng)。編碼于綠膿桿菌mexA操縱子中的外流泵已被證實(shí)受介質(zhì)中的鐵離子含量調(diào)控，并與鐵載體受體的合成共同受到調(diào)控。鐵載體是細(xì)菌在缺鐵離子條件下，如在動(dòng)物感染過(guò)程中，生長(zhǎng)所必需的分子。當(dāng)細(xì)菌細(xì)胞需要鐵離子時(shí)，它們?cè)诎|(zhì)中合成并外排。鐵載體在感染的動(dòng)物中清除鐵離子并將鐵離子歸還給微生物體以用于基本的微生物生命過(guò)程。由于在動(dòng)物體內(nèi)，包括在人體內(nèi)，基本上沒(méi)有游離的鐵離子，感染細(xì)菌產(chǎn)生的鐵載體在感染過(guò)程中是一個(gè)重要的毒力因子。
甚至通常包被有具有相對(duì)高通透性的被膜的有機(jī)體可通過(guò)降低被膜的通透性而產(chǎn)生耐藥性。當(dāng)某種試劑主要通過(guò)某種特異的通道擴(kuò)散穿過(guò)屏障時(shí)，通道的突變丟失可能成為耐藥性的有效機(jī)制。“非經(jīng)典”的β-內(nèi)酰胺化合物亞胺培南，表現(xiàn)出不同尋常的抗綠膿桿菌活性，主要因?yàn)樵撍巹┛赏ㄟ^(guò)一特異的通道OprD擴(kuò)散，該通道的生理功能似乎是運(yùn)輸基本氨基酸。然而，通過(guò)簡(jiǎn)單地丟失oprD通道，綠膿桿菌可獲得對(duì)亞胺培南的耐藥性，目前從醫(yī)院環(huán)境中分離的大部分綠膿桿菌株均由于這種修飾作用而具耐藥性。以同樣的方式，模仿鐵螯合劑(鐵載體)設(shè)計(jì)的β-內(nèi)酰胺化合物在它們透過(guò)外膜的運(yùn)輸中已知可選擇鐵載體特異運(yùn)輸有缺陷的突變體。
概括地說(shuō)，上面的討論暗示細(xì)胞中影響抗生素進(jìn)入細(xì)菌細(xì)胞的運(yùn)輸(主動(dòng)和被動(dòng)運(yùn)輸)的因子，對(duì)許多細(xì)菌種類來(lái)說(shuō)，是抗生素耐藥性的的重要成分。概述本發(fā)明提供了篩選外流泵抑制劑化合物的方法，這些化合物能抑制細(xì)菌或其它微生物細(xì)胞的外流泵。這些外流泵可以能量依賴的方式從胞質(zhì)中外排底物分子，外排的底物分子包括抗細(xì)菌劑。這樣的外流泵抑制劑可用于，例如，通過(guò)降低共同給予的抗微生物劑的外排作用或阻止微生物(如細(xì)菌)合成的能允許或促進(jìn)其生長(zhǎng)的化合物的外排作用而治療微生物感染。降低這種化合物外排作用的一個(gè)實(shí)例是通過(guò)降低鐵載體的外排而抑制鐵離子的利用。因此，本發(fā)明也提供了含這些外流泵抑制劑的組合物以及用這些組合物來(lái)治療微生物感染的方法。從而，本發(fā)明公開(kāi)了一個(gè)適用于許多對(duì)抗微生物劑有耐藥性的病原有機(jī)體的治療方法。這樣的微生物中尤為合適的例子是病原菌綠膿桿菌，它對(duì)許多常用的抗菌劑有固有的耐藥性。將這種細(xì)菌暴露在某種外流泵抑制劑中可明顯減緩抗菌劑從細(xì)胞內(nèi)部的外排或鐵載體的外排。因此，如果另一種抗菌劑與外流泵抑制劑共同給藥，該抗菌劑將聚積到合適的濃度以抑制細(xì)菌細(xì)胞的生長(zhǎng)，否則，由于外排作用，它只能維持較低的胞內(nèi)濃度。根據(jù)所用抗菌劑的種類，這種抑制作用可歸因于抑菌作用或殺菌作用。盡管綠膿桿菌是一合適菌種的例子，其它細(xì)菌和微生物種類可能含有相似的寬底物泵，它們能主動(dòng)地外排許多抗微生物劑，從而也能成為合適的目標(biāo)。除上述之外，對(duì)于某些菌種，外流泵抑制劑可降低細(xì)菌的毒力，例如，通過(guò)抑制重要的病原因子的運(yùn)輸。再次以綠膿桿菌為例，對(duì)這種細(xì)菌外流泵的抑制抑制了鐵離子的攝取，這對(duì)其致病性是非常重要的。細(xì)菌鐵離子運(yùn)輸?shù)臋C(jī)制中涉及了稱作鐵載體的分子，它由細(xì)菌細(xì)胞合成并由外流泵外排。這些鐵載體分子緊緊地與從宿主中清除的鐵離子結(jié)合并被細(xì)菌攝取。通過(guò)這種方式，獲得細(xì)菌代謝所需的鐵離子，從而感染得以維持。
因此，舉例說(shuō)明外流泵抑制劑的功效，綠膿桿菌外流泵的抑制可產(chǎn)生下面的一種或多種生物學(xué)效應(yīng)1.綠膿桿菌株將變?yōu)閷?duì)那些不能用于假單胞菌屬感染治療的抗生素敏感，或變得對(duì)能抑制假單胞菌屬生長(zhǎng)的抗生素更敏感。
2.綠膿桿菌株將變得對(duì)目前用于治療假單胞菌屬感染的抗生素更加敏感。
3.由于鐵離子的利用受到妨礙，綠膿桿菌的致病力減弱。
4.一種泵成分的抑制可能是致命的。這些效應(yīng)甚至獲得一種即可治療這種細(xì)菌的感染。同時(shí)，如前面提到的，相似的泵也發(fā)現(xiàn)于其它的微生物。上面這些效應(yīng)的某些或全部也可從這些微生物中獲得，因而它們也是檢測(cè)或使用外流泵抑制劑的合適的目標(biāo)物。因此，術(shù)語(yǔ)“微生物”包括，例如，細(xì)菌，真菌，酵母，和原生動(dòng)物。
因此，第一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種篩選非四環(huán)素特異的外流泵抑制劑的方法。該方法包括當(dāng)細(xì)菌生長(zhǎng)在非零的亞抑制濃度的某種抗菌劑條件下時(shí)，確定產(chǎn)生非四環(huán)素特異的外流泵的細(xì)菌的生長(zhǎng)，而通常該抗菌劑將被細(xì)菌中的非四環(huán)素特異的外流泵排出。如果不被抑制，外流泵將使抗菌劑的胞內(nèi)濃度維持在低水平，于是抗菌劑不能抑制細(xì)胞。然而，如果也存在能顯著減緩或終止抗菌劑外排的化合物，該藥劑將在胞內(nèi)聚積到一個(gè)較高濃度，從而抗菌劑在較高的胞內(nèi)濃度下能抑制細(xì)胞的生長(zhǎng)。
在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，外流泵的一個(gè)成分與為綠膿桿菌mexA/mexB/oprM外流泵或由綠膿桿菌株K385過(guò)量表達(dá)的外流泵或由綠膿桿菌株P(guān)AO4098E過(guò)量表達(dá)的外流泵的一部分的多肽至少有50％的氨基酸序列相似性。由于該外流泵一多肽組分的上述序列相似性，這種外流泵被稱作綠膿桿菌型外流泵。這種泵將外排一種或多種非四環(huán)素化合物(但也可外排四環(huán)素)，其中包括，例如，其它類型的抗菌劑和毒力因子。在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，外流泵為綠膿桿菌外流泵，為在綠膿桿菌中天然存在的一種外流泵。一些這種綠膿桿菌外流泵已在上面提到。同樣在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，細(xì)菌為綠膿桿菌，例如，菌株K385或菌株P(guān)AO4098E。
同樣在一優(yōu)選的實(shí)施方案中，細(xì)菌可來(lái)自其它的菌種，如下面的任何一種綠膿桿菌，熒光假單胞菌，食酸假單胞菌，產(chǎn)堿假單胞菌，惡臭假單胞菌，嗜麥芽糖寡養(yǎng)單胞菌，洋蔥伯克氏菌，嗜水氣單胞菌，大腸桿菌，弗氏檸檬酸桿菌，鼠傷寒沙門(mén)氏菌，傷寒沙門(mén)氏菌，副傷寒沙門(mén)氏菌，腸炎沙門(mén)氏菌，痢疾志賀氏菌，弗氏志賀氏菌，索氏志賀氏菌，陰溝腸桿菌，產(chǎn)氣腸桿菌，肺炎克雷伯氏菌，產(chǎn)酸克雷伯氏菌，粘質(zhì)沙雷氏菌，土拉熱弗朗西絲氏菌，摩氏摩根氏菌，奇異變形菌，普通變形菌，產(chǎn)堿普羅威登斯菌，雷氏普羅威登斯菌，斯氏普羅威登斯菌，乙酸鈣不動(dòng)桿菌，溶血不動(dòng)桿菌，小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌，鼠疫耶爾森氏菌，假結(jié)核耶爾森氏菌，中間耶爾森氏菌，百日咳博德特氏菌，副百日咳博德特氏菌，支氣管炎博德特氏菌，流感嗜血菌，副流感嗜血菌，溶血嗜血菌，副溶血嗜血菌，杜氏嗜血菌，多殺巴斯德氏菌，溶血巴斯德氏菌，粘膜炎布蘭漢氏球菌，幽門(mén)螺桿菌，胚胎彎曲桿菌，空腸彎曲桿菌，大腸彎曲桿菌，布氏疏螺旋體，霍亂弧菌，副溶血弧菌，侵肺軍團(tuán)菌，單核細(xì)胞增生利斯特氏菌，淋病奈瑟氏球菌，腦膜炎奈瑟氏球菌，陰道加德納氏菌，脆弱擬桿菌，吉氏擬桿菌，擬桿菌3452A同源群，普通擬桿菌，卵擬桿菌，多形擬桿菌，單形擬桿菌，埃氏擬桿菌，內(nèi)臟擬桿菌，艱難梭菌，結(jié)核分枝桿菌，鳥(niǎo)分枝桿菌，胞內(nèi)分枝桿菌，麻風(fēng)分枝桿菌，白喉棒桿菌，潰瘍棒桿菌，肺炎鏈球菌，無(wú)乳鏈球菌，釀膿鏈球菌，糞腸球菌，屎腸球菌，金黃色葡萄球菌，表皮葡萄球菌，腐生葡萄球菌，中間葡萄球菌，豬葡萄球菌豬亞種，溶血葡萄球菌，人葡萄球菌，解糖葡萄球菌。
術(shù)語(yǔ)“外流泵”指一蛋白組合，它能從胞質(zhì)或細(xì)胞周質(zhì)中外排底物分子，這種外排作用需要能量。因此，外流泵一般位于細(xì)胞的質(zhì)膜上(跨質(zhì)膜)。在革蘭氏陰性細(xì)菌中泵可能跨過(guò)周質(zhì)空間并可能存在部分跨過(guò)外膜的外流泵。特定的外流泵將包含一多肽，它與為綠膿桿菌mexA/mexB/oprM的外流泵或綠膿桿菌株K385過(guò)量表達(dá)的外流泵或綠膿桿菌株P(guān)AO4098E過(guò)量表達(dá)的外流泵的一部分的多肽至少有50％的氨基酸序列相似性。由于外流泵組成多肽的上述序列相似性，這樣的外流泵被稱作綠膿桿菌型外流泵。
術(shù)語(yǔ)“非四環(huán)素特異性外流泵”指對(duì)四環(huán)素沒(méi)有高特異性(相對(duì)其它抗生素)的外流泵，從而它不是一個(gè)四環(huán)素(四環(huán)素特異)外流泵。該術(shù)語(yǔ)因而包括廣泛底物的泵(外排多種具有不同結(jié)構(gòu)特征的化合物)和對(duì)除四環(huán)素外的化合物(包括抗生素)有高特異性的泵。四環(huán)素外流泵與細(xì)菌對(duì)四環(huán)素特異的耐藥性有關(guān)。(Speer等，1992年《臨床微生物學(xué)評(píng)論》(Clin.Microbiol.Rev.)5卷387-399頁(yè)。)如所提到的，這些泵對(duì)四環(huán)素具有高的特異性，它們的存在使得細(xì)胞具有高的四環(huán)素耐藥性，但是它們并不能提供對(duì)其它抗生素的耐藥性。四環(huán)素泵成分的基因已在革蘭氏陰性以及革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌的質(zhì)粒中發(fā)現(xiàn)并能分為兩大類tetA(A-E)，和tetK及tetL。TetA-E四環(huán)素耐藥性因子含一結(jié)構(gòu)基因tetA，它是一四環(huán)素特異性泵，以及一阻遏物基因，tetR，它介導(dǎo)可誘導(dǎo)的四環(huán)素耐藥性。屬于這類的四環(huán)素外流泵稱為tetA(A)，tetA(B)，tetA(D)，tetA(E)，存在于腸細(xì)菌和其它革蘭氏陰性細(xì)菌。TetK和TetL是與革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌的四環(huán)素耐藥性有關(guān)的泵。其基因通過(guò)翻譯的弱化而調(diào)節(jié)，與tetA類并不同源。
術(shù)語(yǔ)“一種篩選方法”的使用指該方法適用于，常常是同時(shí)評(píng)價(jià)大量化合物的功效。在本發(fā)明中，這樣的篩選是直接地確定某種化合物抑制某種外流泵的能力。在本文中，“篩選”與檢測(cè)有所區(qū)別，在檢測(cè)中某一方法僅適合用于評(píng)價(jià)一種或幾種化合物。
“外流泵抑制劑”指能特異地干擾外流泵外排其正常底物或其它如抗生素的化合物能力的化合物。該抑制劑可能具有固有的抗微生物(如抗菌)的能力，但至少其主要的相關(guān)活性是由于外流泵抑制活性。本發(fā)明中尤為感興趣的是那些能抑制外排作用或抑制具有包括抗菌劑在內(nèi)的廣泛底物范圍的外流泵活性的化合物。術(shù)語(yǔ)“非四環(huán)素特異性外流泵抑制劑”指抑制某種非四環(huán)素特異性外流泵的外流泵抑制劑。術(shù)語(yǔ)“綠膿桿菌型外流泵抑制劑”指抑制綠膿桿菌型外流泵的外流泵抑制劑?！熬G膿桿菌外流泵抑制劑”指抑制存在于綠膿桿菌的外流泵的外排活性的外流泵抑制劑。
“潛在的”外流泵抑制劑指將被或正被試驗(yàn)其作為外流泵抑制劑的能力的化合物，從而是一“試驗(yàn)化合物”或一“假定的外流泵抑制劑”。
本文中，關(guān)于細(xì)菌或其它微生物的生長(zhǎng)，術(shù)語(yǔ)“生長(zhǎng)”首先指微生物的繁殖，即數(shù)量的增多而不是尺寸的增大。因此這個(gè)術(shù)語(yǔ)可適用于一種或多種類型的單細(xì)胞或細(xì)胞群。然而，這一術(shù)語(yǔ)也指生長(zhǎng)著的細(xì)胞正進(jìn)行其代謝過(guò)程，而不僅僅是正進(jìn)行一輪繁殖，如分裂。當(dāng)然這一術(shù)語(yǔ)也指如某些真菌等有機(jī)體的多核型的大小增長(zhǎng)，同時(shí)伴隨著核的數(shù)目增加。
在細(xì)菌(同樣對(duì)其它微生物)細(xì)胞生長(zhǎng)的上下文中，術(shù)語(yǔ)“抑制”指細(xì)菌群的生長(zhǎng)速率降低。這樣的抑制作用是可監(jiān)控的，例如，通過(guò)抑制劑存在或不存在時(shí)液體培養(yǎng)基的濁度差異，或通過(guò)抑制劑存在或不存在時(shí)固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)物蝕斑的大小差異而監(jiān)控。
關(guān)于細(xì)菌上特異的外流泵的存在，術(shù)語(yǔ)“過(guò)量產(chǎn)生”指與該菌種天然最常見(jiàn)的(通常為非醫(yī)院變種)分離菌相比，特異性外流泵數(shù)目顯著增多的細(xì)菌的存在。該術(shù)語(yǔ)并不是僅指外流泵組成多肽數(shù)目的增多，而是指細(xì)胞膜上有功能的外流泵數(shù)目的增多。結(jié)果，過(guò)量產(chǎn)生外流泵的細(xì)胞比該細(xì)菌不過(guò)量產(chǎn)生外流泵的菌株能更有效地外排底物分子。
過(guò)量產(chǎn)生外流泵的細(xì)菌株因而與“野生型菌株”相對(duì)。野生型菌株產(chǎn)生的特異外流泵水平為該菌種天然分離株的一般水平。但更重要的是，野生型菌株產(chǎn)生特異外流泵的水平明顯低于過(guò)量產(chǎn)生該特異外流泵的相關(guān)菌株的水平。
這里用到的術(shù)語(yǔ)“抗菌劑”指能特異抑制細(xì)菌生長(zhǎng)的化合物。更普遍地，術(shù)語(yǔ)，“抗微生物劑”指能特異地抑制微生物生長(zhǎng)的化合物，因而該術(shù)語(yǔ)的解釋也指其它的微生物和抗微生物劑。因而該術(shù)語(yǔ)包括天然存在的抗生素以及合成和半合成的化合物，這些藥劑具有殺菌或抑菌的能力。通常，如果某種抗菌劑是抑菌的，意味著該藥劑能基本上停止細(xì)菌細(xì)胞的生長(zhǎng)(但不殺死細(xì)菌)；如果某種藥劑是殺菌的，意味著該藥劑將殺死細(xì)菌細(xì)胞(在殺死細(xì)菌前可停止細(xì)菌生長(zhǎng))。但是，該術(shù)語(yǔ)與通常對(duì)細(xì)胞有毒性的化合物有明確地區(qū)別?？咕鷦╊惖囊恍?shí)例有喹諾酮(旋轉(zhuǎn)酶抑制劑)，氨基糖苷，糖肽，磺胺，大環(huán)內(nèi)酯，β-內(nèi)酰胺和四環(huán)素。本發(fā)明中的外流泵抑制劑單獨(dú)使用時(shí)可能是抗微生物(如抗菌)劑，和/或能激發(fā)另一種抗微生物劑的活性(提高微生物對(duì)該抗微生物劑的敏感性)，和/或能降低病原體的毒力。
一種抗菌劑的“亞抑制濃度”指比零高，但低于能抑制該特定菌株的菌群中大部分細(xì)胞的濃度。(對(duì)其它微生物也一樣)。因此，盡管少量的高敏感細(xì)胞可能被抑制，但大多數(shù)細(xì)胞的生長(zhǎng)不會(huì)受到影響或僅僅部分降低，因而，在合適的培養(yǎng)基中，在亞抑制濃度的特異抗菌劑存在下，優(yōu)選特異菌群的生長(zhǎng)降低應(yīng)不超過(guò)50％，更優(yōu)選不超過(guò)30％，更加優(yōu)選不超過(guò)10％。但是在下面的實(shí)施例1和3中的篩選方法中，亞抑制濃度必須足夠高，從而使外流泵的抑制能導(dǎo)致相應(yīng)的生長(zhǎng)抑制和抗菌劑滅活因子的進(jìn)入。通常，一種抗菌劑(或抗微生物劑)的亞抑制濃度低于最小抑制濃度(MIC)。
無(wú)論“包含”后面接什么詞，“包含”意味著包括，但不僅限于這些。因此，術(shù)語(yǔ)“包含”的使用表示列出的要素是所需或必需的，但其它的要求是任選的，可能存在，也可能不存在。無(wú)論詞組“由…組成”后面接什么，“由…組成”意味著包括且限于此。因此“由…組成”表示要素是所需的或必需的，且沒(méi)有其它要素存在?！盎旧嫌伞M成”指包括詞組后列出的所有要素，但不包括其它的不干擾或提高所列要素在本公開(kāi)內(nèi)容中的特異活性或作用的要素。因此，詞組“基本上由…組成”表示所列的要素是所需或必需的，但其它的要素則依其是否影響所列要素的活性或功能而是任選的，即可能存在，也可能不存在。
在另一方面，本發(fā)明提供了一個(gè)篩選非四環(huán)素特異性外流泵抑制劑的方法。在這個(gè)方法中，表達(dá)非四環(huán)素特異外流泵的細(xì)菌培養(yǎng)在含試驗(yàn)化合物和另一種化合物的合適培養(yǎng)基中。該方法包括確定在試驗(yàn)化合物的存在下，第二種化合物(如抗微生物劑)的胞內(nèi)濃度是否升高。第二種化合物通常是被該泵外排的物質(zhì)。確定第二種化合物在胞內(nèi)的濃度是否增高涉及檢測(cè)與調(diào)控序列(啟動(dòng)子)共同轉(zhuǎn)錄的報(bào)道基因的表達(dá)，而該調(diào)控序列的表達(dá)是受第二種化合物升高的胞內(nèi)濃度誘導(dǎo)的。第二種化合物在培養(yǎng)基中以非零的、對(duì)細(xì)菌亞抑制的濃度存在，這會(huì)使其胞內(nèi)濃度過(guò)低而無(wú)法誘導(dǎo)報(bào)道基因的表達(dá)，除非外排該化合物的泵被抑制。如果某試驗(yàn)化合物存在時(shí)比不存在時(shí)報(bào)道基因的表達(dá)水平高，則表明該試驗(yàn)化合物為外流泵抑制劑。第二種化合物優(yōu)選為抗菌劑，但不是必需為抗菌劑。在某些實(shí)施方案中，如果報(bào)道基因?yàn)閱慰截惾旧w插入，如插入非必需基因中，是非常有用的。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，第二種化合物為抗菌劑。在具體的實(shí)施方案中，重組的細(xì)菌可來(lái)自大量菌種中的任何一種，包括上面為第一個(gè)方面列出的那些。
在一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，可誘導(dǎo)調(diào)控序列中報(bào)道基因的表達(dá)可通過(guò)四環(huán)素濃度的提高而誘導(dǎo)。在那些實(shí)施方案中，調(diào)控序列可能是tetA調(diào)控序列(如tetA(A))，它含有一個(gè)能結(jié)合TetR阻遏物分子的操縱位點(diǎn)。細(xì)菌也能表達(dá)該阻遏物。四環(huán)素不存在(或四環(huán)素濃度非常低)時(shí)，阻遏物將與操縱位點(diǎn)結(jié)合而報(bào)道基因不表達(dá)。因此，當(dāng)四環(huán)素在培養(yǎng)基中以對(duì)表達(dá)非四環(huán)素特異外流泵的細(xì)菌為亞抑制水平存在時(shí)，四環(huán)素的胞內(nèi)水平維持在足夠低的水平，報(bào)道基因不能表達(dá)(或以極低水平表達(dá))。如果某種能抑制外流泵活性的化合物(試驗(yàn)化合物)存在，四環(huán)素的胞內(nèi)濃度將升高，TetR從操縱位點(diǎn)上釋放，而報(bào)道基因?qū)⒈磉_(dá)。報(bào)道基因和調(diào)控序列優(yōu)選但非必須以單拷貝形式插在細(xì)菌染色體中。通常，該基因插在一非必需基因中。
在具體的實(shí)施方案中，外流泵為綠膿桿菌外流泵，如MexA/mexB/oprM外流泵或由綠膿桿菌株K385過(guò)量表達(dá)的外流泵。在其它具體的實(shí)施方案中外流泵為綠膿桿菌型外流泵。在特定的實(shí)施方案中，報(bào)道基因編碼一種酶，如β-半乳糖苷酶，或其它表達(dá)易檢測(cè)產(chǎn)物的基因，幾種這樣的基因?qū)Ρ绢I(lǐng)域的技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是熟知的。同樣在特定的實(shí)施方案中，所用的細(xì)胞為綠膿桿菌菌株，但其它的實(shí)施方案中也可使用其它的細(xì)胞，具體地說(shuō)包括上面第一個(gè)方面中列出的細(xì)菌。
在具體的實(shí)施方案中，報(bào)道基因編碼一種酶，如β-半乳糖苷酶；一些合適的報(bào)道基因?qū)Ρ绢I(lǐng)域的技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是熟知的。在某些情況下報(bào)道物可提供一顏色可測(cè)的報(bào)道，但其它的報(bào)道也是有用的。比色報(bào)道即可是光吸收也可是光反射。因此，比色報(bào)道可能包括具有特征光吸收的分子(有色分子)的檢測(cè)或光發(fā)射分子(如熒光分子)的檢測(cè)。
對(duì)暴露在抗微生物劑中的微生物(包括細(xì)菌)來(lái)說(shuō)，某種抗微生物劑的“胞內(nèi)濃度”指該藥劑在細(xì)胞最外層膜內(nèi)的濃度。對(duì)大多數(shù)微生物種來(lái)說(shuō)，最外層膜為質(zhì)膜，但對(duì)革蘭氏陰性細(xì)菌來(lái)說(shuō)，該藥劑在周質(zhì)空間中的濃度可能是其顯著的胞內(nèi)濃度(如對(duì)β-內(nèi)酰胺)。對(duì)革蘭氏陰性細(xì)菌來(lái)說(shuō)，某種抗菌劑的相應(yīng)的胞內(nèi)濃度為可接近該抗菌劑的主要目標(biāo)物的細(xì)胞空間內(nèi)的濃度。
術(shù)語(yǔ)“重組微生物”指通過(guò)人的操作，插入了某種DNA結(jié)構(gòu)或序列的微生物種系，其中所插入的DNA結(jié)構(gòu)或序列原先在該微生物中并不存在，或者被插入到該微生物細(xì)胞或染色體的不同位置。該術(shù)語(yǔ)并不包括天然的遺傳交換如不同天然存在的有機(jī)體間的接合。該術(shù)語(yǔ)明確地包括重組細(xì)菌。對(duì)大多數(shù)目的，優(yōu)選插入DNA序列為穩(wěn)定的插入，也就是說(shuō)該序列可連續(xù)地復(fù)制并在生長(zhǎng)時(shí)傳遞給后代微生物。這樣的后代也是“重組”的。
術(shù)語(yǔ)基因的“表達(dá)”指細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄并翻譯生成多肽產(chǎn)物的過(guò)程。在本文中，該術(shù)語(yǔ)尤指表達(dá)的產(chǎn)物是有功能的，并在某種意義上說(shuō)很容易用適合該具體報(bào)道物的方法檢測(cè)出來(lái)。因此，對(duì)一個(gè)酶報(bào)道物來(lái)說(shuō)，產(chǎn)物具有正常的酶活性。
術(shù)語(yǔ)“提高的濃度”指這種一種胞內(nèi)濃度，它表明通常為抗菌劑的某種化合物處于一種較通常為試驗(yàn)化合物或外流泵抑制劑的第二種化合物不存在時(shí)為高的濃度。因此，在篩選方法的描述中，一種抗菌劑提高的胞內(nèi)濃度為比試驗(yàn)化合物或已知的外流泵抑制劑不存在時(shí)的濃度高的濃度。這種提高的濃度可能低于、等于或者高于培養(yǎng)基中的濃度。
術(shù)語(yǔ)“單拷貝”指該術(shù)語(yǔ)所指的核酸序列在每一染色體組中僅以單拷貝形式存在。這明確地區(qū)別于多拷貝質(zhì)粒中核酸序列的存在，在多拷貝質(zhì)粒中核酸序列在單個(gè)細(xì)胞中可以超過(guò)一的不同數(shù)目存在。
也與細(xì)胞中插入的核酸序列有關(guān)的術(shù)語(yǔ)“染色體插入”指核酸序列插入并共價(jià)連接入所討論的細(xì)胞的染色體中。這意味著該序列在細(xì)胞正常復(fù)制過(guò)程中將與染色體其它部分共同復(fù)制。再次說(shuō)明，這與獨(dú)立于細(xì)胞染色體之外的細(xì)胞質(zhì)粒上的核酸序列有明顯不同。
“報(bào)道基因”是一種所編碼的產(chǎn)物很容易被檢測(cè)的核酸序列。其中一些報(bào)道物為酶，可通過(guò)產(chǎn)物的酶活性而檢測(cè)。一個(gè)具體的例子是β-半乳糖苷酶基因。但還有許多其它的報(bào)道基因存在并為本領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟知。
“調(diào)控序列”是能控制有關(guān)的編碼序列何時(shí)表達(dá)和以什么水平表達(dá)的核酸序列。在涉及基因表達(dá)時(shí)，術(shù)語(yǔ)“可誘導(dǎo)的”指在某種特定條件下，跟隨調(diào)控序列的編碼序列的轉(zhuǎn)譯水平提高。于是，在調(diào)控序列可被抗菌劑誘導(dǎo)的情況下，當(dāng)存在足夠高濃度的抗菌劑時(shí)，有關(guān)的編碼序列的表達(dá)水平將提高。這樣的誘導(dǎo)作用可能有多種機(jī)制，具體包括解阻遏機(jī)制，其中在足夠高濃度的抗菌劑存在下，阻遏物分子被滅活。
在另一方面，本發(fā)明提供了一種利用微生物(如細(xì)菌)細(xì)胞和可被該細(xì)胞外流泵(如非四環(huán)素特異性外流泵)運(yùn)輸?shù)娜玖稀晒饣鶊F(tuán)或其它容易用光譜法檢測(cè)的化合物(檢測(cè)或可測(cè)化合物)來(lái)篩選外流泵抑制劑的方法。該方法包括比較在試驗(yàn)化合物存在或不存在時(shí)檢測(cè)化合物(如染料或熒光基團(tuán))的胞內(nèi)濃度。如果在試驗(yàn)化合物存在時(shí)檢測(cè)化合物的胞內(nèi)濃度較試驗(yàn)化合物不存在時(shí)升高，表明該試驗(yàn)化合物為一種特異的外流泵抑制劑。優(yōu)選細(xì)胞過(guò)量表達(dá)外流泵。
同樣優(yōu)選染料或熒光物質(zhì)的胞內(nèi)濃度可直接確定，然而，在其它的實(shí)施方案中，胞內(nèi)濃度通過(guò)確定懸浮培養(yǎng)基中的染料或熒光物質(zhì)的濃度(胞外濃度)或通過(guò)確定細(xì)胞抽提液中染料或熒光物質(zhì)的濃度而間接測(cè)定。胞內(nèi)染料的直接確定，在某些情況下，通過(guò)細(xì)胞(如一團(tuán)細(xì)胞中)顏色的目測(cè)，可定量確定外流泵的抑制。
許多不同的染料和熒光物質(zhì)在本領(lǐng)域是已知的。這些包括，例如龍膽紫，孔雀綠，美藍(lán)，芐紫(Benzyl Viologen)，溴麝香草酚藍(lán)，甲苯胺藍(lán)，美藍(lán)，玫瑰紅，Alcyan藍(lán)，釕紅，堅(jiān)牢綠，苯胺藍(lán)，二甲苯青，溴酚藍(lán)，考馬斯藍(lán)，溴甲酚紫，溴甲酚綠，臺(tái)盼藍(lán)和酚紅。合適的染料或其它檢測(cè)化合物可通過(guò)用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常用方法判定具體的染料是否被研究中的特定外流泵或被研究中的細(xì)胞的某種外流泵運(yùn)輸(外排)而作出選擇。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，染料為龍膽紫和孔雀綠。
在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種篩選外流泵抑制劑方法，包括將重組的微生物細(xì)胞與一試驗(yàn)化合物接觸，并確定重組的微生物細(xì)胞是否在試驗(yàn)化合物存在下生長(zhǎng)。重組的微生物被構(gòu)建，從而使得當(dāng)外流泵被抑制后微生物細(xì)胞將能生長(zhǎng)，而當(dāng)外流泵不被抑制時(shí)將不能生長(zhǎng)。如果重組的微生物細(xì)胞在試驗(yàn)化合物存在時(shí)生長(zhǎng)而在試驗(yàn)化合物缺乏時(shí)不生長(zhǎng)，則該試驗(yàn)化合物為外流泵抑制劑。這種方法是對(duì)外流泵抑制劑的陽(yáng)性生長(zhǎng)篩選。
在具體的優(yōu)選實(shí)施方案中，這種方法包括將重組的微生物細(xì)胞與一試驗(yàn)化合物、一誘導(dǎo)劑、高于重組微生物細(xì)胞的MIC的某一濃度的抗微生物劑接觸。在滅活因子的誘導(dǎo)不存在時(shí)，抗微生物劑不能被重組的微生物細(xì)胞外排或特異性滅活，誘導(dǎo)劑能誘導(dǎo)抗微生物劑的滅活因子。同樣在具體的實(shí)施方案中，重組的微生物為重組細(xì)菌。滅活因子可以是β-內(nèi)酰胺酶，抗菌劑β-內(nèi)酰胺可被β-內(nèi)酰胺酶斷裂。具體地，在一個(gè)實(shí)施方案中，β-內(nèi)酰胺酶基因可為blaS基因，而β-內(nèi)酰胺為一可降解的卡巴培南，在J.Dufresne等1988年，《抗微生物劑化學(xué)療法》(Antimicrob.Agents Chemother.)32卷819-826頁(yè)中blaS基因被鑒定并首次報(bào)道。而且，在具體的實(shí)施方案中，啟動(dòng)子為tetA啟動(dòng)子，重組的細(xì)菌細(xì)胞能從tetR基因產(chǎn)生有功能的阻遏物，并結(jié)合到啟動(dòng)子上。啟動(dòng)子和β-內(nèi)酰胺酶基因優(yōu)選但非必需以單拷貝形式插在細(xì)菌染色體中。
在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種治療動(dòng)物微生物感染，如細(xì)菌感染的方法，通過(guò)給這類感染動(dòng)物足夠量的外流泵抑制劑以降低外流泵活性，這里的抑制劑可降低微生物的致病能力。例如，這種致病能力的降低可通過(guò)抑制鐵載體的運(yùn)輸而干擾細(xì)菌對(duì)鐵離子的需求而獲得。同樣這種致病能力也可通過(guò)降低或消除能對(duì)宿主造成組織損傷影響的微生物代謝產(chǎn)物而降低。然而其它降低致病能力的方法也包含在這個(gè)方面。動(dòng)物可能是，例如雞和火雞，但在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中為哺乳動(dòng)物。
在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中微生物感染可能由細(xì)菌引起，例如這些細(xì)菌可能是上面第一個(gè)方面中列出的細(xì)菌種類中的任何一種。
在一個(gè)相關(guān)的方面中，本發(fā)明提供了一種通過(guò)給動(dòng)物足夠量的外流泵抑制劑以降低外流泵活性而治療遭受微生物感染的動(dòng)物的方法。在這個(gè)方面中，外流泵抑制劑可減弱與感染有關(guān)的微生物在體內(nèi)的生存能力。通過(guò)減弱在體內(nèi)的生存能力，被感染的動(dòng)物更容易清除體內(nèi)的感染，或微生物甚至可能被殺死。在具體的實(shí)施方案中動(dòng)物為哺乳動(dòng)物。同樣在具體的實(shí)施方案中，微生物可能是致病細(xì)菌種類中的任何一種，尤其是包括上面第一個(gè)方面中列出的那些。
術(shù)語(yǔ)“在體內(nèi)的生存能力”指微生物如細(xì)菌在宿主如動(dòng)物中的存活和生長(zhǎng)能力。因此，某種能降低微生物在體內(nèi)的生存能力的外流泵抑制劑能停止微生物的生長(zhǎng)，和/或殺死微生物。這樣的外流泵抑制劑因而也是抗菌劑。
在另一相關(guān)的方面中，本發(fā)明包括一種哺乳動(dòng)物預(yù)防治療的方法。在這個(gè)方法中，對(duì)處于微生物感染如細(xì)菌感染危險(xiǎn)中的哺乳動(dòng)物給予能減弱微生物致病能力的外流泵抑制劑。
在一相關(guān)的方面中，本發(fā)明提供了一種治療動(dòng)物，具體包括哺乳動(dòng)物的微生物感染的方法，即用抗菌劑和能提高微生物對(duì)該抗菌劑敏感性的外流泵抑制劑來(lái)治療遭受感染的動(dòng)物。通過(guò)這種方式，用較小劑量的抗菌劑即可消滅與感染有關(guān)的微生物，或者用在外流泵抑制劑不存在時(shí)使用沒(méi)有療效的抗菌劑也可治療。因此，本治療方法尤其適用于難以單獨(dú)用抗微生物劑治療的微生物株造成的感染，由于單獨(dú)作用需要大的劑量(可能帶來(lái)不希望的副反應(yīng))，或由于缺乏具有臨床療效的抗生素。但是本方法也適用于治療對(duì)特定抗微生物劑敏感的微生物感染，以減小該抗菌劑的劑量。這能降低發(fā)生副反應(yīng)的危險(xiǎn)，也能降低由于連續(xù)高劑量使用某種抗生素而造成的對(duì)高耐藥性微生物的選擇作用。在具體的實(shí)施方案中微生物為細(xì)菌，例如可能是上面第一個(gè)方面中指出的任何一種。同樣在具體的實(shí)施方案中，可用到不同的抗菌劑，這些包括喹諾酮類、四環(huán)素類、糖肽類、氨基糖苷類、β-內(nèi)酰胺類、利福霉素類、香豆霉素類、大環(huán)內(nèi)酯類和氯霉素。在具體的實(shí)施方案中，上面幾類中的抗生素，例如可是下面的一種β-內(nèi)酰胺抗生素亞胺培南，部分硫霉素，偏硫霉素，頭孢克洛，頭孢羥氨芐，頭孢羥唑，頭孢三嗪，頭孢澤酮，頭孢唑啉，頭孢克肟，頭孢甲肟，頭孢地嗪，頭孢尼西酸，頭孢哌酮，頭孢芐胺四唑，頭孢噻肟，頭孢替安，頭孢咪唑，頭孢匹胺，頭孢泊肟，頭孢磺啶，頭孢他啶，頭孢特侖，頭孢他唑，ceftibuten，頭孢唑肟，頭孢三嗪噻肟，頭孢氨呋肟，頭孢唑喃，頭孢乙腈，頭孢氨芐，頭孢來(lái)星，頭孢噻啶，頭孢噻吩，頭孢匹林，頭孢拉定，頭孢美唑，頭孢噻吩，頭孢替坦，azthreonam，卡蘆莫南，氟氧頭孢，羥羧氧酰胺菌素，脒西林，阿莫西林，氨芐青霉素，阿洛西林，羧芐青霉素，苯青霉素，卡非西林，氯唑西林，二氯唑西林，甲氧西林，美洛西林，萘夫西林，苯唑西林，盤(pán)尼西林G，哌拉西林，磺芐西林，替莫西林，替卡西林，cefditoren，SC004，KY-020，頭孢地尼，ceftibuten，F(xiàn)K-312，S-1090，CP-0467，BK-218，F(xiàn)K-037，DQ-2556，F(xiàn)K-518，cefozopran，ME1228，KP-736，CP-6232，Ro09-1 227，OPC-20000，LY206763大環(huán)內(nèi)酯類阿齊紅霉素，甲基紅霉素，紅霉素，磷酸竹桃霉素，羅他霉素，羅沙米星，羅紅霉素，醋竹桃霉素喹諾酮類氨氟沙星，西諾沙星，環(huán)丙氟哌酸，伊諾沙星，氟羅沙星，氟甲喹，洛美氟哌酸，萘啶酮酸，諾氟沙星，氧氟沙星，左旋氟哌酸，喹酸，培氟沙星，吡乙喹酸，替馬氟沙星，托舒沙星，司巴沙星，clinafloxacin，PD131628，PD138312，PD140248，Q-35，AM-1155，NM394，T-3761，蘆氟沙星，OPC-17116，DU-6859a，(鑒定于Sato，K.等，1992年《抗微生物劑化學(xué)療法》(Antimicrob.Agents Chemother，37卷1491-98頁(yè))，DV-7751a(鑒定于Tanaka，M.等，1992年《抗微生物劑化學(xué)療法》，37卷2212-18頁(yè))四環(huán)素類金霉素，去甲金霉素，強(qiáng)力霉素，賴甲環(huán)素，甲烯土霉素，二甲胺四環(huán)素，土霉素，四環(huán)素氨基糖苷類阿米卡星，阿貝卡星，丁胺菌素，地貝卡星，福貼霉素，慶大霉素，卡那霉素，meomycin，乙基紫蘇霉素，核糖霉素，紫蘇霉素，大觀霉素，鏈霉素，托普霉素，克林霉素，林可霉素在另一相關(guān)的方面中，本發(fā)明包括哺乳動(dòng)物預(yù)防治療的方法。在這個(gè)方法中，給予處于微生物感染如細(xì)菌感染危險(xiǎn)中的哺乳動(dòng)物抗菌劑和外流泵抑制劑。
在微生物如細(xì)菌對(duì)抗菌劑的反應(yīng)的敘述中，術(shù)語(yǔ)“易(敏)感性”指微生物對(duì)抗菌劑存在時(shí)的敏感性。即，提高敏感性意味著微生物將被微生物細(xì)胞周圍培養(yǎng)基中更低濃度的抗微生物劑抑制。這等于說(shuō)微生物對(duì)抗微生物劑更敏感。在大多數(shù)情況下該抗生物劑的最小抑制濃度(MIC)被降低。
這里用到的術(shù)語(yǔ)“治療”指為預(yù)防和/或治療目的給予藥物組合物。術(shù)語(yǔ)“預(yù)防性治療”指治療尚未感染，但容易感染，或有某種感染危險(xiǎn)的患者。術(shù)語(yǔ)“治療性治療”指對(duì)已遭受某種感染的患者進(jìn)行藥物治療。因此，在優(yōu)選的實(shí)施方案中，治療是聯(lián)合給予(同時(shí)或依次)哺乳動(dòng)物(為治療或預(yù)防目的)有療效量的增效劑和抗菌(或抗微生物)劑。
“療效量”或“藥效量”指如本發(fā)明中公開(kāi)的，具有療效的外流泵抑制劑的量，或外流泵抑制劑和抗微生物劑各自的量，療效通常指抑制引起或有助于微生物感染的微生物細(xì)胞的正常代謝到一定程度?？捎糜诼?lián)合治療的外流泵抑制劑和抗微生物劑的劑量為有療效量。因此，這里所用的療效量指那些聯(lián)合使用時(shí)，通過(guò)臨床試驗(yàn)結(jié)果和/或模型動(dòng)物感染研究判斷為產(chǎn)生期望療效的外流泵抑制劑和抗微生物劑的量。在具體的實(shí)施方案中，外流泵抑制劑和抗微生物劑按預(yù)先確定的比例混合，因此療效量應(yīng)是混合物的量。這個(gè)量和外流泵抑制劑及抗菌劑各自的量可由本領(lǐng)域的技術(shù)人員按常規(guī)確定，并隨許多因子如涉及的具體菌株和所用的具體外流泵抑制劑和抗菌劑的不同而變化。這個(gè)量也依賴于患者的身高、體重、性別、年齡及病史。對(duì)于預(yù)防性治療，療效量是如果有微生物感染存在就將有療效的量。
療效在一定程度上減輕一種或多種感染的癥狀，包括治愈感染。“治愈”指感染癥狀的消除，包括與感染有關(guān)的其它殘存的微生物的清除。但是，感染的某些長(zhǎng)期或永久影響在治愈后仍存在(如大范圍的組織損傷)。
術(shù)語(yǔ)“微生物感染”指病原性微生物對(duì)宿主哺乳動(dòng)物的侵染。這包括通常存在于哺乳動(dòng)物體內(nèi)或體表的微生物的過(guò)量生長(zhǎng)。更普遍地，微生物感染可能是微生物群體的存在正損傷宿主哺乳動(dòng)物的任何狀況。因此，當(dāng)過(guò)量微生物群體存在于哺乳動(dòng)物體內(nèi)或體表，或當(dāng)微生物的存在正損傷哺乳動(dòng)物的細(xì)胞或其它組織時(shí)，該哺乳動(dòng)物正“遭受”著微生物感染。這種描述尤其適用于細(xì)菌感染。
術(shù)語(yǔ)“給予(藥)”和“給藥”指一種給予哺乳動(dòng)物某種抗微生物的藥用組合物制劑的方法，該方法為，例如局部用藥、口服、靜脈注射、皮下注射或肌肉注射。給藥的優(yōu)選方法可隨多種因子如藥用組合物的成分、潛在或已有的細(xì)菌感染的部位、所涉及的微生物和已有微生物感染的嚴(yán)重程度的不同而變化。
術(shù)語(yǔ)“哺乳動(dòng)物”用其通常的生物學(xué)意義。因此，它具體包括人、狗和貓，但也包括許多其它的物種。
在另一個(gè)方面，本發(fā)明也以抑制細(xì)胞膜上的膜通道的方法為特色，該方法包括將膜通道與膜通道抑制劑接觸，抑制劑可減弱膜通道的外排能力。在具體的實(shí)施方案中，膜通道中的至少一個(gè)多肽與mexA/mexB/oprM外流泵或綠膿桿菌株K385過(guò)量表達(dá)的外流泵的一個(gè)多肽至少有50％的氨基酸序列相似性。
這里用到的術(shù)語(yǔ)“膜通道”指位于細(xì)胞膜上的允許一種或多種類型分子跨膜運(yùn)輸?shù)牡鞍拙酆象w。這種運(yùn)輸可能是反映濃度梯度的被動(dòng)運(yùn)輸，或是依賴于胞內(nèi)能量供應(yīng)的主動(dòng)運(yùn)輸。
“膜通道抑制劑”類似于外流泵抑制劑，是一種能減緩或阻止分子利用相應(yīng)的膜通道進(jìn)行跨細(xì)胞膜運(yùn)輸?shù)幕衔铩?br> 本發(fā)明也以一種增強(qiáng)抗微生物劑對(duì)微生物的活性的方法為特點(diǎn)，在該方法中將微生物與細(xì)胞中外流泵的非四環(huán)素特異性外流泵抑制劑和一抗菌劑接觸。因此，當(dāng)表達(dá)外流泵的細(xì)胞用抗微生物劑和非四環(huán)素特異性外流泵抑制劑處理時(shí)，本方法使抗微生物劑更有效地作用于該細(xì)胞。在具體的實(shí)施方案中，微生物為細(xì)菌，如上面第一個(gè)方面中指出的菌種中的任何一種，抗菌劑可選自抗生素的許多結(jié)構(gòu)類型，例如包括β-內(nèi)酰胺類、糖肽類、氨基糖苷類、喹諾酮類、四環(huán)素類、利福霉素類、香豆霉素類、大環(huán)內(nèi)酯類和氯霉素類。在具體的實(shí)施方案中，上面類型中的抗生素可為前面提到的那些。
在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞感染有效進(jìn)行治療的藥用組合物，其中包括藥用載體和外流泵抑制劑。這樣的組合物可含有無(wú)其它抗菌劑存在時(shí)為有效抗菌劑的外流泵抑制劑。這樣的組合物可單獨(dú)用于治療感染。在其它的組合物中，外流泵抑制劑可提高細(xì)菌對(duì)其它抗菌劑的敏感性，因而這種組合物應(yīng)與這樣的抗菌劑合用。本發(fā)明也提供了對(duì)哺乳動(dòng)物感染的治療同樣有效的藥用組合物，它包含外流泵抑制劑和抗菌劑。同樣本發(fā)明也提供了含抗菌劑、外流泵抑制劑和載體的藥用制劑。
在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，外流泵抑制劑具有下面通用結(jié)構(gòu)1-4中所示的一種結(jié)構(gòu)
其中R＝烷基(C1-C4)、氟烷基(C1-C4)、過(guò)氟烷基(C1-C4)、烷氧基(C1-C4)、烷硫基(C1-C4)、鹵素(Br，Cl，F(xiàn)或I)、芳基(C6-C10)、單取代芳基(C6-C10)[用烷基(C1-C4)、烷氧基(C1-C4)、烷硫基(C1-C4)、鹵素(Br，Cl，F(xiàn)或I)、氨基、單取代氨基[用烷基(C1-C4)任選地取代]、雙取代氨基[用烷基(C1-C4)或羥基的任意組合任選地取代]任選地取代]、雙取代芳基(C6-C10)[用烷基(C1-C4)、烷氧基(C1-C4)、烷硫基(C1-C4)、鹵素(Br，Cl，F(xiàn)或I)和氨基的任意組合]、2-(或3-)-噻吩基、2-(或3-)-呋喃基、或2-(3-或4-)-吡啶基。W＝H，NH2，單取代氨[用烷基(C1-C4)任選地取代]，雙取代氨[用烷基(C1-C4)的任意組合任選地取代]，氮雜環(huán)[如N-嗎啉基，N-哌嗪基，N-吡咯烷基，N-咪唑基，N-吡咯基，N-吡唑基，N-三唑基，或N-四唑基]，鹵素(Br，Cl，F(xiàn)，I)，羥基，烷氧基(C1-C4)，烷硫基(C1-C4)，R1＝(CH2)nNRbRc，(CH2)nNHC＝(NRa)NRbRc，(CH2)nSNHC＝(NRa)NRbRc，(CH2)nC＝(NRa)NRbRc，(CH2)nN＝CNRbRc，(n＝2-4)；Ra(Rb或Rc)＝H，烷基(C1-C4)，芳基(C6)，取代芳基，苯基，取代苯[用烷基(C1-C4)，烷氧基(C1-C4)，烷硫基(C1-C4)，鹵素(Br，Cl，F(xiàn)或I)，或氨基任選地取代]，或Ra+Rb＝(CH2)2-3或-CH＝CH-，X＝芳基(C6-C10)，-(CH2)0-2芳基(C6-C10)，取代芳基(C6-C10)[用烷基(C1-C4)，烷氧基(C1-C4)，烷硫基(C1-C4)，鹵素(Br，Cl，F(xiàn)或I)，或氨基任選地取代]，取代-(CH2)0-2芳基(C6-C10)[用烷基(C1-C4)，烷氧基(C1-C4)，烷硫基(C1-C4)，鹵素(Br，Cl，F(xiàn)或I)，或氨基在芳基上取代]，2-(或3-)-噻吩基，2-(或3-)-呋喃基，2-(3-或4-)-吡啶基，苯并呋喃基[在苯并呋喃環(huán)的任何位置]，苯并噻吩基[在苯并噻吩環(huán)的任意位置]。其中存在著非對(duì)稱中心，其絕對(duì)立體化學(xué)性質(zhì)可能是R或S構(gòu)型，或?yàn)橥庀旌衔铮及谕ㄓ媒Y(jié)構(gòu)描述中。
符合上述通用結(jié)構(gòu)的化合物可通過(guò)化學(xué)領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的化學(xué)合成方法獲得。
“載體”或“賦形劑”是一種用于使化合物的給藥更容易，如提高上述化合物的溶解性的化合物或材料。固體載體包括，如淀粉，乳糖，磷酸二鈣，蔗糖和高嶺土。液體載體包括，例如無(wú)菌水，鹽水，緩沖液，非離子型表面活性劑，和食用油如油脂，花生油和芝麻油。另外，一些本領(lǐng)域常用的輔劑也可包括在內(nèi)。這些和其它這樣的化合物在文獻(xiàn)中有描述，如Merck目錄，Merck & Company Rahway，NJ.藥用組合物中不同成分的混合應(yīng)注意的事項(xiàng)已有描述，如在Gilman等，1990年編《Goodman和Gilman’s治療的藥學(xué)基礎(chǔ)》(Goodman and Gilman’sThe Pharmacological Basis of Therapeutics)，第8版，Pergamon Press。
在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種遏制表達(dá)非四環(huán)素特異性外流泵的細(xì)菌生長(zhǎng)的方法，該方法通過(guò)將該細(xì)菌與非四環(huán)素特異性外流泵抑制劑在低于細(xì)菌MIC的濃度的抗菌劑存在下作用，而抑制細(xì)菌生長(zhǎng)。這種方法可用于，例如防止或解決具有外流泵的細(xì)菌對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)的污染。然而，它可用于需要這種生長(zhǎng)抑制的任何情況。
在相關(guān)的方面中，本發(fā)明提供了一種抑制細(xì)菌生長(zhǎng)的方法，該方法包括將細(xì)菌與能降低外流泵的一種組分的表達(dá)的外流泵抑制劑接觸，這樣的抑制劑可以多種不同的方式在表達(dá)的調(diào)控中起作用。例如，它可能提高阻止外流泵成分表達(dá)的阻遏物分子產(chǎn)量。另一種可能的機(jī)制是，抑制劑是否阻止了阻遏物分子的釋放。這樣的阻遏物分子的實(shí)例是大腸桿菌中的MarR(Seoane和Levy，1994年，《美國(guó)微生物遺傳學(xué)學(xué)會(huì)會(huì)議摘要》(Abstr.ofthe Am.Soc.for Microbiol.Gen.Meeting)，Las Vegas，NV.Abstr.H-26)。正調(diào)節(jié)物的一個(gè)實(shí)例是枯草桿菌中的BmrR(Ahmed等，1994年《生物與化學(xué)雜志》(J.Biol.Chem.)。
在另一個(gè)相關(guān)的方面中，本發(fā)明提供了一種減少細(xì)菌株群體數(shù)量的方法，該方法包括將群體與抑制該群體的細(xì)菌表達(dá)的外流泵的一種成分的外流泵抑制劑接觸，該外流泵對(duì)表達(dá)該外流泵的細(xì)菌的生長(zhǎng)是必需的。在具體的實(shí)施方案中，該成分為質(zhì)膜成分。如上所述，這樣的外流泵抑制劑可以多種方式起作用，包括但不限于直接與基本成分作用，或抑制該成分的表達(dá)。
術(shù)語(yǔ)“減少群體數(shù)量”意味著該群體的細(xì)菌將被殺死。這區(qū)別于阻止細(xì)菌生長(zhǎng)和繁殖的抑菌劑。按照本方面的敘述，外流泵的“基本成分”是對(duì)細(xì)菌在體內(nèi)存活，即在宿主中存活所必需的成分。
在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種通過(guò)給予動(dòng)物某種外流泵抑制劑而促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)的方法，該外流泵抑制劑可抑制存在于動(dòng)物中的細(xì)菌株表達(dá)的外流泵，并抑制該細(xì)菌株的生長(zhǎng)。這種生長(zhǎng)促進(jìn)效應(yīng)可能是降低了細(xì)菌的能量消耗，從而提高了動(dòng)物對(duì)食物能量的利用。本方法適用于，例如牛，豬，和雞和火雞等家禽。
本發(fā)明其它的特點(diǎn)和優(yōu)點(diǎn)將在下面的優(yōu)選實(shí)施方案的描述和權(quán)利要求中表現(xiàn)出來(lái)。附圖簡(jiǎn)述

圖1表示外流泵分為三大類。
圖2為綠膿桿菌外流泵MexA/MexB/OprM的圖示，表明了三種組分預(yù)期的空間關(guān)系。在該圖中，MexB橫跨質(zhì)膜，MexA跨過(guò)周質(zhì)空間，而OprM跨過(guò)外膜。右邊的圖表明如果試驗(yàn)化合物抑制了外排作用(如通過(guò)抑制一種泵成分)，通常外排的抗生素(如環(huán)丙氟哌酸)將在細(xì)菌胞質(zhì)中聚積。
圖3顯示了實(shí)施例1中描述的用過(guò)量產(chǎn)生運(yùn)輸環(huán)丙氟哌酸的外流泵的菌株和不產(chǎn)生該外流泵的菌株進(jìn)行篩選的預(yù)期結(jié)果。過(guò)量產(chǎn)生的菌株，在外流泵抑制劑存在下，加入亞MIC濃度的環(huán)丙氟哌酸，將不再生長(zhǎng)。
圖4是實(shí)施例2中描述的報(bào)道方法的概括圖示。
圖5顯示了實(shí)施例3中陽(yáng)性生長(zhǎng)篩選的成分及其相互關(guān)系。
圖6顯示了四種綠膿桿菌菌株中四環(huán)素在胞內(nèi)的聚積。超敏感性菌株799/61表現(xiàn)出了最高的胞內(nèi)濃度。
圖7表明了用于L-苯丙胺酰-L-精氨酰-β-萘酰胺的體外鑒定的四種綠膿桿菌菌株外流泵的特點(diǎn)。
圖8顯示了L-苯丙胺酰-L-精氨酰-β-萘酰胺分別與四環(huán)素，和環(huán)丙氟哌酸對(duì)圖4中鑒定的四種綠膿桿菌菌株中的每一種的協(xié)同效應(yīng)。
圖9圖示了綠膿桿菌株P(guān)AO1在不同濃度的L-苯丙胺酰-L-精氨酰-β-萘酰胺中24小時(shí)后對(duì)13種抗生素的敏感性的倍數(shù)提高。
圖10表明了綠膿桿菌株P(guān)AO1和K385在20μg/ml L-苯丙胺酰-L-精氨酰-β-萘酰胺存在和不存在時(shí)對(duì)13種抗生素的敏感性(MICs)。
圖11說(shuō)明了四種兩性氟喹諾酮的疏水性程度與由L-苯丙胺酰L-精氨酰-β-萘酰胺引起的敏感性倍數(shù)提高的關(guān)系，表現(xiàn)出直接的關(guān)系。
圖12表明了環(huán)丙氟哌酸對(duì)26株包括臨床分離的和實(shí)驗(yàn)室的綠膿桿菌株的MIC的減小。
圖13-15顯示了，3株綠膿桿菌株的殺死時(shí)間研究的結(jié)果。各菌株均在每種抗生素存在或不存在，有和無(wú)L-苯丙胺酰-L-精氨酰-β-萘酰胺的情況下對(duì)四環(huán)素和環(huán)丙氟哌酸進(jìn)行試驗(yàn)。
圖16顯示了一些菌種，從這些菌種中選出的菌株用于L-苯丙胺酰-L-精氨酰-β-萘酰胺對(duì)環(huán)丙氟哌酸的增強(qiáng)作用試驗(yàn)，指出了從每一菌種中選出的、顯示出增強(qiáng)作用的部分試驗(yàn)菌株。
圖17比較了L-苯丙胺酰-L-精氨酰-β-萘酰胺對(duì)大腸桿菌Acr+和Acr-菌株對(duì)吖啶橙的敏感性的影響。
圖18顯示了綠膿桿菌株P(guān)AO1和一DNA旋轉(zhuǎn)酶突變株間L-苯丙胺酰-L-精氨酰-β-萘酰胺對(duì)環(huán)丙氟哌酸敏感性的影響的比較。
圖19顯示了在CCCP或L-苯丙胺酰-L-精氨酰-β-萘酰胺存在時(shí)三種產(chǎn)生外流泵的綠膿桿菌株中四環(huán)素聚積的變化。
圖20顯示了CCCP和L-苯丙胺酰-L-精氨酰-β-萘酰胺對(duì)綠膿桿菌株799/61中四環(huán)素聚積的影響的差異。
圖21提供了L-苯丙胺酰-L-精氨酰-β-萘酰胺的一種結(jié)構(gòu)表達(dá)式。優(yōu)選實(shí)施方案的敘述外流泵的生理功能細(xì)菌利用運(yùn)輸體從胞質(zhì)中向胞外介質(zhì)中外排分子。大多數(shù)已知的運(yùn)輸體與不能透膜擴(kuò)散或擴(kuò)散非常慢的分子的運(yùn)輸有關(guān)。外排到胞外介質(zhì)的分子包括蛋白質(zhì)，肽，莢膜多糖，寡聚糖，鐵載體和藥物。運(yùn)輸體允許分子透過(guò)質(zhì)膜并在革蘭氏陰性細(xì)菌中透過(guò)外膜，并可根據(jù)其序列同源性及能量來(lái)源分為三個(gè)主要家族(H.Nikaido，1994年《科學(xué)》(Science)264卷382-388頁(yè)；Dinh等，1994年《細(xì)菌學(xué)雜志》(J.Bacteriol.)176卷3825-3831頁(yè))。(見(jiàn)圖1)。ABC(ATP-結(jié)合盒)家族包括藥物和酶運(yùn)輸體，這個(gè)家族包括與蛋白分泌有關(guān)的運(yùn)輸體。例如HlyD與大腸桿菌中溶血素的外排有關(guān)，而在綠膿桿菌中堿性蛋白酶由AprE系統(tǒng)外排。哺乳動(dòng)物細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的多藥外流泵，金黃色葡萄球菌中的P-1糖蛋白和MsrA屬于這一類。主要的促進(jìn)子超家族包括如Tet外流泵的特異性外流泵，并與參與從胞外介質(zhì)攝取營(yíng)養(yǎng)的運(yùn)輸系統(tǒng)如Xyl系統(tǒng)有關(guān)。這種主要促進(jìn)子家族以質(zhì)子動(dòng)力為能量源。第三個(gè)家族重金屬耐受性/生節(jié)因子家族包括，與鐵載體的分泌有關(guān)的運(yùn)輸體，例如綠膿桿菌中的MexA，與草木犀根瘤菌中的生節(jié)因子的外排有關(guān)的運(yùn)輸體，和與抗生素的外排有關(guān)的具有廣泛底物特異性的外流泵，如綠膿桿菌中的mex泵或大腸桿菌中的Acr.鐵離子代謝與外流泵鐵離子是生命體中最普通的過(guò)渡金屬，并是所有病原菌的基本營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)(Wooldridge和Williams等，1993年《FEMS微生物學(xué)評(píng)論》(FEMS Microbiol.Rev)12卷325-348頁(yè))。鐵離子的利用在感染的發(fā)生和發(fā)展中起著重要作用。人體中胞外的鐵離子與高親和性鐵結(jié)合蛋白轉(zhuǎn)鐵蛋白和乳鐵蛋白結(jié)合。轉(zhuǎn)鐵蛋白和乳鐵蛋白通過(guò)限制病原微生物鐵離子的利用，有助于宿主抵御感染。細(xì)菌在體內(nèi)需要鐵離子才能生存和繁殖，從而演化出不同的獲取鐵離子的方法。細(xì)菌合成并向外部介質(zhì)排放對(duì)鐵離子具有高親和力的分子，當(dāng)這些分子螯合鐵離子后，又被運(yùn)回細(xì)胞(Wooldridge和Williams，1993年)。這些分子通常被稱作鐵載體并對(duì)細(xì)菌感染的發(fā)展是必需的。與鐵載體的合成以及它們的外排和攝取有關(guān)的系統(tǒng)受外部介質(zhì)中可利用的鐵離子的嚴(yán)格調(diào)節(jié)。綠膿桿菌合成兩種主要的鐵載體，綠膿菌熒光素和綠膿菌螯鐵蛋白。兩種鐵載體均能除去轉(zhuǎn)鐵蛋白結(jié)合的鐵離子(Sriyosachati和Cox，1986年，《感染與免疫》(Infect.& Imm.52卷885-891頁(yè)；C.Wolz，1994年《感染與免疫》62卷4021-4027頁(yè))。與綠膿菌螯鐵蛋白相比，綠膿菌熒光素是一更有效的鐵離子清除劑并對(duì)鐵離子具有更高的親和力，它能有效地從轉(zhuǎn)鐵蛋白復(fù)合物中除去鐵離子。綠膿菌熒光素是一大的水溶性分子，分子量1.5KD。它不能穿過(guò)膜的脂層擴(kuò)散，而需要借助運(yùn)輸系統(tǒng)穿過(guò)質(zhì)膜。盡管鐵載體的攝取系統(tǒng)在文獻(xiàn)中已有描述(Gensberg和Smith 1992年《普通微生物學(xué)雜志》(J.Gen.Microbiol.)138卷2381-2387頁(yè))，但直至現(xiàn)在其分泌途徑本身才被推知。外流泵與鐵載體的外排有關(guān)，因?yàn)樾枰鼈兗?xì)菌才能分泌鐵載體，否則鐵載體因其巨大的體積及親水性而不能越過(guò)外膜和內(nèi)膜。在綠膿桿菌中，mexAB，oprM操縱子的表達(dá)受培養(yǎng)基中鐵離子含量的調(diào)控，并與主要的鐵載體綠膿菌熒光素成分的產(chǎn)生與攝取共同受到調(diào)控(Poole等，1993a)，由于鐵離子的運(yùn)輸對(duì)成功的綠膿桿菌感染是必需的(P.Sokol，1987年《感染與免疫》55卷2021-2025頁(yè)；B.Haas，1991年《感染與免疫》59卷3997-4000頁(yè)；Woods和Iglewski，1982年《感染與免疫》35卷461-464頁(yè))，因此該泵的抑制將干擾細(xì)菌鐵離子的代謝從而減弱其毒力。主動(dòng)外排作用作為藥物耐受性的機(jī)制約在1980年，當(dāng)S.B.Levy及其同事揭示了大腸桿菌質(zhì)粒編碼的四環(huán)素耐藥性是基于能量依賴的外流泵后，毒性劑的主動(dòng)泵出或跨膜外排作用引起的耐藥性開(kāi)始引起了科學(xué)家們的興趣。隨后不久又證實(shí)了金黃色葡萄球菌的質(zhì)粒編碼的鈣耐受性也是基于外排機(jī)制。
在許多有機(jī)體對(duì)許多藥劑的耐受中，主動(dòng)外排起著主要的作用，這已逐步得到認(rèn)可。在Neu列出的三種臨床相關(guān)的與降低的通透性有關(guān)的耐藥機(jī)制中，有兩種，可能所有三種都主要是由于外排。(i)1987年，Neal和Chater首先證實(shí)，天藍(lán)色鏈霉菌可保護(hù)自己免受它產(chǎn)生的亞甲霉素的殺傷，在產(chǎn)生抗菌素的鏈霉菌屬的菌種中，已鑒定了許多抗生素外排基因。它們中的一些屬于MF家族，其它的屬ABC家族。(ii)金黃色葡萄球菌中的一種新型的質(zhì)粒介導(dǎo)的大環(huán)內(nèi)酯耐藥性，起先認(rèn)為是由于降低的通透性，已被證實(shí)與主動(dòng)外排有關(guān)。(iii)氯霉素耐藥性最常見(jiàn)的機(jī)制與藥物的酶促乙?；嘘P(guān)?！奥让顾啬退幮缘姆敲复贆C(jī)制”起先也被認(rèn)為是由于氯霉素內(nèi)流作用降低，已發(fā)現(xiàn)也是由主動(dòng)外排引起的，因?yàn)檗D(zhuǎn)座子Tn 1696中的cmLA基因表現(xiàn)為MF家族的一個(gè)主動(dòng)外流運(yùn)輸體。而且，流感嗜血桿菌含一同源的染色體基因，這一(也許許多其它的)菌種中的一些非酶促耐藥性很可能是由于主動(dòng)外排作用。(iv)葡萄球菌中質(zhì)粒編碼的對(duì)季銨抗菌劑的耐藥性被證實(shí)與外排作用有關(guān)，即通過(guò)MF型的QasA-QacB運(yùn)輸體和Smr型的QacC運(yùn)輸體。這些蛋白質(zhì)也能泵出一些堿性染料。(v)一種氟喹諾酮諾氟沙星的主動(dòng)外排在野生型大腸桿菌中首次發(fā)現(xiàn)。一個(gè)與相似的主動(dòng)外排過(guò)程有關(guān)的基因(norA)隨后從金黃色葡萄球菌的耐藥性突變體的染色體上測(cè)序并被證實(shí)編碼MF家族的一個(gè)外排運(yùn)輸體。NorA可泵出許多種氟喹諾酮。外流泵的鑒定當(dāng)去能的細(xì)胞比賦能的細(xì)胞聚積更多的底物時(shí)，細(xì)胞中存在的外流泵可被檢測(cè)出來(lái)。(S.B.Levy，1992年《抗微生物劑化學(xué)療法》(Antimicrob.Agents Chemother.)36卷695-703頁(yè))。去能指使能量依賴的外流泵不能利用能量。例如，這可通過(guò)使已賦能的膜去極化，消除質(zhì)子動(dòng)力(PMF)而完成。由于許多已鑒定的外流泵是受PMF驅(qū)動(dòng)的，因而這種方法是合適的。濃度差異可通過(guò)物質(zhì)在細(xì)胞中的積累直接測(cè)出，或者用另一種方法，將已積累了某種物質(zhì)的細(xì)胞移入不含該物質(zhì)的培養(yǎng)基中，在能量存在或不存在的情況下，測(cè)出該物質(zhì)從細(xì)胞中失去的速率或培養(yǎng)基獲得該物質(zhì)的速率。對(duì)于不同的外排體系，可用到不同的能量阻滯劑，如氰化物，2，4-二硝基苯酚(dnp)和羰基間氯苯腙氰化物(cccp)。對(duì)于某些外流泵，其外排活性也可利用帶有膜蛋白翻轉(zhuǎn)囊狀體來(lái)進(jìn)行研究(S.B.Levy，1992)。
另一種方法，外流泵可通過(guò)它們降低底物在細(xì)胞中的聚積的能力來(lái)鑒定。與藥物耐受性有關(guān)的外流泵能被鑒定是因?yàn)樗鼈兡苜x予對(duì)抗生素的耐藥性。細(xì)菌中與多藥耐受性有關(guān)的外流泵通常對(duì)廣泛的抗生素具有中等水平的耐藥性。特異的耐藥機(jī)制，包括特異的外流泵，對(duì)一種抗生素或一組結(jié)構(gòu)上相關(guān)的抗生素的耐受水平則高得多。對(duì)大量不相關(guān)的抗生素表現(xiàn)出低水平耐藥性的菌株可能表達(dá)一種與抗生素主動(dòng)外排有關(guān)的泵。為了鑒定外流泵是否與一給定菌株的抗生素耐藥性有關(guān)，應(yīng)使用懷疑能被外流泵外排的抗生素進(jìn)行聚積實(shí)驗(yàn)。應(yīng)研究質(zhì)膜蛋白電泳后的蛋白圖譜以鑒定某種蛋白的過(guò)量表達(dá)或凝膠電泳后蛋白譜中新帶的出現(xiàn)。對(duì)于革蘭氏陰性細(xì)菌，也應(yīng)研究其外膜蛋白。由于外流泵通常存在于大多數(shù)細(xì)菌，野生型細(xì)菌中抗生素本底水平的敏感性可能由天然存在的外流泵引起。用這樣的菌株進(jìn)行聚積實(shí)驗(yàn)可證明外流泵的存在。用含抗菌素的培養(yǎng)基可分離出過(guò)量表達(dá)外流泵的突變體。這些突變體對(duì)抗生素具有更強(qiáng)的耐藥性并將聚積較低水平的抗生素。它們也能過(guò)量表達(dá)質(zhì)膜和/或外膜中的蛋白。相似地，對(duì)抗生素高敏感的突變體也可分離出來(lái)并如上進(jìn)行研究。這些突變體將以更高的水平聚積抗生素且膜蛋白以更低水平表達(dá)。以抗生素在綠膿桿菌中的聚積為例，在四個(gè)不同的綠膿桿菌株中測(cè)量了四環(huán)素的聚積1)產(chǎn)生本底水平外流泵的野生型菌株P(guān)AO1，2)和3)菌株P(guān)AO4098E和K385來(lái)自PAO1，為兩種不同外流泵的過(guò)量生產(chǎn)者，4)菌株799/61，一個(gè)不產(chǎn)生可檢測(cè)量的任何外流泵的菌株并對(duì)抗生素高敏感。四環(huán)素聚積的本底水平與這些菌株產(chǎn)生的外流泵的量相關(guān)。菌株799/61比野生型PAO1聚積更多的四環(huán)素，而兩種過(guò)量產(chǎn)生外流泵的菌株則聚積更少量的四環(huán)素。(見(jiàn)圖6)細(xì)菌中的多藥外排系統(tǒng)本領(lǐng)域的一個(gè)重大發(fā)展是發(fā)現(xiàn)了能處理多種藥物的細(xì)菌外流泵，它是哺乳動(dòng)物細(xì)胞中mdr體系的殘跡。諸如QacA，Smr，QacE或MyrC的體系能泵出季銨化合物以及堿性染料并常被稱為多藥外排系統(tǒng)。但是，這些系統(tǒng)的底物至少具有物理相似性，均為帶正電荷的兩性分子。相反，發(fā)現(xiàn)于枯草芽孢桿菌若丹明-6G-耐受性突變體的Bmr運(yùn)輸體，不僅催化陽(yáng)離子型染料如若丹明-6G和溴乙錠，抗生素嘌呤霉素(堿性)和紡錘菌素(強(qiáng)堿性)，和有機(jī)陽(yáng)離子四苯的主動(dòng)外排，也催化氯霉素(無(wú)電荷)的主動(dòng)外排。后來(lái)也證實(shí)它泵出氟喹諾酮，它們中的大多數(shù)在中性pH下以兩性離子狀態(tài)存在。金黃色葡萄球菌中的NorA被證實(shí)為Bmr同源物并確實(shí)表現(xiàn)為泵出陽(yáng)離子性染料嘌呤霉素和氯霉素，它們是化學(xué)結(jié)構(gòu)和物理性質(zhì)均不相關(guān)的溶質(zhì)。
另一個(gè)多藥外排系統(tǒng)在大腸桿菌的抗解偶聯(lián)劑羰基間氯苯腙氰化物(cccp)的突變體中得到鑒定。這種運(yùn)輸體EmrB也泵出一些不相關(guān)的化合物如乙酸苯基汞，萘啶酮酸(弱酸性)和硫代乳霉素(無(wú)電荷)。
大腸桿菌K12的acrA突變體，被認(rèn)為由于提高了外膜通透性而產(chǎn)生藥物超敏感性，表現(xiàn)出滅活多藥外排復(fù)合體AcrAE。在野生型acrA+菌株中，吖黃素穩(wěn)定狀態(tài)的聚積非常低。因?yàn)殛?yáng)離子型染料必須在胞質(zhì)中濃縮，以應(yīng)答跨質(zhì)膜的內(nèi)部陰離子勢(shì)能，這意味著吖黃素必須非常活躍地泵出。在一acrA突變體中，穩(wěn)態(tài)聚積至少提高了5倍，表明AcrAE外排系統(tǒng)參予了這種染料的排出。這解開(kāi)了一個(gè)長(zhǎng)期存在的謎，因?yàn)楸M管進(jìn)行了許多研究，但在AcrA突變體的外膜尚未發(fā)現(xiàn)缺陷，而且已證實(shí)它們外膜的通透性至少對(duì)一種探針是正常的。AcrAE系統(tǒng)的底物范圍似乎非常廣泛，包括親水性抗生素如新生霉素，紅霉素(一種大環(huán)內(nèi)酯)，梭鏈孢酸，絲裂霉素C和四環(huán)素，以及去污劑十二烷基硫酸鈉(SDS)。
大腸桿菌染色體基因束中的一個(gè)改變marRAB，也對(duì)廣泛的抗生素產(chǎn)生明顯的抗藥性，這些抗生素包括喹諾酮類，氯霉素，四環(huán)素和β-內(nèi)酰胺。(至少對(duì)氟喹諾酮和四環(huán)素的耐藥性似乎與外排有關(guān))。但是MarA是一個(gè)影響許多過(guò)程的調(diào)控蛋白，受這個(gè)蛋白影響的泵的性質(zhì)和數(shù)量目前還不清楚。
最近，綠膿桿菌對(duì)大量抗微生物劑的固有耐藥性被揭示出是因?yàn)槠渫饽さ牡屯ㄍ感?，也因其外排系統(tǒng)。綠膿桿菌的臨床分離株，甚至在不含R質(zhì)粒時(shí)，也表現(xiàn)出對(duì)抗微生物劑具有廣泛的、不同水平的“固有”耐藥性。而且，在對(duì)不同藥劑如β-內(nèi)酰胺，氯霉素，四環(huán)素和氟喹諾酮的耐藥性水平間存在良好的相關(guān)性。因而固有的耐藥性的不同水平被認(rèn)為是由外膜通透性相應(yīng)的差異引起的。然而實(shí)驗(yàn)事實(shí)推翻了這一假說(shuō)。當(dāng)試驗(yàn)不同藥物的聚積時(shí)，發(fā)現(xiàn)甚至綠膿桿菌野生型菌株也能非常有效地泵出四環(huán)素，氯霉素和諾氟沙星，而且這種活性與該菌株固有的耐藥水平有關(guān)。
這種外排系統(tǒng)的遺傳同一性由K.Poole及其同事的研究提出。(Poole等，1993a《分子微生物學(xué)》10卷529-544頁(yè)，和Poole等，1993b，《細(xì)菌學(xué)雜志》175卷7363-7372頁(yè)。)這些參考文獻(xiàn)作為一個(gè)整體在此引入作為參考。在對(duì)綠膿桿菌Fe3+攝取的研究中，他們克隆了一個(gè)操縱子mexA-mexB-oprM，它被認(rèn)為在鐵載體綠膿菌熒光素的外排中起作用。(ORFC產(chǎn)物在上面Poole等的參考文獻(xiàn)中被鑒定為OprK，目前被鑒定為OprM(Poole等，未發(fā)表的信息)，并在此引入作為參考)，MexB具有RND家族運(yùn)輸體的典型序列。當(dāng)這個(gè)操縱子被插入突變滅活后，該綠膿桿菌株幾乎變得與大腸桿菌一樣對(duì)氯霉素和四環(huán)素敏感。這表明這個(gè)單一的外排系統(tǒng)是該菌株表現(xiàn)出普遍的藥物耐受現(xiàn)象的主要原因。
主動(dòng)外排似乎也在一些綠膿桿菌的β-內(nèi)酰胺耐藥性中起作用。綠膿桿菌產(chǎn)生一種染色體編碼的可誘導(dǎo)β-內(nèi)酰胺酶，而這個(gè)酶與外膜屏障間的協(xié)同作用解釋了它對(duì)一些表現(xiàn)為該酶的強(qiáng)誘導(dǎo)物的化合物的耐受性。但是，具有高的固有耐藥性的菌株也對(duì)并不誘導(dǎo)β-內(nèi)酰胺酶并對(duì)酶促水解非常穩(wěn)定的化合物具有的高耐受性。而且，這些菌株中β-內(nèi)酰胺作用的目標(biāo)或者β-內(nèi)酰胺酶的水平或性質(zhì)并沒(méi)有改變。這些結(jié)果表明它們的β-內(nèi)酰胺耐藥性也是由主動(dòng)外排引起的。但是，與其它疏水性試劑不同，一些β-內(nèi)酰胺不能越過(guò)質(zhì)膜屏障，它們的作用物在質(zhì)膜的周質(zhì)側(cè)。在這里重提哺乳動(dòng)物mdr蛋白明顯地阻止其底物跨脂雙層膜運(yùn)輸是有益的。對(duì)雙層不通透的β-內(nèi)酰胺的觀察結(jié)果給這個(gè)觀點(diǎn)以有力的支持。
盡管綠膿桿菌外排系統(tǒng)表現(xiàn)出來(lái)的廣泛的底物特異性有些令人吃驚。但這樣廣泛的特異性早已為人所知。例如，哺乳動(dòng)物mdr泵不僅泵出堿性化合物，如阿霉素，也泵出中性化合物，如紫杉醇和弱酸性化合物，如光輝霉素。實(shí)際上，哺乳動(dòng)物mdr泵受疏水性的頭孢菌素抑制，估計(jì)它是作為其底物類似物。外排系統(tǒng)與外膜屏障外排運(yùn)輸體位于質(zhì)膜，因此在革蘭氏陰性細(xì)菌中，可假想藥劑被泵入周質(zhì)中(見(jiàn)圖2)。如果這樣，外排作用就不可能使這些細(xì)菌在沒(méi)有其它因子下更具耐藥性，因?yàn)橥饽て琳系拇嬖谑惯@些抗微生物劑不容易離開(kāi)細(xì)胞。克服這種屏障的一個(gè)方法可能是在革蘭氏陰性細(xì)胞中MF和RND家族的許多外排運(yùn)輸體與一些輔助蛋白同時(shí)存在。這些蛋白被認(rèn)為是胞質(zhì)運(yùn)輸體和一外膜通道間的“橋”，從而藥物能直接外排到外周介質(zhì)中而不進(jìn)入周質(zhì)(圖2)，因?yàn)樗鼈兣c革蘭氏陰性細(xì)菌中的一組蛋白有關(guān)，包括HlyD，LktD，CyaD，AprE和CvaA，它們同樣作為橋并幫助直接將其底物蛋白質(zhì)外排至外部介質(zhì)中。因而輔助蛋白與外膜中的一些通道蛋白如TolC形成復(fù)合物是可能的。最近在綠膿桿菌中發(fā)現(xiàn)mexA-mexB-oprM系統(tǒng)支持了這個(gè)模型。這個(gè)假定的操縱子不僅編碼一個(gè)輔助蛋白MexA，也編碼一個(gè)外膜蛋白o(hù)prM，而且這個(gè)基因組合提示這三種蛋白形成復(fù)合物，該復(fù)合物可能形成一個(gè)對(duì)外面介質(zhì)開(kāi)放的連續(xù)通道(圖2)。事實(shí)上，OprM與外膜蛋白CyaE和PrtF表現(xiàn)出序列同源性，這些外膜蛋白可能與三成分外排復(fù)合物的形成有關(guān)，該復(fù)合物含一胞質(zhì)蛋白運(yùn)輸體，一個(gè)周質(zhì)輔助蛋白和一外膜通道，在百日咳桿菌和菊歐文氏菌中它們分別將細(xì)胞溶素和蛋白酶B和C直接外排到介質(zhì)中。而且，OprM的滅活同MexA的滅活一樣，可導(dǎo)致對(duì)許多藥劑的超敏感性。現(xiàn)在還不知道那些不含輔助蛋白的系統(tǒng)是如何有效地將藥劑外排到介質(zhì)中。但是，對(duì)那些表達(dá)這樣的外膜蛋白如OprM和綠膿桿菌過(guò)量表達(dá)的50kDa蛋白的細(xì)菌來(lái)說(shuō)，外膜為這里描述的外流泵抑制劑提供了另一個(gè)目標(biāo)物。
如已提到的，外膜的低通透性單獨(dú)不能產(chǎn)生臨床上顯著的耐藥性，產(chǎn)生這樣高水平的耐藥性需要另一種協(xié)同因素。在許多系統(tǒng)中，主動(dòng)外排系統(tǒng)似乎是這樣的因素。但這并不意味著外膜屏障不重要。由于許多藥物的胞內(nèi)濃度是內(nèi)流和外排平衡的結(jié)果，因而在如綠膿桿菌的有機(jī)體中，很可能許多藥劑透過(guò)低通透性外膜緩慢的內(nèi)流作用使得外排作用成為特別有效的耐藥機(jī)制。也就是說(shuō)，就算是具有高通透性外膜的有機(jī)體如大腸桿菌，盡管具有較有效的外排系統(tǒng)，也不能產(chǎn)生顯著水平的耐藥性，除非藥劑具有大的體積或能降低其跨過(guò)外膜的透過(guò)率的結(jié)構(gòu)。
在這個(gè)方面，大腸桿菌marRAB基因突變體產(chǎn)生更少量的OmpF孔蛋白是非常重要的，它們?cè)诖竽c桿菌的兩個(gè)非特異性孔蛋白間產(chǎn)生更大的通道，從而在大多數(shù)抗生素的滲透作用中起著決定性作用。隨著內(nèi)流作用的降低，主動(dòng)外排作用將產(chǎn)生高得多的耐藥性。革蘭氏陰性細(xì)菌中一些質(zhì)粒編碼的外排運(yùn)輸體也可能利用了類似的機(jī)制，早在1978年就報(bào)道了一個(gè)抑制OmpF孔蛋白合成的R質(zhì)粒。流感嗜血桿菌中與非酶促氯霉素耐藥性有關(guān)的基因，很可能為CmlA外排運(yùn)輸體(見(jiàn)上)的同源基因，能抑制該有機(jī)體主要孔蛋白的合成?？寺〉腃mlA基因能抑制大腸桿菌中孔蛋白的合成。具有非酶促氯霉素耐藥性的傷寒沙門(mén)氏菌的一個(gè)臨床分離株可能帶有含OmpF的轉(zhuǎn)座子。這種由一些質(zhì)粒和轉(zhuǎn)座子編碼的外排基因降低外膜通透性的能力迄今被證明只有非常窄范圍的耐藥性因子。如果這樣的活性與廣泛底物外排運(yùn)輸體結(jié)合起來(lái)，將產(chǎn)生重大的保健問(wèn)題。
常常伴隨著OmpF孔蛋白合成抑制的外排運(yùn)輸體的表達(dá)提高，可在沒(méi)有任何遺傳改變的情況下發(fā)生。因此，氯霉素和四環(huán)素提高M(jìn)arA調(diào)節(jié)蛋白的轉(zhuǎn)錄，從而可能提高一種或多種外排運(yùn)輸體的合成。有意思的是，病原菌在宿主組織中所處的氧分壓，已知能產(chǎn)生OmpF阻遏而提高對(duì)某些抗菌劑的耐藥性，這可能是外排作用提高的結(jié)果。相似地，植物組織中應(yīng)答微生物侵染而產(chǎn)生的水楊酸，已知能阻遏pmpF孔蛋白的合成從而使大腸桿菌暫時(shí)提高對(duì)氯霉素，四環(huán)素，喹諾酮類和氨芐青霉素的耐藥性。這個(gè)藥劑范圍進(jìn)一步表明一種和幾種外排系統(tǒng)的介入。
由于抗生素耐藥性的特異機(jī)制被認(rèn)為更重要，生產(chǎn)更有效的抗生素的努力通常是在抗生素分子上的特異基團(tuán)進(jìn)行修飾，使它們成為常見(jiàn)的抗生素滅活酶的惰性底物。更普遍的耐藥性機(jī)制的存在迫使人們重新評(píng)價(jià)這個(gè)策略。這些機(jī)制產(chǎn)生臨床上顯著的耐藥性見(jiàn)于重要的機(jī)會(huì)病原體綠膿桿菌的對(duì)多種抗生素的固有耐藥性確實(shí)是由于多藥外排運(yùn)輸體和有效的通透性屏障共同作用的結(jié)果，在表現(xiàn)出對(duì)羧芐青霉素耐藥性水平提高的大多數(shù)不列顛群島臨床分離株中，外排運(yùn)輸體表達(dá)的提高是其耐藥性最可能的原因。對(duì)制藥工業(yè)來(lái)說(shuō)，生產(chǎn)能克服這類機(jī)制的化合物將是一個(gè)重大挑戰(zhàn)，因?yàn)橐恍┒嗨幫馀畔到y(tǒng)似乎能泵出幾乎所有的兩親性化合物。顯然，需要更多的關(guān)于這些運(yùn)輸體的底物結(jié)合過(guò)程的信息。另一個(gè)可行的方法將是提高藥物自發(fā)的內(nèi)流作用，例如，通過(guò)賦予藥物足夠的親脂性從而外排作用可被快速的內(nèi)流作用抵消。確實(shí)，四環(huán)素和氟喹諾酮的更親脂的衍生物對(duì)能泵出這些藥物的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌的耐藥性菌株活性更高。但在革蘭氏陰性細(xì)菌中，更親脂的藥物將更慢地通過(guò)孔蛋白通道，從而提高親脂性不可能提高藥物的效力。鐵載體相關(guān)的綠膿桿菌外流泵如上所述，多藥外流泵存在于綠膿桿菌中。這種細(xì)菌是對(duì)許多抗菌劑具有固有耐藥性的一種臨床上重要的病原體。而且，通常對(duì)該有機(jī)體有潛在抗菌活性的藥物(如卡巴培南和氟喹諾酮)的耐藥性的發(fā)展所帶來(lái)的問(wèn)題出現(xiàn)得越來(lái)越頻繁。另外，對(duì)化學(xué)上不相關(guān)的抗生素的交叉耐藥性可能與氟喹諾酮耐藥性相關(guān)聯(lián)。具有交叉耐藥性的氟喹諾酮耐藥性菌株的體外研究表明耐藥性可歸因于外膜通透性的改變導(dǎo)致的藥物聚積的降低。在有些例子中，這個(gè)結(jié)論是在這些突變體新外膜蛋白的鑒定基礎(chǔ)上產(chǎn)生的。
在綠膿桿菌K385菌株中，50-KDa外膜蛋白的產(chǎn)生伴隨著對(duì)2，2′-二吡啶及許多抗微生物劑敏感性的降低。(K385菌株是能夠在含2，2′-二吡啶(0.5mM)、不含鐵的基本培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的綠膿桿菌鐵載體缺陷的突變株)(Poole等，1993a)。前述的諾氟哌酸耐藥性綠膿桿菌nfxB和nfxC菌株，隨著54-kDa和50-kDa外膜蛋白的產(chǎn)生，也相應(yīng)表現(xiàn)出對(duì)許多抗微生物劑的敏感性降低。但與nfxC突變株不同，K385和nfxB突變株并不表現(xiàn)出OprD水平的降低。對(duì)非喹諾酮抗生素表現(xiàn)出交叉耐藥性的綠膿桿菌環(huán)丙氟哌酸耐藥性突變體也表達(dá)出一種新的54kDa外膜蛋白。最后，在用美羅匹寧或洛美沙星(lomefloxacin)或氧氟沙星和頭孢磺啶合用篩選出的綠膿桿菌多抗生素耐受性突變株中，一個(gè)約49kDa的外膜蛋白(OprM)得到鑒定。盡管上述的突變株在耐藥性的表型上有一些細(xì)微差別，但在所有例子中鑒定的外膜蛋白可能是相同的。如果是這樣，很可能在產(chǎn)生nfxB、nfxC、OprM并具有環(huán)丙氟哌酸耐受性的突變株中導(dǎo)致耐藥性的藥物聚積降低不是由于最初認(rèn)為的外膜通透性的改變，而是由于抗生素的外排作用，只要在OprM(即ORFC產(chǎn)物)和一些細(xì)菌外膜外流泵蛋白間具有同源性。令人感興趣的是，大腸桿菌中喹諾酮耐藥性和多抗生素耐藥性也部分歸因于外排機(jī)制。
除OprM外，ORFA-ORFB-oprM(ORFC)操縱子還編碼40和108kDa、估計(jì)定位于質(zhì)膜上的兩種蛋白。鑒于ORFAB產(chǎn)物和質(zhì)膜外流泵蛋白間的同源性，似乎ORFAB在抗生素耐受性和抗微生物劑跨質(zhì)膜外排作用中起作用。由于這個(gè)原因，ORFAB特指mexAB(多藥外排泵)。
ORFABC(mexA-mexB-oprM)操縱子受鐵離子調(diào)控，并且，OprM確實(shí)在一定的鐵離子限制條件下是可誘導(dǎo)的。當(dāng)生長(zhǎng)在鐵離子缺乏的BM2基本培養(yǎng)基中時(shí)觀察不到蛋白質(zhì)的誘導(dǎo)作用可能是因?yàn)锽M2的磷酸鹽成分中顯著的鐵離子污染，BM2培養(yǎng)基中鐵離子的缺乏不如其它基本培養(yǎng)基。這表明相當(dāng)?shù)腛prM(因此也包括ORFABC[mexA-mexB-oprM])表達(dá)需要更嚴(yán)格的鐵離子限制。例如，當(dāng)生長(zhǎng)在鐵離子缺乏的以HEPES緩沖的基本培養(yǎng)基中時(shí)，OprM容易被誘導(dǎo)，這種培養(yǎng)基被鐵離子污染的程度更小。當(dāng)然，與低鐵離子含量相對(duì)應(yīng)，在這種培養(yǎng)基中鐵載體的產(chǎn)量比在鐵離子缺乏的BM2基本培養(yǎng)基中高三至四倍。同樣地，在預(yù)期能減少可利用的鐵離子的鐵離子螯合劑2，2′-吡啶存在的條件下生長(zhǎng)將使OprM被誘導(dǎo)。觀察到的OprM受Zn2+誘導(dǎo)的現(xiàn)象與這種蛋白的鐵調(diào)控一致，因?yàn)橐阎猌n2+能增強(qiáng)綠膿桿菌中鐵離子調(diào)節(jié)成分包括鐵載體及其受體的表達(dá)。Zn2+對(duì)鐵載體產(chǎn)生相似的影響也發(fā)現(xiàn)于熒光假單胞菌和維涅蘭德固氮菌。在后面的例子中，Zn2+增強(qiáng)鐵載體的產(chǎn)量是因?yàn)閆n2+抑制了三價(jià)鐵還原酶活性而導(dǎo)致了胞質(zhì)中二價(jià)鐵離子的減少。
ORFABC(mexA-mexB-oprM)除了受鐵離子調(diào)控外，這個(gè)操縱子也與綠膿菌熒光素成分的產(chǎn)生與攝取共同受到調(diào)控，這表明它在綠膿菌熒光素的分泌中起作用。觀察到的ORFABC(mexA-mexB-oprM)產(chǎn)物與許多細(xì)菌外排蛋白的同源性與這個(gè)結(jié)論明顯一致。而且，盡管作為ORFABC(mexA-mexB-oprM)外排系統(tǒng)的底物的抗生素在結(jié)構(gòu)上差別很大，但它們有一些共同特征(一個(gè)芳環(huán))，而且大多數(shù)都具有結(jié)合陽(yáng)離子包括鐵離子的能力。在這個(gè)方面，它們類似于綠膿菌熒光素中含幾茶酚的發(fā)色團(tuán)。這表明ORFABC(mexA-mexB-oprM)依賴的藥物耐受性是某種抗微生物劑與綠膿菌熒光素相似的結(jié)果，而綠膿菌熒光素可能是ORFABC(mexA-mexB-oprM)外排系統(tǒng)的真正底物。顯然，ORFABC(mexA-mexB-oprM)產(chǎn)物具有非常廣泛的底物特異性，可能不僅綠膿菌熒光素，而且其代謝物，均為該外排系統(tǒng)的天然底物。因此，ORFABC(mexA-mexB-oprM)可能不僅在開(kāi)始的綠膿菌熒光素分泌，而且在再利用的綠膿菌熒光素及其該過(guò)程的代謝物的分泌中也起著作用。
鐵離子運(yùn)輸成分廣泛的底物特異性的優(yōu)越性在大腸桿菌鐵離子調(diào)節(jié)外膜蛋白Fin和Cir的研究中也有發(fā)現(xiàn)，這兩種蛋白據(jù)報(bào)道與嗜鐵鐵腸桿菌素水解產(chǎn)物的攝取有關(guān)。這些蛋白也可促進(jìn)含鐵螯合基團(tuán)的抗生素，包括兒茶酚取代的β-內(nèi)酰胺的攝取。
ORFAB(mexABC)產(chǎn)物與蛋白AcrA和AcrB間引人注目的高度同源性是相同功能的強(qiáng)烈暗示。盡管AcrA和AcrB被認(rèn)為是與吖啶黃素和其它抗微生物劑耐受性有關(guān)的外排蛋白，但吖啶黃素不可能是這些蛋白正常的細(xì)胞底物。但是，注意到象綠膿菌熒光素一樣，大腸桿菌鐵載體腸桿菌素也是一個(gè)含兒茶酚的分子是非常有趣的。因此，AcrA和AcrB可能在腸桿菌素和/或它的代謝物的分泌中起作用。ORFAB(mexAB)產(chǎn)物和EnvCD(與AcrAB也具有高度同源性)間已證實(shí)的同源性表明大腸桿菌可能利用多系統(tǒng)外排腸桿菌素。β-內(nèi)酰胺相關(guān)的綠膿桿菌外流泵除了上面討論的mexAB-oprM泵外，另一個(gè)綠膿桿菌外流泵也與β-內(nèi)酰胺耐藥性有關(guān)。由于β-內(nèi)酰胺的作用位點(diǎn)位于質(zhì)膜的外表面，因而β-內(nèi)酰胺不用進(jìn)入胞質(zhì)行使其功能，因此主動(dòng)外排作為β-內(nèi)酰胺耐藥性的一個(gè)重要因子，是令人吃驚的。另外，許多β-內(nèi)酰胺上羧基的存在意味著它們不能迅速地?cái)U(kuò)散透過(guò)質(zhì)膜。但是，耐藥性被證實(shí)并不歸因于外膜的低通透性或β-內(nèi)酰胺酶水平的改變(Li等，1994年《抗微生物劑化學(xué)療法》(AntimicrobAgents Chemother)38卷1742-1752頁(yè))。
實(shí)驗(yàn)表明在高耐藥性的綠膿桿菌中，兩種質(zhì)膜蛋白與一種外膜蛋白高表達(dá)。這些蛋白的表達(dá)水平明顯地高于沒(méi)有高耐藥性的相關(guān)菌株。另外，超敏感性突變株K799/61似乎缺乏主動(dòng)外排系統(tǒng)，因?yàn)樗旧喜荒鼙贸鏊沫h(huán)素和氯霉素，這暗示在高耐藥性菌株中三種過(guò)量產(chǎn)生的蛋白是綠膿桿菌外流泵系統(tǒng)的成分。這項(xiàng)工作常用的材料與方法見(jiàn)Li等1994年《抗微生物劑化學(xué)療法》(Antimicrob.Agents Chemother)38卷1732-1741頁(yè)和Li等1994年《抗微生物劑化學(xué)療法》38卷1742-1752頁(yè)。全部這些文獻(xiàn)在此引入作為參考。
這些蛋白質(zhì)的氨基酸序列很容易用本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的方法確定。例如，每種蛋白都可從高水平產(chǎn)生這種外流泵的已鑒定菌株中分離純化。每種純化蛋白質(zhì)的氨基酸序列隨后可用標(biāo)準(zhǔn)的氨基酸測(cè)序法確定。編碼每種蛋白的核酸序列同樣可用許多不同方法中的任何一種方便地確定。一種方法是，一個(gè)蛋白質(zhì)一部分的氨基酸序列可轉(zhuǎn)換成一套簡(jiǎn)并的寡聚核苷酸探針(優(yōu)選使用低編碼簡(jiǎn)并性的序列)，它們中的每一種約八至二十個(gè)核苷酸。這樣一套簡(jiǎn)并的探針隨之用于探測(cè)該多肽全長(zhǎng)的編碼序列。一旦探測(cè)到，該編碼序列可用通常的重組技術(shù)操作并測(cè)序，以證實(shí)它為給定多肽的基因。另一種方法是，外流泵缺陷菌株中對(duì)應(yīng)于丟失或缺陷的外流成分的編碼序列可被鑒定并分離及測(cè)序。盡管舉例說(shuō)明了這些方法，但其它的方法也可有效地使用，而且在特定的情況下可能是優(yōu)選的。外流泵必需基因外流泵對(duì)綠膿桿菌細(xì)胞是重要的。已有很好的間接證據(jù)表明外流泵胞質(zhì)成分的抑制對(duì)細(xì)胞是致死的。產(chǎn)生無(wú)效mexB突變株的唯一方法是利用綠膿菌熒光素產(chǎn)生缺陷的菌株或不能在鐵離子缺乏的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)并且鐵離子代謝損傷的菌株。(Poole等，1993年《分子微生物學(xué)》(Mol.Microbiol.)10卷529-544頁(yè))如果mexB突變株事實(shí)上是致死的，那么外流泵胞質(zhì)成分的抑制劑可能是殺菌的。外流泵的抑制本發(fā)明表明致病菌中的外流泵，尤其是多底物外流泵的存在，可用在篩選化合物以發(fā)現(xiàn)外流泵抑制劑的方法中。如該術(shù)語(yǔ)所示的，也如概述中所述的，這樣的抑制劑能降低外流泵從胞質(zhì)中外排抗菌劑的能力。本發(fā)明表明這樣的篩選方法可為具有多藥外流泵的細(xì)菌設(shè)計(jì)，尤其是綠膿桿菌外流泵，如mexA/mexB/oprM和菌株K385和PAO4098E中過(guò)量表達(dá)的外流泵。
一種方法是以外流泵抑制劑能減緩抗菌劑從細(xì)菌細(xì)胞中的外排為基礎(chǔ)。當(dāng)含外流泵的細(xì)菌在能被該外流泵外排的抗菌劑存在的情況下生長(zhǎng)但該抗菌劑濃度很低而不能明顯地抑制細(xì)胞生長(zhǎng)時(shí)，外流泵使該藥劑在細(xì)胞內(nèi)保持非常低的濃度。但是，當(dāng)某種外流泵抑制劑也存在并且其濃度足夠高能明顯地抑制該外流泵的活性時(shí)，它能提高抗菌劑的胞內(nèi)濃度?？咕鷦舛鹊奶岣邔⒛芤种萍?xì)胞生長(zhǎng)?？咕鷦┮种萍?xì)胞生長(zhǎng)的能力可用兩個(gè)相關(guān)的細(xì)菌株證實(shí)，其中一種高水平產(chǎn)生外流泵，而另一種不產(chǎn)生。因此，所用抗菌劑的濃度必須足夠高以抑制不能高水平產(chǎn)生外流泵的菌株的生長(zhǎng)。但也必須足夠低以使高水平產(chǎn)生外流泵的菌株的生長(zhǎng)不能被明顯抑制。因而抑制高水平外流泵菌株生長(zhǎng)的化合物被鑒定為假定的外流泵抑制劑。緣于外流泵抑制的生長(zhǎng)抑制可通過(guò)比較同一菌株在假定的外流泵抑制劑存在、但沒(méi)有抗菌劑的條件下的生長(zhǎng)情況進(jìn)一步說(shuō)明。如果在假定的抑制劑和抗菌劑同時(shí)存在下的生長(zhǎng)情況明顯不如只有假定的抑制劑存在時(shí)的生長(zhǎng)情況，那么生長(zhǎng)抑制很可能是由于外流泵抑制，至少占大部分。在這個(gè)篩選方法的某些實(shí)施方案中，使用過(guò)量產(chǎn)生外流泵的菌株是非常有用的。那么抗菌劑的亞抑制濃度應(yīng)該足夠高以抑制該細(xì)菌野生型菌株的生長(zhǎng)。
另一個(gè)篩選廣泛底物外流泵如綠膿桿菌外流泵的抑制劑的方法，是基于報(bào)道基因的使用，報(bào)道基因的表達(dá)受一調(diào)控序列的控制，而這個(gè)調(diào)控序列可被濃度足夠高的某種化合物如抗菌劑(或一無(wú)活性的類似物)誘導(dǎo)。在這個(gè)方法中帶有可誘導(dǎo)的調(diào)控序列的報(bào)道基因以單拷貝形式插入細(xì)菌染色體的非必需基因中。因此，當(dāng)帶有報(bào)道基因結(jié)構(gòu)插入的細(xì)菌生長(zhǎng)在外流泵抑制劑化合物和某種抗菌劑(在另外一些因子缺乏時(shí)其濃度不足以明顯抑制細(xì)菌生長(zhǎng))存在的條件下時(shí)，該抗菌劑的胞內(nèi)濃度將提高。該抗菌劑胞內(nèi)濃度的升高是因?yàn)橥馀判实慕档?，如上面的方法所述。但是，在抗菌劑達(dá)到生長(zhǎng)抑制的胞內(nèi)濃度前，升高的濃度將誘導(dǎo)報(bào)道基因的表達(dá)。表達(dá)的發(fā)現(xiàn)表明外流泵的功能被抑制，即正被篩選的化合物為一外流泵抑制劑。
這個(gè)方法的一個(gè)設(shè)計(jì)用到了眾所周知的調(diào)控機(jī)制，其中報(bào)道基因的表達(dá)受四環(huán)素的誘導(dǎo)。在這個(gè)機(jī)制中，四環(huán)素緊緊地與tetR阻遏物分子結(jié)合，阻止了tetR與tetA操縱位點(diǎn)的結(jié)合。沒(méi)有tetR與tetA操縱位點(diǎn)的結(jié)合，該操縱基因下游的報(bào)道基因編碼序列將被轉(zhuǎn)錄并隨后翻譯出可檢測(cè)的產(chǎn)物。(Kirsch等，1991年《抗生素雜志》(J.Antibiotics)44卷210-217頁(yè))。如上所述，一個(gè)含tetR基因，tetA調(diào)控序列，和報(bào)道基因編碼序列的結(jié)構(gòu)插入到綠膿桿菌的非必需基因中。這些重組的細(xì)胞隨后可如上所述用于篩選具有外流泵抑制劑活性的化合物。
上述方法與Rothstein等《抗菌劑化學(xué)療法》(Antimicrob.AgentsChemother.)37卷1624-1629頁(yè)所述的工作大不相同。該報(bào)道描述了一種用質(zhì)粒上的tetR基因連同鑒定新四環(huán)素的技術(shù)篩選大腸桿菌四環(huán)素特異性外流泵抑制劑的方法。
第三種篩選方法用被細(xì)胞中外流泵運(yùn)輸?shù)幕衔?可檢測(cè)的化合物)的光譜檢測(cè)作為外流泵抑制的報(bào)道。在這個(gè)方法中，具有這種外流泵的細(xì)胞與可檢測(cè)的化合物接觸。在外流泵抑制劑不存在時(shí)，可檢測(cè)化合物的胞內(nèi)濃度與抑制外流泵外排作用的化合物存在時(shí)該化合物的胞內(nèi)濃度相比，將維持在低濃度。因此，如果在試驗(yàn)化合物存在時(shí)檢測(cè)到可檢測(cè)化合物胞內(nèi)濃度的升高。這表明該試驗(yàn)化合物抑制了泵的外排活性，從而可能是外流泵抑制劑?；蛘呖纱_定可檢測(cè)化合物的胞外濃度(懸浮介質(zhì)中的濃度)。因而可計(jì)算出胞內(nèi)濃度或直接利用胞外濃度。與外流泵抑制劑不存在時(shí)相比，抑制劑的存在使得更少的染料或熒光物質(zhì)能在細(xì)胞中聚積，從而染料或熒光物質(zhì)的胞外濃度將更低。
第四種篩選方法用陽(yáng)性生長(zhǎng)作為外流泵抑制的報(bào)道。這種篩選方法以外流泵刺激的抗生素滅活物的誘導(dǎo)為基礎(chǔ)。因此微生物可在抑制濃度的抗生素存在下生長(zhǎng)。該抗生素的滅活物受外流泵外排的化合物的胞內(nèi)濃度升高誘導(dǎo)。如果外排該化合物的外流泵受到抑制(如被試驗(yàn)化合物抑制)，滅活物將表達(dá)(或激活)，降低以前產(chǎn)生抑制的抗生素的胞內(nèi)濃度，這將導(dǎo)致可檢測(cè)的生長(zhǎng)。
這種篩選方法的一個(gè)實(shí)施方案使用同上面第二個(gè)篩選方法中一樣的四環(huán)素敏感的tetA啟動(dòng)子。但是，該啟動(dòng)子連接著一個(gè)只有當(dāng)tetA啟動(dòng)子被誘導(dǎo)后方可生長(zhǎng)的基因。這種基因的一個(gè)實(shí)例是blaS基因，它編碼嗜麥芽糖寡養(yǎng)單胞菌(嗜麥芽黃單胞菌)的L-1β-內(nèi)酰胺酶。這個(gè)基因的產(chǎn)物可提供本篩選方法所需的陽(yáng)性選擇。這個(gè)融合基因?qū)⒅糜谌旧w中以獲得遺傳穩(wěn)定性。在綠膿桿菌中L-1β-內(nèi)酰胺酶被誘導(dǎo)后具有全部的功能，而卡巴培南則不能被綠膿桿菌的外流泵分泌。假單胞菌染色體上的β-內(nèi)酰胺酶不能水解卡巴培南(J.Trias，1989年《抗微生物劑化學(xué)療法》(Antimicrob.Agents Chemother.)33卷1201-1206頁(yè))。
篩選株將在低濃度的四環(huán)素，試驗(yàn)化合物和卡巴培南存在下生長(zhǎng)。如果外流泵被抑制，四環(huán)素的胞內(nèi)濃度將升高，從而誘導(dǎo)tetA啟動(dòng)子，隨即是blaS的表達(dá)、L-1β-內(nèi)酰胺酶將水解卡巴培南，從而細(xì)胞能夠生長(zhǎng)。如果泵未被抑制，四環(huán)素的胞內(nèi)濃度將不會(huì)升高，細(xì)胞也就不能合成L-1β-內(nèi)酰胺酶，也就不能在卡巴培南存在下生長(zhǎng)。
這類篩選方法也能簡(jiǎn)單地通過(guò)改變培養(yǎng)基中卡巴培南的濃度提供滴定必需量的功能，提供一種尋找具有不同抑制能力的化合物的高度靈活的系統(tǒng)。阻滯外流泵不能改變亞胺培南的耐受性，因?yàn)檫@種底物不能被外流泵識(shí)別，如果泵被抑制，它也不會(huì)有所變化。泵的作用—調(diào)控機(jī)制外流泵抑制劑可通過(guò)抑制泵的正常功能或泵的正常表達(dá)或兩者都被抑制而抑制外流泵。為了研究泵的調(diào)控，膜上泵的存在將被監(jiān)測(cè)。例如可用標(biāo)準(zhǔn)的電泳技術(shù)對(duì)其進(jìn)行監(jiān)測(cè)，利用常用的蛋白染色技術(shù)(考馬斯藍(lán)或銀染)或利用抗外流泵成分的抗體進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)的Western分析，可觀察到泵成分對(duì)應(yīng)的帶。抑制劑作用的機(jī)制將在轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)一步研究，例如通過(guò)利用從編碼外流泵成分的基因序列中獲得的探針與基因中的已知序列進(jìn)行Northern分析，或通過(guò)將報(bào)道基因處于外流泵啟動(dòng)子的控制下并檢測(cè)報(bào)道基因編碼的蛋白質(zhì)的活性。篩選源化合物及亞結(jié)構(gòu)研究方法的說(shuō)明本發(fā)明的方法適用于篩選多種可能具有外流泵抑制劑活性的源化合物。用不同庫(kù)的化合物進(jìn)行初步篩選，但本方法也適用于其它的化合物庫(kù)。這樣的庫(kù)可以是天然產(chǎn)物庫(kù)，組合庫(kù)，或其它小分子庫(kù)。另外，來(lái)自商品化源的化合物也可被試驗(yàn)。這種試驗(yàn)尤其適用于已鑒定的外流泵抑制劑的可商購(gòu)的類似物。
通過(guò)首先限定待篩選化合物為那些具有優(yōu)選結(jié)構(gòu)特征的化合物，商業(yè)來(lái)源的具有已知結(jié)構(gòu)的化合物可有效地用于外流泵活性篩選。例如，首先嘗試建立一個(gè)用于篩選的亞庫(kù)，它將增加能抑制外流泵的結(jié)構(gòu)。這種嘗試的策略包括獲得含有哺乳動(dòng)物外流泵抑制劑中常見(jiàn)結(jié)構(gòu)特點(diǎn)的可商購(gòu)的化合物。為了加速這種嘗試，ISIS計(jì)算機(jī)程序(MDLInfbrmation Systems，Inc.)被用于可商購(gòu)的化學(xué)試劑目錄數(shù)據(jù)庫(kù)(MDLInformation Systems，Inc.)的二維亞結(jié)構(gòu)研究。這個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)含有近175,000種可商購(gòu)的化合物的結(jié)構(gòu)和訂貨信息。其它已公開(kāi)、可商購(gòu)的化學(xué)品數(shù)據(jù)庫(kù)也可使用。成功化合物的概述用本發(fā)明中的方法鑒定為外流泵抑制劑的實(shí)例化合物是L-苯丙氨酰-L-精氨酰-β-萘酰胺。這個(gè)化合物的一些體外特征在下面的實(shí)施例7中描述。
這個(gè)化合物可被認(rèn)為具有下面結(jié)構(gòu)1-4所代表的通用結(jié)構(gòu)
其中R＝烷基(C1-C4)，氟烷基(C1-C4)，過(guò)氟烷基(C1-C4)，烷氧基(C1-C4)，烷硫基(C1-C4)，鹵素(Br，Cl，F(xiàn)或I)，芳基(C6-C10)，單取代芳基(C6-C10)，[任選地用烷基(C1-C4)，烷氧基(C1-C4)，烷硫基(C1-C4)，鹵素(Br，Cl，F(xiàn)或I)，氨基，單取代氨基[任選地用烷基(C1-C4)取代]，雙取代氨基[任選地用烷基(C1-C4)的組合取代]，或羥基取代]，雙取代芳基(C6-C10)，[烷基(C1-C4)，烷氧基(C1-C4)，烷硫基(C1-C4)，鹵素(Br，Cl，F(xiàn)或I)和氨基的任意組合]，2-(或3-)-噻吩基，2-(或3-)-呋喃基，或2-(3-或4-)-吡啶基。W＝H，NH2，單取代氨基[任選地用烷基(C1-C4)取代]，雙取代氨基[任選地用烷基(C1-C4)的任意組合取代]，氮雜環(huán)[如N-嗎啉基，N-哌嗪基，N-吡咯烷基，N-咪唑基，N-吡咯基，N-吡唑基，N-三唑基或N-四唑基]，鹵素(Br，Cl，F(xiàn)，I)，羥基，烷氧基(C1-C4)，烷硫基(C1-C4)。R1＝(CH2)nNRbRc，(CH2)nNHC＝(NRa)NRbRc，(CH2)nSNHC＝(NRa)NRbRc，(CH2)nC＝(NRa)NRbRc，(CH2)nN＝CNRbRc，(n＝2-4)，Ra(Rb或Rc)＝H，烷基(C1-C4)，芳基(C6)，取代芳基，苯基，取代苯基[任選地用烷基(C1-C4)，烷氧基(C1-C4)，烷硫基(C1-C4)，鹵素(Br，Cl，F(xiàn)或I)，或氨基取代]，或者Ra+Rb＝(CH2)2-3或-CH＝CH-，X＝芳基(C6-C10)，-(CH2)0-2芳基(C6-C10)，取代芳基(C6-C10)[任選地用烷基(C1-C4)，烷氧基(C1-C4)，烷硫基(C1-C4)，鹵素(Br，Cl，F(xiàn)或I)，或氨基取代]，取代-(CH2)0-2芳基(C6-C10)[用烷基(C1-C4)，烷氧基(C1-C4)，烷硫基(C1-C4)，鹵素(Br，Cl，F(xiàn)，I)或氨基在芳基部位取代]，2-(或3-)-噻吩基，2-(或3-)-呋喃基，2-(3-或4-)-吡啶基，苯并呋喃基(在苯并呋喃環(huán)的任何位置)，苯并噻吩基(在苯并噻吩環(huán)的任何位置)。其中存在不對(duì)稱中心，其絕對(duì)立體化學(xué)性質(zhì)可能是R或S構(gòu)型，或可能是外消旋混合體，都包含在結(jié)構(gòu)通式中。
盡管L-苯丙氨酰-L-精氨酰-β-萘酰胺是一外流泵抑制劑，但仍需要找到具有增強(qiáng)的生理學(xué)外形和外排抑制活性的相關(guān)化合物。通常，鑒定具有更好的醫(yī)藥特性的相關(guān)化合物的一般方法是準(zhǔn)備或獲取許多起始化合物的類似物。這些化合物間存在著細(xì)微的結(jié)構(gòu)差異。這些類似物隨后被試驗(yàn)以確定它們是否保留了活性。鑒定以下因素，如對(duì)降解的耐受性，血清結(jié)合，總毒性及溶解性。根據(jù)這些分析的結(jié)果，可確定一個(gè)初步的結(jié)構(gòu)活性關(guān)系(SAR)，反映了特異的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)或取代基與活性水平及其它一些與使用意圖(例如作為治療化合物)相關(guān)的因子之間的關(guān)系。這一信息隨后可用于指導(dǎo)類似物直接進(jìn)一步的制備和試驗(yàn)，以找到具有改善的綜合特點(diǎn)的化合物。對(duì)于L-苯丙氨酰-L-精氨酰-β-萘酰胺，參照上面的通式，制備類似物的一個(gè)合理的初步方法是制備一系列W不同的類似物以找出在血清中更穩(wěn)定的化合物。因此，如上所示，這樣一套類似物將進(jìn)行活性篩選和改良的醫(yī)藥特性的分析。藥物組合物和給藥方式為外流泵抑制劑的特定化合物可通過(guò)其本身，或通過(guò)與抗菌劑合用，或與合適的載體或賦形劑混合成藥物組合物形式給予患者。外流泵抑制劑與抗菌劑合用至少有兩種不同的方式。一種是，一定量的外流泵抑制劑與一定量的抗菌劑混合成混合物，如溶液或粉狀混合物。在這樣的混合物中，抑制劑與抗菌劑的數(shù)量比例可以變化以適合具體的合用和預(yù)期的治療。在第二種合用方式中，抑制劑與抗菌劑共價(jià)結(jié)合，而這種結(jié)合的分子在細(xì)胞中可被斷裂開(kāi)。但是，術(shù)語(yǔ)“合用”也可指其它的可能性，包括抑制劑與另一種抗菌劑的順次給藥。另外，外流泵抑制劑和/或另一種抗菌劑可以藥前體的形式給藥，即該化合物以在細(xì)胞中經(jīng)修飾后才能形成功能形式的形式給予患者。在治療興趣(interest)紊亂的患者時(shí)，可以給予這樣的具有療效量的藥劑，療效劑量指這種用量的化合物將導(dǎo)致癥狀的改善或患者生存期的延長(zhǎng)，并可包括微生物感染的消除。
這樣的化合物的毒性和療效可在細(xì)胞培養(yǎng)或?qū)嶒?yàn)動(dòng)物中用標(biāo)準(zhǔn)的藥物學(xué)方法確定，例如，確定LD50(50％群體致死劑量)和ED50(50％群體療效劑量)。毒性和療效間的劑量比為治療指數(shù)，并可表示為L(zhǎng)D50/ED50的比率形式。具有大的治療指數(shù)的化合物是優(yōu)選的。從這些細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物研究中獲得的數(shù)據(jù)可用于配制用于人的劑量范圍。優(yōu)選這類化合物的劑量處于ED50很小或無(wú)毒性的循環(huán)濃度范圍內(nèi)。依據(jù)所用藥劑形式和所用給藥方式，劑量可在此范圍內(nèi)變化。優(yōu)選外流泵抑制劑治療的血清濃度應(yīng)在0.1-100μg/ml范圍內(nèi)。
對(duì)于用于本發(fā)明的方法中的任意化合物，其療效劑量可從細(xì)胞培養(yǎng)試驗(yàn)中初步估計(jì)。例如，在動(dòng)物模型中可確定某種劑量以獲得循環(huán)的血漿濃度范圍，該范圍內(nèi)的IC50由細(xì)胞培養(yǎng)試驗(yàn)確定。這樣的信息可用于進(jìn)一步精確確定在人中的有效劑量。血漿中的藥物水平可以測(cè)量，例如用HPLC方法測(cè)量。
在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，藥物組合物中的外流泵抑制劑具有前述的結(jié)構(gòu)通式所示的結(jié)構(gòu)。
恰當(dāng)?shù)闹苿?，給藥方式和劑量將由具體的醫(yī)生視患者的情況作出選擇。(見(jiàn)Fingl等《治療的藥學(xué)基礎(chǔ)》(THE PHARMACOLOGICAL BASISOF THERAPEUTICS)1975年，第一章第一頁(yè))。應(yīng)當(dāng)注意主治醫(yī)師應(yīng)知道由于毒性或組織損傷而該如何及何時(shí)終止，中斷或調(diào)整給藥。相反，主治醫(yī)師也應(yīng)知道當(dāng)臨床反應(yīng)不夠時(shí)應(yīng)將治療量提到更高的水平(防止毒性)。例如條件的嚴(yán)格性可部分地通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)的預(yù)后評(píng)價(jià)方法進(jìn)行估價(jià)。而且，劑量和可能的給藥頻率將隨患者的年齡，體重和對(duì)藥物的反應(yīng)的不同而變化。與上面類似的程序也可用于獸醫(yī)學(xué)。
依據(jù)所治療的特異感染，可配制這樣的藥劑并系統(tǒng)地或局部地給藥。配藥和給藥方法可見(jiàn)于《雷明頓制藥科學(xué)》(Remington’sPharmaceutical Sciences)，第18版，Mack Publishing Co.Easton.PA(1990年)。合適的給藥方式包括口腔，直腸，經(jīng)皮，陰道，經(jīng)粘膜，或腸道給藥；非腸道給藥，包括肌肉，皮下，髓內(nèi)注射，以及鞘內(nèi)，直接心室內(nèi)，靜脈內(nèi)，腹膜內(nèi)，鼻內(nèi)，或眼內(nèi)注射，僅例舉一部分。
為了注射，本發(fā)明的藥劑應(yīng)配制成水溶液，優(yōu)選生理上相容的緩沖液如Hank’s溶液，Ringer’s溶液，或生理鹽緩沖液。對(duì)于經(jīng)粘膜的給藥，在制劑中使用了適合于待滲透屏障的滲透劑。這樣的滲透劑在本領(lǐng)域中是熟知的。
用藥用載體將本發(fā)明中公開(kāi)的用于實(shí)現(xiàn)發(fā)明的化合物配制成適合全身給藥的藥劑，也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。選擇正確的載體和合適的制造工藝，本發(fā)明的組合物，尤其是配制成溶液的組合物，可經(jīng)非腸道給藥，如通過(guò)靜脈內(nèi)注射。這些化合物可用本領(lǐng)域熟知的藥用載體方便地配制成適于口服的藥劑。這樣的載體能使本發(fā)明的化合物配制成能被所治療的患者口服吸收的藥片，藥丸，膠囊，液體，膠，糖漿，淤漿，懸液等。
本發(fā)明中適用的藥物組合物包括那些含有有效量的活性成分能達(dá)到所需目的的組合物。有效量的確定是本領(lǐng)域的技術(shù)人員容易辦到的，尤其是在參看了這里提供的詳細(xì)的公開(kāi)內(nèi)容后。除了活性成分外，這些藥物組合物可含有合適的藥用載體，包括賦形劑和輔助劑，它們能有利于將活性化合物加工為藥用制劑。為口服給藥配制的制劑可以為藥片、糖衣丸，膠囊或溶液的形式。本發(fā)明中的藥物組合物可用已知的方式制造，例如利用傳統(tǒng)的混合，溶解，粒化，糖衣化，懸浮(levitating)，乳化，膠囊包裹，夾裹(entrapping)或凍干等方法。
用于非腸道給藥的藥物制劑包括水溶形式的活性化合物的水溶液。另外，活性化合物的懸浮液也可制成合適的油狀注射懸浮液。合適的親脂性溶劑或溶媒包括脂肪油如芝麻油，或合成的脂肪酸酯如油酸乙酯或甘油三脂，或脂質(zhì)體。水溶性的注射懸浮液可含有提高懸浮液粘性的物質(zhì)，例如羧甲基纖維素鈉，山梨醇，或右旋糖苷。懸浮液中也任選地含有合適的穩(wěn)定劑和助溶劑使化合物可形成高度濃縮的制劑。
用于口服的藥用制劑可通過(guò)將活性化合物與固體賦形劑結(jié)合，任選地將混合物搗碎，加工顆?；旌衔铮⒓尤牒线m的輔助劑后獲得，根據(jù)需要，可制成藥片或糖衣核。合適的賦形劑尤為填充劑，如糖，包括乳糖，蔗糖，甘露醇，或山梨醇；纖維素制品如玉米淀粉，小麥淀粉，水稻淀粉，馬鈐薯淀粉，明膠，西黃蓍膠，甲基纖維素，羥脯氨酰甲基纖維素，羧甲基纖維素鈉，和/或聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。根據(jù)需要，可加入分解劑，如交聯(lián)聚乙烯吡咯烷酮，瓊脂或藻蛋白酸或其鹽，如藻蛋白酸鈉。
糖衣核上應(yīng)提供合適的包被，為了這個(gè)目的，可用濃縮的糖溶液，其中可選擇性地包含阿拉伯膠，滑石粉，聚乙烯吡咯烷酮，carbopol凝膠，聚乙二醇，和/或二氧化鈦，漆溶液，和合適的有機(jī)溶劑或溶劑混合物。染料或色素可用在藥片或糖衣片包被中以鑒別或描述活性化合物藥劑的不同組合的特征。
用于口服的藥用制劑包括用明膠制成的推入配合的膠囊以及用明膠和增塑劑如甘油和山梨醇制成的柔軟、密閉的膠囊。推入配合的膠囊可含有與填充劑如乳糖，粘合劑如淀粉，和/或潤(rùn)滑劑如滑石粉或硬脂酸鎂混合的活性成分，還可選擇性地含有穩(wěn)定劑。在軟膠囊中，活性化合物可溶于或懸浮于合適的液體中，如脂肪油，液體石蠟，或液體聚乙二醇。另外也可加入穩(wěn)定劑。實(shí)施例實(shí)施例1外流泵抑制劑篩選-生長(zhǎng)抑制篩選本試驗(yàn)是以能增強(qiáng)抗菌劑作用的分子的篩選為基礎(chǔ)。在這個(gè)篩選方法中用到了兩個(gè)綠膿桿菌菌株。菌株K385，是由K.Poole分離的一種具有多藥耐藥性的突變株，它能過(guò)量表達(dá)外流泵，菌株K613，一種敏感性的oprM∷Hg突變株(Poole等，1993a；Poole等，1993b)。被試驗(yàn)的未知分子加在培養(yǎng)基中，而培養(yǎng)基用菌株K385接種。如果試驗(yàn)分子抑制了外流泵，它將增強(qiáng)抗菌劑的作用從而抑制生長(zhǎng)。在抗菌劑不存在時(shí)也試驗(yàn)這些化合物以檢測(cè)它們固有的抑菌活性。篩選方法在Mueller-Hinton肉湯培養(yǎng)基中菌株K385的新鮮接種液在35℃培養(yǎng)過(guò)夜，隨后用同樣的培養(yǎng)基稀釋至1/50。培養(yǎng)約60分鐘后培養(yǎng)物在600nm處的OD值達(dá)到0.2-0.3。然后用新配制的Mueller-Hinton肉湯培養(yǎng)基稀釋至1/50。每孔含50μl Mueller-Hinton培養(yǎng)基的微量滴定板用50μl稀釋的培養(yǎng)物接種，在50μl培養(yǎng)基中含20μg/ml的試驗(yàn)化合物和0.5μg/ml的環(huán)丙氟哌酸。含同樣體積的Mueller-Hinton肉湯培養(yǎng)基和試驗(yàn)化合物但沒(méi)有環(huán)丙氟哌酸的第二套微量滴定板也用50μl稀釋的培養(yǎng)物接種。起始生長(zhǎng)條件為100μl Mueller-Hinton肉湯培養(yǎng)基中含10μg/ml的試驗(yàn)化合物和0.25μg/ml的環(huán)丙氟哌酸。滴定板置于35℃孵箱中孵育20小時(shí)。生長(zhǎng)情況用微量板讀數(shù)儀(Thermomax微量板讀數(shù)儀，Molecular Devices)在600nm下測(cè)量。用到了以下對(duì)照未接種的Mueller-Hinton肉湯，生長(zhǎng)在含0.25μg/ml環(huán)丙氟哌酸和不含環(huán)丙氟哌酸的Mueller-Hinton肉湯培養(yǎng)基中的K385菌株，生長(zhǎng)在含0.25μg/ml環(huán)丙氟哌酸和不含環(huán)丙氟哌酸的Mueller-Hinton肉湯培養(yǎng)基中的K613菌株。未接種的Mueller-Hinton肉湯用于確立生長(zhǎng)基線。環(huán)丙氟哌酸存在時(shí)試驗(yàn)化合物以雙份進(jìn)行試驗(yàn)。比較菌株K385在0.25μg/ml環(huán)丙氟哌酸存在下的生長(zhǎng)情況，10μg/ml L-苯丙氨酰-L-精氨酰-β-萘酰胺的加入增強(qiáng)了環(huán)丙氟哌酸的作用。以所測(cè)的OD600計(jì)，生長(zhǎng)被抑制了99％。在環(huán)丙氟哌酸不存在時(shí)，10μg/ml L-苯丙氨酰-L-精氨酰-β-萘酰胺對(duì)生長(zhǎng)的抑制為1％。
用過(guò)量產(chǎn)生與K385菌株不同的另一種外流泵的菌株P(guān)AO4098E可進(jìn)行相似的篩選。在這個(gè)篩選方法中試驗(yàn)增強(qiáng)劑所用的環(huán)丙氟哌酸的濃度為0.2μg/ml而不是0.25μg/ml。
如果試驗(yàn)化合物抑制外流泵，環(huán)丙氟哌酸的胞內(nèi)濃度將升高，細(xì)胞生長(zhǎng)將被抑制。增強(qiáng)環(huán)丙氟哌酸作用的化合物將被鑒定并進(jìn)一步評(píng)價(jià)。
如上面所討論的，在優(yōu)選實(shí)施方案中，利用其它表達(dá)外流泵的菌種和被這些外流泵外排的抗生素，也可進(jìn)行相似的篩選。實(shí)施例2第二種篩選方法-測(cè)量四環(huán)素的胞內(nèi)濃度一種更特異的方法是以用tetR調(diào)控域控制報(bào)道基因的表達(dá)為基礎(chǔ)。tetR是一為人熟知的調(diào)控系統(tǒng)，對(duì)四環(huán)素濃度敏感，當(dāng)細(xì)胞內(nèi)四環(huán)素濃度升高時(shí)它能誘導(dǎo)TetA的合成。如果外流泵被阻斷，四環(huán)素的胞內(nèi)濃度將升高，受TetR控制的蛋白質(zhì)將被誘導(dǎo)。
tetR及其調(diào)控區(qū)已被克隆，而且一個(gè)tetA-lacZ融合基因也處于TetR的控制下。這一構(gòu)建物將被插入綠膿桿菌的非必需染色體基因中，以這種菌株的利用為基礎(chǔ)將建立一種篩選方法。這種構(gòu)建物與Rothstem等報(bào)道的有所不同，i)融合基因在tetA的不同位置構(gòu)建，ii)不為尋找四環(huán)素特異外流泵抑制劑而設(shè)計(jì)，而為尋找多底物外流泵抑制劑而設(shè)計(jì)，iii)該構(gòu)建物將插入染色體而不是質(zhì)粒中。
菌株P(guān)AO1將用于本篩選方法。它將在一非必需基因中含有上述的構(gòu)建物。PAO1將生長(zhǎng)在含亞抑制濃度的四環(huán)素和β-半乳糖苷酶底物的培養(yǎng)基中。在菌株接種前或培養(yǎng)物已開(kāi)始生長(zhǎng)后，被試驗(yàn)的化合物將加入培養(yǎng)基中。如果試驗(yàn)化合物抑制了外流泵，四環(huán)素的胞內(nèi)濃度將升高，而LacZ將被合成。LacZ的存在可用β-半乳糖苷酶底物檢測(cè)。實(shí)施例3第三種篩選方法—生色試劑的聚積一種特異的篩選方法是以非生長(zhǎng)的綠膿桿菌或其它細(xì)菌中生色或熒光試劑(或其它可檢測(cè)的化合物)的攝入為基礎(chǔ)。(在此之后的本實(shí)施例將僅指染料。)一種或多種類型的外流泵的抑制將導(dǎo)致染料聚積的增多。因此，如果外流泵被阻斷，染料的胞內(nèi)濃度將升高從而可用分光光度法測(cè)量，或者在某些情況下，可用目測(cè)估計(jì)。
綠膿桿菌株P(guān)AM1001將被用于本實(shí)施例的篩選方法，但其它過(guò)量表達(dá)相同的或其它外流泵的綠膿桿菌株或具有感興趣的外流泵(如其它非四環(huán)素特異性外流泵)的其它菌種也可同樣用于本方法。PAM1001生長(zhǎng)在標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基中，細(xì)胞通過(guò)離心收獲。細(xì)胞轉(zhuǎn)移至Eppendorf離心管中并用合適的緩沖液重懸浮至最佳的光密度。在環(huán)境溫度下培養(yǎng)一段時(shí)間前，染料和待試驗(yàn)的化合物均加入培養(yǎng)基中。懸浮液離心后細(xì)胞沉淀用分光光度法分析(程序A)或者抽提沉淀細(xì)胞中的染料并用分光光度法或熒光分光光度法(程序C)測(cè)量染料的量。如上所述，也可測(cè)量懸浮液培養(yǎng)基中的染料濃度(程序B)。在這種情況下，如果細(xì)胞聚積更多量的染料，上清中染料的量及其光吸收將下降，這三種程序的方法實(shí)例描述如下細(xì)胞制備將凍存的PAM1001劃線接種到Mueller-Hinton瓊脂平板中并于35℃培養(yǎng)過(guò)夜。收獲2-4個(gè)克隆，用于接種至含2mlMueller-Hinton肉湯的管中，于旋轉(zhuǎn)搖床中以200-250rpm，35℃培養(yǎng)過(guò)夜。在一250ml三角錐瓶中用相同的培養(yǎng)基將過(guò)夜培養(yǎng)物1∶100稀釋至40ml，并在上述相同生長(zhǎng)條件下生長(zhǎng)至中對(duì)數(shù)期(用Perkin ElmerLamda Bio分光光度計(jì)測(cè)600nm處OD值等于1)。室溫低速(4000g20分鐘)離心收集細(xì)胞并用40ml含0.2％葡萄糖的0.05M磷酸鉀緩沖液(pH6.9)洗滌一次，以1∶10初體積重懸于相同的緩沖液中。用這種方式制備的細(xì)胞被用于三種程序之中。
程序A—細(xì)胞顏色的改變?cè)诤鲜鼍彌_液的Eppendorf管(1.5ml大小)中細(xì)胞被稀釋至600 nm下1OD。龍膽紫(終濃度1μg/ml)和合適濃度的試驗(yàn)化合物加入管中至終體積為1ml。細(xì)胞懸液于室溫溫育5分鐘并在Eppendorf離心機(jī)中以14,000rpm離心2分鐘。如果外流泵被抑制，細(xì)胞沉淀將變成紫紅色。當(dāng)外流泵抑制劑L-苯丙氨酰-L-精氨酰-β-萘酰胺加至40μg/ml。暴露于龍膽紫和L-苯丙氨酰-L-精氨酰-β-萘酰胺中的細(xì)胞懸浮液的沉淀變成紫色，而未暴露在龍膽紫和L-苯丙氨酰-L-精氨酰-β-萘酰胺中的細(xì)胞懸浮液的沉淀并不變色。程序B—上清光吸收的改變?cè)诤鲜鼍彌_液的Eppendorf管(1.5ml大小)中將細(xì)胞稀釋至600nm 0.5OD。龍膽紫(終濃度8μg/ml)和L-苯丙氨酰-L-精氨酰-β-萘酰胺加入管中，終體積1ml。于室溫將細(xì)胞懸液溫育5分鐘，在Eppendorf離心機(jī)中以14,000rpm離心2分鐘，收集上清測(cè)590nm處的光吸收。這一程序的實(shí)例結(jié)果如下所示
程序C-細(xì)胞沉淀中染料的抽提在含上述緩沖液的Eppendorf管(1.5ml大小)中細(xì)胞稀釋至600nm 0.5OD。龍膽紫(16μg/ml終濃度)和100μg/ml L-苯丙氨酰-L-精氨酰-β-萘酰胺加入管中至終體積0.5ml。細(xì)胞懸液于室溫溫育5分鐘，在Eppendorf離心機(jī)中以14,000rpm離心2分鐘。洗滌細(xì)胞一次并將其重懸于20μl緩沖液中；加入400μl1-丙醇，溫育10分鐘并離心。收集上清并用分光光度法于590nm測(cè)龍膽紫水平。實(shí)例結(jié)果如下<
上述用已知外流泵抑制劑作為試驗(yàn)化合物的篩選方法的實(shí)例程序的結(jié)果證明染料聚積篩選法可用于鑒定其它的外流泵抑制劑。實(shí)施例4第四種篩選方法—陽(yáng)性生長(zhǎng)篩選本試驗(yàn)為一陽(yáng)性生長(zhǎng)篩選即通過(guò)細(xì)菌細(xì)胞的生長(zhǎng)來(lái)表明外流泵抑制劑的存在。本試驗(yàn)利用了受可誘導(dǎo)的調(diào)控區(qū)控制的β-內(nèi)酰胺酶基因。為了這種篩選方法，一個(gè)含tetR基因，tetA啟動(dòng)子和blaS基因的構(gòu)建物插入到綠膿桿菌株P(guān)AO1染色體中的非必需基因中，blaS基因編碼來(lái)自嗜麥芽黃單胞菌的β-內(nèi)酰胺酶；卡巴培南是這個(gè)β-內(nèi)酰胺酶的有效底物。菌株P(guān)AO1不能產(chǎn)生能以卡巴培南為有效底物的β-內(nèi)酰胺酶，另外，卡巴培南不能被綠膿桿菌的外流泵外排。在能有效利用卡巴培南的β-內(nèi)酰胺酶不存在時(shí)，高濃度的卡巴培南將克服綠膿桿菌外膜的低通透性從而抑制細(xì)菌的生長(zhǎng)。因此，如果blaS基因的表達(dá)未被誘導(dǎo)，由于卡巴培南的存在綠膿桿菌細(xì)胞將死亡。然而，如果四環(huán)素在培養(yǎng)基中以非常低的水平存在，而外流泵抑制劑以能有效抑制外排四環(huán)素的外流泵的濃度存在，四環(huán)素的胞內(nèi)濃度將升高，從而誘導(dǎo)blaS基因的表達(dá)，將水解卡巴培南使得細(xì)菌能夠生長(zhǎng)。
本試驗(yàn)還可滴定弱外流泵抑制劑的活性。利用培養(yǎng)基中不同濃度的卡巴培南可完成這種滴定。不足的抑制劑將不能完全誘導(dǎo)blaS基因的表達(dá)，從而不能導(dǎo)致高卡巴培南濃度下的陽(yáng)性細(xì)胞生長(zhǎng)，因?yàn)樯倭勘徽T導(dǎo)的β-內(nèi)酰胺酶不能水解足夠量的卡巴培南，但在低卡巴培南濃度下，將能誘導(dǎo)出足夠的β-內(nèi)酰胺酶，水解足夠的卡巴培南，使細(xì)胞得以生長(zhǎng)。因此，本試驗(yàn)提供了檢測(cè)弱外流泵抑制劑及強(qiáng)外流泵抑制劑的方法。實(shí)施例5目標(biāo)物的評(píng)價(jià)為了評(píng)估外流泵在致病原因中的作用，我們獲得了PAO1中編碼外流泵成分的mexA和oprK。用標(biāo)準(zhǔn)的基團(tuán)置換法構(gòu)建得到該菌株。不能獲得mexB的無(wú)效突變菌株可能因?yàn)樵撏蛔兪侵滤赖?。mexA和oprK無(wú)效突變株對(duì)抗生素更敏感，并將用于動(dòng)物模型以試驗(yàn)這些突變株在中性白細(xì)胞減少的小鼠中的毒力。實(shí)施例6成功化合物的評(píng)價(jià)通過(guò)一種或多種上述的篩選方法(生長(zhǎng)抑制，報(bào)道物誘導(dǎo)，或陽(yáng)性生長(zhǎng)篩選)篩選證明為外流泵抑制劑的化合物將檢測(cè)其增強(qiáng)綠膿桿菌對(duì)無(wú)關(guān)抗生素諾氟哌酸和四環(huán)素敏感性的能力。隨后，用一定范圍的抗生素，如四環(huán)素，氟喹諾酮，β-內(nèi)酰胺，和氨基糖苷確定這些分子的增強(qiáng)作用，也將檢測(cè)外流泵抑制劑化合物的抗菌活性。
而且，也將檢測(cè)這些化合物對(duì)其它泵(如MexC-MexD-OprL系統(tǒng)，NorA，TetA，MDR)的抑制作用，已鑒定的化合物也將在分子水平檢測(cè)其抑制外流泵的能力。實(shí)施例7一種成功化合物—L-苯丙氨酰-L-精氨酰-β-萘酰胺的鑒定用實(shí)施例1中所述的生長(zhǎng)抑制篩選，化合物L(fēng)-苯丙氨酰-L-精氨酰-β-萘酰胺被鑒定為外流泵抑制劑。根據(jù)化合物的結(jié)構(gòu)與預(yù)期的治療用途適用性先選出一組化合物，在這些化合物中進(jìn)行篩選。這個(gè)化合物的結(jié)構(gòu)如圖21所示。這種鑒定之后，這個(gè)化合物受到如實(shí)施例7所述的體外鑒定。實(shí)施例8成功化合物—L-苯丙氨酰-L-精氨酰-β-萘酰胺的性質(zhì)A.L-苯丙氨酰-L-精氨酰-β-蒸酰胺用于鑒定外流泵的存在。
L-苯丙氨酰-L-精氨酰-β-萘酰胺可用于鑒定受其抑制的外流泵的存在。這種鑒定將以受L-苯丙氨酰-L-精氨酰-β-萘酰胺抑制的泵外排的抗生素的增強(qiáng)作用為基礎(chǔ)，或通過(guò)監(jiān)測(cè)泵的底物如蛋白質(zhì)的分泌來(lái)鑒定。B.體外簡(jiǎn)介(profile)L-苯丙氨酰-L-精氨酰-β-萘酰胺提高了綠膿桿菌野生型PAO1菌株以及兩種外流泵過(guò)量產(chǎn)生的菌株K385和PAO4098E對(duì)四環(huán)素和環(huán)丙氟哌酸的敏感性(圖7和8)。利用棋盤(pán)格試驗(yàn)，也明確地證明了這三個(gè)菌株對(duì)L-苯丙氨酰-L-精氨酰-β-萘酰胺與四環(huán)素或環(huán)丙氟哌酸合用的協(xié)同作用。L-苯丙氨酰-L-精氨酰-β-萘酰胺對(duì)外流泵缺陷的突變株K799/61對(duì)四環(huán)素和環(huán)丙氟哌酸的敏感性沒(méi)有影響(圖8)。L-苯丙氨酰-L-精氨酰-β-萘酰胺在高濃度(32μg/ml)下也顯示出固有的抗菌活性，綠膿桿菌四個(gè)菌株的MIC如表2所示。應(yīng)當(dāng)注意到兩種外流泵過(guò)量生產(chǎn)者對(duì)L-苯丙氨酰-L精氨酰-β-萘酰胺的敏感性明顯低于野生型或外流泵缺陷的突變株(圖8)。
利用綠膿桿菌PAO1和K385，我們已表明L-苯丙氨酰-L-精氨酰-β-萘酰胺也具有增強(qiáng)許多被綠膿桿菌特異地泵出的抗生素(四環(huán)素，氯霉素，哌拉西林，頭孢他啶以及包括環(huán)丙氟哌酸和諾氟哌酸在內(nèi)的七種氟喹諾酮)的活性的功能，但是，非綠膿桿菌MDR/綠膿菌熒光素外流泵(Li等，1994a；Li等，1994b)底物的藥物如亞胺培南和慶大霉素的MIC，在L-苯丙氨酰-L-精氨酰-β-萘酰胺存在時(shí)仍保持不變。
圖9圖示了綠膿桿菌株P(guān)AO1對(duì)被測(cè)的每種抗生素的敏感性的倍數(shù)提高，而圖10列出了它們的MIC。四種兩性氟喹諾酮的相對(duì)疏水性與L-苯丙氨酰-L-精氨酰-β-萘酰胺引起的對(duì)綠膿桿菌株P(guān)AO1和K385的MIC的降低程度呈正比關(guān)系(圖11)。
L-苯丙氨酰-L-精氨酰-β-萘酰胺降低了環(huán)丙氟哌酸對(duì)所測(cè)綠膿桿菌所有的實(shí)驗(yàn)室菌株和臨床分離株(n＝26)的MIC。這個(gè)菌株群中有18個(gè)臨床分離株和8個(gè)實(shí)驗(yàn)室菌株。用肉湯培養(yǎng)基微量稀釋法，研究了這個(gè)菌株群對(duì)環(huán)丙氟哌酸及環(huán)丙氟哌酸與L-苯丙氨酰-L-精氨酰-β-萘酰胺合用的敏感性。環(huán)丙氟哌酸對(duì)這個(gè)菌株群的MIC90為2μg/ml。而加入終濃度為20μg/ml的L-苯丙氨酰-L-精氨酰-β-萘酰胺后，則降至0.125μg/ml(圖12)。
用綠膿桿菌的三個(gè)菌株，PAO1，K385，和PAO4098E進(jìn)行了L-苯丙氨酰-L-精氨酰-β-萘酰胺與亞抑制濃度的四環(huán)素或環(huán)丙氟哌酸合用的時(shí)間殺滅研究。研究表明終濃度為20μg/ml的L-苯丙氨酰-L-精氨酰-β-萘酰胺的加入，完全恢復(fù)了四環(huán)素對(duì)這三種菌株的抑菌活性。同樣，在存在20μg/ml L-苯丙氨酰-L-精氨酰-β-萘酰胺時(shí)，低至0.2μg/ml的環(huán)丙氟哌酸對(duì)所有測(cè)試的菌株均有殺菌活性(圖13-15)。
我們也證實(shí)大多數(shù)腸桿菌科和假單胞菌屬的種類對(duì)環(huán)丙氟哌酸的敏感性可被L-苯丙氨酰-L-精氨酰-β-萘酰胺提高。L-苯丙氨酰-L-精氨酰-β-萘酰胺增強(qiáng)了環(huán)丙氟哌酸對(duì)金黃色葡萄球菌的一個(gè)臨床分離株的作用。其MIC從16μg/ml降至4μg/ml(圖16)。
我們也研究了L-苯丙氨酰-L-精氨酰-β-萘酰胺對(duì)大腸桿菌AcrAB泵缺陷突變株的影響，該菌株在H.Nikaido的實(shí)驗(yàn)室中通過(guò)轉(zhuǎn)座子誘變獲得。我們發(fā)現(xiàn)L-苯丙氨酰-L-精氨酰-β-萘酰胺提高了親本菌株NH817—一種Acr陽(yáng)性表型的大腸桿菌K12對(duì)吖啶橙的敏感性。AcrAB泵缺陷型的菌株NH818比親本菌株對(duì)吖啶橙更敏感，且其敏感性水平不受L-苯丙氨酰-L-精氨酰-β-萘酰胺影響(圖17)。
L-苯丙氨酰-L-精氨酰-β-萘酰胺表現(xiàn)出能增強(qiáng)環(huán)丙氟哌酸抗帶有已知的DNA回旋酶突變的綠膿桿菌株(PAO236 NalA)的作用。革蘭氏陰性細(xì)菌對(duì)抗微生物劑的總體敏感性由外膜通透性(包括外排作用)和藥物對(duì)目標(biāo)物的親和力兩者的相對(duì)貢獻(xiàn)確定。如果在NalA菌株中喹諾酮的外排作用受到影響，引起生長(zhǎng)抑制所必需的表觀喹諾酮濃度將降低，導(dǎo)致對(duì)喹諾酮的敏感性增強(qiáng)(圖18)。
四環(huán)素聚積實(shí)驗(yàn)用于測(cè)量綠膿桿菌中外流泵的活性。該實(shí)驗(yàn)測(cè)定[3H]-四環(huán)素在細(xì)菌中的聚積，并使其最優(yōu)化以測(cè)量四環(huán)素在綠膿桿菌中的聚積。在四種不同的綠膿桿菌菌株中測(cè)量了四環(huán)素的聚積1)產(chǎn)生基礎(chǔ)水平外流泵的野生型菌株P(guān)AO1，2)來(lái)自PAO1并過(guò)量產(chǎn)生兩種不同外流泵的菌株P(guān)AO4098E和K385和3)菌株799/61，一種不能產(chǎn)生可檢測(cè)量的外流泵并對(duì)抗生素過(guò)敏感的菌株。
在合成外流泵的細(xì)菌，PAO1，PAO4098E或K385的細(xì)胞懸液中，加入L-苯丙氨酰-L-精氨酰-β-萘酰胺抑制外流泵的正常功能，在1mM或0.1mM L-苯丙氨酰-L-精氨酰-β-萘酰胺存在時(shí)，四環(huán)素聚積顯著提高。當(dāng)CCCP加入細(xì)胞懸液中后也會(huì)出現(xiàn)相似的抑制方式(圖19)，CCCP為一質(zhì)子導(dǎo)體，它能破壞被外流泵用作源能量的質(zhì)子梯度。
當(dāng)在不能產(chǎn)生外流泵的菌株799/61中測(cè)量四環(huán)素聚積時(shí)，L-苯丙氨酰-L-精氨酰-β-萘酰胺的加入并不改變四環(huán)素聚積的穩(wěn)態(tài)水平。質(zhì)子導(dǎo)體CCCP的加入降低了菌株799/61中的四環(huán)素聚積。當(dāng)CCCP加入細(xì)胞懸液中且pH在膜兩邊達(dá)到平衡，將達(dá)到一個(gè)新的四環(huán)素穩(wěn)態(tài)平衡。當(dāng)CCCP存在時(shí)，細(xì)胞懸液中加入L-苯丙氨酰-L-精氨酰-β-萘酰胺不會(huì)改變四環(huán)素聚積的穩(wěn)態(tài)水平，正如所預(yù)料的那樣它是不影響質(zhì)子梯度的特異性外流泵抑制劑(圖20)。
本結(jié)果清楚地表明L-苯丙氨酰-L-精氨酰-β-萘酰胺抑制了綠膿桿菌中外流泵的功能。L-苯丙氨酰-L-精氨酰-β-萘酰胺不能影響質(zhì)子梯度，不能作為質(zhì)子解偶聯(lián)劑。實(shí)施例9成功化合物的體內(nèi)評(píng)價(jià)細(xì)菌外流泵抑制劑首先在體外鑒定。那些顯示出能有效抑制外流泵和那些與抗生素顯示出協(xié)同作用的化合物被挑選出來(lái)進(jìn)行體內(nèi)評(píng)估。將用標(biāo)準(zhǔn)的方法進(jìn)行功效試驗(yàn)。用鼠敗血癥模型可進(jìn)行初步的功效評(píng)估(M.G.Bergeron.1978年，Scand.J.Infect.Dis.增刊14卷189-206頁(yè)；S.D.Davis，1975年，《抗微生物劑化學(xué)療法》(Antimicrob.AgentsChemother.)8卷50-53頁(yè))。在這個(gè)模型中超致死量的細(xì)菌用于攻擊這些嚙齒動(dòng)物。改變治療時(shí)間和抗生素劑量中的一項(xiàng)或二項(xiàng)來(lái)進(jìn)行治療。在這些實(shí)驗(yàn)中，抗生素和外流泵抑制劑的劑量均不同。增效劑(外流泵抑制劑)與抗生素合用與單獨(dú)使用抗生素相比對(duì)致死感染的保護(hù)作用明顯提高表明為陽(yáng)性結(jié)果。
所用的第二種功效模型為小鼠軟組織感染模型(Vogelman等，1988年，《感染性疾病雜志》(J.Infect.Dis.)157卷287-298頁(yè))。在這個(gè)模型中，用合適滴度的細(xì)菌感染麻醉小鼠的后大腿肌肉。小鼠為嗜中性白細(xì)胞減少的(在-4，-2和0天用125mg/kg環(huán)磷酰胺治療)或免疫活性的小鼠。感染劑量通常為每只動(dòng)物105-106克隆形成單位。外流泵抑制劑和/或抗生素的合用進(jìn)行的治療可在感染后，也可在感染前。在全部時(shí)間范圍內(nèi)監(jiān)測(cè)大腿肌肉中細(xì)菌的增殖(或死亡)。有效的合用比單獨(dú)使用抗生素顯示出更高的活性?；钚员欢x為在鼠組織中被試細(xì)菌生長(zhǎng)速率的降低。
另一用于評(píng)價(jià)外流泵抑制劑功效的模型為擴(kuò)散室模型(Malouin等，1990年《感染與免疫》(Infect Immun)58卷1247-1253頁(yè)；Day等，《感染雜志》(J.Infect)2卷39-51頁(yè)；Kelly等，1989年《感染與免疫》(Infect.Immun)57卷344-350頁(yè))。在這個(gè)模型中，用外科手術(shù)在嚙齒動(dòng)物的腹膜腔中置入一擴(kuò)散室。該室可由聚丙烯圓柱組成，圓柱的兩端用半透膜覆蓋。擴(kuò)散進(jìn)或出小室的腹膜液為微生物提供了營(yíng)養(yǎng)。當(dāng)抗生素/外流泵抑制劑存在和不存在時(shí)細(xì)菌的增殖與單獨(dú)使用抗生素時(shí)相比較。合用和單獨(dú)使用抗生素的劑量分布用于評(píng)估抗微生物劑/合用的功效。
用于外流泵抑制劑/抗生素合用的嚴(yán)格試驗(yàn)的第三個(gè)模型為心內(nèi)膜炎模型(J.Santoro和M.E.levinson，1978年《感染與免疫)》(InfectImmun.)19卷915-918頁(yè))。大鼠和兔子均能有效地用于這個(gè)模型。外流泵抑制劑與抗生素合用的效果與單獨(dú)使用抗生素的效果進(jìn)行比較。終點(diǎn)通常為在治療結(jié)束時(shí)殘留在心臟增殖體中的存活細(xì)胞。
所提供的感染模型實(shí)例并非限制性的，其它的模型合適用于特定的感染微生物。尤其是，在某些情況下細(xì)胞感染模型可用來(lái)替代動(dòng)物模型。
這里描述的實(shí)施方案并不意味著對(duì)本發(fā)明進(jìn)行限制。本領(lǐng)域的技術(shù)人員將明白本發(fā)明可用許多細(xì)菌株或種，或其它細(xì)胞類型進(jìn)行實(shí)施。
其它的實(shí)施方案包括在下面的權(quán)利要求中。
權(quán)利要求
1.一種篩選非四環(huán)素特異性外流泵抑制劑的方法，包括在亞抑制濃度的抗菌劑存在時(shí)，確定潛在的非四環(huán)素特異性外流泵抑制劑是否抑制細(xì)菌的生長(zhǎng)其中所說(shuō)的細(xì)菌產(chǎn)生一非四環(huán)素特異性外流泵。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所說(shuō)的細(xì)菌過(guò)量產(chǎn)生非四環(huán)素特異性外流泵。
3.權(quán)利要求2的方法，進(jìn)一步包括比較過(guò)量產(chǎn)生外流泵的細(xì)菌與不能過(guò)量產(chǎn)生外流泵的另一種細(xì)菌的生長(zhǎng)情況，其中如果過(guò)量產(chǎn)生外流泵的細(xì)菌的生長(zhǎng)比所說(shuō)的第二種細(xì)菌的生長(zhǎng)受到更大程度的抑制，那么該試驗(yàn)化合物為一非四環(huán)素特異性外流泵抑制劑。
4.一種篩選非四環(huán)素特異性外流泵抑制劑的方法，包括在試驗(yàn)化合物存在和不存在時(shí)，將具有非四環(huán)素特異性外流泵的細(xì)菌細(xì)胞與被該外流泵運(yùn)輸?shù)娜玖匣驘晒馕镔|(zhì)接觸；和比較該試驗(yàn)化合物存在和不存在時(shí)染料或熒光物質(zhì)的胞內(nèi)濃度；其中該試驗(yàn)化合物存在時(shí)與不存在時(shí)相比，染料或熒光物質(zhì)的胞內(nèi)濃度升高表明該試驗(yàn)化合物為一非四環(huán)素特異性外流泵抑制劑。
5.權(quán)利要求4的方法，其中所說(shuō)的染料選自龍膽紫和孔雀綠。
6.權(quán)利要求4的方法，其中所說(shuō)的比較包括確定染料在懸浮培養(yǎng)基中的濃度變化。
7.一種篩選非四環(huán)素特異性外流泵抑制劑的方法，包括確定在試驗(yàn)化合物和亞抑制濃度的第二種化合物存在時(shí)，在一表達(dá)非四環(huán)素特異性外流泵的重組細(xì)菌中，第二種化合物的胞內(nèi)濃度是否升高，其中所說(shuō)的確定包括檢測(cè)受第二種化合物濃度升高誘導(dǎo)的調(diào)控序列控制的報(bào)道基因的表達(dá)，和其中如果該試驗(yàn)化合物存在時(shí)比其不存在時(shí)報(bào)道基因的表達(dá)水平更高，那么該試驗(yàn)化合物為一非四環(huán)素特異性外流泵抑制劑。
8.權(quán)利要求7的方法，其中所說(shuō)的第二種化合物為抗菌劑。
9.權(quán)利要求8的方法，其中所說(shuō)的調(diào)控序列受四環(huán)素升高的濃度誘導(dǎo)。
10.權(quán)利要求9的方法，其中調(diào)控序列為tetA調(diào)控序列，它含有一結(jié)合TetR的操縱位點(diǎn)。
11.權(quán)利要求7的方法，其中所說(shuō)的報(bào)道基因表達(dá)一種酶。
12.權(quán)利要求11的方法，其中所說(shuō)的報(bào)道基因?yàn)棣?半乳糖苷酶基因。
13.權(quán)利要求7的方法，其中所說(shuō)的報(bào)道基因提供比色報(bào)道。
14.一種試驗(yàn)外流泵抑制劑的方法，包括如下步驟a.將表達(dá)外流泵的重組微生物細(xì)胞與一試驗(yàn)化合物接觸，和b.確定在該試驗(yàn)化合物存在時(shí)，重組的微生物細(xì)胞是否生長(zhǎng)，其中當(dāng)外流泵被抑制后比未被抑制時(shí)，所說(shuō)的微生物細(xì)胞將生長(zhǎng)更好，其中如果該試驗(yàn)化合物存在時(shí)比不存在時(shí)所說(shuō)的重組微生物細(xì)胞生長(zhǎng)得更好，那么該試驗(yàn)化合物為一外流泵抑制劑。
15.權(quán)利要求14的方法，包括將該重組微生物細(xì)胞與一試驗(yàn)化合物，一誘導(dǎo)劑，和一高于該重組微生物細(xì)胞非誘導(dǎo)MIC的濃度的抗微生物劑接觸，進(jìn)一步包括確定在試驗(yàn)化合物存在時(shí)誘導(dǎo)劑的胞內(nèi)濃度是否升高，其中誘導(dǎo)劑升高的胞內(nèi)濃度誘導(dǎo)產(chǎn)生所說(shuō)的抗微生物劑的滅活因子。
16.權(quán)利要求15的方法，其中所說(shuō)的重組微生物細(xì)胞為重組細(xì)菌細(xì)胞，而所說(shuō)的抗微生物劑為抗菌劑。
17.權(quán)利要求16的方法，其中重組細(xì)菌細(xì)胞含人工插入的DNA結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)含一受該誘導(dǎo)劑升高的胞內(nèi)濃度誘導(dǎo)的啟動(dòng)子，與一編碼抗菌劑滅活因子的序列一起轉(zhuǎn)錄，其中誘導(dǎo)劑升高的胞內(nèi)濃度誘導(dǎo)編碼抗菌劑滅活因子的序列表達(dá)。
18.權(quán)利要求17的方法，其中誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)β-內(nèi)酰胺酶基因的表達(dá)，而所說(shuō)的抗菌劑為β-內(nèi)酰胺。
19.權(quán)利要求18的方法，其中誘導(dǎo)劑為四環(huán)素，β-內(nèi)酰胺酶基因?yàn)閎laS基因，β-內(nèi)酰胺為卡巴培南。
20.權(quán)利要求17或19的方法，其中啟動(dòng)子為tetA啟動(dòng)子，而重組細(xì)菌細(xì)胞表達(dá)tetR基因。
21.權(quán)利要求18或19的方法，其中β-內(nèi)酰酶基因是染色體插入的。
22.權(quán)利要求1-21中任意一種方法，其中外流泵為綠膿桿菌型外流泵。
23.權(quán)利要求22的方法，其中外流泵為綠膿桿菌外流泵。
24.權(quán)利要求23的方法，其中細(xì)菌為綠膿桿菌。
25.權(quán)利要求24的方法，其中綠膿桿菌為菌株K385或PAO4098E。
26.權(quán)利要求1-21中任意一種方法，其中至少一種細(xì)菌選自下面綠膿桿菌，熒光假單胞菌，食酸假單胞菌，產(chǎn)堿假單胞菌，惡臭假單胞菌，嗜麥芽糖寡養(yǎng)單胞菌，洋蔥伯克氏菌，嗜水氣單胞菌，大腸桿菌，弗氏檸檬酸桿菌，鼠傷寒沙門(mén)氏菌，傷寒沙門(mén)氏菌，副傷寒沙門(mén)氏菌，腸炎沙門(mén)氏菌，痢疾志賀氏菌，弗氏志賀氏菌、索氏志賀氏菌，陰溝腸桿菌，產(chǎn)氣腸桿菌，肺炎克雷伯氏菌，產(chǎn)酸克雷伯氏菌，粘質(zhì)沙雷氏菌，土拉熱弗朗西絲氏菌，摩氏摩根氏菌，奇異變形菌，普通變形菌，產(chǎn)堿普羅威登斯菌，雷氏普羅威登斯菌，斯氏普羅威登斯菌，乙酸鈣不動(dòng)桿菌，溶血不動(dòng)桿菌，小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌，鼠疫耶爾森氏菌，假結(jié)核耶爾森氏菌，中間耶爾森氏菌，百日咳博德特氏菌，副百日咳博德特氏菌，支氣管炎博德特氏菌，流感嗜血菌，副流感嗜血菌，溶血嗜血菌，副溶血嗜血菌，杜氏嗜血菌，多殺巴斯德氏菌，溶血巴斯德氏菌，粘膜炎布蘭漢氏球菌，幽門(mén)螺桿菌，胚胎彎曲桿菌，空腸彎曲桿菌，大腸彎曲桿菌，布氏疏螺旋體，霍亂弧菌，副溶血弧菌，侵肺軍團(tuán)菌，單核細(xì)胞增生利斯特氏菌，淋病奈瑟氏球菌，腦膜炎奈瑟氏球菌，陰道加德納氏菌，脆弱擬桿菌，吉氏擬桿菌，擬桿菌3452A同源群，普通擬桿菌，卵擬桿菌，多形擬桿菌，單形擬桿菌，埃氏擬桿菌，內(nèi)臟擬桿菌，艱難梭菌，結(jié)核分枝桿菌，鳥(niǎo)分枝桿菌，胞內(nèi)分枝桿菌，麻風(fēng)分枝桿菌，白喉棒桿菌，潰瘍棒桿菌，肺炎鏈球菌，無(wú)乳鏈球菌，釀膿鏈球菌，糞腸球菌，屎腸球菌，金黃色葡萄球菌，表皮葡萄球菌，腐生葡萄球菌，中間葡萄球菌，豬葡萄球菌豬亞種，溶血葡萄球菌，人葡萄球菌，解糖葡萄球菌。
27.權(quán)利要求1-21中任意一種方法，其中外流泵選自mexA/mexB/oprM和綠膿桿菌株K385過(guò)量表達(dá)的外流泵。
28.權(quán)利要求14-21中任意一種方法，其中重組細(xì)菌來(lái)自綠膿桿菌株，菌株K385，或菌株P(guān)AO4098E。
29.一種治療動(dòng)物中微生物感染的方法，包括給予遭受感染的動(dòng)物足以降低外流泵活性的量的外流泵抑制劑，其中外流泵抑制劑降低該動(dòng)物中微生物的致病性或體內(nèi)生存能力。
30.一種治療動(dòng)物中微生物感染的方法，包括給予遭受感染的動(dòng)物某種抗微生物劑和足以降低外流泵活性的量的外流泵抑制劑，其中外流泵抑制劑提高微生物對(duì)該抗微生物劑的敏感性。
31.一種動(dòng)物的預(yù)防治療方法，包括給予有微生物感染危險(xiǎn)的動(dòng)物外流泵抑制劑，其中該外流泵抑制劑降低動(dòng)物中微生物的致病性。
32.一種動(dòng)物的預(yù)防治療方法，包括給予有微生物感染危險(xiǎn)的動(dòng)物某種抗微生物劑和外流泵抑制劑，其中外流泵抑制劑提高微生物對(duì)該抗微生物劑的敏感性。
33.權(quán)利要求29-32中任意一種方法，其中所說(shuō)的動(dòng)物為哺乳動(dòng)物。
34.權(quán)利要求29-32中任意一種方法，其中所說(shuō)的微生物感染與細(xì)菌有關(guān)。
35.一種增強(qiáng)抗微生物劑抗微生物活性的方法，包括將微生物與該抗微生物劑和可有效抑制該微生物中外流泵的量的非四環(huán)素特異性外流泵抑制劑接觸。
36.權(quán)利要求35的方法，其中所說(shuō)的微生物為細(xì)菌。
37.權(quán)利要求34或權(quán)利要求36的方法，其中所說(shuō)的細(xì)菌感染與選自下面的一種細(xì)菌有關(guān)綠膿桿菌，熒光假單胞菌，食酸假單胞菌，產(chǎn)堿假單胞菌，惡臭假單胞菌，嗜麥芽糖寡養(yǎng)單胞菌，洋蔥伯克氏菌，嗜水氣單胞菌，大腸桿菌，弗氏檸檬酸桿菌，鼠傷寒沙門(mén)氏菌，傷寒沙門(mén)氏菌，副傷寒沙門(mén)氏菌，腸炎沙門(mén)氏菌，痢疾志賀氏菌，弗氏志賀氏菌，索氏志賀氏菌，陰溝腸桿菌，產(chǎn)氣腸桿菌，肺炎克雷伯氏菌，產(chǎn)酸克雷伯氏菌，粘質(zhì)沙雷氏菌，土拉熱弗朗西絲氏菌，摩氏摩根氏菌，奇異變形菌，普通變形菌，產(chǎn)堿普羅威登斯菌，雷氏普羅威登斯菌，斯氏普羅威登斯菌，乙酸鈣不動(dòng)桿菌，溶血不動(dòng)桿菌，小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌，鼠疫耶爾森氏菌，假結(jié)核耶爾森氏菌，中間耶爾森氏菌，百日咳博德特氏菌，副百日咳博德特氏菌，支氣管炎博德特氏菌，流感嗜血菌，副流感嗜血菌，溶血嗜血菌，副溶血嗜血菌，杜氏嗜血菌，多殺巴斯德氏菌，溶血巴斯德氏菌，粘膜炎布蘭漢氏球菌，幽門(mén)螺桿菌，胚胎彎曲桿菌，空腸彎曲桿菌，大腸彎曲桿菌，布氏疏螺旋體，霍亂弧菌，副溶血弧菌，侵肺軍團(tuán)菌，單核細(xì)胞增生利斯特氏菌，淋病奈瑟氏球菌，腦膜炎奈瑟氏球菌，陰道加德納氏菌，脆弱擬桿菌，吉氏擬桿菌，擬桿菌3452A同源群，普通擬桿菌，卵擬桿菌，多形擬桿菌，單形擬桿菌，埃氏擬桿菌，內(nèi)臟擬桿菌，艱難梭菌，結(jié)核分枝桿菌，鳥(niǎo)分枝桿菌，胞內(nèi)分枝桿菌，麻風(fēng)分枝桿菌，白喉棒桿菌，潰瘍棒桿菌，肺炎鏈球菌，無(wú)乳鏈球菌，釀膿鏈球菌，糞腸球菌，屎腸球菌，金黃色葡萄球菌，表皮葡萄球菌，腐生葡萄球菌，中間葡萄球菌，豬葡萄球菌豬亞種，溶血葡萄球菌，人葡萄球菌，解糖葡萄球菌。
38.權(quán)利要求34或36的方法，其中外流泵抑制劑為非四環(huán)素特異性外流泵抑制劑。
39.權(quán)利要求34或36的方法，其中外流泵抑制劑為綠膿桿菌型外流泵抑制劑。
40.權(quán)利要求30和32-39中任意一種方法，其中所說(shuō)的微生物感染為細(xì)菌感染，而所說(shuō)的抗微生物劑為抗菌劑。
41.權(quán)利要求40的方法，其中所說(shuō)的抗菌劑為喹諾酮。
42.權(quán)利要求40的方法，其中所說(shuō)的抗菌劑為四環(huán)素。
43.權(quán)利要求40的方法，其中所說(shuō)的抗菌劑為β-內(nèi)酰胺。
44.權(quán)利要求40的方法，其中所說(shuō)的抗菌劑為香豆霉素。
45.權(quán)利要求40的方法，其中所說(shuō)的抗菌劑為氯霉素。
46.權(quán)利要求40的方法，其中所說(shuō)的抗菌劑為糖肽。
47.權(quán)利要求40的方法，其中所說(shuō)的抗菌劑為氨基糖苷。
48.權(quán)利要求40的方法，其中所說(shuō)的抗菌劑為大環(huán)內(nèi)酯。
49.權(quán)利要求40的方法，其中所說(shuō)的抗菌劑為利福霉素。
50.一種抑制微生物細(xì)胞膜上膜通道功能的方法，包括將膜通道與膜通道抑制劑接觸，其中抑制劑降低膜通道的外排能力。
51.權(quán)利要求50的方法，其中膜通道的一個(gè)多肽與mexA/mexB/oprM外流泵或綠膿桿菌K385過(guò)量表達(dá)的外流泵的一個(gè)多肽至少有50％的氨基酸序列相似性。
52.一種能有效治療動(dòng)物的微生物感染的藥物組合物，含有外流泵抑制劑。
53.權(quán)利要求52的藥物組合物，能有效治療動(dòng)物的細(xì)菌感染。
54.權(quán)利要求52的藥物組合物，能有效治療動(dòng)物的微生物感染。
55.一種當(dāng)給予動(dòng)物足以降低外流泵活性的量時(shí)能有效治療動(dòng)物的微生物感染的藥物組合物，包含外流泵抑制劑和抗微生物劑。
56.權(quán)利要求55的藥物組合物，其中該組合物能有效治療哺乳動(dòng)物的微生物感染，其中所說(shuō)的微生物為細(xì)菌。
57.權(quán)利要求56的藥物組合物，它能有效地治療動(dòng)物的細(xì)菌感染，其中抗微生物劑為抗菌劑。
58.一種以足以降低外流泵活性的量與抗微生物劑一道給予動(dòng)物時(shí)能有效治療動(dòng)物的微生物感染的藥物組合物，包括一種藥用載體和一種外流泵抑制劑。
59.權(quán)利要求58的藥物組合物，能有效治療動(dòng)物的細(xì)菌感染，其中抗微生物劑為抗菌劑。
60.權(quán)利要求59的藥物組合物，能有效治療哺乳動(dòng)物的微生物感染，其中所說(shuō)的微生物為細(xì)菌。
61.權(quán)利要求52，55或58的藥物組合物，其中所說(shuō)的外流泵抑制劑具有結(jié)構(gòu)1-4中任何一種結(jié)構(gòu)
其中R＝烷基(C1-C4)，氟烷基(C1-C4)，過(guò)氟烷基(C1-C4)，烷氧基(C1-C4)，烷硫基(C1-C4)，鹵素(Br，Cl，F(xiàn)，或I)，芳基(C6-C10)，單取代芳基(C6-C10)[任選地用烷基(C1-C4)，烷氧基(C1-C4)，烷硫基(C1-C4)，鹵素(Br，Cl，F(xiàn)，I)，氨基，單取代氨基[任選地用烷基(C1-C4)取代]，雙取代氨基[任選地用烷基(C1-C4)任意組合的取代]，或羥基取代]，雙取代芳基(C6-C10)[任選地用烷基(C1-C4)，烷氧基(C1-C4)，烷硫基(C1-C4)，鹵素(Br，Cl，F(xiàn)，I)，和氨基的任意組合取代]，2-(或3-)-噻吩基，2-(或3-)-呋喃基，或2-(3-或4-)-吡啶基。W＝H，NH2，單取代氨基[任選地用烷基(C1-C4)取代]，雙取代氨基[任選地用烷基(C1-C4)的任意組合取代]，氮雜環(huán)[如N-嗎啉基，N-哌嗪基，N-吡咯烷基，N-咪唑基，N-吡咯基，N-吡唑基，N-三唑基，或N-四唑基]，鹵素(Br，Cl，F(xiàn)，I)，羥基，烷氧基(C1-C4)，烷硫基(C1-C4)，R1＝(CH2)nNRaRb，(CH2)nNRbRc，(CH2)nNHC＝(NRa)NRbRc，(CH2)nSNHC＝(NRa)NRbRc，(CH2)nC＝(NRa)NRbRc，(CH2)nN＝CNRbRc，(n＝2-4)；Ra(Rb或Rc)＝H，烷氧基(C1-C4)，芳基(C6)，取代芳基，苯基，取代苯基[任選地用烷基(C1-C4)，烷氧基(C1-C4)，烷硫基(C1-C4)，鹵素(Br，Cl，F(xiàn)或I)，或氨基取代]，或者Ra+Rb＝(CH2)2-3或-CH＝CH-，X＝芳基(C6-C10)，-(CH2)0-2芳基(C6-C10)，取代芳基(C6-C10)[任選地用烷基(C1-C4)，烷氧基(C1-C4)，烷硫基(C1-C4)，鹵素(Br，Cl，F(xiàn)或I)，或氨基取代]，取代-(CH2)0-2芳基(C6-C10)[用烷基(C1-C4)，烷氧基(C1-C4)，烷硫基(C1-C4)，鹵素(Br，Cl，F(xiàn)或I)，或氨基在芳基部位取代]，2-(或3-)-噻吩基，2-(或3-)-呋喃基，2-(3-或4-)-吡啶基，苯并呋喃基[在苯并呋喃環(huán)的任意位置]，苯并噻吩基[在苯并噻吩環(huán)的任意位置]。其中存在非對(duì)稱中心，其絕對(duì)立體化學(xué)性質(zhì)可能是R或S-構(gòu)型，或?yàn)橥庀旌衔铩?br> 62.權(quán)利要求61的藥物組合物，其中所說(shuō)的外流泵抑制劑具有結(jié)構(gòu)1，其中R＝烷基(C1-C4)，氟烷基(C1-C4)，過(guò)氟烷基(C1-C4)，烷氧基(C1-C4)，烷硫基(C1-C4)，鹵素(Br，Cl，F(xiàn)，或I)，芳基(C6-C10)，單取代芳基(C6-C10)[用烷基(C1-C4)，烷氧基(C1-C4)，烷硫基(C1-C4)，鹵素(Br，Cl，F(xiàn)或I)，氨基，單取代氨基[任選地用烷基(C1-C4)取代]，雙取代氨基[任選地用烷基(C1-C4)的任意組合取代]，或羥基任意取代]，雙取代芳基(C6-C10)[任選地用烷基(C1-C4)，烷氧基(C1-C4)，烷硫基(C1-C4)，鹵素(Br，Cl，F(xiàn)或I)和氨基的任意組合取代]，2-(或3-)-噻吩基，2-(或3-)-呋喃基，或2-(3-或4-)-吡啶基。W＝H，NH2，單取代氨基[任選地用烷基(C1-C4)取代]，雙取代氨基[任選地用烷基(C1-C4)的任意組合取代]，氮雜環(huán)[如N-嗎啉基，N-哌嗪基，N-吡咯烷基，N-咪唑基，N-吡咯基，N-吡唑基，N-三唑基，或N-四唑基]，鹵素(Br，Cl，F(xiàn)，I)，羥基，烷氧基(C1-C4)，烷硫基(C1-C4)，R1＝(CH2)nNRaRb，(CH2)nNRbRc，(CH2)nNHC＝(NRa)NRbRc，(CH2)nSNHC＝(NRa)NRbRc，(CH2)nC＝(NRa)NRbRc，(CH2)nN＝CNRbRc，(n＝2-4)，Ra(Rb或Rc)＝H，烷基(C1-C4)，芳基(C6)，取代芳基，苯基，取代苯基[任選地用烷基(C1-C4)，烷氧基(C1-C4)，烷硫基(C1-C4)，鹵素(Br，Cl，F(xiàn)，或I)，或氨基取代]，或者Ra+Rb＝(CH2)2-3或-CH＝CH-，X＝芳基(C6-C10)，-(CH2)0-2芳基(C6-C10)，取代芳基(C6-C10)[任選地用烷基(C1-C4)，烷氧基(C1-C4)，烷硫基(C1-C4)，鹵素(Br，Cl，F(xiàn)或I)，或氨基取代]，取代-(CH2)0-2芳基(C6-C10)[用烷基(C1-C4)，烷氧基(C1-C4)，烷硫基(C1-C4)，鹵素(Br，Cl，f或I)，或氨基在芳基部位取代]，2-(或3-)-噻吩基，2-(或3-)-呋喃基，2-(3-或4-)-吡啶基，苯并呋喃基[在苯并呋喃環(huán)的任何位置]，苯并噻吩基[在苯并噻吩環(huán)的任何位置]。其中存在非對(duì)稱中心，其絕對(duì)立體化學(xué)性質(zhì)可能是R或S-構(gòu)型，或?yàn)橥庀旌衔铩?br> 63.權(quán)利要求62的藥物組合物，其中R＝烷基(C1-C4)，氟烷基(C1-C4)，過(guò)氟烷基(C1-C4)，芳基(C6-C10)，單取代芳基(C6-C10)[任選地用烷基(C1-C4)，烷氧基(C1-C4)，烷硫基(C1-C4)，鹵素(Br，Cl，F(xiàn)或I)，氨基，單取代氨基[任選地用烷基(C1-C4)取代]，雙取代氨基[任選地用烷基(C1-C4)的任意組合取代]，或羥基取代]，雙取代芳基(C6-C10)[任選地用烷基(C1-C4)，烷氧基(C1-C4)，烷硫基(C1-C4)，鹵素(Br，Cl，F(xiàn)或I)和氨基的任意組合取代]，2-(或3-)-噻吩基，2-(或3-)-呋喃基，或2-(3-或4-)-吡啶基。W＝H，NH2，單取代氨基[任選地用烷基(C1-C4)取代]，雙取代氨基[任選地用烷基(C1-C4)的任意組合取代]，氮雜環(huán)[如N-嗎啉基，N-哌嗪基，N-吡咯烷基，N-咪唑基，N-吡咯基，N-吡唑基，N-三唑基，或N-四唑基]，鹵素(Br，Cl，F(xiàn)，I)，羥基，烷氧基(C1-C4)，烷硫基(C1-C4)，R1＝(CH2)nNRbRc，(CH2)nNHC＝(NRa)NRbRc，(CH2)nSNHC＝(NRa)NRbRc，(CH2)nC＝(NRa)NRbRc，(CH2)nN＝CNRbRc，(n＝2，-4)，Ra(Rb或Rc)＝H，烷基(C1-C4)，芳基(C6)，取代芳基，苯基，取代苯基[任選地用烷基(C1-C4)，烷氧基(C1-C4)，烷硫基(C1-C4)，鹵素(Br，Cl，F(xiàn)或I)，或氨基取代]或者Ra+Rb＝(CH2)2-3或-CH＝CH-，X＝芳基(C6-C10)，-(CH2)0-2芳基(C6-C10)，取代芳基(C6-C10)[任選地用烷基(C1-C4)，烷氧基(C1-C4)，烷硫基(C1-C4)，鹵素(Br，Cl，F(xiàn)或I)，或氨基取代]，取代-(CH2)0-2芳基(C6-C10)[用烷基(C1-C4)，烷氧基(C1-C4)，烷硫基(C1-C4)，鹵素(Br，Cl，F(xiàn)或I)，或氨基在芳基部位取代]，2-(或3-)-噻吩基，2-(或3-)-呋喃基，2-(3-或4-)-吡啶基，苯并呋喃基[在苯并呋喃環(huán)的任何位置]，苯并噻吩基[在苯并噻吩環(huán)的任何位置]。其中存在非對(duì)稱中心，其絕對(duì)立體化學(xué)性質(zhì)可能是R或S構(gòu)型，或?yàn)橥庀旌衔铩?br> 64.權(quán)利要求63的藥物組合物，其中R＝烷基(C1-C4)，氟烷基(C1-C4)，芳基(C6-C10)，單取代芳基(C6-C10)[任選地用烷基(C1-C4)，烷氧基(C1-C4)，烷硫基(C1-C4)，氨基，單取代氨基[任選地用烷基(C1-C4)取代]，雙取代氨基[任選地用烷基(C1-C4)的任意組合取代]取代]，2-(或3-)-噻吩基，2-(或3-)-呋喃基，或2-(3-或4-)-吡啶基。W＝H，NH2，單取代氨基[任選地用烷基(C1-C4)取代]，雙取代氨基[任選地用烷基(C1-C4)的任意組合取代]，氮雜環(huán)[如N-嗎啉基，N-哌嗪基，N-吡咯烷基，N-咪唑基，N-吡咯基，N-吡唑基，N-三唑基，或N-四唑基]，R1＝(CH2)nNRbRc，(CH2)nNHC＝(NRa)NRbRc，(CH2)nC＝(NRa)NRbRc，(CH2)nN＝CNRbRc，(n＝2-4)；Ra(Rb或Rc)＝H，烷基(C1-C4)，芳基(C6)，或者Ra+Rb＝(CH2)2-3或-CH＝CH-，X＝芳基(C6-C10)，-(CH2)0-2芳基(C6-C10)，取代芳基(C6-C10)[任選地用烷基(C1-C4)，烷氧基(C1-C4)，烷硫基(C1-C4)，鹵素(Br，Cl，f或I)，或氨基取代]，取代-(CH2)0-2芳基(C6-C10)[任選地用烷基(C1-C4)，烷氧基(C1-C4)，烷硫基(C1-C4)，鹵素(Br，Cl，F(xiàn)或I)，或氨基取代]，2-(或3-)-噻吩基，2-(或3-)-呋喃基，或2-(3-或4-)-吡啶基，其中存在非對(duì)稱中心，其絕對(duì)立體化學(xué)性質(zhì)可能為R或S構(gòu)型，或?yàn)橥庀旌衔铩?br> 65.權(quán)利要求61的藥物組合物，其中所說(shuō)的外流泵抑制劑具有結(jié)構(gòu)2，其中R＝芳基(C6-C10)，單取代芳基(C6-C10)[任選地用烷基(C1-C4)，烷氧基(C1-C4)，烷硫基(C1-C4)，鹵素(Br，Cl，F(xiàn)或I)，氨基，單取代氨基[任選地用烷基(C1-C4)取代]，雙取代氨基[任選地用烷基(C1-C4)的任意組合取代]，或羥基取代]，2-(或3-)-噻吩基，2-(或3-)-呋喃基，或2-(3-或4-)-吡啶基，R1＝(CH2)nNRbRc，(CH2)nNHC＝(NRa)NRbRc，(CH2)nSNHC＝(NRa)NRbRc，(CH2)nC＝(NRa)NRbRc，(CH2)nN＝CNRbRc，(n＝2-4)，Ra(Rb或Rc)＝H，烷基(C1-C4)，芳基(C6)，取代芳基，苯基，取代苯基[任選地用烷基(C1-C4)，烷氧基(C1-C4)，烷硫基(C1-C4)，鹵素(Br，Cl，F(xiàn)或I)，或氨基取代]或者Ra+Rb＝(CH2)2-3或-CH＝CH-，X＝芳基(C6-C10)，-(CH2)0-2芳基(C6-C10)，取代芳基(C6-C10)[任選地用烷基(C1-C4)，烷氧基(C1-C4)，烷硫基(C1-C4)，鹵素(Br，Cl，F(xiàn)或I)，或氨基取代]，取代-(CH2)0-2芳基(C6-C10)[用烷基(C1-C4)，烷氧基(C1-C4)，烷硫基(C1-C4)，鹵素(Br，Cl，F(xiàn)或I)，或氨基在芳基環(huán)上取代]，2-(或3-)-噻吩基，2-(或3-)-呋喃基，2-(3-或4-)-吡啶基，苯并呋喃基[在苯并呋喃環(huán)任何位置上]，苯并噻吩基[在苯并噻吩環(huán)的任何位置上]。其中存在非對(duì)稱中心，其絕對(duì)立體化學(xué)性質(zhì)可能為R或S-構(gòu)型，或?yàn)橥庀旌衔铩?br> 66.權(quán)利要求65的藥物組合物，其中R＝芳基(C6-C10)，單取代芳基(C6-C10)[任選地用烷基(C1-C4)，烷氧基(C1-C4)，烷硫基(C1-C4)，鹵素(Br，Cl，F(xiàn)或I)，氨基，單取代氨基[任選地用烷基(C1-C4)，取代]，雙取代氨基[任選地用烷基(C1-C4)的任意組合取代]，或羥基取代]，2-(或3-)-噻吩基，2-(或3-)-呋喃基，或2-(3-或4-)-吡啶基。R1＝(CH2)nNRbRc，(CH2)nNHC＝(NRa)NRbRc，(CH2)nSNHC＝(NRa)NRbRc，(CH2)nC＝(NRa)NRbRc，(CH2)nN＝CNRbRc，(n＝2-4)，Ra(Rb或Rc)＝H，烷基(C1-C4)，芳基(C6)，取代芳基，苯基，取代苯基[任選地用烷基(C1-C4)，烷氧基(C1-C4)，烷硫基(C1-C4)，鹵素(Br，Cl，F(xiàn)或I)，或氨基取代]或者Ra+Rb＝(CH2)2-3或-CH＝CH-，X＝芳基(C6-C10)，-(CH2)0-2芳基(C6-C10)，取代芳基(C6-C10)[任選地用烷基(C1-C4)，烷氧基(C1-C4)，烷硫基(C1-C4)，鹵素(Br，Cl，F(xiàn)或I)，或氨基取代]，取代-(CH2)0-2芳基(C6-C10)[任選地用烷基(C1-C4)，烷氧基(C1-C4)，烷硫基(C1-C4)，鹵素(Br，Cl，F(xiàn)或I)，或氨基取代]，2-(或3-)-噻吩基，2-(或3-)-呋喃基，2-(3-或4-)-吡啶基，苯并呋喃[在苯并呋喃環(huán)的任何位置上]，苯并噻吩[在苯并噻吩環(huán)的任何位置上]。其中存在非對(duì)稱中心，其絕對(duì)立體化學(xué)性質(zhì)可能為R或S-構(gòu)型，或?yàn)橥庀旌衔铩?br> 67.權(quán)利要求66的藥物組合物，其中R＝芳基(C6-C10)，單取代芳基(C6-C10)[任選地用烷基(C1-C4)，烷氧基(C1-C4)，烷硫基(C1-C4)，氨基，單取代氨基[任選烷基(C1-C4)的取代]，雙取代氨基[任選地用烷基(C1-C4)的任意組合取代]，或羥基取代]，2-(或3-)-噻吩基，2-(或3-)-呋喃基，或2-(3-或4-)-吡啶基。R1＝(CH2)nNRbRc，(CH2)nNHC＝(NRa)NRbRc，(CH2)nC＝(NRa)NRbRc，(CH2)nN＝CNRbRc，(n＝2-4)，Ra(Rb或Rc)＝H，烷基(C1-C4)，芳基(C6)，或者Ra+Rb＝(CH2)2-3或-CH＝CH-，X＝芳基(C6-C10)，-(CH2)0-2芳基(C6-C10)，取代芳基(C6-C10)[任選地用烷基(C1-C4)，烷氧基(C1-C4)，烷硫基(C1-C4)，鹵素(Br，Cl，F(xiàn)或I)，或氨基取代]，取代-(CH2)0-2芳基(C6-C10)[用烷基(C1-C4)，烷氧基(C1-C4)，烷硫基(C1-C4)，鹵素(Br，Cl，F(xiàn)或I)，或氨基在芳基部位取代]，2-(或3-)-噻吩基，2-(或3-)-呋喃基，2-(3-或4-)-吡啶基，其中存在非對(duì)稱中心，其絕對(duì)立體化學(xué)性質(zhì)可能為R或S-構(gòu)型，或?yàn)橥庀旌衔铩?br> 68.權(quán)利要求61的藥物組合物，其中所說(shuō)的外流泵抑制劑具有結(jié)構(gòu)3其中R＝烷基(C1-C4)，芳基(C6-C10)，單取代芳基(C6-C10)[任選地用烷基(C1-C4)，烷氧基(C1-C4)，烷硫基(C1-C4)，鹵素(Br，Cl，F(xiàn)或I)，氨基，單取代氨基[任選地用烷基(C1-C4)取代]，雙取代氨基[任選地用烷基的任意組合取代]取代]，雙取代芳基(C6-C10)[任選地用烷基(C1-C4)，烷氧基(C1-C4)，烷硫基(C1-C4)，鹵素(Br，Cl，F(xiàn)或I)，和氨基的任意組合取代]，2-(或3-)-噻吩基，2-(或3-)-呋喃基，或2-(3-或4-)-吡啶基。W＝H，NH2，單取代氨基[任選地用烷基(C1-C4)取代]，雙取代氨基[任選地用烷基(C1-C4)的任意組合取代]，氮雜環(huán)[如N-嗎啉基，N-哌嗪基，N-吡咯烷基，N-咪唑基，N-吡咯基，N-吡唑基，N-三唑基，或N-四唑基]，R1＝(CH2)nNRbRc，(CH2)nNHC＝(NRa)NRbRc，(CH2)nC＝(NRa)NRbRc，(CH2)nN＝CNRbRc，(n＝2-4)，Ra(Rb或Rc)＝H，烷基(C1-C4)，芳基(C6)，取代芳基，苯基，取代苯基[任選地用烷基(C1-C4)，烷氧基(C1-C4)，烷硫基(C1-C4)，鹵素(Br，Cl，F(xiàn)或I)取代]或者Ra+Rb＝(CH2)2-3或-CH＝CH-，X＝芳基(C6-C10)，-(CH2)0-2芳基(C6-C10)，取代芳基(C6-C10)[任選地用烷基(C1-C4)，烷氧基(C1-C4)，烷硫基(C1-C4)，鹵素(Br，Cl，F(xiàn)或I)，或氨基取代]，取代-(CH2)0-2芳基(C6-C10)[用烷基(C1-C4)，烷氧基(C1-C4)，烷硫基(C1-C4)，鹵素(Br，Cl，F(xiàn)或I)，或氨基在芳基部位取代]，2-(或3-)-噻吩基，2-(或3-)-呋喃基，2-(3-或4-)-吡啶基，其中存在非對(duì)稱中心，其絕對(duì)立體化學(xué)性質(zhì)可能為R或S-構(gòu)型，或?yàn)橥庀旌衔铩?br> 69.權(quán)利要求68的藥物組合物，其中R＝烷基(C1-C4)，芳基(C6-C10)，單取代芳基(C6-C10)[任選地用烷基(C1-C4)，烷氧基(C1-C4)，烷硫基(C1-C4)，鹵素(Br，Cl，F(xiàn)或I)，氨基取代]，雙取代芳基(C6-C10)[任選地用烷基(C1-C4)，烷氧基(C1-C4)，烷硫基(C1-C4)，鹵素(Br，Cl，F(xiàn)或I)，氨基的任意組合取代]，2-(或3-)-噻吩基，2-(或3-)-呋喃基，或2-(3-或4-)-吡啶基。W＝H，NH2，單取代氨基[任選地用烷基(C1-C4)取代]，雙取代氨基[任選地用烷基(C1-C4)的任意組合取代]，氮雜環(huán)[如N-嗎啉基，N-哌嗪基，N-吡咯烷基，N-咪唑基，N-吡咯基，N-吡唑基，N-三唑基，或N-四唑基]，R1＝(CH2)nNRbRc，(CH2)nNHC＝(NRa)NRbRc，(CH2)nC＝(NRa)NRbRc，(CH2)nN＝CNRbRc，(n＝2-4)，Ra(Rb或Rc)＝H，烷基(C1-C4)，芳基(C6)，取代芳基，苯基，取代苯基[任選地用烷基(C1-C4)，烷氧基(C1-C4)，烷硫基(C1-C4)取代]或者Ra+Rb＝(CH2)2-3或-CH＝CH-，X＝芳基(C6-C10)，-(CH2)0-2芳基(C6-C10)，取代芳基(C6-C10)[任選地用烷基(C1-C4)，烷氧基(C1-C4)，烷硫基(C1-C4)，鹵素(Br，Cl，F(xiàn)或I)，或氨基取代]，取代-(CH2)0-2芳基(C6-C10)[用烷基(C1-C4)，烷氧基(C1-C4)，烷硫基(C1-C4)在芳基部位取代]，2-(或3-)-噻吩基，2-(或3-)-呋喃基，2-(3-或4-)-吡啶基，其中存在非對(duì)稱中心，其絕對(duì)立體化學(xué)性質(zhì)可能為R或S-構(gòu)型，或?yàn)橥庀旌衔铩?br> 70.權(quán)利要求69的藥物組合物，其中R＝烷基(C1-C4)，芳基(C6-C10)，2-(或3-)-噻吩基，2-(或3-)-呋喃基，或2-(3-或4-)-吡啶基，W＝H，NH2，單取代氨基[任選地用烷基(C1-C4)取代]，雙取代氨基[任選地用烷基(C1-C4)的任意組合取代]，氮雜環(huán)[如N-嗎啉基，N-哌嗪基，N-吡咯烷基，N-咪唑基，N-吡咯基，N-吡唑基，N-三唑基]，R1＝(CH2)nNRbRc，(CH2)nNHC＝(NRa)NRbRc，(CH2)nC＝(NRa)NRbRc，(CH2)nN＝CNRbRc，(n＝2-4)，Ra(Rb或Rc)＝H，烷基(C1-C4)，芳基(C6)，取代芳基，苯基，或者Ra+Rb＝(CH2)2-3或-CH＝CH-，X＝芳基(C6-C10)，-(CH2)0-2芳基(C6-C10)，取代芳基(C6-C10)[任選地用烷基(C1-C4)，烷氧基(C1-C4)，烷硫基(C1-C4)取代]，2-(或3-)-噻吩基，2-(或3-)-呋喃基，2-(3-或4-)-吡啶基，其中存在非對(duì)稱中心，其絕對(duì)立體化學(xué)性質(zhì)可能為R或S-構(gòu)型，或?yàn)橥庀旌衔铩?br> 71.權(quán)利要求61的藥物組合物，其中所說(shuō)的外流泵抑制劑具有結(jié)構(gòu)4其中R＝烷基(C1-C4)，芳基(C6-C10)，單取代芳基(C6-C10)[任選地用烷基(C1-C4)，烷氧基(C1-C4)，烷硫基(C1-C4)，鹵素(Br，Cl，F(xiàn)或I)，氨基，單取代氨基[任選地用烷基(C1-C4)取代]，雙取代氨基[任選地用烷基(C1-C4)的任意組合取代]取代]，雙取代芳基(C6-C10)[任選地用烷基(C1-C4)，烷氧基(C1-C4)，烷硫基(C1-C4)，鹵素(Br，Cl，F(xiàn)或I)，和氨基的任意組合取代]，2-(或3-)-噻吩基，2-(或3-)-呋喃基，或2-(3-或4-)-吡啶基。R1＝(CH2)nNRbRc，(CH2)nNHC＝(NRa)NRbRc，(CH2)nC＝(NRa)NRbRc，(CH2)nN＝CNRbRc，(n＝2-4)，Ra(Rb或Rc)＝H，烷基(C1-C4)，芳基(C6)，取代芳基，苯基，取代苯基[任選地用烷基(C1-C4)，烷氧基(C1-C4)，烷硫基(C1-C4)，鹵素(Br，Cl，F(xiàn)或I)取代]，或者Ra+Rb＝(CH2)2-3或-CH＝CH-，X＝芳基(C6-C10)，-(CH2)0-2芳基(C6-C10)，取代芳基(C6-C10)[任選地用烷基(C1-C4)，烷氧基(C1-C4)，烷硫基(C1-C4)，鹵素(Br，Cl，F(xiàn)或I)，或氨基取代]，取代(CH2)0-2-芳基(C6-C10)[用烷基(C1-C4)，烷氧基(C1-C4)，烷硫基(C1-C4)，鹵素(Br，Cl，F(xiàn)或I)，或氨基在芳基部位取代]，2-(或3-)-噻吩基，2-(或3-)-呋喃基，2-(3-或4-)-吡啶基，其中存在非對(duì)稱中心，其絕對(duì)立體化學(xué)性質(zhì)可能為R或S-構(gòu)型，或?yàn)橥庀旌衔铩?br> 72.權(quán)利要求71的藥物組合物，其中R＝烷基(C1-C4)，芳基(C6-C10)，單取代芳基(C6-C10)[任選地用烷基(C1-C4)，烷氧基(C1-C4)，烷硫基(C1-C4)，鹵素(Br，Cl，F(xiàn)或I)，氨基取代]，雙取代芳基(C6-C10)[任選地用烷基(C1-C4)，烷氧基(C1-C4)，烷硫基(C1-C4)，鹵素(Br，Cl，F(xiàn)或I)，氨基的任意組合取代]，2-(或3-)-噻吩基，2-(或3-)-呋喃基，或2-(3-或4-)-吡啶基，R1＝(CH2)nNRbRc，(CH2)nNHC＝(NRa)NRbRc，(CH2)nC＝(NRa)NRbRc，(CH2)nN＝CNRbRc，(n＝2-4)，Ra(Rb或Rc)＝H，烷基(C1-C4)，芳基(C6)，取代芳基，苯基，取代苯基[任選地用烷基(C1-C4)，烷氧基(C1-C4)，烷硫基(C1-C4)取代]，或者Ra+Rb＝(CH2)2-3或-CH＝CH-，X＝芳基(C6-C10)，-(CH2)0-2芳基(C6-C10)，取代芳基(C6-C10)[任選地用烷基(C1-C4)，烷氧基(C1-C4)，烷硫基(C1-C4)，鹵素(Br，Cl，F(xiàn)或I)，或氨基取代]，取代-(CH2)0-2芳基(C6-C10)[用烷基(C1-C4)，烷氧基(C1-C4)，烷硫基(C1-C4)在芳基部位取代]，2-(或3-)-噻吩基，2-(或3-)-呋喃基，2-(3-或4-)-吡啶基，其中存在非對(duì)稱中心，其絕對(duì)立體化學(xué)性質(zhì)可能為R或S-構(gòu)型，或?yàn)橥庀旌衔铩?br> 73.權(quán)利要求72的藥物組合物，其中R＝烷基(C1-C4)，芳基(C6-C10)，2-(或3-)-噻吩基，2-(或3-)-呋喃基，或2-(3-或4-)-吡啶基。R1＝(CH2)nNRbRc，(CH2)nNHC＝(NRa)NRbRc，(CH2)nC＝(NRa)NRbRc，(CH2)nN＝CNRbRc，(n＝2-4)，Ra(Rb或Rc)＝H，烷基(C1-C4)，芳基(C6)，取代芳基，苯基，或者Ra+Rb＝(CH2)2-3或-CH＝CH-，X＝芳基(C6-C10)，-(CH2)0-2芳基(C6-C10)，取代芳基(C6-C10)[任選地用烷基(C1-C4)，烷氧基(C1-C4)，烷硫基(C1-C4)取代]，2-(或-3-)-噻吩基，2-(或-3-)-呋喃基，2-(3-或4-)-吡啶基。其中存在非對(duì)稱中心，其絕對(duì)立體化學(xué)性質(zhì)可能為R或S-構(gòu)型，或?yàn)橥庀旌衔铩?br> 74.一種含抗菌劑、外流泵抑制劑和藥用載體的抗菌制劑。
75.一種抑制表達(dá)非四環(huán)素特異性外流泵的細(xì)菌生長(zhǎng)的方法，包括在低于細(xì)菌MIC的濃度的抗菌劑存在下，將該細(xì)菌與非四環(huán)素特異性外流泵抑制劑接觸，
76.一種抑制細(xì)菌生長(zhǎng)的方法，包括將細(xì)菌與外流泵抑制劑接觸，其中該抑制劑降低在該細(xì)菌中正常表達(dá)的某一外流泵組分的表達(dá)。
77.一種減少一個(gè)菌株群體的方法，包括將該群體與外流泵抑制劑接觸，其中該抑制劑抑制在該細(xì)菌群體中表達(dá)的外流泵的某一組分，該組分對(duì)表達(dá)該外流泵的細(xì)菌生長(zhǎng)是必需的。
78.權(quán)利要求77的方法，其中該必需組分是外流泵的質(zhì)膜成分。
79.一種促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)的方法，包括給予該動(dòng)物外流泵抑制劑，其中該外流泵抑制劑抑制該動(dòng)物中細(xì)菌株表達(dá)的外流泵，和其中該外流泵抑制劑降低該動(dòng)物中細(xì)菌株的生長(zhǎng)。
全文摘要
本發(fā)明提供了篩選包括外排抗生素的外流泵在內(nèi)的微生物外流泵抑制劑的方法。該篩選方法的基礎(chǔ)是,當(dāng)細(xì)菌細(xì)胞與某種外流泵抑制劑接觸后,某種化合物,例如抗生素或染料在細(xì)胞內(nèi)的濃度將提高。另外,本發(fā)明還提供了含這些外流泵抑制劑的藥用組合物,以及用這些組合物治療微生物感染的方法。
文檔編號(hào)A61K38/05GK1188512SQ96194896
公開(kāi)日1998年7月22日 申請(qǐng)日期1996年4月19日 優(yōu)先權(quán)日1996年4月19日
發(fā)明者S·查伯爾蘭德, S·J·赫克爾, V·J·李, J·特萊斯 申請(qǐng)人:邁克羅賽藥品公司