專利名稱：含有吸附于磷酸鋁上的多糖綴合抗原的疫苗組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及含有與載體蛋白相連的綴合多糖抗原的新的疫苗制劑，本發(fā)明具體涉及抗原吸附于磷酸鋁上的預(yù)防嗜血乙型流感病毒(Hib)感染的疫苗制劑，本發(fā)明也涉及多價疫苗，即用于改善或治療一種以上疾病狀態(tài)的疫苗，本發(fā)明也涉及這種疫苗的生產(chǎn)及其在醫(yī)藥上的應(yīng)用。
現(xiàn)有技術(shù)中已知利用多糖的疫苗，例如用于預(yù)防嗜血乙型流感病毒(Hib)感染的疫苗是以與載體蛋白綴合的莢膜多糖(PRP)為基礎(chǔ)的。該多糖是核糖、核糖醇和磷酸的聚合物，這些疫苗典型地以簡單的(即沒有佐劑)制劑形式存在，盡管在一種情況下，(由Merck生產(chǎn)的Pedvax Hib)利用了含有氫氧化鋁的稀釋劑以重建凍干的綴合物。載體蛋白典型地是白喉或破傷風類毒素或腦膜炎奈瑟氏球菌的外膜蛋白。這種綴合疫苗抗原的例子公開于US 4 365 170，US 4 673 574，EP 208 375，EP 477508和EP 161 188。
可以將這種綴合疫苗與其他抗原或疫苗同時施用，這涉及到多次注射，與多次注射相關(guān)的問題包括更復(fù)雜的施用方法和大的總注射體積。當疫苗給嬰兒使用時，這是一個十分嚴重的問題。
因此建議生產(chǎn)聯(lián)合疫苗，一個眾所周知的聯(lián)合疫苗提供抗白喉、破傷風和百日咳芽胞桿菌(B.pertussis)感染的保護，此疫苗含有整個細胞或無細胞的百日咳成分，所述成分典型地由兩或三種抗原組成(去毒的PT，F(xiàn)HA和經(jīng)常但不是全部為69KDa)，盡管在某些情況下，其他百日咳芽胞桿菌(B.pertussis)抗原也可存在并使白喉和破傷風毒素類毒素化。這種疫苗經(jīng)常指的是DTPw或DTPa，也可以在這種聯(lián)合疫苗中加入合乎需要的其他抗原以預(yù)防如乙型肝炎或脊髓灰質(zhì)炎的疾病。
可以在此聯(lián)合中加入多糖綴合疫苗，然而我們已發(fā)現(xiàn)成分的簡單混合會導(dǎo)致降低對多糖成分的抗體滴度。
本發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)如果將綴合抗原吸附于磷酸鋁上即可抑制這種降低，相反，如果抗原被吸附于氫氧化鋁上，對多糖成分的抗體滴度徹底降低。
因此本發(fā)明提供了含有吸附于磷酸鋁上的多糖綴合抗原的疫苗組合物，此抗原優(yōu)選為得自與載體蛋白綴合的Hib的莢膜多糖(PRP)。
載體蛋白優(yōu)選為白喉或破傷風類毒素，白喉Crm197蛋白或如N.enigitidis的細菌的外膜蛋白。
通過任何已知的偶聯(lián)技術(shù)都可制備多糖綴合物，例如可通過硫酯鍵偶聯(lián)多糖，此綴合法依靠用1-氰-4-二甲基氨基吡啶四氟硼酸鹽(CDAP)激活多糖以形成氰酸酯，因此被激活的多糖可直接或通過間隔基與載體蛋白上的氨基基團偶聯(lián)，優(yōu)選使氰酸酯與己烷二胺偶聯(lián)，使用涉及硫酯鍵形成的異連接化學(heteroligation)使氨基-衍生化的多糖與載體蛋白綴合。這種綴合物描述于PCT公開申請WO93/15760 Uniformed Services University。
也可通過US 4365170(Jennings)和US 4673574(Anderson)中描述的直接還原氨基化法制備綴合物，其他方法描述于EP-0-161-188，EP-208375和EP-0-477508中。
另一個方法涉及通過碳二亞胺縮合使被溴化氰激活又被己二酸酰肼(ADH)衍生化的多糖與蛋白載體偶聯(lián)，這種綴合描述于Chu C.等感染免疫(Infec Immurnity)，1983 245 256。
在本發(fā)明優(yōu)選的實施方案中，PRP多糖與載體蛋白的比例由典型的1∶3降至1∶0.3-1∶2，這種低比例的綴合物是有利的，因為即使在沒有佐劑的狀態(tài)下，它們也不會遇到干擾的問題。
在本發(fā)明優(yōu)選的實施方案中，該制劑優(yōu)選含有至少一種可提供抗一種或多種選自下列病原的保護作用的抗原的其他成分甲肝病毒(HAV)，白喉，破傷風，百日咳，乙肝和脊髓灰質(zhì)炎病毒。
在本發(fā)明范圍內(nèi)的特殊的組合疫苗包括DTPa(白喉-破傷風-無細胞的百日咳)-Hib聯(lián)合疫苗制劑，Hib-乙型肝炎疫苗制劑，DTPa-Hib-乙型肝炎疫苗制劑和IPV(滅活的脊髓灰質(zhì)炎疫苗)-DTPa-Hib-乙型肝炎疫苗制劑。
上述聯(lián)合疫苗可任選包括具有抗甲型肝炎的保護作用的成分。
用于這種疫苗的適當成分已經(jīng)可以商購，可從世界衛(wèi)生組織得到詳情。例如，IPV成分可以是Salk滅活脊髓灰質(zhì)炎疫苗，白喉、破傷風和百日咳疫苗可含有無細胞的產(chǎn)物，如Infanrix DTPa(SmithKline Beecham Biologicals)，提供抗甲型肝炎的保護作用的成分優(yōu)選為已知為‘Havrix’(SmithKlineBeecham Biologicals)的產(chǎn)物，它是得自HAV的HM-175株的被殺死的減毒疫苗[見滅活甲肝候選疫苗(‘Inactivated Candidate Vaccines for Hepatitis A’)，F(xiàn).EAndre，AHepburn and E.D Hondt，醫(yī)學病毒學進展(Prog.Med.Virol).Vol 37，page 72-95(1990)and‘Havrix’產(chǎn)品專題(the product monograph‘Havrix’published by SmithKline Beecham Biologicals)(1991)]。乙型肝炎病毒成分可含有‘Engerix-B’的‘S’抗原。
根據(jù)本發(fā)明的有利的嗜血乙型流感病毒或聯(lián)合疫苗是小兒科疫苗。
疫苗的制備一般描述于疫苗設(shè)計-亞單元和綴合物方法(VaccineDesign-The Subunit and adjuvant approach)Ed Powell and Newman，Pellum Press.包入脂質(zhì)體囊描述于例如Fullerton的美國專利4,235,877。蛋白質(zhì)與大分子的綴合公開于如Likhite的美國專利4,372,945和Armor等人的美國專利4,474,757。
每一疫苗劑量中綴合抗原的量選定為在典型的疫苗中可誘導(dǎo)免疫保護性應(yīng)答而沒有顯著的，有害的副作用的量，這種量依據(jù)所用特殊免疫原的不同而有所不同，一般希望每一劑量含有1-1000ug總免疫原，優(yōu)選2-100ug，最優(yōu)選4-40ug。可通過涉及觀察抗體滴度和受試者的其他反應(yīng)的一般性研究確定對于特殊疫苗而言的最適量，受試者可以約4周為間隔接受一至兩次加強注射。
根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了含有吸附于磷酸鋁上的綴合抗原的疫苗的生產(chǎn)方法，所述吸附優(yōu)選在pH5-6之間進行，優(yōu)選在約5.4時進行。在一個實施方案中，將疫苗在放置超過24小時后冷凍干燥，另外本發(fā)明的疫苗可以液體形式與其他抗原聯(lián)合。
本發(fā)明進一步提供了這種疫苗的首次醫(yī)學應(yīng)用。
本發(fā)明的另一個實施方案提供了預(yù)防或改善嗜血乙型流感病毒感染的方法，此方法包括施用無毒的有效量的本發(fā)明疫苗。
下列實施例將闡明本發(fā)明。實施例1含有吸附于磷酸鋁上的與破傷風類毒素綴合的HiB多糖的疫苗制劑合成嗜血乙型流感病毒莢膜多糖(PRP)破傷風類毒素(TT)綴合物1.a溴化氰偶聯(lián)通過在NIH下開展的偶聯(lián)化學(Chu C.et al(1983)，進一步研究嗜血乙型流感病毒和6A型肺炎球菌綴合多糖蛋白的免疫原性(further studies on theimmunogenicity of Haemophilus influenzae type b and pneumococcal type 6Apolysaccharide protein conjugates)。感染免疫(infec Immunity)，245-256)進行PRP和TT的共價偶聯(lián)，在控制的條件下，用溴化氰激活并用己二酸酰肼間隔基衍生化PRP。
衍生化后，通過滲濾純化被激活的多糖(PRP-AH)，通過碳二亞胺縮合使兩個純化的成分(PRP-AH和TT)偶聯(lián)，然后通過超濾和凝膠過濾純化綴合物以除去試劑和未綴合的PRP和TT。PRP-TT綴合物的合成1.b CDAP偶聯(lián)將30mg天然Hib PRP溶于6ml 2M NaCl中，在多糖溶液(來自100mg/ml的于乙腈中的儲存溶液)中加入225mcl的CDAP(1-氰-4-二甲基氨基-吡啶四氟硼酸鹽)，90秒后，加入450mcl 0.2M的三乙胺，激活在pH10.0下進行，冰上1分鐘，室溫下分鐘。
在激活的多糖中加入90mg破傷風類毒素(最初的PS與蛋白質(zhì)的比例為1比3)，偶聯(lián)反應(yīng)在室溫下進行1小時，然后，在室溫下用3ml 1M的甘氨酸溶液，pH5.0淬滅反應(yīng)30分鐘，并在4℃下過夜。
通過在用0.2M NaCl平衡過的sephacryl HR 500柱上凝膠過濾純化綴合物，測定每一級分中的糖類和蛋白質(zhì)的含量，收集綴合物并無菌過濾(膜Minisart 0.222γm)。吸附于磷酸鋁上1.c在0.15mg磷酸鋁中加入12.5mcg實施例1(a)中的多糖綴合物，攪拌2小時，將pH調(diào)至5.1，將混合物在室溫下放置一天，再將被吸附的綴合物在2至8℃下放置9天，為了制備凍干的產(chǎn)物，將被吸附的產(chǎn)物在乳糖(15.75mg)中稀釋以得到25mcg多糖/ml和0.4mg Al/ml的最終組合物，將所得最終組合物裝入0.5ml小瓶中凍干。
為了制備液體產(chǎn)物，將被吸附的綴合物在水中稀釋以與150mM NaCl和5mg/ml苯氧基乙醇注射得到20mcg多糖/ml和0.32mgAl/ml的最終組合物。
1.d根據(jù)WO93/24148(SmithKline Beecham Biologicals)的方法配制含和不含乙型肝炎病毒的白喉破傷風和百日咳(無細胞的)疫苗。
1.e制備‘低比例’PRP-TT磷酸鋁預(yù)-吸附綴合物。
用與實施例1.a相似，但是所用的破傷風類毒素的量(30mcg，60mcg)有所降低的方法制備綴合物，得到多糖蛋白質(zhì)的比例為1∶1或1∶2的產(chǎn)物，然后根據(jù)實施例1c的方法，將綴合物吸附于磷酸鋁上，最終的凍干制品含有12.5μg綴合物，0.15mgALPO4，15.75mg乳糖，使用前在0.5ml注射用水，pH0.1+/-0.1中重建。實施例2預(yù)吸附于磷酸鋁上并與DTPa或DTPa-HB聯(lián)合的PRP-TT綴合物的免疫原性在注射前，將普通或預(yù)吸附于ALPO4上的實施例1a)中的Hib綴合物(兩種疫苗都被凍干)與DTPa或DTPaHB混合不超過1小時，將此聯(lián)合疫苗以相當于1/20人劑量的劑量(0.5μgPRP)通過皮下途徑注射幼鼠(1周齡)，2周和4周后對小鼠加強免疫，每次免疫接種后收集血清以測量抗-PRP抗體，對照包括在鹽水中重建的Hib疫苗(吸附或未吸附于ALPO4上)。
在0-14-28天用1/20人劑量的Hib疫苗，單獨或與DTPa或DTPaHB(1/20th人劑量)聯(lián)合將隨機抽取的10只幼鼠組(1周的ago-OFA株)皮下免疫3次，在免疫接種前，用鹽水或聯(lián)合(DTPa或DTPaHB)重建凍干的Hib疫苗不超過1小時。
在14-28-56天，麻醉下取鼠血，通過單個血清的ELISA測量抗-PRP的抗體，使用校正參比以γ/ml表示滴度，計算每一組每一時間點的GMT，計算第三次免疫接種后所得滴度的95％置信限。
如表1所示，Hib綴合物吸附于ALPO4沒有修飾其免疫原性如在嬰兒中見到的，第二次劑量后產(chǎn)生了一些抗-PS，第三次劑量后顯示出良好的加強免疫效果。將Hib疫苗與DTPa或DTPaHB混合使抗-PRP反應(yīng)降低了3至8倍，在DTPaHB情況下，這一降低更加明顯。相反，在ALPO4預(yù)吸附的Hib疫苗將抗-PRP反應(yīng)恢復(fù)到至少與普通疫苗相等的水平。結(jié)論因而，該Hib/磷酸鋁制劑具有解決當將Hib與其他小兒科聯(lián)合疫苗混合時所遇到的相容性問題的潛力。
表1預(yù)吸附于ALPO4上并與DTPa或DTPa-HB聯(lián)合的PRP-TT綴合物在幼鼠模型中的免疫原性
權(quán)利要求
1.疫苗組合物，它含有吸附于磷酸鋁上的多糖綴合抗原。
2.權(quán)利要求1所要求的疫苗，其中抗原是得自與載體蛋白綴合的嗜血乙型流感病毒的莢膜多糖。
3.權(quán)利要求1或2所要求的疫苗，其中載體選自含有白喉類毒素，白喉CRM197蛋白，腦膜炎球菌外膜蛋白和破傷風類毒素的組中。
4.權(quán)利要求1，2或3所要求的疫苗，其中載體蛋白是破傷風類毒素。
5.權(quán)利要求1-4中任一個所要求的疫苗，其中多糖與蛋白質(zhì)的比例為從1∶0.3至1∶2(重量∶重量)。
6.權(quán)利要求1-5中任一個所要求的疫苗，含有至少一種可提供抗除嗜血乙型流感病毒以外的病原體的保護作用的其他成分。
7.權(quán)利要求1-6中任一個所要求的疫苗，其中其他成分選自抗原組并可提供抗甲型肝炎病毒，白喉，破傷風，百日咳，乙型肝炎病毒和脊髓灰質(zhì)炎的保護作用。
8.權(quán)利要求1-7中任一個所要求的疫苗，其中所吸附的綴合物被凍干。
9.權(quán)利要求1-7中任一個所要求的疫苗，其中所吸附的綴合物懸浮于水中以供注射。
10.一種試劑盒，含有一個根據(jù)權(quán)利要求8的凍干疫苗的容器和一個含抗第二種病原體的疫苗的第二個容器。
11.生產(chǎn)根據(jù)權(quán)利要求1-6的疫苗的方法，包括將多糖抗原與蛋白載體綴合并將所述抗原吸附于磷酸鋁上。
12.權(quán)利要求1-9中任一個所限定的疫苗組合物用于醫(yī)藥。
13.治療患有或易感嗜血乙型流感病毒感染的病人的方法，包括施用安全和有效量的根據(jù)權(quán)利要求1-9中任一個所述的疫苗組合物。
全文摘要
本發(fā)明涉及預(yù)防嗜血乙型流感病毒(Hib)感染的疫苗制劑,其中抗原被吸附到磷酸鋁上,本發(fā)明也涉及多價疫苗,此疫苗可改善或治療一種以上的疾病,本發(fā)明也涉及這種疫苗的生產(chǎn)和在醫(yī)藥中的應(yīng)用。
文檔編號A61K39/116GK1188418SQ96194973
公開日1998年7月22日 申請日期1996年6月19日 優(yōu)先權(quán)日1995年6月23日
發(fā)明者朱利恩·皮特曼斯, 皮埃爾·豪澤 申請人:史密斯克萊·比奇曼生物公司