專利名稱：：熱易變腸毒素和霍亂毒素b亞基之間的雜合分子的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及熱易變腸毒素B亞基(LTB)和霍亂毒素B亞基(CTB)之間的雜合分子。包含該雜合分子的免疫原性蛋白，任選與細(xì)胞或病毒的免疫反應(yīng)性氨基酸序列融合，可用作疫苗中的免疫原性成份，例如抗腸毒素引起的腹瀉的廣譜疫苗。背景霍亂在許多發(fā)展中國家仍是一種重要的病因，且估計每年導(dǎo)致超過200,000人死亡。被腸毒性大腸桿菌(ETEC)感染是發(fā)展中國家和旅游者中最常見的腹瀉病因，每年它引起超過1億的腹瀉病例且一百萬人死亡。被ETEC感染也是動物中的重要病因。對于霍亂和ETEC感染都迫切需要有效的疫苗。在霍亂和ETEC感染中，腹瀉的首要原因是腸道中感染的生物釋放的腸毒素的作用，在霍亂中是霍亂毒素(CT)，在ETEC中是熱易變腸毒素(LT)。兩個毒素在結(jié)構(gòu)上和功能上均密切相關(guān)，均由毒性A亞基(分別是CTA或LTA)被5個相同的B亞基(分別是CTB或LTB)(Spangler，1992)包圍組成。B亞基5聚體負(fù)責(zé)將毒素結(jié)合到存在于腸上皮細(xì)胞表面的GM1神經(jīng)節(jié)苷脂受體上(Holmgren，1981)；LT也能結(jié)合到結(jié)構(gòu)上相關(guān)的半乳糖蛋白受體上(Holmgren和Fredman等1982)。盡管2種蛋白質(zhì)在一些氨基酸殘基上表現(xiàn)出內(nèi)部變異，例如在人類與動物ETEC分離物中及在典型性與ElT或生物型霍亂菌株中，LTB和CTB顯示出高度同源性，在成熟蛋白質(zhì)中具有85％的氨基酸保守(圖1)，晶體學(xué)研究的證據(jù)表明LTB和CTB五聚體也在結(jié)構(gòu)上相似(Sixma和Pronk等，1991，Sixma和Kalk等，993，Merritt和Sarfaty等，1994)。盡管大多數(shù)抗體針對組裝的五聚體的結(jié)構(gòu)特征，但在2個分子間也具有高度的免疫學(xué)交叉反應(yīng)性(Svennerhdm和Wickstrm等，1986)，這進(jìn)一步表明了兩個分子間的結(jié)構(gòu)相似性。已發(fā)現(xiàn)CT是一種有效的口服免疫原，它產(chǎn)生主要針對B亞基的腸IgA反應(yīng)。而且，口服施用單獨(dú)的CTB也發(fā)現(xiàn)有效地刺激相似的反應(yīng)，特別是在人類，已發(fā)現(xiàn)CTB在缺乏佐劑或全毒素毒性效應(yīng)的條件下是一種強(qiáng)免疫原。這些反應(yīng)與高水平相關(guān)，盡管對霍亂弧菌的攻擊或自然感染具有相當(dāng)短期(約6-9個月)的保護(hù)和持續(xù)更長時間的免疫學(xué)記憶(Svennerholm和Sack等，1982，Svennerholm和Gothefors，等，1984，Svennerholm和Jerrborn等，1984，Clemens和Sack等，1990，Quiding和Nordstrom等，1991)。抗毒素抗體在其保護(hù)性作用中似乎與針對細(xì)菌的細(xì)胞相聯(lián)性抗原如霍亂弧菌Ol(Svennerholm和Holmgren，1976)或新血清型O139(JHolmgren等，未公開)的脂多糖(LPS)的腸IgA抗體協(xié)同作用。根據(jù)這些發(fā)現(xiàn)，已形成抗霍亂的口服疫苗，由CTB和殺死的霍亂弧菌O1的細(xì)胞組成(Holmgren和Svennerholm，等，1992)，它產(chǎn)生持續(xù)幾年的保護(hù)(Clernens和Sack等，1990)并且目前被改良成也包括O139血清型的細(xì)胞B亞基-O1全細(xì)胞疫苗在Bangladesh的大量野外試驗證實(shí)，除了對霍亂觀察到的長期保護(hù)外，還觀察到由于CTB成分而對ETEC感染的明顯的短期交叉保護(hù)(Clemens和Sack，等，1988(a))。由霍亂疫苗引起的對ETEC的保護(hù)隨后在對到摩洛哥的芬蘭旅游者的研究中得以證實(shí)(Peltola和Siitonen，等。1991)。根據(jù)這些結(jié)果，已形成了一種更廣譜的抗ETEC的疫苗，其中CTB與表達(dá)涉及附著于腸上皮的主要定居因子抗原的殺死的大腸桿菌結(jié)合使用(Svennerholm和Arhen，等，1991)。為了提供對單獨(dú)或與LT一起釋放熱穩(wěn)定性腸毒素(STa)的ETEC菌株的免疫性而包括大腸桿菌菌株。在霍亂和ETEC均是地方性流行病的地區(qū)，需要一種單一的疫苗對兩種感染都提供有效的保護(hù)。這可通過增強(qiáng)由已許可的霍亂疫苗CTB成分提供的對ETEC的保護(hù)來部分實(shí)現(xiàn)。盡管LTB和CTB顯示出明顯的免疫學(xué)交叉反應(yīng)，以CTB免疫的個體的血清中的LT不如以相同血清中和CT一樣有效(Ahren和Wenneras等，1993)。相反，已知抗LT或LTB的抗血清與LT比與CT以更高的滴度反應(yīng)(Svennerholm和Holmgren等，1983)。因此可能LTB中的一些中和抗原決定簇在CTB中缺乏且反之亦然。經(jīng)過簽定LTB特異性中和抗體進(jìn)一步證實(shí)了這點(diǎn)(Svennerholm和Wickstrrn等，1986)。在霍亂和ETEC疫苗中均包含CTB導(dǎo)致形成能以大量且完全缺乏毒性CTA亞基的方式生產(chǎn)的重組蛋白質(zhì)的過度生產(chǎn)的表達(dá)系統(tǒng)(Sanchez和Holmgren，1989，Lebens和Johansson，等，1993)。這也為生產(chǎn)攜帶外源肽抗原的蛋白質(zhì)融合物前遺傳修飾CTB的相當(dāng)簡單的方法開辟了一條道路。本發(fā)明基于經(jīng)定點(diǎn)誘變編碼CTB的結(jié)構(gòu)基因進(jìn)行的修飾、導(dǎo)致產(chǎn)生雜合蛋白質(zhì)，其中LTB特異性的抗原決定簇導(dǎo)入基本上保留CTB的蛋白質(zhì)中，從而產(chǎn)生的該雜合分子除了交叉反應(yīng)的和CTB特異性的抗原決定簇外還攜帶LTB特異性的抗原決定簇，以便增強(qiáng)免疫交叉反應(yīng)性。為了提供預(yù)防或治療腸毒性疾病的廣譜疫苗而形成了這種雜合的CTB/LTB分子。本發(fā)明的描述一方面，本發(fā)明涉及熱易變性腸毒素B亞基(LTB)和霍亂毒素B亞基(CTB)之間的雜合分子，該分子包含由成熟CTB的氨基酸序列組成的氨基酸序列，其中該氨基酸殘基被成熟LTB的相應(yīng)氨基酸殘基取代，它將LTB特異性的抗原決定基特征傳遞給所說的免疫原性成熟CTB，或反之亦然。因此，所說的雜合分子可選擇包含由成熟LTB氨基酸序列組成的氨基酸序列，其中該氨基酸殘基被成熟CTB的相應(yīng)氨基酸殘基取代，它將CTB特異性的表位特征傳遞給所說的免疫原性成熟LTB。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明所說的雜交分子具有由成熟CTB的氨基酸序列組成的氨基酸序列，其中第1、94和95位的氨基酸殘基被LB的相應(yīng)氨基酸殘基取代。在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明所說的雜交分子具有由成熟CTB的氨基酸序列組成的氨基酸序列，其中在第1-25位的氨基酸殘基被LTB的相應(yīng)氨基酸殘基取代。在圖1中描述了成熟CTB和成熟LTB的氨基酸序列，且以氨基酸+1開始。相應(yīng)的結(jié)構(gòu)基因在同一附圖中描述。本發(fā)明的另一方面涉及編碼根據(jù)本發(fā)明的雜合分子的結(jié)構(gòu)基因。另外，本發(fā)明涉及含有該結(jié)構(gòu)基因的質(zhì)粒。本發(fā)明還有一個方面涉及包含根據(jù)本發(fā)明的雜合分子的免疫原性蛋白質(zhì)。在本發(fā)明該方面的一個實(shí)施方案中，所說的免疫原性蛋白質(zhì)是本發(fā)明所說的雜合分子的融合蛋白和原核或真核細(xì)胞或病毒的或來自它們的免疫反應(yīng)性氨基酸序列。本發(fā)明還有一個方面涉及包含根據(jù)本發(fā)明的免疫學(xué)有效量的免疫原性蛋白質(zhì)作為免疫成分的疫苗。優(yōu)選所說的疫苗抗腸毒素誘導(dǎo)的疾病，如腹瀉。本發(fā)明的B亞基雜合體試圖用于預(yù)防或治療個體中(動物或人類)腸毒素引起的疾病的方法中，包含給所說的個體施用免疫學(xué)上有效量的根據(jù)本發(fā)明的免疫原性蛋白質(zhì)。附圖描述圖1人ETEC分離物(Leong等，1985)的LTB和CTB(M.Lebens，未公開)的序列的比較。對于導(dǎo)致氨基酸改變的差異，LTB相應(yīng)位置的殘基在上面DNA序列中給出。CTB氨基酸序列下的數(shù)字表示成熟CTB和LTB蛋白質(zhì)中氨基酸殘基的位置。圖2編碼CTB/LTB雜合體的質(zhì)粒。在兩個質(zhì)粒中，來自ctxB的基因從tac啟動子中表達(dá)。a)由基因插入產(chǎn)生的pML-LCTBtacA，其中來自pML-LCTBtacl(21)的Sacl/Accl片段被編碼LTB前25個氨基酸的合成寡核苷酸取代。ctxB基因的剩余部分未改變。該質(zhì)粒攜帶LTB信號肽和核糖體結(jié)合序列。b)以PCR定向誘變從pML-CTBtac產(chǎn)生pML-LCTBtacB，其中，導(dǎo)入單個EcoRl位點(diǎn)，且位置94和95的氨基酸改變成相應(yīng)于LTB的相同位置。該質(zhì)粒攜帶CTB信號肽和λcll核糖體結(jié)合序列。改變的序列在盒中顯示。僅描述了雜合基因相關(guān)區(qū)域的序列圖3與用rCTB、rLTB或CTB/LTB雜合蛋白質(zhì)LCTBA(A)或LCTBB(B)之一腹膜內(nèi)免疫應(yīng)答的3次免疫中每一次之后(1、2和3組)分別產(chǎn)生的抗體。滴度是兩只小鼠的平均值，且以材料和方法所述的GMl-ELISA測定。圖4.用CTB對以rCTB、rLTB或CTB/LTB雜合蛋白LCTBA或LCTBB之一三次免疫后獲得的小鼠血清中CTB-和LTB反應(yīng)性抗體滴度的吸附影響。本發(fā)明的雜合CTB/LTB分子的制備本發(fā)明的雜合CTB/LTB分子可根據(jù)本領(lǐng)域生產(chǎn)肽和蛋白質(zhì)的任何已知方法制備，如遺傳工程和/或肽合成方法，例如，根據(jù)Merrifield的方法。為了說明該分子的制備，本發(fā)明的兩個雜合CTB/LTB分子按如下制備。雜合CTB/LTB分子的生產(chǎn)用于本發(fā)明的兩個雜合毒素基因從兩個不同的CTB表達(dá)載體生產(chǎn)。首先，經(jīng)過將合成寡核苷酸插入ctxB基因內(nèi)的合適限制性位點(diǎn)之間完成修飾，其次，經(jīng)過使用特異性引物按前面所述對完整的質(zhì)粒進(jìn)行PCR擴(kuò)增產(chǎn)生突變(Schdel和Milich等，1991)。兩個所得的質(zhì)粒是pML-LCTBtacA和pML-LCTBtacB，它們攜帶修飾的ctxB基因，經(jīng)DNA測序證實(shí)了其序列且在圖2中表示。pML-LCTBtacA表達(dá)的雜合蛋白LCTBA在其前25個氨基酸與LTB相同，其后與CTB相同。由pMLLCTBtacB表達(dá)的雜合蛋白命名為LCTBB且在相應(yīng)于LTB的位置1、94和95改變，其它與典型的O1霍亂弧菌菌株395的天然CTB相同。雜合蛋白質(zhì)在霍亂弧菌菌株JS1569中表達(dá)導(dǎo)致該產(chǎn)物在生長培養(yǎng)基中積累，以六偏磷酸沉淀接著經(jīng)HPLC可從培養(yǎng)基中純化該蛋白質(zhì)。根據(jù)SDSPAGE該蛋白質(zhì)如果是LCTBA似乎與對照CTB蛋白質(zhì)相同，如果是LCTBB，其泳動更象LTB、特別是以單體的形式。CTB/LTB雜合分子的抗原性分析兩種雜合蛋白質(zhì)以攜帶各自表達(dá)載體的霍亂弧菌的生長培養(yǎng)基中部分純化并進(jìn)行各種不同的分析以測定與天然CTB和LTB相比較的其抗原特性。用不同CTB或LTB特異性的抗體以GM1-ELISA滴定開始濃度固定的不同蛋白質(zhì)。該方法可測量GM1受體和不同檢測抗體之一或兩者的親合力差異，以前我們已顯示不同蛋白質(zhì)同樣地結(jié)合GM1，因此這些差異是抗體特異性的(結(jié)果未顯示)。這些結(jié)果在表1中顯示。可見對一定范圍的兩種單克隆抗體和吸附的多克隆抗血清獲得的滴度圖形可區(qū)分雜合分子和天然蛋白質(zhì)。結(jié)果表明雜合蛋白的LCTBA獲得了能被根據(jù)與單克隆抗體的反應(yīng)識別的LTB特異性表位，被LTB特異性單克隆抗體LT338和LT807識別的顯著的抗原決定簇。然而，它還與CTB特異性的抗體CTWi反應(yīng)。在western印跡中也證實(shí)了這一點(diǎn)。對于LCTBB，使用的單克隆抗體沒有證實(shí)在雜合分子的抗原性中有區(qū)別。對此有2個可能的解釋，一個是用更大范圍的抗體篩選需要在分子中有相當(dāng)小的數(shù)量的變化以便發(fā)現(xiàn)對特定抗決定基表現(xiàn)出親和力的抗體。另外，基于MG1-ELISA的試驗不能檢測隱藏在GM1結(jié)合位點(diǎn)內(nèi)的分子區(qū)域的改變。用雜合蛋白免疫產(chǎn)生交叉反應(yīng)的抗血清用LTB，CTB或不同的雜合分子之一免疫后，分析所得的抗血清抗LTB和CTB的總抗體水平，隨后分析LTB特異性的抗體水平。圖3顯示了3次免疫的每次免疫之后的抗CTB和LTB的抗體水平。首次免疫前在任何試驗的小鼠中沒有可檢測到的抗任一B亞基的滴度。如果是CTB和兩種雜交蛋白質(zhì)，抗CTB的滴度一致比抗LTB的更高。在用LTB免疫的小鼠中，情況相反。在用CTB或LCTBB雜合分子免疫的小鼠中，第一次和第二次免疫后獲得的抗CTB和LTB的相對滴度間沒有明顯的區(qū)別。在兩種情況下CTB的滴度明顯比抗LTB的滴度更高。然而在用LCTBA免疫的小鼠中，抗LTB和CTB的滴度水平互相之間更相似。這是由于與CTB-和LCTBB免疫的小鼠相比抗LTB抗體的水平升高而抗CTB抗體的水平下降所致。第三次免疫后，可見在用雜合分子免疫的兩組小鼠中抗CT3的滴度與用CTB免疫的小鼠相似，但抗LTB的水平更高。當(dāng)試驗全血清的抗LTB或CTB的抗體滴度時，由于存在交叉反應(yīng)的抗體使結(jié)果不清楚。為了確定在不同血清中觀察到的區(qū)別是否是由于LTB-特異性的抗體水平的改變而引起的，用CTB-Sepharose吸附第三次免疫后取的血清以去掉交叉反應(yīng)和CTB特異性的抗體。然后試驗它們的抗CTB和抗-LTB的滴度。結(jié)果在圖4中顯示?？梢娫撎幚碛行У貜难逯谐チ怂械目笴TB抗體。在用CTB免疫的小鼠中，全部觀察到的抗-LTB滴度是由于交叉反應(yīng)的抗體所產(chǎn)生的且吸附后沒有LTB反應(yīng)性抗體殘留。對于LCTBA和LCTBB，保留明顯的抗LTB滴度，盡管不如用LTB免疫的小鼠一樣高。這是導(dǎo)入CTB分子的突變確實(shí)具有產(chǎn)生LTB特異性抗體的免疫學(xué)效力的證據(jù)。還清楚了在CTB分子中具有7個取代的LCTBA的效力比僅具有3個取代的LCTBB更大。用不同的B亞基抗血清中和CT和LT在體外試驗中試驗了不同抗血清中和LT或CT的能力。結(jié)果在表2中表示。在用于試驗的條件下，CTB和LTB抗血清僅有輕微的交叉反應(yīng)。在所用的范圍內(nèi)的任何稀釋度下，LTB抗血清不中和CT，而CTB抗血清對LT具有輕微的效力。相反，抗雜合分子之一的抗血清對CT和LT都具有明顯的中和活性。即使用CTB完全吸附抗血清的CT中和活性后，仍有明顯的LT中和活性。這些結(jié)果表明在CTB分子中進(jìn)行的取代導(dǎo)入了中和的LTB抗原決定簇，而同時保留CT中和抗原決定簇。很明顯用LCTBB免疫的小鼠抗血清表現(xiàn)出的抗LT的中和活性水平幾乎比得上LCTBA免疫的小鼠血清所發(fā)現(xiàn)的水平，盡管用GM1ELISA試驗僅存在低水平的LTB特異性抗體。這表明在B亞基結(jié)構(gòu)的94和95位的氨基酸形成部分有力的中和表位，它可能位于或靠近受體結(jié)合位點(diǎn)。說明書實(shí)驗部分提供的結(jié)果的小結(jié)本工作描述了基本上由CTB組成的兩個雜合B亞基毒性分子的合成和分析，其中的突變將特定氨基酸殘基改變成類似于人LTB的相應(yīng)位置。發(fā)現(xiàn)兩種蛋白質(zhì)均以高水平表達(dá)且保留CTB和LTB的基本特征。兩者都組裝成5聚體且都結(jié)合到GM1神經(jīng)節(jié)苷脂上。兩種分子除了以交叉反應(yīng)性單克隆抗體LT39同樣地與野生型CTB和LTB反應(yīng)外，還以多克隆抗血清強(qiáng)烈、地與CTB或LTB反應(yīng)。然而，在與其它LTB-或CTB特異性單克隆抗體的反應(yīng)中，不同蛋白質(zhì)有區(qū)別，表明新蛋白質(zhì)確實(shí)在相同分子上攜帶對各野生型蛋白質(zhì)特異性的抗原決定簇。以免疫實(shí)驗進(jìn)一步說明了這一點(diǎn)，它表明從用雜合分子免疫的動物獲得的血清交叉反應(yīng)性增強(qiáng)。還證實(shí)了在CHO細(xì)胞毒性中和試驗中，抗雜合分子的抗血清比抗單獨(dú)的CTB的抗血清更有效地中和LT，且該活性不被CTB吸附掉。生產(chǎn)用于本工作的2個雜合分子以說明在CTB分子不同區(qū)域的突變的影響。在第一個構(gòu)建體中，CTB的氨酸末端改變，而在第二個中，在靠近認(rèn)為涉及受體結(jié)合的底物特異性的羧基末端的位置的兩個殘基改變。在本工作中未研究LCTBB位置1Thr→Ala的突變。用于對照的重組CTB從前面所述的表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)(Lebens和Johansson等，1993)且也進(jìn)行了我們以前顯示無免疫意義的這種突變(Leben和Johansson等，1993和MLeben和J.Holmgren，未公開的資料)。從這些結(jié)果很清楚在CTB的氨基末端所作的改變越大，與產(chǎn)生可檢測但極低抗LTB特異性GM1-ELISA滴度的成熟蛋白質(zhì)94和95位兩個殘基改變相比產(chǎn)生更多LTB特異性抗體(以不被CTB-Sepharose吸附掉的GM1-ELISA抗體滴度來限定)。因此，相當(dāng)有趣的是發(fā)現(xiàn)了在CHO細(xì)胞中抗兩個成熟B亞基的抗血清對LT(和CT)的中和相似。這表明盡管由第二種雜合體產(chǎn)生的LTB特異性抗體的滴度似乎很低，但該抗體具有相當(dāng)?shù)闹泻托Я?，這表明受影響的兩個殘基位于中和表位內(nèi)。進(jìn)一步的證據(jù)是在B亞基分子上有一個以上的該中和表位，因為沒有突變體喪失中和CT的能力，盡管存在由于取代一些CTB特異性中和表位已喪失的可能。突變CTB分子的交叉反應(yīng)性由產(chǎn)生的特異性改變引起，因為它產(chǎn)生LTB特異性抗體，該抗體不受免疫吸附除去CTB-特異性以所有交叉反應(yīng)性抗體導(dǎo)致CHO細(xì)胞試驗中完全喪失CT中和活性的影響。然而LT中和活性得以保留。從這些研究清楚了可生產(chǎn)含CTB-和LTB特異性中和表位的雜合分子。另外，最近描述的CTB的過度表達(dá)系統(tǒng)允許大量生產(chǎn)這些蛋白質(zhì)。因此現(xiàn)在提供該分子用于將其摻入分離的霍亂和ETEC疫苗中或摻入設(shè)計成對兩類腹瀉疾病產(chǎn)生明顯的保護(hù)的單個廣譜疫苗中。材料和方法細(xì)菌菌株和質(zhì)粒用于本工作生產(chǎn)重組CTB(rCTB)和LTB(rLTB)及突變衍生物的細(xì)菌菌株是O1E1T或霍亂弧菌菌株JBK70(Kaper和Lockman等，1984)，以及O1典型霍亂弧菌菌株JS1569(Lebens和Johansson，等，1993)。攜帶合適重組質(zhì)粒的菌株凍存于-70℃含20％甘油的培養(yǎng)基中。經(jīng)過各菌株劃線于含氨芐青霉素100μg/ml的L-瓊脂上復(fù)蘇培養(yǎng)物。本研究產(chǎn)生的質(zhì)粒在圖2中顯示。DNA操作包括質(zhì)粒制備，限制性酶使用，DNA連接和瓊脂糖凝膠電泳的DNA操作基本上按Sambrook和Fritsch等(1989)所述的標(biāo)準(zhǔn)程序進(jìn)行。限制性酶在廠商提供的緩沖液中使用。從InnovagenAB，瑞典獲得用于經(jīng)連接插入質(zhì)?；蛴糜谑褂肞CR擴(kuò)增的寡核苷酸。根據(jù)Schdel和Milich等(1991)所述的方法將PCR用于將突變導(dǎo)入來自質(zhì)粒的ctxB基因中。使用從Amersham(UK)獲得的測序酶Version20試劑盒進(jìn)行DNA測序。CTB和LTB及其突變衍生物的制備粗制rCTB和其衍生物從攜帶相關(guān)表達(dá)質(zhì)粒的菌株霍亂弧菌JS1569中制備。從攜帶表達(dá)質(zhì)粒pMMB68的霍亂弧菌菌株JBK70中制備LTB(Sandqvist和Hist，等，1987)。培養(yǎng)物在改良的syncase上生長(Lebens和Johansson，等，1993)且在培養(yǎng)基中積累的CTB或LTB以前面描述的六偏磷酸沉淀法回收(Lebens和Johansson等，1993)。獲得的B亞基濃度使用交叉反應(yīng)性單克隆抗體LT39以GM1-ELISA(Svennerholm和Holmgren，1978)測定。使用HPLC建立進(jìn)一步純化LTB和CTB衍生物的方法。六偏磷酸沉淀重懸于20mMTris-HClpH9中。然后將所得的懸液以10,000rpm離心3分鐘，含B亞基的上清通過0.2m無菌濾器過濾。使用DEAEMem-SepHP1000柱(MilliporeCorp.，USA)在水600多溶劑傳遞系統(tǒng)(MilliporeCorp，USA)上進(jìn)行HPLC。首先將B亞基結(jié)合到pH9的柱上(20mMTris-HCl)并用0.16M(對LCTBA)或0.18M(對LCTBB)乙酸鈉在pH8下洗脫柱。體外抗原性和蛋白質(zhì)分析聚苯乙烯ELISA平板的小孔用100μl0.3nmol/mlGM1神經(jīng)節(jié)苷脂在室溫下覆蓋6小時并保存于4℃?zhèn)溆?。首先以兩次更換PBS洗滌覆蓋的平板并用磷酸鹽緩沖液pH7.2(PBS)，0.1％(w/v)牛血清白蛋白(BSA)37℃封閉30分鐘。經(jīng)過在PBS，0.1％BSA中稀釋濃縮的貯液獲得25ng/ml各B亞基制品的溶液。這些稀釋樣品的100ml等分試樣經(jīng)過在室溫下培養(yǎng)1小時用于覆蓋封閉的平板。然后將不同抗體的溶液加入第一排平板上并用5倍系列稀釋液滴定掉。然后用與辣根過氧化物酶(HRP)連接的第二抗小鼠或抗免免疫球蛋白(Jackson，PA，USA)檢測結(jié)合于B亞基上的抗體。室溫下培養(yǎng)1小時后，按以前所述(Svennerholm和Holmgren，1978)使用生色底物鄰苯二胺(OPD)和H2O2在檸檬酸緩沖液(pH4.5)中檢測抗體的結(jié)合。在各步驟之間用PBS，0.05％Tween洗滌平板3次。反應(yīng)10分鐘后以產(chǎn)生450nm下吸光率超出背景0.4的倒數(shù)稀釋測定滴度。在廠家推薦的條件下使用從Biorad(CA.USA)獲得的miniproteanII裝置進(jìn)行SDS-聚丙烯凝膠電泳和電轉(zhuǎn)移分辨的蛋白質(zhì)到硝酸纖維素上。小鼠免疫C57/Black小鼠對用CTB，LTB或突變的CTB衍生物之一經(jīng)腹膜內(nèi)注射免疫3次。含10mgB亞基的前兩次劑量在含F(xiàn)reunds不完全佐劑的200ml中施用，且給藥間隔10天。第二次劑量14天后施用無任何佐劑的20mgB亞基的第三次劑量。在前2次劑量前給小鼠抽血并在第三次劑量7天后處死小鼠，之后收集血液用于分析。制備血清并貯存于-20℃?zhèn)溆?。血清滴度測定以GM1-ELISA(Svennerholm和Holmgren，1978)試驗免疫獲得的血清。使用前用GM1覆蓋的平板首先立即用PBS洗滌2次并用PBS，0.1％BSA在37℃封閉30分鐘。然后將平板分成2組。將在PBS，0.1％BSA中的100μlCTB加入第一組平板的孔中并將在PBS，0.1％BSA中的100tlLTB0.5μg/ml加入第二組的孔中。然后將平板在室溫下保溫1小時并用PBS，0.05％Tween洗滌3次。然后將100μlPBS，0.1％BSA，0.05％Tween的溶液加入除第一排的所有孔中。向第一排的孔中加入在PBS，0.1％BSA中1/1000稀釋的血清的150ml等分試樣。然后用系列3倍稀釋液滴定它們并在室溫下培養(yǎng)1小時。用PBS，0.05％Tween洗滌3次后，結(jié)合于CTB和LTB上的抗體經(jīng)過用與HRP連接的抗小鼠IgG(Jackson，PA，USA)培養(yǎng)測定結(jié)合于CTB和LTB上的抗體。生色底物是OPD且滴度以上面所述測定體外抗原性所用的相同方式計算。CTB抗體吸附為了去掉CTB特異性抗體和與LTB交叉反應(yīng)的抗體將血清用CTBSepharose珠吸附。根據(jù)廠家說明書經(jīng)過將CTB五聚體共價連接到溴化氰激活的Sepharose(PharmaciaAB，Sweden)上制備CTB-Sepharose。血清首先在PBS中以1∶10稀釋。100μl該稀釋液與50μlSepharose-CTB珠在微型離心管中以間歇搖動在室溫下培養(yǎng)1小時。然后將它們在臺式頂部微量離心機(jī)中以9000rpm離心2分鐘并回收上清。然后重復(fù)該程序。按上面所述以GM1-ELISA試驗抗CTB和LTB的吸附的血清。毒性中和試驗用各種CTB衍生物和CTB第3次免疫小鼠后獲得的血清在中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞試驗(Guerrant和Brunton等，1974)中試驗其用CTB-Sepharose吸附前和后抑制CT或LT毒性的能力。未吸附的血清首先以1∶20稀釋。所得血清的50ml等份試樣然后以一式二份在微量滴定平板上用3倍稀釋液進(jìn)行系列稀釋。向第一組一式二份的孔中加入在50μl含1％BSA的HAMF12培養(yǎng)基中的0.2ngCT并向第二組中加入在相同培養(yǎng)基中的LT溶液。平板在室溫下培養(yǎng)1小時，之后向所有孔中加入100μl在F12HAM培養(yǎng)其中的2×105細(xì)胞/ml的懸液。在37℃在10％CO2，5％O2的氣體中使培養(yǎng)進(jìn)行1小時。用甲醇固定細(xì)胞并用Giemsa溶液(Merck)染色。以光學(xué)顯微鏡觀察細(xì)胞的損傷。對用CTB-Sepharose珠吸附的血清應(yīng)用相同的程序。所有實(shí)驗以一式二份進(jìn)行。參考文獻(xiàn)(a)Clemens.J.，Sack，D.，Harris，J.R.J.，Chakrabony，J.，Neogy，P.K.Stanton，B，Huda，N.，Khan，M.U.，Kay，B.A.，Khan，M.R.，Ansaruzzaman，M.，Yunus，M.，Rao，M.R.，SvennerholmA，-M.和Holmgren，J.(1988)傳染病雜志158，372-377。(b)Clemens，J.，Sack，D.，Harris，J.R.J.，vanLoon，F(xiàn).，Chakraborty，J.Ahmed，F(xiàn).，Rao，M.R，Khan，M.R.，Yunus，M.，Huda，N.，Stanton，B.，Kay，B.A.，Walter，S，Eeckels，R，SvennerholmA-M和Holmgren，J.(1990)柳葉刀i.270-273。Guerrant，R.L.，Brunton，L.L，Schnaitman，R.C.，Rebhun；L.I.；和Gliman，A.G.(1974)感染與免疫10，320-327Holmgren，J(1981)自然292，413-417。Holmgren，J.，F(xiàn)redman，P.，Lindblad，M，Svennerholm，A-M和Svennerholm，L(1982)感染與免疫38，424-433。Holmgren，J.Svennerholm，A-M；Jertborn，M；Clemens，J；Sack，D.A；Salenstedt，R.和Wigzell.H.(1992)疫苗10，911-914。Quiding，M，Nordstrom，I.，Kilander，A，Andersson，G.，HansonL.-A，Holmgren，J和CzerkinskyC(1991)臨床研究雜志88，143-148。Kaper，J.B.，Lockman，H，Baldini，M.M.和Levine，M.M.(1984)自然308，655-658。Lebens，M.，Johansson，S.，Osek，J.，Lindblad，M.，和Holmgren；J.(1993)生物技術(shù)11，1574-1578。Leong，J.，Vinal，A.C.和Dallas，W.S.l(985)感染與免疫48，73-78。Merrit，E.A，Sarfaty，S.，vandenAkker，F(xiàn)，L′Hoir，C，Martial，J.A.，和Hol，W.G.J.(1994)Prot.Sci.3，166-175。Peltola，H.，Siitonen，A.，Kyrnsepp，H.，Simula，I.，Mattila，L.，Oksanen，P.，Kataja，M.J.和Cadoz，M.(1991)柳葉刀338，1285-1289。Sambrook，J.，F(xiàn)ritsch，E.F.和maniatisT.(1989)分子克隆實(shí)驗手冊(第二版)冷泉港實(shí)驗室出版社，紐約冷泉港。Sanchez，J.，和Holmgren，J.(1989)美國國家科學(xué)院學(xué)報，86，481-485。sandkvist，M.，Hirst，T.和Bagdassrian，M.(1987)細(xì)菌學(xué)雜志169，4570-4576。Sch6del，F(xiàn).，Milich，D.R.，和Will，H.1991)InBrowrl，F(xiàn).，Chanock，R.M.，ginsberg，H.S和Lerner，R.A.(編輯)，疫苗91，冷泉港實(shí)驗室出版社，冷泉港，紐約.pp319-325。Sixma，T.K.，Kalk，K.H.，vanZanten，B.A.M.，Dauter，Z.，Kingma，J.，Witholt，B.和Hol，W.G.J.(1993)分子生物學(xué)雜志230，890-918。Sixma，T.K.，Pronk，S.E.，Kalk，K.H.，Wartner，E.S.，vanZanten，B.A.M.，Witholt，B.和Hol，W.G.J.(1991)自然35l，37l-378。Spangler，B.D.(1992)微生物學(xué)回顧，56，622-647。Svennerholm，A.-M.，Gothefors，L.，Sack，D.A.，Bardhan，P.K.和HolmgrenJ.(1984)世界衛(wèi)生組織通報.62，909-918。Svennerholm，A.-M.，和Holmgren，J.(1976)感染免疫學(xué).13，735-740。Svennerholm，A.-M.，和Holmgren，J.(1978)當(dāng)今微生物學(xué)．1，19-23。Svennerholm，A.-M.，和Holmgren，J.Black，R.，Levine，M.和Merson.M.M(1983)傳染病雜志.147，514—522。Svennerholm，A.-M.，Jenborn，M.，Gothefors，L.，Karim，A.M.M.M.，Sack，D.A.，和HolmgrenJ.(1984)傳染病雜志.149，884-893。Svennerholm，A.-M.，Wickstrm，M.，Lindblad，M.，和Holmgren，J.(1986)醫(yī)用生物學(xué).64，23-30。Svennerholm，A.-M.，Sack，D.A.，Holmgren，J.和Bardhan，P.K.(1982)Lanceti，305—308。Svennerholm，A.-M.，hren，C.，Wenners，C和Holmgren，J.(1991)在Wadstrm，T.，Mekele.H.，Svennerholm，A.-M.，和Wolf-Watz，H.(編輯)胃腸道感染的分子發(fā)病機(jī)理Plenum，倫敦pp.287-294。Ahrén，C.，Wenners，C.，holmgren，J.和Svennerholm，A.-M.(1993)疫苗11、929-935。表1在雜合蛋白質(zhì)中產(chǎn)生保留CTB抗原決定基的LTB特異性抗原決定基</tables>a抗體滴度以GM1-ELISA程序測定(見材料和方法)。LT39是與LTB和CTB都具有相似的反應(yīng)的交叉反應(yīng)性單克性抗體。LT33∶8和LT80∶7是LTB特異性單克隆抗體且CTWi是CTB特異性單克隆抗體。R953是抗LTB的免多克隆超免疫血清，R953abs是用CTB吸附后的相同血清。估計超過log10＝0.5(即3倍)的滴度差異認(rèn)為是顯著的。表2雜合蛋白的產(chǎn)生具有增強(qiáng)的LT-中和活性的抗血清a使用CHO細(xì)胞試驗(見材料和方法)測定以CTB、LTB或兩和LTB/CTB雜合體之一三次免疫小鼠后獲得的血清對LT和CT的中和。也用CTBSepharose吸附該血清并以相同的方法試驗。進(jìn)行實(shí)驗以使第一孔中的開始濃度與用CTB-Sepharose吸附前和后的血清的實(shí)驗相當(dāng)。為實(shí)現(xiàn)這點(diǎn)，在第一孔中1∶20稀釋未吸附的血清，而吸附后使用未稀釋的。用3倍稀釋液系列稀釋未吸附的血清，用2部稀釋液系列稀釋吸附的血清。顯示的滴度表明最大稀釋的血清保護(hù)細(xì)胞免受損傷且表明從以兩個分離的雙份實(shí)驗進(jìn)行的滴定獲得該范圍。權(quán)利要求1.熱易變性腸毒素B亞基(LTB)和霍亂毒素B亞基(CTB)之間的雜合分子，其特征在于所說的分子包含由成熟CTB的氨基酸序列組成的氨基酸序列，其中該氨基酸殘基用相應(yīng)于成熟LTB的氨基酸殘基取代，它將LTB特異性的表位特征傳遞給所說的免疫原性成熟CTB。2.熱易變性腸毒素B亞基(LTB)和霍亂毒素B亞基(CTB)之間的雜合分子，其特征在于所說的分子包含由成熟LTB氨基酸序列組成的氨基酸序列，其中該氨基酸殘基用成熟CTB的相應(yīng)氨基酸殘基取代，它將CTB特異性的表位特征傳遞給所說的免疫原性成熟LTB。3.根據(jù)權(quán)利要求1的雜合分子，其中所說的氨基酸序列由成熟CTB的氨基酸序列組成，其中第1，94和95位的氨基酸殘基用相應(yīng)的LTB的氨基酸殘基取代。4.根據(jù)權(quán)利要求1的雜合分子，其中所說的氨基酸序列由成熟CTB的氨基酸序列組成，其中1-25位的氨基酸殘基用LTB的相應(yīng)氨基酸殘基取代。5.編碼根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一項的雜合分子的結(jié)構(gòu)基因。6.含有根據(jù)權(quán)利要求5的結(jié)構(gòu)基因的質(zhì)粒。7.包含根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一項的雜合分子的免疫原性蛋白質(zhì)。8.根據(jù)權(quán)利要求7的免疫原性蛋白質(zhì)，其中所說的蛋白質(zhì)是所說的雜合分子和原核或真核細(xì)胞或病毒的免疫反應(yīng)性氨基酸序列的融合蛋白質(zhì)9.包含免疫學(xué)有效量的根據(jù)權(quán)利要求7或8的免疫原性蛋白質(zhì)作為免疫成份的疫苗。10.根據(jù)權(quán)利要求9的疫苗，其中所說的疫苗抗腸毒素引起的疾病。11.一種預(yù)防或治療個體中腸毒素引起的疾病的方法，包括給所說的個體施用免疫學(xué)有效量的根據(jù)權(quán)利要求7或8的免疫原性蛋白質(zhì)。全文摘要本發(fā)明公開了熱易變腸毒素B亞基(LTB)和霍亂毒素B亞基(CTB)之間的雜合分子。該雜合分子包含由成熟CTB氨基酸序列組成的氨基酸序列,其中該成熟CTB的氨基酸殘基用相應(yīng)于成熟LTB的氨基酸殘基取代,它將LTB特異性表位特征傳遞給所說的免疫原性成熟CTB,或反之亦然。另外,還公開了編碼該雜合分子的結(jié)構(gòu)基因,含有該結(jié)構(gòu)基因的質(zhì)粒,包含該雜合分子及任選的一種原核或真核細(xì)胞或病毒的免疫反應(yīng)性氨基酸序列的免疫原性蛋白質(zhì)。還公開了一種疫苗,例如抗腸毒素誘導(dǎo)的疾病,它包含該免疫原性蛋白質(zhì),還公開了一種在個體中防止或治療腸毒素誘導(dǎo)的疾病的方法。文檔編號A61P31/04GK1189840SQ9619522公開日1998年8月5日申請日期1996年5月2日優(yōu)先權(quán)日1995年5月5日發(fā)明者簡·霍姆格倫,邁克爾R·里本斯申請人:簡·霍姆格倫,邁克爾R·里本斯