專利名稱：：非菌體性百日咳疫苗及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及非菌體性百日咳疫苗，及其成分和制備方法。相關(guān)申請(qǐng)參考本申請(qǐng)是1995年7月12日提交的共同未決的美國專利申請(qǐng)第08/501,743號(hào)的部分繼續(xù)申請(qǐng)，該申請(qǐng)是1995年5月4日提交的、共同未決的美國專利申請(qǐng)第08/433,646號(hào)的部分繼續(xù)申請(qǐng)。
背景技術(shù)：
：百日咳是由百日咳包特氏菌引起的嚴(yán)重傳染性上呼吸道傳染病。世界衛(wèi)生組織估計(jì)每年約有6千萬人罹患該病，50～100萬人相關(guān)死亡(參考文獻(xiàn)1?？v觀該文，引用的諸多文獻(xiàn)均列于括號(hào)中，它們?cè)敱M地?cái)⑹隽吮景l(fā)明所屬領(lǐng)域的現(xiàn)狀。每篇引用文獻(xiàn)的目錄信息均附錄于說明書之后、權(quán)利要求之前。這些公開內(nèi)容在此引入，作為本公開內(nèi)容的參考。)。未接種疫苗的5歲以下兒童的百日咳發(fā)病率高達(dá)80％(參考文獻(xiàn)2)。盡管百日咳普遍被認(rèn)為是一種兒童期疾病，但有越來越多的證據(jù)證明，在青少年和成人中，存在臨床和無癥狀感染(參考文獻(xiàn)3，4，5)。含有化學(xué)或熱滅活的百日咳桿菌菌體的全菌體性疫苗在20世紀(jì)40年代的引入，使百日咳桿菌引起的百日咳的發(fā)病率得到顯著降低。全菌體性百日咳疫苗的有效率根據(jù)對(duì)病例的不同定義估計(jì)可高達(dá)95％(參考文獻(xiàn)6)。盡管百日咳桿菌感染后可獲得終生免疫，但有越來越多的證據(jù)表明全菌體性百日咳疫苗免疫后，其保護(hù)作用逐漸減弱(參考文獻(xiàn)3)。幾篇報(bào)導(dǎo)敘述了全菌體性百日咳疫苗接種及其反應(yīng)性和嚴(yán)重副作用的關(guān)系，致使疫苗的可接受性下降，隨之而來的是百日咳重新流行(參考文獻(xiàn)7)。最近發(fā)展了確定成分百日咳疫苗。確定成分百日咳疫苗抗原目前已發(fā)展了多種非菌體性百日咳疫苗，含有百日咳桿菌抗原，百日咳毒素(PT)，絲狀血凝素(FHA)，69kDa外膜蛋白(pertactin)和菌毛凝集原(見下表。附表在說明書末尾)。百日咳毒素百日咳毒素是一種外毒素，為具有ADP-核糖基轉(zhuǎn)移酶活性的細(xì)菌毒素A/B家族中的一員(參考文獻(xiàn)8)。這些毒素的A部分顯示ADP-核糖基轉(zhuǎn)移酶活性，B部分介導(dǎo)毒素與宿主細(xì)胞受體的結(jié)合，并將A轉(zhuǎn)移至其作用部位。PT尚可促進(jìn)百日咳桿菌對(duì)纖毛上皮細(xì)胞的粘附(參考文獻(xiàn)9)，在百日咳桿菌侵襲巨噬細(xì)胞的過程中也具有一定意義(參考文獻(xiàn)10)。所有非菌體性百日咳疫苗均含有PT，該物質(zhì)被認(rèn)為是主要的毒力因子和保護(hù)性抗原(參考文獻(xiàn)11，12)。百日咳桿菌自然感染后，可產(chǎn)生針對(duì)PT的體液和細(xì)胞免疫(參考文獻(xiàn)13～17)。嬰兒具有通過胎盤獲得的抗～PT抗體(參考文獻(xiàn)16，18)，且人初乳中所含的抗-PT抗體可有效地被動(dòng)保護(hù)小鼠抵抗通過空氣的感染(參考文獻(xiàn)19)。非菌體性疫苗免疫后，可產(chǎn)生針對(duì)PT亞基的細(xì)胞免疫(CMI)應(yīng)答(參考文獻(xiàn)20)，而接種全菌體性疫苗后，可產(chǎn)生針對(duì)PT的CMI應(yīng)答(參考文獻(xiàn)13)。在動(dòng)物模型和人類中，全菌體性疫苗或成分疫苗中化學(xué)滅活的PT均具有保護(hù)性(參考文獻(xiàn)21)。而且，針對(duì)S1亞基的單克隆抗體可對(duì)百日咳桿菌的感染提供保護(hù)(參考文獻(xiàn)22，23)。PT的主要病理效應(yīng)基于其ADP-核糖基轉(zhuǎn)移酶活性。PT催化ADP-核糖從NAD轉(zhuǎn)移到G1鳥嘌呤核苷酸結(jié)合蛋白，從而干擾了細(xì)胞腺苷酸環(huán)化酶調(diào)節(jié)系統(tǒng)(參考文獻(xiàn)24)。PT還阻止巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞向炎癥部位的遷移，干擾中性粒細(xì)胞介導(dǎo)的吞噬作用和殺菌作用(參考文獻(xiàn)25)。有很多體內(nèi)和體外方法用來評(píng)價(jià)S1和/或PT的酶活性，包括牛轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白的ADP-核糖基化法(參考文獻(xiàn)26)，中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞聚集法(參考文獻(xiàn)27)，組胺致敏法(參考文獻(xiàn)28)，白細(xì)胞增多法和NAD糖水解酶法。當(dāng)CHO細(xì)胞與PT接觸后，可顯示一種特征性的聚集形態(tài)。這種現(xiàn)象有賴于PT的結(jié)合以及轉(zhuǎn)位，S1的ADP-核糖基轉(zhuǎn)移酶活性，因此，CHO細(xì)胞聚集法被廣泛應(yīng)用于檢測PT全毒素的完整性和毒性。絲狀血凝素絲狀血凝素是一種非毒性的大(220kDa)多肽，在細(xì)菌定居過程中，介導(dǎo)百日咳桿菌對(duì)上呼吸道纖毛細(xì)胞的粘附(參考文獻(xiàn)9，29)。自然感染可誘導(dǎo)抗-FHA抗體和細(xì)胞免疫(參考文獻(xiàn)13，15，17，30和31)。人初乳中含抗-FHA抗體，并可通過胎盤傳遞(參考文獻(xiàn)17，18和19)。接種全菌體性或非菌體性百日咳疫苗，可產(chǎn)生抗-FHA抗體，且含F(xiàn)HA的非菌體性疫苗還可誘導(dǎo)產(chǎn)生針對(duì)FHA的CMI應(yīng)答(參考文獻(xiàn)20，32)。在鼠呼吸道細(xì)菌攻擊模型中，主動(dòng)或被動(dòng)免疫后，F(xiàn)HA是一種保護(hù)性抗原(參考文獻(xiàn)33，34)。但是，在鼠腦內(nèi)細(xì)菌攻擊實(shí)驗(yàn)中，單獨(dú)的FHA不具有保護(hù)鼠的潛能(參考文獻(xiàn)28)。69kDa外膜蛋白(pertactin)69kDa蛋白是一種外膜蛋白，最初是從支氣管敗血性包特氏菌中鑒定的(參考文獻(xiàn)35)。它是一種針對(duì)支氣管敗血性包特氏菌的保護(hù)性抗原，后來在百日咳桿菌和副百日咳桿菌中均得到鑒定。69kDa蛋白可與真核細(xì)胞直接連接(參考文獻(xiàn)36)，百日咳桿菌自然感染后，可誘導(dǎo)抗-P.69的體液免疫應(yīng)答(參考文獻(xiàn)14)，P.69還可誘導(dǎo)細(xì)胞免疫應(yīng)答(參考文獻(xiàn)17，37，38)。接種全菌體性或非菌體性疫苗，可誘導(dǎo)產(chǎn)生抗-P.69抗體(參考文獻(xiàn)32，39)，且非菌體性疫苗還可誘導(dǎo)產(chǎn)生針對(duì)P.69的CMI應(yīng)答(參考文獻(xiàn)39)。Pertactin在百日咳桿菌的氣霧劑攻擊實(shí)驗(yàn)中，可保護(hù)小鼠(參考文獻(xiàn)40)，與FHA聯(lián)合應(yīng)用，在百日咳桿菌腦內(nèi)攻擊實(shí)驗(yàn)中，可保護(hù)小鼠(參考文獻(xiàn)41)。被動(dòng)轉(zhuǎn)移的多克隆或單克隆抗-P.69抗體，可保護(hù)小鼠避免氣霧劑攻擊的感染(參考文獻(xiàn)42)。凝集原百日咳桿菌的血清型是通過其菌毛凝集來確定的。WHO推薦的全菌體性疫苗包括1，2和3型凝集原(Aggs)，因?yàn)樗鼈冎g不具有交叉保護(hù)能力(參考文獻(xiàn)43)。Agg1不是菌毛成分，存在于所有的百日咳菌株中，而血清型2和3Aggs則是菌毛成分。自然感染或接種全菌體性或非菌體性疫苗可誘導(dǎo)抗-Agg抗體(參考文獻(xiàn)15，32)。小鼠氣霧劑感染后，可產(chǎn)生針對(duì)Agg2和Agg3的特異性細(xì)胞免疫應(yīng)答(參考文獻(xiàn)17)。Aggs2和3在小鼠呼吸道細(xì)菌攻擊實(shí)驗(yàn)中，具有保護(hù)作用，含有抗-凝集原抗體的人初乳在此試驗(yàn)中也具有保護(hù)作用(參考文獻(xiàn)19，44，45)。非菌體性疫苗第一種非菌體性疫苗是由Sato等開發(fā)的雙成分PT+FHA疫苗(JNIH6)(參考文獻(xiàn)46)。這種疫苗的制備是從百日咳桿菌株Tohama的培養(yǎng)上清中純化PT和FHA抗原，之后用福爾馬林脫毒。1981年以來，日本成功地應(yīng)用多廠家、多種組分的非菌體性百日咳疫苗免疫兒童，預(yù)防百日咳，使該病的發(fā)病率大大降低(參考文獻(xiàn)47)。1986年，JNIH6疫苗和一種單成分PT類毒素疫苗(JNIH7)在瑞典進(jìn)行了大型臨床試驗(yàn)的測試。開始的結(jié)果顯示，這兩種疫苗的有效率較全菌體性疫苗報(bào)告的為低，但隨后的研究顯示，它們對(duì)通過血清學(xué)方法診斷的輕型疾病更有效(參考文獻(xiàn)48，49，50，51)。但是，有證據(jù)顯示這些疫苗中福爾馬林滅活的PT出現(xiàn)毒性復(fù)活。還發(fā)現(xiàn)這些疫苗對(duì)疾病的保護(hù)性優(yōu)于對(duì)感染的保護(hù)性。最近，評(píng)估了很多新的非菌體性百日咳疫苗，它們均含有PT，F(xiàn)HA，P.69和/或凝集原的組合物，這些疫苗列于表1。幾種化學(xué)脫毒技術(shù)應(yīng)用于PT，包括應(yīng)用福爾馬林(參考文獻(xiàn)46)，戊二醛(參考文獻(xiàn)52)，過氧化氫(參考文獻(xiàn)53)和四硝基甲烷(參考文獻(xiàn)54)滅活。但是，目前商用的非菌體性百日咳疫苗可能不含有適于免疫的適宜抗原的合適制劑，以在百日咳易感人群中獲得理想效果。提供一種含有選定相對(duì)劑量的選定抗原的有效非菌體性百日咳疫苗及其制備方法將是順應(yīng)需求的。發(fā)明簡述本發(fā)明涉及非菌體性百日咳疫苗制劑，其成分，制備方法，及應(yīng)用方法。本發(fā)明的另一方面，提供了一種含有本文所述菌毛凝集原制劑的免疫原性組合物。這種免疫原性組合物可作為疫苗體內(nèi)應(yīng)用以保護(hù)經(jīng)它免疫后的宿主避免包特氏菌感染，該組合物還包括至少一種其他包特氏菌抗原。這種至少一種其他包特氏菌抗原可以是絲狀血凝素，69kDa外膜蛋白，腺苷酸環(huán)化酶，包特氏菌脂寡糖，外膜蛋白和百日咳毒素或其類毒素，包括其遺傳脫毒類似物。本發(fā)明的另一方面，本文提供的免疫原性組合物，包括至少一種非包特氏菌免疫原。這種非包特氏菌免疫原可以是白喉類毒素，破傷風(fēng)類毒素，嗜血桿菌屬莢膜多糖，嗜血桿菌屬外膜蛋白，乙型肝炎病毒表面抗原，脊髓灰質(zhì)炎病毒，流行性腮腺炎病毒，麻疹病毒和/或風(fēng)疹病毒。本文提供的免疫原性組合物尚包含一種佐劑，這種佐劑可以是磷酸鋁，氫氧化鋁，QuilA，QS21，磷酸鈣，氫氧化鈣，氫氧化鋅，糖脂類似物，氨基酸的十八烷基酯或脂蛋白。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了一種為保護(hù)易感人群避免百日咳桿菌感染的疫苗組合物，包括選定相對(duì)劑量的純化型百日咳類毒素，絲狀血凝素，pertactin和菌毛凝集原，可以為至少約70％的易感人群提供保護(hù)。這種疫苗組合物含有約5～30μg氮的百日咳類毒素，約5～30μg氮的絲狀血凝素，約3～15μg氮的pertactin和約1～10μg氮的菌毛凝集原。在一個(gè)特定實(shí)施方案中，疫苗含有的百日咳類毒素，絲狀血凝素，69kDa蛋白和包特氏菌菌毛凝集原重量比約為10∶5∶5∶3，即在單人劑量中，含有約10μg的百日咳類毒素，約5μg的絲狀血凝素，約5μg的69kDa蛋白和約3μg的菌毛凝集原。在另一個(gè)特定實(shí)施方案中，疫苗含有的百日咳類毒素，絲狀血凝素，69kDa蛋白和菌毛凝集原重量比約為20∶20∶5∶3，即在單人劑量中，含有約20μg的百日咳類毒素，約20μg的絲狀血凝素，約5μg的69kDa蛋白和約3μg的菌毛凝集原。在另一個(gè)特定實(shí)施方案中，疫苗含有的百日咳類毒素，絲狀血凝素，69kDa蛋白和菌毛凝集原重量比約為20∶10∶10∶6，即在單人劑量中，含有約20μg的百日咳類毒素，約10μg的絲狀血凝素，約10μg的69kDa蛋白和約6μg的菌毛凝集原。對(duì)于陣發(fā)性咳嗽持續(xù)至少21天并培養(yǎng)確證細(xì)菌感染的病例，本發(fā)明疫苗組合物對(duì)易感人群的保護(hù)范圍至少約為80％，優(yōu)選約為85％。對(duì)于咳嗽持續(xù)至少1天的輕型百日咳病例，該疫苗的保護(hù)范圍至少約為70％。疫苗的凝集原成分優(yōu)選菌毛凝集原2(Agg2)和菌毛凝集原3(Agg3)，基本上不含凝集原1。Agg2和Agg3的重量比約為1.5∶1～2∶1。本文提供的疫苗尚可與白喉類毒素和破傷風(fēng)類毒素聯(lián)合應(yīng)用，提供一種白-破-百三聯(lián)疫苗。在一個(gè)實(shí)施方案中，疫苗含有大約15Lfs的白喉類毒素和約5Lfs的破傷風(fēng)類毒素。另外，疫苗還包括一種佐劑，特別是礬。本發(fā)明的另一方面尚提供了一種免疫易感人群避免百日咳桿菌感染的方法，包括給易感人群應(yīng)用免疫有效劑量的本文提供的疫苗組合物，該疫苗組合物可以為至少70％的易感人群提供保護(hù)。本發(fā)明的優(yōu)勢(shì)包括一種提高了效果的改良非菌體性百日咳疫苗。本發(fā)明在另一方面尚提供了應(yīng)用于生產(chǎn)疫苗組合物的純化型百日咳類毒素，絲狀血凝素，pertactin和菌毛凝集原，該組合物應(yīng)用于易感人群，可以為至少約70％的成員提供保護(hù)。在這種用途上，疫苗的單人劑量包括約30μg氮的pertactin和約1～10μg氮的菌毛凝集原。特別是美國政府國立變態(tài)反應(yīng)與傳染病研究所(NIAID)選擇本疫苗組合物進(jìn)行雙盲臨床療效觀察，以期在該領(lǐng)域的專家中，建立充分的基礎(chǔ)，證明該組合物可以在一定程度上有效抑制該病(百日咳)。該課題(成為一種疫苗)遇到了合理預(yù)計(jì)應(yīng)用結(jié)果的困難。附圖簡述結(jié)合后文的發(fā)明詳述、參考實(shí)例和附圖，將對(duì)本發(fā)明有一個(gè)更加深刻的理解。圖1是從包特氏菌株中分離制備凝集原的技術(shù)流程圖。發(fā)明詳述圖1顯示了從包特氏菌株中制備凝集原的流程。如圖1所示，一種含有凝集原的包特氏菌細(xì)胞勻漿，如百日咳桿菌細(xì)胞勻漿，用含有尿素的緩沖液，如10mM的磷酸鉀，150mM的氯化鈉和4M尿素，從細(xì)菌細(xì)胞勻漿中選擇性提取凝集原，產(chǎn)生含有凝集原的第一上清(sp1)和第一沉淀(ppt1)。第一上清(sp1)和第一沉淀(ppt1)可通過離心法分離。棄去沉淀(ppt1)。澄清上清(sp1)可通過應(yīng)用10mM的磷酸鉀/150mM的氯化鈉/0.1％TritonX-100和100～300kDaNMWL薄膜濾器進(jìn)行濃縮和透濾。然后將第一上清在適宜的溫度下溫育一段時(shí)間，以產(chǎn)生含有凝集原的澄清上清液(sp2)和不含凝集原的棄去沉淀(ppt2)。適宜的溫度包括約50～100℃，包括75～85℃，適宜的溫育時(shí)間包括1～60分鐘。第二次上清可加入分子量約為8000的聚乙二醇(PEG8000)使其終濃度約為4.5±0.2％，并輕輕攪拌至少約30分鐘而濃縮，以產(chǎn)生第三沉淀(ppt3)。離心收集沉淀，棄去上清(sp3)。第三沉淀(ppt3)可用含有如10mM的磷酸鉀/150mM的氯化鈉的緩沖液提取，制成含有菌毛凝集原的原液。然后將1M磷酸鉀加入原液，使其終濃度為100mM。另外，含熱處理菌毛凝集原的澄清上清還可通過凝膠過濾色譜法，如應(yīng)用SepharoseCL6B膠，而非沉淀法進(jìn)行純化。原液中的菌毛凝集原再通過柱層析，如通過PEI硅石柱，進(jìn)行純化，以得到含菌毛凝集原制劑的過柱液。含菌毛凝集原的過柱液還可用含有10mM磷酸鉀/150mM氯化鈉的緩沖液和100～300kDaNMWL薄膜濾器進(jìn)行濃縮和透濾。凝集原制劑還要通過一個(gè)≤0.22μM的微孔薄膜濾器過濾除菌，最后得到含有菌毛凝集原2和3的精制凝集原制劑。從包特氏菌株得到的凝集原制劑包括菌毛凝集原2(Agg2)和菌毛凝集原3(Agg3)，基本上不包括凝集原1。Agg2和Agg3的重量比約為1.5∶1～2∶1。這種菌毛凝集原制劑可通過這里提供的上述方法制備獲得。本發(fā)明還包括用上述方法制備的含有菌毛凝集原的其它免疫原性組合物(包括疫苗)。還包括用這些疫苗包括其它包特氏菌免疫原，包括絲狀血凝素，69kDa外膜蛋白，百日咳毒素或其類毒素，包括如在文獻(xiàn)68中所述的遺傳脫毒的PT類似物。這些疫苗包括非包特氏菌免疫原，如白喉類毒素，破傷風(fēng)類毒素，嗜血桿菌屬莢膜多糖，嗜血桿菌屬外膜蛋白，乙型肝炎病毒表面抗原，脊髓灰質(zhì)炎病毒，流行性腮腺炎病毒，麻疹病毒和/或風(fēng)疹病毒。每一種包特氏菌抗原均分別吸附于佐劑(如礬)，以方便、快速地生產(chǎn)本文提供的含有選定相對(duì)劑量抗原的疫苗，該疫苗可以為至少70％的易感人群提供保護(hù)，優(yōu)選可以為至少80％的易感人群提供保護(hù)。在備選實(shí)施方案中，本發(fā)明提供具有以下特征的疫苗(這里用的μg蛋白質(zhì)，是根據(jù)純化濃縮物進(jìn)行Kjedahl實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，表示為蛋白質(zhì)含氮的μg數(shù))，均可用于肌肉注射。(a)CP10/5/5/3DT一種包括成分百日咳疫苗和白喉、破傷風(fēng)類毒素的聯(lián)合制劑被命名為CP10/5/5/3DT。每0.5ml人用劑量CP10/5/5/3DT包括10μg百日咳類毒素(PT)5μg絲狀血凝素(FHA)5μg菌毛凝集原2和3(FIMB)3μg69kDa外膜蛋白15Lf白喉類毒素5Lf破傷風(fēng)類毒素1.5mg磷酸鋁0.6％2-苯氧基乙醇，作為保存劑(b)CP20/20/5/3DT另一種包括成分百日咳疫苗和白喉、破傷風(fēng)類毒素的聯(lián)合制劑被命名為CP20/20/5/3DT。每0.5ml人用劑量CP20/20/5/3DT包括20μg百日咳類毒素(PT)20μg絲狀血凝素(FHA)5μg菌毛凝集原2和3(FIMB)3μg69kDa外膜蛋白15Lf白喉類毒素5Lf破傷風(fēng)類毒素1.5mg磷酸鋁0.6％2-苯氧基乙醇，作為保存劑(c)CP10/5/5DT另一種包括成分百日咳疫苗和白喉、破傷風(fēng)類毒素的聯(lián)合制劑被命名為CP10/5/5DT。每0.5ml人用劑量CP10/5/5DT包括10μg百日咳類毒素(PT)5μg絲狀血凝素(FHA)5μg菌毛凝集原2和3(FIMB)15Lf白喉類毒素5Lf破傷風(fēng)類毒素1.5mg磷酸鋁0.6％2-苯氧基乙醇，作為保存劑(d)CP20/10/10/6DT另一種包括成分百日咳疫苗和白喉、破傷風(fēng)類毒素的聯(lián)合制劑被命名為CP20/10/10/6DT。每0.5ml人用劑量CP20/10/10/6DT包括20μg百日咳類毒素(PT)10μg絲狀血凝素(FHA)10μg菌毛凝集原2和3(FIMB)6μg69kDa外膜蛋白15Lf白喉類毒素5Lf破傷風(fēng)類毒素1.5mg磷酸鋁0.6％2-苯氧基乙醇，作為保存劑其它包特氏菌免疫原，百日咳毒素(包括其遺傳脫毒類似物，如在此引入作為參考的Klein等轉(zhuǎn)讓給受讓人的美國專利第5,085,862號(hào))，F(xiàn)HA和69kDa蛋白，可用下述方法生產(chǎn)。PT的純化PT可以用傳統(tǒng)方法從百日咳桿菌的培養(yǎng)上清中分離得到。如可應(yīng)用Sekura等的方法(參考文獻(xiàn)55)。PT的分離包括，首先將培養(yǎng)上清吸附于含染料配體的凝膠基質(zhì)Affi-GelBlue(Bio-Rad實(shí)驗(yàn)室，Richmond，CA)的柱上，然后用高濃度鹽，如0.75M氯化鎂洗柱，將PT洗脫下來，去鹽后，將含PT的洗脫液再過一次柱，該柱為胎球蛋白-Sepharose親和基質(zhì)，含有胎球蛋白及與其相連的溴化氰活化的Sepharose。用4M鎂鹽溶液將PT從胎球蛋白柱上洗脫下來。另外，還可采用Irons等(參考文獻(xiàn)56)的方法進(jìn)行PT的純化。將培養(yǎng)上清吸附于經(jīng)溴化氰活化并已與結(jié)合珠蛋白共價(jià)結(jié)合的Sepharose4B柱上。PT在pH6.5時(shí)與吸附劑結(jié)合，應(yīng)用0.1MTris/0.5MNaCl緩沖液洗柱，pH逐漸改變至10時(shí)，PT從柱上洗脫下來。另外，于1987年11月10日授予Scott等的美國專利第4,705,686號(hào)所闡述的方法，在此引入，亦作為參考。在該方法中，百日咳桿菌的培養(yǎng)上清或其提取物經(jīng)過一個(gè)陰離子交換樹脂柱，該柱可以充分吸附內(nèi)毒素，而允許包特氏菌的抗原成分流出，或與內(nèi)毒素分離。另外，PT還可應(yīng)用珍珠巖層析法進(jìn)行純化，如在此引入作為參考的轉(zhuǎn)讓給受讓人的EP專利第336,736號(hào)所述。PT的脫毒PT的脫毒就是除去其在最后應(yīng)用中可能引起副作用的不需要活性。多種傳統(tǒng)化學(xué)脫毒的方法均可應(yīng)用，如用福爾馬林、過氧化氫、四硝基甲烷和戊二醛處理。例如，PT可以采用Munoz等(參考文獻(xiàn)57)描述的改良戊二醛法脫毒。在此脫毒過程中，純化的PT溫育于0.01M磷酸鹽鹽水緩沖溶液中。將戊二醛加入該溶液至終濃度為0.05％，室溫溫育2小時(shí)，再加入L-賴氨酸至終濃度為0.02M。室溫溫育2小時(shí)后，在0.01MPBS中透析2天。在一個(gè)特定實(shí)施方案中，可應(yīng)用EP專利第336,736號(hào)描述的脫毒過程。簡而言之，PT可用下述方法應(yīng)用戊二醛脫毒溶解于pH8.0，含0.22M氯化鈉的75mM磷酸鉀溶液中的純化PT，用等體積甘油稀釋至蛋白濃度約為50～400μg/ml。將溶液加熱至37℃后，加入戊二醛至終濃度為0.5％(w/v)以去除毒性。37℃溫育4小時(shí)后，加入天冬氨酸(1.5M)至終濃度為0.25M。室溫溫育1小時(shí)，用10倍體積的pH8.0，含0.15M氯化鈉和5％甘油的10mM磷酸鉀溶液透濾，以減少甘油，去除戊二醛。最后將PT類毒素通過0.2μM的微孔薄膜濾器以濾過除菌。如果應(yīng)用重組技術(shù)制備了無毒或少毒的PT突變分子，作為PT類毒素分子，就不必進(jìn)行化學(xué)脫毒了。FHA的純化基本如Cowell等所述(參考文獻(xiàn)58)，F(xiàn)HA可從細(xì)菌培養(yǎng)上清中純化。生長促進(jìn)因子，如甲基化β-環(huán)糊精，可以用來增加培養(yǎng)上清中FHA的產(chǎn)量。將培養(yǎng)上清上羥基磷灰石柱。FHA吸附在柱上，而PT則否。用大量TritonX-100洗柱以去除內(nèi)毒素。然后，用含0.5M氯化鈉的0.1M磷酸鈉溶液洗脫FHA，如有必要，可再過胎球蛋白-Sepharose柱以去除殘留的PT。此外，純化尚可包括過SepharoseCL-6B柱。另外，F(xiàn)HA還可應(yīng)用針對(duì)該抗原的單克隆抗體予以純化，該單克隆抗體已附于溴化氰活化的親和柱上(參考文獻(xiàn)59)。另外，F(xiàn)HA還可應(yīng)用上述EP專利336,736所述的珍珠巖層析法予以純化。69kDa外膜蛋白(pertactin)的純化69kDa外膜蛋白(69K或pertactin)可從應(yīng)用抑菌劑如硫柳汞滅活的細(xì)菌菌體中獲得，正如在此引入作為參考的已發(fā)表EP專利484,621所述。滅活的細(xì)菌懸浮于水溶液中，如PBS(pH7～8)，反復(fù)加熱(45～60℃)后冷卻至室溫或4℃以抽提。抽提過程使69K蛋白質(zhì)從菌體中釋放出來。用沉降法收集含有69K蛋白質(zhì)的物質(zhì)并過Affi-gelBlue柱。用高濃度鹽，如0.5M氯化鎂將69K蛋白質(zhì)洗脫下來。透析后，過聚焦層析支持物。另外，69kDa蛋白質(zhì)尚可應(yīng)用以本文中受讓人名義在此引入作為參考的已發(fā)表PCT申請(qǐng)WO91/15505所述的方法，從百日咳桿菌培養(yǎng)上清中純化。其它從百日咳桿菌中純化69kDa外膜蛋白的方法，尚可見于1984年1月4日授予Gotto等的美國專利第5,276,142號(hào)和1992年3月31日授予Burns的美國專利第5,101,014號(hào)。這里描述了許多已實(shí)施的人類臨床試驗(yàn)，以建立一種安全、無副反應(yīng)的有用的成分疫苗以預(yù)防百日咳。特別是，對(duì)疫苗中包含的每一種抗原產(chǎn)生了免疫應(yīng)答(如下表3所示)。在一組大的安慰劑對(duì)照、多中心參與、雙隨機(jī)分組的易感人群臨床試驗(yàn)中，分析了一種非菌體疫苗CP10/5/5/3DT，以對(duì)其預(yù)防典型百日咳的效果予以評(píng)估。典型百日咳的診斷標(biāo)準(zhǔn)是陣發(fā)性咳嗽21天或以上，合并以下之一者培養(yǎng)確證百日咳桿菌感染，或血清學(xué)證據(jù)證明百日咳特異性感染，證據(jù)為用ELISA方法顯示的雙份血清中抗FHA或PT的IgG或IgA抗體升高100％?；蛉缛狈ρ鍖W(xué)證據(jù)，在受試兒童開始咳嗽之前或之后28天內(nèi)，曾與培養(yǎng)確證百日咳桿菌感染的患者密切接觸。這項(xiàng)研究的結(jié)果表明，CP10/5/5/3DT可有效預(yù)防大約85％的典型病例。在同一研究中，僅含PT和FHA的雙成分百日咳非菌體性疫苗，其有效率約為58％，而全菌體性疫苗的有效率約為48％(見下表4)。另外，CP10/5/5/3DT疫苗對(duì)咳嗽持續(xù)至少1天的輕型百日咳的有效率約為77％。特別是，獲得的針對(duì)疫苗的免疫應(yīng)答概況，與全菌體性疫苗免疫后獲得的免疫基本相同，據(jù)報(bào)導(dǎo)，后者可高效預(yù)防百日咳。疫苗的制備和應(yīng)用宜于作為疫苗的免疫原性組合物可用這里公開的方法從包特氏菌中制備。疫苗刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答，產(chǎn)生的抗體可具有調(diào)理作用或殺菌作用。如果接種了疫苗的機(jī)體再次遭遇百日咳桿菌，這些抗體將與細(xì)菌結(jié)合并滅活之。而且，有調(diào)理作用和殺菌作用的抗體還可能通過其它機(jī)制提供保護(hù)。包括疫苗的免疫原性組合物應(yīng)制為可注射的流體溶液或乳液。包特氏菌免疫原應(yīng)與與之可配伍的藥用賦形物混合。這些賦形物可包括水，鹽水，右旋葡萄糖，甘油，乙醇和其組合物。免疫原性組合物及疫苗尚應(yīng)包括一些附加物，如濕化或乳化劑，pH緩沖劑或佐劑以增強(qiáng)其效果。免疫原性組合物和疫苗采用非腸道用藥，即皮下注射或肌肉注射。免疫原性制劑和疫苗的應(yīng)用方式要配以合適的劑量，而且該劑量應(yīng)治療有效，具免疫原性與保護(hù)性。應(yīng)用劑量有賴于受體本身，包括該個(gè)體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生抗體的能力，如果需要，尚包括產(chǎn)生細(xì)胞免疫的能力。所需活性成分的準(zhǔn)確用量有賴于醫(yī)師的判斷。然而，本領(lǐng)域的技術(shù)人員易于確定適宜的劑量范圍，可以是毫克數(shù)量級(jí)的免疫原。首次用藥和加強(qiáng)劑量的適宜方案也多種多樣，但應(yīng)包括首次用藥和隨后加強(qiáng)用藥。劑量還有賴于用藥途徑和宿主身材大小。根據(jù)本發(fā)明，免疫原性組合物中免疫原的濃度一般約為1～95％。僅含有一種病原體抗原物質(zhì)的疫苗為單價(jià)疫苗。含有多種病原體抗原物質(zhì)的疫苗為聯(lián)合疫苗，屬于本發(fā)明范疇。這種聯(lián)合疫苗含有，如多種病原體、或同種病原體的不同菌株、或多種聯(lián)合病原體的物質(zhì)。如果抗原與佐劑同時(shí)應(yīng)用，其免疫原性會(huì)得到顯著提高。佐劑的濃度一般為0.005～0.5％，溶于磷酸緩沖鹽水溶液中。佐劑增強(qiáng)抗原的免疫原性，但其本身不必具有免疫原性。佐劑可以將抗原保留在用藥局部，產(chǎn)生儲(chǔ)存效應(yīng)，緩慢、持續(xù)地將抗原釋放至免疫系統(tǒng)的細(xì)胞。佐劑還可以將免疫細(xì)胞吸引至抗原儲(chǔ)存處，刺激這些細(xì)胞產(chǎn)生免疫應(yīng)答。免疫刺激劑或佐劑被用來提高宿主對(duì)，如疫苗，的免疫應(yīng)答已有多年。內(nèi)源性佐劑，如脂多糖，一般是作為疫苗的死菌或減毒菌的成分。外源性佐劑是免疫調(diào)節(jié)劑，常與抗原非共價(jià)連接，提高宿主免疫應(yīng)答。但是，佐劑被鑒定只能提高對(duì)非腸道應(yīng)用的抗原的免疫應(yīng)答。而一些佐劑具有毒性，會(huì)引起不必要的副反應(yīng)，使它們不適用于人類和多種動(dòng)物。確實(shí)，只有氫氧化鋁和磷酸鋁(一般合稱為礬)常規(guī)作為佐劑用于人類和獸用疫苗。礬提高對(duì)白喉和破傷風(fēng)類毒素抗體應(yīng)答的效果已經(jīng)確立，就在最近，一種乙型肝炎表面抗原疫苗也用礬作為佐劑。盡管礬的有效性在一些申請(qǐng)中已確立，但其仍有局限性。例如，礬在流感疫苗中無效，不能持續(xù)產(chǎn)生細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答。以礬作為佐劑的抗原刺激小鼠產(chǎn)生的抗體主要為IgG1亞型，對(duì)于一些疫苗制劑，此亞型不能提供最佳保護(hù)。多種外源性佐劑可刺激機(jī)體對(duì)抗原產(chǎn)生有效的免疫應(yīng)答。這些包括皂角甙與膜蛋白抗原的復(fù)合物(免疫刺激復(fù)合物)、含礦物油的普盧蘭尼克聚合物、礦物油中的死亡分枝桿菌，F(xiàn)reund’s完全佐劑，細(xì)菌產(chǎn)物，如胞壁酰二肽(MDP)和脂多糖(LPS)，以及脂質(zhì)A和脂質(zhì)體。為了有效誘導(dǎo)體液免疫應(yīng)答(HIR)和細(xì)胞介導(dǎo)的免疫(CMI)，免疫原通常在佐劑中乳化。很多佐劑具有毒性，誘導(dǎo)產(chǎn)生肉芽腫、急性和慢性炎癥(Freund’s完全佐劑，F(xiàn)CA)、細(xì)胞溶解(皂角甙和普盧蘭尼克聚合物)和致熱原性、關(guān)節(jié)炎和前葡萄膜炎(LPS和MDP)。盡管FCA作為一種很好的佐劑在研究中廣泛應(yīng)用，但由于其毒性而未獲準(zhǔn)用于人類和獸用疫苗。理想佐劑應(yīng)包括以下所需特征(1)無毒性；(2)刺激機(jī)體產(chǎn)生持續(xù)免疫應(yīng)答的能力；(3)生產(chǎn)簡便，長期儲(chǔ)存中性質(zhì)穩(wěn)定；(4)對(duì)多種途徑應(yīng)用的抗原均可激發(fā)CMI和HIR；(5)可與其它佐劑協(xié)同作用；(6)具有與不同抗原提呈細(xì)胞(APC)選擇性作用的能力；(7)具有特異激發(fā)適宜TH1或TH2細(xì)胞特異性免疫應(yīng)答的能力；(8)選擇性提高針對(duì)抗原的適宜抗體亞型水平(如，IgA)的能力；在此引入作為參考的于1989年8月8日授予Lockhoff等的美國專利第4,855,283號(hào)，介紹了將糖脂類似物包括糖基用氨基酸取代的N-糖基酰胺，N-糖基脲和N-糖基氨基甲酸酯作為免疫調(diào)節(jié)劑或佐劑。而且，Lockhoff等(美國專利第4,855,283號(hào)和參考文獻(xiàn)60)報(bào)導(dǎo)了N-糖脂類似物與天然存在的糖脂，如鞘糖脂和糖基甘油脂結(jié)構(gòu)類似，并在單純皰疹病毒疫苗和假狂犬病病毒疫苗的應(yīng)用中，能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生很強(qiáng)的免疫應(yīng)答。有些糖脂可從長鏈烷基胺和脂肪酸合成，該長鏈烷基胺和脂肪酸通過異頭碳原子直接與糖連接以模仿天然存在的脂基功能。在此引入作為參考的授予Moloney的美國專利第4,258,029號(hào)，已轉(zhuǎn)讓給本文中受讓人。在該專利中，介紹了將十八烷基酪氨酸鹽酸鹽作為佐劑與破傷風(fēng)類毒素和福爾馬林滅活的I，II，III型脊髓灰質(zhì)炎病毒疫苗聯(lián)合應(yīng)用。Nixon-George等(參考文獻(xiàn)61)也報(bào)導(dǎo)了將芳香族氨基酸的十八烷基酯與重組乙型肝炎表面抗原混合，增強(qiáng)宿主對(duì)乙型肝炎病毒的免疫應(yīng)答。實(shí)例以上公開內(nèi)容梗概描述了本發(fā)明。參考以下具體實(shí)例，可獲得對(duì)本發(fā)明更加全面的理解。這些實(shí)例僅作為說明，而非限制本發(fā)明的范圍如果要求便利，形式的改變和等價(jià)物的取代均在考慮之列。盡管這里應(yīng)用了特殊術(shù)語，但這些術(shù)語僅作為說明，而非限制本發(fā)明的范圍。所用蛋白質(zhì)的生物化學(xué)、發(fā)酵和免疫學(xué)方法在本公開內(nèi)容中不予詳述。這些實(shí)例在科學(xué)文獻(xiàn)中大量報(bào)導(dǎo)，并在本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員的能力范圍之內(nèi)。實(shí)施例1本實(shí)例描述了百日咳桿菌的生長。主菌種百日咳桿菌菌株主菌種培養(yǎng)物分批存于2～8℃，凍干狀態(tài)。工作菌種凍干培養(yǎng)物在Hornibrook培養(yǎng)基中復(fù)蘇，并接種到Bordet-Gengou瓊脂(BGA)平皿上。Hornibrook培養(yǎng)基含下列成分組分1升中含量酪蛋白水解產(chǎn)物(活性炭處理)10.0g煙酸0.001g氯化鈣0.002g氯化鈉5.0g六水合氯化鎂0.025g氯化鉀0.200g磷酸二氫鉀0.250g淀粉1.0g蒸餾水加至1升用1％碳酸鈉溶液調(diào)整pH至6.9±0.1。將培養(yǎng)基分裝至試管中，先在消毒鍋中蒸20分鐘，然后在121～124℃高壓滅菌20分鐘。接種菌種兩次，第一次在BGA平皿，然后在成分百日咳瓊脂(CPA)。成分百日咳瓊脂(CPA)含有下列組合物氯化鈉2.5g/L磷酸二氫鉀0.5g/L氯化鉀0.2g/L六水合氯化鎂0.1g/LTris堿1.5g/L酪蛋白氨基酸10.0g/L谷氨酸氫鈉10.0g/L濃鹽酸至pH7.2瓊脂15.0g/L生長因子(CPGF)10.0mL/L成分百日咳生長因子(CPGF)-100X含有下列組合物左旋半胱氨酸鹽酸鹽4.0g/L煙酸0.4g/L抗壞血酸40.0g/L谷胱甘肽，還原型15.0g/L七水合硫酸亞鐵1.0g/L二甲基-β-環(huán)糊精100g/L二水合氯化鈣2.0g/L最終培養(yǎng)產(chǎn)物懸浮于百日咳菌種懸浮緩沖液(CPSB)中，2～4ml等量分裝，-60～-80℃冷凍儲(chǔ)存。百日咳菌種懸浮緩沖液(PSSB)含有下列組合物酪蛋白氨基酸10.0g/LTris堿1.5g/L無水甘油100m/L濃鹽酸至pH7.2這些甘油懸浮液提供了制備工作菌種的起始物質(zhì)。培養(yǎng)過程工作菌種在成分百日咳瓊脂Roux瓶中，34～38℃培養(yǎng)4～7天。培養(yǎng)后，用百日咳成分肉湯(CPB)將菌體從瓊脂上洗下來。革蘭氏染色觀察培養(yǎng)物純度和混濁度。菌體轉(zhuǎn)移至含有CPB的4升錐形瓶中，34～38℃振蕩溫育20～26小時(shí)。革蘭氏染色觀察樣本，檢驗(yàn)培養(yǎng)物純度。收集瓶中懸浮液，接種到含有CPB(10升體積，起始OD600為0.1～0.4)的兩個(gè)發(fā)酵罐中。菌種生長至終OD600為5.0～10.0。革蘭氏染色檢驗(yàn)培養(yǎng)物純度，抗原特異性ELISAs檢驗(yàn)無菌性。實(shí)例2本實(shí)例描述從百日咳桿菌培養(yǎng)物中純化抗原的方法。在肉湯中的制備和細(xì)菌的濃縮細(xì)菌懸浮液用兩個(gè)發(fā)酵罐在34～37℃培養(yǎng)35～50小時(shí)。發(fā)酵罐經(jīng)過培養(yǎng)基無菌檢驗(yàn)。懸浮液用連續(xù)流動(dòng)圓盤堆積離心法(12,000×g)分離細(xì)菌與肉湯。收集細(xì)菌，準(zhǔn)備提取菌毛成分。澄清的液體通過一個(gè)≤0.22μm的微孔薄膜濾器。過濾后的液體再通過10～30kDa標(biāo)稱分子量限制(NMWL)膜超濾濃縮。濃縮后的液體儲(chǔ)存以備分離純化百日咳毒素(PT)，絲狀血凝素(FHA)和69kDa(pertactin)成分。肉湯成分的分離肉湯成分(69kDa，PT和FHA)可以應(yīng)用珍珠巖層析法和選擇性洗脫步驟進(jìn)行分離和純化，基本上是上述EP專利第336,736號(hào)和申請(qǐng)人發(fā)表的PCT申請(qǐng)第WO.91/15505號(hào)中描述的方法。具體的有效純化操作見下述。百日咳毒素(PT)用50mMTris，50mMTris/0.5％TritonX-100和50mMTris緩沖液洗珍珠巖柱。PT部分可用50mMTris/0.12MNaCl緩沖液從柱上洗脫下來。從珍珠巖柱上洗脫下來的PT部分再上羥基磷灰石柱，然后用30mM的磷酸鉀緩沖液洗柱。PT可用75mM磷酸鉀/225mM氯化鈉緩沖液洗脫。用200mM磷酸鉀/0.6M氯化鈉/0.6氯化鈉緩沖液洗柱以收獲FHA部分并棄之。將甘油加入純化的PT中至終濃度為50％。將混合物保存于2～8℃，直至1周內(nèi)脫毒完成。絲狀血凝素(FHA)FHA部分可用50mMTris/0.6MNaCl從珍珠巖柱上洗脫下來，再經(jīng)羥基磷灰石柱層析純化。從珍珠巖柱上洗脫下來的FHA部分再上羥基磷灰石柱，先用含有0.5％TritonX-100的30mM的磷酸鉀洗柱，然后再用30mM的磷酸鉀緩沖液洗柱。用85mM的磷酸鉀緩沖液將PT部分洗脫下來并棄之。最后用200mM磷酸鉀/0.6M氯化鈉將FHA部分洗脫下來。2～8℃保存至1周內(nèi)脫毒完成。69kDa(pertactin)將濃肉湯用注射用水(WFI)稀釋至其傳導(dǎo)率為3～4mS/cm，上珍珠巖柱。每毫升珍珠巖柱上0.5～3.5mg蛋白質(zhì)。流出液(69kDa成分部分)再通過10～30kDaNMWL膜進(jìn)行濃縮。將硫酸銨加入濃縮的流出液至終濃度為35％±3％(w/v)，該混合物于2～8℃保存4±2天或立即離心(7000×g)。移出多余上清，收集離心(7000×g)沉淀。69kDa沉淀或凍存于-20～-30℃，或溶解于Tris或磷酸緩沖液中立即應(yīng)用。珍珠巖柱的濃縮流出液加35％(w/v)硫酸銨沉淀所得的69kDa外膜蛋白可用來純化。將硫酸銨(每升100±5g)加入69kDa部分，2～8℃至少攪拌2小時(shí)。離心(7,000×g)收集上清。將硫酸銨(每升100～150g)力入上清部分，2～8℃至少攪拌2小時(shí)。離心(7,000×g)收集沉淀，溶解在pH8的10mMTrisHCl中。溶液的離子強(qiáng)度調(diào)整至與10mMTrisHCl(pH8)等價(jià)，并含15mM硫酸銨。將69kDa蛋白上前后連接的羥基磷灰石柱和Q-Sepharose柱。用含15mM硫酸銨的10mMTrisHCl(pH8)洗柱，收集流出液中的69kDa蛋白。用6～10倍體積含0.15M氯化鈉的10mM磷酸鉀(pH8)和100～300kDa的NMWL膜透濾69kDa蛋白。收集超濾液，69kDa蛋白在超濾過程中被濃縮。將69kDa蛋白溶劑交換成10mMTrisHCl(pH8)，吸附至Q-Sepharose柱，用10mMTrisHCl(pH8)/5mM硫酸銨洗柱。用50mM磷酸鉀(pH8)將69kDa蛋白洗脫下來。用6～10倍體積含0.15M氯化鈉的10mM磷酸鉀(pH8)和10～30kDa的NMWL膜透濾69kDa蛋白。將69kDa蛋白過≤0.22μm的微孔薄膜濾器以除菌。將無菌的69kDa蛋白儲(chǔ)存于2～8℃，并于3個(gè)月內(nèi)實(shí)施吸附。菌毛凝集原凝集原可從肉湯中分離出的細(xì)菌勻漿中純化。用含10mM磷酸鉀、150mM氯化鈉和4M尿素的緩沖液將細(xì)菌勻漿稀釋至細(xì)菌占0.05體積，混合30分鐘。離心(12,000×g)澄清細(xì)菌溶解產(chǎn)物，然后用10mM磷酸鉀/150mM氯化鈉/0.1％TritonX-100和100～300kDa的NMWL膜透濾、濃縮。濃縮物加熱至80℃30分鐘，離心(9,000×g)使之再次澄清。在澄清的上清中加入PEG8000至終濃度為4.5±0.2％，輕輕攪拌至少30分鐘。離心(17,000×g)收集沉淀，用10mM磷酸鉀/150mM氯化鈉緩沖液抽提沉淀，獲得菌毛凝集原原液。菌毛凝集原通過PEI硅石層析柱得到純化。用1M磷酸鉀調(diào)整原液磷酸鉀濃度為100mM，過PEI硅石柱。流出液用10mM磷酸鉀/150mM氯化鈉緩沖液，過100～300kDa的NMWL膜透濾、濃縮。將無菌的菌毛凝集原儲(chǔ)存于2～8℃，并于3個(gè)月內(nèi)實(shí)施吸附。制備的菌毛凝集原含Agg2和Agg3，兩者的重量比約為1.5～2∶1，基本上不含Agg1。實(shí)例3本實(shí)例描述了純化百日咳桿菌抗原，PT和FHA的類毒素化。如實(shí)例2所述制備的純化PT，加入戊二醛至濃度為0.5±0.1％，在37±3℃溫育4小時(shí)以類毒素化。加入L-天冬氨酸至0.21±0.02M以終止反應(yīng)?；旌衔镌谑覝乇４?±0.1小時(shí)，然后2～8℃存放1～7天?；旌衔镉?0mM磷酸鉀/0.15M氯化鈉/5％甘油緩沖液，過30kDa的NMWL膜透濾，過≤0.22μm的微孔薄膜濾器以除菌。無菌液儲(chǔ)存于2～8℃，并于3個(gè)月內(nèi)實(shí)施吸附。如實(shí)例2所述制備的FHA部分，分別調(diào)整L-賴氨酸和甲醛的濃度至47±5mM和0.24±0.05％，35～38℃溫育6周以類毒素化?；旌衔镉?0mM磷酸鉀/0.5M氯化鈉，過30kDa的NMWL膜透濾，過微孔薄膜濾器以除菌。無菌液儲(chǔ)存于2～8℃，并于3個(gè)月內(nèi)實(shí)施吸附。實(shí)例4本實(shí)例描述了純化的百日咳桿菌抗原的吸附。為了將PT，F(xiàn)HA，Agg和69kDa分別吸附至磷酸鋁(礬)上，需要制備磷酸鋁的儲(chǔ)備液，濃度為18.75±1mg/ml。準(zhǔn)備合適的容器，將抗原無菌分裝至容器中。無菌加入2-苯氧基乙醇至終濃度為0.6±0.1％v/v，攪拌至均質(zhì)狀態(tài)。將合適體積的磷酸鋁無菌加入容器。加入適量體積的無菌蒸餾水，使磷酸鋁的終濃度為3mg/ml。將容器密封、標(biāo)記，室溫?cái)嚢?天。將容器保存直至最后應(yīng)用。實(shí)例5本實(shí)例描述了百日咳成分疫苗與白喉、破傷風(fēng)類毒素聯(lián)合制劑。如前實(shí)例所述制備的百日咳抗原與白喉、破傷風(fēng)類毒素聯(lián)合，提供了幾種成分的百日咳疫苗(CP)。如上實(shí)例1～4所詳述，百日咳成分從生長于深層培養(yǎng)基中的百日咳桿菌中生產(chǎn)。細(xì)菌生長完成后，離心分離培養(yǎng)肉湯和細(xì)菌菌體。每種抗原均分別純化。百日咳毒素(PT)和絲狀血凝素(FHA)順次通過珍珠巖和羥基磷灰石層析柱從肉湯中獲得純化。PT用戊二醛脫毒，F(xiàn)HA部分中殘存的任何PT(大約1％)用甲醛脫毒。菌毛凝集原(2+3)(AGG)從細(xì)菌菌體中制備。用尿素和熱處理裂解菌體，菌毛凝集原通過聚乙二醇沉淀和聚乙烯亞胺硅石層析以純化。69kDa蛋白(pertactin)成分從珍珠巖層析柱(實(shí)例2)流出液中經(jīng)硫酸銨沉淀分離，再順次通過羥基磷灰石和Q-sepharose層析柱純化。所有成分均通過0.22μm的微孔薄膜濾器以除菌。白喉類毒素可用標(biāo)準(zhǔn)方法從生長于深層培養(yǎng)基中的白喉棒桿菌中制備。白喉類毒素的制備分為五個(gè)階段，即工作菌種的維持，白喉棒桿菌的繁殖，白喉毒素的收獲，白喉毒素的脫毒和白喉類毒素的濃縮。白喉類毒素的制備(I)工作菌種白喉棒桿菌菌株以凍干菌種形式分批維持。復(fù)蘇的菌種在35±2℃，Loeffler斜面上生長18～24小時(shí)。然后轉(zhuǎn)移至含白喉培養(yǎng)基的燒瓶中。檢測培養(yǎng)物的純度和Lf量。剩余菌種用來接種至發(fā)酵罐。(II)白喉棒桿菌的生長培養(yǎng)物在35±2℃溫育，并搖動(dòng)發(fā)酵罐。將預(yù)先設(shè)定量的硫酸亞鐵，氯化鈣和磷酸鹽溶液加入培養(yǎng)基。每種溶液的實(shí)際用量(磷酸鹽，硫酸亞鐵，氯化鈣)通過每種培養(yǎng)基的預(yù)實(shí)驗(yàn)決定。選擇的用量是能提供最高Lf含量的用量。生長周期結(jié)束時(shí)(30～50小時(shí))，檢測培養(yǎng)物的純度和Lf量。用碳酸氫鈉調(diào)整pH，用0.4％甲苯在35±2℃滅活培養(yǎng)物1小時(shí)。然后進(jìn)行無菌實(shí)驗(yàn)以確定沒有活的白喉棒桿菌。(III)白喉毒素的收獲來自一個(gè)或幾個(gè)發(fā)酵罐的培養(yǎng)物經(jīng)甲苯處理過后，收集于一個(gè)大容器。加入大約0.12％的碳酸氫鈉，0.25％活性炭，23％的硫酸銨，測量pH。攪拌混合液30分鐘。加硅藻土，將混合物泵入深濾器。濾液循環(huán)過濾直至清澈，然后收集濾液，取樣檢測Lf量。將硫酸銨加入濾液至濃度為40％。再次加入硅藻土。混合液于2～8℃靜置3～4天以沉淀。收集沉淀的毒素，并溶解于0.9％的鹽水中。硅藻土通過過濾去除，毒素用0.9％的鹽水透析以去除硫酸銨。收集透析后的毒素，檢測Lf量和純度。(IV)白喉毒素的脫毒透析后須立即進(jìn)行脫毒。為脫毒，毒素須稀釋至終溶液中含a)白喉毒素1000±10％Lf/mlb)0.5％碳酸氫鈉c)0.5％福爾馬林d)0.9％w/vL-賴氨酸單鹽酸鹽溶液用鹽水補(bǔ)足體積，并調(diào)整pH7.6±0.1。類毒素通過纖維素硅藻土濾墊和/或膜預(yù)濾器和0.2μm的微孔薄膜濾器過濾，收集于容器中，34℃溫育5～7周。取一次樣本檢測毒性。(V)純化類毒素的濃縮收集類毒素，超濾法濃縮后，存放在適宜的容器中。取樣本檢測Lf量和純度。加入保存劑(2-苯氧基乙醇)至終濃度為0.375％，調(diào)整pH至6.6～7.6。類毒素通過預(yù)濾器和0.2μm的微孔薄膜濾器過濾除菌后收集。取無菌類毒素樣本，檢測其類毒素的不可逆性、Lf量、保存劑含量、純度(氮含量)、無菌性和毒性。無菌濃縮類毒素儲(chǔ)存于2～8℃，直至最后制備。破傷風(fēng)類毒素的制備破傷風(fēng)類毒素(T)可從生長于深層培養(yǎng)基中的破傷風(fēng)梭菌中制備。破傷風(fēng)類毒素的生產(chǎn)分為五個(gè)階段，即工作菌種的維持，破傷風(fēng)梭菌的生長，破傷風(fēng)毒素的收獲，破傷風(fēng)毒素的脫毒和破傷風(fēng)類毒素的純化。(1)工作菌種用來生產(chǎn)破傷風(fēng)毒素并最終轉(zhuǎn)化為破傷風(fēng)類毒素的破傷風(fēng)梭菌菌株以凍干菌種形式分批維持。菌種接種于巰基乙醇酸鹽培養(yǎng)基中，并于35±2℃生長大約24小時(shí)。取樣本檢測培養(yǎng)物純度。(II)破傷風(fēng)梭菌的生長將破傷風(fēng)培養(yǎng)基分裝至發(fā)酵罐中，熱處理后冷卻。發(fā)酵罐中接種細(xì)菌，34±2℃生長4～9天。取樣本檢測培養(yǎng)物純度和Lf量。(III)破傷風(fēng)毒素的收獲通過纖維素硅藻土墊過濾分離毒素，澄清的毒素通過微孔薄膜濾器除菌。取樣本檢測Lf量和無菌性。通過30,000道爾頓孔徑超濾濃縮毒素。(IV)破傷風(fēng)毒素的脫毒脫毒前先檢測樣本的Lf量。濃縮的毒素(475～525Lf/ml)中加入0.5％w/v碳酸氫鈉，0.3％v/v福爾馬林和0.9％w/vL-賴氨酸單鹽酸鹽脫毒，并用鹽水補(bǔ)足體積。調(diào)整pH至7.5±0.1，將混合物在37℃溫育20～30天。取樣本檢測無菌性和毒性。(V)類毒素的純化濃縮的類毒素依次通過預(yù)濾器和0.2μm的微孔薄膜濾器過濾除菌。取樣本檢測無菌性和Lf量。硫酸銨的最適濃度根據(jù)類毒素樣本的分級(jí)分離“S”曲線確定。將第一個(gè)濃度加入類毒素(稀釋至1900-2100Lf/ml)?；旌弦涸?0～25℃至少保存1小時(shí)，收集上清，棄去含高分子量部分的沉淀。將第二個(gè)濃度的硫酸銨加入上清，進(jìn)行第二次分離以去除低分子量雜質(zhì)?；旌弦涸?0～25℃至少保存2小時(shí)，然后在2～8℃最多保存3天。通過離心和過濾收集代表純化類毒素的沉淀。應(yīng)用透濾法從純化的類毒素中去除硫酸銨。應(yīng)用Amicon(或等價(jià)物)超濾膜和PBS超濾，直至在類毒素溶液中檢測不到硫酸銨。調(diào)整pH至6.6～7.6，加入2-苯氧基乙醇至終濃度為0.375％。類毒素通過薄膜濾器過濾除菌，取標(biāo)本檢測(類毒素的不可逆性、Lf量、pH、保存利含量、純度、無菌性和毒性。一種成分百日咳疫苗和白喉、破傷風(fēng)類毒素聯(lián)合制劑被命名為CP10/5/5/3DT。每0.5ml成人劑量的CP10/5/5/3DT含有10μg百日咳類毒素(PT)5μg絲狀血凝素(FHA)5μg菌毛凝集原2和3(FIMB)3μg69kDa外膜蛋白15Lf白喉類毒素5Lf破傷風(fēng)類毒素1.5mg磷酸鋁0.6％2-苯氧基乙醇作為保存劑另一種成分百日咳疫苗和白喉、破傷風(fēng)類毒素聯(lián)合制劑被命名為CP10/5/5DT。每0.5ml成人劑量的CP10/5/5DT含有10μg百日咳類毒素(PT)5μg絲狀血凝素(FHA)5μg菌毛凝集原2和3(FIMB)15Lf白喉類毒素5Lf破傷風(fēng)類毒素1.5mg磷酸鋁0.6％2-苯氧基乙醇作為保存劑另一種成分百日咳疫苗和白喉、破傷風(fēng)類毒素聯(lián)合制劑被命名為CP20/20/5/3DT。每0.5ml成人劑量的CP20/20/5/3DT含有20μg百日咳類毒素(PT)20μg絲狀血凝素(FHA)5μg菌毛凝集原2和3(FIMB)3μg69kDa外膜蛋白15Lf白喉類毒素5Lf破傷風(fēng)類毒素1.5mg磷酸鋁0.6％2-苯氧基乙醇作為保存劑還有一種成分百日咳疫苗和白喉、破傷風(fēng)類毒素聯(lián)合制劑被命名為CP20/10/10/6DT。每0.5ml成人劑量的CP20/10/10/6DT含有20μg百日咳類毒素(PT)10μg絲狀血凝素(FHA)10μg菌毛凝集原2和3(FIMB)6μg69kDa外膜蛋白15Lf白喉類毒素5Lf破傷風(fēng)類毒素1.5mg磷酸鋁0.6％2-苯氧基乙醇作為保存劑實(shí)例6本實(shí)例描述了根據(jù)本發(fā)明生產(chǎn)的非菌體性百日咳成分疫苗的臨床評(píng)估。(a)成人研究對(duì)成人和16～20個(gè)月兒童的研究顯示，含菌毛凝集原的多成分疫苗安全而又具免疫原性(表2)。五成分百日咳疫苗(CP10/5/5/3DT在Calgary，Alberta對(duì)17～18個(gè)月的兒童進(jìn)行了I期臨床觀察，并報(bào)告了副反應(yīng)。33個(gè)兒童接受了該疫苗，另外35個(gè)兒童接受了不含69kDa蛋白成分的相同疫苗。局部反應(yīng)少見。全身性副反應(yīng)，主要是煩燥，在無論使用哪種疫苗的約半數(shù)研究參加者均可出現(xiàn)。通過酶免疫法，可檢測到抗-PT，抗-FHA，抗-菌毛凝集原和抗-69kDa的IgG抗體水平顯著升高，通過CHO細(xì)胞中和法，也可檢測到抗-PT抗體水平顯著升高。接受四成分(CP10/5/5DT)和五成分(CP10/5/5/3DT)疫苗的兒童，除抗-69kDa抗體外，檢測的其它抗體反應(yīng)無差異。接受含有69kDa蛋白的五成分疫苗的兒童，免疫后，抗-69kDa抗體水平顯著提高。對(duì)四成分疫苗的劑量反應(yīng)研究在Winnipeg，Manitoba，Canada進(jìn)行。應(yīng)用的兩種成分疫苗制劑為CP10/5/5/3DT和CP20/10/10/6DT。一種全菌體性DPT疫苗作為對(duì)照也包括在研究中。該研究在91年對(duì)17～18個(gè)月的嬰兒進(jìn)行了雙盲研究，該時(shí)段是這些嬰兒進(jìn)行百日咳疫苗加強(qiáng)注射的時(shí)候。這些兒童可以很好地耐受CP10/5/5/3DT和CP20/10/10/6DT。無論接受哪一種成分疫苗，出現(xiàn)局部反應(yīng)或全身性反應(yīng)的兒童人數(shù)顯示無差異。相反，接受全菌體性疫苗的兒童，出現(xiàn)局部和全身性反應(yīng)的人數(shù)顯著多于接受CP20/10/10/6DT成分疫苗的兒童。嬰兒研究II期應(yīng)用CP10/5/5/3DT疫苗的一項(xiàng)研究在Calgary，Alberta和BritishColumbia，Canada進(jìn)行。在這項(xiàng)研究中，432個(gè)嬰兒在2，4和6個(gè)月接受成分百日咳疫苗或全菌體性對(duì)照疫苗DPT。這些嬰兒可以很好地耐受CP10/5/5/3DT疫苗。每劑量免疫后，成分疫苗的局部反應(yīng)較之全菌體性疫苗要少見。成分百日咳疫苗接種后，可觀察到對(duì)全部抗原的顯著抗體反應(yīng)。全菌體性疫苗的接受者，對(duì)菌毛凝集原、D和T可產(chǎn)生較強(qiáng)的抗體反應(yīng)。免疫后7個(gè)月，82～89％的成分疫苗接受者和92％的全菌體性疫苗接受者，菌毛凝集原的抗體滴度有4倍或4倍以上的升高。相反，對(duì)FHA的抗體反應(yīng)，成分疫苗接受者為75～78％，而全菌體性疫苗接受者只有31％?？?69kDa抗體在90～93％的成分疫苗接受者和75％的全菌體性疫苗接受者中存在4倍升高?？?PT抗體用酶免疫法檢測在40～49％的成分疫苗接受者和32％的全菌體性疫苗接受者中存在4倍升高抗-PT抗體用CHO細(xì)胞中和法檢測在55～69％的成分疫苗接受者和6％的全菌體性疫苗接受者中存在4倍升高。(表2)II期B在一項(xiàng)雙盲隨機(jī)研究中，評(píng)價(jià)了CP20/20/5/3DT和CP10/10/5/3DT疫苗的效果。對(duì)照疫苗是D15PT，D15PT對(duì)照疫苗含有15Lf的白喉類毒素，較25Lf的制劑為低。該研究在100個(gè)2，4和6個(gè)月大嬰兒中進(jìn)行。在兩種成分疫苗制劑中，副反應(yīng)的發(fā)生率無差異；兩者的副反應(yīng)均較全菌體性疫苗顯著低下。含抗原劑量高的CP20/10/5/3DT疫苗的接受者，通過酶免疫法和CHO細(xì)胞中和法檢測的抗PT和FHA抗體滴度均較高。免疫后7個(gè)月，抗FHA幾何平均滴度在CP20/20/5/3DT接受者中為95.0，在CP10/5/5/3DT接受者中為45.2，在D15PT接受者中僅為8.9。抗PT滴度用酶免疫法檢測，三者分別為133.3，58.4和10.4；用CHO細(xì)胞中和法檢測，三者分別為82.4，32.7和4.0(表2)。該研究顯示成分百日咳疫苗與吸附的白喉、破傷風(fēng)類毒素聯(lián)合應(yīng)用，盡管抗原含量增加，在嬰兒中應(yīng)用仍然安全且具免疫原性，而且抗原(PT和FHA)含量的增加加強(qiáng)了對(duì)該抗原的免疫應(yīng)答而無副反應(yīng)的增加。II期，NIAID，美國的對(duì)比觀察在美國國立變態(tài)反應(yīng)和傳染性疾病研究所(NIAID)的主持下，一項(xiàng)II期研究拉開了大規(guī)模觀察非菌體性百日咳疫苗效果的序幕。本發(fā)明的一種成分百日咳疫苗與吸附的白喉、破傷風(fēng)類毒素聯(lián)合疫苗(CP10/5/5/3DT)與其它12種非菌體性疫苗和兩種全菌體性疫苗在此研究之列。137名兒童在2，4和6個(gè)月接受了CP10/5/5/3DT成分疫苗的免疫，結(jié)果顯示了疫苗的安全性。如在以前的研究中所看到的，成分疫苗安全、副反應(yīng)低、并能被很好地耐受。在7個(gè)月，抗-PT抗體，抗-FHA抗體，抗-69kDa抗體和抗-菌毛凝集原抗體均高于或等于全菌體性疫苗接種后獲得的抗體水平(參考文獻(xiàn)71和表2)。一項(xiàng)雙盲研究將兒童隨機(jī)分為接受CP20/20/5/3DT或CP10/5/5/3DT疫苗制劑的組。總共有美國和加拿大的2050名嬰兒參加了該項(xiàng)研究，其中，1961名嬰兒完成了研究。在這些嬰兒中，這兩種疫苗制劑均具有安全、低副反應(yīng)和免疫原性。在包括292名嬰兒的小組中，免疫原性得到了評(píng)價(jià)。兩種疫苗制劑均可獲得針對(duì)所含全部抗原的抗體水平升高。CP20/20/5/3DT制劑可誘導(dǎo)更高的抗FHA抗體滴度，而抗PT抗體滴度則否。CP10/5/5/3DT制劑可誘導(dǎo)更高的抗菌毛和凝集原抗體滴度。另一項(xiàng)安全性和免疫原性研究在法國進(jìn)行。研究設(shè)計(jì)除疫苗應(yīng)用時(shí)間在2，3和4個(gè)月外，其余與上述北美研究設(shè)計(jì)相似。局部和全身性反應(yīng)普遍較小。總之，疫苗的這種使用方法在法國被研究參與者很好地接受。在10,000個(gè)嬰兒中兩種非菌體性百日咳疫苗和一種全菌體性疫苗的安慰劑對(duì)照效果觀察在美國NIAIDII期對(duì)比觀察之后，一組多中心、有對(duì)照雙隨機(jī)分組和安慰劑對(duì)照的效果觀察選擇了一種雙成分和一種五成分非菌體性疫苗。該臨床觀察在百日咳發(fā)病率較高的瑞典進(jìn)行。雙成分疫苗含有戊二醛和福爾馬林滅活的PT(25μg)，福爾馬林處理的FHA(25μg)和白喉類毒素17Lf以及破傷風(fēng)類毒素10Lf。五成分百日咳疫苗是CP10/5/5/3DT。在此觀察中，10,000名嬰兒，代表瑞典約半數(shù)該年齡段嬰兒，根據(jù)出生證明，在14個(gè)根據(jù)地理劃分的研究區(qū)域參加了該研究。出生于1992年1～2月的兒童被隨機(jī)分為3組。在征得家長同意之后，三分之二的嬰兒在2，4和6個(gè)月接受兩種白喉-破傷風(fēng)-非菌體性百日咳制劑中的一種。對(duì)照組只接受DT。1992年5月，引進(jìn)了美國領(lǐng)有許可執(zhí)照的商用全菌體性DTP疫苗，生于1992年3～12月的兒童被隨機(jī)分為4組。在征得家長同意之后，四分之三的嬰兒在2，4和6個(gè)月接受三種DTP制劑中的一種。對(duì)照組只接受DT。每種疫苗均有2,500名兒童應(yīng)用。疫苗應(yīng)用有三種劑量。首劑在嬰兒2個(gè)月，最遲不超過3個(gè)月時(shí)應(yīng)用。以后的劑量以8周的間隔給予。疫苗用于肌肉注射。隨訪兒童及其家人30個(gè)月。如果懷疑百日咳感染，收集臨床數(shù)據(jù)，并尋求實(shí)驗(yàn)室證據(jù)，方法是作鼻腔抽吸物的細(xì)菌培養(yǎng)和聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)以診斷。收集急性期和恢復(fù)期血樣以作出血清學(xué)診斷。在此研究之前，并不知道在易感人群(特別是新生兒)中應(yīng)用的本發(fā)明成分百日咳疫苗中的pertactin劑量范圍。特別是，多種包特氏菌成分和它們?cè)诎偃湛纫呙缰械倪x定相對(duì)劑量對(duì)疫苗效果的影響也并不知道。該觀察的主要目的是評(píng)價(jià)非菌體性百日咳疫苗和全菌體性疫苗相對(duì)于安慰劑對(duì)典型百日咳的保護(hù)能力。第二目的是探索疫苗對(duì)已確診的不同嚴(yán)重程度的百日咳感染的保護(hù)效果。疫苗的效果定義為接種疫苗的兒童相對(duì)于未接種疫苗的兒童，患百日咳可能性下降的百分比。兩組接種不同疫苗組的百日咳相對(duì)危險(xiǎn)性用兩組患病可能性之比表示。百日咳患病可能性，也稱為發(fā)病率，可用不同的方法衡量。計(jì)算樣本大小后，在指定研究組中，百日咳患病可能性用研究隨訪結(jié)束時(shí)患病兒童數(shù)與研究組剩余兒童數(shù)之商衡量。在此觀察中，成分疫苗CP10/5/5/3DT預(yù)防典型百日咳的效果見表4，大約為85％。在同一觀察中，一種只含有PT和FHA的雙成分非菌體性百日咳疫苗約58％有效，一種全菌體性疫苗約48％有效。CP10/5/5/3DT對(duì)預(yù)防輕型百日咳也有效，有效率為77％。公開內(nèi)容概要總結(jié)該公開內(nèi)容，本發(fā)明提供了一種新的百日咳桿菌菌毛凝集原制劑及其制備方法。菌毛凝集原可與其它包特氏菌和非包特氏菌抗原聯(lián)合，制成多種多成分百日咳疫苗。這些疫苗在人類使用中安全、無副反應(yīng)、具免疫原性和保護(hù)性。在本發(fā)明的范圍內(nèi)可作調(diào)整。表1.非菌體性百日咳疫苗a.過氧化氫滅活b.麻省公共衛(wèi)生實(shí)驗(yàn)室c.四硝基甲烷滅活d.戊二醛滅活e.福爾馬林滅活f.應(yīng)用微生物與研究中心表2.成人和兒童接受安慰劑和非菌體性百日咳類毒素(AP)，白破百類毒素(DTP)，或多成分非菌體性白破百(ADTP)類毒素免疫后，機(jī)體對(duì)百日咳抗原，白喉、破傷風(fēng)類毒素的IgG抗體應(yīng)答。</tables>數(shù)據(jù)用幾何平均數(shù)的95％置信空間表示。百日咳類毒素，絲狀血凝素，凝集原，pertactin和白喉、破傷風(fēng)類毒素的抗體滴度用ELISA單位/nL表示。CHO細(xì)胞中和法中，所示數(shù)值表示80％細(xì)胞被中和的最高稀釋度的倒數(shù)。表3.嬰兒接種非菌體性百日咳疫苗的血清學(xué)結(jié)果(2、4和6個(gè)月齡)</tables>CLI-Connaught實(shí)驗(yàn)室有限公司，Swiftwater，Pennsylvania.Mass-麻省公共實(shí)驗(yàn)室CLL-Connaught實(shí)驗(yàn)室有限公司，Willowdale，Ontario.Lederle-Lederle實(shí)驗(yàn)室有限公司表4.非菌體性百日咳疫苗的效果疫苗有效率％ABCP10/5/5/3DT84.7(80.3→88.5)177PT25.FHA25DT58(49.8→64.8)1DPT247.9(37.1→56.9)1A病例定義陣發(fā)性咳嗽21天并培養(yǎng)陽性B病例定義咳嗽至少1天的輕型百日咳注釋1置信限注釋2全菌體性百日咳疫苗參考文獻(xiàn)1.Muller，A.S.Leeuwenburg，J.Pratt，D.S.(1986)百日咳流行病學(xué)和控制?！妒澜缧l(wèi)生組織通報(bào)》(BullWHO)64卷321-331頁2.Fine，P.E.M.Clarkson，J.A.(1984)百日咳免疫性在英格蘭和威爾士人群中的分布?！缎l(wèi)生學(xué)雜志》(J.Hyg)92卷21-26頁3.Mortimer，E.A.Jr.(1990)百日咳及其預(yù)防家庭事件。《傳染病雜志》(J.Infect.Dis)161卷473-479頁4.Addiss，D.G.Davis，I.P.，Meade，B.D.，Burstyn，D.G.Meissner，M.，Zastrow，J.A.，Berg，J.L.Drinka，P.Phillips，R.(1991)百日咳在威斯康星一家私立醫(yī)院爆發(fā)。《傳染病雜志》(J.Infect.Dis)164卷704-710頁5.Halperin，S.A.Marrie，T.J.(1991a)成人百日咳腦病個(gè)案報(bào)導(dǎo)和綜述，傳染病評(píng)論》(Rev.Infect.Dis)13卷1043-1047頁6.Onorato，I.M.Wassilak，S.G.Meade，B.(1992)全細(xì)胞性百日咳疫苗在美國學(xué)齡前兒童中的應(yīng)用效果?！睹绹t(yī)學(xué)學(xué)會(huì)會(huì)刊(JAMA)267卷2745-2749頁7.Miller，D.L.Ross，E.M.Alderslade，R.Bellman，M.H.Brawson，N.SB.(1981)兒童中百日咳免疫和嚴(yán)重急性神經(jīng)病?！队t(yī)學(xué)雜志》(BritMed.J)282卷1595-1599頁8.Tamura，M.Nogimori，K.Murai，S.Yajima，M.Ito，K.Katada，T.Ui，M.Ishii，S.(1982)胰島活性蛋白，百日咳毒素的亞基結(jié)構(gòu)與A-B模型一致?！渡锘瘜W(xué)》(Biochemistry)21卷5516-5522頁9.Tuomanen，E.Weiss，A.(1985)對(duì)粘附人呼吸道纖毛上皮細(xì)胞的百日咳桿菌兩種粘附素的鑒定?！秱魅静‰s志》(J.InfectDis)152卷118-125頁10.Friedman，R-L.Nordensson，K.Wilson，L.Akporiaye，E.T.YocumD.E.(1992)人巨噬細(xì)胞對(duì)百日咳桿菌的攝取及其胞內(nèi)存活?！秱魅九c免疫》(Infect.Immu.)60卷4578-4585頁11.Pittman，M.(1979)百日咳毒素百日咳損傷效應(yīng)和持久免疫的因由。一種假說?！秱魅静≡u(píng)論》(Rev.InfectDis)1卷401-402頁12.Granstrom，M.，Granstrom，G.(1993)百日咳的血清學(xué)相關(guān)特點(diǎn)?！兑呙纭?Vaccine)11卷445-448頁13.Gearing，A.J.H.Bird，C.R.Redhead，K.Thomas，M.(1989)人百日咳桿菌感染后細(xì)胞免疫應(yīng)答?！稓W洲微生物學(xué)會(huì)聯(lián)合會(huì)微生物學(xué)與免疫學(xué)》(FEMSMicrobial.Immunol)47卷205-212頁14.Thomas，M.G.Redhead，K.Lambert，H.P.(1989a)百日咳桿菌感染和疫苗接種后人血清抗體反應(yīng)?！秱魅静‰s志》(J.Infect.Dis)159卷211-218頁15.Thomas，M.G.Ashworth，L.A.E.Miller，E.Lambert，H.P.(1989b)百日咳桿菌感染和全細(xì)胞性疫苗接種后對(duì)百日咳毒素，絲狀血凝素和凝集原2，3的血清IgG，IgA和IgM應(yīng)答《傳染病雜志》(J.Infect.Dis)160卷838-845頁16.Tomoda，T.Ogura，H.Kurashige，T.(1991)百日咳桿菌感染和疫苗接種后的免疫應(yīng)答?！秱魅静‰s志》(J.Infect.Dis)163卷559-563頁17.Peterson，J.W.Ibsen，P.H.Haslov，K.Capiau，C.Heron，I，(1992a)鼠吸入百日咳桿菌感染后氣管支氣管淋巴結(jié)和脾淋巴細(xì)胞的增殖反應(yīng)及其γ-干擾素、腫瘤壞死因子的產(chǎn)生?！秱魅九c免疫》(Infect.immun)60卷4563-4570頁18.Englund，J.A.Reed，G.F.Edwards，K.M.Decker，D.Pichichero，M.E.Ronnels，M.B.Steinhoff，M.C.Anderson，E.L.Meade，B.D.Deloria，M.A.NIAID非細(xì)胞性百日咳疫苗組(1992b)嬰兒通過胎盤傳遞得到的抗體和接種非細(xì)胞性(AC)、全細(xì)胞性(WC)百日咳疫苗后產(chǎn)生的抗百日咳毒素(PT)和絲狀血凝素(FHA)抗體的效應(yīng)?！秲嚎茖W(xué)研究》(Pediat.Res.)31卷91A頁19.Oda，M.Cowell，J.L.Burstyn，D.G.Thaib，S.Manclark，C.R.(1985)人初乳中抗百日咳桿菌抗體及其對(duì)鼠吸入感染的保護(hù)活性《傳染與免疫》(Infect.Immun)47卷441-445頁20.Petersen，J.W.P.H.Bentzon，M.W.Capiau，C.Heron，I.(1991)成人接種非細(xì)胞性和全細(xì)胞性百日咳疫苗后的細(xì)胞和體液免疫應(yīng)答《歐洲微生物學(xué)會(huì)聯(lián)合會(huì)微生物學(xué)通訊》(FEMSMicrobiolLett)76卷279-288頁21.Oda，M.Cowell.J.LBurstyn，D.G.Manclark，C.R.(1984)百日咳桿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