專利名稱：含有用鋅及選擇性的賴氨酸或者鈣離子預處理過的生長激素的穩(wěn)定藥物組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及含有生長激素的穩(wěn)定藥物組合物，制備該組合物的方法，使用鋅穩(wěn)定生長激素的組合物，以及治療因生長激素異常所致疾病的方法。
人及普通家禽的生長激素為約含191個氨基酸的蛋白質(zhì)，其在垂體前葉合成并分泌。人類生長激素由191個氨基酸組成。
生長激素為一種重要的激素，不僅參與軀體生長的調(diào)節(jié)，而且還參與蛋白質(zhì)，碳水化合物及脂肪代謝的調(diào)節(jié)。生長激素的主要作用是促進生長。
受生長激素影響的器官包括骨骼，結(jié)締組織，肌肉，以及內(nèi)臟如肝臟，腸及腎臟。
由于重組技術(shù)的發(fā)展及生長激素基因的成功克隆，現(xiàn)已對如人類生長激素及Met-hGH進行工業(yè)化生產(chǎn)提到日程上來，但在此之前只能從人尸體的垂體中提取得到人類生長激素。雖然人們建議使用生長激素治療身材矮小(因生長激素缺乏而致，正常身材矮小及Turner綜合癥)，成人生長激素缺乏，不孕癥，燒傷，傷口愈合，營養(yǎng)不良，骨折愈合，骨質(zhì)疏松，彌漫性胃出血以及假關(guān)節(jié)，但由于生長激素非常有限的供應限制了其在矮小患者的兒童和青春期縱向生長促進的應用。
此外，還有人建議使用生長激素增加家禽的生長速度或者減少動物脂肪的比例以供人類進行消耗。
生長激素的藥用組合物不很穩(wěn)定。尤其是生長激素的溶液劑型，可產(chǎn)生降解產(chǎn)物如去酰胺化或者硫氧化產(chǎn)物及二聚體或者多聚體形式。
hGH的主要降解反應有1)通過直接水解進行脫酰胺化或者通過形成環(huán)琥珀酰亞胺中介物而最后形成不同量的L-asp-hGH，L-iso-asp-hGH，D-asp-hGH，以及D-iso-asp-hGH(ref 1-3)，和2)14及125位點上的蛋氨酸氧化(ref 4-9)。溶液甚至凍干狀態(tài)下的hGH的主要降解產(chǎn)物為脫酰胺的hGH。
脫酰胺化主要發(fā)生在149位點上的Asn，另外152位點上的Asn也發(fā)生少量的脫酰胺反應。
hGH在其14和125位點上也很容易發(fā)生氧化反應。
溶液中的hGH發(fā)生氧化形成亞砜是由于溶解在劑型中的氧所致。氧在蒸餾水中的溶解度約為200uM(9)。當含有4IU/ml劑型的hGH濃度為1.3mg/ml時則相當于60nM的hGH，在正常的儲存條件下，經(jīng)化學計量計算，氧的含量已超過氧化hGH所需量的3000倍。但要想在劑型封裝前將緩沖液中的氣體排出并不是一件容易的事情。
雖然目前認為hGH的脫酰胺及氧化形式?jīng)]有毒性，生物活性的改變或者受體結(jié)合特性的改變，但是較天然的hGH比較其亞砜物的構(gòu)形穩(wěn)定性降低了。
開發(fā)含hGH的穩(wěn)定旦可溶的劑型，對于了解脫酰胺反應及亞砜化物形成的速率以及尋找控制反應的方法是很重要的。
降解的動力學取決于溫度，pH以及hGH劑型中各種添加劑或者佐劑。
由于不穩(wěn)定性，生長激素目前是以凍干的形式儲存在4℃的條件下，直到使用前才進行配制，這樣可使降解減至最小。
含有hGH的凍干藥用劑型目前在使用期間由病人配制成溶液形式，在這種狀態(tài)下4℃可儲存14天，但即使是這樣仍然會有一些降解反應發(fā)生。
另外，對病人來講將凍干的生長激素進行配制也常常是有困難的。
因此，目前主張使用生長激素前盡可能晚地進行配制，并將劑型是在凍干的形式下儲存及運輸。在生產(chǎn)者到藥房這一轉(zhuǎn)運鏈中盡可能使劑型在控制的低溫條件下如4℃進行，這樣可將其在藥架上的有效期延長至2年。
可是，隨著自我給藥的存放系統(tǒng)的廣泛應用以及使用范圍的擴大，最后的使用者在足夠冷卻的條件下得到足夠長時間穩(wěn)定的制劑不總是可能的。
優(yōu)選最后的使用者所用的劑型在凍干狀態(tài)下能夠保持穩(wěn)定一個月，并且在存放裝置中重新配制的情況下另外保持穩(wěn)定一個月從而延長制劑的使用時間。
因此，需要一種更穩(wěn)定的生長激素劑型，該劑型的凍干狀態(tài)可在相對較高的溫度下保持較長時間的穩(wěn)定，另外使用期間的溶液狀態(tài)也可在相對較高的溫度下保持較長時間的穩(wěn)定性。當生長激素的給藥由臨床轉(zhuǎn)為在家給藥時而又沒有上述合適的儲存條件時，這種穩(wěn)定性對這種情況是非常重要的。
另外，為了方便病人使用，使生長激素的給藥方式適于存放方式使用，這就需要含有生長激素的穩(wěn)定可溶解的劑型。可制備穩(wěn)定的含有生長激素的溶解劑型，以適于患者不必重組制劑而以存放裝置的藥筒形式使用，因而不需凍干劑型、重組所需的適宜裝置及為滅菌重組制劑所需的技術(shù)及無菌器皿。
為了安全的原因，避免恰在使用制劑前重組凍干制劑也是需要的。
另外，在制備生長激素時避免凍干步驟也是很有益的。凍干處理過程耗時且費用昂貴，并且由于凍干器容量的限制也常常是生產(chǎn)過程中的瓶頸步驟。
因此，有必要降低降解的速度以使溶解的hGH劑型在藥架和使用期間保持穩(wěn)定一個月。
以往對于穩(wěn)定hGH的嘗試都不是很成功，主要的原因是不能有效的防止二聚體的形成。有關(guān)二聚體形成的問題可參見Becker，G.W.報道的文獻，生物技術(shù)和生化應用9,478(1987)。
國際專利公開號WO 89/09614及澳大利亞專利申請?zhí)?0771/89披露了一種穩(wěn)定的含有生長激素，甘氨酸以及甘露醇的藥物制劑。該制劑在重新配制后使用期間及在加工過程及凍干狀態(tài)儲存期間都顯示出改善的穩(wěn)定性。
歐洲專利申請公開號3003746披露了可使用各種穩(wěn)定劑來穩(wěn)定動物的生長激素，從而減少不溶性物質(zhì)并保持液態(tài)下藥物的活性，這類穩(wěn)定劑包括一些多元醇，氨基酸，在生理條件pH條件下側(cè)鏈帶有電荷的氨基酸聚合物，以及膽堿鹽。多元醇包括未還原的糖類，糖醇，糖酸，季戊四醇，乳糖，水溶性右旋糖苷和菲克；氨基酸包括甘氨酸，肌氨酸，賴氨酸或者其鹽，絲氨酸，精氨酸或者其鹽，甜菜堿，N，N，-二甲基-甘氨酸，天門冬氨酸或者其鹽，谷氨酸或者其鹽；在生理pH條件下側(cè)鏈帶有電荷的氨基酸聚合物可包括多聚賴氨酸，多聚天門冬氨酸，多聚谷氨酸，多聚精氨酸，多聚組氨酸，多聚鳥氨酸或者其鹽；膽堿衍生物包括氯化膽堿，枸櫞酸二氫膽堿，二酒石酸膽堿，碳酸氫膽堿，枸櫞酸三膽堿，抗壞血酸膽堿，硼酸膽堿，葡萄糖酸膽堿，磷酸膽堿，硫酸二膽堿及粘多糖酸二膽堿。
美國專利說明書書號為4,917,685披露了一種埋置式的給藥裝置其包括，以EP303746中所述的穩(wěn)定劑穩(wěn)定的生長激素。
已公開的歐洲專利申請?zhí)枮?74,120公開了含有hGH和具有三個羥基的多元醇的穩(wěn)定制劑。其中提到了甘油和三(羥甲基)氨基甲烷。另外還公開了多元醇與作為緩沖液的鹽酸組氨酸在一起。
國際專利公開號為WO 92/00998公開了用鋅形成的生長激素結(jié)晶。
國際專利公開號為WO 93/12811公開了含有天冬酰胺的穩(wěn)定的生長激素制劑，該制劑為凍干粉末形式或者水溶液形式。
國際專利公開號為WO 93/12812公開了含有組氨的穩(wěn)定的生長激素制劑，該制劑為凍干粉末形式或者水溶液形式。該制劑與含有磷酸緩沖液生長激素制劑比較脫酰胺反應降低了25-30％。另外還公開了在組氨酸存在的條件下用鋅的生長激素可以形成結(jié)晶。
國際專利公開號為WO 93/19776公開了一種以枸櫞酸鹽作為緩沖物質(zhì)的生長激素蛋白制劑，該制劑較以磷酸鹽作為緩沖液的制劑更為穩(wěn)定。該制劑也可含有氨基酸如甘氨酸及丙氨酸和/或甘露醇或其它糖醇和/或甘油和/或其它碳水化合物，及選擇性的防腐劑如芐醇。
國際專利公開號為WO 94/03198公開了一種穩(wěn)定的水溶液制型，該制劑含有生長激素，緩沖液，非離子表面活性劑，選擇性的中性鹽，甘露醇或者防腐劑。
已公開的歐洲專利申請?zhí)枮?77,478公開了一種緩釋組合物，該組合物包括在生物相容油連續(xù)相中的鋅及生長激素。
已公開的歐洲專利申請?zhí)枮?16,485公開了一種可持續(xù)釋放組合物，該組合物包括于載體中的鋅及生長激素，該載體含有植物油和佐劑，佐劑為蜂蠟，單硬脂酸鋁，巴西棕櫚蠟或者液體石蠟。
已公開的歐洲專利申請?zhí)枖?shù)為277,043披露了一種方法，該方法通過加入一種過渡金屬鹽并沉淀不容性的復合物來回收溶液中的生長激素。
國際專利公開號為WO 93/13792公開了一種可埋藏式的緩釋給藥裝置，該裝置裝有生長激素，鋅，一種選擇的含有溶解鋅-生長激素氨基酸的堿性側(cè)鏈集團，以及上述實例中所述的氨基酸-精氨酸，丙氨酸，組氨酸及谷氨酸。
國際專利公開號數(shù)為WO 92/17200公開了二聚體形式的穩(wěn)定不易變性的生長激素金屬離子制劑。該制劑包括甘氨酸，可選擇加入的丙氨酸，谷氨酸，天冬氨酸，精氨酸或者賴氨酸，當凍干劑型以產(chǎn)生足夠的量來形成穩(wěn)定的干燥條塊制劑時，這些氨基酸是很有益處的。
現(xiàn)已令人驚異地發(fā)現(xiàn)在最終的制劑制備前，用鋅及選擇性的賴氨酸或者鈣離子處理生長激素可使其在水溶液中對脫酰胺反應具有很高的穩(wěn)定性，并且在凍干情況下很容易在含水溶劑中溶解。產(chǎn)品的這種穩(wěn)定性使其可以以凍干的狀態(tài)或者溶解或再溶解的制劑形式進行儲存及運輸。
本發(fā)明的藥物制劑可以任何適宜方式配制給藥，如非腸道或口服給藥或粘膜給藥如通過鼻粘膜給藥。本藥物制劑可做成一定劑量的各種形式，如將其裝入小瓶或者藥筒或者其它容器內(nèi)如預先填充的注射器或者筆式裝置。
所以本發(fā)明的制劑可以制成凍干的粉末狀，以后可用常規(guī)的載體如蒸餾水或者注射用水進行重組，也可制成含有生長激素的溶液形式。載體包括常規(guī)的穩(wěn)定劑如苯酚，m-甲苯酚及芐醇。
本發(fā)明生長激素制劑的優(yōu)選實施例是將人生長激素預先用鋅及選擇性的賴氨酸或者鈣離子處理，其還包括生長激素的緩沖水溶液形式的載體。這種制劑是一種備用形式，并且可以以水溶液的形式儲存及運輸而沒有明顯的降解。
作為預處理生長激素溶液的緩沖液可以是如組氨酸，枸櫞酸鹽，酒石酸鹽或者是磷酸鹽緩沖液。但以組氨酸緩沖液為較好。
預先處理溶液的pH值應在約2到9之間，但以6到8為較好，7-7.3為最好。
為了使制劑穩(wěn)定，預處理過的生長激素最后制劑的pH值應約在2到9之間，但以6-8為較好，6.0到6.8為最好。
為了得到穩(wěn)定的效果，鋅及選擇性的賴氨酸或者鈣離子鋅的量優(yōu)選加至2mM，但以每摩爾生長激素1到4摩爾鋅為較好，以每摩爾生長激素1到2摩爾鋅更好，最好是每摩爾生長激素1摩爾鋅。
加入的鋅以生理相容的可溶性鹽的形式如氯化鋅為較好。
如果使用鈣以加入生理相容的可溶性鹽的形式如氯化鈣為較好。
本發(fā)明的藥物制劑還可包括為了調(diào)節(jié)強度的鹽或者糖醇，以及為了便于加工如凍干以及在使用前快速并完全溶解凍干的制劑的選擇性賦形劑。
賦形劑可有以選自二糖如乳糖，海藻糖和蔗糖，糖醇如山梨醇或者甘露醇，多糖如已經(jīng)商品化的葡聚糖(Dextran)多聚物如Dextran40，Dextran70，或者Dextran75，菲克(Ficoll)，多元醇如聚乙二醇或者聚乙烯醇，或者上述兩種或者多種的混合物。
本發(fā)明另一方面涉及制備藥物制劑的方法，該制劑包括用鋅和選擇性的賴氨酸或者鈣離子進行預處理的生長激素，其中生長激素溶于含鋅和選擇性的賴氨酸或鈣離子的溶液，具體的步驟是先將氯化鋅溶于含有選擇性賴氨酸或者鈣離子的去離子水中，將該溶液靜置片刻，然后加入生長激素并調(diào)節(jié)pH至2到9。
通過加入對生長激素無副作用的酸來調(diào)節(jié)pH值，優(yōu)選生理可接受的酸如礦物酸如鹽酸，硫酸或者硝酸或者有機酸如乙酸。
在本發(fā)明方法的一個實施例中，選擇性地加入鹽及一種賦形劑，然后將溶液裝入容器內(nèi)并進行凍干。
本發(fā)明還涉及使用鋅和選擇性的賴氨酸或者鈣離子來預處理生長激素，從而得到穩(wěn)定的生長激素制劑。
本發(fā)明還涉及治療因生長激素異常而引發(fā)的疾病的方法，該方法包括給予一種預先經(jīng)鋅和選擇性賴氨酸或者鈣離子處理過的生長激素的制劑。
本文中所述的“生長激素”可來源于下面的動物器官如鳥，牛，馬，人，綿羊，豬，大馬哈魚，鱒魚或者金槍魚，但以人，牛或者豬的生長激素為較好，以人的生長激素為最好。本發(fā)明中所使用的生長激素可以是從天然物提取的天然生長激素，如使用常規(guī)的方法從垂體腺提取，或者是用重組技術(shù)制備的生長激素，如E.B.Jensen和S.Carlsen在生物技術(shù)和生物工程.36，1-11(1990)雜志中所報道的?！吧L激素”可以是已經(jīng)切掉了一個或者多個氨基酸的生長激素；可以是天然生長激素中一個或者多個氨基酸已經(jīng)被其它氨基酸替換的類似物，其中氨基酸以天然氨基酸為較好，但上述的替換不應引起不良的影響如增加了抗原性或者減少了藥物活性；也可以是帶有N-或者C-末端的其衍生物，如Met-hGH。以hGH這種生長激素為較好。
生長激素“劑量”這一詞是指在給藥的方案中可以起到治療效果的量。所制備的制劑含有hGH的量至少為0.1mg/ml，以達到10mg/ml為較好，一般為1mg/ml到40mg/ml，以1mg/ml到25mg/ml為較好，如1mg/ml到5mg/ml，劑量是按照備用制劑來計算的。如給患垂體功能低下的侏儒癥病人服用該組合物，該制劑應含有hGH 0.1mg/ml到10mg/ml，這與所要治療疾病的劑量方案相對應。本發(fā)明的濃度范圍倒不是很重要，可根據(jù)執(zhí)行治療的醫(yī)生來變化。
本發(fā)明所使用的賴氨酸以天然的α氨基酸為較好。賴氨酸可以是1或者d賴氨酸或者是兩者的混合物。
如制劑較常規(guī)含有磷酸鹽緩沖液的劑型更穩(wěn)定且優(yōu)選與相應的含組氨酸作穩(wěn)定劑的制劑一樣穩(wěn)定，則得到了本發(fā)明中所述的“高穩(wěn)定性”劑型，其中與WO 93/12812中用磷酸鹽緩沖液的制劑比較，用組氨酸作為穩(wěn)定劑的相應制劑其hGH的脫酰胺反應減少了20％。
本發(fā)明方法中所用的溶劑可為水，醇類如乙醇，n-丙醇或者異丙醇，丁醇或者是它們的混合物。溶劑中可含有穩(wěn)定劑如苯酚，m-甲苯酚或者芐醇。
本文中與生長激素制劑相關(guān)的“預處理”一詞是指在為制備生長激素制劑加入其它成分之前，使用鋅和選擇性的賴氨酸或者鈣離子來處理生長激素。
本發(fā)明將通過下述實施例更詳細地闡述本發(fā)明。但這些實施例并不是用來限制附加的權(quán)利要求所限定的本發(fā)明的范圍。
實驗部分實施例減少脫酰胺反應對于含有4mg/ml hGH，0.18mM ZnCl2，3mM組氨酸，1.5％芐醇，pH6.8的hGH制劑在于37℃經(jīng)過不同的預處理后測定脫酰胺的速度，并比較pH為6.8時組氨酸和磷酸鹽緩沖液的制劑在脫酰胺速度上的差異。
hGH制劑是通過將24mg hGH溶解于2.5ml下面的溶液來制備的a)2mM CaCl2+0.36mM ZnCl2，pH7-7.3b)2mM賴氨酸+0.36mM ZnCl2，pH7-7.3c)0.36mM ZnCl2，pH7-7.3。
在4℃下靜置1h后(使鋅與hGH復合)，使用PD10去鹽柱子(Pharmacia)重配制劑a)-c)，使其成為3ml 6mM組氨酸，0.36mM ZnCl2，8mg/mlhGH的制劑。然后加入3ml 3％的芐醇使最后的制劑含有4mg/ml hGH，3mM組氨酸，0.18 ZnCl2mM，1.5％芐醇，(通過加入HCl/NaOH將pH調(diào)節(jié)至6.8)。
所用的對照制劑為a)4mg/ml hGH，3mM組氨酸，0.18mM ZnCl2，1.5％芐醇，pH6.8；b)4mg/ml hGH，3mM組氨酸，1.5％芐醇，pH6.8；和c)4mg/ml hGH，3mM組氨酸，3mM Na2HPO4，1.5％芐醇，pH6.8。對照劑型預先不經(jīng)Zn++處理。
在下面表中所述的hGH制劑于37℃的條件下儲存7天，然后用IE-HPLC分析脫酰胺的hGH的含量。結(jié)果見下面的表。
<p>#脫酰胺的量是通過pH值6.8的每0.1pH單位偏差的1％校正的。
上面的表顯示在再用鹽處理最終的組氨酸制劑之前，在鈣離子或者賴氨酸存在的條件下，經(jīng)鋅離子處理hGH溶液后，對于組氨酸，hGH脫酰胺速率減少到84％(磷酸鹽制劑為68％)。
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權(quán)利要求
1.藥物制劑，其包括預先用鋅和選擇性的賴氨酸或者鈣離子處理過的生長激素。
2.權(quán)利要求1中所要求的藥物制劑還包括載體，其形式為經(jīng)鋅和選擇性的賴氨酸或者鈣離子處理過的生長激素緩沖溶液。
3.權(quán)利要求1或者2中所要求的藥物制劑，其中將pH值調(diào)節(jié)至2到9之間。
4.上述權(quán)利要求中任何一條所要求的藥物的制劑，其中鋅離子濃度多至約2mM。
5.上述權(quán)利要求中任何一條所要求的藥物制劑，其還包括鹽類和/或糖類和/或糖醇類。
6.上述權(quán)利要求1-5中任何一條所要求的藥物制劑，其中生長激素為hGH。
7.制備藥物制劑的方法，該制劑包括用鋅和選擇性的賴氨酸或鈣離子預處理的生長激素，其中生長激素溶于包括鋅和選擇性速酸或鉆離子的溶液，該方法包括將氯化鋅溶于選擇性的含有賴氨酸或鈣離子的去離子水中，使該溶液靜置片刻，加入生長激素，并選擇性地加入防腐劑，選擇性地將pH值調(diào)節(jié)至約2到9。
8.權(quán)利要求7中所要求的方法，其中選擇性地加入鹽類和/或者糖醇類及賦形劑，然后將溶液裝入容器內(nèi)并且凍干處理。
9.使用鋅和選擇性的賴氨酸或鈣離子預先處理生長激素從而得到穩(wěn)定的生長激素制劑。
10.一種治療因生長激素缺乏所致疾病的方法，其包括給予權(quán)利要求1中所述的制劑。
全文摘要
經(jīng)鋅和選擇性的賴氨酸或鈣離子預先處理過的生長激素藥物制劑,該制劑具有抗脫酰胺反應,抗氧化及肽鍵斷裂的非常高的穩(wěn)定性。產(chǎn)品的這種穩(wěn)定性使其可以以凍干的狀態(tài)或者在普通的環(huán)境溫度下以溶解或者重新溶解的制劑形式進行運輸或者儲存。
文檔編號A61K47/02GK1190897SQ9619553
公開日1998年8月19日 申請日期1996年6月28日 優(yōu)先權(quán)日1995年7月14日
發(fā)明者T·克里斯滕森, P·巴施米德特, H·H·索蘭森, O·H·奧爾森, L·希姆 申請人:諾沃挪第克公司