專利名稱：用于治療的cd44基因表達的控制的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及腫瘤治療領(lǐng)域，更具體地講，涉及應用反義寡核苷酸控制CD44的表達。
背景技術(shù)：
CD44是一族由許多種不同細胞表達的多形性膜糖蛋白。能夠找到CD44的細胞有許多，如循環(huán)淋巴細胞，它作為一種淋巴結(jié)歸巢受體，上皮細胞，它參與細胞和細胞間的相互粘附(1)。在肺、上支氣管基底細胞、肺泡巨噬細胞、肺泡淋巴細胞和活化的肺泡II型細胞上也可以找到CD44，在這些細胞上它同樣參與細胞和細胞間的相互粘附(2)。CD44有一個高親合力結(jié)合部位作為透明質(zhì)酸鹽(hyaluronan)的受體，CD44與透明質(zhì)酸鹽的相互作用可使細胞錨定在某個部位(3)。
CD44在單個細胞中可表達為兩種或兩種以上的變異體，可能因為細胞的需求不斷變化。這些變異體的多形性變化源自對CD44 mRNA的可變剪接，即CD44基因的各種編碼序列(外顯子)以不同的組合被轉(zhuǎn)錄(被表達)。CD44剪接變異體的蛋白產(chǎn)物(同種型)在大小(從110KDa到大于250KDa)和功能上差別很大。已知CD44蛋白的胞外功能區(qū)參與細胞和細胞間的相互粘附以及與胞外基質(zhì)成分包括透明質(zhì)酸、纖連蛋白和膠原蛋白等相結(jié)合，而CD44的胞內(nèi)功能區(qū)與在依賴CD44的細胞遷移中起重要作用的細胞錨定骨架蛋白相結(jié)合。CD44還被發(fā)現(xiàn)在造血和淋巴細胞進入外周循環(huán)中起一定作用(4，5，6)。CD44的各種功能引起了人們極大的興趣，因為它們可以用來解釋活化的淋巴細胞和轉(zhuǎn)移性腫瘤細胞所具有的相似的行為。這兩種細胞都有相對較高水平的CD44的表達，而且都有浸潤性行為，能進行細胞遷移，其中包括可逆性粘附，能在淋巴組織中集結(jié)和擴散，以及能釋放入外周循環(huán)(6)。CD44與淋巴組織的關(guān)系尤其有趣，因為淋巴細胞和轉(zhuǎn)移性腫瘤細胞都是通過CD44的變異體與特異性配體相結(jié)合，而這種配體要么存在于淋巴結(jié)的胞外基質(zhì)上，要么存在于淋巴組織中的樹突狀細胞或其它細胞的表面。并且，隨著淋巴細胞和腫瘤細胞在淋巴結(jié)中的生長和分化，它們都同步釋放入外周循環(huán)的輸出淋巴管。釋放時在淋巴細胞和腫瘤細胞之間，胞外基質(zhì)成分和周圍細胞之間發(fā)生一系列復雜的相互作用，可能還需要粘附受體、蛋白水解酶、生長因子和生長因子受體的參與。這些過程可能依賴對CD44分子進行修剪，釋放過程的特異性是由與CD44同種型相互作用的組織特異性配體介導的。因此，CD44在惡性細胞中的表達是使腫瘤能夠原位生長、局部浸潤和有轉(zhuǎn)移傾向的一個重要因素(7，8，9)。
人基因組CD44基因座位于染色體11p13(10)。最近，人CD44基因的大部分基因組結(jié)構(gòu)已經(jīng)搞清(11)。在大約60千堿基(Kb)的長度上，分布著至少20個外顯子。這些編碼序列中有十個(外顯子1-5和16-20)是用于編碼標準型CD44的。在外顯子5和16之間，至少又有十個外顯子，它們常用來進行可變剪接(外顯子6-15)。在人類，如同在其它物種，CD44基因也編碼許多可變剪接的蛋白，它們有不同的大小和功能。到目前為止，已有數(shù)種CD44同種型被純化和鑒定，其中有一種80-90KDa的糖蛋白，稱其為“標準型”或“造血型”同種型(CD44 S)；另一種180KDa或分子量更大的糖蛋白，稱其為“上皮型”或“變異型”同種型(CD44v)。對編碼標準型和上皮型同種型的cDNA克隆進行分離和鑒定表明除了上皮型有額外的134個或更多個氨基酸以外，蛋白質(zhì)序列是一致的，而這些氨基酸是由至少十個編碼胞外功能區(qū)的外顯子(V1-V10)編碼的；此外，上皮型同種型的糖基化程度更高(12，27)。雖然現(xiàn)在已經(jīng)公認CD44標準型在控制細胞遷移上扮演著關(guān)鍵的角色，但還不知道在大多數(shù)細胞類型中占優(yōu)勢的CD44可變剪接變異體的確切功能。
文獻對CD44的表達，無論是以標準的還是以變異的形式，是否與人類腫瘤轉(zhuǎn)移力相關(guān)這個問題尚無定論。譬如，一篇1993年的文獻指出這種相關(guān)從未存在(13)。另一方面，人們已經(jīng)知道表達CD44變異型同種型水平最高的細胞似乎最易發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化。這些細胞生長失控，伴隨著CD44的表達以及可能有的其它粘附分子的表達可能使它們更具浸潤性和轉(zhuǎn)移性。還有，大量的研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了惡性轉(zhuǎn)化或腫瘤轉(zhuǎn)移與CD44變異型同種型表達之間的相關(guān)。例如，一篇1994年的文獻提供證據(jù)表明某些CD44變異體可能幫助介導了人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞的粘附和轉(zhuǎn)移(14，15)。也有發(fā)現(xiàn)揭示子宮頸癌強烈表達由外顯子V7和V8編碼的表位，而這些表位在正常宮頸上皮細胞上檢測不到(16)。在另一項研究中，在結(jié)腸腫瘤進展的特殊階段有特異的CD44變異體的過度表達，且表達以前認為與腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)的CD44v的結(jié)腸腫瘤預后不佳(17，18)。
在某些研究中，只有過度表達一些特殊的變異體才和癌癥相關(guān)。例如，含外顯子V6序列的變異體在某些腫瘤進展的晚期階段表達，而一些不含外顯子V6序列的CD44變異體在腫瘤發(fā)生的最早階段和腺瘤的早期表達。對胃腺癌的檢查表明CD44v在所有的被檢標本中均有表達，其中腸型腺癌表達含外顯子V5和V6的變異體，擴散型腺癌主要表達只含外顯子V5的變異體。正常的胃粘膜在胃小凹增生帶和粘液上皮上有外顯子V5的表達(19)。外顯子V11已被確認也有同樣的表達方式，即與擴散型癌組織相比它主要分布于分化良好的腸道腫瘤。正常的胃粘膜只有極低水平的外顯子V11的表達。在平均14個月的隨訪中，CD44的表達與腫瘤復發(fā)、死亡率升高相關(guān)。
文獻中已有提示CD44的過度表達有長期的臨床意義。一組病人，其原位乳腺腫瘤的87％和附屬淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶的100％陽性表達外顯子V6，整體的低生存率與CD44v表位的表達相關(guān)(20，21)。另一組病人有相似的結(jié)果，但其關(guān)聯(lián)隨時間延長而減小。在一項對神經(jīng)膠質(zhì)瘤的研究中，通過應用抑制CD44表達的CD44特異的反義寡核苷酸，兩種細胞系的浸潤性被高度抑制，五種細胞系的浸潤性被完全扼制(15)。
據(jù)我們所知，CD44的反義治療從未應用于人的肺癌、黑色素瘤或白血病，也從未確立一種或多種CD44變異體與上述任何腫瘤相關(guān)。至于肺癌則問題更糟，因為肺癌至少有兩種主要類型小細胞性肺癌(SCLC)和非小細胞性肺癌(NSCLC)。SCLC約占四分之一的病例，它表達神經(jīng)內(nèi)分泌的標志物，通常很早就轉(zhuǎn)移到淋巴結(jié)、腦、骨、肺和肝；NSCLC占其它肺部腫瘤的大多數(shù)，包括腺癌、鱗狀細胞癌和大細胞肺癌。NSCLC的特點是有上皮樣生長因子及其受體且局部浸潤。1994年P(guān)enno及其同事報道在非小細胞性肺部腫瘤及肺的鱗狀上皮化生中，CD44標準型的轉(zhuǎn)錄和翻譯水平均很高，而在肺的小細胞性腫瘤和靜止的肺泡II型細胞中水平很低(2)。
黑素細胞和黑色素瘤細胞已被廣泛地作為一種模型用來研究惡性轉(zhuǎn)化過程中發(fā)生的變化，包括尋找在惡變細胞中表達而在正常的黑素細胞中不表達的基因。黑色素瘤細胞不象黑素細胞，它能夠在缺少外源性生長因子的情況下增殖。這種不依賴性顯然反映細胞產(chǎn)生生長因子和細胞因子作為自分泌性生長刺激因素(22)。
黑色素瘤細胞分泌許多生長因子，包括TGF-α、TGF-β、血小板衍生生長因子的A鏈和B鏈、堿性成纖維細胞生長因子、IL-6、IL-1、粒細胞巨噬細胞集落刺激因子以及MGSA。這些生長因子，或者組成型表達，或者在各種細胞因子的誘導下表達，通過作為自分泌性生長因子或通過調(diào)節(jié)宿主對腫瘤細胞的反應來促進已轉(zhuǎn)化的黑色素瘤細胞表型的發(fā)展(23，24)。
黑色素瘤細胞若要轉(zhuǎn)移，必須與腫瘤原發(fā)灶分離，穿過宿主的基質(zhì)進入外周循環(huán)，借助血流四處播散，成功到達遠端毛細血管床并在此粘貼、外滲至人器官實質(zhì)組織中，再增殖成次級生長灶。當腫瘤細胞產(chǎn)生自分泌性生長因子或?qū)λ拗骷毎a(chǎn)生的旁分泌性生長因子發(fā)生反應時，腫瘤細胞就可以在遠處生長。
約有95％的家族性惡性黑色素瘤和40％散發(fā)性黑色素瘤有前體病灶。黑素細胞病灶有三種類型先天性痣、獲得性痣和發(fā)育不良性痣，先天性痣和獲得性痣都是正常的黑素細胞在局部的增殖。相反，發(fā)育不良性痣是由一群異質(zhì)性細胞組成，包括正常的黑素細胞和表現(xiàn)出色素沉著增加、核多形性和有絲分裂不典型的黑素細胞，由于這個原因，發(fā)育不良性痣的黑素細胞被認為代表了人惡性黑色素瘤的前體病灶。人黑色素瘤可以分成三個階段i)基底生長期黑色素瘤；ii)垂直生長期黑色素瘤；iii)轉(zhuǎn)移性黑色素瘤。與正常人黑素細胞和黑素細胞前體病灶相比，處于基底生長期和垂直生長期的原位黑色素瘤以及轉(zhuǎn)移性黑色素瘤在生物、生化和核型上有顯著不同(23)。
人黑色素瘤提供了一個極其恰當?shù)哪Ｐ拖到y(tǒng)，因為從腫瘤進展的不同階段分離出的細胞均可在實驗室里培養(yǎng)和研究。在下面所討論的實驗中應用的人黑色素瘤Hs294T(ATCC)建自淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶，是一種高轉(zhuǎn)移性黑色素瘤細胞系(25)。應用Hs294T的實驗，結(jié)合應用NSCLC的實驗，能夠預見申請專利的治療方法即對過度表達CD44的腫瘤進行治療的總體有效性。
發(fā)明概述本發(fā)明涉及將反義寡核苷酸應用于肺癌、黑色素瘤和白血病細胞以控制CD44的表達。此處公開的一些優(yōu)選的反義寡核苷酸在執(zhí)行此項功能時可達到的95％的有效性，其效應有序列特異性且對正常細胞無毒性作用。
附圖簡述附圖里，其中相同的附注文字在許多圖中均表示相同的含義。


圖1是一條形圖，表示用22種不同的寡核苷酸與兩種不同的肺癌細胞(NCI-H460和NCI-H661)孵育后對細胞生長的影響。在本申請中有意義的寡核苷酸如下所示第1道-ICN-240(SEQ ID NO1)第3道-ICN-248(SEQ ID NO2)第6道-ICN-237(SEQ ID NO3)第11道-ICN-308(SEQ ID NO4)第13道-ICN-310(SEQ ID NO5)第17道-ICN-314(SEQ ID NO6)圖2是一條形圖，表示所選的寡核苷酸對癌細胞的細胞毒性作用。
圖3A和3B是線圖，表示所選的寡核苷酸的不同濃度對兩種肺癌細胞系細胞生長的影響。
圖4A和4B是線圖，表示所選的寡核苷酸其作用時間對兩種肺癌細胞系細胞生長的影響。
圖5是一幅RT-PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠的照片，顯示未經(jīng)處理的肺癌細胞(NCI-460)以不同對引物擴增后CD44的基因表達情況，第1道-P1(SEQ ID NO9)+P2(SEQ ID NO10)第2道-P3(SEQ ID NO11)+P4(SEQ ID NO12)第3道-P5(SEQ ID NO13)+P6(SEQ ID NO14)第4道-P6(SEQ ID NO14)+P7(SEQ ID NO15)第5道-pHE7第6道-PCNA(增殖細胞核抗原)第7道-100bp DNA梯形帶圖6是用反義、有義和隨機序列處理人肺癌細胞(NCI-H460)后，其RT-PCR產(chǎn)物再作Southern印跡而得到的一張放射自顯影照片。
Unt-未經(jīng)處理的細胞第1道-ICN-237(SEQ ID NO3)第2道-ICN-236(SEQ ID NO7)第3道-ICN-240(SEQ ID NO1)第4道-ICN-248(SEQ ID NO2)
第5道-ICN-308(SEQ ID NO4)第6道-ICN-310(SEQ ID NO5)第7道-ICN-314(SEQ ID NO6)第8道-ICN-88(SEQ ID NO8)圖7是以pHE7作內(nèi)對照，用反義、有義和隨機序列處理肺癌細胞(NCI-H460)后，其“熱”RT-PCR產(chǎn)物的熒光放射顯影照片。
Unt-未經(jīng)處理的細胞。
第1道-ICN-308(SEQ ID NO4)第2道-ICN-248(SEQ ID NO2)第3道-ICN-236(SEQ ID NO7)第4道-ICN-240(SEQ ID NO1)第5道-ICN-310(SEQ ID NO5)第6道-ICN-88(SEQ ID NO8)圖8是以β-肌動蛋白作內(nèi)對照7，用反義/有義和隨機序列處理肺癌細胞(NCI-H661)后，其RT-PCR產(chǎn)物作Southern印跡而得到的放射自顯影照片。
第1道-未經(jīng)處理的細胞第2道-ICN-237(SEQ ID NO3)第3道-ICN-240(SEQ ID NO1)第4道-ICN-236(SEQ ID NO7)第5道-ICN-308(SEQ ID NO4)第6道-ICN-88(SEQ ID NO8)圖9是以β-肌動蛋白作內(nèi)對照，用反義、有義和隨機序列處理黑色素瘤細胞(Hs294T)后，對其RT-PCR產(chǎn)物作Southern印跡而得到的放射自顯影照片。
第1道-未經(jīng)處理的細胞第2道-ICN-237(SEQ ID NO3)第3道-ICN-240(SEQ ID NO1)第4道-ICN-236(SEQ ID NO7)第5道-ICN-308(SEQ ID NO4)第6道-ICN-248(SEQ ID NO2)第7道-ICN-88(SEQ ID NO8)
圖10是一條形圖，表示在裸鼠體內(nèi)應用ICN-240(SEQ ID NO1)后對人白血病(NB4)的抑制。
圖11A和11B是條形圖，表示在用ICN-240(SEQ ID NO1)和其糖基化修飾形式ICN-967(SEQ ID NO1)治療后，對NB4和Daudi人白血病細胞分別所起的抑制作用。
發(fā)明詳述以下討論講述了各種寡核苷酸序列的制備和對它們作用于肺癌或/和黑色素瘤細胞的效果的檢測。針對人CD44 cDNA的反義和有義寡核苷酸是Stamenkovic等發(fā)表的序列中所標明的片段(26)。歸結(jié)起來共有22個核苷酸被合成和檢測，從中又選出以下所列的作進一步評估參者號序列 位置(在CD44編碼 SEQ ID NO序列中的堿基對序號)反義寡核苷酸ICN-240 5′ATTCGAAATG AAACAA 1620 SEQ ID NO1ICN-248 5′TTTATCTTCT TCCAAGGCGA AGC 991 SEQ ID NO2ICN-237 5′TTTATCTTCT TCCAAG 991 SEQ ID NO3ICN-308 5′TTCCTCCCAG GAC 2038 SEQ ID NO4ICN-310 5′AAATTTCCTC CCAG2038 SEQ ID NO5ICN-314 5′GGCAGGTTAT ATTCA 250 SEQ ID NO6有義寡核苷酸ICN-236 5′ATTTGAATAT AACCTGGCGA AGC 246 SEQ ID NO7隨機寡核苷酸ICN-88 5′TGCCAGACTA TTGTCCCAn/a SEQ ID NO8被測的所有序列均在一臺DNA自動合成儀(Applied Biosystems 394型)中合成，是以典型的氨基磷酸酯(phosphoroamidite)化學方法合成的由磷酸二酯鍵連接的寡核苷酸。得到的寡核苷酸通過HPLC純化，使用反向半制備的C8柱(ABI)，以溶于0.1M乙酸三乙銨的5％乙腈和乙腈組成線性樣度。產(chǎn)物純度利用HPLC分析性C18柱(Beckman)進行鑒定。
對22種寡核苷酸序列進行測試的細胞系是大細胞肺癌細胞系NCI-H460、NCI-H661和黑色素瘤細胞系Hs294T，來自美國典型培養(yǎng)物保藏中心。細胞按常規(guī)在培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng)，培養(yǎng)箱保持一定濕度，溫度為37℃，氣體為大氣壓下5％CO2/95％空氣。在含10％胎牛血清90％RPMI-1640的培養(yǎng)液中，兩種細胞系均為貼壁生長。將細胞鋪于96孔培養(yǎng)板中，每孔2000個細胞，然后加入各種濃度(0.1，0.25，0.5，1.0μM)的反義和有義寡核苷酸，下文中將對這些寡核苷酸作更詳細描述。培養(yǎng)72小時后，所有細胞均按1μCi/ml加入[3H]胸腺嘧啶，繼續(xù)培養(yǎng)2個小時，自動的96型收集儀(Tomtec)收集細胞，β-計數(shù)儀測定[3H]胸腺嘧啶的摻入量。為確保結(jié)果的準確性，所有實驗均設三個復孔，至少重復三次。
在進行DNA抑制實驗以前，用肺癌細胞進行了預篩選。每一種寡核苷酸以0.5μM的濃度與肺癌細胞NCI-H460和NCI-H661共同孵育72小時。圖1為篩選的結(jié)果，其中的每一條垂直線(1-22)均表示一種特異的寡核苷酸對細胞生長的抑制效應。反義寡核苷酸中有六種第一道-ICN-240(SEQ ID NO1)、第三道-ICN-248(SEQ ID NO2)、第六道-ICN-237(SEQ ID NO3)、第11道-ICN-308(SEQ IDNO4)、第13道-ICN-310(SEQ ID NO5)和第17道-ICN-314(SEQID NO6)幾乎完全抑制了肺癌細胞的生長，而其它被測的寡核苷酸對細胞生長影響甚微。
圖2是用中性紅吞噬法(Clonetics，San Diego)檢測六種寡核苷酸(選自圖1)對兩種肺癌細胞系的細胞毒性作用的結(jié)果。每一種寡核苷酸與未處理細胞結(jié)果相當，表明它們處理時沒有細胞毒作用。
圖3A和3B是檢測三種反義寡核苷酸ICN-240(SEQ ID NO1)、ICN-237(SEQ ID NO3)、ICN-308(SEQ ID NO4)和一種有義寡核苷酸ICN-236(SEQ ID NO7)的劑量效應結(jié)果。實驗時，兩種肺癌細胞以不同濃度(0.1，0.25，0.5，1.0μM)的寡核苷酸處理72小時。隨著濃度的升高，三種反義寡核苷酸對細胞生長的抑制程度均有所增加，濃度在0.25～0.5μM的時候?qū)毎L抑制程度從55％增至95％。有義寡核苷酸ICN-236(SEQ ID NO7)濃度的升高并不影響細胞生長。
圖4A和4B是反義寡核苷酸ICN-237(SEQ ID NO3)、ICN-240(SEQ ID NO1)和ICN-308(SEQ ID NO4)對兩種肺癌細胞系作用六天后的實驗結(jié)果。顯而易見，所選的三種反義寡核苷酸對細胞生長有最高抑制(20～45％)作用的時間均在24-48小時，72-120小時抑制作用基本消失。
為了確定序列作用特異性，我們用RT-PCR的方法核定了寡核苷酸ICN-88(SEQ ID NO8)、ICN-236(SEQ ID NO7)、ICN-237(SEQ ID NO3)、ICN-240(SEQ ID NO1)、ICN-248(SEQ ID NO2)和ICN-308(SEQ ID NO4)。實驗中，對肺癌細胞和黑色素瘤細胞均用異硫氰酸胍法(Glass MAX RNA Microisolation Spin Cartridge System-Gibco BRL)提取細胞總RNA，然后根據(jù)廠商(Perkin Elmer Cetus)說明，用0.5μg總RNA、oligo(dT)引物和M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA的第一條鏈。接著，我們選擇能特異地與CD44基因的某些部分發(fā)生退火的引物擴增編碼特異性CD44蛋白的基因部分。所用的針對人CD44 cDNA的引物和DNA探針其序列在Stamenkovic等人發(fā)表的序列(1989)中已列出，具體如下(26)引物序列5′-3′ 位置(bp)SEQ ID NOP-1 GACACATATT GCTTCAATGC TTCAGC 520 SEQ ID NO9P-2 GATGCCAAGA TGATCAGCCA TTCTGGAAT920 SEQ ID NO10P-3 AGCAGAGTAA TTCTCAGAG947 SEQ ID NO11P-4 CTGATAAGGA ACGATTGACA 1,221 SEQ ID NO12P-5 GAGACCAAGA CACATTCCAC CCCAG 1,241 SEQ ID NO13P-6 ACTCCTTGTT CACCAAATGCA 1,561 SEQ ID NO14P-7 ACACCTTGTT CACCAAATGCA 182 SEQ ID NO15PCR引物P-1(SEQ ID NO9)和P-2(SEQ ID NO10)與Matsamura和Tarcin所用引物一致(27)，被設計成能與CD44的標準型部分退火。在表達標準型CD44的樣品中，這些引物的PCR產(chǎn)物是一個480bp的片段；在表達CD44上皮型的樣品中，這些引物的PCR產(chǎn)物是一個878bp的片段；而在發(fā)生可變剪接轉(zhuǎn)錄的樣品中，會產(chǎn)生位于不同帶的片段。接下來用這些cDNA產(chǎn)物(每一例總量的10％)作模板進行PCR，其反應混合物包括1×Taq緩沖液、MgCl2(15mM)，dNTP(500μM)、適宜的5′和3′引物和Taql聚合酶(50單位/ml)。所有樣品的循環(huán)參數(shù)為55℃8分鐘，94℃1分鐘，55℃1分鐘和72℃2分鐘；(三十五個循環(huán))之后是72℃8分鐘。
為證實質(zhì)量和數(shù)量，cDNA也用核糖體基因(pHE7)(29)有義引物5′CTT CGAAAGG CAAGGAGGAA(SEQ ID NO16)和反義引物5′TGGCTCTACA ATCCTCAGCA(SEQ ID NO17)以及β-肌動蛋白有義引物5′CAGCCATGTA CGTTGCTATC CAG(SEQ ID NO18)和反義引物5′GTTTCGTGGA TGCCACAGGA C(SEQ ID NO19)進行PCR擴增作為內(nèi)對照。結(jié)果是產(chǎn)生了針對核糖體基因的300bp的片段或針對β-肌動蛋白的450bp的片段。取每種PCR產(chǎn)物10μl，用15％瓊脂糖凝膠進行電泳，然后轉(zhuǎn)到帶正電的尼龍膜上(Boehringer Mannheim)，與CD44寡核苷酸探針5′CCTGAAGAAG ATTGTACATC AGTCACAGAC(SEQID NO20)進行雜交。探針的5′端用T4多核苷酸激酶標記上放射性g-32P-ATP。預雜交和雜交在快速雜交緩沖液(Arnersham)中進行，溫度42℃，時間90分鐘。然后在42℃依次以5×SSC、含0.1％SDS的1×SSC洗膜2次，每次15分鐘，再用分子成像儀(GS-250，Bio-Rad)進行分析。
為確定有CD44分子的表達，我們使用為擴增CD44基因的不同編碼區(qū)域而設計的不同引物的組合，首先檢測了未經(jīng)處理的肺癌細胞NCI-H460(26)。實驗時，從約5×105細胞中提取RNA，以上述相同的條件用RT-PCR進行分析。正如預期的那樣，使用引物P-1(SEQ ID NO9)和P-2(SEQ ID NO10)進行PCR擴增產(chǎn)生的是針對標準型CD44同種型RNA的480bp片段(圖5，第1道)。相形之下，由其它引物的不同組合擴增的是針對分子大小迥然不同的CD44的其它片段(圖5，第2道-P3(SEQ ID NO11)+P4(SEQ ID NO12)，第3道-P5(SEQ ID NO13)+P6(SEQ ID NO14)和第4道-P6(SEQ ID NO14)+P7(SEQ ID NO15)。
為了說明一個所選的反義寡核苷酸怎樣抑制CD44 mRNA的表達，我們接下來用RT-PCR和Southern印跡雜交相結(jié)合的方法檢測CD44的表達。用作RT-PCR引物的P-1(SEQ ID NO9)和P-2(SEQ IDNO10)來源于編碼標準型同種型序列的外顯子(1-5和16-20)，這些序列靠近變異插入序列。同樣，正如從已發(fā)表的數(shù)據(jù)(30)和在圖5中總結(jié)的我們以前的結(jié)果所顯示的那樣，引物P-1(SEQ ID NO9)和P-2(SEQID NO10)的擴增只產(chǎn)生CD44標準型同種型。接著從兩種肺癌細胞系中提取RNA標本，這些細胞中有一些未用反義寡核苷酸處理，一些用了反義寡核苷酸處理(0.5/μM2小時)。我們檢測了我們所選的六種反義寡核苷酸，并用一種有義和一種隨機寡核苷酸作內(nèi)對照(圖6)。在RT-PCR和Southern印跡之后我們發(fā)現(xiàn)其中三種反義寡核苷酸一致表現(xiàn)出對NCIH460細胞系CD44 mRNA表達的強烈抑制作用(見圖6，第一道-ICN-237(SEQ ID NO3)，第三道-ICN-240(SEQ ID NO1)和第五道-ICN-308(SEQ ID NO4)。同樣的對mDNA的抑制也可在NCI-H661上找到(圖8，第2道-ICN-237(SEQ ID NO3)，第3道-ICN-240(SEQ ID NO1)和第5道-ICN-308(SEQ ID NO4)。與之相反，CD44的表達在未處理細胞上是陽性(圖8，第1道)，在經(jīng)有義或隨機寡核苷酸處理的細胞上也是陽性(見圖8，第4道-ICN-236(SEQ ID NO7)，第6道-ICN-88(SEQ ID NO8)。
應用“熱”PCR可以定量測定在應用反義寡核苷酸處理肺癌細胞后CD44 mRNA表達的下降量(圖7)。此項實驗基本應用上述同樣的方法，只是混和物中的一種脫氧核苷酸在PCR擴增時進行了放射性標記，PCR的終產(chǎn)物也被標記。通過光密度測定所得的結(jié)果是0.5μM的反義寡核苷酸處理2h后，CD44mRNA的表達下降79-94％(圖7，第1道-ICN-308(SEQ ID NO4)和第4道-ICN-240(SEQ ID NO1)。無論是有義寡核苷酸還是隨機寡核苷酸(圖7，第3道-ICN-236(SEQ ID NO7)和第6道-ICN-88(SEQ ID NO8))，或其余兩種反義寡核苷酸(圖7，第2道-ICN-248(SEQ ID NO2)和第5道-ICN-310(SEQ ID NO5))均未觀察到同樣的效應。并且沒有任何一種被測的寡核苷酸影響了核糖體RNA的水平(pHE7)，這樣就證明了對靶CD44 mRNA有選擇性，圖9是與圖6相似的Southern印跡分析的結(jié)果。但此處黑色素瘤細胞(Hs294T)的樣品是與四種反義寡核苷酸ICN-237(SEQ ID NO3)、ICN-240(SEQ ID NO1)、ICN-310(SEQ ID NO5)和ICN-248(SEQID NO2)，一種有義寡核苷酸(SEQ ID NO7)和一種隨機寡核苷酸ICN-88(SEQ ID NO8)共同孵育。在進行了RT-PCR和Southern印跡分析之后我們發(fā)現(xiàn)有兩種反義寡核苷酸抑制CD44 mRNA表達的效率很高第3道-ICN-240(SEQ ID NO1)達91％，第5道-ICN-248(SEQID NO6)達84％；剩下的反義寡核苷酸，第5道-ICN-308(SEQ ID NO4)抑制效率為約54％。第4道-ICN-236(SEQ ID NO4)，隨機寡核苷酸，第7道-ICN-88(SEQ ID NO8)以及第1道未經(jīng)處理的細胞均未表現(xiàn)出任何效應。β-肌動蛋白用作內(nèi)對照。
圖10是一條形圖，表示裸鼠應用ICN-240(SEQ ID NO1)后對體內(nèi)人白血病(NB4)的抑制，這幅圖顯示在一段長達兩周的時間里，體內(nèi)的生長抑制約為80％；而且圖中還顯示在第5到第15天，白血病細胞幾乎一點生長都沒有。
圖11A和11B是條形圖，表示在應用ICN-240(SEQ ID NO1)和其糖基化修飾形式ICN-967(SEQ ID NO1)處理后，對NB4和Daudi人白血病細胞分別所起的抑制作用。這些圖顯示G1期的白血病細胞的百分比明顯升高。
此處所描述的寡核苷酸的給藥方法，在許多動物身上，包括哺乳動物，尤其是人，在本領(lǐng)域中是眾所周知的。例如，CRC出版社出版的(Saghir Akhtar編輯，1995)《(反義寡核苷酸治療劑的給藥策略))詳述了許多這樣的給藥途徑和策略，在此將此書全文引入作為參考，以下僅以第五章為例進行說明，但并不限制整本書的應用。第五章，描述了以傳統(tǒng)的靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)和皮下途徑給藥；此外，還描述了一些“非損傷性”給藥途徑，如鼻內(nèi)給藥、眼部給藥、經(jīng)皮給藥和離子滲透給藥等途徑(同上71-83)。所有這些途徑均可用于本項發(fā)明。同一本書中的第6章提及為使寡核苷酸治療劑有核酸酶抗性而進行的修飾，此處所用術(shù)語核苷酸、寡核苷酸和核酸堿基具體包括這些化合物的修飾形式和所有其它的對天然形式進行微小修飾的變體(同上85-104)。要求專利保護的寡核苷酸也可與一種脂或其它能主動跨越細胞膜的化合物相連，連接可使用連接物也可不用連接物；并且，可以象美國專利5,411,947所公開的那樣口服給藥，美國專利5,411,947也在此引入以作參考。此外，本發(fā)明中的寡核苷酸的給藥方式還有“裸露”形式，用膠囊包裹，與囊泡、脂質(zhì)體、珠子、微球相連、作為偶合體以及使用象ICN Biomedicals號碼為SPAG.2的產(chǎn)品作氣霧劑直接入肺。因此，本發(fā)明中的寡核苷酸基本可以以已知的所有寡核苷酸的給藥途徑給藥，進行各種已接受的修飾以制備核苷酸類似物和藥物前體，使用所有的適宜的粘合劑和賦形劑，采用所有適當?shù)乃幬飫┝亢椭委煼桨浮?br> 目前，本發(fā)明的寡核苷酸的最優(yōu)選給藥包括按病人每kg體重0.1～10mg寡核苷酸的量給藥，每天1-2次，持續(xù)約40天。這個方案基于曾經(jīng)觀察到的相似寡核苷酸在體內(nèi)半衰期達數(shù)小時，而且對蛋白合成的影響可持續(xù)48或72小時。針對任何某人的特殊治療方案都將取決于臨床醫(yī)生的經(jīng)驗，包括估計疾病的嚴重程度、病人的健康情況和反應性、副作用以及他們所熟知的許多其它因素。比如，劑量的高低，治療方案持續(xù)時間的長短都將取決于主治醫(yī)生的判斷，治療時可能還會有間歇期，這時用寡核苷酸的治療將暫時停止。如果合適，還可以結(jié)合其它抗癌治療和姑息治療。疾病是好轉(zhuǎn)還是惡化可通過腫瘤大小、轉(zhuǎn)移程度以及由放射學分析和本領(lǐng)域已知的其它方法所得的參數(shù)進行判斷；副作用的有無和廣泛程度可通過測肝臟和/或腎臟的功能進行判斷，還可以通過使用象EKG這樣的方法測血循環(huán)情況進行判斷，這種方法在本領(lǐng)域中也是眾所周知的。
這樣，反義寡核苷酸控制過度表達CD44的肺癌細胞，尤其是非小細胞肺癌和黑色素瘤細胞表達CD44的效應已被公開。在臨床實踐中應用這些寡核苷酸的方法也已被公開。雖然已經(jīng)例舉和描述了具體的實施方案和應用，但對本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說，可以進行不脫離本發(fā)明精神的其它改動。因此，本發(fā)明僅由所附權(quán)利要求的精神進行限定。
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權(quán)利要求
1.一種包含序列5′TTT ATC TTC TTC CAA G(SEQ ID NO3)的寡核苷酸。
2.一種包含序列5′ATT CGA AAT GAA ACA A(SEQ ID NO1)的寡核苷酸。
3.一種包含序列5′AAA TTT CCT CCC AG(SEQ ID NO5)的寡核苷酸。
4.一種包含序列5′TTT ATC TTC TTC CAA GGC GAA GC(SEQ IDNO2)的寡核苷酸。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4的寡核苷酸，其中該寡核苷酸能與CD44基因雜交。
6.一種能使CD44基因在肺癌細胞的表達降低50％以上的寡核苷酸，包括。
7.一種能使CD44基因在非小細胞性肺癌細胞的表達降低50％以上的寡核苷酸。
8.一種能使CD44基因在黑色素瘤細胞的表達降低50％以上的寡核苷酸。
9.一種能使CD44基因在白血病細胞的表達降低50％以上的寡核苷酸
10.一種長約13-24個堿基對并與CD44編碼序列250-2038位的某些部分互補的寡核苷酸。
11.根據(jù)權(quán)利要求6-10的寡核苷酸，包含13-24個核酸堿基，13和24個包括在內(nèi)。
12.根據(jù)權(quán)利要求6-10的寡核苷酸，包含一種DNA分子。
13.一種治療腫瘤患者的方法，該方法至少部分由CD44介導，該方法包括以下步驟給予患者能降低CD44基因表達的有效量的寡核苷酸。
14.根據(jù)權(quán)利要求13的方法，其中腫瘤包括非小細胞性肺癌。
15.根據(jù)權(quán)利要求13的方法，其中寡核苷酸包括以下序列中的至少一種5′ATT CGA AAT GAA ACA A(SEQ ID NO)；5′TTT TAT CTT CTT CCAA G(SEQ ID NO3)和5′AAA TTT CCT CCC AG(SEQ ID NO5)。
16.根據(jù)權(quán)利要求1 3的一種方法，其中腫瘤包括黑色素瘤。
17.根據(jù)權(quán)利要求13-16中任何一項的方法，其中寡核苷酸包括下列序列中的至少一種5′ATT CGA AAT GAA ACA A(SEQ ID NO1)；5′TTT ATC TTC TTC CAA GGC GAA GC(SEQ ID NO2)和5′AAA TTT CCT CCC AG(SEQ ID NO5)。
18.根據(jù)權(quán)利要求13-16中任何一項的方法，其中給藥方法包括后述途徑中的至少一種，即靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、皮下、鼻內(nèi)、眼部、支氣管內(nèi)、肺內(nèi)、經(jīng)皮和離子滲透。
19.權(quán)利要求13-16中任何一項的方法，其中寡核苷酸以下列形式中的至少一種形式應用，即核酸酶抗性形式；與一種脂或能主動跨膜運輸?shù)钠渌衔锵嘟Y(jié)合；以“裸露”的形式；用膠囊包裹；與囊泡連接；與脂質(zhì)體連接；與珠子粘附；與微球粘附；作為偶合體和作為氣霧劑。
全文摘要
過度表達CD44的腫瘤細胞,尤其包括非小細胞性肺癌細胞和黑色素瘤細胞,用反義寡核苷酸進行處理以控制CD44的表達。實驗結(jié)果顯示要求專利保護的寡核苷酸以CD44序列特異性的方式明顯抑制了肺癌細胞,或黑色素瘤細胞,或兩者均在內(nèi)的細胞生長,但對正常細胞基本無毒。文中還舉例說明了臨床情況下所用劑量。
文檔編號A61K38/00GK1193280SQ9619627
公開日1998年9月16日 申請日期1996年7月31日 優(yōu)先權(quán)日1995年8月14日
發(fā)明者Z·皮特茨科, C·達里烏茨, S·盧迪及克 申請人:Icn藥品公司