專利名稱：大環(huán)內(nèi)酯類化合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一類新的大環(huán)內(nèi)酯類化合物，它們具有重要的藥學(xué)和相關(guān)的活性。為了方便起見(jiàn)，該類新的大環(huán)內(nèi)酯類化合物在本申請(qǐng)中統(tǒng)稱為“Sanglifehrins”從放線菌發(fā)酵肉湯培養(yǎng)基中首次分離出Sanglifehrins。它們是下式的Sanglifehrins A-D
可以看出，大環(huán)Sanglifehrins A-D具有完全新的結(jié)構(gòu)，其特征在于i)1至6位含有3-羧基哌噠嗪基羧酸殘基(3-carboxypiperidazinylcarboxylic acid residue)，ii)7至9位含有芳香族α-氨基酸殘基，iii)10至12位含有脂肪族α-氨基酸殘基。該大環(huán)的其余那分含有羥基羧酸殘基，在Sanglifehrins A-D的情況下該主環(huán)中提供另外的11個(gè)碳原子。
在大環(huán)內(nèi)酯化學(xué)中按照方便的作法，Sanglifehrin基本大環(huán)的原子按照以上Sanglifehrin A所示進(jìn)行編號(hào)，即將大環(huán)內(nèi)酯鍵羰基的碳原子作為1位開(kāi)始編號(hào)。
Sanglifehrins A-D特征還在于，通過(guò)烴基連接基團(tuán)在大環(huán)的23位上連有新的雙環(huán)螺旋系統(tǒng)。
Sanglifehrins A-D可以經(jīng)歷廣泛的化學(xué)反應(yīng)，得到另一類Sanglifehrin大環(huán)。所述反應(yīng)包括大環(huán)(尤其是在該內(nèi)酯氧基團(tuán)上)的裂解、在大環(huán)內(nèi)酯和螺旋環(huán)系統(tǒng)之間連接基團(tuán)的裂解，以及如以下所述取代基團(tuán)的保護(hù)反應(yīng)、衍生反應(yīng)或其他化學(xué)修飾。熟悉本技術(shù)領(lǐng)域的專業(yè)人員對(duì)進(jìn)一步化學(xué)修飾方法是明白的。
按照本發(fā)明，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，就其生物活性來(lái)說(shuō)，Sanglifehrins(尤其是其中有螺旋環(huán)的Sanglifehrins，vk Sanglifehrins A-D的情況)，具有特征性的和完全新的作用。尤其是已發(fā)現(xiàn)它們具有以下共同活性-親環(huán)蛋白結(jié)合活性；-免疫抑制活性；-抑制B-細(xì)胞和T-細(xì)胞增生；-它們沒(méi)有FK結(jié)合蛋白結(jié)合活性或鈣調(diào)磷酸酶抑制活性。
因此，可以將Sanglifehrins看作為提供了一類令人鼓舞的和新的免疫抑制劑和抗感染化合物。尤其是Sanglifehrins具有不同于先前已知免疫抑制劑和抗感染化合物(如環(huán)孢菌素類和大環(huán)內(nèi)酯類，例如雷怕霉素和FK-506)的活性特點(diǎn)，同時(shí)表明，Sanglifehrins具有不同于先前化合物的作用模式。因此就結(jié)構(gòu)和活性來(lái)說(shuō)，Sanglifehrins提供了一類新的藥物，可以預(yù)料它們實(shí)質(zhì)上擴(kuò)大了免疫抑制和/或抗感染治療的范圍，例如它們避免或減少了先前免疫抑制和抗感染治療不希望有的副作用，和/或改進(jìn)或擴(kuò)大了對(duì)新的疾病范圍或新的患者類型的治療。
Sanglifehrins，例如其中大環(huán)內(nèi)酯環(huán)是開(kāi)環(huán)形式，其中在大環(huán)內(nèi)酯與螺旋環(huán)系統(tǒng)之間的烴基連接的26位和27位均可以有羥基取代，或者其中與大環(huán)連接的螺環(huán)殘基被裂解或截?cái)?，它們通常部分或完全的失去Sanglifehrins共同的特征活性。例如，其中螺環(huán)殘基被裂解的Sanglifehrins通常具有親環(huán)的蛋白結(jié)合活性，但是不具有明顯的免疫抑制活性。然而，熟悉本技術(shù)領(lǐng)域的專業(yè)人員明白，這樣的化合物提供了制備另外新的Sanglifehrins有價(jià)值的成分、中間體或關(guān)鍵的結(jié)構(gòu)骨架，從而進(jìn)一步擴(kuò)大了Sanglifehrin類化合物可能的治療效果。
例如Sanglifehrins A～D中雙環(huán)螺旋系統(tǒng)可以看作為提供了具有關(guān)鍵生物效果的結(jié)構(gòu)成分，由于它的存在顯然對(duì)生物活性是重要的，因此它可以用作為制備另外的Sanglifehrins進(jìn)一步衍生或修飾的結(jié)構(gòu)成分，或者用作為衍生或修飾其他藥物的結(jié)構(gòu)成分，例如可以用于改變大環(huán)內(nèi)酯類其他免疫抑制劑的活性。
如以上所示，Sanglifehrins代表了完全新穎和完全具有特征結(jié)構(gòu)的一類新的大環(huán)內(nèi)酯類化合物。
因此，第一方面，本發(fā)明提供了一大環(huán)內(nèi)酯類化合物，它們?yōu)橛坞x的或受保護(hù)的形式，或?yàn)槠潲}，其中i)大環(huán)的2～6位為哌噠嗪基羧酸殘基(piperidazinyl carboxylicacid residue)；和/或ii)大環(huán)的7～9位為芳香族α-氨基酸殘基；和/或iii)大環(huán)的10～12位為脂肪族α-氨基酸殘基。
本發(fā)明的大環(huán)內(nèi)酯類化合物合適地包括特征結(jié)構(gòu)i)、ii)和iii)中的2項(xiàng)，尤其是包括全部3項(xiàng)特征結(jié)構(gòu)i)、ii)和iii)。
哌噠嗪基(piperidazinyl)羧酸殘基合適地為1，2-哌噠嗪-3-羧基-1-基殘基，其中羧基位于大環(huán)的1位，1-氮原子位于大環(huán)的6位，例如式I殘基，
其中編號(hào)代表殘基的原子在大環(huán)中的位置。該殘基可以是環(huán)被取代的或者是未被取代的。未被取代是合適的。
芳香族α-氨基酸殘基的α-氨基部分合適地位于大環(huán)的9位。合適的芳香族α-氨基酸為苯基丙氨酸，尤其是3-OH-苯基丙氨酸，殘基可為游離的或受保護(hù)的形式。
脂肪族α-氨基酸殘基的α-氨基部分合適地位于大環(huán)的12位。合適的脂肪族α-氨基酸殘基為游離的或受保護(hù)形式的纈氨酸。
大環(huán)的其余部分合適地含有一羥基羧酸殘基，它的氧部分連接大環(huán)內(nèi)酯鍵，它的羰基部分與大環(huán)12位上的α-氨基一起形成一酰氨鍵。所述羥基羧酸殘基有6～20個(gè)碳原子鏈長(zhǎng)是合適的，有11個(gè)碳原子鏈長(zhǎng)更合適。它可以是被取代的或者是未被取代的，和/或它含有1個(gè)或多個(gè)不飽和的鍵，尤其是沿其鏈長(zhǎng)有多個(gè)雙鍵。更合適的是，大環(huán)的其余部分含有11-氧-十一碳烯酰(endecanoyl)-11-基，尤其是11-氧-6，8-十一碳二烯酰(endecadienoyl)-11-基，該殘基可任意地被取代，例如在2、3、4和/或5位取代。所述羥基羧酸殘基更合適的是式II殘基，它可以是游離的或受保護(hù)的形式，或?yàn)槠潲}，
其中R1和R2均為氫，或代表額外鍵；R3為氫；R4為-CO-CH3或-CH(OH)-CH3，或R3與R4一起代表式III結(jié)構(gòu)，
按照本發(fā)明，優(yōu)選的大環(huán)內(nèi)酯類化合物含有式IV的大環(huán)，
其中X、Y和Z是以上定義的殘基i)、ii)和iii)，A為以上定義的羥基羧酸殘基，它可以是游離的或受保護(hù)的形式，或其鹽；尤其是含有式V的大環(huán)，它可以是游離的或受保護(hù)的形式，或?yàn)槠潲}，
一般來(lái)講，在Sanglifehrins(如在Sanglifehrins A～D)中，大環(huán)在鄰近內(nèi)酯橋氧部分的碳原子上被取代。所述取代基通常包括2-氧雜-2′-氮雜-3′-氧代-螺雙環(huán)己烷-3-基殘基，例如式VI，它可以是游離的或受保護(hù)的形式，或其鹽，它通過(guò)螺環(huán)殘基和大環(huán)內(nèi)酯環(huán)之間含有6-11個(gè)碳原子(通常為9個(gè)碳原子)鏈長(zhǎng)的連接基團(tuán)與大環(huán)內(nèi)酯環(huán)相連，
其中-a-b-為-(Me)C＝CH-或-(Me)CH-CH(OH)-，和R5為H或Me(其中Me和Et分別代表甲基和乙基)該連接基團(tuán)可以是被取代的或是未被取代的，和/或含有1個(gè)或多個(gè)不飽和鍵，尤其是沿其鏈長(zhǎng)的多個(gè)雙鍵。該連接基團(tuán)可以適當(dāng)?shù)乇患谆〈?，例如?個(gè)甲基取代。該連接基團(tuán)可以適當(dāng)?shù)乇涣u基進(jìn)一步取代，例如由3個(gè)羥基取代，和/或可以烯化不飽和，例如可以含有2個(gè)碳-碳雙鍵。更合適的是，該連接基團(tuán)含有1-甲基-7-甲基-壬?；?9-基，尤其是1-甲基-7-甲基-1-壬?；?9-基或1-甲基-7-甲基-1，3-壬二烯?；?9-基，殘基可任意地被取代，例如在3、4和/或8位取代。優(yōu)選的連接基團(tuán)是式VII基團(tuán)，它可以是游離的或受保護(hù)的形式，
其中c代表與螺環(huán)殘基相連，
d代表與大環(huán)相連；R6和R7各自為OH，或者它們一起代表另外的鍵。
所述連接基團(tuán)通常在鄰近內(nèi)酯氧基團(tuán)的碳原子處與大環(huán)相連，即當(dāng)大環(huán)含有11-氧-十一碳烯?；?11-基殘基時(shí)，在其11位相連。
因此本發(fā)明提供了式VIII化合物，可以是游離的或受保護(hù)的形式，或?yàn)槠潲}，S-L-MVIII其中S代表如以上定義的螺旋雙環(huán)殘基；L代表如以上定義的連接基團(tuán)；M代表如以上定義的大環(huán)內(nèi)酯環(huán)。
本發(fā)明具體的化合物是式IX所示化合物，可以是游離的或受保護(hù)的形式，或?yàn)槠潲}，
其中-a-b-的定義同上；-e-f-為-CH(OH)-CH(OH)-或-CH＝CH-；-g-h-同上述-a-b-的定義，和R3、R4和R5的定義同上。
式I～I(xiàn)X化合物含有不對(duì)稱碳原子，因此可以有許多差向立體異構(gòu)體形式。所有這些可能的差向立體異構(gòu)體以及它們的非對(duì)映異構(gòu)體混合物均包括在本發(fā)明內(nèi)。但是，其中大環(huán)內(nèi)酯環(huán)為閉環(huán)形式并且有合適立體化學(xué)的式VIII和IX化合物一般具有如以上所述Sanglifehrins特征的活性。優(yōu)選具有Sanglifehrin特征活性的差向立體異構(gòu)體。一般來(lái)說(shuō)，對(duì)于本發(fā)明的藥學(xué)用途，優(yōu)選純的或?qū)嵸|(zhì)上純的(即游離的或?qū)嵸|(zhì)上游離的Sanglifehrin特征活性缺乏的差向立體異構(gòu)體)具有Sanglifehrin特征活性的差向立體異構(gòu)體，例如含有至少90％，例如含有至少95％活性的差向立體異構(gòu)體(即含有少于10％，例如含有少于5％無(wú)活性的差向立體異構(gòu)體)。
在大環(huán)1～6位的3-羧基哌噠嗪基羧酸殘基最好具有下式構(gòu)型
在大環(huán)7～9位的芳香族氨基酸ii)最好為L(zhǎng)構(gòu)型，例如最好為下式構(gòu)型，
在大環(huán)10～12位的脂肪族氨基酸iii)最好為L(zhǎng)構(gòu)型，例如最好為下式構(gòu)型，
當(dāng)大環(huán)的其余部分含有式II殘基時(shí)，它最好具有下式構(gòu)型，
或
當(dāng)R3和R4一起代表下式時(shí)，
它最好具有下式構(gòu)型，
2-氧雜-2′-氮雜-3′-氧代-螺雙環(huán)己烷-3-基殘基最好具有下式構(gòu)型，
其中當(dāng)-a-b-為-(Me)CH-CH(OH)-時(shí)，它最好為下式構(gòu)型，
當(dāng)連接基團(tuán)為式VII時(shí)，它最好為下式構(gòu)型，
當(dāng)R6和R7各自為OH時(shí)，在26和27位上的構(gòu)型最好為26(S)、27(S)或26(R)、27(R)。當(dāng)R6和R7一起代表另外的鍵時(shí)，在26和27位上的構(gòu)型最好如下式，
本發(fā)明式IX化合物最好具有下式構(gòu)型，
其中當(dāng)-a-b-為-(Me)CH-CH(OH)-時(shí)，它最好為下式構(gòu)型，
當(dāng)-e-f-為-CH(OH)-CH(OH)-時(shí)，它最好具有(S)，(S)構(gòu)型或(R)，(R)構(gòu)型，當(dāng)-g-h-為-(Me)CH-CH(OH)-時(shí)，它最好具有下式構(gòu)型，
當(dāng)-g-h-為-(Me)C＝CH-時(shí)，它最好具有下式構(gòu)型，
當(dāng)R3和R4稠合在一起時(shí)，它們最好具有下式構(gòu)型，
Sanglifehrins A～C最好具有下式構(gòu)型，
本發(fā)明化合物可以為游離的或受保護(hù)的形式，例如“ProtectiveGroups in Organic Synthesis”(由T.W.Greene和P.G.M.Wuts編著，第二版，1991，John Wiley & Sons Inc.，New York)中所述受保護(hù)形式。尤其是羥基可以為受保護(hù)的形式，例如為甲硅烷基醚(例如在Green和Wuts編著的上述一書的p.68-86所述)、酯(見(jiàn)Green和Wuts編著的上述一書的p.87-103)和碳酸酯的形式(見(jiàn)Green和Wuts編著的上述一書的p.104-111)。所述受保護(hù)的形式也包括內(nèi)部受保護(hù)的形式；例如在式IX大環(huán)內(nèi)酯的情況(其中-g-h-為-CH(CH3)-CH(OH)-)，其中大環(huán)14～17位受保護(hù)的形式包括式X殘基，
例如其構(gòu)型為
又例如，在Sanglifehrins中的1，3-二醇可以以合適的環(huán)結(jié)構(gòu)進(jìn)行保護(hù)，例如參見(jiàn)Greene和Wuts編著的上述一書的p.118-142所述。
本發(fā)明化合物還可以以鹽的形式存在。用于本發(fā)明藥學(xué)上適用的鹽的實(shí)例，根據(jù)存在于化合物中特定的取代基包括酸加成鹽和堿加成鹽。如以上所述，本發(fā)明化合物的大環(huán)可以被裂解(尤其在內(nèi)酯氧基上)，得到其中大環(huán)為開(kāi)環(huán)形式的化合物。內(nèi)酯氧基的裂解一般可通過(guò)水解(溶劑分解)進(jìn)行，得到式XI化合物，R6O-X-Y-Z-A-OH XI例如式XII化合物，
例如式IX′化合物，
其中X、Y、Z、A、R3、R4和R5的定義同上，R6為氫或C1-4烷基，例如甲基。
所述開(kāi)環(huán)形式提供了改變基本Sanglifehrin大環(huán)系統(tǒng)中間體的方法，它們也屬于本發(fā)明部分。
因此，另一方面，本發(fā)明還提供了-上述開(kāi)環(huán)形式的大環(huán)內(nèi)酯，所述開(kāi)環(huán)大環(huán)為游離的或受保護(hù)的形式，或?yàn)槠潲}；-上述化合物R6O-X-Y-Z-A-OH，它可以為游離的或受保護(hù)的形式，或?yàn)槠潲}；-化合物R6O-X-Y-Z-A′-CH(OH)-L-S，為游離的或受保護(hù)的形式，或?yàn)槠潲}，其中-A′-CH(OH)-為羥基羧酸殘基，例如上面定義的式II殘基，其他符號(hào)的定義同上；式XII′化合物，為游離的或受保護(hù)的形式，或?yàn)槠潲}，
-式IX″化合物，為游離的或受保護(hù)的形式，或?yàn)槠潲}，
本發(fā)明還包括其中2-氧雜-2′-氮雜-3′-氧代-3′-基-螺雙環(huán)己烷系統(tǒng)為開(kāi)環(huán)形式的化合物，例如式XII化合物，它可以是游離的或受保護(hù)的形式，或?yàn)槠潲}，
其中a、b、L和M的定義同上。
本發(fā)明的開(kāi)環(huán)化合物的構(gòu)型最好為以上閉環(huán)化合物確定的優(yōu)選構(gòu)型。開(kāi)環(huán)螺雙環(huán)系統(tǒng)化合物式XII最好具有下式構(gòu)型，
其中當(dāng)-a-b-為-(Me)CH-CH(OH)-時(shí)，它最好具有下式構(gòu)型，
具有與大環(huán)連接的螺雙環(huán)殘基的本發(fā)明大環(huán)內(nèi)酯還可以經(jīng)歷涉及連接基團(tuán)的裂解(例如關(guān)于式IX，尤其是在殘基26和27之間的鍵)，結(jié)果得到獨(dú)立的新的螺雙環(huán)化合物和另一大環(huán)內(nèi)酯類化合物。如以上所述，上述化合物也可以用作為中間體，尤其是在Sanglifehrins的生物活性中具有主要官能作用的Sanglifehrins的螺雙環(huán)部分。
因此，本發(fā)明提供了-2-氧雜-2′-氮雜-3′-氧代-3′-基-螺雙環(huán)己烷，它可以為游離的或受保護(hù)的形式，或?yàn)槠潲}，尤其是式VI′化合物，它可以是游離的或受保護(hù)的形式，或?yàn)槠潲}，
其中R7為H，任意受保護(hù)的OH基團(tuán)，活性官能團(tuán)或-CH2-CH(OH)-CH(CH3)-CH2-CH2-CHO基團(tuán)，或其等效的δ鄰位羥基內(nèi)醚優(yōu)選的式VI′化合物具有以下構(gòu)型，
其中當(dāng)-a-b-為-(Me)CH-CH(OH)-時(shí)，它最好具有下式構(gòu)型，
本發(fā)明還包括開(kāi)環(huán)的2-氧雜-2′-氮雜-3′-氧代-3′-基-螺雙環(huán)己烷，它為游離的或受保護(hù)的形式，或?yàn)槠潲}，尤其是式XII′化合物，它為游離的或受保護(hù)的形式，或?yàn)槠潲}，
其中a、b和R7的定義同前。開(kāi)環(huán)的螺雙環(huán)系統(tǒng)式XII′化合物最好為下式構(gòu)型，
其中當(dāng)-a-b-為-(Me)CH-CH(OH)-時(shí)，它最好具有下式構(gòu)型，
本發(fā)明還提供了式XIII大環(huán)內(nèi)酯，它為游離的或受保護(hù)的形式，或?yàn)槠潲}，
其中M為如上定義的大環(huán)內(nèi)酯環(huán)，尤其是式XIV大環(huán)內(nèi)酯環(huán)，
尤其是具有下式構(gòu)型的大環(huán)內(nèi)酯環(huán)，
其中當(dāng)-g-h-為-(Me)CH-CH(OH)-時(shí)，它最好具有下式構(gòu)型，
當(dāng)-g-h-為-(Me)C＝CH-時(shí)，它最好具有下式構(gòu)型，
當(dāng)R3和R4稠合在一起時(shí)，它們最好具有下式構(gòu)型，
另一方面，本發(fā)明包括本發(fā)明所述大環(huán)內(nèi)酯類及相關(guān)化合物，尤其是實(shí)質(zhì)上純的(例如至少90％，至少95％較好，尤其至少98％純的)天然產(chǎn)品。
除了以上所述之外，本發(fā)明也提供了制備任一上述本發(fā)明化合物的方法，該方法包括
i)為了制備Sanglifehrins A、B、C、D中任何一個(gè)產(chǎn)品，將能產(chǎn)生Sanglifehrin A、B、C、D的放線菌菌株在培養(yǎng)基中培養(yǎng)，并且從得到的肉湯培養(yǎng)物中分離所需要的Sanglifehrin A、B、C或D；ii)為了制備Sanglifehrins C和D，使Sanglifehrins A和B在15及16位進(jìn)行環(huán)合；iii)為了制備Sanglifehrins A和B，使Sanglifehrins C和D在15和16位的鄰位羥基內(nèi)醚環(huán)進(jìn)行開(kāi)環(huán)；iv)為了制備其中-g-h-為-C(CH3)＝CH-的式IX或IX′大環(huán)內(nèi)酯，將其中-g-h-為-CH(CH3)-CH(OH)-的式IX或IX′化合物或其受保護(hù)形式進(jìn)行脫水；v)為了制備其中R4為-CH(OH)-CH3的式IX或IX′大環(huán)內(nèi)酯，將其中R4為-C(O)-CH3的式IX或IX′化合物進(jìn)行氫化；vi)為了制備其中大環(huán)內(nèi)酯環(huán)的14～16位含有式X殘基的式IX或IX′大環(huán)內(nèi)酯，使式IX或IX′化合物在15和17位進(jìn)行內(nèi)部保護(hù)，
vii)為了制備式IX或IX′大環(huán)內(nèi)酯，使其中大環(huán)內(nèi)酯環(huán)的14～16位含有式X殘基的式IX或IX′化合物在15和17位進(jìn)行內(nèi)部保護(hù)的脫保護(hù)，
viii)為了制備其中R5為甲基的式IX或IX′大環(huán)內(nèi)酯，將其中R5為氫的式IX或IX′大環(huán)內(nèi)酯進(jìn)行甲基化；ix)為了制備其中R4為氧-受保護(hù)形式的式IX或IX′大環(huán)內(nèi)酯，使其中R4為氧-未受保護(hù)形式的式IX或IX′大環(huán)內(nèi)酯轉(zhuǎn)變?yōu)檠?受保護(hù)形式；x)為了制備其中R4為氧-未受保護(hù)形式的式IX或IX′大環(huán)內(nèi)酯，使其中R4為氧-受保護(hù)形式的式IX或IX′大環(huán)內(nèi)酯進(jìn)行氧脫保護(hù)；xi)為了制備在大環(huán)7～10位上有氧-受保護(hù)的羥基苯基丙氨酸殘基的式IX或IX′大環(huán)內(nèi)酯，使其中在大環(huán)的7～10位有氧-未受保護(hù)的羥基苯基丙氨酸殘基的式IX或IX′大環(huán)內(nèi)酯進(jìn)行氧-保護(hù)；xii)為了制備在大環(huán)7～10位上有氧-未受保護(hù)的羥基苯基丙氨酸殘基的式IX或IX′大環(huán)內(nèi)酯，使在大環(huán)7～10位有氧-受保護(hù)的羥基苯基丙氨酸殘基的式IX或IX′大環(huán)內(nèi)酯進(jìn)行氧-脫保護(hù)；xiii)為了制備其中-e-f-為-CH(OH)-CH(OH)-的式IX或IX′大環(huán)內(nèi)酯，使其中-e-f-為-CH＝CH-的式IX或IX′大環(huán)內(nèi)酯進(jìn)行氧化水解；xiv)為了制備式V′化合物或式XII化合物，使式IX或IX′的螺雙環(huán)與大環(huán)之間的連接基團(tuán)進(jìn)行裂解；xv)為了制備式R6O-X-Y-Z-A-OH或式R6O-X-Y-Z-A′-CH(OH)-L-S化合物，使式IV大環(huán)或式VIII大環(huán)在其內(nèi)酯橋處進(jìn)行開(kāi)環(huán)；xvi)為了制備閉環(huán)形式的式IX或XII大環(huán)內(nèi)酯，使式R6O-X-Y-Z-A-OH化合物或式R6O-X-Y-Z-A′-CH(OH)-L-S化合物進(jìn)行大環(huán)的閉合；xvii)為了制備式XII或XII′化合物，使式IX或VI′化合物在螺雙環(huán)系統(tǒng)內(nèi)進(jìn)行開(kāi)環(huán)；xix)為了制備式IX或VI′化合物，使式XII或XII′化合物在螺雙環(huán)系統(tǒng)內(nèi)進(jìn)行閉合。
本發(fā)明的方法可以按例如實(shí)施例所述進(jìn)行。可以明白，以上所述方法可用于任一合適的順序或合適順序的組合，結(jié)果得到另一大環(huán)內(nèi)酯類化合物，它可以是以上所述游離的、受保護(hù)的、開(kāi)環(huán)的和閉環(huán)的形式。
本發(fā)明的大環(huán)內(nèi)酯，例如Sanglifehrins A～D是天然的化合物，或是由天然化合物衍生的，它們通?？梢杂涉溍咕频某蓡T中得到。
如以上所述，細(xì)菌能夠產(chǎn)生大環(huán)內(nèi)酯，這在以前是未被確定的。
因此，再一方面，本發(fā)明提供了-產(chǎn)生大環(huán)內(nèi)酯的放線菌菌株，其中大環(huán)內(nèi)酯是下述大環(huán)內(nèi)酯，其中i)大環(huán)的2～6位為哌噠嗪基羧酸殘基；和/或ii)大環(huán)的7～9位為芳香族α-氨基酸殘基；和/或iii)大環(huán)的10～12位為脂肪族α-氨基酸殘基，尤其是本發(fā)明提供了-產(chǎn)生Sanglifehrin A、B、C或D的射線菌菌株。
合適的放線菌株是鏈霉菌科，更合適的是鏈霉菌屬，尤其是后面所述的鏈霉菌sp.A 92-308110株，或者是由它衍生的菌株，例如包括其突變系、變異株、融合、重組株或改性的形式。
本發(fā)明應(yīng)用的合適的菌株是生物學(xué)上純的分離菌株。
通過(guò)常用的方法，例如通過(guò)紫外線照射或通過(guò)用化學(xué)誘變劑(如N-甲基-N′-硝基-亞硝基胍)，可以使鏈霉菌菌株A92-308110變異或變化成不同的形式。通過(guò)原生質(zhì)融合可以得到重組的細(xì)胞系。能夠產(chǎn)生Sanglifehrins的所有變異株或重組株或變化的形式，包括能夠增加收率產(chǎn)生Sanglifehrins的變異株和重組株均包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
在本發(fā)明特定的實(shí)施例中，其中Sanglifehrins A、B、C和D是從新的鏈霉菌菌株A92-308110中分離得到的。鏈霉菌屬A92-308110菌種以Budapest Treaty名稱存儲(chǔ)在Deutsche Sammlung vonMikroorganismen und Zellkulturen GmbH，Mascheroder Weg 1b，D-38124 Braunschweig，德國(guó)(1995年5月3日)，其存儲(chǔ)編號(hào)為DSM 9954。鏈霉菌屬A92-308110菌種也可以從Sandoz Ltd.CH4002 Basel瑞士得到。
必須注意，按照供給規(guī)則28(4)和(5)EPC，利用DSM 9985菌種是有限制的。
在實(shí)施例2中敘述從鏈霉菌屬A92-308110中分離SanglifehrinsA、B、C和D。
按照Bergey′s Manual(第4卷，1989，Williams and Wilkins，Baltimore)和The Prokaryotes(1992 Springer Verlag，紐約)的敘述，鏈霉菌屬A92-308110株屬于鏈霉菌科。該細(xì)菌的細(xì)胞壁含有LL-二氨基庚二酸。該脂肪酸是異-和反異-支鏈、直鏈和不飽和的。糖光譜不是特殊的。營(yíng)養(yǎng)菌絲體沒(méi)有分解成碎片。氣生菌絲體形成長(zhǎng)鏈芽孢。
根據(jù)以上所引的參考中，標(biāo)為A92-308110的菌株是新的鏈霉菌。A92-308110生長(zhǎng)在各種有機(jī)和無(wú)機(jī)介質(zhì)中，并且在大多數(shù)情況下形成氣生菌絲體。原始的基質(zhì)菌絲體作為菌絲生長(zhǎng)，并且通常為米色至淡灰棕色。氣生菌絲體的顏色屬于灰色型，序數(shù)4，該菌絲體形成長(zhǎng)鏈的、屬于螺旋b型的芽孢。
在下表中列出了鏈霉菌屬A92-308110在常用的生物介質(zhì)中的生長(zhǎng)能力、它的碳應(yīng)用以及它的生理特征。
表1.在各種生物介質(zhì)中的生長(zhǎng)培養(yǎng)基培養(yǎng)物特征酵母浸出物/ 生長(zhǎng)良好麥芽瓊脂 基質(zhì)菌絲體淡棕色氣生菌絲體淡灰-棕色可溶性色素?zé)o燕麥瓊脂 生長(zhǎng)良好基質(zhì)菌絲體暗棕色氣生菌絲體淡灰-棕色可溶性色素淡棕色葡萄糖-天冬酰胺 生長(zhǎng)適度基質(zhì)菌絲體淡棕色氣生菌絲體淡灰-棕色可溶性色素?zé)o無(wú)機(jī)鹽/淀粉瓊脂 生長(zhǎng)適度基質(zhì)菌絲體灰色氣生菌絲體淡灰-棕色可溶性色素?zé)o蔗糖/硝酸鹽瓊脂 生長(zhǎng)很不好基質(zhì)菌絲體灰白色氣生菌絲體不好，淡灰棕色可溶性色素?zé)o甘油/天冬酰胺瓊脂 生長(zhǎng)適度基質(zhì)菌絲體淡棕色氣生菌絲體淡灰-棕色可溶性色素?zé)o營(yíng)養(yǎng)瓊脂 生長(zhǎng)適度基質(zhì)菌絲體米色氣生菌絲體無(wú)可溶性色素棕色表2碳應(yīng)用適度或良好 葡萄糖、果糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖不好 鼠李糖、蔗糖、棉子糖、纖維素、柳醇陰性 m-肌醇表3生理特征硝酸還原 陽(yáng)性淀粉水解 對(duì)無(wú)機(jī)鹽-淀粉瓊脂為適度對(duì)燕麥瓊脂為陰性酪氨酸降解 陰性牛奶胨化 陽(yáng)性黑素生成 陽(yáng)性生長(zhǎng)溫度 18～37℃在13℃生長(zhǎng)很不好在45℃不生長(zhǎng)pH范圍 在pH5和7，富生長(zhǎng)在pH9，生長(zhǎng)良好NaCl抗性 直到6％，但在濃度為2％時(shí)生長(zhǎng)已經(jīng)減慢本發(fā)明的大環(huán)內(nèi)酯類化合物，包括Sanglifehrins A、B、C和D可以通過(guò)在合適的培養(yǎng)基上培養(yǎng)鏈霉菌屬A92-308110或其變異株、重組株或改性形式得到。實(shí)施例1敘述(僅僅是為了本發(fā)明的敘述)了培養(yǎng)鏈霉菌屬A92-308110株的方法。
因此，再一方面，本發(fā)明包括a)能夠產(chǎn)生本發(fā)明大環(huán)內(nèi)酯的生物學(xué)上純的鏈霉菌屬A92-308110(DSM 9954)株或其變異株、重組株或改性的形式，b)制備本發(fā)明大環(huán)內(nèi)酯的方法，該方法包括在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)鏈霉菌屬A92-308110(DSM 9954)菌株或其變異株、重組株或改性的形式，并且有選擇地回收Sanglifehrin。
本發(fā)明的大環(huán)內(nèi)酯類化合物，例如式IX化合物，例如SanglifehrinsA、B、C和D以及它們的藥學(xué)上適用的鹽(后面從種屬上來(lái)說(shuō)后面稱為“本發(fā)明藥物”)具有Sanglifehrin特征活性，即具有下述共同活性-有親環(huán)蛋白結(jié)合活性；-有免疫抑制活性；-抑制B-細(xì)胞和T-細(xì)胞增生作用；-沒(méi)有FK結(jié)合蛋白結(jié)合活性；-沒(méi)有抑制鈣調(diào)磷酸酶活性。
為了測(cè)定它們的活性，下面較詳細(xì)地?cái)⑹鲈囼?yàn)和它們的活性。本發(fā)明大環(huán)內(nèi)酯類化合物，例如式IX化合物以及Sanglifehrins A、B、C和D的生物活性可以用例如下述通常的體外和體內(nèi)試驗(yàn)方法來(lái)表明。1.對(duì)羊血紅細(xì)胞的初級(jí)體液免疫反應(yīng)(MD，Mishell-Dutton)在24孔培養(yǎng)板中，以1ml的最后體積將小鼠脾細(xì)胞(OF 1，雌性，8-10周齡，1×107)與羊紅細(xì)胞(SRBC，3×107)共同培育3天。收集淋巴細(xì)胞，洗滌，并以1×106個(gè)細(xì)胞的密度在帶有新鮮抗原(SRBC)的軟瓊脂上作平皿培養(yǎng)。培育60-90分鐘之后，加入補(bǔ)體(豚鼠血清)，再繼續(xù)培養(yǎng)60分鐘，然后通過(guò)空斑計(jì)數(shù)(顯微鏡下)評(píng)價(jià)試驗(yàn)結(jié)果。在3天的培育中，淋巴細(xì)胞被抗原(SRBC)致敏。當(dāng)再次與抗原共同養(yǎng)育時(shí)，B-淋巴細(xì)胞分泌特異性抗體，并與該分泌性淋巴細(xì)胞附近的抗原相結(jié)合。加入補(bǔ)體引起抗體包被紅細(xì)胞的溶解而產(chǎn)生空斑。每個(gè)空斑則代表一個(gè)產(chǎn)生抗體的細(xì)胞。
對(duì)空斑形成的抑制作用是藥劑有效性的指針。本發(fā)明的化合物，如Sanglifehrins A至D，在大約…？…至…？…nM的濃度在此試驗(yàn)中有活性。
參考文獻(xiàn)R.I.Mishell & F.W.Dutton(1966)，正常小鼠脾細(xì)胞懸液在體外的免疫作用。Scierce 1531004-1006。
R.I.Mishell & F.W.Dutton(1967)，從正常小鼠分離的脾細(xì)胞培養(yǎng)物的免疫作用。J.Exp.Med.126423-442。2.淋巴細(xì)胞對(duì)異源性刺激的增殖反應(yīng)雙向MLR(鼠混合淋巴細(xì)胞反應(yīng))將來(lái)源于Balb/c小鼠(雌性，8-10周齡)的脾細(xì)胞(2×105)與來(lái)源于CBA小鼠(雌性，8-10周齡)的2×105脾細(xì)胞共同培育4天。異源細(xì)胞對(duì)反應(yīng)性脾細(xì)胞群誘發(fā)增殖反應(yīng)，可通過(guò)標(biāo)記前體物摻入DNA來(lái)測(cè)定。本發(fā)明的大環(huán)內(nèi)酯，如結(jié)構(gòu)式IX的化合物及其藥劑學(xué)可接受的鹽，如Sanglifehrins A、B、C和D，具有從大約30up至200nM范圍的IC50，與之相比較，環(huán)孢多肽A在此試驗(yàn)中測(cè)得IC50為大約20nM。
T.Meo(1979)小鼠MLR反應(yīng)。In“免疫學(xué)方法”，L.Lefkovitsand B.Pernis，Eds，Academic Press，N.Y.pp.227-239。3.LPS激活的鼠B細(xì)胞將來(lái)源于CBA小鼠的脾細(xì)胞(2×105)與50μg/ml LPS及待測(cè)化合物混合培育48小時(shí)。通過(guò)標(biāo)記的前體物摻入DNA測(cè)定細(xì)胞增殖反應(yīng)。本發(fā)明的大環(huán)內(nèi)酯，如結(jié)構(gòu)式IX化合物及其藥劑學(xué)可接受的鹽，如Sanglifehrins A、B、C和D，抑制B細(xì)胞增殖，具有從大約40up至100μM范圍的IC50。
參考文獻(xiàn)Greaves，M.and J.Janossy，1972，通過(guò)細(xì)胞表面結(jié)合配體而引發(fā)的選擇性T和B淋巴細(xì)胞反應(yīng)，Transplant Rev.1187。
Janossy，G.and M.F.Greaves，1971，淋巴細(xì)胞激活作用。I.T和B淋巴細(xì)胞對(duì)植物致絲裂素的反應(yīng)。4.用THP1細(xì)胞株作體外細(xì)胞毒性和細(xì)胞抑制活性試驗(yàn)用人單核細(xì)胞株THP1(5×104個(gè)細(xì)胞/孔)作細(xì)胞毒性測(cè)定，在存在IFNγ(100U/ml)和LPS(5μg/ml)加待測(cè)定化合物(至10μM)的情況下，將它在37℃培育24-72小時(shí)。用比色MTT讀出法，通過(guò)測(cè)定活細(xì)胞中線粒體脫氫酶的活性而對(duì)存活細(xì)胞進(jìn)行定量(Mossman1983)。在本試驗(yàn)經(jīng)過(guò)24小時(shí)培育之后，本發(fā)明的大環(huán)內(nèi)酯，如結(jié)構(gòu)式IX化合物及其藥劑學(xué)可接受的鹽，如Sanglifehrins A、B、C和D，具有大約1000-5000nM的IC50。
Mossman T.J.(1983)，細(xì)胞生長(zhǎng)和存活的快速比色測(cè)定法用于細(xì)胞增殖和毒性測(cè)定，J.Imm.Methods，65，55-635.人外周血單核細(xì)胞釋放TNF按照Hansell et al.(1991)的方法，借助Ficoll-Hypaque密度分離技術(shù)，從健康志愿者的外周血制備單核細(xì)胞。在加入刺激劑之前，將細(xì)胞(105個(gè)細(xì)胞/孔，在含有10％體積FCS的200μl RPMI中)與系列稀釋的待測(cè)化合物在37℃共同培育30分鐘。以γ干擾素(100U/ml)和LPS(5μg/ml)作刺激劑，誘發(fā)外周血單核細(xì)胞釋放α腫瘤壞死因子(TNF)。培育3小時(shí)之后，將細(xì)胞離心(1200rpm，10分鐘)，收集上清液。用可購(gòu)得的酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)試劑盒，測(cè)定細(xì)胞上清液中TNF的含量。用此法測(cè)定時(shí)，本發(fā)明的大環(huán)內(nèi)酯，如結(jié)構(gòu)式IX化合物及其藥劑學(xué)可接受的鹽，如Sanglifehrins A、B、C和D，具有從大約200nM至1000nM范圍的IC50。6.親環(huán)蛋白結(jié)合測(cè)定法適合的親環(huán)蛋白結(jié)合測(cè)定法是由Quesniaux在Eur.J.Immunol.1987 17 1359-1365中所述的競(jìng)爭(zhēng)性ELISA試驗(yàn)。在此試驗(yàn)中，在親環(huán)蛋白(重組的人親環(huán)蛋白A)與包被的BSA-環(huán)孢多肽A共溫育的過(guò)程中加入待測(cè)化合物，然后計(jì)算達(dá)到?jīng)]有競(jìng)爭(zhēng)劑的對(duì)照反應(yīng)50％抑制所需要的濃度(IC50)。另一種測(cè)定法是Schneider et al在Biochemistry(1994)，33，8218-8224中所述的競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合試驗(yàn)。它包括在將生物素化的親環(huán)蛋白(重組的人A)與包被的BSA-環(huán)孢多肽A共溫育的過(guò)程中加入待測(cè)化合物?？赏ㄟ^(guò)與抗生蛋白鏈菌素偶聯(lián)的堿性磷酸酶共溫育，來(lái)測(cè)定存在和不存在待測(cè)化合物時(shí)被結(jié)合的生物素化親環(huán)蛋白的量。本發(fā)明的大環(huán)內(nèi)酯，如結(jié)構(gòu)式IX化合物，如Sanglifehrin A、B、C和D，具有從大約10至100nM范圍的IC50，與之相比較。當(dāng)環(huán)孢多肽A用這些檢測(cè)法測(cè)定時(shí)，具有大約80nM的IC50。
可用于證明Sanglifehrins生物活性的另一些體外試驗(yàn)是，IL-2指示基因檢測(cè)法和ConA刺激脾細(xì)胞檢測(cè)法(指示對(duì)T-細(xì)胞激活的作用)。
當(dāng)用標(biāo)準(zhǔn)的試驗(yàn)進(jìn)行測(cè)定時(shí)，本發(fā)明的大環(huán)內(nèi)酯，如結(jié)構(gòu)式IX化合物如Sanglifehrin A、B、C和D，不具有結(jié)合FK的蛋白質(zhì)結(jié)合活性，也不能抑制神經(jīng)鈣蛋白的活性。7.大鼠的局部移植-對(duì)抗-宿主(GvH)反應(yīng)〔Ford et al.，TRANSP L.PROC.10(1979)258〕從起始日(0天)開(kāi)始，將來(lái)自6周齡雌性Wistar/Furth(WF)大鼠的脾細(xì)胞(1×107)，對(duì)體重約100g的雌性(F344×WF)F1大鼠的左后腳爪作皮下注射。動(dòng)物被再連續(xù)處理4天，在第7天取出雙側(cè)腘淋巴結(jié)并稱重。以二個(gè)淋巴結(jié)之間的重量差異作為評(píng)價(jià)反應(yīng)的參數(shù)。
在上述試驗(yàn)中，對(duì)GvH反應(yīng)的抑制作用是藥劑效果的指針。本發(fā)明的大環(huán)內(nèi)酯，如結(jié)構(gòu)式IX化合物及其藥劑學(xué)可接受的鹽，如Sanglifehrins A、B、C和D，當(dāng)以大約1mg/kg的劑量皮下給藥時(shí)，能夠抑制GvH反應(yīng)達(dá)到大約30％。8.SRBC-TH細(xì)胞誘發(fā)的DTH對(duì)雌性C57 BL/6小鼠(6-12周齡)的右后爪墊皮下注射TH(備用的羊紅細(xì)胞)細(xì)胞克隆(2×106)和10％羊紅細(xì)胞(SRBC)懸液的1∶1(v/v)混合物50μl。而對(duì)小鼠左后爪皮下注射50μl SRBC細(xì)胞懸液(以PBS 1∶1 v/v稀釋的)(用于測(cè)定由于注射操作引起的非特異性爪墊腫脹增加)。24小時(shí)之后，測(cè)定左、右后爪墊的厚度。
計(jì)算右爪墊比左爪墊厚度增加的百分?jǐn)?shù)(z)。右爪墊厚度＝x，左爪墊厚度＝y(tǒng)，％比增加＝zz＝((x-y)/y)·100本發(fā)明的大環(huán)內(nèi)酯，如結(jié)構(gòu)式IX化合物及其藥劑學(xué)可接受的鹽，如Sanglifehrins A、B、C和D，在皮下注射大約5mg/kg劑量時(shí)，DTH小鼠的腫脹減少達(dá)到大約50％。
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P.Herrmann，M.H.Schreier，J.-F.Borel & C.Feurer(1988)肥大細(xì)胞脫顆粒作為由純系輔助T細(xì)胞誘發(fā)的遲發(fā)型過(guò)敏反應(yīng)效應(yīng)時(shí)相內(nèi)的主要事件。Int.Archs Allergy appl.Immun.86102-105。
大鼠/小鼠心臟異質(zhì)移植本發(fā)明大環(huán)內(nèi)酯的體內(nèi)試驗(yàn)效果，可用Alzet滲透微型真空泵皮下給藥，通過(guò)大鼠和小鼠心臟異質(zhì)移植來(lái)測(cè)定。在小鼠心臟異質(zhì)移植中(以BALB/c對(duì)C3H移植)，本發(fā)明的大環(huán)內(nèi)酯，如結(jié)構(gòu)式IX化合物及其藥劑學(xué)可接受的鹽，Sanglifehrins A、B、C和D，在大約30mg/kg/天的劑量下能延長(zhǎng)移植存活時(shí)間。在大鼠心臟異質(zhì)移植中(以DA對(duì)Lewis移植)，以亞最佳劑量的環(huán)孢多肽A與本發(fā)明的大環(huán)內(nèi)酯，如結(jié)構(gòu)式IX化合物及其藥劑學(xué)可接受的鹽，如Sanglifehrins A、B、C和D，配伍給藥可延長(zhǎng)移植存活時(shí)間，如下表所示。
本發(fā)明化合物可以用作為藥物，例如作為免疫抑制劑以及作為抗炎劑。
本發(fā)明化合物尤其可用于防治急性和/或慢性器官或組織的同種異體移植和異種異體移植排異反應(yīng)，例如用于心、肝、合并的心肺、肝、腎、胰、皮膚或角膜的移植。還表明，本發(fā)明化合物也可用于防治如下述骨髓移植的移植物抗宿主疾病。
本發(fā)明藥物也可用于治療自身免疫疾病和炎癥，尤其是與病原學(xué)(包括自身免疫成分)有關(guān)的炎癥，如關(guān)節(jié)炎(例如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、慢性關(guān)節(jié)炎和關(guān)節(jié)變形)以及風(fēng)濕性疾病。本發(fā)明藥物可以應(yīng)用的具體的自身免疫疾病包括自身免疫血液疾病(包括例如溶血性貧血、再生障礙性貧血、純紅細(xì)胞性貧血和自發(fā)的血小板減少癥)、全身紅斑狼瘡、多軟骨炎、硬皮疾、韋格內(nèi)氏肉芽腫病、皮膚肌炎、慢性活性肝炎、重癥肌無(wú)力、牛皮癬、史蒂文斯-約翰遜綜合征、自發(fā)的口炎性腹瀉、自身免疫炎性腸疾病(包括例如潰瘍性結(jié)腸炎和節(jié)段性回腸炎)、內(nèi)分泌的眼病、格雷夫斯病、肉樣瘤病、多發(fā)性硬化病、原發(fā)性膽汁性肝硬變、青少年糖尿病(糖尿病I型)、眼色素尿炎(前和后)、干性角膜結(jié)膜炎和春天的和/或過(guò)敏性的角膜結(jié)膜炎、間隙的肺纖維化、牛皮癬關(guān)節(jié)炎、腎小球性腎炎(有或者沒(méi)有腎變病綜合征，例如包括自發(fā)的腎變病綜合征或最小變化的腎病)以及哮喘。
對(duì)于上述用途和其他用途，本發(fā)明藥物可以單獨(dú)應(yīng)用或者與另外的免疫抑制劑或抗炎劑(包括環(huán)孢菌素、雷怕霉素、FK 506和甾族化合物)一起應(yīng)用。
對(duì)于上述適應(yīng)癥，合適的劑量可以根據(jù)所選用的本發(fā)明的藥物、接受治療對(duì)象的情況、給藥的方式、需治療疾病的特點(diǎn)和嚴(yán)重的程度進(jìn)行變化。但是一般來(lái)講，每天按0.01～10mg/kg劑量經(jīng)口服給藥，在動(dòng)物試驗(yàn)中得到了滿意的結(jié)果。在較大的哺乳動(dòng)物(例如人)中，每天1次口服Sanglifehrin的劑量范圍為0.5～500mg，每天以均分劑量分2～4次服用更為合適。
在人的器官移植中可以按0.1～100mg/kg劑量口服本發(fā)明藥物，按0.3～30mg/kg劑量口服較好，更好的是按0.5～10mg/kg劑量口服。當(dāng)本發(fā)明藥物與其他的免疫抑制劑(如皮質(zhì)甾類化合物或環(huán)孢菌素類或雷怕霉素類化合物)一起用二、三或四聯(lián)藥進(jìn)行治療時(shí)，可以應(yīng)用低劑量(例如0.1mg/kg/天，靜脈注射；3mg/kg/天開(kāi)始口服)本發(fā)明藥物尤其可以與其他非甾族的免疫抑制劑，例如與環(huán)孢菌素A、雷怕霉素或FK506一起應(yīng)用，目的在于部分或完全的取代甾族化合物。
本發(fā)明藥物可以按通常的途徑給藥，尤其是經(jīng)胃腸道給藥，例如以口服溶液劑形式、片劑或膠囊劑形式給藥，或者以非經(jīng)胃腸形式例如注射的溶液劑或混懸液劑形式給藥。雖然對(duì)于某些情況(例如防治肝臟移植的排斥反應(yīng))靜脈注射形式是合適的，但是對(duì)于全身給藥口服通常是較好的。本發(fā)明化合物還可以局部給藥或經(jīng)皮給藥，例如以經(jīng)皮膚給藥的霜?jiǎng)┗蚰z劑或類似的制劑形式應(yīng)用，對(duì)于眼科應(yīng)用，可以應(yīng)用眼用霜?jiǎng)?、凝膠劑或滴眼制劑。
口服制劑合適的單位劑量形式為每個(gè)劑量含有例如0.5～100mg本發(fā)明化合物。
按照以上所述，本發(fā)明還提供了一系列具體的方法A.給需要上述治療的對(duì)象有效的免疫抑制的方法，該方法包括給所述對(duì)象施用有效劑量的本發(fā)明藥物。
B.1)防治急性和/或慢性器官同種異體移植或異種異體移植排異反應(yīng)的方法，例如治療接受上面所示任一類型器官移植接受者的排異反應(yīng)的方法；
2)防治移植物抗宿主疾病的方法，例如防治骨髓移植接受者中的移植物抗宿主疾病的方法；3)治療自身免疫疾病或治療上述任一疾病或病患的方法；4)在需要所述治療的對(duì)象中治療哮喘的方法，該方法包括給所述對(duì)象施用有效劑量的本發(fā)明藥物。
C.用作為藥品的本發(fā)明化合物，例如用作為免疫抑制劑的本發(fā)明化合物，或用于治療以上B所述疾病或病患的本發(fā)明化合物。
D.含有本發(fā)明化合物以及藥學(xué)上適用的稀釋劑或載體的本發(fā)明藥用組合物。
E.本發(fā)明化合物在制備藥物中的應(yīng)用，所述藥物用作為免疫抑制劑或用于治療上述B所述疾病或病患。
此外，具有親環(huán)蛋白結(jié)合活性的本發(fā)明大環(huán)內(nèi)酯類化合物還可以用作為環(huán)孢菌素和其他親環(huán)蛋白結(jié)合化合物的置換免疫試驗(yàn)的試劑，例如在我們的共同未決專利申請(qǐng)WO 95/07468中所述試驗(yàn)方法中應(yīng)用作為試劑。該專利申請(qǐng)涉及測(cè)定血中親免疫因子結(jié)合藥物(如環(huán)孢素)濃度的試驗(yàn)方法，該方法包括加一結(jié)合競(jìng)爭(zhēng)劑以便從血的免疫抑制劑一親免疫因子復(fù)合物中置換藥物；加一可與藥物結(jié)合但不明顯與競(jìng)爭(zhēng)劑結(jié)合的受體；從標(biāo)本中分離受體-藥物復(fù)合物；測(cè)定藥物的量。在該試驗(yàn)中Sanglifehrins可以用作為結(jié)合競(jìng)爭(zhēng)劑，例如從親環(huán)蛋白中置換環(huán)孢菌素，因此釋放的環(huán)孢菌素可用于定量測(cè)定，例如用對(duì)環(huán)孢菌素專一的單克隆抗體進(jìn)行定量測(cè)定。
以下面的實(shí)施例進(jìn)一步敘述本發(fā)明，下述實(shí)施例僅是為了敘述，實(shí)施例中還涉及附圖，其中

圖1表明化合物Sanglifehrin B的質(zhì)譜；圖2表明化合物Sanglifehrin A的質(zhì)譜；圖3表明化合物Sanglifehrin D的質(zhì)譜；圖4表明化合物Sanglifehrin C的質(zhì)譜；圖5表明化合物Sanglifehrin B的紅外光譜；圖6表明化合物Sanglifehrin A的紅外光譜；圖7表明化合物Sanglifehrin D的紅外光譜；圖8表明化合物Sanglifehrin C的紅外光譜；圖9表明化合物Sanglifehrin A的核磁共振譜；
圖10表明化合物Sanglifehrin D的核磁共振譜；圖11表明化合物Sanglifehrin B的核磁共振譜；圖12表明化合物Sanglifehrin C的核磁共振譜。
實(shí)施例培養(yǎng)條件將鏈霉菌屬A92-308110菌株置于有合適營(yíng)養(yǎng)物和無(wú)機(jī)物的各種培養(yǎng)基中于合適的溫度下用需氧性或浸漬培養(yǎng)法進(jìn)行培養(yǎng)。發(fā)酵培養(yǎng)基通常含有可利用的碳源、氮源和包括多種微量元素的無(wú)機(jī)鹽，所有這些均可以確切的產(chǎn)品或復(fù)合混合物的形式加入，例如在各種基源生物產(chǎn)品中可以找到它們。
實(shí)施例1敘述得到式I化合物的固有條件。通過(guò)培養(yǎng)條件的最佳選定(換氣、溫度、pH、碳源和氮源的質(zhì)量和數(shù)量、無(wú)機(jī)鹽和微量元素的數(shù)量)以及通過(guò)控制生物反應(yīng)罐中的發(fā)酵條件，可以提高產(chǎn)量。實(shí)施例1 A92-308110菌株的培養(yǎng)a.起始的瓊脂培養(yǎng)物將A92-308110的斜瓊脂培養(yǎng)物置于下面的瓊脂培養(yǎng)基中生長(zhǎng)10～14天葡萄糖 10.0g可溶性淀粉 20.0g酵母萃取物(Gistex，Gist Brocades) 5.0gNZ-胺，A型(Sheffield) 5.0g碳酸鈣 1.0g瓊脂(Bacto)15.0g脫礦質(zhì)水 加至1000ml用NaOH/H2SO4將上述培養(yǎng)基調(diào)至pH6.6～6.8，然后于121℃滅菌20分鐘。
培養(yǎng)物貯存在-25℃～-70℃，在甘油一胨中的混懸物于液氮條件下貯存。
b.預(yù)培養(yǎng)將芽孢和菌絲體的10份起始培養(yǎng)物懸浮在100ml 0.9％鹽溶液中。各自含有1立升預(yù)培養(yǎng)基的二個(gè)2立升三角燒瓶各自用50ml上述混懸液接種。預(yù)培養(yǎng)基的成分如下
葡萄糖(工業(yè))7.5g甘油7.5g酵母萃取物(BBL) 1.35g麥芽萃取液(Wander) 7.50g可溶性淀粉 7.50gNZ-胺，A型(Sheffield) 2.50g大豆蛋白質(zhì) 2.50gL(-)天冬酰胺1.00gCaCO30.050gNaCl0.050gKH2PO40.250gK2HPO40.500gMgSO4·7H2O 0.100g微量元素溶液A 1ml瓊脂(Bacto) 1g脫礦物質(zhì)水 加至1000ml用NaOH/H2SO4將上述培養(yǎng)基調(diào)至pH6.8～7.2，并于121℃滅菌20分鐘。
微量元素溶液A的成分如下FeSO4·7H2O 5.0gZnSO4·7H2O 4.0gMnCl2·4H2O 2.0gCuSO4·5H2O 0.2gCoCl2·6H2O 2.0gH3BO30.1gKI 0.05gH2SO4(95％) 1ml脫礦物質(zhì)水 加至1000ml將上述預(yù)培養(yǎng)物在轉(zhuǎn)速為200rpm、偏心率為50mm的旋轉(zhuǎn)振蕩器上于27℃發(fā)酵24小時(shí)。
c.第一中間體培養(yǎng)物將各自含有50立升預(yù)培養(yǎng)基的二個(gè)75立升生物反應(yīng)器分別用1立升預(yù)培養(yǎng)物接種并于27℃發(fā)酵96小時(shí)。發(fā)酵物以150rpm轉(zhuǎn)速旋轉(zhuǎn)。以每立升培養(yǎng)基每分鐘0.5立升的速度引入空氣。
d.第二中間體培養(yǎng)物將各自含有500立升預(yù)培養(yǎng)基的二個(gè)750立升發(fā)酵容器分別用50立升第一中間體培養(yǎng)物接種。第二中間體培養(yǎng)物于27℃溫孵70小時(shí)。以100rpm轉(zhuǎn)速使發(fā)酵物旋轉(zhuǎn)并以每立升培養(yǎng)基每分鐘0.8立升的速度引入空氣。
e.主要培養(yǎng)物將各自含有3000立升主要培養(yǎng)基的二個(gè)5000立升生物反應(yīng)器分別用250立升和300立升第二中間體培養(yǎng)物接種。主要培養(yǎng)物于24℃溫孵96小時(shí)。生物反應(yīng)器以45rpm轉(zhuǎn)速旋轉(zhuǎn)，并以每立升培養(yǎng)基每分鐘0.5立升的速度引入空氣。
主要培養(yǎng)基的成分如下葡萄糖(工業(yè)) 20g麥芽萃取液(Wander)2g酵母萃取物(Bacto) 2g大豆(Bacto) 2gKH2PO40.2gK2HPO40.4gMgSO4·7H2O0.2gNaCl 0.05gCaCl2·6H2O0.05g微量元素溶液B 1ml瓊脂(Bacto) 1g脫礦物質(zhì)水加至1000ml用KOH/HCl將pH調(diào)至6.3。該培養(yǎng)基于121℃滅菌20分鐘。
微量元素溶液B的成分如下FeSO4·7H2O5.0gZnSO4·7H2O4.0gMnCl2·4H2O2.0gCuSO4·5H2O0.2g(NH4)6Mo7O240.2g
CoCl2·6H2O1.0gH3BO30.1gKI0.05gH2SO4(95％)1ml脫礦物質(zhì)水加至1000ml主要培養(yǎng)物的最佳培養(yǎng)基如下大豆粗粉 20.0g甘油 40.0gMES 0.1M脫礦物質(zhì)水加至1000ml，pH6.8。實(shí)施例2 從鏈霉菌屬A92-308110菌株中分離Sanglifehrins_A、B、C和D用活性定向分級(jí)、HPLC和薄層色譜分析，從二個(gè)3000l發(fā)酵罐中完成4個(gè)新的CBA活性代謝產(chǎn)物的初步分離和特性鑒定。上述CBA(親環(huán)因子結(jié)合試驗(yàn))可用作生物活性的試驗(yàn)。
將二份3000l發(fā)酵產(chǎn)物分開(kāi)。從每份發(fā)酵產(chǎn)物中取1500l，并與2000l乙酸乙酯一起置于4000l不銹鋼容器內(nèi)攪拌20小時(shí)。用SA-20型Westfalia-Saparator分離有機(jī)相。用80l水將乙酸乙酯萃取液洗滌2次，并在減壓下蒸發(fā)至干，得到1.64和2kg萃取物。用40l甲醇/水(9∶1)和40l己烷以三步萃取法將二份粗的萃取物進(jìn)行脫脂肪。在減壓下蒸發(fā)至干，得到1.34kg萃取物。
在10kg Sephadex H的甲醇溶液裝填的柱上分二份(每份670g)將上述脫脂肪的萃取物進(jìn)行柱層析。在將每份脫脂肪萃取物加到柱中時(shí)使每份溶于3.3l甲醇中。在收集開(kāi)始的15l洗脫液(作為級(jí)分1)之后，在收集2l洗脫液部分期間，繼續(xù)進(jìn)行層析。最具活性的級(jí)分是2、3和4，因此將其合并，得到146g。將樣品再在1kg硅膠(Merck，0.04～0.063mm)柱上進(jìn)一步進(jìn)行層析，用甲基叔丁基醚(MTBE)、MTBE/5g甲醇和MTBE/10％甲醇作為洗脫劑。收集2l級(jí)分。級(jí)分5～9是最具活性的，將其合并，得到43.8g樣品。將該樣品進(jìn)一步在1kg硅膠(Merck，0.04～0.063mm)柱上分離，用己烷/丙酮(7∶3)～丙酮進(jìn)行梯度洗脫。將該層析的部分6(7.0g)在3kg Lihroprep R P 18(Merck，40～63μm)柱上進(jìn)一步分離，用甲醇/水(94∶6)進(jìn)行洗脫，得級(jí)分4～7共2.16g，然后再在100g硅膠H柱上層析分離，用二氯甲烷和3％甲醇洗脫，得到733mg，再在3kg Lichroprep R P 18柱上層析分離，得到621mg，然后在100g Lichroprep R P 18柱上層析分離，用乙腈/水(1∶1)進(jìn)行洗脫，得到324mg純的Sanglifehrin A(m.p.142～145℃(無(wú)定形的)，(α)D25＝-67.30(c＝0.988，甲醇)。
從層析柱上用己烷/丙酮洗脫得到的級(jí)分5和7合并(7.1g)，并在3kg Lichroprep R P18(40-63μm)柱上進(jìn)行純化，用甲醇/水(9∶1)洗脫，得到769mg，在100g硅膠H的柱上層析，用MTBE/3％甲醇洗脫，得到309mg，最后在100g硅膠H柱上層析，用二氯甲烷和3％甲醇洗脫，得到90mg純化Sanglifehrin B，m.p.117～121℃(無(wú)定形的)，(α)D25＝-52.8(c＝1.128，甲醇)在3kg Lichroprep R P 18柱上層析，用甲醇/水(94∶6)洗脫得到的級(jí)分9和10(2.147g)進(jìn)一步在100g硅膠H柱上純化，用二氯甲烷/5％甲醇洗脫，得到800mg，最后在3kg Lihroprep R P 18柱上層析，用甲醇/水(9∶1)洗脫，得到480mg Sanglifehrin C，m.p.165～170℃，(α)D25＝-35.60(c＝0.736，甲醇)。
在3kg Lichroprep R P 18柱上層析，用甲醇/水(94∶6)洗脫得到的級(jí)分11和12(835mg)進(jìn)一步在100g硅膠H上純化，用MTBE/5％甲醇洗脫，得到140mg Sanglifehrin D，mp.137～142℃，無(wú)定形的。
然后用紫外、紅外、質(zhì)譜和核硫共振譜表示Spnglifehrin A、B、C和D的特征。得到的結(jié)果見(jiàn)下面表4和附圖。
表4Sanglifehrin A分子式C60H91N5O13(1090.4)UV(MeOH)275(1962)，242(54500)，197(75755)H+275(1635)，242(51884)，OH-292(1973)，242(60495)IR-譜圖6質(zhì)譜FAB 1096[MH+Li]+；圖2NMR譜圖9Sanglifehrin B分子式C60H89N5O12(1072.4)UV(MeOH)273(4395)，242(50600)，197(78577)IR-譜圖5質(zhì)譜FAB 1098[MH+Li]+；圖1NMR譜圖11Sanglifehrin C分子式C61H93N5O13(1104.4)UV(MeOH)275(1876))，242(51557)，197(72643)H+275(1391)，242(50120)OH-292(1832)，242(57960)IR-譜圖8質(zhì)譜FAB 1110[MH+Li]+；圖4NMR譜圖12Sanglifehrin D分子式C61H91N5O12(1086.4)UV(MeOH)273(3 194)，242(47584)，197(73766)H+273(3237)，242(46389)OH-285(2600)，242(52907)IR-譜圖7質(zhì)譜FAB 1092[MH+Li]+；圖3NMR譜圖10
實(shí)施例3 將Sanglifehrin A轉(zhuǎn)變成Sanglifehrin C向攪拌的，冷至0℃的20mg(18.3μmol)Sanglifehrin A的0.5ml甲醇溶液中加入對(duì)甲苯磺酸一水合物結(jié)晶。將得到的黃色溶液攪拌1小時(shí)，用飽和碳酸氫鈉水溶液終止反應(yīng)。得到的混合物用乙酸乙酯萃取二次。有機(jī)溶液用飽和鹽水洗滌，往無(wú)水硫酸鈉干燥，過(guò)濾，并于減壓下濃縮。殘余物經(jīng)硅膠柱層析純化，用甲基叔丁基醚∶甲醇(95∶5)洗脫，得到Sanglifehrin C，為白色無(wú)定形粉末。它是Sanglifehrin C及其C53差向立體異構(gòu)體的4∶1混合物，Sanglifehrin C具有下示(S)構(gòu)型(R＝Me)。
非對(duì)映異構(gòu)體的4∶1混合物
另外，上述轉(zhuǎn)變可以用其他的質(zhì)子酸(如對(duì)甲苯磺酸吡啶鎓、鹽酸或硫酸)或路易斯酸(如氯化鋅、溴化鎂或氯化鎂。四異丙醇鈦或三氟化硼)于甲醇中進(jìn)行。應(yīng)用其他的醇溶劑或共溶劑如乙醇。異丙醇、丁醇、烯丙醇、炔丙醇、芐醇、按用樣方式得到在上式結(jié)果里其中及分別乙基、異丙基、丁基、烯丙基、炔丙基、芐基的同系物。
按上述同樣的方式，可以將Sanglifehrin B轉(zhuǎn)變成Sanglifehrin D實(shí)施例4 將Sanglifehrin C轉(zhuǎn)變成Sanglifehrin A將550mg(0.5mmol)Sanglifehrin C在5ml 4∶1 THF-水中的溶液用0.5ml 2N稀硫酸處理并攪拌1.5小時(shí)。用飽和碳酸氫鈉水溶液終止反應(yīng)，得到的混合物用乙酸乙酯萃取二次。有機(jī)層先用飽和碳酸氫鈉洗滌一次，然后用飽和鹽水洗滌二次，經(jīng)無(wú)水硫酸鈉干燥，過(guò)濾，并于減壓下濃縮。殘余物經(jīng)硅膠柱層析純化，用甲基叔丁基醚∶甲醇(90∶10)洗脫，得到Sanglifehrin A，為白色無(wú)定形粉末。
其他的無(wú)機(jī)或有機(jī)酸可以用于含有水和任意一有機(jī)共溶劑的介質(zhì)。合適的酸包括鹽酸、對(duì)甲苯磺酸或其他的磺酸，對(duì)甲苯磺酸吡啶鎓、乙酸、三氟乙酸、甲酸。合適的有機(jī)共溶劑有乙腈、三甲基甲酰胺、二甲基亞砜、二噁烷。
所述反應(yīng)伴隨形成不用數(shù)量的式XV化合物，尤其是取決于反應(yīng)時(shí)間(生成式XV化合物較好的方法，見(jiàn)下面實(shí)施例5)。
同樣，可以將Sanglifehrin D轉(zhuǎn)變成Sanglifehrin B。實(shí)施例5 將Sanglifehrin A轉(zhuǎn)變成式XV化合物向攪拌的、冷至0℃的50mg(46μmmol)Sanglifehrin A在1.9ml乙腈的溶液中加入0.1ml氟化氫-吡啶。得到的黃色溶液攪拌1小時(shí)，并用飽和碳酸氫鈉水溶液終止反應(yīng)。得到的混合物用乙酸乙酯萃取二次。有機(jī)層用飽和鹽水洗滌二次，經(jīng)無(wú)水硫酸鈉干燥，過(guò)濾并減壓濃縮。殘余物經(jīng)硅膠柱層析純化，用95∶5甲基叔丁基醚∶甲醇洗脫，得到式XV化合物，為白色無(wú)定形粉末。
按類似方法，可以將Sanglifehrin B轉(zhuǎn)變成式XVI化合物。所述物質(zhì)的C53位單一的差向立體異構(gòu)體形式存在，但是絕對(duì)構(gòu)型當(dāng)末明確的確定。
式XVMS m/z 1078[M+Li]+(相對(duì)強(qiáng)度100)；1H NMR(DMSO)(僅列出具有特征的信號(hào))δ0.40(3H，d，H-50)，1.20(3H，s，H-54)，1.69(3H，s，H-49)，4.20(1H，t，H-15)，4.58(1H，dd，H-17)，5.19(1H，dd，H-18)，5.28(1H，dd，H-23)，5.62(1H，m，H-21)，5.67(1H，m，H-27)，5.99(1H，d，H-25)，6.03(1H，dd，H-19)，6.14(1H，dd，H-20)，6.22(1H，dd，H-26).實(shí)施例6 將式XV化合物轉(zhuǎn)變成Sanglifehrin A向攪拌的54mg(μmol)式XV化合物在0.5ml 4∶1 THF-水的溶液中加入50μl 2N稀硫酸。得到的溶液于室溫下攪拌12小時(shí)，用飽和碳酸氫鈉水溶液終止反應(yīng)。混合物用乙酸乙酯萃取2次。合并的有機(jī)層依次用飽和碳酸氫鈉水溶液和鹽水洗滌，經(jīng)無(wú)水硫酸鈉干燥，過(guò)濾并于減壓下濃縮。殘余物經(jīng)硅膠柱層析，用90∶10甲基叔丁基醚∶甲醇洗脫，得到Sanglifehrin A，為白色無(wú)定形固體。
同樣，可以將式XVI化合物轉(zhuǎn)變成Sanglifehrin B。
實(shí)施例3～6所述方法可以用作為有選擇的分子內(nèi)保護(hù)-脫保護(hù)程序。因此，按實(shí)施例5所述反應(yīng)，15位羥基可以有選擇地受保護(hù)，這樣使得其余游離的羥基可以有選擇的處理。實(shí)施例5中的方法考慮到15和17位二個(gè)羥基的選擇性保護(hù)。二個(gè)方法還可以用作為C53酮的分子內(nèi)保護(hù)。按實(shí)施例4和6所述反應(yīng)，還可以使羥基和酮重生。因此Sanglifehrins C和D以及式XV和式XVI化合物是制備其他Sanglifehrin類化合物重要的中間體。實(shí)施例7 制備16-脫氫-17-脫羥基-Sanglifehrin A(式XVII)
將54mg(50μmol)式XV化合物和對(duì)甲苯磺酸一水合物晶體在1ml 4∶1乙腈-水中的溶液加熱至80℃并保持1.5小時(shí)。加入飽和的碳酸氫鈉水溶液使反應(yīng)終止。得到的混合物用乙酸乙酯萃取2次。有機(jī)層用飽和的碳酸氫鈉水溶液和鹽水洗滌，經(jīng)無(wú)水硫酸鈉干燥，過(guò)濾并濃縮。殘余物經(jīng)硅膠柱層析純化(以90∶10甲基-叔丁基醚∶甲醇洗脫)，隨后經(jīng)反相層析(RP18，以50∶50乙腈-水～乙腈洗脫45分鐘)純化，得到純的標(biāo)題化合物，為白色無(wú)定形的固體。MS m/z 1078[M+Li]+(相對(duì)強(qiáng)度100)；1H NMR(DMSO)(僅列出特征信號(hào))δ1.58(3H，s，H-50)，1.71(3H，s，H-49)，2.08(3H，s，H-54)，4.03(2H，d，H-15和C31-OH)，5.57(2H，m，H-21(和C35-OH)，5.72(1H，dt，H-27)，5.96(1H，d，C15-OH)，6.03(1H，d，H-25)，6.09-6.28(4H，m，H-18，H-19，H-20和H-26)，6.37(1H，d，H-17).實(shí)施例8 制備42-N-甲基-Sanglifehrin A(式XVIII)
向攪拌并冷卻(-15℃)的109mg(0.1mmol)Sanglifehrin A和67μl(0.3mmol)2，6-二叔丁基吡啶在1ml二氯甲烷的溶液中加入16.5μl甲基三氟甲磺酸酯。將混合物溫至室溫并連續(xù)攪拌6小時(shí)，然后加入飽和的碳酸氫鈉水溶液使反應(yīng)終止。得到的混合物用乙酸乙酯萃取2次。有機(jī)層用鹽水洗滌，經(jīng)無(wú)水硫酸鈉干燥，過(guò)濾并濃縮。殘余物經(jīng)硅膠2次連續(xù)層析純化(以90∶10甲基-叔丁基醚∶甲醇，然后95∶5甲基-叔丁基醚∶甲醇洗脫)，得到純的標(biāo)題化合物，為白色無(wú)定形的固體。MS m/z 1110[M+Li]+(相對(duì)強(qiáng)度100)；1H NMR(DMSO)(僅列出特征信號(hào))δ1.70(3H，s，H-49)，2.06(3H，s，H-54)，3.53(3H，s，42 N-Me)，3.98(1H，d，C31-OH)，4.50(1H，d，H-65)，4.77(1H，d，C17-OH)，5.43(1H，d，C15-OH)，5.49(1H，d，C35-OH)，7.50(1H，d，H-12)，8.11(1H，d，H-9)，9.22(1H，s，C61-OH).實(shí)施例9 制備53二氫Sanglifehrin A(式XIX)
向攪拌并冷卻(0℃)的54mg(50μmol)Sanglifehrin A在0.5ml甲醇的溶液中加入2.8mg(75μmol)硼氫化鈉。連續(xù)攪拌1小時(shí)，并加入飽和的碳酸氫鈉水溶液?；旌衔镉靡宜嵋阴ポ腿?次。有機(jī)溶液用鹽水洗滌，經(jīng)無(wú)水硫酸鈉干燥，過(guò)濾并濃縮。殘余物經(jīng)硅膠層析純化(先用95∶5甲基-叔丁基醚∶甲醇，然后用90∶10甲基-叔丁基醚∶甲醇洗脫)，得到純的標(biāo)題化合物，為白色無(wú)定形的固體。分離出的產(chǎn)物相當(dāng)于約1∶1 C-53非對(duì)映體的混合物MS m/z 1098[M+Li]+(相對(duì)強(qiáng)度63)，1104[M+2Li-H]+(相對(duì)強(qiáng)度100)；1HNMR(DMSO)(僅列出特征信號(hào))δ0.62(3H，d，H-50)，1.02(3H，d，H-54)，3.55和3.59(1H，2m，H-53).實(shí)施例10 制備53-甲苯磺?；?Sanglifehrin A(式XX)
將55mg(50μmol)Sanglifehrin A和23mg(125μmol)甲苯磺酰基肼在0.5ml二氯甲烷中的混合物在室溫下攪拌6小時(shí)。除去溶劑，殘余物經(jīng)硅膠層析純化(以90∶10甲基-叔丁基醚∶甲醇洗脫)，得到標(biāo)題化合物，為白色無(wú)定形的粉末。MS m/z 1264[M+Li]+(相對(duì)強(qiáng)度100)；1H NMR(DMSO)(僅列出特征信號(hào))δ1.70(3H，s，H-49)，1.77(3H，s，H-54)，2.37(3H，s，-NSO2C6H4CH3)，6.51(1H，s，H-60)，6.59(2H，2d，H-62 and H-64)，7.06(1H，dd，H-63)，7.35(2H，d，甲苯磺?；g位質(zhì)子)，7.73(2H，d，甲苯磺酰基對(duì)位質(zhì)子)。實(shí)施例11 制備26S，27S-二羥基-Sanglifehrin A(式XXI)和26R，27R-二羥基-Sanglifehrin A(式XXII)
向攪拌并冷卻(0℃)的495mg(1.5mmol)鐵氰化鉀、207mg(1.5mmol)碳酸鉀、19.5mg(0.025mmol)(DHQ)2PHAL、65μl(0.005mmol)0.08M四氧化鋨在叔丁醇中的溶液和95mg(1mmol)甲基氨磺酰在2.5ml丁醇和5ml水的溶液中加入545mg(0.5mmol)Sanglifehrin A的2.5ml叔丁醇溶液。將得到的兩相混合物溫至室溫并攪拌3小時(shí)。然后加入1.08g(8.6mmol)亞硫酸鈉，隨后加入乙酸乙酯和水，混合物劇烈攪拌15分鐘。分離兩層，水層用乙酸乙酯萃取2次。合并的有機(jī)層用飽和的碳酸氫鈉水溶液和鹽水洗滌，經(jīng)無(wú)水硫酸鈉干燥，過(guò)濾并濃縮。殘余物經(jīng)反相層析純化(RP18，以30∶70乙腈-水～乙腈洗脫60分鐘)，得到26S，27S-二醇，為無(wú)定形的粉末。
用上述方法，但用(DHQD)2PHAL代替(DHQ)2PHAL，制得相應(yīng)的26R，27R-二醇。
26S，27S-二醇；MS m/z 1130[M+Li]+(相對(duì)強(qiáng)度100)；1H NMR(DMSO)(僅列出特征信號(hào))δ1.64(3H，s，H-49)，2.06(3H，s，H-54)，3.20(1H，寬的m，H-27)，3.45(1H，寬的m，H-31)，3.94(3H，m，H-17，H-26和C31-OH)，4.30(1H，d，C27-OH)，4.57(1H，d，C26-OH)，5.20(1H，t，H-23)，5.33(1H，d，H-25)，5.57(3H，m，H-18，H-21和C35-OH)，6.03(1H，dd，H-19)，6.14(1H，dd，H-20).26R，27R-二醇MS m/z 1130[M+Li]+(相對(duì)強(qiáng)度100)；1H NMR(DMSO)(僅列出特征信號(hào))δ1.64(3H，s，H-49)，2.06(3H，s，H-54)，3.16(1H，寬的m，H-27)，3.48(1H，寬的m，H-31)，3.94(3H，m，H-17，H-26和C31-OH)，4.30(1H，d，C27-OH)，4.57(1H，d，C26-OH)，5.20(1H，dd，H-23)，5.35(1H，d，H-25)，5.57(3H，m，H-18，H-21和C35-OH)，6.03(1H，dd，H-19)，6.14(1H，dd，H-20).實(shí)施例12 26S，27S-二羥基-Sanglifehrin A中二醇的裂解向90mg(79μmol)26S，27S二醇在0.9ml 2∶1 THF-水的溶液中加入33.7mg(157μmol)高碘酸鈉。連續(xù)攪拌1小時(shí)，并加入飽和的碳酸氫鈉水溶液?；旌衔镉靡宜嵋阴ポ腿?次。有機(jī)溶液用鹽水洗滌，經(jīng)無(wú)水硫酸鈉干燥，過(guò)濾并濃縮。殘余物經(jīng)硅膠純化(95∶5甲基-叔丁基醚∶甲醇)，得到式XXIII化合物(泡沫狀)和式(XXIV)化合物(粉末狀)。
式XXIIIMS m/z 366[M+H-H2O]+(相對(duì)強(qiáng)度100)；1H NMR(DMSO)(在異頭中心處OHax∶Oheq差向立體異構(gòu)體的2∶1混合物)δ3.54和4.08(1H，2m，H-31)，3.57(1H，寬的m，H-35)，3.66(1H，m，H-33)，4.38(0.67H，ddd，H-27ax)，4.95(0.33H，寬的m，H-27eq)，5.40(0.33H，d，C27-OHeq)，5.59(0.33H，d，C35-OH)，5.61(0.67H，d，C35-OH)，5.96(0.67H，d，C27-OHax)，7.89(0.67H，s，NH-42)，7.91(0.33H，s，NH-42).式XXIVMS m/z 745[M+Li]+；1H NMR(DMSO)(僅列出特征信號(hào)δ0.64(3H，d，H-50)，0.81(6H，d，H-56和H-57)，2.06(3H，s，H-54)，2.17(4H，s，H-14 and H-49)，3.80(1H，寬的m，H-15)，3.94(1H，dd，H-17)，5.33(1H，寬的d，H-23)，5.62(2H，m，H-18和H-21)，6.89(1H，d，H-25)，6.10(1H，dd，H-19)，6.18(1H，dd，H-20)，10.0(1H，d，H-26).實(shí)施例13 Sanglifehrin A乙酰化得到61-O-乙?；?Sanglifehrin A(式XXV)
向攪拌并冷卻(0℃)的54mg(50μmol)Sanglifehrin A和50μl吡啶在0.5ml二氯甲烷的溶液中加入5.2μl(55μmol)乙酐。反應(yīng)液于0℃保持1小時(shí)，然后將其溫至室溫，并連續(xù)攪拌12小時(shí)。加入飽和的碳酸氫鈉水溶液，得到的混合物用乙酸乙酯萃取。有機(jī)層經(jīng)無(wú)水硫酸鈉干燥，過(guò)濾并濃縮。殘余物經(jīng)反相層析純化(RP18，以40∶60乙腈-水～乙腈洗脫45分鐘)，得到標(biāo)題化合物，為無(wú)定形粉末。MS m/z 1132[M+H]+(相對(duì)強(qiáng)度100)；1H NMR(DMSO)(僅列出具有特征的信號(hào))δ1.68(3H，s，H-49)，2.06(3H，s，H-54)，2.25(3H，s，CH3CO2)，4.04(1H，d，C31-OH)，4.67(1H，d，C2-NH)，4.76(1H，d，C17-OH)，5.42(2H，m，H-8和C15-OH)，5.57(3H，m，H-18，H-21和C35-OH)，6.85(1H，s，H-60)，6.98(1H，d，H-62)，7.06(1H，d，H-64)，7.31(1H，dd，H-63)，7.51(1H，d，H-12)，7.89(1H，s，H-42)，8.23(1H，d，H-9).
權(quán)利要求
1.大環(huán)內(nèi)酯，其中i)大環(huán)的2～6位為哌噠嗪羧酸殘基；和/或ii)大環(huán)的7～9位為芳香族α-氨基酸殘基；和/或iii)大環(huán)的10～12位為脂肪族α-氨基酸殘基，所述大環(huán)內(nèi)酯為游離的或受保護(hù)的形式，或?yàn)槠潲}。
2.權(quán)利要求1所述的大環(huán)內(nèi)酯，它含有上述特征結(jié)構(gòu)i)、ii)和iii)中2項(xiàng)，或尤其是全部3項(xiàng)。
3.權(quán)利要求1或2所述的大環(huán)內(nèi)酯，其中大環(huán)的其余部分含有6～20個(gè)碳原子，尤其是11個(gè)碳原子鏈長(zhǎng)的羥基羧酸殘基。
4.權(quán)利要求3所述的大環(huán)內(nèi)酯，其中所述羥基羧酸殘基為式II殘基，
其中R1和R2均為氫，或代表一額外的鍵；R3為氫；R4為-CO-CH3或-CH(OH)-CH3，或R3和R4一起代表式III結(jié)構(gòu)，
所述大環(huán)內(nèi)酯為游離的或受保護(hù)的形式，或?yàn)槠潲}。
5.權(quán)利要求1～5中任何一項(xiàng)所述的大環(huán)內(nèi)酯，它包括式IV大環(huán)，
其中X、Y和Z為權(quán)利要求1中所述的殘基i)、ii)和iii)，A為權(quán)利要求3或4中所述的羥基羧酸殘基，所述大環(huán)內(nèi)酯為游離的或受保護(hù)的形式，或?yàn)槠潲}。
6.權(quán)利要求5所述的大環(huán)內(nèi)酯，它包括式V大環(huán)
其中A同權(quán)利要求5所述，所述大環(huán)內(nèi)酯為游離的或受保護(hù)的形式，或?yàn)槠潲}。
7.上述權(quán)利要求中任何一項(xiàng)所述大環(huán)內(nèi)酯，在鄰近內(nèi)酯橋氧部分的碳原子被2-氧雜-2′-氮雜-3′-氧代-螺雙環(huán)己烷-3-基殘基取代。
8.權(quán)利要求7所述大環(huán)內(nèi)酯，其中螺雙環(huán)己烷基殘基為式VI基團(tuán)，
其中-a-b-為-(Me)C＝CH-或-(Me)CH-CH(OH)-，R5為氫或甲基，所述大環(huán)內(nèi)酯為游離的或受保護(hù)的形式，或?yàn)槠潲}，其通過(guò)螺環(huán)殘基與大環(huán)內(nèi)酯之間含有6～11，通常為9個(gè)碳原子鏈長(zhǎng)的連接基團(tuán)與大環(huán)內(nèi)酯相連。
9.權(quán)利要求8所述大環(huán)內(nèi)酯，其中在螺環(huán)殘基與大環(huán)內(nèi)酯之間的連接基團(tuán)為式VII基團(tuán)，
其中c代表與螺環(huán)殘基連接，d代表與大環(huán)連接，R6和R7各自為羥基，或者R6和R7一起代表另外的鍵；所述大環(huán)內(nèi)酯為游離的或受保護(hù)的形式。
10.式VIII化合物，S-L-M VIII其中S代表2-氧雜-2′-氮雜-3′-氧代-螺雙環(huán)己烷-3-基殘基，L代表含有6～11，通常為9個(gè)碳原子鏈長(zhǎng)的連接基團(tuán)，M代表權(quán)利要求1～6中任何一項(xiàng)所述的大環(huán)內(nèi)酯，所述化合物為游離的或受保護(hù)的形式，或?yàn)槠潲}。
11.權(quán)利要求10所述化合物，其具有式IX結(jié)構(gòu)，
其中-a-b-的定義同上；-e-f-為-CH(OH)-CH(OH)-或-CH＝CH-；-g-h-的定義同-a-b-；和R3、R4和R5的定義同上，所述化合物為游離的或受保護(hù)的形式，或?yàn)槠潲}。
12.權(quán)利要求11所述化合物，其具有下示構(gòu)型，
其中當(dāng)-a-b-為-(Me)CH-CH(OH)-時(shí)，它最好具有下面構(gòu)型，
當(dāng)-e-f-為-CH(OH)-CH(OH)-時(shí)，它最好具有(S)，(S)構(gòu)型或(R)，(R)構(gòu)型；當(dāng)-g-h-為-(Me)CH-CH(OH)-時(shí)，它最好具有下面構(gòu)型，
當(dāng)-g-h-為-(Me)C＝CH-時(shí)，它最好具有下面構(gòu)型，
當(dāng)R3和R4稠合在一起時(shí)，它們最好具有下面構(gòu)型，
13.選自Sanglifehrin A、B、C和D的Sanglifehrin。
14.權(quán)利要求4～9中任何一項(xiàng)所述大環(huán)內(nèi)酯或權(quán)利要求10～12中任何一項(xiàng)所述化合物，其中大環(huán)的14～17位含有式X殘基，
例如，其構(gòu)型為
15.式XI化合物，R6O-X-Y-Z-A-OH XI例如式XII
例如式IX′化合物
其中X、Y、Z、A、R3、R4和R5定義同上，R6為氫或C1-4烷基，例如甲基，所述化合物是游離的或受保護(hù)的形式，或?yàn)槠潲}。
16.權(quán)利要求1-9中任何一項(xiàng)所述的大環(huán)內(nèi)酯，其為開(kāi)環(huán)形式，所述開(kāi)環(huán)大環(huán)是游離的或受保護(hù)的形式，或?yàn)槠潲}。
17.化合物R6O-X-Y-Z-A-OH，其中X、Y、Z和A定義同權(quán)利要求5，R6為氫或C1-4烷基，所述化合物為游離的或受保護(hù)的形式，或?yàn)槠潲}。
18.化合物R6O-X-Y-Z-A′-CH(OH)-L-S，其中-A′-CH(OH)-為權(quán)利要求3定義的羥基羧酸殘基，其他的符號(hào)同權(quán)利要求17，所述化合物為游離的或受保護(hù)的形式，或?yàn)槠潲}。
19.式XII′化合物，
所述化合物為游離的或受保護(hù)的形式，或?yàn)槠潲}。
20.式IX″化合物，
所述化合物為游離的或受保護(hù)的形式，或?yàn)槠潲}。
21.其中2-氧雜-2′-氮雜-3′-氧代-3′-基-螺雙環(huán)己烷環(huán)系為開(kāi)環(huán)形式的化合物，例如式XII化合物，
其中a、b、L和M的定義同上，所述化合物為游離的或受保護(hù)的形式，或?yàn)槠潲}。
22.2-氧雜-2′-氮雜-3′-氧代-3′基-螺雙環(huán)己烷化合物，其為游離的或受保護(hù)的形式，或?yàn)槠潲}；尤其是式VI′化合物，
其中R7為氫或任意受保護(hù)的羥基，活性功能基團(tuán)或-CH2-CH(OH)-CH(CH3)-CH2-CH2-CHO基團(tuán)或相應(yīng)的δ-鄰位羥基內(nèi)醚，所述化合物為游離的或受保護(hù)的形式，或?yàn)槠潲}。
23.開(kāi)環(huán)的2-氧雜-2′-氮雜-3′-氧代-3′基-螺雙環(huán)己烷，它可以為游離的或受保護(hù)的形式，或?yàn)槠潲}，尤其是式XII′化合物，
其中a、b和R7定義同上，所述化合物為游離的或受保護(hù)的形式，或?yàn)槠潲}。
24.式XIII大環(huán)內(nèi)酯，
其中M為以上所述大環(huán)內(nèi)酯，尤其是式XIV大環(huán)內(nèi)酯，
所述大環(huán)內(nèi)酯為游離的或受保護(hù)的形式，或?yàn)槠潲}，
25.制備上述任一本發(fā)明化合物的方法，該方法包括i)為了制備Sanglifehrins A、B、C或D中任何一個(gè)，在培養(yǎng)基中培養(yǎng)能產(chǎn)生Sanglifehrin A、B、C或D的放線菌菌株，從得到的肉湯培養(yǎng)物中分離所需要的Sanglifehrin A、B、C或D；ii)為了制備Sanglifehrins C和D，使Sanglifehrins A和B在15和16位環(huán)合；iii)為了制備Sanglifehrins A和B，使Sanglifehrins C和D在15和16位的鄰位羥基內(nèi)醚環(huán)開(kāi)環(huán)；iv)為了制備其中-g-h-為-C(CH3)＝CH-的式IX或IX′大環(huán)內(nèi)酯，使其中-g-h-為-CH(CH3)-CH(OH)-或其受保護(hù)的形式的式IX或IX′化合物脫水；v)為了制備其中R4為-CH(OH)-CH3的式IX或IX′大環(huán)內(nèi)酯，將其中R4為-C(O)-CH3的式IX或IX′化合物進(jìn)行氫化；vi)為了制備其中大環(huán)內(nèi)酯環(huán)的14～16位含有式X殘基的式IX或IX′大環(huán)內(nèi)酯，使式IX或IX′化合物進(jìn)行內(nèi)部保護(hù)，
vii)為了制備式IX或IX′大環(huán)內(nèi)酯，使其中大環(huán)內(nèi)酯環(huán)的14～16位含有式X殘基的式IX或IX′化合物進(jìn)行脫去內(nèi)部保護(hù)，
viii)為了制備其中R5為甲基的式IX或IX′大環(huán)內(nèi)酯，使其中R5為氫的式IX或IX′大環(huán)內(nèi)酯進(jìn)行甲基化；ix)為了制備其中R4為O-受保護(hù)形式的式IX或IX′大環(huán)內(nèi)酯，使其中R5為O-未受保護(hù)的式IX或IX′大環(huán)內(nèi)酯進(jìn)行O-保護(hù)；x)為了制備其中R4為O-未受保護(hù)形式的式IX或IX′大環(huán)內(nèi)酯，使其中R5為O-受保護(hù)形式的式IX或IX′大環(huán)內(nèi)酯進(jìn)行O-脫保護(hù)；xi)為了制備其中在大環(huán)的7～10位上含有O-受保護(hù)的羥基苯基丙氨酸殘基的式IX或IX′大環(huán)內(nèi)酯，使其中在大環(huán)的7～10位含有O-未受保護(hù)的羥基苯基丙氨酸殘基的式IX或IX′大環(huán)內(nèi)酯進(jìn)行O-保護(hù)；xii)為了制備其中在大環(huán)的7～10位含有O-未受保護(hù)的羥基苯基丙氨酸殘基的式IX或IX′大環(huán)內(nèi)酯，使其中在大環(huán)的7～10位含有O-受保護(hù)的羥基苯基丙氨酸殘基的式IX或IX′大環(huán)內(nèi)酯進(jìn)行O-脫保護(hù)；xiii)為了制備其中-e-f-為-CH(OH)-CH(OH)-的式IX或IX′大環(huán)內(nèi)酯，使其中-e-f-為-CH＝CH-的式IX或IX′大環(huán)內(nèi)酯進(jìn)行氧化水解；xiv)為了制備式V′化合物或式XII化合物，使式IX或IX′化合物的螺雙環(huán)基團(tuán)與大環(huán)之間的連接基團(tuán)進(jìn)行裂解；xv)為了制備式R6O-X-Y-Z-A-OH或式R6O-X-Y-Z-A′-CH(OH)-L-S化合物，使式IV大環(huán)或式VIII大環(huán)進(jìn)行開(kāi)環(huán)；xvi)為了制備閑環(huán)形式的式IX或XII大環(huán)內(nèi)酯，使式R6O-X-Y-Z-A-OH或式R6O-X-Y-Z-A′-CH(OH)-L-S化合物進(jìn)行大環(huán)的閉合；xvii)為了制備式？？？？化合物，使式？？？？化合物在螺雙環(huán)系統(tǒng)內(nèi)進(jìn)行開(kāi)環(huán)；xix)為了制備式？？？？化合物，使式？？？？化合物在螺雙環(huán)系統(tǒng)內(nèi)進(jìn)行閉環(huán)。
26.產(chǎn)生大環(huán)內(nèi)酯的放線菌菌株，這里該大環(huán)內(nèi)酯是其中i)該大環(huán)的2～6位為哌噠嗪基羧酸殘基；和/或ii)該大環(huán)的7～9位為芳香族α-氨基酸殘基；和/或iii)該大環(huán)的10～12位為脂肪族α-氨基酸殘基，
27.能夠產(chǎn)生本發(fā)明大環(huán)內(nèi)酯的生物學(xué)純的分離菌株鏈霉菌菌株A92-308110(DSM 9954)或其突變株、其重組或改性形式。
28.制備本發(fā)明大環(huán)內(nèi)酯的方法，該方法包括在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)鏈霉菌菌株A92-308110(DSM 9954)或其突變株、其重組或改性的形式，并且任選地回收Sanglifehrin。
29.給需要所述治療的對(duì)象進(jìn)行免疫抑制的方法，該方法包括給該對(duì)象施用有效劑量的本發(fā)明化合物。
30.在需要所述治療的對(duì)象中i)防止急性和/或慢性器官同種異體移植或異種異體移植排異反應(yīng)，例如治療上述任一具體類型器官移植接受者；ii)防止移植物抗宿主疾病，例如在骨髓移植接受者中的該疾?。籭ii)治療自身免疫疾病或任一上述疾病或疾患；iv)治療哮喘的方法，該方法包括給所述對(duì)象施用有效劑量的本發(fā)明化合物。
31.用作為藥物的本發(fā)明化合物，例如用作為免疫抑制劑或用于治療上面B所述任一疾病或疾患。
32.含有本發(fā)明化合物以及藥學(xué)上適用稀釋劑或載體的藥用組合物。
33.本發(fā)明化合物在制備作為免疫抑制劑或用于治療上面B所述任一疾病或疾患的藥物中的應(yīng)用。
34.權(quán)利要求1～6、8～10、15或16中任何一項(xiàng)所述化合物在環(huán)孢菌素或其他結(jié)合親環(huán)蛋白的化合物的置換免疫試驗(yàn)中作為試劑應(yīng)用。
全文摘要
一類新的大環(huán)內(nèi)酯類化合物,其中i)大環(huán)2～6位為哌噠嗪基羧酸殘基;和/或ii)大環(huán)7～9位為芳香族α－氨基酸殘基;和/或iii)大環(huán)10～12位為脂肪族α－氨基酸殘基,該大環(huán)內(nèi)酯類化合物含有i)、ii)和iii)中2項(xiàng),尤其含有所有3項(xiàng)特征結(jié)構(gòu),更好的是式Ⅸ化合物,它具有免疫抑制作用和抗感染作用,并且它可以是受保護(hù)的和開(kāi)環(huán)的形式。
文檔編號(hào)A61K38/00GK1193979SQ96196487
公開(kāi)日1998年9月23日 申請(qǐng)日期1996年7月4日 優(yōu)先權(quán)日1995年7月4日
發(fā)明者T·費(fèi)爾, L·奧貝雷爾, V·奎斯尼奧克斯－賴費(fèi)爾, J·J·桑利爾, W·舒勒爾, R·瑟拉尼 申請(qǐng)人:諾瓦蒂斯有限公司