專利名稱:艱難梭菌毒素作為粘膜佐劑的制作方法
背景技術(shù):
本發(fā)明涉及粘膜佐劑艱難梭菌是一種產(chǎn)芽孢、產(chǎn)毒素的革蘭氏陽性細(xì)菌、可導(dǎo)致與抗生素相關(guān)的腹瀉,能進(jìn)一步發(fā)展成嚴(yán)重的和有時為致命的結(jié)腸炎。通過例如抗菌或抗腫瘤治療一旦破壞正常腸內(nèi)菌群,艱難梭菌在結(jié)腸中定居并產(chǎn)生兩種高分子量毒素,毒素A和毒素B。這兩種多肽都是細(xì)胞毒素,但毒素B比毒素A強效1000倍。毒素A也是一種腸毒素,可導(dǎo)致已結(jié)扎的動物腸絆內(nèi)的體液積累。發(fā)明概況我們已證明,當(dāng)鼻內(nèi)施用一種抗原時〔例如,幽門螺桿菌脲酶,卵白蛋白(OVA),或鑰孔血藍(lán)蛋白(KLH)〕,艱難梭菌可以有效誘導(dǎo)對抗原的粘膜免疫應(yīng)答。例如通過鼻內(nèi)脲酶和一種艱難梭菌而誘導(dǎo)的對幽門螺桿菌的免疫應(yīng)答是保護(hù)性的,防止螺桿菌感染。我們也證明,用一種艱難梭菌毒素A的非毒性衍生物與抗原進(jìn)行鼻內(nèi)給藥,此毒素A包含構(gòu)成碳水化合物連接區(qū)域的羧基末端重復(fù),所產(chǎn)生一種粘膜免疫應(yīng)答。此外,我們已證明直腸和陰道的免疫途徑均為有效。因此,艱難梭菌毒素及其片段是有效的粘膜佐劑,可用于接種方法中。
因此,本發(fā)明以在哺乳動物中誘導(dǎo)對抗原的免疫應(yīng)答(例如,一種粘膜免疫應(yīng)答)的方法為特征。在此方法中,對哺乳動物施用抗原和來源于梭菌屬細(xì)菌的具有佐劑活性(例如艱難梭菌,諾氏梭菌,索氏梭菌,產(chǎn)氣莢膜梭菌,破傷風(fēng)梭菌和肉毒梭菌)的毒素(例如艱難梭菌毒素A或B),或其片段或衍生物〔例如,含部分或全部重復(fù)的一段羧基末端片段,此重復(fù)構(gòu)成毒素A碳水化合物的結(jié)合區(qū)(ARll;見下面)〕。這些毒素可單抗與抗原施用或結(jié)合施用(例如抗原+毒素A+毒素B)。本發(fā)明方法可用來防止或減少未來感染的機會(例如誘導(dǎo)一種保護(hù)性免疫應(yīng)答)和/或治療已進(jìn)行的感染(例如誘導(dǎo)一種治療性的免疫應(yīng)答)。
此處使用的一種“佐劑”,是一種與抗原一起進(jìn)行施用時能增加對抗原的免疫應(yīng)答的物質(zhì)。此處所用的一種“毒素”,是一種毒性的或有毒的物質(zhì)(例如細(xì)胞毒素),在特定微生物和高等動植物的代謝和生長時期,以細(xì)胞或組織的組成部分(內(nèi)毒素),或細(xì)胞外產(chǎn)物(外毒素)或結(jié)合形式形成或修飾。
本發(fā)明所用的毒素可從細(xì)菌培養(yǎng)物(例如艱難梭菌培養(yǎng)物,見例如Lyerly等,F(xiàn)EMS Microbio.Lett. 3331-35,1986)中純化,或用標(biāo)準(zhǔn)重組或化學(xué)合成方法生產(chǎn)制得。如果用重組DNA技術(shù)生產(chǎn)多肽,例如在異源的細(xì)菌、酵母或哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)編碼多肽的核酸,多肽描述為“重組體”。編碼多肽的核酸包含在一個載體中,或整合到表達(dá)它的細(xì)胞染色體中(例如,Ausubel等,編,分子生物學(xué)現(xiàn)行方法,JohnWiley&Sons,Inc.,1994)。如果在體外用化學(xué)方法例如標(biāo)準(zhǔn)固相肽合成法生產(chǎn)蛋白質(zhì),蛋白質(zhì)描述為“化學(xué)合成物”。用例如重組、合成或蛋白水解方法生產(chǎn)毒素片段。對于肽毒素,片段長度通常為至少20個氨基酸。特別有用的片段可能包含全部或部分羧基末端重復(fù),此重復(fù)構(gòu)成毒素A的碳水化合物的結(jié)合區(qū)。除保留佐劑活性外,本發(fā)明包括的毒素衍生物可能包含野生型毒素序列的突變,插入和/或缺失。
本領(lǐng)域技術(shù)人員容易理解,在生產(chǎn)用于本發(fā)明方法和組合物的毒素片段或衍生物時,保持佐劑活性的要求不如保持生物活性的要求嚴(yán)格。事實上,在生產(chǎn)本發(fā)明毒素片段或衍生物中,不需要保持毒素的生物活性(例如毒性)。
本發(fā)明所用毒素也能以融合蛋白的形式產(chǎn)生。融合蛋白是一種多肽,含相應(yīng)兩種或多種蛋白(或相應(yīng)片段)的氨基酸序列,這些通常獨立的蛋白通過肽鍵相連。融合蛋白通常由雜合基因表達(dá)而合成,雜合基因包含編碼構(gòu)成融合蛋白的每個單獨多肽的核苷酸。本發(fā)明包括的一個融合蛋白實例是含與抗原,例如幽門螺桿菌脲酶融合的梭菌(例如艱難梭菌)毒素(例如艱難梭菌毒素A或B;或有佐劑活性的片段或衍生物)的蛋白。本發(fā)明包括的另一種融合蛋白類型包含與一個利于融合蛋白純化的多肽〔例如谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)〕融合的艱難梭菌毒素。本發(fā)明所用毒素也可以使用標(biāo)準(zhǔn)方法與抗原共價偶聯(lián)或化學(xué)交聯(lián)。
本發(fā)明也可以利用梭菌屬類毒素作為佐劑。這種類毒素是經(jīng)過處理的毒素(或毒素混合物,例如艱難梭菌毒素A和毒素B),以便破壞或降低毒素的毒性特征,但保留抗原性??赏ㄟ^標(biāo)準(zhǔn)方法生產(chǎn)本發(fā)明包括的類毒素,包括,但不限于,化學(xué)處理(例如甲醛或戊二醛),蛋白酶分解和重組方法〔例如,生產(chǎn)毒素的片段或突變(例如點突變)〕。
保護(hù)性和/或治療性免疫應(yīng)答所需的任何抗原可與本發(fā)明佐劑進(jìn)行施用。所獲得抗原(可能是,例如亞基抗原,死亡的整個細(xì)胞,或細(xì)胞溶解產(chǎn)物)的微生物實例包括,但不限于,螺桿菌(例如幽門螺桿菌,貓螺桿菌,H.heilmanii),彎曲桿菌(例如空腸彎曲桿菌),梭菌(艱難梭菌),白喉棒桿菌,百日咳桿菌,流感病毒,副流感病毒,呼吸道合胞體病毒,布氏疏螺旋體,瘧原蟲,單純性皰疹病毒,人類免疫缺陷型病毒,乳頭狀病毒,霍亂病毒,大腸桿菌,麻疹病毒,風(fēng)疹病毒,水痘-帶狀皰疹病毒,流行性腮腺炎,輪狀病毒,志賀氏桿菌屬,傷寒桿菌,淋病奈瑟氏菌,耶爾森氏菌,梅毒螺旋體,肝炎病毒和衣原體。此外,抗非微生物病原體的疫苗可與本發(fā)明佐劑同時施用,例如包含殺傷的腫瘤細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞特異的或豐富的抗原。
本發(fā)明佐劑(與抗原一起)通過標(biāo)準(zhǔn)方法施用給病人。例如,給藥到病人粘膜表面(例如鼻內(nèi),口,眼,胃,直腸,陰道,腸和尿道)。本發(fā)明組合物也可經(jīng)非腸道途徑施用(例如靜脈內(nèi)的,皮下的,腹膜內(nèi)或肌內(nèi))。用本發(fā)明方法治療的病人包括,但不限于哺乳動物如人、奶牛、馬、豬、狗、貓、綿羊和山羊。
本發(fā)明也以一種組合物為特征,包含抗原和梭菌屬的一種毒素(或多種毒素)(例如艱難梭菌,諾氏梭菌、索氏梭菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌、破傷風(fēng)梭菌、肉毒梭菌),或具佐劑活性的片段或衍生物,以藥學(xué)上可接受的載體存在〔例如依據(jù)選擇的免疫途徑,可有水,鹽溶液(例如磷酸緩沖鹽溶液),碳酸氫鹽溶液(例如0.24M NaHCO3),或以栓劑形式存在〕。以上描述了本發(fā)明組合物可能包含的毒素,并且毒素包括,例如艱難梭菌毒素A,艱難梭菌毒素B,艱難梭菌毒素A和艱難梭菌毒素B,或片段〔例如含重復(fù)片段的羧基末端片段,此重復(fù)構(gòu)成毒素A(ARU)的碳水化合物結(jié)合區(qū)〕或具佐劑活性的衍生物。毒素可以是重組的,合成的,融合蛋白的一部分〔包括例如抗原(例如,幽門螺桿菌脲酶)或一個利于融合蛋白純化的多肽(例如GST)〕,與抗原共價偶聯(lián),與抗原化學(xué)交聯(lián)或類毒素性的(例如,產(chǎn)生較少毒性的,見上面)。上面已列舉了本發(fā)明組合物所包含的與佐劑一起的抗原實例。
細(xì)菌毒素作為粘膜佐劑用途的普通概念并不新鮮。然而,過去報導(dǎo)的具佐劑活性的細(xì)菌毒素代表了密切相關(guān)的一類單一毒素,每個毒素包含多個結(jié)合區(qū)的多肽和具ADP-核糖轉(zhuǎn)移酶酶活性的單一肽。這些毒素的毒性機理包含腺苷酸環(huán)化酶的糖基化作用,最終引起感染細(xì)胞內(nèi)cAMP水平的升高?;魜y毒素(CT)和大腸桿菌不耐熱毒素(LT)是這類佐劑的典型實例(Spangler等,微生物綜述56(4)622-647,1992),但這類群體也包括百日咳毒素。艱難梭菌毒素A和B的特征不如ADP核糖化毒素熟悉,但根據(jù)毒性機理〔例如當(dāng)CT和LT促進(jìn)ADP糖基化(見,例Spanger等,上文)時,艱難梭菌毒素誘導(dǎo)細(xì)胞骨架變化(見例如Siffert等,感染和免疫61(3)1082-1090,1993)〕,酶活性(艱難梭菌毒素不具有ADP-核糖轉(zhuǎn)移酶活性),和整體結(jié)構(gòu)(艱難梭菌是單肽鏈,而LT和CT各含多鏈)而言,它們明確地代表了完全不同的一類毒素。這些差異對輔佐性機理是重要的,并可能影響粘膜應(yīng)答的關(guān)鍵方面。粘膜應(yīng)答中的變量包括,但不限于,佐劑的有效劑量,與效應(yīng)物位置相關(guān)的誘導(dǎo)位置,參與的T協(xié)助因子亞型,抗體應(yīng)答持續(xù)時間以及免疫應(yīng)答記憶。
通常認(rèn)為抗原的鼻內(nèi)給藥增加上呼吸道粘膜免疫應(yīng)答(URT,見,例如McGhee等,感染劑和疾病,255-73,Raven Press,Ltd,New York)。我們已證明,除URT外,艱難梭菌佐劑(例如艱難梭菌毒素A和B)與抗原進(jìn)行鼻內(nèi)給藥也能增加胃腸道和生殖-尿道中對抗原的粘膜免疫應(yīng)答。因此,本發(fā)明佐劑的一個優(yōu)點是,不像傳統(tǒng)粘膜佐劑〔例如霍亂毒素(CT)〕,本發(fā)明佐劑經(jīng)鼻內(nèi)給藥,能誘導(dǎo)腸和生殖-尿道中免疫應(yīng)答。由此,當(dāng)這些區(qū)域的應(yīng)答主要防護(hù)或治療感染疾病時,可以使用本發(fā)明佐劑。除鼻內(nèi)途徑外,也可用直腸或陰道途徑。例如,本發(fā)明佐劑與合適的疫苗可以用于性傳播感染疾病的預(yù)防和治療(例如獲得性免疫缺陷綜合癥、淋病和衣原體屬)。
從下面優(yōu)選實施方案和權(quán)利要求中可看出,本發(fā)明的其它特征和優(yōu)點是顯而易見的。
詳細(xì)描述首先描述附圖附1A和1B表示用卵白蛋白(OVA,
圖1A)或鑰孔血藍(lán)蛋白(KLH,圖1B),結(jié)合艱難梭菌毒素A,大腸桿菌不耐熱毒素(LT)或如圖所示無佐劑進(jìn)行鼻內(nèi)免疫的小鼠樣品中,抗原特異性血清IgG、血清IgA,唾液IgA、糞便IgA和陰道IgA水平。
圖2是一系列附圖,表示用脲酶(5μg)和指明的佐劑〔(PBS=磷酸緩沖鹽溶液)(無佐劑),脲酶(無佐劑);+CT=脲酶+5μgCT(霍亂毒素);+txd=脲酶+15μgtxd(類毒素);+toxA=脲酶+0.2μg毒素A(艱難梭菌毒素A);+toxb=脲酶+1μgtoxB(艱難梭菌毒素B);CT/CTB=脲酶+5ng CT(霍亂毒素)和5μg CTB(霍亂毒素B亞單位)〕鼻內(nèi)免疫的小鼠,其血清中脲酶特異性IgG水平和其血清、唾液、糞便和陰道分泌物中的脲酶特異性IgA水平。圖中表示的平均重復(fù)讀數(shù)(OD405)用最初抗體的單一稀釋法(血清1∶100;粘膜樣品1∶20)??贵w水平是每組5只動物的平均值。
圖3表示鼻內(nèi)施用脲酶(5μg),結(jié)合用指明的佐劑,以及隨后用毒性貓螺桿菌激發(fā)產(chǎn)生免疫的小鼠胃組織中脲酶活性(見上面圖2描述)。在貓螺桿菌攻擊后兩周取胃組織樣品。
圖4A-4B表示根據(jù)表4中所列圖解,用含毒素A(GST-ARU)羧基末端區(qū)域的融合蛋白免疫接種小鼠,用ELISA法測其血清(圖4a)和唾液,糞便及陰道樣品中抗艱難梭菌毒素A的IgG和IgA水平。
圖5A-5B表示用指明的卵白蛋白+GST/ARU和/或毒素A鼻內(nèi)免疫接種的小鼠中血清抗卵白蛋白IgA水平和血清IgG水平。棒表示每組5個小鼠的平均抗體水平,注明了標(biāo)準(zhǔn)誤差(SD)。
圖6A-6B表示用指明的卵白蛋白+GST/ARU和/或毒素A鼻內(nèi)免疫接種的小鼠中唾液抗卵白蛋白IgA(圖6A)水平和糞便IgA水平。棒表示每組5個小鼠的平均抗體水平,注明了標(biāo)準(zhǔn)誤差(SD)。
圖7A-7B表示用指明的卵白蛋白+GST/ARU和/或毒素A鼻內(nèi)免疫接種的小鼠中陰道抗卵白蛋白IgA水平和陰道IgG水平。棒表示每組5個小鼠的平均抗體水平,注明了標(biāo)準(zhǔn)誤差(SD)。
圖8是一系列圖,表示用指明的卵白蛋白,卵白蛋白+毒素A,或卵白蛋白+LT進(jìn)行直腸(Rec)或陰道(Vag)免疫接種的小鼠,其抗卵白蛋白血清IgG水平,血清IgA水平,唾液IgA水平,直腸IgA水平,陰道IgA水平和陰道IgG水平。棒表示每組5個小鼠的平均抗體水平,注明了標(biāo)準(zhǔn)誤差(SD)。艱難梭菌毒素作為粘膜佐劑的用途本發(fā)明提供了誘導(dǎo)對抗原的保護(hù)性和/或治療性免疫應(yīng)答的方法和組合物,包括用一種梭菌(例如,艱難梭菌)毒素多肽(例如艱難梭菌毒素A或B),具佐劑活性的片段或衍生物〔例如毒素A的ARU片段,或其衍生物(見下面)〕,或一種艱難梭菌類毒素作為佐劑。下面描述集中在艱難梭菌毒素A,艱難梭菌毒素B和艱難梭菌類毒素作為本發(fā)明所包括佐劑的具體實例。同時下面描述也包括來自其它梭菌例如諾氏梭菌(例如諾氏梭菌α-毒素;Bette等,Toxicon 29(7)877-887,1991)和索氏梭菌(例如索氏梭菌致死毒素,Bette等;Supra)的毒素和類毒素。
用幾種標(biāo)準(zhǔn)方法中任何一種可制備本發(fā)明方法和組合物中所用的毒素多肽。例如從細(xì)菌培養(yǎng)濾液中純化毒素(例如艱難梭菌毒素A和/或艱難梭菌毒素B)(見例如Lyerly等,F(xiàn)EMS Microbio,Lett.3331-35,1986,和Kim等,感染和免疫552984-2992,1987從艱難梭菌濾液中制備毒素的方法)。也可用標(biāo)準(zhǔn)重組DNA方法生產(chǎn)毒素多肽。在這些方法中,用含全部或部分編碼毒素核苷酸片段的合適表達(dá)載體來轉(zhuǎn)化合適的宿主細(xì)胞(見Dove等,感染和免疫58488,1990,和Barroso等,核酸研究184004,1990,分別為艱難梭菌毒素A的核苷酸序列和推斷的氨基酸序列,及艱難梭菌毒素B的核苷酸序列)。一個范圍較寬的表達(dá)系統(tǒng)中任一個都可以用于生產(chǎn)重組毒素。在原核宿主(例如細(xì)菌,如大腸桿菌)或真核宿主中〔例如酵母細(xì)胞,例如啤酒酵母,哺乳動物細(xì)胞(例如COSI,NIH3T3或JEG3細(xì)胞)或節(jié)肢動物細(xì)胞(例如草地夜蛾(SF9)細(xì)胞)〕可以生產(chǎn)毒素多肽。這些細(xì)胞來源范圍較廣例如,美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC),Rockland,MD(也見例Ausubel等,上文)。轉(zhuǎn)染方法和表達(dá)載體的選擇根據(jù)所選的宿主系統(tǒng)而決定。例如Ausubel等,上文描述了轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)染方法。表達(dá)載體(例如質(zhì)粒和病毒載體)可以從《克隆載體實驗手冊》(Pouwels等,1985,補刊,1987)中描述的那些載體中挑選。毒素多肽,特別是短片段,也可以用化學(xué)合成方法,例如固相多肽合成法,1984,第二版.,Stewart and Young;Eds.,Pierce Chemical Co.,Rockford,IL或通過標(biāo)準(zhǔn)的體外翻譯方法生產(chǎn)制得。
類毒素(例如艱難梭菌類毒素)也可以用在本發(fā)明的方法和組合物中。類毒素是為消除或減輕毒素毒性而經(jīng)過處理的毒素,但保持了佐劑活性??捎脴?biāo)準(zhǔn)方法制備類毒素,例如通過化學(xué)(例如戊二醛或甲醛)處理(見例Libby等,感染和免疫36822-829,1982)。也可以用標(biāo)準(zhǔn)重組DNA方法制備類毒素。例如在編碼毒素基因中造成突變,并在一個如上所述的表達(dá)系統(tǒng)中生產(chǎn)突變基因編碼的突變毒素。艱難梭菌毒素A和艱難梭菌毒素B中可能突變的區(qū)域包括,例如保守的半胱氨酸殘基,核苷酸結(jié)合區(qū)域、內(nèi)部疏水區(qū)域,和/或羧基末端重復(fù)區(qū)域。例如Barroso等,微生物病理16297-303,1990描述了本發(fā)明可能使用的艱難梭菌毒素中突變的具體實例。
生產(chǎn)本發(fā)明所用類毒素的其它方法包括對毒性起關(guān)鍵作用的氨基酸化學(xué)修飾,但與輔佐性無關(guān)。例如,本發(fā)明所用的并為本領(lǐng)域已知的化學(xué)試劑,可特異修飾賴氨酸,酪氨酸,色氨酸,組氨酸或含SH-氨基酸(見例如Cohen等,生物化學(xué)年評,37683-695,1986)。此外,可用標(biāo)準(zhǔn)光親和標(biāo)記方法生產(chǎn)本發(fā)明所用的類毒素,此方法利用例如疊氮相連底物衍生物,通過紫外輻射而將其共價連接到毒素活性位置。本發(fā)明也包括毒素和類毒素的混合物作為佐劑的用途。例如,一種艱難梭菌類毒素可以與痕量毒素A或毒素B一起施用(見例如Tamura等,疫苗12(12)1083-1089,1994)。
只要保留了佐劑活性,除天然全長的艱難梭菌毒素外,毒素多肽片段或含突變(可能是或不是類毒素)的毒素(毒素多肽片段)可以用于本發(fā)明。例如艱難梭菌毒素片段的例子,見例如Price等,當(dāng)代微生物學(xué)1655-60,1987;Lyerly等,感染和免疫602488-2492,1992。所以用標(biāo)準(zhǔn)方法(見例如Ausubel等,上文)制備編碼艱難梭菌毒素片段和/或含突變的毒素的基因。用本領(lǐng)域標(biāo)準(zhǔn)方法篩選本發(fā)明所包括的片段,衍生物和類毒素的佐劑活性,例如通過測粘膜免疫應(yīng)答的誘發(fā)或保護(hù)性和/或治療性免疫的誘發(fā)(見下面)。如下面所述,艱難梭菌毒素A的ARU片段是一種有效的粘膜佐劑。
本發(fā)明也包括融合蛋白,其含有與病原體(例如幽門螺桿菌脲酶)的抗原相融合的梭菌屬(例如艱難梭菌)毒素(或具佐劑活性的片段或衍生物),并用標(biāo)準(zhǔn)方法(見例Ausubel等,上文)制備此蛋白。此外,本發(fā)明的毒素佐劑可與抗原共價偶聯(lián)或交聯(lián)(見例Cryz等,疫苗1367-71,1994;Liang等,免疫學(xué)雜志1411495-1501,1988;和Czerkinsky等,感染和免疫571072-1077,1989)。
本發(fā)明的佐劑/疫苗組合物可以施用到粘膜表面(例如鼻內(nèi)、口、眼、胃腸、直腸、陰道、或生殖-尿道)。另外,也可用非腸道給藥方式(例如,靜脈內(nèi),皮下,腹膜內(nèi)或肌肉內(nèi))。佐劑和疫苗的施用量依據(jù)具體的疫苗抗原和佐劑,給藥方式和頻率,和所需效果(例如保護(hù)和/或治療)而由本領(lǐng)域技術(shù)人員決定。通常,本發(fā)明佐劑施用量范圍從1μg到1mg,抗原范圍在1μg到100mg。由本領(lǐng)域技術(shù)人員決定重復(fù)給藥。例如,一份引發(fā)劑量可以以周為間隔跟隨3個增強劑量。
本發(fā)明佐劑(與抗原結(jié)合)以藥學(xué)上接受的載體或稀釋液〔例如水、鹽水溶液(例如磷酸緩沖鹽溶液),碳酸氫鹽溶液(例如0.24MNaHCO3),栓劑,油膏或凝膠〕形式施用,可根據(jù)給藥方式和途徑,及標(biāo)準(zhǔn)藥物的醫(yī)療而選擇。Remingtons藥物科學(xué)(Alfonso Gennaro等,編,第17版,Mack publishing Co.,Easton PA,1985),在此領(lǐng)域,USP/NF中所用的標(biāo)準(zhǔn)參考書,和Lachman等寫的(工業(yè)藥學(xué)理論和實踐,2nd edn,Lea&Fabiger,Philadelphia PA,1976)描述了藥物制劑中的合適藥物載體和稀釋液,以及藥物調(diào)用輔助劑。在直腸和陰道給藥情況中,使用將藥物施用到區(qū)域的標(biāo)準(zhǔn)方法和載體施用疫苗。例如,栓劑,油膏(例如可可油)或凝膠,以及標(biāo)準(zhǔn)陰道涂藥器,滴劑、注射劑、或可能用的灌腸劑。由本領(lǐng)域技術(shù)人員決定合適的方法。
下面的實施例意味著闡明,但不限制,本發(fā)明的方法和組合物。下文所引出的一些對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員顯而易見的條件和參數(shù)的修飾也包括在本發(fā)明中。
實施例實施例1與卵白蛋白(OVA)或鑰孔血藍(lán)蛋白(KLH)一起施用的艱難梭菌毒素的佐劑活性為了分析艱難梭菌毒素A的佐劑活性,對雌性瑞士Webster小鼠(Tacohic Farms,Germantoun,NY)進(jìn)行鼻內(nèi)免疫接種抗原,單獨用抗原〔50μg卵白蛋白(OVA)或鑰孔血藍(lán)蛋白(KLH)〕或與毒素A(40ng)結(jié)合。作為一個對照組,疫苗抗原與大腸桿菌不耐熱毒素(LT;5μg)共同施用,已知此毒素有粘膜佐劑活性。免疫接種方法為每周給藥一次,連續(xù)四周。在最后一次給藥一周后取動物樣品。
與只施用OVA而無佐劑的相似動物組織相比,用OVA和毒素或LT鼻內(nèi)免疫接種的動物血清、唾液、糞便和陰道樣品中具有明顯比較高的OVA-特異性IgA抗體應(yīng)答(圖1A)。甚至無佐劑時,血清中OVA-特異性IgG水平普遍比血清和粘膜樣品中OVA-特異IgA水平較高,但佐劑存在時水平提高(圖1A)。僅在佐劑和抗原一起施用的動物中能明顯觀察到OVA-特異性粘膜IgA(圖1A)。
同樣地,與只施用KLH無佐劑的小鼠相比,用KLH+毒素A或LT鼻內(nèi)施用的小鼠,其KLH-特異性粘膜免疫應(yīng)答(IgG和IgA)都增加了(圖1B)。
下面表1中總結(jié)了在佐劑是否存在情況下對抗原(OVA和KLH)產(chǎn)生的免疫應(yīng)答的統(tǒng)計對照。表1與毒素A一起施用的OVA和KLH的Wilcoxon秩量和(RanKedSums)分析按處理組對比免疫應(yīng)答,在OVA/KLH+ToxinA(毒素A)和OVA/KLH+LT處理組中未觀察到統(tǒng)計差異秩量和p值(OVA)OVA+毒素A(40ng)處理與OVA單獨處理比較血清IgA唾液IgA糞便IgA陰道IgAp值0.1172 0.009 0.009 0.009血清IgG唾液IgG糞便IgG陰道IgGp值0.0758 0.1172 0.009 0.0163OVA+LT(5μg)處理與OVA單獨處理比較血清IgA唾液IgA糞便IgA陰道IgAp值0.1172 0.1172 0.0283 0.0361血清IgG唾液IgG糞便IgG陰道IgGp值0.1172 0.009 0.009 0.758秩量和p值(KLH)KLH+毒素A(40ng)處理與KLH單獨處理比較血清IgA唾液IgA糞便IgA陰道IgAp值0.0283 0.009 0.1425 0.009血清IgG唾液IgG糞便IgG陰道IgGp值0.3472 0.009 0.0163 0.0283KLH+LT(5μg)處理與KLH單獨處理比較血清IgA唾液IgA糞便IgA陰道IgAp值0.6015 0.009 0.009 0.016
血清IgG唾液IgG糞便IgG陰道IgGp值0.6015 0.009 0.009 0.009方法抗原與佐劑的制備卵白蛋白(OVA;Turkey,Sigma Chemical Co.,St.Louis.MO)或鑰孔血藍(lán)蛋白在磷酸緩沖鹽溶液(PBS)中稀釋到終濃度為5mg/ml。通過裂解、超濾、DEAE瓊脂糖層析和Q-瓊脂糖層析,從重組的大腸桿菌中制備重組脲酶(rllrease)(Lee等,傳染病雜志172161-172,1995)。冷凍干燥的純化脲酶重新溶在PBS中濃度為4mg/ml。冷凍干燥的大腸桿菌不耐熱腸毒素(LT;Berna,CoralGables,F(xiàn)L)重新溶在PBS中濃度為lmg/ml。
通過硫酸銨沉淀DEAE層析和酸沉淀從艱難梭菌培養(yǎng)物濾液中純化毒素A。通過DEAE層析(Lyerly等,上文,1986)從艱難梭菌培養(yǎng)物濾液中純化毒素B。免疫應(yīng)答的ELISA分析對相應(yīng)抗原(OVA或KLH)的抗體,用ELISA分析血清(IgG和IgA),唾液(IgA),糞便(IgA)和陰道(IgA)樣品,可測免疫接種小鼠的免疫應(yīng)答。在異熒烷麻醉情況下通過眶后取血獲得血清樣品。在毛果蕓香堿處理后獲得唾液樣品。為獲得陰道樣品,將預(yù)先浸過蛋白酶抑制劑的濕紗布條放在動物體內(nèi)〔200μM氨乙基苯磺酰氟化物(AEBSF),0.1%抑蛋白酶肽,0.01μM亮肽素和3.25μM貝他定〕。含陰道樣品的糞便和紗布條在分析前重新懸浮在蛋白酶抑制劑溶液,2.5%非脂干性脫脂乳中。
對ELISA分析,96孔板包被在碳酸鹽包被緩沖液中(0.1M碳酸鹽pH 9.6),與濃度為10μg/ml的抗原在4℃溫育過夜,接著用2%Tween20(Sigma Chemical Co.,St.Louis.MO)與PBS中2.5%非脂干性脫脂乳在37℃封閉1小時。血清抗體在封閉溶液中以1∶100比例稀釋檢測,粘膜樣品按1∶10稀釋檢測。用羊抗鼠IgG堿性磷酸酶結(jié)合物檢測特異性IgG抗體。用羊抗鼠IgG堿性磷酸酶結(jié)合物檢測特異性IgA抗體。圖1A和1B中結(jié)果以每個處理組中OD405平均讀數(shù)來表示。實施例II與幽門螺桿菌一起施用的艱難梭菌毒素的佐劑活性下面實驗證明,當(dāng)抗原與低毒,無毒劑量的艱難梭菌毒素A或艱難梭菌毒素B鼻內(nèi)施用時,對幽門螺桿菌脲酶的粘膜免疫應(yīng)答提高,并且進(jìn)一步證明這種免疫應(yīng)答是保護(hù)性的,防止隨后的螺桿菌攻擊。
對雌性瑞士Webster小鼠(5小鼠/佐劑)鼻內(nèi)施用幽門螺桿菌脲酶脫輔基酶蛋白(5μg),此蛋白從表達(dá)脲酶結(jié)構(gòu)亞基的重組大腸桿菌中純化(Lee等,上文),每周一次連續(xù)四周,并結(jié)合艱難梭菌毒素A(0.2μg),艱難梭菌毒素B(1μg),艱難梭菌類毒素培養(yǎng)物濾出液(各含用1%福爾馬林滅活的15μg毒素A和毒素B),CT(5μg),CT的B亞基(CTB;5μg)+CT(10ng),或無佐劑。確定毒素輔佐性<1>測定脲酶-特異性粘膜IgA誘發(fā)和<2>觀察保護(hù)性免疫誘發(fā)。粘膜IgA的誘發(fā)最后一次脲酶免疫接種后一周,從小鼠中取糞便、唾液和陰道樣品來分析抗脲酶IgA粘膜免疫應(yīng)答。通過在蛋白酶抑制劑溶液(200μMAEBSF,0.1%抑蛋白酶肽,0.01μM亮肽素,3.25M貝他定)中勻漿幾個糞便顆粒來制備糞便樣品。在氯胺酮麻醉情況下,毛果蕓香堿誘發(fā)獲得唾液樣品;在非熒烷麻醉情況下,將預(yù)先浸濕了蛋白酶抑制劑溶液(見上面)的可吸收性紗布條插入動物體內(nèi),可獲得陰道樣品。
通過ELISA可測樣品中抗脲酶IgA水平。用有脲酶(0.5μg/孔)的碳酸鹽包被緩沖液包被96孔板(見上面),用2.5%非脂干性脫脂乳封閉,并與小鼠樣品接觸。通過將堿性磷酸酶標(biāo)記的羊抗鼠IgA抗體放入孔中,并測定405納米可見光吸收值,來確定抗脲酶IgA水平(圖2)。
通過Wilcoxon秩量和檢驗比較每個處理組中抗體水平(表格2)。在鼻內(nèi)施用脲酶的所有組中血清抗-脲酶IgG水平提高,在不同處理組中無明顯差異。與單獨施用脲酶,或脲酶和CT相比,當(dāng)毒素A或毒素B與脲酶共同施用時,糞便的抗脲酶IgA水平明顯提高。施用脲酶和毒素A或B的動物與施用脲酶結(jié)合CTB和CT的動物相比,糞便的抗脲酶IgA無差異。毒素A與脲酶共同施用的陰道抗脲酶IgA水平明顯高于其它處理組。與單獨施用脲酶或與其它任何一種佐劑結(jié)合施用的試驗相比,這種差異在統(tǒng)計學(xué)上是顯著的。表2經(jīng)佐劑處理的對脲酶的粘膜應(yīng)答統(tǒng)計分析。顯示了在單獨施用脲酶、脲酶和CT,或脲酶和CTB+CT;以及脲酶和毒素A,脲酶和毒素B,或脲酶和類毒素的處理組中,糞便、唾液和陰道分泌物中抗體應(yīng)答的差異(Wilcoxon秩量和)p值(Wilcoxon)糞便IgA處理 CT CTR+CT脲酶毒素A 0.0119 0.11720.009毒素B 0.0163 0.91660.0163類毒素 未做 未做 0.4647唾液IgA處理 CT CTB+CT脲酶毒素A 0.8345 0.21010.2087毒素B 0.6752 0.91680.4647類毒素 未做 未做 0.0749陰道IgA處理 CT CTB+CT 脲酶毒素A 0.0283 0.0283 0.009毒素B 0.1745 0.1172 0.0937類毒素未做未做 0.472因此,當(dāng)鼻內(nèi)給藥時,艱難梭菌毒素A和艱難梭菌毒素B能在不同部位對異源抗原明顯地提高粘膜免疫應(yīng)答。特別是,當(dāng)毒素A施用到上呼吸道時誘發(fā)強烈的生殖-尿道和腸道應(yīng)答。與其它已知粘膜佐劑施用相比,這種增強作用更強烈。當(dāng)鼻內(nèi)施用抗原時,其它佐劑(例CT,LT和CT+CTB)主要刺激呼吸道免疫。保護(hù)性免疫的誘發(fā)為確定艱難梭菌毒素誘發(fā)的免疫應(yīng)答是否與防護(hù)激發(fā)有關(guān),用貓螺桿菌激發(fā)已免疫接種的動物。在最后一次脲酶免疫14天后,對麻醉的雌性瑞士Webster小鼠鼻內(nèi)施用貓螺桿菌(1×107)。14天后殺死動物,分析胃活體組織檢查(竇)的脲酶液體培養(yǎng)基(加入酚紅pH指示劑的脲緩沖液)溫育活體組織檢查樣品4個小時。離心去除胃物質(zhì)并測定OD550。由OD550測量值(胃中脲酶活性的定量)反映細(xì)菌菌落密度,并與通過組織病理觀察的細(xì)菌密度相關(guān)。吸收值高于背景2倍的小鼠被認(rèn)為已受感染。部分保護(hù)定義為OD550水平高于背景并低于感染對照組(PBS組)的2倍SD。
圖3表示胃脲酶檢測結(jié)果,表3總結(jié)了保護(hù)作用的結(jié)果。在已激發(fā)動物中,單獨施用脲酶及施用脲酶和艱難梭菌類毒素對誘發(fā)保護(hù)性免疫是無效的。施用脲酶和CT或CT+CTB能分別完全保護(hù)4/4和5/5動物,然而施用脲酶和毒素A完全保護(hù)3/5動物和部分保護(hù)5/5動物。Wilcoxon秩量和分析表明,通過測OD550確定感染量,與單獨施用脲酶(p0.0122)的動物相比,施用脲酶+毒素A的動物中感染量明顯較低。用脲酶+毒素B免疫接種的動物比那些單用脲酶免疫接種的動物感染程度低,并且脲酶+毒素B免疫接種的4/5動物是部分保護(hù)。這些數(shù)據(jù)表明,艱難梭菌毒素A和毒素B與幽門螺桿菌脲酶進(jìn)行鼻內(nèi)施用時,能對貓螺桿菌激發(fā)誘發(fā)保護(hù)性免疫。表3脲酶和粘膜佐劑進(jìn)行鼻內(nèi)免疫接種后小鼠對貓螺桿菌菌落的防護(hù)處理 感染動物/總數(shù)PBS 5/5脲酶 5/5脲酶+CT 0/4脲酶+類毒素 5/5脲酶+毒素A1/5*脲酶+毒素B4/5**脲酶+CTB+CT 0/5*1只感染動物的菌落比對照組少**3只感染動物的菌落比對照組少實施例III艱難梭菌毒素A融合蛋白(GST-ARU)的合成艱難梭菌毒素A的羧基末端區(qū)域包含一系列重復(fù)的氨基酸單位,并認(rèn)為參與將毒素連接到靶細(xì)胞的碳水化合物殘基上(見,例如,Lyerly等,當(dāng)代微生物2129-32,1990;Frey等,感染和免疫602488-2492,1992;及此處所引用的文獻(xiàn))。如下述構(gòu)建一個融合蛋白,包含與谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶融合的艱難梭菌毒素A羧基末端區(qū)域。通過標(biāo)準(zhǔn)方法,分離一段Sau 3A片段,包含編碼毒素A的794羧基末端氨基酸的核苷酸(見,例如,Dove等,上文,毒素A基因序列)。補平此片段的粘性末端,并且將平端片段接進(jìn)Sma I-消化的pGEX3X中(Pharmacia,Piscataway,NJ)。包含編碼GST-ARU的質(zhì)??寺≡诖竽c桿菌中生長,用谷胱甘肽-瓊脂糖親和柱純化GST-ARU融合蛋白,用游離的谷胱甘肽從柱上洗脫下來并用標(biāo)準(zhǔn)方法透析除去谷胱甘肽。GST-ARU是無毒的。實施例IV艱難梭菌毒素A融合蛋白(GST-ARU)的佐劑活性A.施用GST-ARU誘發(fā)抗-毒素A免疫應(yīng)答在大腸桿菌中表達(dá)GST-ARU,用標(biāo)準(zhǔn)方法親和純化,并施用到表4中所說明的實驗小鼠。表4用包含艱難梭菌毒素A的羧基末端的融合蛋白免疫接種小鼠后,關(guān)于粘膜免疫應(yīng)答分析的實驗圖解。GST-ARU=包含谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶和毒素A重復(fù)單位的融合蛋白;GST=谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶;PBS=磷酸緩沖鹽溶液;IG=胃內(nèi)的;IN=鼻內(nèi)的;IP=腹膜內(nèi)的。在第0、7、14和21天進(jìn)行免疫接種。在第28天取血清、陰道、糞便和唾液樣品??乖?劑量(μg) 佐劑 途徑 #大鼠GST-ARU 100CTIG5GST-ARU 100無IG5GST-ARU 50 CTIN5GST-ARU 50 無IN5GST-ARU 25 RIBI IP5GST-ARU 25 無IP5GST 25 CTIG5GST 25 無IG5GST 12.5 CTIN5GST 12.5 無IN5GST 6.25 RIBI IP5GST 6.25 無IP5PBS 0 CTIG5PBS 0 CTIN5PBS 0 RIBI IP5
通過ELISA測定樣品中抗艱難梭菌毒素A IgA和/或IgG水平。96孔板用毒素A在碳酸鹽包被緩沖液中包被(見上面),用2.5%非脂干性脫脂乳封閉,然后接觸樣品。通過將堿性磷酸酶標(biāo)記的羊抗鼠IgA(或IgG)抗體放入孔中,并測405納米可見光吸收值來確定抗脲酶IgA(或IgG)水平。
這些實驗結(jié)果表示在圖4A-4B中。這些數(shù)據(jù)表明無需用CT來提高誘導(dǎo)的抗毒素A血清IgA或IgG,或抗毒素A粘膜免疫應(yīng)答。鼻內(nèi)免疫接種后(圖4A-4B),此效果特別顯著。因為毒素A的羧端區(qū)域在無異源佐劑(如CT)時能夠誘導(dǎo)免疫應(yīng)答。這些數(shù)據(jù)表明毒素A的這一區(qū)域作為佐劑是有效的。然而,當(dāng)已知佐劑存在或缺失時進(jìn)行粘膜或全身給藥時,未發(fā)現(xiàn)GST單獨有抗原性(例如GST不是以有ARU的融合蛋白形式存在)。因此,對于艱難梭菌毒素-抗原融合蛋白,GST不是一種合適的試驗抗原。在以下描述實驗中,當(dāng)鼻內(nèi)施用GST-ARU與卵白蛋白,GST-ARU是一種有效的佐劑。B.GST-ARU+卵白蛋白的鼻內(nèi)給藥產(chǎn)生一種抗卵白蛋白免疫應(yīng)答通過鼻內(nèi)免疫接種GST-ARU和/或毒素A與卵白蛋白,檢驗GST-ARU的佐劑活性。小鼠鼻內(nèi)給藥100μg卵白蛋白,25μg GST-ARU,和毒素A的減少量(200ng,40ng,8ng,1.6ng和0ng),或100μg卵白蛋白和毒素A的減少量(200ng,40ng,8ng,1.6ng和0ng),但無GST-ARU,間隔期四周。給藥量不超過20μg,并且不施用麻醉藥。每個處理組中有5只小鼠。
如上面描述(見圖5A-7B),通過EUSA分析確定血清,唾液,糞便和陰道分泌物中的抗卵白蛋白免疫應(yīng)答。血清IgA和IgG免疫應(yīng)答表明動物中抗卵蛋白抗體水平隨毒素A劑量的減少而降低。當(dāng)施用GST時,隨著活性毒素的減少劑量,甚至不施用毒素A(圖5A和5B),應(yīng)答不消失。相似地,不管是否存在活性毒素A,當(dāng)GST-ARU作為佐劑時,唾液、糞便、和陰道抗卵白蛋白相比,當(dāng)GST-ARU作為一種佐劑時已分析的所有免疫應(yīng)答均為顯著增加。這些應(yīng)答與LT用作佐劑所觀察的免疫應(yīng)答的差異程度并不顯著(表5)。所以,GST-ARU顯著增加對血清和粘膜分泌物中共同施用抗原的免疫應(yīng)答。此外,這些數(shù)據(jù)表明能從遺傳上去除毒素A的毒性,并不影響佐劑活性。實施例V直腸和陰道免疫接種方法以下調(diào)查了直腸和陰道免疫接種途徑。小鼠給藥200μg卵白蛋白和1μg毒素A,25μgLT,或無佐劑,間隔期四周。每個處理組中有5只小鼠。當(dāng)小鼠輕微麻醉時,通過喂食時施用總量為15μg的疫苗。
表5
如上面所述,在最后一次免疫接種后,取血清和粘膜分泌物樣品通過ELISA測抗卵白蛋白抗體水平。當(dāng)抗原與毒素A經(jīng)直腸或陰道途徑施用時,血清抗卵白蛋白IgG免疫應(yīng)答增加,但單獨施用抗原時不增加(圖8)。當(dāng)毒素A用作佐劑時,糞便中抗卵白蛋白IgA抗體應(yīng)答明顯提高,血清,唾液和陰道分泌物中輕微增加(圖8)。直腸免疫接種卵白蛋白+佐劑后測定的所有免疫應(yīng)答比單獨用卵白蛋白直腸免疫接種后的免疫應(yīng)答統(tǒng)計值大(表6)。陰道免疫接種是有明顯的相似趨勢,但需要大量的小鼠來證實統(tǒng)計意義。有趣的是,與單獨施用抗原相比,直腸或陰道施用帶有佐劑的卵白蛋白時,直腸抗卵白蛋白IgG應(yīng)答提高。這些數(shù)據(jù)表明,當(dāng)給藥到直腸或陰道粘膜時,毒素A提高血清和粘膜分泌物中的特異性抗體水平。另一方面支持了直腸途徑的功效,使用與上述相似的攻擊和鑒定方法,螺桿菌脲酶和毒素A直腸免疫接種的小鼠能防止螺桿菌的激發(fā)。
表6直腸免疫接種卵白蛋白+毒素A的Wilcoxon秩量和分析處理 血清IgG 血清IgA 唾液IgA 唾液IgG 糞便IgA 糞便IgG 陰道IgA 陰道IgG直腸毒素A對0.009 0.009 0.009 0.02780.0089 0.0088 0.0088 0.0088卵白蛋白單用直腸毒素A對0.08640.62420.22071 0.6242 0.8065 0.3272 0.3272直腸LT其它一些實施方案在下面的權(quán)利要求書中。
權(quán)利要求
1.一種在哺乳動物中誘導(dǎo)對抗原的免疫應(yīng)答的組合物,所說組合物包含所說抗原和一種有佐劑活性的梭菌屬細(xì)菌毒素或其片段或衍生物組成的佐劑。
2.權(quán)利要求1的組合物,其中所說抗原和所說佐劑被制劑化,以便于給藥于所說哺乳動物的粘膜表面。
3.權(quán)利要求2的組合物,其中所說的粘膜表面是鼻內(nèi)。
4.權(quán)利要求2的組合物,其中所說的粘膜表面是口。
5.權(quán)利要求2的組合物,其中所說的粘膜表面是直腸。
6.權(quán)利要求2的組合物,其中所說的粘膜表面是在生殖-尿道內(nèi)。
7.權(quán)利要求6的組合物,其中所說的粘膜表面是陰道。
8.權(quán)利要求1的組合物,其中所說的細(xì)菌選自艱難梭菌,索氏梭菌和諾氏梭菌。
9.權(quán)利要求1的組合物,其中所說的細(xì)菌是艱難梭菌。
10.權(quán)利要求1的組合物,其中所說的佐劑是艱難梭菌毒素A。
11.權(quán)利要求1的組合物,其中所說的佐劑是艱難梭菌毒素B。
12.權(quán)利要求1的組合物,其中所說的抗原與艱難梭菌毒素A和艱難梭菌毒素B,或其具佐劑活性的片段或衍生物一起給藥。
13.權(quán)利要求1的組合物,其中所說的佐劑包含艱難梭菌毒素A的碳水化合物的結(jié)合區(qū)域。
14.權(quán)利要求1的組合物,其中所說的毒素被以融合蛋白形式制備。
15.權(quán)利要求14的組合物,其中所說的融合蛋白包含所說抗原。
16.權(quán)利要求1的組合物,其中所說的抗原是幽門螺桿菌脲酶,或其片段或衍生物。
全文摘要
本發(fā)明涉及在哺乳動物中誘導(dǎo)對一種抗原的保護(hù)性和/或治療性免疫應(yīng)答的方法和組合物。在這些方法中,將該抗原與梭菌屬(例如艱難梭菌)的毒素,或其具有佐劑活性的片段或其衍生物一起施用于哺乳動物。
文檔編號A61K39/106GK1195297SQ96196777
公開日1998年10月7日 申請日期1996年7月1日 優(yōu)先權(quán)日1995年7月7日
發(fā)明者小·W·D·湯馬斯, T·P·莫納思, 張振西, F·J·托雷斯-羅佩茲, 雷文德, D·M·賴爾利, J·S·莫克里夫 申請人:奧拉瓦克斯有限公司