專利名稱：旋轉(zhuǎn)異構(gòu)酶活性抑制劑的制作方法
相關(guān)申請本申請是美國專利申請08／551026(1995年10月31)的部分繼續(xù)申請。
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及本發(fā)明涉及將神經(jīng)營養(yǎng)FK506結(jié)合蛋白(FKBP)抑制劑化合物用作與親免蛋白有關(guān)的酶活性的抑制劑，這些化合物對FKBP型的親免蛋白具有親和性，具體地講，本發(fā)明涉及肽基脯氨?；悩?gòu)酶或旋轉(zhuǎn)異構(gòu)酶活性的抑制劑。2．先有技術(shù)術(shù)語親免蛋白指作為主要的免疫抑制藥物(環(huán)孢菌素A(CsA)、FK506和雷帕霉素)受體的一些蛋白質(zhì)。已知的親免蛋白類型有親環(huán)蛋白和FK506結(jié)合蛋白，如FKBP。環(huán)孢菌素A結(jié)合親環(huán)蛋白而FK506和雷帕霉素結(jié)合FKBP。這些親免蛋白-藥物復(fù)合物干預(yù)特別是免疫系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)的多種細(xì)胞間信號傳導(dǎo)系統(tǒng)。
已知親免蛋白具有肽基-脯氨?；悩?gòu)酶(PPIase)或旋轉(zhuǎn)異構(gòu)酶活性。已確定旋轉(zhuǎn)異構(gòu)酶活性在親免蛋白的順反異構(gòu)體互變中起催化作用。
起初親免蛋白是在免疫系統(tǒng)中發(fā)現(xiàn)并研究的。本領(lǐng)域技術(shù)人員原來推斷親免蛋白旋轉(zhuǎn)異構(gòu)酶活性的抑制導(dǎo)致T細(xì)胞增殖的抑制，于是引起免疫抑制藥物如環(huán)孢菌素A、FK506和雷帕霉素表現(xiàn)出的免疫抑制作用。進(jìn)一步研究表明旋轉(zhuǎn)異構(gòu)酶活性的抑制，其本身不足以發(fā)揮免疫抑制活性。相反，免疫抑制藥物和親免蛋白的復(fù)合制劑似乎產(chǎn)生免疫抑制作用。已表明親免蛋白-藥物復(fù)合物的作用方式是作用于三元靶蛋白。對于FKBP-FK506和FKBP-CsA來說，藥物-親免蛋白復(fù)合物結(jié)合鈣調(diào)磷酸酶，抑制導(dǎo)致T細(xì)胞增殖的T細(xì)胞受體信號。同樣，雷帕霉素和FKBP的復(fù)合物與RAFT1／FRAP蛋白作用并抑制IL-2受體產(chǎn)生的信號。
已發(fā)現(xiàn)在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中存在高濃度的親免蛋白。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中親免蛋白濃度比免疫系統(tǒng)中的高10-50倍。在神經(jīng)組織中，親免蛋白似乎影響一氧化氮的合成、神經(jīng)遞質(zhì)的釋放及神經(jīng)元突起的延伸。
FK506也能增強(qiáng)生長相關(guān)蛋白-43(GAP43)的磷酸化作用。GAP43參與神經(jīng)元突起的延伸，且其磷酸化作用似乎增強(qiáng)此活性。因此，用PC12細(xì)胞已檢測了FK506、雷帕霉素和環(huán)孢菌素在神經(jīng)元突起延伸中的作用。PC12細(xì)胞是神經(jīng)元樣的不死性細(xì)胞系，它們受神經(jīng)生長因子(NGF)刺激時延伸軸突。
令人驚奇的是，已發(fā)現(xiàn)皮摩爾濃度的免疫抑制劑如FK506和雷帕霉素刺激PC12細(xì)胞和感覺神經(jīng)元即背根神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(DRGs)中軸突的突起。在全身動物試驗(yàn)中，已表明面部神經(jīng)損傷后FK506刺激神經(jīng)再生并導(dǎo)致動物坐骨神經(jīng)損傷的功能恢復(fù)。
更具體地講，已發(fā)現(xiàn)對FKBP具高親和性的藥物是強(qiáng)旋轉(zhuǎn)異構(gòu)酶抑制劑并表現(xiàn)出神經(jīng)營養(yǎng)作用。Snyder等，“親免蛋白及神經(jīng)系統(tǒng)”，Nature Medicine，第1卷，No．1，1995年1月，32-37頁。這些發(fā)現(xiàn)表明可使用免疫抑制劑治療多種外周神經(jīng)疾病并促進(jìn)中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)中的神經(jīng)元再生。研究表明神經(jīng)退化性紊亂如阿爾茨海默病和帕金森病會因在這些紊亂中受侵襲的特定神經(jīng)元群是由特異性神經(jīng)營養(yǎng)物質(zhì)的損失或利用率降低而發(fā)病。
已確定了中樞神經(jīng)系統(tǒng)中作用于特定神經(jīng)元群的若干神經(jīng)營養(yǎng)因子。例如，已假設(shè)阿爾茨海默病是由于神經(jīng)生長因子(NGF)的降低或損失。因而，也建議用外源性神經(jīng)生長因子或其它神經(jīng)營養(yǎng)蛋白治療SDAT患者以增加正在退化的神經(jīng)元群的存活時間，其它神經(jīng)營養(yǎng)蛋白如腦來源生長因子、神經(jīng)膠質(zhì)來源的生長因子、睫神經(jīng)營養(yǎng)因子及神經(jīng)營養(yǎng)蛋白-3。
這些蛋白在多種神經(jīng)性疾病中的臨床應(yīng)用，受到對靶神經(jīng)系統(tǒng)給藥困難及大分子蛋白質(zhì)的生物利用度低的阻礙。相反，建議神經(jīng)營養(yǎng)活性的免疫抑制藥物相對較小并具有優(yōu)異的生物利用度和特異性。但是，當(dāng)長期給藥時，免疫抑制藥物具有一些可能的嚴(yán)重副作用，包括腎毒性，如腎小球過濾作用的損害及不可逆性間質(zhì)纖維化(Kopp等，1991，美國腎病學(xué)聯(lián)合會雜志1∶162)；神經(jīng)缺損，如不自主震顫，或者非特異性腦絞痛如部位不定的頭痛(De Groen等，1987，N．Engl．J．Med．317∶861)；以及伴有由此產(chǎn)生的并發(fā)癥的血管性高血壓(Kahan等，1989新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志321∶1725)。
本發(fā)明提供了用于治療與神經(jīng)退化有關(guān)的神經(jīng)紊亂(包括帕金森病和阿爾茨海默病)的非免疫抑制性的FKBP抑制劑化合物，其中含有小分子FKBP旋轉(zhuǎn)異構(gòu)酶抑制劑，它們在神經(jīng)元修復(fù)可以被促進(jìn)的多種神經(jīng)疾病狀態(tài)中，極強(qiáng)地加強(qiáng)軸突突起、促進(jìn)神經(jīng)元生長和再生。這些疾病包括由物理損傷或疾病如糖尿病引起的外周神經(jīng)損傷、中樞神經(jīng)系統(tǒng)(脊髓和腦)的物理損害、與休克有關(guān)的腦損害。
發(fā)明概述本發(fā)明涉及將神經(jīng)營養(yǎng)FKBP抑制劑化合物用作與親免蛋白有關(guān)的酶活性的抑制劑，這些化合物對FKBP型的親免蛋白具有親和性，具體地講，本發(fā)明涉及肽基脯氨酰基異構(gòu)酶或旋轉(zhuǎn)異構(gòu)酶活性的抑制劑。
本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案是調(diào)節(jié)動物神經(jīng)活性的方法，包括給動物使用有效量的具有FKBP型親免蛋白親和性的FKBP抑制劑，以刺激損傷的外周神經(jīng)的生長或促進(jìn)神經(jīng)元再生，其中FKBP型親免蛋白表現(xiàn)有旋轉(zhuǎn)異構(gòu)酶活性而哌可酸衍生物抑制所述親免蛋白的旋轉(zhuǎn)異構(gòu)酶活性。
本發(fā)明的另一個優(yōu)選的實(shí)施方案是治療動物神經(jīng)紊亂的方法，包括給動物使用有效量的具有FKBP型親免蛋白的FKBP抑制劑和有效量的神經(jīng)營養(yǎng)因子以刺激損傷的外周神經(jīng)的生長或促進(jìn)神經(jīng)元再生，該神經(jīng)營養(yǎng)因子選自神經(jīng)生長因子、腦來源的生長因子、神經(jīng)膠質(zhì)來源的生長因子、睫神經(jīng)營養(yǎng)因子和神經(jīng)營養(yǎng)蛋白-3，其中FKBP型親免蛋白表現(xiàn)有旋轉(zhuǎn)異構(gòu)酶活性而哌可酸衍生物抑制所述親免蛋白的旋轉(zhuǎn)異構(gòu)酶活性。
本發(fā)明的另一個優(yōu)選的實(shí)施方案是刺激損傷的外周神經(jīng)生長的方法，包括給損傷的外周神經(jīng)使用有效量的具有FKBP型親免蛋白親和性的FKBP抑制劑化合物，以刺激或促進(jìn)損傷的外周神經(jīng)的生長，其中FKBP型親免蛋白表現(xiàn)有旋轉(zhuǎn)異構(gòu)酶活性而哌可酸衍生物抑制所述親免蛋白的旋轉(zhuǎn)異構(gòu)酶活性。
本發(fā)明的另一個優(yōu)選的實(shí)施方案是刺激損傷的外周神經(jīng)生長的方法，包括給損傷的外周神經(jīng)使用有效量的具有FKBP型親免蛋白親和性的FKBP抑制劑化合物，以刺激損傷的外周神經(jīng)的生長，其中FKBP型親免蛋白表現(xiàn)有旋轉(zhuǎn)異構(gòu)酶活性而哌可酸衍生物抑制所述親免蛋白的旋轉(zhuǎn)異構(gòu)酶活性。
本發(fā)明的另一個優(yōu)選的實(shí)施方案是促進(jìn)動物神經(jīng)元再生和生長的方法，包括給動物使用有效量的具有FKBP型親免蛋白親和性的FKBP抑制劑化合物，以促進(jìn)神經(jīng)元再生，其中FKBP型親免蛋白表現(xiàn)有旋轉(zhuǎn)異構(gòu)酶活性而哌可酸衍生物抑制所述親免蛋白的旋轉(zhuǎn)異構(gòu)酶活性。
本發(fā)明的另一優(yōu)選的實(shí)施方案是防止動物神經(jīng)退化的方法，包括給動物使用有效量的具有FKBP型親免蛋白親和性的FKBP抑制劑化合物以防止神經(jīng)退化，其中FKBP型親免蛋白表現(xiàn)有旋轉(zhuǎn)異構(gòu)酶活性而哌可酸衍生物抑制所述親免蛋白的旋轉(zhuǎn)異構(gòu)酶活性。
附圖簡述

圖1是實(shí)施例15的量效曲線。圖1給出了用6-10個不同的濃度的數(shù)據(jù)得到典型的量效曲線，從其中計算ED50值。
圖2是實(shí)施例22的量效曲線。圖2給出了用6-10個不同的濃度的數(shù)據(jù)得到典型的量效曲線，從其中計算ED50值。
圖3是感覺神經(jīng)元對藥物營養(yǎng)作用的反應(yīng)的典型顯微照片。圖3顯示了在培養(yǎng)的感覺神經(jīng)元中實(shí)施例21的量效曲線。
圖4是感覺神經(jīng)元對藥物營養(yǎng)作用的反應(yīng)的典型顯微照片。圖4顯示了在培養(yǎng)的感覺神經(jīng)元中300pM的實(shí)施例15對軸突突起的作用。
圖5是感覺神經(jīng)元對藥物營養(yǎng)作用的反應(yīng)的典型顯微照片。圖5顯示了在培養(yǎng)的感覺神經(jīng)元中1nM的實(shí)施例22對軸突突起的作用。
發(fā)明詳述本發(fā)明的新的神經(jīng)營養(yǎng)FKBP抑制劑化合物對FK506結(jié)合蛋白如FKBP-12具有親和力。當(dāng)本發(fā)明的神經(jīng)營養(yǎng)化合物結(jié)合FKBP時，已發(fā)現(xiàn)它們抑制結(jié)合蛋白的脯氨酰基肽基順反異構(gòu)酶活性或旋轉(zhuǎn)異構(gòu)酶活性并出人意料地刺激軸突生長。
本發(fā)明的化合物可以以與無機(jī)酸或有機(jī)酸或堿形成的鹽的形式使用。這樣的酸加成鹽包括乙酸鹽、己二酸鹽、藻酸鹽、天冬氨酸鹽、苯甲酸鹽、苯磺酸鹽、酸式硫酸鹽、丁酸鹽、枸櫞酸鹽、樟腦酸鹽、樟腦磺酸鹽、環(huán)戊基丙酸鹽、二葡糖酸鹽、十二烷基磺酸鹽、乙磺酸鹽、富馬酸鹽、葡糖庚酸鹽、甘油磷酸鹽、半硫酸鹽、庚酸鹽、己酸鹽、鹽酸鹽、氫溴酸鹽、氫碘酸鹽、2-羥基乙磺酸鹽、乳酸鹽、馬來酸鹽、甲磺酸鹽、2-萘磺酸鹽、煙酸鹽、草酸鹽、雙羥萘酸鹽、果膠酸鹽、丙酸鹽、琥珀酸鹽、酒石酸鹽、硫氰酸鹽、甲苯磺酸鹽和十一烷酸鹽。堿加成鹽包括銨鹽、堿金屬鹽如鈉鹽和鉀鹽、堿土金屬鹽如鈣鹽和鎂鹽，與有機(jī)堿形成的鹽如二環(huán)己胺鹽、N-甲基-D-葡糖胺鹽，及與氨基酸如精氨酸、賴氨酸等形成的鹽。同樣，堿性含氮基團(tuán)可以被如下試劑季胺化，如低級烷基鹵代物，如甲基、乙基、丙基和丁基的氯化物、溴化物及碘化物；二烷基硫酸鹽如二甲基、二乙基、二丁基和二戊基硫酸鹽；長鏈鹵代物如癸基、十二烷基、十四烷基和硬脂基氯化物、溴化物和碘化物；芳烷基鹵代物如芐基和苯乙基溴化物；等等。于是，得到水或油溶性或分散性產(chǎn)品。
本發(fā)明的神經(jīng)營養(yǎng)化合物可定期給進(jìn)行神經(jīng)紊亂治療或因其它原因需要刺激神經(jīng)元再生和生長的患者使用，如用于與神經(jīng)退化有關(guān)的多種外周神經(jīng)營養(yǎng)和神經(jīng)紊亂。本發(fā)明的化合物也可給人以外的動物使用以治療哺乳動物的多種神經(jīng)紊亂。
本發(fā)明的新化合物是旋轉(zhuǎn)異構(gòu)酶的強(qiáng)力抑制劑并具有優(yōu)異的神經(jīng)營養(yǎng)活性。此活性對刺激損傷的神經(jīng)元、促進(jìn)神經(jīng)元再生、防止神經(jīng)退化及治療已知與神經(jīng)元退化及外周神經(jīng)疾病有關(guān)的若干神經(jīng)紊亂是有益的。可治療的神經(jīng)紊亂包括但不限于三叉神經(jīng)痛、舌咽神經(jīng)痛、貝爾麻痹、重癥肌無力、肌營養(yǎng)不良、漸進(jìn)性肌萎縮、漸進(jìn)性延髓遺傳性肌萎縮、突出的、破裂的或下垂的椎間盤綜合征、頸脊關(guān)節(jié)強(qiáng)硬、神經(jīng)叢紊亂、胸廓出口破壞綜合征、如由鉛、達(dá)普宋、蜱引起的外周神經(jīng)疾病、卟啉癥或林-巴二氏多神經(jīng)綜合征、阿爾茨海默病及帕金森病。
為此，本發(fā)明的化合物可以口服、非腸道、噴霧吸入、局部、直腸、鼻內(nèi)、口腔、陰道或通過埋植儲藥器給藥，其制劑中含有常規(guī)無毒藥用載體、輔劑和賦形劑。本文中術(shù)語非腸道給藥包括皮下、靜脈、肌肉、腹膜內(nèi)、鞘內(nèi)注射或輸液技術(shù)。
為了對靶中樞神經(jīng)系統(tǒng)有療效，當(dāng)外周給藥時，親免蛋白-藥物復(fù)合物應(yīng)容易地通過血腦屏障。不能通過血腦屏障的本發(fā)明的化合物可通過心室內(nèi)有效地給藥。
藥物組合物可以是滅菌注射制劑，例如，含水或含油滅菌注射混懸液。此混懸液可以按照本領(lǐng)域已知技術(shù)使用適宜的分散劑或濕潤劑及混懸劑配制。此滅菌注射制劑也可以是存在于無毒非腸道給藥用稀釋劑或溶劑(如作為溶液，在1，3-丁二醇中)的滅菌注射溶液或混懸液。在可接受的載體和溶劑中，可以使用水、Ringer溶液及等滲氯化鈉溶液。此外，滅菌的固定油可方便地用作溶劑或混懸基質(zhì)。為此，可使用任何刺激性小的固定油，包括合成的單或二甘油酯。脂肪酸如油酸及其甘油酯衍生物可用于注射劑中，橄欖油或蓖麻油，特別是以其聚氧乙烯化的形式。這些油溶液或混懸液中也可含有長鏈醇稀釋劑或分散劑。
這些化合物可以以膠囊、片劑或含水混懸液或溶液等形式口服。對于口服用片劑，通常使用的載體包括乳糖和玉米淀粉。一般也加入潤滑劑，如硬脂酸鎂。口服給藥的膠囊形式中，可使用的稀釋劑包括乳糖和干燥的玉米淀粉。當(dāng)需要口服含水混懸液時，活性成分與乳化劑和混懸劑結(jié)合。如果需要，可加入某些甜味劑和／或調(diào)味劑和／或著色劑。
本發(fā)明的化合物也可以栓劑的形式直腸給藥。這些組合物可以通過將藥物與適宜的無刺激賦形劑混合，該賦形劑在室溫是固體而在直腸溫度熔化以釋放藥物。這樣的物質(zhì)包括可可油、蜂蠟和聚乙二醇類。
本發(fā)明的化合物也可局部給藥，特別是當(dāng)所治療的發(fā)病部位或器官可容易地通過局部給藥接近時，包括眼部、皮膚或近端腸道的神經(jīng)紊亂。適宜的局部給藥制劑對這些領(lǐng)域的每個技術(shù)人員來說是容易制備的。
為了眼科使用，這些化合物可以在等滲的、pH適當(dāng)?shù)臏缇}水，配制成微?；幕鞈乙?，或優(yōu)選配制成等滲的、pH適當(dāng)?shù)臏缇}水溶液，其中含或不含防腐劑如氯芐烷胺。或者為了眼科使用，這些化合物可以在膏如凡士林中配制。
為了皮膚局部使用，這些化合物可以在適宜的膏中配制，其中化合物懸浮或溶解在，例如，一種或多種下列物質(zhì)的混合物中礦物油、液體石蠟、白凡士林、丙二醇、聚氧乙烯聚氧丙烯化合物、乳化蠟和水?；蛘撸@些化合物可以在適宜的洗劑或霜中配制，其中所含化合物懸浮或溶解在，例如，一種或多種下列物質(zhì)的混合物中礦物油、脫水山梨醇單硬脂酸酯、多乙氧基醚60、鯨臘酯、十六烷基硬脂醇、2-辛基十二醇、芐醇和水。
為了近端腸道局部使用，可以配制成直腸栓劑(見上)或使用的灌腸劑。
在治療損傷疾病中，活性化合物組份劑量水平為約0．1mg至約10000mg是有利的，優(yōu)選劑量為約0．1mg至約1000mg?？梢耘c載體物質(zhì)混合制成單劑量形式的活性組份的量可根據(jù)接受治療的患者及特定的給藥方式變化。
但是，應(yīng)理解的是，對任何特定患者的特定劑量應(yīng)依賴于多種因素，包括所用特定化合物的活性、年齡、體重、總的健康狀況、性別、飲食、給藥時間、排泄途徑、聯(lián)合用藥及所治療特定疾病的嚴(yán)重程度以及給藥形式。
這些化合物可以與其它神經(jīng)營養(yǎng)試劑如神經(jīng)營養(yǎng)生長因子(NGF)、神經(jīng)膠質(zhì)來源的生長因子、腦來源的生長因子、睫神經(jīng)營養(yǎng)因子及神經(jīng)營養(yǎng)蛋白-3。其它神經(jīng)營養(yǎng)藥物的劑量可依賴于上述因素及藥物組合的神經(jīng)營養(yǎng)作用。
方法和步驟在小雞背根神經(jīng)節(jié)中由親免蛋白的非免疫抑制配體引起神經(jīng)延伸在以前的研究中，已觀察到在鼠背根神經(jīng)節(jié)的外植物中免疫抑制藥物的神經(jīng)營養(yǎng)作用，F(xiàn)K506濃度低至1皮摩爾也能顯著加強(qiáng)神經(jīng)突起(Lyons等，1994)。在此鼠神經(jīng)節(jié)中，即使在NGF不存在時也觀察到了FK506的神經(jīng)營養(yǎng)作用。在現(xiàn)在的工作中，使用了小雞背根神經(jīng)節(jié)，它們是較早用來研究神經(jīng)突起的物質(zhì)。不存在NGF時，我們觀察到親免蛋白配體藥物的最小作用。小雞細(xì)胞比PC-12細(xì)胞對NGF更敏感，故我們使用0．1ng／ml NGF產(chǎn)生最小的軸突突起并顯示親免蛋白配體的神經(jīng)營養(yǎng)作用(圖5)。
突起數(shù)量的最大增加，其長度和分支在親免蛋白配體和NGF(100ng／ml)的最有效濃度非常近似。隨著不同藥物的濃度逐漸增加，觀察到較大數(shù)量的突起、更延伸的分支和較長的個體突起。
我們通過檢測肽基-脯氨?；悩?gòu)酶活性的抑制和3H-FK506結(jié)合重組FKBP-12的抑制(表1)評價藥物結(jié)合FKBP-12的能力。在刺激軸突突起及抑制旋轉(zhuǎn)異構(gòu)酶活性的能力之間存在顯著的平行性。
在藥物結(jié)合親免蛋白、抑制其旋轉(zhuǎn)異構(gòu)酶活性和刺激軸突突起的能力之間存在非常緊密的聯(lián)系，說明旋轉(zhuǎn)異構(gòu)酶活性的抑制是藥物的神經(jīng)營養(yǎng)作用的直接原因。藥物在刺激軸突突起和結(jié)合親免蛋白方面的超常高的能力使其與任何其它可引起神經(jīng)營養(yǎng)作用的手段極不相同。
由于這些藥物超常的能力及旋轉(zhuǎn)異構(gòu)酶抑制和神經(jīng)營養(yǎng)作用之間的緊密聯(lián)系，我們推斷旋轉(zhuǎn)異構(gòu)酶抑制也參與神經(jīng)營養(yǎng)作用。已報道了一些蛋白是親免蛋白的旋轉(zhuǎn)異構(gòu)酶活性的底物，包括膠原(Steinmann等，1991)和轉(zhuǎn)移酶(transferring)(Lodish and King，1991)。最近，已報道高度純化的ryanodine受體和IP-3受體(主要細(xì)胞間鈣離子通道)制劑，存在于與FKBP-12的復(fù)合物中。由這些復(fù)合物中解離FKBP-12引起鈣離子通道變得“泄漏”(Cameron等，1995)。鈣離子流參與軸突的延伸，故IP-3受體和ryanodine受體可能參與藥物的神經(jīng)營養(yǎng)作用。因?yàn)樗幬锱cIP-3受體和ryanodine受體在FKBP-12上結(jié)合同樣的位點(diǎn)，人們可推斷這些藥物從FKBP-12上置換了通道。尚未有報道說明這些鈣離子通道與親環(huán)蛋白的相互作用，故此模型不能解釋環(huán)孢菌素A的神經(jīng)營養(yǎng)作用。
本文中，在極低的濃度進(jìn)行藥物的神經(jīng)營養(yǎng)作用的研究，這表明其較如腦來源的生長因子、神經(jīng)營養(yǎng)蛋白-3及神經(jīng)營養(yǎng)生長因子等神經(jīng)營養(yǎng)蛋白能力更強(qiáng)。
下列實(shí)施例舉例說明了本發(fā)明一些的實(shí)施方案，并不是以此來限制本發(fā)明。所有聚合物分子量是平均分子量。除非另外說明所有百分比是基于最后給藥系統(tǒng)或制劑的治療百分比，而所有總量等于100％(重量)。
可用于本發(fā)明目的的示例性一般FKBP抑制劑化合物包括
及其藥用鹽，其中A是CH2、O、NH或N-(C1-C4烷基)；其中B和D獨(dú)立地是Ar、(C5-C7)環(huán)烷基取代的(C1-C6)直鏈或支鏈烷基或鏈烯基、(C5-C7)環(huán)烯基取代的(C1-C6)直鏈或支鏈烷基或鏈烯基、或者Ar取代的(C1-C6)直鏈或支鏈烷基或鏈烯基，其中在每種情況下，直鏈或支鏈烷基或鏈烯基中的一個或兩個碳原子可以以化學(xué)容許的取代方式被1-2個雜原子取代，雜原子選自氧原子、硫原子、SO及SO2，或者
其中Q是氫原子、(C1-C6)直鏈或支鏈烷基或(C1-C6)直鏈或支鏈鏈烯基；其中T是Ar或取代基在3位和4位的取代的5-7元環(huán)烷基，取代基獨(dú)立地選自氫原子、羥基、O-(C1-C4)烷基或O-(C1-C4)鏈烯基及羰基；其中Ar選自1-萘基、2-萘基、2-呋喃基、3-呋喃基、2-噻吩基、3-噻吩基、2-吡啶基、3-吡啶基、4-吡啶基和苯基，單環(huán)及每個環(huán)為5或6元的二環(huán)雜環(huán)系統(tǒng)，其中在兩個環(huán)之一或兩個環(huán)上可含有總共1-4個雜原子，這些雜原子獨(dú)立地選自氧原子、氮原子和硫原子；其中Ar可以含有一至三個取代基，這些取代基獨(dú)立地選自氫原子、鹵原子、羥基、羥甲基、硝基、CF3、三氟甲氧基、(C1-C6)直鏈或支鏈烷基或(C1-C6)直鏈或支鏈鏈烯基、O-(C1-C4)直鏈或支鏈烷基或O-(C1-C4)直鏈或支鏈鏈烯基、O-芐基、O-苯基、氨基、1，2-亞甲二氧基、羰基及苯基；其中L是氫原子或U；M是氧原子或CH-U，條件是如果L是氫原子，那么M是CH-U，或如果M是氧原子，則L是U；其中U是氫原子、O-(C1-C4)直鏈或支鏈烷基或O-(C1-C4)直鏈或支鏈鏈烯基、(C1-C6)直鏈或支鏈烷基或(C1-C6)直鏈或支鏈鏈烯基、(C5-C7)環(huán)烷基、取代有(C1-C4)直鏈或支鏈烷基或(C1-C4)直鏈或支鏈鏈烯基的(C5-C7)環(huán)烯基、[(C1-C4)烷基或(C1-C4)鏈烯基]-Ar或Ar(Ar如上所述)；其中J是氫原子或C1或C2烷基或芐基；K是(C1-C4)直鏈或支鏈烷基、芐基或環(huán)己基乙基；或者其中J和K可以一起形成5-7元雜環(huán)，該雜環(huán)上可以含氧原子、硫原子、SO或SO2；而其中n是0-3。
在1位(式I)的立體化學(xué)構(gòu)型是(R)或(S)，優(yōu)選(S)。2位的立體化學(xué)構(gòu)型是(R)或(S)。
可以用于本發(fā)明目的的示例性優(yōu)選FKBP抑制劑化合物描述于美國專利US5330993，其中內(nèi)容引入本文作為參考?；衔锏膶?shí)例包括具有下式的化合物及其藥用鹽
其中A是O、NH或N-(C1-C4烷基)；其中B氫原子、CHL-Ar、(C1-C6)直鏈或支鏈烷基、(C1-C6)直鏈或支鏈烷基或鏈烯基、(C5-C7)環(huán)烷基、(C5-C7)環(huán)烯基或者Ar取代的(C1-C6)直鏈或支鏈烷基或鏈烯基，或者
其中L和Q獨(dú)立地是氫原子、(C1-C6)直鏈或支鏈烷基或(C1-C6)直鏈或支鏈鏈烯基；其中T是Ar或取代基在3位和4位的取代的環(huán)己基，取代基獨(dú)立地選自氫原子、羥基、O-(C1-C4)烷基或O-(C1-C4)鏈烯基及羰基；其中Ar選自1-萘基、2-萘基、2-呋喃基、3-呋喃基、2-噻吩基、2-吡啶基、3-吡啶基、4-吡啶基和苯基，其上有1至3個取代基，這些取代基獨(dú)立地選自氫原子、鹵原子、羥基、硝基、CF3、(C1-C6)直鏈或支鏈烷基或(C1-C6)直鏈或支鏈鏈烯基、O-(C1-C4)烷基或O-(C1-C4)鏈烯基、O-芐基、O-苯基、氨基和苯基；其中D是氫原子或U；E是氧原子或CH-U，條件是如果D是氫原子，那么E是CH-U，或如果E是氧原子，則D是U；其中U是氫原子、O-(C1-C4)直鏈或支鏈烷基或O-(C1-C4)直鏈或支鏈鏈烯基、(C1-C6)直鏈或支鏈烷基或(C1-C6)直鏈或支鏈鏈烯基、(C5-C7)環(huán)烷基、取代有(C1-C4)直鏈或支鏈烷基或(C1-C4)直鏈或支鏈鏈烯基的(C5-C7)環(huán)烯基、2-吲哚基、3-吲哚基、[(C1-C4)烷基或(C1-C4)鏈烯基]-Ar或Ar(Ar如上所述)；其中J是氫原子或C1或C2烷基或芐基；K是(C1-C4)直鏈或支鏈烷基、芐基或環(huán)已基乙基；或者其中J和K可以一起形成5-7元雜環(huán)，該雜環(huán)上可以含氧原子、硫原子、SO或SO2。
在1位(式Ⅰ)的立體化學(xué)構(gòu)型是(R)或(S)，優(yōu)選(S)。
K1試驗(yàn)步驟通過文獻(xiàn)(Harding，M．W．等，自然 341∶758-760(1989)；Holt等，美國化學(xué)聯(lián)合會雜志115∶9923-9938)描述的已知方法評價本文中使用的化合物對肽基-脯氨?；悩?gòu)酶(旋轉(zhuǎn)異構(gòu)酶)活性的抑制。這些值以明顯的K′s獲得并在表Ⅰ中列出了多種化合物的值。結(jié)合在模型底物N-琥珀?；?Ala-Ala-Pro-Phe-對硝基苯胺上的丙氨酸-脯氨酸的順反異構(gòu)作用，在本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的糜蛋白酶偶合試驗(yàn)中用分光光度檢測方法監(jiān)控，由反式底物上釋放對硝基苯胺。加入不同濃度的抑制劑測定對此反應(yīng)的抑制，以一級速率常數(shù)中的變化分析這些數(shù)據(jù)作為抑制劑濃度的功能，得到表觀K值。
在塑料透明小容器中，加入950ml冰冷的試驗(yàn)緩沖液(25mMHEPES，pH7．8，100mM NaCl)、10ml FKBP(2．5mM，在10ml Tris-ClpH7．5、100mM NaCl、1mM二硫蘇糖醇中)、25ml糜蛋白酶(50mg／ml，在1mM HCl中)和10ml存在于二甲基亞砜中的不同濃度的試驗(yàn)化合物。加入5ml底物(N-琥珀?；?Ala-Ala-Pro-Phe-對硝基苯胺，5mg／ml，在2．35mM LiCl的三氟乙醇溶液中)引發(fā)反應(yīng)。
用分光光度計監(jiān)控90秒在390nm的吸收率與時間并用吸收率與時間數(shù)據(jù)確定速率常數(shù)。
這些試驗(yàn)的數(shù)據(jù)列于表Ⅰ和Ⅳ中。
表Ⅰ
表Ⅱ
小雞背根神經(jīng)節(jié)培養(yǎng)物和軸突突起由妊娠10天的小雞胚胎分離背根神經(jīng)節(jié)。在37℃，5％二氧化碳環(huán)境中，在薄層Matrigel包被的12孔板中培養(yǎng)整個神經(jīng)節(jié)移植物，培養(yǎng)基含Liebovitz加高葡糖基質(zhì)，其中補(bǔ)充有2mM葡糖胺和10％胎牛血清，并還含有10μM胞嘧啶β-D阿糖胞苷(Ara C)。24小時后，用不同濃度的神經(jīng)生長因子、親免蛋白配體或NGF加藥物的結(jié)合形式處理DRGs。藥物處理48小時后，用Zeiss Axiovert倒置顯微鏡在相差或Hoffman Modulation相差下看到神經(jīng)節(jié)。制作這些移植物的顯微照片，并定量測定軸突的突起。軸突比DRG直徑長被記為陽性，每個試驗(yàn)條件都定量測定軸突的總數(shù)。每孔培養(yǎng)3或4個DRGs，且每種處理進(jìn)行同樣的兩份。用6-10個不同濃度的數(shù)值作量效曲線，由其計算ED50值。典型的反應(yīng)曲線示于圖1和圖2，分別是實(shí)施例15和22。
這些試驗(yàn)的數(shù)據(jù)列于表Ⅲ和Ⅳ。對藥物的營養(yǎng)作用的反應(yīng)的感覺神經(jīng)元的典型顯微照片見圖3-5。圖3顯示了實(shí)施例21對神經(jīng)元培養(yǎng)物的劑量依賴性神經(jīng)營養(yǎng)作用。圖4顯示了由300pM量的實(shí)施例15引起的對軸突突起的刺激，而圖5顯示了由1nM實(shí)施例20引起的對軸突突起的刺激。
表Ⅲ小雞DRG中軸突的突起
表Ⅳ生物結(jié)果
本發(fā)明描述如上，同樣的形式可以有多種變化形式是顯而易見的。這樣的變化是不背離本發(fā)明的實(shí)質(zhì)和范圍，且所有這樣的變化形式將包括在下面的權(quán)利要求的范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1．治療動物神經(jīng)活性的方法，其中包括給動物使用有效量的下式的哌可酸衍生物及其藥用鹽，
其中其中A是CH2、O、NH或N-(C1-C4烷基)；其中B和D獨(dú)立地是Ar、(C5-C7)環(huán)烷基取代的(C1-C6)直鏈或支鏈烷基或鏈烯基、(C5-C7)環(huán)烯基取代的(C1-C6)直鏈或支鏈烷基或鏈烯基、或者Ar取代的(C1-C6)直鏈或支鏈烷基或鏈烯基，其中在每種情況下，直鏈或支鏈烷基或鏈烯基中的一個或兩個碳原子可以以化學(xué)容許的取代方式被1-2個雜原子取代，雜原子選自氧原子、硫原子、SO及SO2，或者
其中Q是氫原子、(C1-C6)直鏈或支鏈烷基或(C1-C6)直鏈或支鏈鏈烯基；其中T是Ar或取代基在3位和4位的取代的5-7元環(huán)烷基，取代基獨(dú)立地選自氫原子、羥基、O-(C1-C4)烷基或O-(C1-C4)鏈烯基及羰基；其中Ar選自1-萘基、2-萘基、2-呋喃基、3-呋喃基、2-噻吩基、3-噻吩基、2-吡啶基、3-吡啶基、4-吡啶基和苯基，單環(huán)及每個環(huán)為5或6元的二環(huán)雜環(huán)系統(tǒng)，其中在兩個環(huán)之一或兩個環(huán)上可含有總共1-4個雜原子，這些雜原子獨(dú)立地選自氧原子、氮原子和硫原子；其中Ar可以含有一至三個取代基，這些取代基獨(dú)立地選自氫原子、鹵原子、羥基、羥甲基、硝基、CF3、三氟甲氧基、(C1-C6)直鏈或支鏈烷基或(C1-C6)直鏈或支鏈鏈烯基、O-(C14-C4)直鏈或支鏈烷基或O-(C1-C4)直鏈或支鏈鏈烯基、O-芐基、O-苯基、氨基、1，2-亞甲二氧基、羰基及苯基；其中L是氫原子或U；M是氧原子或CH-U，條件是如果L是氫原子，那么M是CH-U，或如果M是氧原子，則L是U；其中U是氫原子、O-(C1-C4)直鏈或支鏈烷基或O-(C1-C4)直鏈或支鏈鏈烯基、(C1-C6)直鏈或支鏈烷基或(C1-C6)直鏈或支鏈鏈烯基、(C5-C7)環(huán)烷基、取代有(C1-C4)直鏈或支鏈烷基或(C1-C4)直鏈或支鏈鏈烯基的(C5-C7)環(huán)烯基、[(C1-C4)烷基或(C1-C4)鏈烯基]-Ar或Ar(Ar如上所述)；其中J是氫原子或C1或C2烷基或芐基；K是(C1-C4)直鏈或支鏈烷基、芐基或環(huán)己基乙基；或者其中J和K可以一起形成5-7元雜環(huán)，該雜環(huán)上可以含氧原子、硫原子、SO或SO2；其中n是0-3；其中所述哌可酸衍生物對FKBP型親免蛋白具有親和力，所述給藥刺激損傷的外周神經(jīng)的生長或促進(jìn)神經(jīng)元再生，此FKBP型親免蛋白具有旋轉(zhuǎn)異構(gòu)酶活性，且此哌可酸衍生物抑制所述親免蛋白的旋轉(zhuǎn)異構(gòu)酶活性。
2．權(quán)利要求1的方法，其中神經(jīng)元活性選自刺激損傷的神經(jīng)元，促進(jìn)神經(jīng)元再生，防止神經(jīng)退化和治療神經(jīng)紊亂。
3．權(quán)利要求2的方法，其中所述神經(jīng)紊亂選自由物理損傷或疾病、腦物理損傷、脊髓物理損傷、與腦損傷有關(guān)的休克及與神經(jīng)退化有關(guān)的神經(jīng)紊亂引起的外周神經(jīng)疾病。
4．權(quán)利要求3的方法，其中神經(jīng)紊亂選自阿爾茨海默病和帕金森病。
5．權(quán)利要求1的方法，其中哌可酸衍生物化合物是免疫抑制或非免疫抑制劑。
6．治療動物神經(jīng)活性的方法，包括給動物使用有效量的、對FKBP型親免蛋白具有親和力的、權(quán)利要求1所述的哌可酸衍生物，該衍生物與有效量的神經(jīng)營養(yǎng)因子結(jié)合使用，以刺激損傷的外周神經(jīng)的生長或促進(jìn)神經(jīng)元再生，其中神經(jīng)營養(yǎng)因子選自神經(jīng)營養(yǎng)生長因子、腦來源的生長因子、神經(jīng)膠質(zhì)來源的生長因子、睫神經(jīng)營養(yǎng)因子及神經(jīng)營養(yǎng)蛋白-3，其中FKBP型親免蛋白具有旋轉(zhuǎn)異構(gòu)酶活性而哌可酸衍生物抑制所述親免蛋白的旋轉(zhuǎn)異構(gòu)酶活性。
7．權(quán)利要求6的方法，其中神經(jīng)元活性選自刺激損傷的神經(jīng)元，促進(jìn)神經(jīng)元再生，防止神經(jīng)退化和治療神經(jīng)紊亂。
8．權(quán)利要求7的方法，其中所述神經(jīng)紊亂選自由物理損傷或疾病、腦物理損傷、脊髓物理損傷、與腦損傷有關(guān)的休克及與神經(jīng)退化有關(guān)的神經(jīng)紊亂引起的外周神經(jīng)疾病。
9．權(quán)利要求6的方法，其中神經(jīng)紊亂選自阿爾茨海默病和帕金森病。
10．權(quán)利要求6的方法，其中哌可酸衍生物化合物是免疫抑制或非免疫抑制劑。
11．刺激損傷的外周神經(jīng)生長的方法，包括給損傷的外周神經(jīng)使用有效量的、對FKBP型親免蛋白具有親和力的、權(quán)利要求1所述的哌可酸衍生物，以刺激或促進(jìn)損傷的外周神經(jīng)的生長，其中FKBP型親免蛋白具有旋轉(zhuǎn)異構(gòu)酶活性而哌可酸衍生物抑制所述親免蛋白的旋轉(zhuǎn)異構(gòu)酶活性。
12．權(quán)利要求11的方法，其中進(jìn)一步包括使用神經(jīng)營養(yǎng)因子刺激或促進(jìn)損傷的外周神經(jīng)的生長，其中神經(jīng)營養(yǎng)因子選自神經(jīng)營養(yǎng)生長因子、腦來源的生長因子、神經(jīng)膠質(zhì)來源的生長因子、睫神經(jīng)營養(yǎng)因子及神經(jīng)營養(yǎng)蛋白-3。
13．權(quán)利要求11的方法，其中哌可酸衍生物化合物是免疫抑制或非免疫抑制劑。
14．促進(jìn)動物神經(jīng)元再生和生長的方法，包括給動物使用有效量的、對FKBP型親免蛋白具有親和力的、權(quán)利要求1所述的哌可酸衍生物，以促進(jìn)神經(jīng)元再生，其中FKBP型親免蛋白具有旋轉(zhuǎn)異構(gòu)酶活性而哌可酸衍生物抑制所述親免蛋白的旋轉(zhuǎn)異構(gòu)酶活性。
15．權(quán)利要求14的方法，其中進(jìn)一步包括使用有效量的神經(jīng)營養(yǎng)因子促進(jìn)神經(jīng)元再生，其中神經(jīng)營養(yǎng)因子選自神經(jīng)營養(yǎng)生長因子、腦來源的生長因子、神經(jīng)膠質(zhì)來源的生長因子、睫神經(jīng)營養(yǎng)因子及神經(jīng)營養(yǎng)蛋白-3。
16．權(quán)利要求14的方法，其中哌可酸衍生物化合物是免疫抑制或非免疫抑制劑。
17．防止動物神經(jīng)退化的方法，包括給動物使用有效量的、對FKBP型親免蛋白具有親和力的、權(quán)利要求1所述的哌可酸衍生物，以防止神經(jīng)退化，其中FKBP型親免蛋白具有旋轉(zhuǎn)異構(gòu)酶活性而哌可酸衍生物抑制所述親免蛋白的旋轉(zhuǎn)異構(gòu)酶活性。
18．權(quán)利要求17的方法，其中進(jìn)一步包括使用有效量的神經(jīng)營養(yǎng)因子防止神經(jīng)退化，其中神經(jīng)營養(yǎng)因子選自神經(jīng)營養(yǎng)生長因子、腦來源的生長因子、神經(jīng)膠質(zhì)來源的生長因子、睫神經(jīng)營養(yǎng)因子及神經(jīng)營養(yǎng)蛋白-3。
19．權(quán)利要求17的方法，其中哌可酸衍生物化合物是免疫抑制或非免疫抑制劑。
20．權(quán)利要求1所述的治療神經(jīng)活性的方法，其中包括給動物使用有效量的下式哌可酸衍生物及其藥用鹽，
其中A是O、NH或N-(C1-C4烷基)；其中B氫原子、CHL-Ar、(C1-C6)直鏈或支鏈烷基、(C1-C6)直鏈或支鏈烷基或鏈烯基、(C5-C7)環(huán)烷基、(C5-C7)環(huán)烯基或者Ar取代的(C1-C6)直鏈或支鏈烷基或鏈烯基，或者
其中L和Q獨(dú)立地是氫原子、(C1-C6)直鏈或支鏈烷基或(C1-C6)直鏈或支鏈鏈烯基；其中T是Ar或取代基在3位和4位的取代的環(huán)己基，取代基獨(dú)立地選自氫原子、羥基、O-(C1-C4)烷基或O-(C1-C4)鏈烯基及羰基；其中Ar選自1-萘基、2-萘基、2-呋喃基、3-呋喃基、2-噻吩基、2-吡啶基、3-吡啶基、4-吡啶基和苯基，其上有1至3個取代基，這些取代基獨(dú)立地選自氫原子、鹵原子、羥基、硝基、CF3、(C1-C6)直鏈或支鏈烷基或(C1-C6)直鏈或支鏈鏈烯基、O-(C1-C4)烷基或O-(C1-C4)鏈烯基、O-芐基、O-苯基、氨基和苯基；其中D是氫原子或U；E是氧原子或CH-U，條件是如果D是氫原子，那么E是CH-U，或如果E是氧原子，則D是U；其中U是氫原子、O-(C1-C4)直鏈或支鏈烷基或O-(C1-C4)直鏈或支鏈鏈烯基、(C1-C6)直鏈或支鏈烷基或(C1-C6)直鏈或支鏈鏈烯基、(C5-C7)環(huán)烷基、取代有(C1-C4)直鏈或支鏈烷基或(C1-C4)直鏈或支鏈鏈烯基的(C5-C7)環(huán)烯基、2-吲哚基、3-吲哚基、[(C1-C4)烷基或(C1-C4)鏈烯基]-Ar或Ar(Ar如上所述)；其中J是氫原子或C1或C2烷基或芐基；K是(C1-C4)直鏈或支鏈烷基、芐基或環(huán)己基乙基；或者其中J和K可以一起形成5-7元雜環(huán)，該雜環(huán)上可以含氧原子、硫原子、SO或SO2。
全文摘要
本發(fā)明涉及用對FKBP型親免蛋白具有親和力的特別配制的神經(jīng)營養(yǎng)哌可酸衍生物作為與親免蛋白有關(guān)的酶活性的抑制劑,特別是肽基－脯氨酸基異構(gòu)酶或旋轉(zhuǎn)異構(gòu)酶活性的抑制劑,以刺激或促進(jìn)神經(jīng)元生長或再生。
文檔編號A61K31/40GK1205635SQ96199127
公開日1999年1月20日 申請日期1996年8月26日 優(yōu)先權(quán)日1996年8月26日
發(fā)明者J·P·斯泰納, G·S·哈米爾頓 申請人:吉爾福特藥品有限公司