專利名稱：治療玻璃體內(nèi)出血的酶學(xué)方法與組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明一般涉及用于人類或其他哺乳動物眼睛治療用藥的酶制劑，并特別涉及a)利用一種或多種酶加速從哺乳動物眼睛玻璃體出血清除血液的方法和b)用于眼科給藥的一種改進(jìn)的透明酯酸酶。
背景技術(shù)：
i.人類眼睛的解剖在人類，眼睛的解剖包括位于晶狀體之后幾乎占眼球腔五分之四的“玻璃體”。該玻璃體由凝膠狀物質(zhì)，即所謂的玻璃液形成。一般說，正常人眼睛的玻璃液含約99％的水和1％的大分子物質(zhì)包括膠原，透明酯酸，可溶性糖蛋白，糖和其他低分子量代謝物。
視網(wǎng)膜基本上是眼球后表面內(nèi)側(cè)形成的一層神經(jīng)組織。視網(wǎng)膜由稱做脈絡(luò)膜的一層細(xì)胞所包繞。視網(wǎng)膜可被分成a)參與視覺機(jī)制的光學(xué)部分和b)不參與視覺機(jī)制的非光學(xué)部分。視網(wǎng)膜的光學(xué)部分含視桿和視錐，它們是視覺效應(yīng)器。許多動脈和靜脈在視網(wǎng)膜的中心進(jìn)入視網(wǎng)膜，并向外展開以提供血液循環(huán)到視網(wǎng)膜。
玻璃體的后部直接與視網(wǎng)膜相接觸。原纖維束網(wǎng)絡(luò)從視網(wǎng)膜延伸并分布或深入玻璃體以至使玻璃體與視網(wǎng)膜相接。
ii.玻璃體內(nèi)出血的病因，治療及臨床后遺癥糖尿病視網(wǎng)膜病變，創(chuàng)傷和其他眼科疾病有時(shí)導(dǎo)致視網(wǎng)膜血管破壞或滲漏結(jié)果出血到眼睛的玻璃液中(即“玻璃體內(nèi)出血”)。這種玻璃體內(nèi)出血一般表現(xiàn)為玻璃液渾濁或不透明。
玻璃體內(nèi)出血有時(shí)但不總是伴隨視網(wǎng)膜的撕裂或分離。在玻璃體內(nèi)出血伴隨視網(wǎng)膜撕裂或分離的情況，重要的是應(yīng)該對這種視網(wǎng)膜撕裂或分離做及時(shí)診斷和手術(shù)修復(fù)。未能及時(shí)診斷和修復(fù)視網(wǎng)膜撕裂或分離則可使該撕裂或分離區(qū)域的視網(wǎng)膜光感受器細(xì)胞形成壞死。這種視網(wǎng)膜光感受器細(xì)胞的壞死可導(dǎo)致視覺喪失。而且，視網(wǎng)膜分離持續(xù)未修復(fù)狀態(tài)一段時(shí)間可導(dǎo)致進(jìn)一步玻璃體內(nèi)出血并/或在出血部位形成纖維組織。這種纖維組織形成可導(dǎo)致玻璃體與視網(wǎng)膜間的不良粘連。
修復(fù)視網(wǎng)膜撕裂或分離所使用的一般手術(shù)方法要求外科醫(yī)師能透過玻璃液觀察，以顯現(xiàn)視網(wǎng)膜受損區(qū)(即“視網(wǎng)膜經(jīng)玻璃體檢查”)。當(dāng)發(fā)生玻璃體內(nèi)出血時(shí)，玻璃體內(nèi)存在的出血血液會使玻璃體變渾濁以至妨礙外科醫(yī)師透過玻璃體觀察視網(wǎng)膜。這種玻璃體出血性渾濁可能需要6-12個(gè)月或更長的時(shí)間才變清澈到足以進(jìn)行視網(wǎng)膜的經(jīng)玻璃體檢查。然而由于對視網(wǎng)膜撕裂或分離的延誤診斷或治療可產(chǎn)生潛在并發(fā)癥，等待發(fā)生如此出血血液的自然清除一般是不期望的。
而且，甚至在無視網(wǎng)膜撕裂或分離相伴隨的玻璃體內(nèi)出血時(shí)，通常難以確認(rèn)并未發(fā)生視網(wǎng)膜撕裂或分離，因?yàn)椴Ａw出血性渾濁使醫(yī)生不能進(jìn)行視網(wǎng)膜常規(guī)眼底鏡檢查。而且，玻璃體內(nèi)存在出血可明顯損傷患者受累眼睛的視力，并且這種出血造成的損害會持續(xù)到所述出血血液被基本或完全清除。。
因此，玻璃體內(nèi)存在出血血液會引起多種臨床問題，包括a)不能肉眼檢查和診斷出血部位和/或視網(wǎng)膜的任何相應(yīng)撕裂或分離，b)受累眼睛的視力全部或部分損害和c)不利和妨礙進(jìn)行一般為修復(fù)出血部位和/或修復(fù)任何伴隨的視網(wǎng)膜撕裂或分離所應(yīng)用的那類經(jīng)玻璃體外科手術(shù)。
在玻璃體內(nèi)出血已導(dǎo)致視網(wǎng)膜大量渾濁或不透明的病歷中，治療醫(yī)師可選擇進(jìn)行所謂的玻璃體切除術(shù)，在手術(shù)中從眼睛內(nèi)側(cè)除去全部(或部分)玻璃體，并用清澈的液體代替。進(jìn)行這種玻璃體切除術(shù)手術(shù)是為使醫(yī)師觀察視網(wǎng)膜足以進(jìn)行必要的視網(wǎng)膜檢查和/或?qū)Τ鲅约叭魏伟殡S的視網(wǎng)膜撕裂或分離的手術(shù)修復(fù)。然而，這種玻璃體切除術(shù)方法是高度技術(shù)密集的，并伴有一些明顯的缺點(diǎn)，風(fēng)險(xiǎn)和并發(fā)癥。這些缺點(diǎn)，風(fēng)險(xiǎn)和并發(fā)癥是潛在的以至去除玻璃體的操作會引起視網(wǎng)膜進(jìn)一步分離或撕裂和/或引起本已脆弱的視網(wǎng)膜血管進(jìn)一步出血。
iii.透明酯酸酶及其他酶的早期應(yīng)用為致力于使進(jìn)行玻璃體切除術(shù)期間引起的視網(wǎng)膜進(jìn)一步分離或撕裂的可能性減到最小，以前在美國專利號5,292,509(Hageman)中曾提出過向玻璃體內(nèi)注射一些無蛋白酶的糖胺聚糖酶，使玻璃體從視網(wǎng)膜分開(uncouple)或“游離”(disinsert)，然后除去玻璃體。這種玻璃體游離或分開旨在使除去玻璃體時(shí)會發(fā)生的視網(wǎng)膜進(jìn)一步撕裂或分離的可能性減到最小。旨在可用于產(chǎn)生這種玻璃體游離的專一性無蛋白酶糖胺聚糖酶的實(shí)例包括；軟骨素酶ABC，軟骨素酶AC，軟骨素酶B，軟骨素4-硫酸酯酶，軟骨素6-硫酸酯酶，透明酯酸酶和β葡糖苷酸酶。
雖然已知透明酯酸酶可用于各種眼科用途，包括在美國專利5,292,509(Hageman)中描述的玻璃體切除術(shù)附屬應(yīng)用，發(fā)表過的研究已經(jīng)表明透明酯酸酶本身對視網(wǎng)膜和/或眼睛的其他解剖學(xué)結(jié)構(gòu)可能是有毒的。參見，玻璃體內(nèi)透明酯酸酶的安全性；Gottleib，J.L.；Antoszyk，A.N.，Hatchell，D.L.和Soloupis，P.，Invest Ophthalmol Vis Sci3111，2345-52(1990)。
有些透明酯酸酶制劑的眼科毒性已由其他研究者所證實(shí)，他們建議在動物模型中用這類透明酯酸酶制劑做為一種毒性刺激劑以引起眼睛的實(shí)驗(yàn)誘導(dǎo)性新血管形成。參見，兔視網(wǎng)膜前新血管形成的實(shí)驗(yàn)動物模型；Antoszyk，A.N.，Gottleib，J.L.，Casey，R.C.，Hatchel，D.L.andMachemer，R.，Invest Ophthalmol Vis Sci 321，46-51(1991)。
遺憾的是，以前不知道所報(bào)道的透明酯酸酶的治療活性和毒性是否普遍適用于所有的透明酯酸酶制劑，或是否這種功效和/或毒性僅適用于含某些賦形劑物質(zhì)的透明酯酸酶制劑或僅適用于特殊來源的透明酯酸酶。這是一項(xiàng)重要的考慮，因?yàn)榍笆龉ぷ髦惺褂玫母鞣N透明酯酸酶制劑隨透明酯酸酶的來源以及透明酯酸酶所結(jié)合的溶劑和/或其他制劑成分而可能有純度和特征(例如分子量分布)的不同。
iv.早期用于眼科給藥的透明酯酸酶制劑之純度及特征術(shù)語“透明酯酸酶”通常用于描述一組內(nèi)切-β葡糖苷酸酶，該酶解聚某些粘多糖，如透明酯酸。Myer，K.等.，酶；第四卷，第二版447頁，科學(xué)出版公司.，紐約(一九六零年)。
透明酯酸酶引起透明酯酸和硫酸軟骨素A和C的內(nèi)切-N-乙?；禾前锋I水解，主要水解成四糖殘基。
明顯證據(jù)表明不同來源的透明酯酸酶在酶的分子量分布和特異酶活性上都不相同。鑒于透明酯酸酶可分離自各種來源，包括牛睪丸，綿羊(ovine)睪丸，某些細(xì)菌如鏈霉菌和某些非脊椎動物如水蛭，這種分子量分布和比酶活性的差異是值得考慮的。
據(jù)報(bào)道Wydase透明酯酸酶制劑以前已經(jīng)為各種臨床和實(shí)驗(yàn)應(yīng)用給哺乳動物眼睛用藥，包括治療青光眼和在從眼睛除去玻璃體的玻璃體切除術(shù)手術(shù)期間促進(jìn)玻璃體液化。
盡管已報(bào)道有些透明酯酸酶制劑在給眼睛注射或局部用藥時(shí)表現(xiàn)出符合要求的治療效果，透明酯酸酶和/或乙基汞硫代水楊酸鈉防腐劑的潛在毒性仍是有關(guān)眼內(nèi)注射制劑常規(guī)臨床給藥安全性的慮及原因。
因此，在本領(lǐng)域存在一種組合和開發(fā)新的透明酯酸酶制劑的需求，該制劑可依足以產(chǎn)生最理想的治療效果又不引起眼睛的毒性的劑量水平給眼睛用藥。
因此，鑒于上述討論的有關(guān)從玻璃體自然出血清除血液緩慢的問題，本領(lǐng)域存在一種闡明和開展用于加速從眼睛玻璃體出血清除血液的新方法和手術(shù)的需要，以至可對眼睛后部，包括視網(wǎng)膜做經(jīng)玻璃體檢查，而無須除去玻璃體(即全部或部分玻璃體切除術(shù))。
發(fā)明概述本發(fā)明提供一種加速從哺乳動物眼睛的玻璃液出血清除血液的方法，其中該方法包括用所述玻璃液與一定量的酶接觸，該酶有加速從所述玻璃液出血清除血液的活性。可施用特殊的酶以產(chǎn)生本發(fā)明的出血清除效果，它們包括β葡糖苷酸酶如透明酯酸酶，角蛋白酶，軟骨素酶AC，軟骨素酶B和軟骨素酶ABC；軟骨素硫酸酯酶如軟骨素4硫酸酯酶和軟骨素6硫酸酯酶；基質(zhì)金屬蛋白酶如基質(zhì)金屬蛋白酶1和基質(zhì)金屬蛋白酶2，基質(zhì)金屬蛋白酶3和基質(zhì)金屬蛋白酶9；以及蛋白激酶如鏈激酶和尿激酶。
進(jìn)一步根據(jù)本發(fā)明，提供了一種改進(jìn)的，無乙基汞硫代水楊酸鈉的透明酯酸酶制劑，它適合于作為治療各種病的治療劑在眼睛上或眼睛內(nèi)給藥所述治療包括但不限于根據(jù)本發(fā)明出血清除的方法學(xué)加速從玻璃液出血清除血液。本發(fā)明的這類透明酯酸酶制劑包含優(yōu)選的透明酯酸酶，該酶基本沒有分子量超過100,000MW，60,000-70,000MW之間和/或低于40,000MW的透明酯酸酶分子?？蓮木d羊睪丸得到本發(fā)明優(yōu)選的透明酯酸酶，并可與大量的乳糖和磷酸鹽結(jié)合成水溶液以提供無乙基汞硫代水楊酸鈉的透明酯酸酶水溶液供眼內(nèi)注射用。
在閱讀和理解如下詳細(xì)描述，附圖以及其中所舉實(shí)施例后，本領(lǐng)域技術(shù)人員將清楚本發(fā)明的進(jìn)一步目的和優(yōu)點(diǎn)。
附圖簡述

圖1顯示含1-6泳道的電泳膠，所述泳道表示1)分子量標(biāo)準(zhǔn)31，000MW到200,000MW，2)綿羊透明酯酸酶(ACS)，3)牛透明酯酸酶VI-S型，4)綿羊透明酯酸酶V型，5)牛透明酯酸酶IV-S型和6)牛透明酯酸酶I-S型。
圖2是一個(gè)表，它概括了與牛透明酯酸酶VI-S型，IV-S型和I-S型以及綿羊透明酯酸酶V型相比，酶學(xué)圖譜所確定的本發(fā)明的透明酯酸酶ACS的透明酯酸水解，明膠水解和酪蛋白水解活性。
圖3是一個(gè)表，根據(jù)如下實(shí)施例1，它概括了BSS，BSS+乙基汞硫代水楊酸鈉，透明酯酸酶(ACS)和透明酯酸酶Wydase的單劑量玻璃體內(nèi)注射在兔體內(nèi)的毒性作用。
圖4是一個(gè)表，根據(jù)下面實(shí)施例II，它概括了單劑量玻璃體內(nèi)透明酯酸酶(ACS)在兔體內(nèi)的功效。
圖5是一個(gè)表，根據(jù)下面實(shí)施例III，它概括了多劑量玻璃體內(nèi)透明酯酸酶(ACS)在兔體內(nèi)的安全性及功效。
圖6是一個(gè)圖表，根據(jù)下面實(shí)施例IV，它概括了在糖尿病視網(wǎng)膜病變的患者體內(nèi)單劑量透明酯酸酶ACS的出血清除功效。
優(yōu)選實(shí)施方案詳述下面詳述及相應(yīng)的實(shí)施例僅提供用于描述和解釋本發(fā)明的某些優(yōu)選實(shí)施方案之目的，并無任何限制本發(fā)明范圍之意。
i.加速從眼睛玻璃體出血清除血液的酶學(xué)方法根據(jù)本發(fā)明，申請人已經(jīng)確定某些類型的酶在與出血之后的玻璃液接觸時(shí)會加快從所述玻璃液出血清除血液的速率。
在此目的，申請人發(fā)明了一種加速從眼睛玻璃體出血清除血液的方法，所述方法一般包含用玻璃液接觸至少一種含加速從玻璃液出血清除血液活性的量的酶之步驟。本發(fā)明的出血清除的方法可在無任何玻璃體切除術(shù)或其他外科操作或除去玻璃液的情況下進(jìn)行，由此避免與這種玻璃體切除術(shù)方法有關(guān)的潛在風(fēng)險(xiǎn)和并發(fā)癥。
表現(xiàn)出這種出血清除作用的專一性β葡糖苷酸酶包括·透明酯酸酶·角蛋白酶·軟骨素酶AC·軟骨素酶B·軟骨素酶ABC·軟骨素4硫酸酯酶；和·軟骨素6硫酸酯酶表現(xiàn)這種出血清除作用的專一性金屬蛋白酶包括·基質(zhì)金屬蛋白酶-1·基質(zhì)金屬蛋白酶-2·基質(zhì)金屬蛋白酶-3·基質(zhì)金屬蛋白酶-9表現(xiàn)這種出血清除作用的專一性蛋白激酶包括·鏈激酶·尿激酶這些出血清除酶的優(yōu)選給藥途徑是通過眼內(nèi)注射給藥。由此將含一種或多種上而列出的出血清除酶的注射液通過針頭直接注射進(jìn)位于眼睛后腔的玻璃體中。然而，可另外通過任何其他足以分布所述酶到玻璃體以引起需要的出血清除作用的適當(dāng)給藥途徑(例如局部給藥)施用本發(fā)明的出血清除酶。
除出血清除酶之外，出血清除酶優(yōu)選注射液含有可使該溶液基本等滲并具有適合注射進(jìn)眼睛的pH的非活性成分。這樣的注射液可以最初被凍干成干燥狀態(tài)，然后在用前可被。
ii.優(yōu)選的眼科給藥用透明酯酸酶制劑本發(fā)明的可注射無乙基汞硫代水楊酸鈉透明酯酸酶的一般制劑在下表I中給出表I一般制劑
這些制劑成分最初被溶解在無菌水中，無菌過濾并隨后凍干成干燥制劑。該凍干的制劑被包裝以便隨后于用前重新溶解在平衡鹽溶液中。這種平衡鹽溶液一般含0.64％氯化鈉，0.075％氯化鉀，0.048％二水氯化鈣，0.03％六水氯化鎂，0.39％三水醋酸鈉，0.17％二水檸檬酸鈉，氫化鈉/鹽酸調(diào)pH，補(bǔ)充水到100％。
如本文所用術(shù)語“透明酯酸酶(ACS)”指無高于100,000、60,000-70,000之間和40,000以下透明酯酸酶分子量組分的優(yōu)選透明酯酸酶。這種透明酯酸酶可得自綿羊睪丸，并可從Calbiochem Biochemicals，P.O.Box 12087，La Jolla，Ca 92039-2087買到。申請人已確定透明酯酸酶ACS的這種特殊分子量分布導(dǎo)致的眼科毒性比其他透明酯酸酶制劑小，同時(shí)在許多眼科應(yīng)用中表現(xiàn)出稱心的治療效果。
圖1顯示一個(gè)電泳膠(10％-SDS-PAGE)，該電泳膠驗(yàn)證與購自SigmaChemical Company，P.O.Box 14508，St.Loius，Missouti 63178的牛VI-S，IV-S和I-S型以及綿羊V型透明酯酸酶對比的優(yōu)選透明酯酸酶ACS的分子量分布。每種酶的標(biāo)準(zhǔn)化量(即等價(jià)單位透明酯酸酶)被添加到圖1中顯示的電泳膠的每個(gè)泳道中(lane)(泳道2-6)。圖1中顯示的電泳膠的泳道1含分子量標(biāo)記分別是200,000MW，116,000MW，97,400MW，66,000MW，45,000MW，和31,000MW。圖1中顯示的電泳膠的泳道2-6含各個(gè)被測透明酯酸酶制劑如下泳道 泳道中被測物2透明酯酸酶ACS3牛透明酯酸酶VI-S型4綿羊透明酯酸酶V型5牛透明酯酸酶型IV-S型6牛透明酯酸酶型I-S型泳道2顯示透明酯酸酶ACS的分子量分布，包括分子量組分97,000，50,000(大約)和45,000(大約)，而完全沒有高于100,000、60,000-70,000之間和低于40,000的分子量組分。
圖1中電泳膠泳道3，4，5和6顯示被檢測的全部牛睪丸透明酯酸酶VI-S，IV-S和I-S型以及綿羊睪丸透明酯酸酶V型不同于本發(fā)明的透明酯酸酶ACS，因?yàn)樗鼈儼?0,000-70,000MW之間和低于40,000MW的分子量組分。而且，被測的四種(4)牛睪丸透明酯酸酶中的三種(3)(即VI-S，IV-S和I-S型)包括了超過100,000MW的透明酯酸酶分子量組分。
此外，做酶譜以比較標(biāo)準(zhǔn)化量(即等價(jià)單位透明酯酸酶活性)的上述透明酯酸酶ACS，VI-S，V，IV-S和I-S型牛透明酯酸酶對透明酯酸，明膠和酪蛋白的相對水解活性。關(guān)于圖2，這些酶譜的每個(gè)所使用的特殊方法如下透明酯酸酶活性酶譜明膠—1毫克/毫升明膠；10％聚丙烯酰胺；過夜緩沖液＝50mMTrisHCI，5mM氯化鈣，0.05％Triton-100 pH7.5；考馬斯藍(lán)染色；10％醋酸/50％甲醇脫色。
酪蛋白水解活性酶譜酪蛋白-4毫克/毫升；15％聚丙烯酰胺；過夜緩沖液＝50mMTris/HCI，5mM氯化鈣和0.05％Triton X-100 pH7.5；考馬斯藍(lán)染色；10％醋酸/50％甲醇脫色。
透明酯酸水解活性酶譜透明酯酸2毫克/毫升，10％聚丙烯酰胺；過夜緩沖液＝磷酸鹽緩沖生理鹽水，pH7.4；0.5％alcian蘭于3％醋酸中染色；10％醋酸/甲醇脫色。
這些透明酯酸，明膠和酪蛋白酶譜的結(jié)果被概括于圖2的表中。值得注意的是，本發(fā)明優(yōu)選的透明酯酸酶ACS沒有約100,000MW以上的透明酯酸水解分子量組分，而被測的每個(gè)牛睪丸透明酯酸酶(即VI-S，IV-S，和I-S型)含高于100,000MW的透明酯酸水解分子量組分。
類似的，本發(fā)明透明酯酸酶ACS沒有約60,000-100,000MW之間的明膠水解分子量組分，而被測的每種牛睪丸透明酯酸酶包含約60,000-70,000MW之間的明膠水解分子量組分。
而且，本發(fā)明透明酯酸酶沒有約45,00MW以上的酪蛋白水解分子量組分，而被測的每種牛睪丸透明酯酸酶(即VI-S，IV-S和I-S型)以及綿羊睪丸透明酯酸酶(V型)卻包含約45,000MW以上的酪蛋白水解分子量組分。
本發(fā)明的優(yōu)選透明酯酸酶(ACS)的特殊分子量分布和特殊酶活性分布型(和/或從其制劑中排除乙基汞硫代水楊酸鈉)提供了一種透明酯酸酶制劑，該制劑對眼睛是無毒的，而以同樣劑量給藥時(shí)其他透明酯酸酶制劑會產(chǎn)生毒性作用。
為用于下面提供的實(shí)施例，通過下面描述并于表1給出的方法和一般制劑在無乙基汞硫代水楊酸鈉制劑中制備優(yōu)選的透明酯酸酶ACS。特別是，用于下述實(shí)施例并根據(jù)特殊制劑制備的透明酯酸酶在下表II中給出。
表II特殊制劑
如下述實(shí)施例中描述的，如表II(見上)給出的透明酯酸酶ACS的特別優(yōu)選制劑可以產(chǎn)生稱心效果的劑量水平直接被注射到眼睛后部腔中，其效果包括但無須限于本發(fā)明的出血清除效果，而不引起對眼睛或相關(guān)解剖學(xué)結(jié)構(gòu)的明顯毒性。
實(shí)施例1乙基汞硫代水楊酸鈉，透明酯酸酶(ACS)和透明酯酸酶(Wydase)對兔的眼科毒性五十二(52)只健康新西蘭雜交種兔(26雄，26雌)，體重1.5公斤到2.5公斤，分別被標(biāo)記以便識別并各自在懸籠中飼養(yǎng)。所述動物每日進(jìn)食市售顆粒兔飼料，并任意接供水管。
所述動物以每組四只動物(2雄，2雌)被分成十三組。選出每組中的兩只動物(1雄，1雌)進(jìn)行處理前眼底照相和熒光血管造影。
固定動物并用裝好Kodak Gold 200 ASA膠卷的KOWA RC-3眼底相機(jī)拍攝視神經(jīng)，視網(wǎng)膜弓形組織和眼底。
熒光血管造影包括經(jīng)耳緣靜脈注射1.5毫升2％熒光素溶液。約注射熒光素后30秒鐘，拍攝視神經(jīng)，視網(wǎng)膜血管和眼底。
繼日，經(jīng)靜脈施用34毫克/公斤鹽酸氯胺酮和5毫克/公斤甲苯噻嗪的制劑麻醉每個(gè)動物。用開瞼器收縮眼瞼，并且用providone碘洗液消毒眼睛。
用1毫升的結(jié)核菌素注射器，30號，接0.5英寸針頭通過注射施用以鹽水溶液(BSS)，BSS+乙基汞硫代水楊酸鈉，透明酯酸酶(Wydase)或以透明酯酸酶(ACS)平衡的實(shí)驗(yàn)治療劑。在此實(shí)施例中使用的透明酯酸酶(ACS)溶液不含乙基汞硫代水楊酸鈉并組成上述表II中給出的特別優(yōu)選透明酯酸酶ACS制劑。
給每組動物施用的實(shí)驗(yàn)治療劑如下
組號治療劑1 BSS2 BSS+0.0075毫克乙基汞硫代水楊酸鈉3 BSS+0.025毫克乙基汞硫代水楊酸鈉4 透明酯酸酶(Wydase)1國際單位5 透明酯酸酶(Wydase)15國際單位6 透明酯酸酶(Wydase)30國際單位7 透明酯酸酶(Wydase)50國際單位8 透明酯酸酶(Wydase)150國際單位9 透明酯酸酶(ACS)1國際單位10 透明酯酸酶(ACS)15國際單位11 透明酯酸酶(ACS)30國際單位12 透明酯酸酶(ACS)50國際單位13 透明酯酸酶(ACS)150國際單位注射后之繼日(第一天)，用本底劑量檢查所使用的同樣方法觀察做過眼底照相和熒光造影的26只動物。
注射后的第二天，第一天以本底劑量接受過眼底照相和熒光造影的13只雄兔以及沒有被選做照相的13只雌兔用戊巴比妥鈉類藥物安樂死。然后手術(shù)移取眼睛放置于有pH7.37的0.1摩爾磷酸緩沖生理鹽水的2.5％戊二醛固定液中。
或者，隨機(jī)選取一只兔用戊巴比妥注射安樂死，而然后通過心內(nèi)注射戊二醛溶液進(jìn)入左心室以確定固定方法對被摘除眼球內(nèi)組織檢查的影響。
在第七天，按照同于前述方法觀察先前接受過照相和造影的13只雌兔。
在給藥7天后其余26只動物如上述方法安樂死。用與第二天固定的同樣方法固定眼球。仍隨機(jī)選一只兔子接受上述先前隨機(jī)選取的動物所接受的同樣心內(nèi)戊二醛固定方法。
對該實(shí)施例中處理的動物眼球做肉眼觀察和顯微鏡檢查以得到與處理相關(guān)的毒性的證據(jù)。圖3給出一個(gè)表，該表給出每個(gè)處理組中毒性或非毒性的組織學(xué)證據(jù)的概況。概括之，BSS處理的對照組的眼球在給藥后2和7天無毒性。
BSS+乙基汞硫代水楊酸鈉(0.0075毫克)處理的第二組動物之眼球在第二天無毒性，但在第7天呈現(xiàn)視網(wǎng)膜血屏障的破壞的證據(jù)。
BSS+乙基汞硫代水楊酸鈉(0.025毫克)處理的第3組動物在給藥后第2天和第7天呈現(xiàn)嚴(yán)重的處理相關(guān)毒性作用。
以1國際單位Wydase處理的第4組動物在第2天和第7天無毒性，然而，以劑量范圍在15國際單位-150國際單位的Wydase處理的第5-8組動物的眼球一般在第2天和第7天呈現(xiàn)總體的與劑量相關(guān)的毒性作用。
以劑量范圍1國際單位到150國際單位的透明酯酸酶(ACS)處理的第9-13處理組的動物眼球在給藥后第2天和第7天無毒性作用證據(jù)。
因此，得出結(jié)論是乙基汞硫代水楊酸鈉和含乙基汞硫代水楊酸鈉的Wydase制劑在檢測劑量下在兔眼中確引起毒性，然而，在這些動物中在檢測劑量下透明酯酸酶(ACS)不產(chǎn)生毒性作用。
在第7天進(jìn)行的檢查的結(jié)果被概括在圖3中。如圖3所示，在BSS加乙基汞硫代水楊酸鈉(0.0075毫克)和透明酯酸酶(Wydase)以1國際單位-150國際單位之間的全部劑量處理的圖眼中在第7天觀察到明顯的毒性作用。相反，在以1-50國際單位之間劑量的透明酯酸酶(ACS)處理的動物眼中觀察不到毒性作用。
實(shí)施例II在兔眼中玻璃體內(nèi)注射的透明酯酸酶(ACS)的安全性和功效在本實(shí)施例中，12只健康的新西蘭雜種兔被標(biāo)記以供識別并在懸籠中飼養(yǎng)。每日這些動物食用市售顆粒飼料并任意接飲用水管。
所述動物被隨機(jī)分成四個(gè)(4)處理組，每組三只(3)動物。
開始，用1-2滴10％托吡卡胺擴(kuò)瞳檢查每只動物的眼，隨后肉眼觀察，用20屈光度透鏡做間接檢眼鏡檢查，和眼睛前部解剖的裂隙鏡檢查。
繼動物眼睛的初步檢查后，向每只動物的每只眼睛玻璃體內(nèi)注射100微升或10微升的血液。
第2天，每個(gè)處理組動物接受單一玻璃體內(nèi)注射BSS或透明酯酸酶(ACS)進(jìn)入右眼，按如下處理一覽表進(jìn)行組號 處理左眼 右眼A無BSS(30微升)X1B無25國際單位透明酯酸酶(ACS)30微升X1C無50國際單位透明酯酸酶(ACS)30微升X1D無75國際單位透明酯酸酶(ACS)30微升X1本實(shí)施例中使用的透明酯酸酶(ACS)是上述優(yōu)選制劑并在表II給出。
在第3，5，7，14和21天，每只動物眼再次用裂隙鏡檢查以評估角膜，前腔和虹膜。此外，用10％托吡卡胺溶液擴(kuò)瞳每只動物的眼并用有20屈光度透鏡的間接檢眼鏡檢查視網(wǎng)膜。
所觀察到的透明酯酸酶ACS的出血清除的功效被概括于圖4。一般說，由于被注入到其中的血量，每個(gè)處理組中的每只動物的左眼(未處理)含混濁的玻璃體和一些血塊。組A的BSS處理的(對照)動物的右眼也含混濁玻璃體和一些血塊，而在處理組B-D中所有透明酯酸酶處理的動物的右眼含清晰的玻璃體并且透過它可進(jìn)行視網(wǎng)膜經(jīng)玻璃體檢查。而且，在B-D處理組中所有動物的右眼視網(wǎng)膜表現(xiàn)正常并無處理相關(guān)毒性。
本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明玻璃體內(nèi)施用透明酯酸酶(ACS)在25-75國際單位的單一劑量對加快從被處理動物眼清除血液的速率是有效的，并進(jìn)一步表明在本實(shí)驗(yàn)中施用這樣單一劑量的透明酯酸酶(ACS)在本實(shí)驗(yàn)受處理的兔眼中不引起可見的毒性作用。
每次給藥后的觀察是一致的并被概括于圖5。一般說，每個(gè)處理組中的每只動物的左眼(未處理)含混濁的玻璃液和一些血塊，是由于被注入其中的血液量。組A的BSS處理的(對照)動物右眼也含混濁的玻璃體和一些血塊，而處理組B-E(即用透明酯酸酶(ACS)處理的動物)中所有動物的右眼含清澈的玻璃體，通過它可進(jìn)行視網(wǎng)膜的經(jīng)玻璃體檢查。而且，處理組B-D中的所有動物右眼的視網(wǎng)膜表現(xiàn)是正常的并無處理相關(guān)毒性，即使在多劑量透明酯酸酶ACS處理后。
本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明在25-75國際單位單一劑量的4倍時(shí)，玻璃體內(nèi)施用透明酯酸酶(ACS)對加快從兔眼清除血液的速率是有效的并進(jìn)一步表明透明酯酸酶(ACS)的這種劑量，以及透明酯酸酶ACS的這種劑量在受處理的兔眼中即使在2周間隔內(nèi)四個(gè)(4)連續(xù)劑量的施用透明酯酸酶ACS亦不引起可見的毒性作用。
實(shí)施例III在人體中，透明酯酸酶出血清除的功效在本實(shí)驗(yàn)中，用單一玻璃體內(nèi)注射劑量為50-200國際單位的透明酯酸酶(ACS)治療玻璃體內(nèi)出血的六位(6)病人(5女，1男)。
本實(shí)驗(yàn)中施用的透明酯酸酶(ACS)通過上面描述并在表II給出的優(yōu)選制劑來制備。
本實(shí)驗(yàn)中全部接受治療的病人有糖尿病視網(wǎng)膜病變史，并被發(fā)現(xiàn)有各期的玻璃體內(nèi)出血。在每位病人中玻璃體內(nèi)出現(xiàn)的血液量足以妨礙用標(biāo)準(zhǔn)的眼底鏡方法檢查視網(wǎng)膜。
每位病人接受了單一透明酯酸酶(ACS)玻璃體內(nèi)注射。四位(4)病人接受了一個(gè)50國際單位的劑量，一位(1)病人接受了一個(gè)70國際單位的劑量，而一位病人接受了一個(gè)200國際單位的劑量。
本實(shí)驗(yàn)的觀察結(jié)果概括于圖6。
在本實(shí)驗(yàn)的六位(6)受治療病人中，在單一注射透明酯酸酶(ACS)的6-16天內(nèi)，出血的玻璃體變清澈足以進(jìn)行視網(wǎng)膜的經(jīng)玻璃體檢查。所述玻璃體的如此的清除作用主觀上被確定為其發(fā)生明顯快于未受透明酯酸酶治療的病人中所發(fā)生的清除作用。
前文詳細(xì)的描述，實(shí)施例，和附圖描述了本發(fā)明有關(guān)某些當(dāng)前所述優(yōu)選實(shí)施方案。本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員會意識到從上述具體實(shí)施方案和制劑可制造各種偏差而并沒脫離本發(fā)明的動機(jī)和范圍。因此，要求所有這類合理偏差都被包含在如下權(quán)利要求的范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種加速從哺乳動物眼睛的玻璃液出血清除血液的方法，所述方法包括步驟用所述玻璃液與一定量的酶接觸，該酶有加速從玻璃液出血清除血液的活性。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述酶選自的組分包含透明酯酸酶；角蛋白酶；軟骨素酶AC；軟骨素酶B；軟骨素酶ABC；軟骨素4硫酸酯酶；軟骨素6硫酸酯酶；基質(zhì)金屬蛋白酶-1；基質(zhì)金屬蛋白酶-2；基質(zhì)金屬蛋白酶-3；基質(zhì)金屬蛋白酶-9；鏈激酶；尿激酶；和其組合。
3.權(quán)利要求1的方法，其中所述酶是β-葡糖苷酸酶。
4.權(quán)利要求1的方法，其中所述酶是基質(zhì)金屬蛋白酶。
5.權(quán)利要求1的方法，其中所述酶是蛋白質(zhì)激酶。
6.權(quán)利要求1的方法，其中所述酶是軟骨素硫酸酯酶。
7.權(quán)利要求1的方法，其中所述酶在流體溶液中，并且其中所述酶與玻璃液接觸的步驟包括注射所述流體溶液進(jìn)入玻璃液。
8.權(quán)利要求1的方法，其中所述酶是透明酯酸酶。
9.權(quán)利要求8的方法，其中所述所述透明酯酸酶的量是10-300國際單位。
10.權(quán)利要求1的方法，其中所述酶以單一玻璃體內(nèi)注射方式被施用。
11.權(quán)利要求10的方法，其中單一玻璃體內(nèi)注射體積低于50微升。
12.權(quán)利要求8的方法，其中所述透明酯酸酶無100,000MW以上的分子量組分。
13.權(quán)利要求8的方法，其中所述透明酯酸酶無低于40,000MW透明酯酸酶分子量組分。
14.權(quán)利要求8的方法，其中所述透明酯酸酶無60,000-70,000MW之間的分子量組分。
15.權(quán)利要求8的方法，其中所述透明酯酸酶無100,000MW以上，40,000MW以下和60,000-70,000MW之間的分子量組分。
16.權(quán)利要求8的方法，其中的透明酯酸酶無分子量為約60,000-100,000MW之間的明膠水解透明酯酸酶。
17.權(quán)利要求8的方法，其中所述透明酯酸酶無分子量約為45,000MW以上的酪蛋白水解透明酯酸酶。
18.權(quán)利要求8的方法，其中所述透明酯酸酶無分子量約為100,000MW以上的透明酯酸水解透明酯酸酶。
19.權(quán)利要求1的方法，其中所述方法進(jìn)一步包括在無乙基汞硫代水楊酸鈉的條件下，所述酶與所述玻璃液接觸。
20.權(quán)利要求8的方法，其中所述透明酯酸酶被制備成注射用無乙基汞硫代水楊酸鈉的溶液并且其含一般制劑透明酯酸酶(ACS)……0-8000國際單位；乳糖，USP……13.3毫克；和磷酸鹽，USP……5mM；并且，其中透明酯酸酶無40,000以下分子量組分。
21.權(quán)利要求20的方法，其中所述注射用溶液含如下特殊制劑透明酯酸酶(ACS)……7,200國際單位；乳糖，USP……13.3毫克，和磷酸鹽，USP……5mM。
22.權(quán)利要求20的方法，其中所述注射用溶液被溶解于平衡鹽溶液。
23.眼科給藥用透明酯酸酶制劑，所述制劑無乙基汞硫代水楊酸鈉并無低于40,000MW的透明酯酸酶。
24.權(quán)利要求23的制劑，其中所述制劑還不含分子量為60,000-70,000MW之間的透明酯酸酶。
25.權(quán)利要求23的制劑，其中所述制劑還不含分子量超過100,000MW的透明酯酸酶。
26.權(quán)利要求23的制劑，其中所述制劑還不含分子量在約100,000MW以上的透明酯酸水解透明酯酸酶。
27.權(quán)利要求23的制劑，其中所述制劑還不含分子量約45,000MW以上的酪蛋白水解透明酯酸酶。
28.權(quán)利要求23的制劑，其中所述制劑還不含分子量約60,000-70,000之間的明膠水解透明酯酸酶。
29.權(quán)利要求23的制劑，其中所述制劑是含如下一般制劑的注射用溶液透明酯酸酶(ACS)……0-8000國際單位；乳糖，USP……13.3-133.3毫克；和磷酸鹽，USP……5-200mM；并且，其中透明酯酸酶無低于40,000分子量組分。
30.權(quán)利要求29的制劑，其中在所述制劑中透明酯酸酶(ACS)的量是7,200國際單位。
31.權(quán)利要求29的制劑，其中所述制劑的成分被溶解于平衡鹽溶液。
全文摘要
一種無乙基汞硫代水楊酸鈉的制劑,其中優(yōu)選的透明酯酸酶不含低于40,000MW,60,000—70,000MW之間和高于100,000MW的分子量組分。公開的還有一種加速從眼睛的玻璃液出血清除血液的方法,所述方法包含至少一種出血清除酶以有效引起加速從玻璃液清除血液之量與玻璃液相接觸的步驟(例如β葡糖苷酸酶,基質(zhì)金屬蛋白酶,軟骨素酶,軟骨素硫酸酯酶或蛋白質(zhì)激酶)。
文檔編號A61P27/00GK1207684SQ96199746
公開日1999年2月10日 申請日期1996年11月20日 優(yōu)先權(quán)日1995年11月22日
發(fā)明者H·L·卡拉格奧茲安, V·H·卡拉格奧茲安, M·C·肯尼, J·L·G·弗羅雷斯, G·A·C·阿拉貢, A·B·內(nèi)斯布恩 申請人:先進(jìn)角膜系統(tǒng)公司