專利名稱：溶血巴斯德氏菌運(yùn)鐵蛋白結(jié)合蛋白和包含該蛋白質(zhì)的疫苗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及新的溶血巴斯德氏菌(Pasteurela haemolytica)運(yùn)鐵蛋白結(jié)合蛋白，其截短物、類似物、同系物以及同工型；編碼該蛋白質(zhì)和其截短物、類似物和同系物的核酸分子；包含該蛋白質(zhì)的疫苗；抗該蛋白質(zhì)的抗體；以及所述蛋白質(zhì)和核酸分子的用途。
巴斯德氏菌屬的成員包括一組相關(guān)的細(xì)菌物種，它們是反芻動(dòng)物重要的病原體。這組細(xì)菌包括基于糖利用已被分類成兩種生物型(A和T)的溶血巴斯德氏菌物種，和分類成基于它們的菌體抗原所識(shí)別的16種血清型(Biberstein,E.L.等，1960；Fraser等，1982)。以利用海藻糖為特征的溶血巴斯德氏菌的T-型菌株前不久被再分類為新的海藻巴斯德氏菌(P.trehalosi)物種(Sneath,P.H.A等，1990)。
由溶血巴斯德氏菌引起的肺巴斯德氏菌病在世界范圍內(nèi)對(duì)牛、綿羊和山羊產(chǎn)業(yè)是一個(gè)主要的經(jīng)濟(jì)問題。牛敗血病，這一疾病的各種變型在北美的牛產(chǎn)業(yè)上是一個(gè)主要的問題，并且?guī)缀跞坑蛇@一物種的A1型菌株引起(Babiuk,LA.和S.D.Acres,1984)。血清型A2是在綿羊中最主要的致病型，但其它血清型在綿羊和山羊中也可能是重要的(Gilmour和Gilmour,1991)。相關(guān)物種海藻巴斯德氏菌(以前稱為T-型溶血巴斯德氏菌)是小羊敗血癥的病原體，該疾病是困擾綿羊產(chǎn)業(yè)(特別是在英國)的問題。同樣，相關(guān)物種多殺巴斯德氏菌(Pasteurella multocida)物種的菌株引起出血性敗血癥(在牛和水牛中的一種嚴(yán)重的傳染病)，這種病在東南亞特別嚴(yán)重。
接種是在反芻動(dòng)物中控制巴斯德氏菌病的一種合乎需要的方法，但是由于缺乏誘導(dǎo)針對(duì)所有致病血清型的保護(hù)作用的免疫制劑，其有效性受到限制，特別是在考慮對(duì)所有反芻動(dòng)物有效的疫苗時(shí)。殺滅全細(xì)胞的疫苗在小牛中引發(fā)保護(hù)作用不一致的水平和抗體反應(yīng)(Wilkie,B.N.,1990)，包含水楊酸鈉提取物(SSEs)的同種疫苗保護(hù)綿羊抵抗由血清型A1,A6和A9引起的疾病(Cilmour等，1983)，但不能抵抗更流行的血清型A2引起的疾病(Fraser等，1982)。由溶血巴斯德氏菌產(chǎn)生的外毒素(其對(duì)反芻動(dòng)物的白細(xì)胞和肺泡巨噬細(xì)胞特異性致死(Benson等，1978))在小牛和綿羊的保護(hù)實(shí)驗(yàn)中作為疫苗候選者已顯示出很大希望(13,35)，但對(duì)抵抗異種血清型具有有限的保護(hù)作用(33)。將在鐵-有限生長條件下誘導(dǎo)的蛋白質(zhì)包含進(jìn)小羊巴斯德氏菌病疫苗中已經(jīng)顯示出增強(qiáng)的保護(hù)作用(15)。
以前的研究已經(jīng)說明病原菌體內(nèi)獲取鐵的能力是其病理生物學(xué)的關(guān)鍵性因素(7,11)。從宿主鐵-結(jié)合耱蛋白，運(yùn)鐵蛋白取回鐵的一種機(jī)理涉及通過細(xì)菌上的表面受體直接結(jié)合運(yùn)鐵蛋白，和從運(yùn)鐵蛋白除去鐵并攝取到細(xì)胞中(21)。Schryvers(1992)描述了利用親和層析從各種細(xì)菌病原體分離運(yùn)鐵蛋白受體蛋白質(zhì)的方法。所說的運(yùn)鐵蛋白受體已經(jīng)顯示由兩種蛋白質(zhì)組成，這兩種蛋白質(zhì)稱為運(yùn)鐵蛋白結(jié)合蛋白1或A(Tbp1或TbpA)和運(yùn)鐵蛋白結(jié)合蛋白2或B(Tbp2或TbpB)。鐵攝取的受體介導(dǎo)的類型已經(jīng)顯示出在血清型A牛溶血巴斯德氏菌菌株中起作用(26)。在鐵有限條件下體外生長的溶血巴斯德氏菌細(xì)胞表達(dá)大量的可抑制鐵的外膜蛋白(IROMPs)，其與由從患巴斯德氏菌病的動(dòng)物的感染部位體內(nèi)回收的細(xì)胞產(chǎn)生的那些相同(9,10)。在這些蛋白質(zhì)中尤其突出的是分子大小為100,77,70和60 Kda的那些(9,10)。100 Kda的蛋白質(zhì)已作為一種牛分離物中的宿主特異性運(yùn)鐵蛋白受體被鑒別(26)，而某些其它IROMPs已被提出為可能與鐵獲取受體復(fù)合物中的100Kda蛋白質(zhì)相關(guān)(26)。由小羊溶血巴斯德氏菌表達(dá)的IROMPs在鐵獲取中的作用還未闡明，也不知道由山羊分離物表達(dá)的類似蛋白質(zhì)。
溶血巴斯德氏菌通過受體介導(dǎo)型機(jī)制從牛宿主運(yùn)鐵蛋白獲得鐵。具有這一類型的鐵獲取機(jī)制的細(xì)菌可以僅依賴于它們的體內(nèi)鐵獲取表面受體(29)的觀點(diǎn)意味著它們僅能夠引起這些宿主(其運(yùn)鐵蛋白由它們的表面受體識(shí)別)中的疾病。已報(bào)道溶血巴斯德氏菌引起牛、綿羊和山羊中的疾病，因而預(yù)期它們的表面受體會(huì)識(shí)別這些宿主的運(yùn)鐵蛋白。因此，確定綿羊和山羊分離物是否也具有鐵獲取中所涉及的運(yùn)鐵蛋白受體以估價(jià)它們對(duì)不同反芻動(dòng)物運(yùn)鐵蛋白的特異性，以及確定在引起牛、綿羊和山羊肺巴斯德氏菌病的不同菌株的表面受體之間是否具有抗原相關(guān)性是重要的。
在牛、綿羊和山羊的各種血清型和生物型(A和T)溶血巴斯德氏菌(和海藻巴斯德氏菌)的收集中鑒別了運(yùn)鐵蛋白受體。生長研究、結(jié)合研究和親和性分離實(shí)驗(yàn)顯示這些受體具有識(shí)別牛、綿羊和山羊運(yùn)鐵蛋白的相同的特異性。這表明在這些受體蛋白質(zhì)上具有配體結(jié)合中所涉及的保守區(qū)，其是在細(xì)胞表面可及的。
抗個(gè)體純化的溶血巴斯德氏菌血清型A1菌株受體蛋白質(zhì)(TbpA和TbpB)所制備的抗血清顯示出抗選擇的代表性菌株的受體蛋白質(zhì)的相當(dāng)大的交叉反應(yīng)性。也觀察到抗完整細(xì)胞的交叉反應(yīng)性，說明在細(xì)胞表面具有用作宿主免疫作用機(jī)制的靶的保守的免疫表位。
本發(fā)明發(fā)明人已經(jīng)從溶血巴斯德氏菌A1克隆、測(cè)序和表達(dá)了編碼運(yùn)鐵蛋白受體蛋白TbpA和TbpB(本文也分別稱為Tbp1和Tbp2)的tbpA和tbpB基因。這些基因組構(gòu)在tbpB-tbpA的操縱子排列中。tbpB基因之前是推定的啟動(dòng)子和調(diào)節(jié)序列，之后為96個(gè)堿基對(duì)的基因間序列，在其中沒有發(fā)現(xiàn)任何啟動(dòng)子區(qū)，說明這兩個(gè)基因是協(xié)調(diào)轉(zhuǎn)錄的。TbpA與TbpB蛋白質(zhì)的推定的氨基酸序列具有與相應(yīng)的腦膜炎奈瑟氏球菌(Neisseriameningitidis)、淋病奈瑟氏球菌(N.gonorrhoeae)、流感嗜血菌(Haemophilusinfluenzae)和胸膜肺炎放線桿菌(Actinobacillus pleuropneumoniae)Lbp和Tbp蛋白質(zhì)同源的區(qū)。完整的tbpB基因在T7表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)，并且所形成的重組TbpB蛋白質(zhì)保持功能性牛運(yùn)鐵蛋白結(jié)合特征。重組TbpB的有用性使發(fā)明人能夠說明其對(duì)反芻動(dòng)物運(yùn)鐵蛋白的特異性，其結(jié)合牛運(yùn)鐵蛋白的C-和N-端片段兩者的能力，以及其對(duì)這一蛋白質(zhì)的載鐵形式的優(yōu)先選擇性。
本發(fā)明發(fā)明人也明顯地發(fā)現(xiàn)用包含溶血巴斯德氏菌TbpA和TbpB的制劑進(jìn)行的免疫接種給出很好的抵抗實(shí)驗(yàn)性牛肺巴斯德氏菌病的保護(hù)作用。用兩劑量的TbpB也給出保護(hù)作用。
廣泛而言，本發(fā)明提供了包含編碼TbpA蛋白質(zhì)的序列的純化的與分離的核酸分子，或包含編碼TbpB蛋白質(zhì)的序列的純化的與分離的核酸分子。TbpA與TbpB蛋白質(zhì)結(jié)合反芻動(dòng)物運(yùn)鐵蛋白，并且在其反芻動(dòng)物宿主中的溶血巴斯德氏菌的受體介導(dǎo)的鐵獲取中起作用。TbpA蛋白質(zhì)大小約100kDa,TbpB大小約60kDa。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，純化的與分離的核酸分子包含編碼具有如圖22或SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的TbpA蛋白質(zhì)的序列，或編碼具有如圖24或SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列的TbpB蛋白質(zhì)的序列。在本發(fā)明一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，純化的與分離的核酸分子包含編碼TbpA蛋白質(zhì)并且具有如圖21或SEQ ID NO:1所示的核酸序列的序列，或編碼TbpB蛋白質(zhì)并且具有如圖23或SEQ ID NO:3所示的核酸序列的序列。
本發(fā)明也涉及(a)包含編碼TbpA或TbpB的截短物(其對(duì)所說的蛋白質(zhì)是唯一的)、TbpA或TbpB的類似物或同系物或它們的截短物(本文分別統(tǒng)稱為＂TbpA相關(guān)蛋白質(zhì)＂或＂TbpB相關(guān)蛋白質(zhì)＂)之序列的核酸分子；b)包含在高嚴(yán)格條件下雜交到編碼TbpA或TbpB(分別具有如圖22和24所示的氨基酸序列)或TbpA或TbpB相關(guān)蛋白質(zhì)的全長核酸上之序列的核酸分子；(c)包含在高嚴(yán)格條件下雜交到分別具有如圖21或SEQ ID NO:1所示的，或者如圖23或SEQ ID NO:3所示的序列的tbpA或tbpB基因的全長核酸序列上之序列的核酸分子。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及純化的與分離的雙鏈核酸分子，該分子含有本發(fā)明的核酸分子，本發(fā)明的核酸分子結(jié)合與互補(bǔ)核酸堿基序列氫鍵結(jié)合。
本發(fā)明的核酸分子可以插入到一個(gè)適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體中，即插入到含有所插入的編碼序列的轉(zhuǎn)錄與翻譯必要的元件的載體中。因此，可以構(gòu)建適于轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞的重組表達(dá)載體，其包含本發(fā)明的核酸分子和一個(gè)或多個(gè)有效地與核酸分子連接的轉(zhuǎn)錄和翻譯元件。
所說的重組表達(dá)載體可以用來制備表達(dá)TbpA和/或TbpB，或TbpA或TbpB相關(guān)蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。因此，本發(fā)明進(jìn)一步提供了包含本發(fā)明的重組分子的宿主細(xì)胞。
本發(fā)明進(jìn)一步提供了利用本發(fā)明的純化的與分離的核酸分子制備新的TbpA或TbpB，以及TbpA或TbpB相關(guān)蛋白質(zhì)的方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，提供了一種用于制備TbpA或TbpB的方法，該方法包括(a)將本發(fā)明的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)移到宿主細(xì)胞中；(b)選擇轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，使其與未轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞分離；(c)在使得TbpA或TbpB可以表達(dá)條件下培養(yǎng)選出的轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞；和(d)分離重組TbpA或TbpB。
本發(fā)明更廣泛地涉及結(jié)合到反芻動(dòng)物運(yùn)鐵蛋白上的純化的與分離的TbpA或TbpB，其優(yōu)選地是通過培養(yǎng)包含本發(fā)明的重組表達(dá)載體的宿主細(xì)胞獲得的。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，提供了分別具有圖22或圖24所示的氨基酸序列的純化的TbpA或TbpB。本發(fā)明也包括所說蛋白質(zhì)的截短物和所說蛋白質(zhì)的類似物、同系物以及同工型和它們的截短物(即＂TbpA或TbpB相關(guān)蛋白質(zhì)＂)。
本發(fā)明的TbpA和TbpB，或TbpA和TbpB相關(guān)蛋白質(zhì)可以與其它分子，如蛋白質(zhì)連接，以制備融合蛋白質(zhì)。這可以通過例如合成N-端或C-端融合蛋白來完成。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及具有抗本發(fā)明的TbpA或TbpB，或者TbpA或TbpB相關(guān)蛋白質(zhì)的特異性的抗體?？梢杂每蓹z測(cè)的物質(zhì)標(biāo)記這些抗體，它們可以用于在樣品中監(jiān)測(cè)本發(fā)明的TbpA或TbpB，或者TbpA或TbpB相關(guān)蛋白質(zhì)。
本發(fā)明也使得可以構(gòu)建這樣的核苷酸探針，其對(duì)本發(fā)明的核酸分子是唯一的，因而對(duì)本發(fā)明的TbpA或TbpB，或者TbpA或TbpB相關(guān)蛋白質(zhì)是唯一的。這樣，本發(fā)明也涉及包含編碼TbpA或TbpB，或者TbpA或TbpB相關(guān)蛋白質(zhì)的序列的探針?？梢杂美缈蓹z測(cè)的物質(zhì)標(biāo)記探針，該探針可以用于從核苷酸序列混合物中選擇編碼顯示一種或多種TbpA或TbpB性質(zhì)的蛋白質(zhì)的核苷酸序列。
本發(fā)明還進(jìn)一步提供了用于鑒別能夠結(jié)合到TbpA或TbpB，或者TbpA或TbpB相關(guān)蛋白質(zhì)，或其活化形式上的物質(zhì)的方法，該方法包括使TbpA或TbpB，或者TbpA或TbpB相關(guān)蛋白質(zhì)，或其活化形式與至少一種潛在地可以與TbpA或TbpB，或者TbpA或TbpB相關(guān)蛋白質(zhì)，或其活化形式結(jié)合的物質(zhì)在使得可以在所說物質(zhì)與TbpA或TbpB，或者TbpA或TbpB相關(guān)蛋白質(zhì)，或其活化形式之間形成復(fù)合物的條件下反應(yīng)，并測(cè)定復(fù)合物、游離的物質(zhì)、非復(fù)合的TbpA或TbpB，或者TbpA或TbpB相關(guān)蛋白質(zhì)，或其活化形式。潛在地可以與TbpA或TbpB，或者TbpA或TbpB相關(guān)蛋白質(zhì)結(jié)合的物質(zhì)包括運(yùn)鐵蛋白，特別是反芻動(dòng)物運(yùn)鐵蛋白，運(yùn)鐵蛋白的類似物和衍生物以及抗TbpA和TbpB，或TbpA或TbpB相關(guān)蛋白質(zhì)的抗體。
此外，本發(fā)明還提供了一種測(cè)定介質(zhì)中TbpA或TbpB，或者TbpA或TbpB相關(guān)蛋白質(zhì)和與TbpA或TbpB，或者TbpA或TbpB相關(guān)蛋白質(zhì)，或其活化形式結(jié)合的物質(zhì)之間相互作用的興奮劑或拮抗劑的存在的方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述的方法包括在可以使所說物質(zhì)與TbpA或TbpB，或者TbpA或TbpB相關(guān)蛋白質(zhì)之間形成復(fù)合物的條件下提供已知濃度的TbpA或TbpB，或者TbpA或TbpB相關(guān)蛋白質(zhì)，以及能夠結(jié)合到TbpA或TbpB，或者TbpA或TbpB相關(guān)蛋白質(zhì)上的物質(zhì)和懷疑的興奮劑或拮抗劑物質(zhì)，并且測(cè)定復(fù)合物、游離的物質(zhì)、非復(fù)合的TbpA或TbpB，或者TbpA或TbpB相關(guān)蛋白質(zhì)。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述的物質(zhì)是反芻動(dòng)物運(yùn)鐵蛋白、其類似物，衍生物或部分，或者抗TbpA或TbpB，或者TbpA或TbpB相關(guān)蛋白質(zhì)的抗體。
影響TbpA或TbpB，或者TbpA或TbpB相關(guān)蛋白質(zhì)的表達(dá)的物質(zhì)也可以通過比較在所述物質(zhì)的存在和不存在下，細(xì)胞中本發(fā)明的TbpA或TbpB，或者TbpA或TbpB相關(guān)蛋白質(zhì)的表達(dá)方式和水平，采用本發(fā)明的方法鑒別。
利用本發(fā)明的方法鑒別的物質(zhì)可以用于動(dòng)物的治療，特別是受到溶血巴斯德氏菌感染的反芻動(dòng)物的治療，因此它們可以配制成供反芻動(dòng)物施用的藥物組合物。所說的動(dòng)物例如患溶血巴斯德氏菌感染或者接觸溶血巴斯德氏菌感染的牛，綿羊以及山羊。
本發(fā)明發(fā)明人已經(jīng)證實(shí)本發(fā)明的TbpA或TbpB或者TbpA或TbpB相關(guān)蛋白質(zhì)是免疫原性的。因此，本發(fā)明也涉及抗本發(fā)明的TbpA或TbpB，或者TbpA或TbpB相關(guān)蛋白質(zhì)的抗體。在一個(gè)實(shí)施方案中，抗體是抗寬范圍的血清型溶血巴斯德氏菌TbpA或TbpB，或者TbpA或TbpB相關(guān)蛋白質(zhì)交叉反應(yīng)性的。所說的抗體可以用于診斷以及治療溶血巴斯德氏菌感染，例如，可用于被動(dòng)免疫以治療或預(yù)防反芻動(dòng)物中由溶血巴斯德氏菌引起的疾病。
本發(fā)明進(jìn)一步包括疫苗組合物，這些組合物包含本發(fā)明的TbpA或TbpB，或者TbpA或TbpB相關(guān)蛋白質(zhì)，兩者之一或兩者組合在一起。本發(fā)明還進(jìn)一步包括通過施用治療有效量的所述疫苗免疫宿主(優(yōu)選地是反芻動(dòng)物)使其抵抗溶血巴斯德氏菌感染的方法。本發(fā)明發(fā)明人已弄清來源于一系列反芻動(dòng)物的不同溶血巴斯德氏菌的菌株能夠結(jié)合和利用一系列反芻動(dòng)物運(yùn)鐵蛋白。因此可以預(yù)期本發(fā)明的疫苗組合物作為適于免疫一系列反芻動(dòng)物(例如綿羊、奶牛和山羊)使其抵抗寬范圍的溶血巴斯德氏菌生物型和血清型感染的廣譜疫苗是有用的。
本發(fā)明也涉及編碼TbpA或TbpB，或者TbpA或TbpB相關(guān)蛋白質(zhì)的本發(fā)明的核酸分子在重組病毒載體疫苗(用于增強(qiáng)反芻動(dòng)物對(duì)溶血巴斯德氏菌的免疫反應(yīng)或者治療溶血巴斯德氏菌感染)中的用途?？梢杂帽绢I(lǐng)域公知技術(shù)構(gòu)建重組病毒載體。
本發(fā)明的其它目的，特點(diǎn)以及優(yōu)點(diǎn)從下列詳細(xì)描述中可以明顯看出。然而，應(yīng)當(dāng)理解，顯示本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案的詳細(xì)描述和特定的實(shí)施例僅僅以說明的方式給出，因?yàn)橥ㄟ^這些詳細(xì)描述，本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)清楚在本發(fā)明的本質(zhì)和范圍內(nèi)的各種改變和修改。
現(xiàn)在參照附圖描述本發(fā)明，在附圖中

圖1是PCR方法(a)以及由Tbp1引物和左引物(b)擴(kuò)增的0.8kb PCR產(chǎn)物的一個(gè)示意性圖；圖2是tbp質(zhì)粒9,10和482的限制性內(nèi)切核酸酶圖譜；圖3是溶血巴斯德氏菌tbpA和tpbB的基本核苷酸序列；圖4是溶血巴斯德氏菌TbpB(PHTBPB)的啟動(dòng)子區(qū)；圖5是以ClaⅠ消化的并且用tbpA基因探查的溶血巴斯德氏菌基因組DNA的Southern雜交印跡；圖6是以HindⅢ和BamHⅠ消化的并且用tbpA基因探查的溶血巴斯德氏菌基因組DNA的Southern雜交印跡；圖7是以各種選擇性內(nèi)切核酸酶消化的并且用溶血巴斯德氏菌tbpA探查的豬放線桿菌(A.suis)37114、胸膜肺炎放線桿菌CM5和shope 4074基因組DNA的Southern雜交印跡；圖8是溶血巴斯德氏菌A1，胸膜肺炎放線桿菌CM5,Shope 4074和豬放線桿菌3714中的tbpA、tbpB區(qū)的限制性酶切圖；圖9顯示了溶血巴斯德氏菌A1的Tbp1(PHTBP)和淋病奈瑟氏球菌的Tbp1(NGTBP1)與腦膜炎奈瑟氏球菌的Tbp1(NM1)的氨基酸序列對(duì)比；圖10顯示了溶血巴斯德氏菌A1的Tbp1(PHTBP)和胸膜肺炎放線桿菌血清型1和7 TfbA蛋白質(zhì)(APL,APL7)的氨基酸序列對(duì)比；
圖11是說明溶血巴斯德氏菌A1的Tbp1(PHTBP)和淋病奈瑟氏球菌的Tbp1(NGTBP1)，腦膜炎奈瑟氏球菌的Tbp1(NM1)和胸膜肺炎放線桿菌血清型1和7 TfbA蛋白質(zhì)(APL,APL7)之間的遺傳相關(guān)性的圖示；圖12是溶血巴斯德氏菌A1 Tbp1和大腸桿菌TonB-依賴性外膜受體之間的肽序列對(duì)比；圖13是顯示溶血巴斯德氏菌Tbp1蛋白質(zhì)的T7分析的印跡；圖14是溶血巴斯德氏菌A1和大腸桿菌HB101的內(nèi)和外膜的Western免疫印跡；圖15是采用在小牛中用Presponse接種抗可溶性抗原產(chǎn)生的血清獲得的溶血巴斯德氏菌A1和大腸桿菌HB101的內(nèi)和外膜的Western免疫印跡；圖16是顯示由鐵-缺乏細(xì)菌膜結(jié)合的標(biāo)記運(yùn)鐵蛋白的印跡；圖17是顯示用運(yùn)鐵蛋白親和柱分離受體蛋白質(zhì)的免疫印跡；圖18是顯示來源于牛、綿羊和山羊的不同血清型溶血巴斯德氏菌的受體蛋白質(zhì)的免疫學(xué)分析的免疫印跡，其中A組用抗-TbpB血清，B組用抗-TbpA血清；圖19顯示由完整的細(xì)胞結(jié)合的標(biāo)記運(yùn)鐵蛋白和抗-受體抗體的印跡；圖20是溶血巴斯德氏菌tbp操縱子(頂端)和溶血巴斯德氏菌tbp操縱子(頂端)和調(diào)節(jié)序列(底端)的圖；tbpA和tbpB分別是編碼TbpA和TbpB的基因；p是在tbpB前的推定的啟動(dòng)子區(qū)，在底部以-35和-10部位表示；圖21和SEQ ID NO:1顯示溶血巴斯德氏菌菌株h196 tbpA基因的DNA序列；圖22和SEQ ID NO:2顯示溶血巴斯德氏菌菌株h196的TbpA蛋白質(zhì)的預(yù)測(cè)的氨基酸序列；圖23和SEQ ID NO:3顯示溶血巴斯德氏菌菌株h196 tbpB基因的DNA序列；圖24和SEQ ID NO:4顯示溶血巴斯德氏菌菌株h196的TbpB蛋白質(zhì)的預(yù)測(cè)的氨基酸序列；圖25是顯示固相HRP-Tf結(jié)合測(cè)定結(jié)果的印跡；圖26是顯示用溶血巴斯德氏菌血清型A1的抗-TbpA和抗-TbpB抗血清進(jìn)行的銀染(A組)和Western印跡(B組)研究的印跡；圖27是顯示用抗完整細(xì)胞的溶血巴斯德氏菌血清型A1的單特異性抗-TbpA和抗-TbpB抗血清進(jìn)行的交叉反應(yīng)性研究結(jié)果的印跡；圖28顯示PCR擴(kuò)增的溶血巴斯德氏菌和海藻巴斯德氏菌菌株的tbpA(A組)和tbpB(B組)基因的限制性內(nèi)切核酸酶消化模式的凝膠；和圖29是顯示tbpA(A組)和tbpB(B組)基因可變區(qū)段的PCR擴(kuò)增的凝膠。
氨基酸殘基的下列標(biāo)準(zhǔn)縮寫在整個(gè)說明書中使用A,Ala-丙氨酸；C,Cys-半胱氨酸；D,Asp-天冬氨酸；E,Glu-谷氨酸；F,Phe-苯丙氨酸；G,Gly-甘氨酸；H,His-組氨酸；I,Ile-異亮氨酸；K,Lys-賴氨酸；L,Leu-亮氨酸；M,Met-甲硫氨酸；N,Asn-天冬酰胺；P,Pro-脯氨酸；Q,Gln-谷氨酰胺；R,Arg-精氨酸；S,Ser-絲氨酸；T,Thr-蘇氨酸；V,Val-纈氨酸；W,Trp-色氨酸；Y,Tyr-酪氨酸；和p.Y.,P.Tyr-磷酸酪氨酸。Ⅰ．本發(fā)明的核酸分子如上文所述，本發(fā)明提供了包含編碼TbpA蛋白質(zhì)的序列的純化的與分離的核酸分子，或包含編碼TbpB蛋白質(zhì)的序列的純化的與分離的核酸分子。術(shù)語＂分離的與純化的＂指當(dāng)經(jīng)重組DNA技術(shù)產(chǎn)生時(shí)實(shí)質(zhì)上沒有細(xì)胞物質(zhì)或培養(yǎng)基，或者當(dāng)用化學(xué)合成產(chǎn)生時(shí)實(shí)質(zhì)上沒有化學(xué)前體或其它化學(xué)物質(zhì)的核酸。＂分離的與純化的＂核酸也沒有天然側(cè)翼于所述核酸所來源的核酸的序列(即，位于所述核酸5’和3’端的序列)，術(shù)語＂核酸＂旨在包括DNA和RNA，并且可以是雙鏈或單鏈。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，提供了編碼具有圖22或SEQ.ID.NO:2所示的氨基酸序列的TbpA的核酸分子。在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了編碼具有圖24或SEQ.ID.NO:4所示的氨基酸序列的TbpB的核酸分子。在本發(fā)明的優(yōu)選的實(shí)施方案中，所說的核酸分子是包含圖21或SEQ.ID.NO:1所示的核苷酸序列或者圖23或SEQ.ID.NO:3所示的核苷酸序列的DNA。
本發(fā)明包括互補(bǔ)于以下核酸的核酸序列(a)編碼具有圖22或SEQ.ID.NO:2所示的氨基酸序列的TbpA的核酸；(b)編碼具有圖24或SEQ.ID.NO:4所示的氨基酸序列的TbpB的核酸；(c)具有圖21或SEQ.ID.NO:1或者圖23或SEQ.ID.NO:3所示的序列的核酸。優(yōu)選地，所說的序列互補(bǔ)于圖21或SEQ.ID.NO:1或者圖23或SEQ.ID.NO:3所示的全長核酸序列。
本發(fā)明也包括與以下核酸序列具有實(shí)質(zhì)上的序列等同性或同源性的核酸分子圖21或SEQ.ID.NO:1所示的或圖23或SEQ.ID.NO:3所示的核酸序列；分別編碼具有與圖22或SEQ.ID.NO:2所示的或圖24或SEQ.ID.NO:4所示的氨基酸序列實(shí)質(zhì)上的同源性的TbpA或TbpB蛋白質(zhì)的核酸序列。同源性指序列之間的序列相似性，可以通過比較在各序列(為了比較的目的所排列的)中的位置確定。當(dāng)在所比較的序列中的一個(gè)位置由相同的核苷酸堿基或氨基酸占據(jù)時(shí)，則這些分子是匹配的或具有這些序列所共有的相同的位置。
具有實(shí)質(zhì)上同源性的核酸序列包括(a)與圖21或SEQ.ID.NO:1所示的核酸序列具有至少40-60％，優(yōu)選地60-80％，最優(yōu)選地80-90％的等同性的核酸序列；和(b)與圖23或SEQ.ID.NO:3所示的核酸序列具有至少40-60％，優(yōu)選地60-80％，最優(yōu)選地80-90％的等同性的核酸序列。
本發(fā)明的另一方面提供了這樣的核酸分子以及其具有至少15個(gè)核苷酸堿基的片段，所述的核酸分子在雜交條件下，優(yōu)選地是在嚴(yán)格雜交條件下與本發(fā)明的核酸分子雜交。有利于DNA雜交的適當(dāng)?shù)膰?yán)格條件是本領(lǐng)域技術(shù)人員知道的，或者可以在分子生物學(xué)的當(dāng)代方案(John Wiley＆Sons,N.Y.(1989)6.3.1-6.3.6)中找到。例如，采用在約45℃下的6.0 X氯化鈉/檸檬酸鈉(SSC)，其后為在50℃下的2.0 X SSC洗滌。基于在洗滌步驟中使用的條件，可以選擇嚴(yán)格度。舉例來說，在洗滌步驟中的鹽濃度可以選擇在50℃下的約0.2X SSC的高嚴(yán)格度。此外，在洗滌步驟中的溫度可以在高嚴(yán)格條件下，在約65℃。
編碼具有TbpA或TbpB活性的蛋白質(zhì)的分離的與純化的核酸分子，和由于遺傳密碼子簡并性分別具有不同于圖21或SEQ.ID.NO:1或者圖23或SEQ.ID.NO:3所示的核酸序列的序列的分離的與純化的核酸分子也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。這樣的核酸應(yīng)編碼功能上等同TbpA或TbpB的蛋白質(zhì)，但由于遺傳密碼子簡并性，序列上分別不同于圖21或SEQ.ID.NO:1或者圖23或SEQ.ID.NO:3所示的序列。
包括DNA在內(nèi)的本發(fā)明的分離的與純化的核酸分子可以通過以下方法分離基于圖21或SEQ.ID.NO:1或者圖23或SEQ.ID.NO:3所示的全部或部分核酸序列制備標(biāo)記的核酸探針，并使用該標(biāo)記的核酸探針篩選合適的DNA文庫(例如cDNA或基因組DNA文庫)。通過篩選cDNA或基因組DNA文庫分離到的核酸可以用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)測(cè)序。
為DNA的本發(fā)明的分離的與純化核酸分子也可以通過以下方法分離利用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)方法和cDNA或基因組DNA選擇性地?cái)U(kuò)增編碼TbpA或TbpB的核酸。從圖21或SEQ.ID.NO:1或者圖23或SEQ.ID.NO:3所示的核苷酸序列設(shè)計(jì)用于PCR的合成寡核苷酸引物是可能的。利用這些寡核苷酸引物與標(biāo)準(zhǔn)的PCR擴(kuò)增技術(shù)可以從cDNA或基因組DNA擴(kuò)增核酸。如此擴(kuò)增的核酸可被克隆進(jìn)一種合適的載體中，并且通過DNA序列分析確定特征。合乎需要的是通過用各種技術(shù)，例如通過使用Chirgwin等，生物化學(xué)，18,5294-5299(1979)的硫氰酸胍抽提法，分離總細(xì)胞mRNA，可以從mRNA制備cDNA。然后利用逆轉(zhuǎn)錄酶(例如，由Gibco/BRL Bethesda,MD提供的Moloney MLV逆轉(zhuǎn)錄酶，或由Seikagaku America,Inc.St.Petersburg，F(xiàn)L提供的AMV逆轉(zhuǎn)錄酶)從mRNA合成cDNA。
是RNA的本發(fā)明的分離的與純化的核酸分子可以通過以下方法分離將編碼TbpA或TbpB的cDNA克隆進(jìn)一個(gè)適當(dāng)?shù)妮d體中，這種載體允許所說的cDNA轉(zhuǎn)錄，產(chǎn)生編碼顯示出TbpA或TbpB活性的蛋白質(zhì)的RNA分子。
本發(fā)明的核酸分子也可以利用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)化學(xué)合成?；瘜W(xué)合成聚脫氧核苷酸的各種方法是已知的，包括如同肽合成的固相合成，其已由市售的DNA合成儀完全自動(dòng)化(參見例如，Itakura等的美國專利4,598,049；Caruthers等的美國專利4,458,066；以及Itakura的美國專利4,401,796和4,373,071)。
確定特定的核酸分子是否編碼具有TbpA或TbpB活性的蛋白質(zhì)可以通過以下方法完成用標(biāo)準(zhǔn)的技術(shù)在合適的宿主細(xì)胞中表達(dá)DNA，試驗(yàn)所表達(dá)的蛋白質(zhì)結(jié)合反芻動(dòng)物運(yùn)鐵蛋白和/或調(diào)節(jié)鐵攝取的能力。具有這樣的活性的cDNA可以用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)測(cè)序，如用雙脫氧核苷酸鏈終止或Maxam-Gilbert測(cè)序法，以確定核酸序列和所編碼的蛋白質(zhì)的預(yù)計(jì)氨基酸序列。
采用常規(guī)技術(shù)可以鑒別tbpA或tbpB的調(diào)節(jié)元件。通過用這些元件表達(dá)有效連接到這些元件上的報(bào)道基因可以證實(shí)這些元件的功能。采用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)可以將這些構(gòu)建體引入到培養(yǎng)細(xì)胞中。
本發(fā)明的核酸分子的序列相對(duì)于正常出現(xiàn)而言，為了轉(zhuǎn)錄可以顛倒，以產(chǎn)生反義核酸分子。利用本領(lǐng)域已知的方法，用化學(xué)合成和酶促連接反應(yīng)可以構(gòu)建反義核酸分子。Ⅱ．重組TbpA和TbpB本發(fā)明也涉及純化的與分離的來源于溶血巴斯德氏菌A1的TbpA或TbpB蛋白質(zhì)，這些蛋白質(zhì)顯示出運(yùn)鐵蛋白結(jié)合活性。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，提供了具有圖22或SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的純化的TbpA蛋白質(zhì)。在另一個(gè)本發(fā)明的實(shí)施方案中，提供了具有圖24或SEQ IDNO:4所示的氨基酸序列的純化的TbpB蛋白質(zhì)。重組TbpB不同于天然受體復(fù)合物，它識(shí)別在運(yùn)鐵蛋白的N-片段與C-片段上的結(jié)合決定簇。
除全長TbpA或TbpB氨基酸序列之外，如本文的描述，本發(fā)明的蛋白質(zhì)包括TbpA或TbpB的截短物，以及TbpA或TbpB的類似物和同系物和它們的截短物。截短的蛋白質(zhì)可以包括具有至少3個(gè)氨基酸殘基的肽。該截短的蛋白質(zhì)可以具有氨基(-NH2)；在氨基末端的疏水基團(tuán)(例如芐氧羰基、丹酰、或叔-丁氧羰基)、乙酰基、9-芴基甲氧-羰基(PMOC)、或大分子(包括但不限于脂-脂肪酸綴合物、聚乙二醇或糖類)。該截短的蛋白質(zhì)可以具有羧基；在羧基末端的酰氨基、叔-丁氧羰基、或大分子(包括但不限于脂-脂肪酸綴合物、聚乙二醇、或糖類)。
如本文所描述的，本發(fā)明的蛋白質(zhì)也包括分別在圖22或SEQ ID NO:2或者圖24或SEQ ID NO:4所示的TbpA或TbpB的類似物，和/或它們的截短物，其可以包括但不限于含有一個(gè)或多個(gè)氨基酸取代，插入和/或缺失的TbpA或TbpB(圖22或SEQ ID NO:2或者圖24或SEQ ID NO:4)。氨基酸取代可以是具有保守或非-保守性質(zhì)的。保守氨基酸取代包括以類似的電荷、大小和/或疏水性特征的氨基酸取代TbpA或TbpB氨基酸序列中的一個(gè)或多個(gè)氨基酸。當(dāng)僅進(jìn)行保守取代時(shí)，所形成的類似物應(yīng)該是功能上等同于TbpA或TbpB的。非保守取代包括以一個(gè)或多個(gè)不類似的電荷、大小和/或疏水性特征的氨基酸取代TbpA或TbpB氨基酸序列中的一個(gè)或多個(gè)氨基酸。
一個(gè)或多個(gè)氨基酸插入可以引入到TbpA或TbpB(圖22或SEQ ID NO:2或者圖24或SEQ ID NO:4)。氨基酸插入可以由單一氨基酸殘基或者長度在2至15個(gè)氨基酸范圍內(nèi)的連續(xù)氨基酸組成。
缺失可以由從TbpA或TbpB(圖22或SEQ ID NO:2或者圖24或SEQID NO:4)序列除去一個(gè)或多個(gè)氨基酸或不連續(xù)的部分組成。所缺失的氨基酸可以也可以不必鄰接。缺失突變所形成的類似物的低限長度是約10個(gè)氨基酸，優(yōu)選地是100氨基酸。
如本文的描述，本發(fā)明的蛋白質(zhì)也包括TbpA或TbpB(圖22或SEQ IDNO:2或者圖24或SEQ ID NO:4)的同系物和/或它們的截短物。這樣的TbpA或TbpB同系物是這樣一些蛋白質(zhì)，其氨基酸序列由其它物種的TbpA或TbpB區(qū)的氨基酸序列組成，所說的區(qū)在嚴(yán)格雜交條件(參見本文的嚴(yán)格雜交條件的討論)下與用于獲得TbpA或TbpB的探針雜交。
具有實(shí)質(zhì)上的同源性的蛋白質(zhì)包括與圖22(或SEQ ID NO:2)或者圖24(SEQ ID NO:4)所示的氨基酸序列至少具有40-60％，優(yōu)選地60-80％，最優(yōu)選地80-90％等同性的蛋白質(zhì)序列。
本發(fā)明也涉及本發(fā)明的蛋白質(zhì)的同工型。同工型含有與本發(fā)明的蛋白質(zhì)相同數(shù)量和種類的氨基酸，但是同工型具有不同的分子結(jié)構(gòu)。本發(fā)明所包括的同工型是那些具有與本發(fā)明的蛋白質(zhì)相同的性質(zhì)的那些。
本發(fā)明也包括與所選擇的蛋白質(zhì)或選擇性標(biāo)記蛋白質(zhì)(參見下述)綴合產(chǎn)生融合蛋白質(zhì)的TbpA,TbpB或TbpA或TbpB相關(guān)蛋白質(zhì)。另外，TbpA,TbpB或TbpA或TbpB相關(guān)蛋白質(zhì)的免疫原性部分也在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
利用重組DNA方法制備本發(fā)明的TbpA,TbpB或者TbpA或TbpB相關(guān)蛋白質(zhì)。因此，具有編碼本發(fā)明的TbpA,TbpB或者TbpA或TbpB相關(guān)蛋白質(zhì)的序列的本發(fā)明的核酸分子可以用已知的方式摻合到保證所說的蛋白質(zhì)得到很好表達(dá)的適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體中。表達(dá)載體＂適于轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞＂意指表達(dá)載體含有本發(fā)明的核酸分子，和基于用于表達(dá)的宿主細(xì)胞所選擇的調(diào)節(jié)序列，這些調(diào)節(jié)序列有效地與所說的核酸分子連接。有效連接意指核酸以使得其可以表達(dá)的方式與調(diào)節(jié)序列連接。
因此，本發(fā)明涉及包含本發(fā)明的核酸分子、或其片段以及插入的蛋白質(zhì)序列轉(zhuǎn)錄和翻譯所必需的調(diào)節(jié)序列的重組表達(dá)載體。合適的調(diào)節(jié)序列可以來自各種來源，包括細(xì)菌，真菌，病毒，哺乳動(dòng)物或昆蟲基因。對(duì)適當(dāng)?shù)恼{(diào)節(jié)序列的選擇依賴于按以下討論所選擇的宿主細(xì)胞，易于由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員完成。
本發(fā)明的重組表達(dá)載體也可以含有選擇性標(biāo)記基因，該基因有利于以本發(fā)明的重組分子轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞的選擇。選擇性標(biāo)記基因的例子是編碼賦予某些藥物抗性的蛋白質(zhì)或β-半乳糖苷酶的基因。
重組表達(dá)載體也可以含有編碼融合部分的基因，其給出重組蛋白質(zhì)增加的表述；重組蛋白質(zhì)增加的溶解性；并通過在親和純化法中作為配體有助于靶重組蛋白質(zhì)的純化。
重組表達(dá)載體可以引入宿主細(xì)胞產(chǎn)生轉(zhuǎn)化體宿主細(xì)胞。術(shù)語＂轉(zhuǎn)化體宿主細(xì)胞＂旨在包括已由本發(fā)明的重組表達(dá)載轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的原核和真核細(xì)胞。術(shù)語＂用...轉(zhuǎn)化＂，＂用...轉(zhuǎn)染＂，＂轉(zhuǎn)化＂和＂轉(zhuǎn)染＂旨在包括通過本領(lǐng)域已知的許多可能的技術(shù)之一將核酸(例如載體)引入到細(xì)胞中。轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞的合適的方法可以在Sambrook等(分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)，第二版，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社(1989))和其它實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)中找到。
本發(fā)明的蛋白質(zhì)也可以經(jīng)采用蛋白質(zhì)化學(xué)領(lǐng)域已知的技術(shù)由化學(xué)合成制備，所說的技術(shù)例如固相合成(Merrifield,1964，美國化學(xué)會(huì)雜志，85:2149-2154)或均相溶液中合成法(Houbenweyl,1987，有機(jī)化學(xué)方法，編者E.Wansch,Vol.15Ⅰ和Ⅱ,Thieme，斯圖加特)。
包括與其它分子(例如蛋白質(zhì))綴合的本發(fā)明的TbpA,TbpB，或TbpA或TbpB相關(guān)蛋白質(zhì)在內(nèi)的N-端或C-端融合蛋白可以經(jīng)重組技術(shù)將TbpA,TbpB，或TbpA或TbpB相關(guān)蛋白質(zhì)N-端或C-端與所選擇的蛋白質(zhì)或選擇性標(biāo)記蛋白質(zhì)(具有所需生物功能)的序列融合而制備。所形成的融合蛋白含有融合進(jìn)所選擇的蛋白質(zhì)或標(biāo)記蛋白質(zhì)的TbpA,TbpB，或TbpA或TbpB相關(guān)蛋白。Ⅲ．本發(fā)明的應(yīng)用本發(fā)明的核酸分子使得本領(lǐng)域技術(shù)人員可以構(gòu)建用于檢測(cè)樣品中的核酸序列的核苷酸探針。合適的探針包括基于分別編碼圖22和SEQ ID NO:2或者圖24和SEQ ID NO:4中所示的TbpA或TbpB蛋白質(zhì)的區(qū)的至少6個(gè)連續(xù)氨基酸之核酸序列的核酸分子。例如，合適的探針可以包括選自圖21和SEQ ID NO:1所示的TbpA序列的1741至2784位核苷酸的TbpA的核酸分子。核苷酸探針可以用可檢測(cè)的物質(zhì)標(biāo)記，所述物質(zhì)如提供充分的信號(hào)并且具有足夠的半衰期的放射性標(biāo)記，如32P,3H,14C或類似的物質(zhì)?？杀焕玫钠渌蓹z測(cè)的物質(zhì)包括被特異性標(biāo)記抗體識(shí)別的抗原，熒光化合物，酶，對(duì)標(biāo)記抗原特異性的抗體和發(fā)光化合物。合適的標(biāo)記可以基于考慮雜交速率，探針對(duì)待測(cè)核苷酸的結(jié)合和雜交可用的核苷酸的量選擇。如Sambrook等1989，分子克隆，實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(第二版)中一般性所描述的，標(biāo)記的探針可以在固相支持體(例如硝酸纖維素濾膜或尼龍膜)上與核酸雜交。所說的核酸探針可以用于檢測(cè)編碼TbpA,TbpB，或者TbpA或TbpB相關(guān)蛋白質(zhì)的基因，優(yōu)選的是在人細(xì)胞中的。
本發(fā)明的TbpA,TbpB，或者TbpA或TbpB相關(guān)蛋白質(zhì)可以用于制備對(duì)所述蛋白質(zhì)特異性的抗體。常規(guī)方法可以用來制備抗體。為了產(chǎn)生多克隆抗體，可以用TbpA,TbpB蛋白質(zhì)的片段或者兩者的混合物免疫哺乳類動(dòng)物，如兔，小鼠或大鼠。蛋白質(zhì)的免疫原性通過添加佐劑至蛋白質(zhì)混合物中或通過將蛋白質(zhì)與免疫原性載體綴合可以得到增強(qiáng)。載體的例子包括鑰孔血藍(lán)蛋白(KLH)和牛血清白蛋白(BSA)。
為了產(chǎn)生單克隆抗體，可以從動(dòng)物(如上所述免疫的)收獲產(chǎn)生抗體的細(xì)胞(淋巴細(xì)胞)，并且用標(biāo)準(zhǔn)的體細(xì)胞融合方法與骨髓瘤細(xì)胞融合，由此使這些細(xì)胞無限增殖和產(chǎn)生雜交瘤細(xì)胞。這樣的技術(shù)是本領(lǐng)域已知的，例如，最初由Kohler和Milstein(自然256,495-497(1975))開發(fā)的雜交瘤技術(shù)，以及其它技術(shù)，例如人B-細(xì)胞雜交瘤技術(shù)(Kozbor等，當(dāng)代免疫學(xué)，4,72(1983))，產(chǎn)生人單克隆抗體的EBV-雜交瘤技術(shù)(Cole等，在癌治療中單克隆抗體(1985)Allen R.Bliss,Inc.,77-96頁)，以及篩選組合抗體文庫(Huse等，科學(xué)246,1275(1989)]?？梢越?jīng)免疫化學(xué)篩選雜交瘤細(xì)胞，以產(chǎn)生與所說的肽發(fā)生特異性反應(yīng)的抗體，并且可以分離單克隆抗體。因此，本發(fā)明也涉及分泌具有對(duì)如本文所描述的TbpA或TbpB或者TbpA或TbpB相關(guān)蛋白質(zhì)特異性的單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞。
本文所使用的術(shù)語＂抗體＂旨在包括其片段，這些片段也特異性地與具有TbpA或TbpB活性的蛋白質(zhì)或其肽反應(yīng)?？梢杂贸Ｒ?guī)技術(shù)使抗體片段化，篩選的片段以本文描述的相同的方式使用。例如，F(xiàn)(ab’)2片段可以通過利用胃蛋白酶處理抗體產(chǎn)生?？梢蕴幚硭纬傻腇(ab’)2片段，還原二硫鍵，產(chǎn)生Fab’片段。多價(jià)抗體可以通過融合兩個(gè)或多個(gè)F(ab’)2片段或Fab’片段制備。例如，多價(jià)抗體可以含有一個(gè)對(duì)TbpA特異性的F(ab’)2片段和一個(gè)對(duì)TbpB特異性的F(ab’)2片段。
嵌合的抗體衍生物，即，結(jié)合非反芻動(dòng)物可變區(qū)和反芻動(dòng)物恒定區(qū)的抗體分子也包括在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。嵌合的抗體分子可以包括，例如，小鼠，大鼠或其它物種抗體的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域，以及牛恒定區(qū)。常規(guī)方法可以用來制造包含免疫球蛋白可變區(qū)(其識(shí)別本發(fā)明的新的Tbp基因的基因產(chǎn)物)的嵌合抗體(參見，例如，Morrison等，美國科學(xué)院院報(bào)81,6651(1985)；Takeda等，自然314,452(1985),Cabilly等，美國專利4,816,567；Boss等，美國專利4,816,397；Tanaguchi等，歐洲專利出版物EP171496；歐洲專利出版物0173494)。
與TbpA,TbpB或者TbpA或TbpB相關(guān)蛋白質(zhì)，或其衍生物(如酶綴合物或標(biāo)記的衍生物)特異性反應(yīng)的抗體可以用作檢測(cè)樣品(例如組織和細(xì)胞)中的TbpA,TbpB或者TbpA或TbpB相關(guān)蛋白質(zhì)的探針，例如它們可以用于任何依賴于TbpA,TbpB或者TbpA或TbpB相關(guān)蛋白質(zhì)的抗原決定簇與抗體之間的結(jié)合相互作用的已知免疫測(cè)定中。這樣的測(cè)定的例子是放射免疫測(cè)定，酶免疫測(cè)定(例如ELISA)，免疫熒光，免疫沉淀法，乳汁凝集作用，血凝，以及組織化學(xué)測(cè)定。這樣，抗體可以用于檢測(cè)并且在樣品中定量TbpA,TbpB或者TbpA或TbpB相關(guān)蛋白質(zhì)。在一個(gè)實(shí)施方案中，抗體是對(duì)寬范圍血清型溶血巴斯德氏菌TbpA或TbpB或TbpA，或TbpB相關(guān)蛋白質(zhì)交叉反應(yīng)性的。當(dāng)用作探針時(shí)，抗體通常用本領(lǐng)域已知的技術(shù)標(biāo)記。
本發(fā)明的抗體也可以用于溶血巴斯德氏菌感染的診斷和治療。在一個(gè)實(shí)施方案中，抗體用于被動(dòng)免疫，以治療或預(yù)防反芻動(dòng)物中由溶血巴斯德氏菌引起的疾病。在這種情況下，可以利用抗體的混合物或多價(jià)抗體。
本發(fā)明還進(jìn)一步地提供了用于鑒別能夠結(jié)合到TbpA或TbpB或者TbpA或TbpB相關(guān)蛋白質(zhì)，或它們的活化形式上的物質(zhì)的方法，該方法包括使TbpA或TbpB，或者TbpA或TbpB相關(guān)蛋白質(zhì)，或它們的活化形式與至少一種潛在地可以與TbpA或TbpB，或者TbpA或TbpB相關(guān)蛋白質(zhì)，或它們的活化形式結(jié)合的物質(zhì)在使得可以在所說物質(zhì)與TbpA或TbpB，或者TbpA或TbpB相關(guān)蛋白質(zhì)，或它們的活化形式之間形成復(fù)合物的條件下反應(yīng)，并測(cè)定復(fù)合物、游離的物質(zhì)、非復(fù)合的TbpA或TbpB，或者TbpA或TbpB相關(guān)蛋白質(zhì)，或它們的活化形式。潛在地可以與TbpA或TbpB，或者TbpA或TbpB相關(guān)蛋白質(zhì)結(jié)合的物質(zhì)包括運(yùn)鐵蛋白，特別是反芻動(dòng)物運(yùn)鐵蛋白，運(yùn)鐵蛋白的類似物和衍生物和抗TbpA和TbpB，或TbpA或TbpB相關(guān)蛋白質(zhì)的抗體。
此外，本發(fā)明還提供了一種測(cè)定介質(zhì)中TbpA或TbpB，或者TbpA或TbpB相關(guān)蛋白質(zhì)和與TbpA或TbpB，或者TbpA或TbpB相關(guān)蛋白質(zhì)，或其活化形式結(jié)合的物質(zhì)之間相互作用的興奮劑或拮抗劑的存在的方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述的方法包括在所說物質(zhì)與TbpA或TbpB，或者TbpA或TbpB相關(guān)蛋白質(zhì)之間能夠形成復(fù)合物的條件下提供已知濃度的TbpA或TbpB，或者TbpA或TbpB相關(guān)蛋白質(zhì)，以及能夠結(jié)合到TbpA或TbpB，或者TbpA或TbpB相關(guān)蛋白質(zhì)上的物質(zhì)和懷疑的興奮劑或拮抗劑物質(zhì)，并且測(cè)定復(fù)合物、游離的物質(zhì)、非復(fù)合的TbpA或TbpB，或者TbpA或TbpB相關(guān)蛋白質(zhì)。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述的物質(zhì)是反芻動(dòng)物運(yùn)鐵蛋白、其類似物，衍生物或部分，或者抗TbpA或TbpB，或者TbpA或TbpB相關(guān)蛋白質(zhì)的抗體。
影響TbpA或TbpB，或者TbpA或TbpB相關(guān)蛋白質(zhì)的表達(dá)的物質(zhì)也可以通過比較在所述物質(zhì)的存在和不存在下，細(xì)胞中本發(fā)明的TbpA或TbpB，或者TbpA或TbpB相關(guān)蛋白質(zhì)的表達(dá)方式和水平，采用本發(fā)明的方法鑒別。
利用本發(fā)明的方法鑒別的物質(zhì)可以用于動(dòng)物的治療，特別是受到溶血巴斯德氏菌感染的反芻動(dòng)物的治療，因此它們可以配制成供反芻動(dòng)物施用的藥物組合物。所說的動(dòng)物例如患溶血巴斯德氏菌感染或者接觸溶血巴斯德氏菌感染的牛，綿羊以及山羊。
所說的物質(zhì)可以配制成用于施用于受治療者的藥物組合物，該組合物是適于體內(nèi)施用的生物學(xué)上相容的形式?！斑m于體內(nèi)施用的生物學(xué)上相容的形式”意指其中任何毒性副作用小于治療作用的待施用物質(zhì)的形式。該物質(zhì)可以施用于活的生物體，包括人和動(dòng)物。本發(fā)明的藥物組合物的治療有效量的施用被定義為給予獲得所需的結(jié)果所必需的有效量和時(shí)間。例如，一種物質(zhì)的治療有效量可以根據(jù)一些因素變化，這些因素例如個(gè)體疾病狀態(tài)、年齡、性別和體重，以及抗體在個(gè)體中激發(fā)所需反應(yīng)的能力。用藥方式可以調(diào)節(jié)，以給出最佳的治療反應(yīng)。
所說的活性物質(zhì)可以以一種方便的方式施用，例如注射(皮下，靜脈內(nèi)，等)，口服，吸入，經(jīng)皮使用，或直腸施用。依據(jù)施用途徑，活性物質(zhì)可以包衣在物質(zhì)中，以便保護(hù)化合物使之免受酶，酸，以及滅活化合物的其它天然條件的作用。
本文所描述的組合物可以通過用于制備藥學(xué)上可接受的組合物(其可以施用于受治療者)的本來已知的方法制備，以便有效量的活性物質(zhì)在混合物中與藥學(xué)上可接受的載體組合。合適的載體在例如Remington的藥物科學(xué)(Remington的藥物科學(xué)，Mack出版公司，Easton,Pa.,美國1985)中有描述。在此基礎(chǔ)上，所說的組合物包括但不限于與一種或多種藥學(xué)上可接受的載體或稀釋劑締合的所述物質(zhì)的溶液，和包含在具有合適的pH值和與生理體液等滲的緩沖溶液中的所述物質(zhì)的溶液。
TbpA或TbpB和/或TbpA或TbpB相關(guān)蛋白質(zhì)可以用作在動(dòng)物中預(yù)防和治療各種傳染病的疫苗。包含在本發(fā)明中的傳染病包括由溶血巴斯德氏菌引起的感染，例如牛中的牛肺炎，綿羊中的全身性疾病和肺炎。此外，按照本發(fā)明的疫苗也可以用于預(yù)防和治療由其它Pasteurella spp引起的感染。一個(gè)例子是在牛、豬和家禽中預(yù)防和治療多殺巴斯德氏菌，包括呼吸和全身性感染，例如出血性敗血癥和牛乳腺炎。預(yù)期所說的疫苗可以施用于各種動(dòng)物，優(yōu)選地是反芻動(dòng)物，包括牛、綿羊和山羊。
本發(fā)明發(fā)明人證明一系列反芻動(dòng)物的溶血巴斯德氏菌不同菌株都可以結(jié)合和利用一系列反芻動(dòng)物運(yùn)鐵蛋白。因此可以預(yù)期，本發(fā)明的疫苗組合物作為適于免疫一系列反芻動(dòng)物(如綿羊，奶牛以及山羊)使其抵抗寬范圍的溶血巴斯德氏菌生物型和血清型引起的感染的廣譜疫苗是有用的。
所說的疫苗組合物包含TbpA,TbpB和/或TbpA或TbpB相關(guān)蛋白質(zhì)，兩者之一或者兩者。該疫苗組合物可以含有所描述的蛋白質(zhì)或其免疫原性片段的任何組合。此外，所述組合物可以含有Tbp蛋白質(zhì)，這些蛋白質(zhì)是從一種或多種溶血巴斯德氏菌生物型或血清型或者其它微生物分離的。包括TbpA,TbpB和/或TbpA或TbpB相關(guān)蛋白質(zhì)的重組蛋白質(zhì)優(yōu)選地用于本發(fā)明的疫苗組合物中。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的一種或多種重組TbpA或TbpB，和TbpA或TbpB相關(guān)蛋白質(zhì)用于疫苗組合物中。在另一個(gè)本發(fā)明的實(shí)施方案中，疫苗組合物含有純化的與分離的TbpA和TbpB，優(yōu)選地是重組TbpA和TbpB。
本發(fā)明的疫苗含有免疫有效量的一種或多種TpbA,TbpB,TbpA相關(guān)蛋白質(zhì)，和TbpB相關(guān)蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)的最佳量取決于感染(需要針對(duì)它進(jìn)行保護(hù))的性質(zhì)，待保護(hù)動(dòng)物的特征，以及本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它因素。
除TpbA,TbpB,TbpA相關(guān)蛋白質(zhì)和/或TbpB相關(guān)蛋白質(zhì)之外，疫苗還可以包含一種免疫學(xué)上可接受的載體，如含水稀釋劑，懸浮助劑，緩沖液，賦形劑，和一種或多種本領(lǐng)域已知的佐劑。合適的佐劑包括氫氧化鋁，弗氏佐劑(完全或不完全)，細(xì)菌(如百日咳博德特氏菌或大腸桿菌)或細(xì)菌衍生的物質(zhì)，免疫刺激復(fù)合物(iscom)，油，sapronin，寡肽，乳化的石蠟-EmulsigenTM(MVP Labs,Ralston,Nebraska)，包含AL(OH)3的L80佐劑(Reheis，新澤西)，Quil A(Superphos)或技術(shù)人員已知的其它佐劑。優(yōu)選地，所說的佐劑是包含AL(OH)3的L80佐劑(Reheis，新澤西)和QuilA(Superphos)。疫苗可以摻入到使TbpA和/或TbpB蛋白質(zhì)在接受者中緩釋的脂質(zhì)體系統(tǒng)中。疫苗也可以含有防腐劑如疊氮化鈉，硫柳汞(thimersol)，慶大霉素，新霉素，以及多粘菌素。
疫苗可以是多價(jià)疫苗，并且還以預(yù)防和治療有效的方式含有溶血巴斯德氏菌的其它免疫原或與其它疾病相關(guān)的免疫原。例如，本發(fā)明的疫苗組合物可以含有溶血巴斯德氏菌白細(xì)胞毒素和TbpB。
本發(fā)明的疫苗可以以一種方便的方式施用，如靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、皮下、腹膜內(nèi)、產(chǎn)期內(nèi)或經(jīng)口。疫苗優(yōu)選地經(jīng)肌內(nèi)或皮下施用。
劑量取決于感染的性質(zhì)，所需的效果、所選擇的施用途徑和本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它因素。
本發(fā)明也涉及重組病毒載體疫苗和重組細(xì)菌載體疫苗在治療和/或預(yù)防溶血巴斯德氏菌感染上的用途，所說的疫苗含有本發(fā)明的編碼TbpA,TbpB,TbpA相關(guān)蛋白質(zhì)和/或TbpB相關(guān)蛋白質(zhì)的核酸分子。在這樣的系統(tǒng)中，TbpA或Tbpg蛋白質(zhì)在受體中從疫苗中的外源核酸分子體內(nèi)合成。采用本領(lǐng)域已知的技術(shù)和如本文的描述，可以構(gòu)建重組病毒或細(xì)菌載體。細(xì)菌系統(tǒng)的例子包括大腸桿菌和沙門氏菌(Salmonella spp)。
下列非限制性的實(shí)施例是說明本發(fā)明的。
實(shí)施例實(shí)施例1下列材料與方法用于實(shí)施例所描述的研究中材料和方法細(xì)菌菌株和克隆載體溶血巴斯德氏菌菌株由P.Shewen博士(Guelph大學(xué)獸醫(yī)微生物學(xué)和免疫學(xué)系(VMI))提供，這些菌株最初從E.Biberstein博士(加利福尼亞大學(xué)，Davis),G.Frank博士(USDA,Ames,Iowa)和W.Donachie博士(Moredun研究院，Edinburgh,U.K)獲得。豬放線桿菌(Actinobacillus suis)菌株3714，胸膜肺炎放線桿菌菌株CM5和Shope 4074由S.Rosendal博士(VMI)提供。大腸桿菌菌株HB101和TG-1由R.Lo博士(Guelph大學(xué)微生物學(xué)系)提供，用作克隆實(shí)驗(yàn)的受體菌株。大腸桿菌菌株JM109(DE3)由C.Whitfield博士(Guelph大學(xué)微生物學(xué)系)提供。
巴斯德氏菌屬和放線桿菌屬菌株保持在綿羊血瓊脂上并在心腦浸出肉湯(BHIB)(Difco Labs,Detroit,Michigan)中培養(yǎng)。大腸桿菌HB101在加有胸苷的Luria-Bertaini(LT)上培養(yǎng)，所述的培養(yǎng)基在用于選擇重組質(zhì)粒時(shí)以100mg/L補(bǔ)充了氨芐青霉素(西格瑪化學(xué)公司，圣路易斯，密蘇里)。類似地，大腸桿菌TG-1和JM109(DE3)在具有氨芐青霉素的Davis基本培養(yǎng)基中培養(yǎng)。通過加入鐵螯合劑乙二胺二(o-羥苯基乙酸)(EDDA)(西格瑪)至100μM的終濃度產(chǎn)生鐵-耗盡狀態(tài)。通過添加FeCl3至1mM產(chǎn)生鐵-耗盡狀態(tài)。
質(zhì)粒pBR322,噬菌體載體M13/mp18和M13/mp19按以前描述(Lo和Cameron,1986；Lo等，1985；和Lo等，1987)使用。pBluescript載體從Stratagene(La Jolla，加利福尼亞)獲得。重組克隆482由A.Schryvers博士(Calgary大學(xué)微生物學(xué)系)提供。
酶，化學(xué)藥品和抗血清限制性內(nèi)切核酸酶和DNA修飾酶從Bethesda研究實(shí)驗(yàn)室(BRL)(Burlington，安大略)或Pharmacia化學(xué)品公司(Dorval，魁北克)購買，并且按制造廠商的描述使用。放射性同位素從ICN生物化學(xué)公司(蒙特利爾，魁北克)或Amersham實(shí)驗(yàn)室(Oakville，安大略)購買。
山羊抗-兔免疫球蛋白G-堿性磷酸酶綴合物和免疫檢測(cè)試劑從Bio-Rad實(shí)驗(yàn)室(Mississauga，安大略)購買。山羊抗-牛免疫球蛋白G-堿性磷酸酶綴合物從杰克森免疫研究公司(西Grove,PA)購買。兔抗-自體抗血清和?？?Presponse抗血清從P.Shewen博士(Guelph大學(xué)獸醫(yī)微生物學(xué)和免疫學(xué)系)獲得。兔＂抗-自體＂抗血清針對(duì)溶血巴斯德氏菌A1(在補(bǔ)充有兔自身血清的RPMI 1640中培養(yǎng))的可溶性抗原產(chǎn)生。注意到RPMI 1640是一種貧鐵培養(yǎng)基是重要的。
DNA方法a)染色體DNA分離根據(jù)Marmer(1961)的方法從細(xì)菌細(xì)胞分離染色體DNA。將細(xì)菌接種在250ml合適的培養(yǎng)基中，并且在37℃于150rpm振蕩下培養(yǎng)過夜。下一天，通過在Sorvall RC5-B冷凍離心機(jī)(Dupont儀器公司，Mississauga，安大略)的GSA轉(zhuǎn)鼓中于4,000 xg離心10分鐘使細(xì)胞沉淀。沉淀懸浮在8ml0.6M山梨醇，0.05mM Tris-HCl(pH8.0),0.05M EDTA溶液中。加入溶菌酶(西格瑪)至3mg/ml終濃度，并且將樣品置于冰上溫育30分鐘。將2ml裂解液(0.5％SDS,0.05 M EDTA,0.05 M Tris-Cl[pH 8.0])和3 mg/ml蛋白酶K(西格瑪)溶液加入到樣品中，然后在37℃水浴中溫育4小時(shí)，接著在56℃下溫育。
以用等體積的TE緩沖液(0.05M Tris-HCl[pH7.5],0.001M EDTA)飽和的苯酚(Gibco/BRL)抽提懸液，并在30-50 rpm下振蕩45分鐘。通過在5℃下在SS34轉(zhuǎn)鼓中于12,000 xg離心10分鐘分離苯酚和水相。用切斷的寬口巴斯德移液管收集上清液，用2-3倍體積的冰冷95％乙醇沉淀DNA。將DNA鏈蘸取到玻璃棒上，并溶解到小體積的0.1X SSC(1X SSC含有0.15 M NAC1,0.015 M檸檬酸鈉)中。
用RNase處理DNA至10μg/ml終濃度并在37℃溫育30分鐘，用2-3倍體積的冷95％乙醇再次沉淀DNA，蘸取到玻璃棒上并溶于1XSSC中。4℃下貯藏樣品。
b)限制性內(nèi)切核酸酶消化和連接根據(jù)制造廠商的說明，以適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切核酸酶消化質(zhì)粒和噬菌體載體。將載體和插入DNA混合至5μl總體積，并用0.5單位的T4 DNA連接酶連接。在轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌細(xì)胞之前，將連接混合物在室溫下溫育3-4小時(shí)，或者在14℃下溫育一夜。
c)感受態(tài)大腸桿菌細(xì)胞的制備轉(zhuǎn)化用來將質(zhì)粒和噬菌體DNA引入到感受態(tài)大腸桿菌細(xì)胞(Mandel和Higa,1970；Lederberg和Cohen等，1972)中。在37℃和150rpm振蕩下在LT肉湯中培養(yǎng)待轉(zhuǎn)化的大腸桿菌菌株一夜。下一天，在20ml相同的培養(yǎng)基中制備1/40傳代培養(yǎng)物，并且在37℃和75rpm振蕩下培養(yǎng)額外的60分鐘。通過在SS34轉(zhuǎn)鼓中于3,000 xg離心收集細(xì)胞，并重懸在10ml無菌冰冷的50mM CaCl2中。將懸液置于冰上溫育30分鐘。然后經(jīng)離心收集細(xì)胞，并重懸于2ml無菌冰冷的mM CaCl2中。此時(shí)，感受態(tài)細(xì)胞可以貯存在4℃下，并且用到多達(dá)3天。
為了轉(zhuǎn)化，將感受態(tài)細(xì)胞的0.2ml在冰上與DNA樣品混合30分鐘，在42℃下熱擊細(xì)胞2分鐘，然后加入0.2ml LT肉湯。將細(xì)胞在37℃培養(yǎng)15分鐘，接著平板接種到含有合適的抗生素的LT平板上，37℃下培養(yǎng)過夜。
d)大量質(zhì)粒分離按照修改的Clewell和Helinski方法(1969)進(jìn)行大量質(zhì)粒分離。將攜帶質(zhì)粒的大腸桿菌接種到包含氨芐青霉素的250ml LT肉湯中，并且在37℃和150rpm振蕩下培養(yǎng)過夜。下一天，加入氯霉素(西格瑪)至25mg/l的終濃度，使培養(yǎng)物再生長4-6小時(shí)。通過在GSA轉(zhuǎn)鼓中在4,000 xg下離心10分鐘收集細(xì)胞。將細(xì)胞沉淀重懸在4ml包含25％蔗糖和0.05M TrisHCl(pH8.0)的冰冷溶液中，然后加入新鮮的1ml 10mg/ml溶菌酶(西格瑪)溶液。將混合物在37℃水浴中溫育30分鐘，置于冰上5分鐘，然后加入2ml 0.25M EDTA(pH8.0)。進(jìn)一步置于冰上5分鐘后，加入5ml裂解溶液(0.05M Tris-HCl[pH8.0],0.0625M EDTA和2％Triton X-100)。將混合物返回到37℃水浴中5-15分鐘直到細(xì)胞裂解完全。然后在27,000 xg下離心30分鐘，將澄清的裂解物轉(zhuǎn)換到一支清潔的試管中，將裂解物與1g/ml固體CsCl(Boehringer曼海姆，Laval，魁北克)混合至總共4.5ml。然后將100μl溴化乙錠(10mg/ml)加入到4.5ml樣品中。熱封離心管，并將樣品在Beckman VTi65垂直轉(zhuǎn)鼓中于15℃和240,000 xg下離心至少9小時(shí)。
通過刺破離心管的頂端與底端并收集管中兩個(gè)帶的下一個(gè)回收質(zhì)粒DNA。為了從樣品中抽提溴化乙錠，將質(zhì)粒DNA溶液與等體積的Cs/C1飽和的正丁醇混合。在進(jìn)行相分離后，除去包含正丁醇和溴化乙錠的上層。將這一過程重復(fù)三次。在抽提溴化乙錠后，透析下層水相以除去CsC1。通過在0.1M碳酸氫鈉中煮沸2×15分鐘和在0.25M EDTA(pH7.5)中煮沸1×15分鐘制備分子截?cái)嘀禐?0kDa透析管(Fisher)，于4℃貯存在50％乙醇和1mM EDTA中。在透析之前，用dH2O洗滌透析管，然后加入質(zhì)粒DNA溶液。于4℃在4×1L透析緩沖液(0.01 M Tris-HCl[pH 7.5,40℃]，和0.001 M EDTA)中透析DNA24小時(shí)。將樣品貯存在-20℃。
此外，將得自Pharmacia(魁北克市，魁北克)的Flexi-prep試劑盒用于小量質(zhì)粒制備。這一方法包括標(biāo)準(zhǔn)的堿性細(xì)胞裂解，包括RNase處理和異丙醇沉淀(Birnboim和Doly,1979；Isch-Horowicz和Burke,1981)。純化質(zhì)粒DNA,并且利用在鹽酸胍中的二氧化硅基質(zhì)(SephaglasFPTM)濃縮。
e)經(jīng)隨機(jī)引發(fā)放射性標(biāo)記DNA探針利用GIBCO/BRL的隨機(jī)引物DNA標(biāo)記系統(tǒng)用[α-32P] dATP(3,000Ci/mmol,ICN)標(biāo)記DNA片段。這一標(biāo)記系統(tǒng)基于Feinberg和Vogelstein的方法(1983)，具有某些修改(Feinberg和Vogelstein,1984)。通過煮沸5分鐘(在10μl H2O中的25ng DNA)使樣品變性，然后立即置于冰上。仍然在冰上加入下列試劑dCTP,dGTP和dTTP各2μl,15μl隨機(jī)引物緩沖液，4μl[α-32P]dATP，加水至49μl。簡短地混合樣品，并加入3個(gè)單位的克列諾片段。將反應(yīng)混合物在25℃溫育1小時(shí)，通過加入5μl終止緩沖液終止。
經(jīng)通過小型葡聚糖凝膠G-50柱的凝膠過濾從未摻入的放射性核苷酸分離放射性標(biāo)記的DNA。所述的柱用塞有玻璃棉的巴斯德移液管制備，在加入放射性標(biāo)記的樣品之前用TE緩沖液平衡。采用Geiger計(jì)數(shù)器(Mini-Instruments公司，Essex,England)監(jiān)測(cè)穿過柱的DNA的遷移。放射性第一個(gè)峰相應(yīng)于標(biāo)記的DNA，而第二個(gè)峰相應(yīng)于未摻入的[32P]-dATP。在加入到雜交溶液之前，通過煮沸5分鐘使DNA探針變性。
f)瓊脂糖凝膠電泳和Southern雜交通過添加TAE緩沖液(40 mM Tris[pH 7.9],1mM EDTA)至電泳級(jí)瓊脂糖粉(正常或低熔點(diǎn)；西格瑪)上至0.7％至1％的終濃度制備瓊脂糖凝膠。在水平平面凝膠裝置(Tyler Research,Edmonton,Alberta)中使瓊脂糖凝膠電泳。
將DNA樣品與1/2體積的示蹤染料(50％甘油，0.1％梯(Gibco/BRI)混合，或者將用HindⅢ消化的λDNA(Pharmacia)用作分子標(biāo)準(zhǔn)。使用補(bǔ)充有1μg/ml溴化乙錠的TAE跑膠緩沖液。樣品最初在100V下電泳5分鐘，然后將電壓減少至10-12V進(jìn)行一夜電泳。在電泳之后，用中等范圍的紫外透射儀觀察樣品并用Polaroid 57型黑白膠卷(Sharp等，1973；Hayward,1972)照相。
為了Southern雜交，將瓊脂糖凝膠浸沒在0.25M HCl中15分鐘，以使DNA脫嘌呤。將凝膠轉(zhuǎn)移到由0.5M NaOH和1.5M NaCl組成的堿性溶液中15分鐘，然后用0.5M Tris-HCl(pH7.5),1.5M NaCl中和30分鐘。在150mA的恒定電流下30分鐘(Wahl等，1979；Southern,1975)內(nèi)，在20X SSPE緩沖液(3.6M NaCl,0.2M Na2PO4[PH 7.0],0.02MNa2EDTA,0.16M NaOH)中用半干印跡裝置(Tyler Research)經(jīng)電泳轉(zhuǎn)移法將DNA移到硝酸纖維素膜(Schleicher和Shuell,Willowdale，安大略)上。
在電泳轉(zhuǎn)移之后，硝酸纖維素膜用2X SSPE緩沖液洗滌10分鐘，經(jīng)UV交聯(lián)劑(Stratagene)交聯(lián)DNA。將膜在密封的塑料袋中預(yù)雜交，所說的塑料袋含有在0.1％甘氨酸中的25％(低嚴(yán)格性)或50％(高嚴(yán)格性)甲酰胺溶液(Gibco/BRL),5X BFP(100X BFP含有2％w/v牛血清白蛋白，F(xiàn)icoll和聚乙烯吡咯烷-40),5X SSPE緩沖液和0.1mg/ml聲波處理、煮沸的鮭精載體DNA。將密封的袋子放置在42℃的振蕩水浴中，其中使膜可以預(yù)雜交至少1小時(shí)。然后棄去預(yù)雜交緩沖液，用含有煮沸的標(biāo)記的DNA探針的雜交緩沖液(10％葡聚糖硫酸酯，5X SSPE,5X BFP,0.1％SDS,0.1mg/ml載體DNA或25％或50％甲酰胺)替代。將袋子置于42℃的振蕩水浴中，使膜雜交過夜。
在雜交之后，從塑料袋移去硝酸纖維素膜，并且在42℃的振蕩水浴中用高嚴(yán)格性(5X SSPE,0.1％SDS)或低嚴(yán)格性(2X SSPE,0.1％SDS)洗滌緩沖液洗滌硝酸纖維素膜。使膜通風(fēng)干燥，置于Whatman濾紙上，以塑料覆蓋物覆蓋，并且于-20℃暴露在X-光膠片(Cronex,Willingmington,Delaware)下104天,直到獲得所需的暴露。通過采用Geiger計(jì)數(shù)器測(cè)定放射活性信號(hào)的強(qiáng)度確定暴露時(shí)間。用柯達(dá)GBX快速顯影儀(Eastman柯達(dá)，Rochester，紐約)顯影放射自顯影圖2分鐘。通過在2.5％乙酸中浸沒膠卷1分鐘終止顯影反應(yīng)，在柯達(dá)GBX定影液(Eastman柯達(dá))定影2分鐘。
g)Southern菌落印跡將生長在加氨芐青霉素的LT上的細(xì)菌菌落的主模板在37℃下培養(yǎng)過夜。將在主平板上的菌落復(fù)制到硝酸纖維素膜上，該膜覆蓋在加氨芐青霉素的LT平板上，在37℃培養(yǎng)2-3天。然后將膜覆蓋在Whatman濾紙上(該濾紙?jiān)?.5M NaOH,1.5M NaCl溶液中浸透)，在室溫(RT)下溫育5分鐘，以裂解細(xì)胞。然后將硝酸纖維素膜轉(zhuǎn)移到Whatman濾紙上(該濾紙?jiān)?.5M Tris=HCl(pH7.5),1.5M NaCl溶液中浸透)，在室溫(RT)下溫育5分鐘，以中和膜。將膜轉(zhuǎn)移到在95％乙醇中浸透的Whatman濾紙上，用95％乙醇噴射以沉淀DNA。用UV交聯(lián)劑(Stratagene)交聯(lián)在膜上的DNA，然后，如上所述進(jìn)行預(yù)雜交和雜交。
h)聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)PCR反應(yīng)在Perkin-Elmer Cetus 480 DNA熱循環(huán)儀中的薄壁500μlGeneAmp微量離心管(microfuge tubes)中進(jìn)行，其中利用Ferkin-ElmerCetus PCR核心試劑試劑盒，該試劑盒包含脫氧核苷酸三磷酸，MgCl2，反應(yīng)緩沖液和Ampli-Taq DNA聚合酶(Perkin-Elmer Cetus)。按照Saiki等(1988)的方法(由Perkin-Elmer Cetus修改的)完成擴(kuò)增反應(yīng)。PCR反應(yīng)在包含1X反應(yīng)緩沖液(0.5 M KCl,0.1 M Tris-HCl[pH 9.0]),0.2 mM的各dNTP,0.4μM引物，5μg模板，15mM MgCl2和2.5單位的Ampli-Taq酶的100μl混合物中進(jìn)行。將反應(yīng)混合物在95℃加熱2分鐘，以變性模板DNA。然后，30個(gè)循環(huán)的變性，退火和延伸分別按照溫度和時(shí)間為95℃(1分鐘)，52℃(1分鐘)和72℃(2分鐘)進(jìn)行。使用溫度之間(0.01秒的斜坡時(shí)間)的最快可用轉(zhuǎn)變。不含模板DNA的陰性對(duì)照包含在每一個(gè)PCR反應(yīng)中。
在擴(kuò)增之后，PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢查。通過低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠經(jīng)電泳分離PCR產(chǎn)物，其后切下所需的DNA片段。利用玻璃株基質(zhì)純化試劑盒(GENECLEAN)純化來自瓊脂糖的DNA產(chǎn)物。
i)來自瓊脂糖凝膠的DNA片段的純化利用來源于Bio/Can Scientific(Mississauga，安大略)的GENECLEAN試劑盒純化來自瓊脂糖凝膠的DNA片段。GENECLEAN純化過程基于Vogelstein和Gillespie(1979)的方法。用剃刀片從凝膠切下包含所述片段的凝膠片，并且放置在1.5ml Eppendorf離心管中。加入等體積的貯存NaI溶液，將樣品在55℃水浴中溫育5分鐘，直到瓊脂糖完全熔化。
以每5μg或更少的DNA 5μl體積的量將GLASSMILK(Bio/CanScientific)加入到樣品中，將混合物置于冰上5分鐘。通過在16,000 xg下離心10秒鐘收集二氧化硅基質(zhì)，然后重懸于600μl NEW洗滌緩沖液(Bio/Can Scientific)中。用NEW緩沖液洗滌沉淀總共3次。在最后洗滌后，將二氧化硅基質(zhì)重懸于10μl TE緩沖液中，并在55℃下溫育5分鐘。將樣品離心，回收TE，以避免二氧化硅基質(zhì)沉淀。將樣品貯存在-20℃下。
j)DNA雙脫氧測(cè)序利用Pharmacia T7-測(cè)序試劑盒按照制造商的描述通過克隆進(jìn)M13mp18/mp19噬菌體載體(單鏈測(cè)序)或者直接從重組體質(zhì)粒(雙鏈測(cè)序)對(duì)DNA片段進(jìn)行測(cè)序。Pharmacia T7-測(cè)序試劑盒方法基于由Sanger等(1977)概述的方法。
對(duì)于單鏈測(cè)序，將DNA片段克隆進(jìn)M13 mp18/mp19噬菌體載體，并且轉(zhuǎn)化進(jìn)感受態(tài)大腸桿菌TG-1細(xì)胞。選擇由于喪失β-半乳糖苷酶產(chǎn)生而顯示出白色的重組噬菌體＂噬斑＂。將各噬斑接種到10ml LT肉湯(接種有在Davis基本培養(yǎng)基中生長過夜的培養(yǎng)物大腸桿菌TG-1)中，在37℃和75rpm振蕩下培養(yǎng)4-5小時(shí)。將樣品在12,000 xg下離心10分鐘，以除去大腸桿菌細(xì)胞。通過加入1/4體積的20％聚乙二醇(8,000 MW；西格瑪)，2.5MNaCl使噬菌體從培養(yǎng)上清液沉淀，并置于冰上30分鐘。用微量離心機(jī)(microfuge)在12,000 xg下離心10分鐘回收沉淀的噬菌體。將沉淀重懸于0.6ml噬菌體緩沖液(0.1M Tris-HCl[pH8.0]),0.001M EDTA,0.3MNaCl)中。
用0.5ml TE緩沖液飽和的苯酚(Gibco/BRL)抽提噬菌體DNA。通過在14,000 xg下離心10分鐘使苯酚和水相分離。水相以1∶1苯酚∶氯仿，最后以氯仿抽提。然后用1/10體積的3M乙酸鈉(pH7.0)和2體積的冷的95％乙醇沉淀噬菌體DNA，在-20℃下溫育一夜。通過14,000xg下離心10分鐘來收集沉淀的DNA。水相用1∶1苯酚∶氯仿，最后以氯仿抽提。然后用1/10體積的乙酸鈉(pH7.0)和2體積的冷95％乙醇沉淀噬菌體DNA，在-20℃溫育過夜。通過在4℃的微量離心機(jī)中在14,000 xg下離心10分鐘收集沉淀的DNA。將沉淀通風(fēng)干燥并重懸于50μl TE緩沖液中，用于測(cè)序。在測(cè)序反應(yīng)之前，通過在65℃下溫育10分鐘，然后在室溫下溫育10分鐘，在退火緩沖液(Pharmacia T7測(cè)序試劑盒)存在下將所說的DNA退火到通用M13引物或特異性引物上。
對(duì)于雙鏈測(cè)序，利用修改的Pharmacia T7測(cè)序試劑盒方案中所概述的方法制備質(zhì)粒模板。將質(zhì)粒DNA調(diào)節(jié)至1.5-2.0μg/32μl，并且通過加入12μl 2M NaOH 1分鐘使其變性。由加入11μl 3M乙酸鈉(pH5.0)終止變性。用7μl dH2O和120μl冰冷的無水乙醇沉淀DNA，并在-20℃下溫育過夜。
在14,000 xg下于微量離心機(jī)中離心10分鐘收集DNA，用100μl冰冷的70％乙醇洗滌沉淀，離心并真空干燥。將樣品重懸于5μl dH2O中，與5μl引物和2μl退火緩沖液混合。在測(cè)序前，將混合物在65℃下溫育5分鐘，37℃下溫育10分鐘，室溫下溫育5分鐘。
將[32P]dATP或[35S]dATP(比活性3000 Ci/mmol)用于測(cè)序反應(yīng)中。對(duì)短的放射自顯影暴露時(shí)間，使用[32P]dATP。對(duì)較高的分辨率，使用[35S]dATP。根據(jù)制造廠商的說明在國際應(yīng)用生物系統(tǒng)391 PCR-MateDNA合成儀上合成寡核苷酸引物并純化。通過使用前測(cè)定在260nm的光密度定量所說的引物。
對(duì)于[32P]dATP測(cè)序，測(cè)序凝膠含有18g尿素(ICN，蒙特利爾，魁北克)，3.75ml 10X TBE緩沖液(1M Tris[pH 8.3],0.02M EDTA和0.865M硼酸)和7.5ml 40％丙烯酰胺(19∶1丙烯酰胺∶雙丙烯酰胺,Bio-Rad)，加dH2O至38ml。攪拌溶液直到尿素溶解，然后加入0.23ml 10％的過硫酸銨(西格瑪)以及10μl TEMED(N,N,N’,N’-四甲基乙二胺)(西格瑪)(0.01％終濃度)，用于聚合。
對(duì)于[35S]dATP測(cè)序，凝膠含有16.8g尿素(ICN),4.8ml 10X TEE緩沖液和4ml改性的丙烯酰胺溶液(＂Long Ranger＂,J.T.Baker,Phillipsburg,新澤西)。向溶液中加水使體積達(dá)到40ml，將溶液與200μ1過硫酸銨(西格瑪)和20μl TEMED(西格瑪)聚合。
跑膠緩沖液含有1X TBE。測(cè)序凝膠在40W/凝膠恒定功率下進(jìn)行2-6小時(shí)。將[35S]dATP測(cè)序凝膠轉(zhuǎn)移到一張Whatman濾紙上，并且在80℃真空下干燥45分鐘。將兩種類型測(cè)序凝膠對(duì)Cronex 4 X-光膠卷曝光(對(duì)Cronex而言，-20℃下18-48小時(shí))。Ⅳ．蛋白質(zhì)方法a)內(nèi)和外膜的分離用Hancock和Carey(1979)等的修改(Lo等，1991)的方法從大腸桿菌和溶血巴斯德氏菌A1制備內(nèi)和外膜制劑。于37℃在250ml合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)菌一夜。經(jīng)在4,000xg離心收集細(xì)胞，用0.01M Tris-HCl(pH 6.8)洗滌兩次，并重懸于7.5ml冷的Sucrose-Tris溶液中，該溶液含有20％蔗糖，0.01 M Tris-HCl(pH 6.8)，溶菌酶(1mg/ml),DNase(50μg/ml)和RNase(100μg/ml)。于4℃在16,000-18,000 psi下用弗氏壓碎器裂解細(xì)胞3次。將樣品在1,085xg下離心5分鐘以除去未裂解細(xì)胞。
將上清液鋪設(shè)放到70∶52∶樣品∶12％蔗糖梯度液(含有14ml 70和52％蔗糖，接著是5ml樣品裂解物和4-5ml 12％蔗糖)上。于4℃在80,000 xg下在吊桶式轉(zhuǎn)頭中離心該梯度液16-18小時(shí)。經(jīng)抽吸收集內(nèi)與外膜組分。內(nèi)膜組分位于12％和52％蔗糖區(qū)之間，并且具有淡黃-褐色。白色的外膜組分鄰近70％蔗糖區(qū)。將收集的組分裝入離心管，用dH2O封蓋，于4℃在225,000 xg下在定角Ti80轉(zhuǎn)鼓中離心1小時(shí)。然后通風(fēng)干燥沉淀，并重懸于Tris-HCl(pH6.8),0.001M二硫蘇糖醇緩沖液中。將樣品保存在-20℃下。
b)蛋白質(zhì)濃度的Bradford測(cè)定利用Bradford(1976)的方法測(cè)定內(nèi)與外膜組分的蛋白質(zhì)濃度。制備各膜組分的稀釋液，用dH2O添加到0.8ml最終體積。然后將樣品與0.2mlBradford試劑(Biorad,Mississauga，安大略)混合，在室溫下溫育5分鐘，使發(fā)生顯色。在595nm波長的分光光度計(jì)中測(cè)定各樣品的光密度(OD)。利用在1-25μg范圍中的牛血清白蛋白(BSA；西格瑪)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，從BSA標(biāo)準(zhǔn)曲線推知各樣品的蛋白質(zhì)的濃度。
c)十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳采用十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)以4％(w/v)堆積和7.5％(w/v)分離凝膠(Laemelli,1970)分析蛋白質(zhì)。通過添加0.1％過硫酸銨和TEMED到0.01％使凝膠聚合。通過在100℃下5分鐘用等體積的2X樣品緩沖液溶解樣品。也煮沸一種高分子量的標(biāo)準(zhǔn)物，并加到凝膠上。使用不連續(xù)緩沖液系統(tǒng)(0.192M甘氨酸，0.02M Tris-HCl[pH8.4],0.1％SDS)。
在100V使凝膠電泳，直到當(dāng)電壓增加到150V時(shí)樣品進(jìn)入分離膠。使樣品電泳，直到染料前端脫離凝膠底部。除去堆積凝膠，將分離膠以考馬斯亮藍(lán)染色或者經(jīng)電泳轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素上用于Western免疫印跡分析。用考馬斯亮藍(lán)R250(在40％甲醇，10％乙酸中的0.05％)(Eastman柯達(dá))染色凝膠一夜，然后在甲醇∶乙酸溶液中脫色。
d)Western免疫印跡分析按照Burnette(1981)的方法將在丙烯酰胺凝膠上的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。將凝膠浸透在印跡緩沖液(0.192M甘氨酸，0.025MTris-Cl[pH8.4]，20％甲醇)中10分鐘，以除去SDS。將剪切得符合凝膠的一片硝酸纖維素膜(Schleicher和Shuell,Willowdale，安大略)也浸透在印跡緩沖液中。用Bio-Rad Transblot裝置在450 mA于3小時(shí)內(nèi)將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。水冷卻系統(tǒng)用來阻止印跡緩沖液的升溫和分解。
在電泳轉(zhuǎn)移之后，將硝酸纖維素膜浸透在在TTBS緩沖液(0.02MTris-C1[pH7.5],0.5M NaCl,0.05％Tween-20)中的3％明膠中30分鐘，以封阻膜。將硝酸纖維素膜轉(zhuǎn)移到1/500稀釋的在1％明膠中的第一抗體上，在室溫輕輕振蕩下溫育一夜。然后用TTBS緩沖液洗滌膜兩次(每次15分鐘)，將膜置入第二抗體溶液(1/2000稀釋)中1小時(shí)。第二抗體是在1％明膠中的山羊抗-兔或山羊抗-牛IgG-堿性磷酸酶綴合物(Bio-Rad)。將膜用TTBS緩沖液洗滌兩次(每次洗滌15分鐘)，然后用NBT緩沖液(0.1MTris-C1[pH9.5],0.1M NaCl,50mM MgCl2)洗滌兩次(每次洗滌5分鐘)。然后將膜置入100μl各試劑5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸(BCIP，在二甲基甲酰胺中的25mg/ml；西格瑪)和氮藍(lán)四唑(NBT，在70％二甲基甲酰胺中的50mg/ml；西格瑪)的顯色溶液中。使顏色出現(xiàn)，直到獲得所需可見度的區(qū)帶。通過用水洗滌膜終止顏色反應(yīng)。將膜通風(fēng)干燥。
e)T7蛋白質(zhì)表達(dá)用Tabor和Richardson(1985)的方法分析由重組質(zhì)拉鳊碼的蛋白質(zhì)。將tbpA基因克隆進(jìn)質(zhì)粒載體pBluescipt。將該重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌JM109(DE3)，該菌株是具有整合進(jìn)染色體的T7 RNA聚合酶基因和lac啟動(dòng)子控制下的T7聚合酶基因的大腸桿菌JM109菌株(Yaninsch-Perron等，1985)。
在轉(zhuǎn)化之后，將細(xì)胞在包含1.0％酪蛋白氨基酸，0.4％葡萄糖和適當(dāng)?shù)目股氐腄avis基本培養(yǎng)基中在37℃培養(yǎng)一夜。制備在20ml相同培養(yǎng)基中的1/50傳代培養(yǎng)物，在37℃下培養(yǎng)另外的3-4小時(shí)，直到OD550=0.6。通過在14,000 xg下離心5分鐘收集細(xì)胞，將沉淀重懸于具有0.4％葡萄糖的Davis基本培養(yǎng)基中。將樣品在37℃下溫育90分鐘，然后加入100μl5mM異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)。在于37℃培養(yǎng)細(xì)胞20分鐘后，加入利福霉素(400μg/ml的終濃度)。將樣品在37℃溫育30分鐘，然后用5μCi[35S]-甲硫氨酸(“Trans-Label”ICN Biomedical，魁北克)標(biāo)記60分鐘。細(xì)胞用冰冷的PBS洗滌兩次，并且于微量離心機(jī)中在14,000 xg下離心5分鐘收集。將沉淀重懸于2X SDS-PAGE樣品緩沖液中。
用SDS-PAGE分離蛋白質(zhì)，以考馬斯藍(lán)R250染色凝膠。然后將凝膠浸透在AmplifyTM(Amersham,Oakville，安大略)中30分鐘，并且在真空下干燥。暴露放射自顯影圖18-48小時(shí)。結(jié)果Ⅰ．推定的tbpA,tbpB基因的初步克隆克隆tbpA基因的第一階段是經(jīng)聚合酶鏈反應(yīng)篩選溶血巴斯德氏菌A1基因。合成對(duì)Tbp1蛋白質(zhì)的N端氨基酸序列特異性的寡引物。溶血巴斯德氏菌A1密碼子表(Lo,1992)用來優(yōu)化引物序列。Tbp1引物與基于克隆載體pBR322的連接序列的引物一起使用(表1)。獲得0.8 kbp PCR產(chǎn)物(圖1)，克隆進(jìn)M13載體并測(cè)序。這一PCR產(chǎn)物的序列分析顯示頭20個(gè)氨基酸與由Tbp1的N端氨基酸測(cè)序獲得的序列相匹配。
表1．用于PCR的寡核苷酸引物
*下劃線序列是HindⅢ位點(diǎn)**下劃線序列是EcoRⅠ位點(diǎn)然后放射性標(biāo)記0.8kb PCR產(chǎn)物，并用于經(jīng)Southern雜交篩選含有溶血巴斯德氏菌A1基因文庫的大腸桿菌克隆的特異性探針。兩重組體克隆9和10與tbpA探針強(qiáng)烈雜交。通過限制性內(nèi)切酶作圖分析各重組體克隆的質(zhì)粒DNA(圖2)。確定溶血巴斯德氏菌A1的插入物對(duì)質(zhì)粒9和10分別約為8.7kb和2.3kb。質(zhì)粒的初始序列分析確認(rèn)兩個(gè)質(zhì)粒的DNA共有一個(gè)重疊區(qū)。質(zhì)粒9包含整個(gè)tbpA基因，但是tbpA的直接上游區(qū)不同于質(zhì)粒10的上游區(qū)。質(zhì)拉9中的插入DNA從基因組分離區(qū)的兩個(gè)DNA片段形成是可能的。在質(zhì)粒10中，tbpA的直接上游區(qū)包含相應(yīng)于tbpB基因的附加開放讀框。因此這一質(zhì)粒不僅包含tbpA基因的5’區(qū)，而且在tbpA基因的直接上游也包含tbpB基因的一部分區(qū)。
第三個(gè)重組體克隆482包含整個(gè)tbpB基因。這一質(zhì)粒與質(zhì)粒10共有一個(gè)重疊區(qū)(圖2)。在質(zhì)拉482中的插入DNA是利用對(duì)Tbp2蛋白質(zhì)的氨基酸序列特異性的引物從溶血巴斯德氏菌A1基因組DNA獲得的PCR產(chǎn)物。然后將這一PCR產(chǎn)物克隆進(jìn)載體PCRⅡ。
從質(zhì)粒9測(cè)序3.0kbp tbpA基因(從BgⅢ位點(diǎn)開始)。從質(zhì)粒482和10測(cè)序2.1kbp tbpB基因與thpA和tbpB之間的91bp序列。Ⅱ．序列分析測(cè)序5.2kbp DNA，顯示含有串聯(lián)排列的兩個(gè)開放讀框，具有上游于tbpA的tbpB(圖3)。這一遺傳組構(gòu)與在其它細(xì)菌中的鐵攝取系統(tǒng)是一致的，在其它細(xì)菌中所說的基因經(jīng)常排列在操縱子中(Payne,1988)?；谕贫ǖ腡bp1蛋白質(zhì)的序列分析，觀察到推定的28個(gè)氨基酸的前導(dǎo)肽。在推定的Tbp2蛋白質(zhì)中觀察到脂蛋白的推定的切割序列。tbpA和tbpB密切近似和在tbpA中缺乏啟動(dòng)子區(qū)說明兩種蛋白質(zhì)可以協(xié)同表達(dá)。在tbpB的啟動(dòng)子區(qū)中的Fur共有序列說明蛋白質(zhì)可以以類Fur方式被調(diào)節(jié)。在溶血巴斯德氏菌tbpB中的Fur共有序列類似于在淋病奈瑟氏球菌和腦膜炎奈瑟氏球菌tbpB中發(fā)現(xiàn)的共有序列(圖4)。Tbp1和Tbp2的等電點(diǎn)由PCGene(Chargpro)計(jì)算分別為9.16和9.71，使它們?yōu)閴A性蛋白質(zhì)。Ⅲ．預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)序列分析程序Gene Runner(Hastings軟件)用來分析溶血巴斯德氏菌Tbp1和Tbp2蛋白質(zhì)的物理特征和預(yù)言二級(jí)結(jié)構(gòu)。利用Kyte和Doolittle(1982)的方法產(chǎn)生Tbp1和Tbp2的親水性圖。Tbp1的頭28個(gè)氨基酸形成疏水區(qū)，這是所有信號(hào)序列的特征。在所述蛋白質(zhì)中有六個(gè)其它疏水區(qū)，這可以是蛋白質(zhì)的跨膜結(jié)構(gòu)域。蛋白質(zhì)的親水區(qū)域可以暴露在細(xì)胞表面或在外周質(zhì)中。也產(chǎn)生淋病奈瑟氏球菌的親水性圖。淋病奈瑟氏球菌Tbp1蛋白質(zhì)似乎不如溶血巴斯德氏菌Tbp1疏水，但某些疏水區(qū)的位置是類似的。例如，兩種蛋白質(zhì)都具有圍繞200,400，以及780氨基酸殘基的疏水區(qū)。在疏水區(qū)中的相似性說明兩種蛋白質(zhì)共有重要程度的同源性，并且可以具有一種類似的結(jié)構(gòu)。
溶血巴斯德氏菌Tbp2的Kyte-Doolittle圖揭示在該蛋白質(zhì)的中心的幾個(gè)大的疏水區(qū)和在各末端的兩個(gè)較小的親水區(qū)。與淋病奈瑟氏球菌Tbp的親水性圖的這一明顯不同說明兩種蛋白質(zhì)可以具有不同的結(jié)構(gòu)。
采用Emini表面概率方法(Emini等，1985)確定Tbp1和Tbp2的表面暴露區(qū)。圖表上的峰相應(yīng)于具有暴露最高概率的區(qū)。各種蛋白質(zhì)的表面暴露區(qū)可以涉及到配體結(jié)合和可以是抗原性的。溶血巴斯德氏菌Tbp1的Emini圖說明鄰近蛋白質(zhì)的330,410,460,560,610和820的氨基酸的親水區(qū)可以暴露在細(xì)胞表面。淋病奈瑟氏球菌Tbp1的Emini圖顯示與溶血巴斯德氏菌Tbp1的幾個(gè)共同的暴露區(qū)(在330,580,810區(qū))。
溶血巴斯德氏菌Tbp2的Emini圖說明在氨基酸140,160和620的親水區(qū)具有暴露的最大概率。淋病奈瑟氏球菌Tbp2的Emini圖顯示僅在160,330的暴露區(qū)類似于溶血巴斯德氏菌Tbp2的表面區(qū)。
利用Chou-Fasman(1978)的方法，預(yù)測(cè)Tbp1和Tbp2的二級(jí)結(jié)構(gòu)。溶血巴斯德氏菌Tbp1的Chou-Fasman圖預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)主要是β-折疊與β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)。淋病奈瑟氏球菌Tbp1的Chou-Fasman圖預(yù)測(cè)一種類似的結(jié)構(gòu)。這些預(yù)測(cè)與其它鐵-相關(guān)外膜蛋白質(zhì)的其它拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)是一致的，所說的外膜蛋白質(zhì)也是由兩親性β-折疊組成的(Moeck等，1994)。注意到兩個(gè)Tbp1Kyte-Doolittle圖中β-折疊的位置相應(yīng)于疏水結(jié)構(gòu)域的位置也是有意義的。
溶血巴斯德氏菌Tbp2的Chou-Fasman圖表明它也是主要由β-折疊與β-轉(zhuǎn)角組成的。β-折疊的所預(yù)測(cè)的模式不同于淋病奈瑟氏球菌Tbp2，后者也具有β-折疊區(qū)。這些結(jié)果增加了Tbp2蛋白質(zhì)具有不同結(jié)構(gòu)的證據(jù)。Ⅳ．tbpA在溶血巴斯德氏菌和相關(guān)物種中的分布進(jìn)行Southern雜交分析以確定是否所有的十六種血清型溶血巴斯德氏菌攜帶有編碼Tbp1蛋白質(zhì)的基因。用限制性內(nèi)切核酸酶消化來源于每種血清型的染色體DNA，并且以溶血巴斯德氏菌A1的tbpA基因的5’末端探查。在胸膜肺炎放線桿菌CM％和shope 4074和豬放線桿菌3714上進(jìn)行類似的雜交實(shí)驗(yàn)。
用溶血巴斯德氏菌A1 tbpA探針的高嚴(yán)格性雜交(50％甲酰胺)顯示在溶血巴斯德氏菌的所有十六種血清型中存在tbpA同源的序列(圖5,6)。此外，在A和T生物型之間與探針雜交的片段的大小上存在明顯的不同。注意到在圖5中血清型7 DNA(用Southern雜交其不給出反應(yīng)帶)的質(zhì)量上存在問題是重要的。這一血清型的反應(yīng)應(yīng)與血清型1的相同。一個(gè)類似的問題在圖6中發(fā)現(xiàn)，其中血清型12和16的DNA被不適當(dāng)?shù)叵?。這些血清型的反應(yīng)應(yīng)該與血清型1的相同。
與tbpA探針的低嚴(yán)格性雜交(25％甲酰胺)顯示豬放線桿菌3714，胸膜肺炎放線桿菌CM5和Shope 4074基因組DNA與溶血巴斯德氏菌tbpA探針雜交(圖7)。胸膜肺炎放線桿菌的兩個(gè)菌株都屬于血清型1，并以相同的方式雜交。溶血巴斯德氏菌A1，豬放線桿菌和胸膜肺炎放線桿菌中tbpA,tbpB區(qū)的基本限制性酶切圖在圖8中顯示。Ⅴ．同源性研究將溶血巴斯德氏菌Tbp1的預(yù)測(cè)的氨基酸序列與Neisseria spp和胸膜肺炎放線桿菌運(yùn)鐵蛋白結(jié)合蛋白以及幾個(gè)大腸桿菌TonB-依賴性受體蛋白質(zhì)的預(yù)測(cè)的序列比較。所有比較均按照Higgins和Sharp算法(Higgins和Sharp,1988)進(jìn)行。
發(fā)現(xiàn)溶血巴斯德氏菌Tbp1的預(yù)測(cè)的氨基酸序列具有與淋病奈瑟氏球菌和腦膜炎奈瑟氏球菌Tbp1蛋白質(zhì)(Comelissen等，1992；Legrain等，1993)高度的同源性(圖9)。發(fā)現(xiàn)包括相同和保守氨基酸的同源性為41％。這一結(jié)果與蛋白質(zhì)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)研究一致，說明溶血巴斯德氏菌和Neisseria spp.Tbp1蛋白質(zhì)共有一種類似的結(jié)構(gòu)。溶血巴斯德氏菌Tbp1和胸膜肺炎放線桿菌血清型7和血清型1 TfbA蛋白質(zhì)(Gerlach等，1992a；Gerlach等，1992b)之間的同源性比較揭示僅有低程度(22％)的同源性(圖10)。在巴斯德氏菌屬，奈瑟氏球菌屬和放線桿菌屬運(yùn)鐵蛋白結(jié)合蛋白之間的遺傳相關(guān)性程度在圖11中以樹形圖形式顯示。注意到溶血巴斯德氏菌Tbp1對(duì)奈瑟氏球菌屬Tbp1的相關(guān)性比對(duì)放線桿菌屬運(yùn)鐵蛋白結(jié)合蛋白的相關(guān)性更密切是有意義的。
溶血巴斯德氏菌Tbp1也有與大腸桿菌TonB依賴性外膜受體同源的局部區(qū)(圖12)。與這些蛋白質(zhì)的同源性意味著溶血巴斯德氏菌Tbp1也是一種TonB依賴性受體蛋白質(zhì)。第一個(gè)同源的結(jié)構(gòu)域包含TonB盒，這在TonB和受體蛋白質(zhì)之間的直接相互作用中涉及到(BeⅡ等，1990)。其它的同源結(jié)構(gòu)域的意義不清楚，然而，它們也牽涉到TonB相互作用是可能的。Ⅵ．Tbp1的T7表達(dá)進(jìn)行T7表達(dá)以表達(dá)由tbpA編碼的蛋白質(zhì)(圖13)。在鐵-耗盡和鐵-充分的條件下通過大腸桿菌maxi-細(xì)胞分析來表達(dá)tbpA的嘗試是不成功的(數(shù)據(jù)未顯示出)。T7表達(dá)不產(chǎn)生任何在100 kDa的反應(yīng)帶。30 dDa陽性對(duì)照在第1泳道上顯示。在攜帶tbpA的質(zhì)粒和pBluescript單獨(dú)的載體之間沒有任何區(qū)別(圖13，第2和3道)。Ⅶ．Western免疫印跡分析制備在鐵-有限和鐵-充分條件下生長的溶血巴斯德氏菌A1和大腸桿菌HB101細(xì)胞的內(nèi)和外膜組分，并用Western免疫印跡法分析。這些實(shí)驗(yàn)的目的是鑒別鐵-調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)是否與針對(duì)可溶性溶血巴斯德氏菌抗原制備的抗血清發(fā)生抗原性反應(yīng)。將所說的內(nèi)與外膜組分與兔＂抗-自身＂抗血清一起免疫印跡，所說的抗血清是抗可溶性溶血巴斯德氏菌A1(在補(bǔ)充有兔自身血清(避免包含血清蛋白質(zhì)的抗體)的RPMI 1640中培養(yǎng)的)抗原產(chǎn)生的。用大腸桿菌HB101細(xì)胞預(yù)吸收所說的抗血清，以最大限度地減小與大腸桿菌抗原的反應(yīng)性。在鐵-有限條件下生長的溶血巴斯德氏菌A1細(xì)胞的外膜組分中沒有觀察到相應(yīng)于運(yùn)鐵蛋白結(jié)合蛋白的免疫活性帶(圖14，第3泳道)。
也將內(nèi)與外膜組分與牛血清一起免疫印跡，所說的牛是用Presponse作為第一抗體接種過的(圖15)。用大腸桿菌HB101細(xì)胞預(yù)吸收所說的抗血清，以限制大腸桿菌免疫反應(yīng)性物質(zhì)的量。在溶血巴斯德氏菌細(xì)胞(在鐵-有限條件下培養(yǎng)的)外膜中觀察到71,77和100 kDa的帶(圖15，第3泳道)。這些蛋白質(zhì)帶相應(yīng)于溶血巴斯德氏菌運(yùn)鐵蛋白結(jié)合蛋白大小。如果這些抗原帶是運(yùn)鐵蛋白-結(jié)合蛋白，則，這一結(jié)果說明這些肽在牛中是抗原性的，也是免疫原性的。討論Ⅰ．基本序列分析溶血巴斯德氏菌tbpA和tbpB的基本核苷酸序列在圖3中顯示。溶血巴斯德氏菌tpbB的啟動(dòng)子區(qū)在圖4中顯示。
基于克隆DNA的基本序列分析，發(fā)現(xiàn)兩個(gè)tbp基因串聯(lián)排列，tbpB直接在tbpA的上游。這一遺傳組構(gòu)與在其它細(xì)菌(如Neisseria spp)中的鐵攝取系統(tǒng)是一致的，在其它細(xì)菌中所說的基因經(jīng)常排列在操縱子中(Anderson等，1994)。很可能在溶血巴斯德氏菌A1鐵攝取中牽涉到的基因也排列在操縱子中。tbpA基因僅僅是核糖體結(jié)合序列，而tbpB基因之前是核糖體結(jié)合位點(diǎn)，并且在它的啟動(dòng)子區(qū)中具有Fur共有序列。
推定的Fur共有序列的存在意味著兩個(gè)基因可以被鐵濃度協(xié)同調(diào)節(jié)，以及溶血巴斯德氏菌A1中存在Fur同系物。在病原性Neisseria Spp.中Fur同系物已被克隆和測(cè)序(Berish等，1993；Thomas和Sparling,1994)。如果溶血巴斯德氏菌A1 Fur同系物存在，則它可以牽涉到其它抗原(白細(xì)胞毒素)的調(diào)節(jié)作用。Strathdee和Lo(1989)報(bào)道在鐵-有限條件下，產(chǎn)生的白細(xì)胞毒素的量減小。這一點(diǎn)在diptheria毒素的情形下相反(Boyd等，1990)，其中當(dāng)細(xì)胞在鐵-有限條件下培養(yǎng)時(shí)，毒素的產(chǎn)生增加。在溶血巴斯德氏菌白細(xì)胞毒素產(chǎn)生中Fur充當(dāng)正調(diào)物是可能的。這一點(diǎn)與Gentry等(1986)在包含鐵的介質(zhì)中增加毒素產(chǎn)生的早期觀察是一致的。腦膜炎奈瑟氏球菌也產(chǎn)生鐵-調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)，其與外蛋白質(zhì)的RTX家族相關(guān)(Thompson等，1993)。
在tbpA序列中的頭28個(gè)預(yù)測(cè)的氨基酸形成推定的信號(hào)序列。信號(hào)序列對(duì)在橫跨膜的轉(zhuǎn)運(yùn)的過程中將前體蛋白質(zhì)插入到膜中來說十分重要。信號(hào)序列還在前體蛋白解蛋白切割為其成熟形式中充當(dāng)識(shí)別位點(diǎn)(vonHeijne,1983；Benson和Silhavy,1983)。信號(hào)序列的存在證實(shí)Tbp1位于胞質(zhì)膜以外，但是它不含有任何排序信息。Tbp1的預(yù)測(cè)氨基酸序列在蛋白質(zhì)的羧基末端具有末端苯丙氨酸殘基。苯丙氨酸是疏水芳香族氨基酸，有利于在膜中分配疏水環(huán)境。末端苯丙氨酸殘基的存在顯示對(duì)外膜定位來說是重要的(Struve等，1991)，并且說明溶血巴斯德氏菌Tbp1位于外膜中。
tbpB的序列分析揭示脂蛋白的推定的切割序列。脂蛋白具有特征性切割序列Leu-X-Y-Cys，其中X和Y是小的中性氨基酸(Wu,1987)。這說明Tbp2是被加工的和被脂質(zhì)修飾的。注意到Tbp2缺乏牽涉到外膜定位的末端苯丙氨酸殘基是有意義的。類似的運(yùn)鐵蛋白結(jié)合脂蛋白在流感嗜血菌，淋病萘瑟氏球菌和腦膜炎奈瑟氏球菌(Legain等，1993)Anderson等，1994)中發(fā)現(xiàn)。Griffiths等(1993)已闡明在淋病萘瑟氏球菌，腦膜炎奈瑟氏球菌和流感嗜血菌b型中的Tbp2蛋白質(zhì)中的共同的抗原結(jié)構(gòu)域。
一種蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)(pI)被定義為所說的肽具有0凈電荷時(shí)的pH值。pI的計(jì)算假定沒有干擾電離狀態(tài)的任何三維結(jié)構(gòu)。因此，計(jì)算的pI值僅僅是近似值，并且可以不同于實(shí)驗(yàn)結(jié)果。溶血巴斯德氏菌Tbp1和Tbp2的pI被計(jì)算出分別為9.16和9.71。已說明陽離子多肽增加體內(nèi)膜相互作用。Tbp1的堿性性質(zhì)提高與宿主運(yùn)鐵蛋白蛋白質(zhì)相互作用是可能的。奈瑟氏球菌屬的Tbp1(Cornelissen等，1992)和Fbp(Berish等，1990)蛋白質(zhì)也是堿性蛋白質(zhì)。在嗜肺軍團(tuán)菌(Legionella pneumophilia)中，堿性表面蛋白質(zhì)起作用抑制噬溶酶體(phagolysosomal)融合(Cianociotto等，1989)。
Ⅱ．蛋白質(zhì)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的初步預(yù)測(cè)利用Kyte和Doolittie的方法(1982)產(chǎn)生Tbp1和Tbp2的親水性圖。在溶血巴斯德氏菌Tbp1的親水性圖中，第一個(gè)峰位于第1至30位氨基酸。這代表所有信號(hào)序列共同的疏水核心(Hayashi和Wu,1990)。其它的疏水區(qū)可以是跨膜結(jié)構(gòu)域。疏水結(jié)構(gòu)域可以是暴露在細(xì)胞表面或外周質(zhì)的蛋白質(zhì)的區(qū)。在溶血巴斯德氏菌Tbp1蛋白質(zhì)中跨膜區(qū)的位置類似于許多在淋病奈瑟氏球菌Tbp1中預(yù)測(cè)的跨膜區(qū)。這說明Tbp1蛋白質(zhì)可以具有一種類似的結(jié)構(gòu)，以及它們?cè)诎被崴缴瞎灿幸欢ǔ潭鹊耐葱浴Ｈ苎退沟率暇鶷bp2蛋白質(zhì)具有在蛋白質(zhì)的中心的疏水前導(dǎo)序列以及幾個(gè)大的疏水區(qū)，并且明顯不同于對(duì)淋病奈瑟氏球菌Tbp2預(yù)測(cè)的親水性圖。這意味著兩種蛋白質(zhì)在結(jié)構(gòu)上不同。
利用Emini表面概率方法預(yù)測(cè)Tbp1和Tbp2的表面暴露區(qū)。向細(xì)胞表面暴露的Tbp1和Tbp2的區(qū)可以牽涉到配體相互作用，并且可以是抗原性的。
Chou-Fasman法一般用于預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)。該方法基于各氨基酸具有的對(duì)α-螺旋、β-折疊或β-轉(zhuǎn)角的傾向。Chou-Fasman法預(yù)測(cè)溶血巴斯德氏菌Tbp1由許多β-折疊與β-轉(zhuǎn)角組成。這些β-折疊重復(fù)橫越外膜和間插序列構(gòu)成表面或外周質(zhì)暴露環(huán)是可能的。Chou-Fasman法也預(yù)測(cè)淋病奈瑟氏球菌Tbp1也是由β-折疊組成的。對(duì)大腸桿菌外膜蛋白質(zhì)如FepA(Moeck等，1994)，這一結(jié)構(gòu)已經(jīng)提出。溶血巴斯德氏菌和淋病奈瑟氏球菌Tbp1蛋白質(zhì)共有一種共同的結(jié)構(gòu)，它意味著它們也可以有從宿主運(yùn)鐵蛋白分子除去鐵的一種類似的機(jī)理。溶血巴斯德氏菌Tbp2的Chou-Fasman圖也預(yù)測(cè)明顯不同于對(duì)淋病奈瑟氏球菌Tbp2預(yù)測(cè)的占優(yōu)勢(shì)的β-折疊與β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)。Ⅲ．tbpA在溶血巴斯德氏菌和相關(guān)物種中的分布十六種溶血巴斯德氏菌血清型基因組DNA與tbpA探針的Southern雜交顯示高度同源的基因存在于A生物型內(nèi)。結(jié)果也說明遺傳組構(gòu)或tbpA基因在T生物型中明顯不同。這支持了Murray等(1992)的觀察結(jié)果，Murray等指出，A和T生物型的鐵-調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)在抗原性上是不同的。以前在溶血巴斯德氏菌抗原決定簇上的工作說明，唾液酸糖蛋白酶，血清型特異性抗原，三種脂蛋白以及LPS生物合成基因在T生物型中是喪失的或具有一種不同的遺傳組構(gòu)(Burrows，博士論文，1993)。A和T生物型確實(shí)共有表型和生化特性(Holt,1977)，但是基于DNA:DNA雜交，它們僅僅是遠(yuǎn)緣相關(guān)的(Bingham等，1990)。Sneath和Stevens(1990)提出生物型T血清型重新命名為物種海藻巴斯德氏菌。
在運(yùn)鐵蛋白結(jié)合蛋白的遺傳組構(gòu)中的多樣性也在胸膜肺炎放線桿菌TfbA(Gonzalez等，1990；Gerlach等.,1992b)和腦膜炎奈瑟氏球菌Tbp2(Legrain等，1993；Rokbi,1993)中顯示。在胸膜肺炎放線桿菌中，血清型1和血清型7 TfbA蛋白質(zhì)在氨基酸水平上共有僅55％的同源性(Gerlach等，1992b)?；谒鼈兊姆肿恿?，序列相似性，以及抗原不均一性，腦膜炎奈瑟氏球菌Tbp2蛋白質(zhì)劃分成兩類(Robki等，1993)。在物種之內(nèi)的運(yùn)鐵蛋白結(jié)合蛋白的多樣性可以有利于結(jié)合不同的血清型，以避免抗異源菌株的宿主免疫反應(yīng)(Gerlach等，1992b)。
Southern雜交實(shí)驗(yàn)顯示來源于胸膜肺炎放線桿菌菌株CM5和Shope4074的染色體DNA僅在低嚴(yán)格性條件下與tbpA探針雜交。這說明溶血巴斯德氏菌和胸膜肺炎放線桿菌運(yùn)鐵蛋白結(jié)合蛋白僅共有低程度的同源性。這一結(jié)果由對(duì)溶血巴斯德氏菌Tbp1和胸膜肺炎放線桿菌TfbA蛋白質(zhì)的氨基酸序列的同源性研究證實(shí)。
豬放線桿菌基因組DNA也與tbpA探針雜交，這說明它可以具有類似運(yùn)鐵蛋白結(jié)合蛋白。結(jié)果也說明豬放線桿菌運(yùn)鐵蛋白結(jié)合蛋白對(duì)Tbp1和溶血巴斯德氏菌的相關(guān)性可以比對(duì)胸膜肺炎放線桿菌TfbA的相關(guān)性更為密切。Ⅳ．同源性研究所有蛋白質(zhì)序列由PCGene(Clustal)進(jìn)行序列對(duì)比，PCGene根據(jù)Higgins和Sharp的方法比較序列(1988)。在這一方法中的第一個(gè)步驟是計(jì)算所有逐對(duì)序列的相似性。然后從第一步驟產(chǎn)生的相似性基礎(chǔ)產(chǎn)生樹型圖。圖11中的樹型圖是用巴斯德氏菌屬，放線桿菌屬和奈瑟氏球菌屬運(yùn)鐵蛋白結(jié)合蛋白的Higgins與Sharp序列對(duì)比產(chǎn)生的。
a)Neisseria spp溶血巴斯德氏菌tbpA的預(yù)測(cè)的氨基酸序列具有與淋病奈瑟氏球菌tbpA預(yù)測(cè)的氨基酸序列的同源性區(qū)。這說明運(yùn)鐵蛋白結(jié)合蛋白在結(jié)構(gòu)上類似，并且與蛋白質(zhì)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)研究中的觀察結(jié)果一致。Ogunnariwo和Schryvers(1990)報(bào)道溶血巴斯德氏菌A1 Tbp1在大小和性質(zhì)上類似于淋病奈瑟氏球菌Tbp1蛋白質(zhì)。兩物種都產(chǎn)生在SDS-PAGE之后不能結(jié)合運(yùn)鐵蛋白的100 kDa受體蛋白質(zhì)，這說明在運(yùn)鐵蛋白結(jié)合中天然蛋白質(zhì)構(gòu)象是重要的。然而，兩種蛋白質(zhì)在它們的結(jié)合特異性方面是不同的淋病奈瑟氏球菌Tbp1僅結(jié)合人運(yùn)鐵蛋白，而溶血巴斯德氏菌A1 Tbp1結(jié)僅合牛運(yùn)鐵蛋白。這說明兩種tbpA序列之間的區(qū)別可以是編碼鐵來源的特異性的區(qū)。
b)胸膜肺炎放線桿菌溶血巴斯德氏菌A1 Tbp1的預(yù)測(cè)的氨基酸序列與胸膜肺炎放線桿菌TfbA的序列具有低程度的同源性。這一結(jié)果由Southern雜交實(shí)驗(yàn)證實(shí)，該實(shí)驗(yàn)說明胸膜肺炎放線桿菌菌株CM％和Shope 4074的染色體DNA僅在低嚴(yán)格性條件下與tbpA探針雜交。這是有意思的，因?yàn)閮煞N細(xì)菌都屬于巴斯德氏菌科，預(yù)期具有一種類似的運(yùn)鐵蛋白結(jié)合蛋白。以前的工作曾說明兩種蛋白質(zhì)在功能上類似但是在結(jié)構(gòu)上不同。在胸膜肺炎放線桿菌中的TfbA蛋白質(zhì)表現(xiàn)出是脂蛋白(Gonzalez等，1990)，而100 kDa溶血巴斯德氏菌A1 Tbp1不是(Ogunnariwo和Schryvers,1990)。胸膜肺炎放線桿菌能夠區(qū)別鐵-飽和和鐵-耗盡運(yùn)鐵蛋白(Gerlach等，1992a)，而腦膜炎萘瑟氏球菌不能(Tsai等，1988)。注意到胸膜肺炎放線桿菌TfbA具有與也是脂蛋白的淋病奈瑟氏球菌Tbp2的同源性是有意義的。這說明TbpA蛋白質(zhì)類似于Tbp2，胸膜肺炎放線桿菌的Tbp1目前還沒有鑒別。
cTonB依賴性-受體蛋白質(zhì)溶血巴斯德氏菌Tbp1序列也具有與大腸桿菌TonB依賴性受體蛋白質(zhì)組共同的氨基酸。這一發(fā)現(xiàn)說明溶血巴斯德氏菌A1屬于這一家族，TonB同系物存在于巴斯德氏菌屬的物種中。第一個(gè)同源的結(jié)構(gòu)域或＂TonB盒＂在受體蛋白質(zhì)和TonB之間的直接相互作用中牽涉到(BeⅡ等，1990,Brewer等，1990)。其它的同源的區(qū)的意義不清楚，但是它們對(duì)TonB相互作用可以是所需的，或?qū)ν饽ざㄎ粊碚f可以是必要的。溶血巴斯德氏菌Tbp1，如同許多其它TonB-依賴性蛋白質(zhì)一樣，是鐵-調(diào)節(jié)的跨膜蛋白質(zhì)，并且牽涉到鐵利用中(Mietzner和Morse,1994)。如同對(duì)大腸桿菌FepA(Rutz等，1992)所提出的，溶血巴斯德氏菌Tbp2可能起門控通道的作用。淋病奈瑟氏球菌(Cornelissen等，1992)和流感嗜血菌(Jarosik等，1994)兩者的Tbp1也都屬于TonB-依賴性受體蛋白質(zhì)家族。
Ⅴ．提出的溶血巴斯德氏菌鐵攝取模型許多類似蛋白質(zhì)在奈瑟氏球菌屬，巴斯德氏菌屬和嗜血菌屬中的存在說明一種共同的機(jī)理可被鐵獲取所利用。鐵獲取的假設(shè)模型已經(jīng)對(duì)奈瑟氏球菌屬提出(Chen等，1993)，其可以用作溶血巴斯德氏菌A1的模型。鐵喪失激活類Fur調(diào)節(jié)系統(tǒng)的鐵-調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)錄。宿主運(yùn)鐵蛋白通過由兩種或多種蛋白質(zhì)組成的特異性鐵受體復(fù)合物結(jié)合到細(xì)菌細(xì)胞表面。鐵被從運(yùn)鐵蛋白除去，并且利用TonB提供的能量橫跨細(xì)菌外膜。在外周質(zhì)中，鐵短暫復(fù)合到外周質(zhì)組分Fbp上，該組分向胞質(zhì)膜通透酶運(yùn)輸它。鐵通過外周質(zhì)結(jié)合蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)橫跨胞質(zhì)膜。在胞質(zhì)中，鐵還原成Fe2+，并且由細(xì)胞同化。
對(duì)溶血巴斯德氏菌A1鐵攝取可以是唯一的一個(gè)特征是第三鐵-調(diào)節(jié)外膜蛋白質(zhì)的存在(71 kDa)，其可以形成受體復(fù)合物的一部分(Ogunnariwo和Schryvers,1990)。此外，溶血巴斯德氏菌沒有在SDS-PAGE和電印跡之后能夠結(jié)合運(yùn)鐵蛋白的受體蛋白，而淋病奈瑟氏球菌有(Schryvers和Morris,1988)。這說明溶血巴斯德氏菌受體復(fù)合物的結(jié)合機(jī)理可以與淋病奈瑟氏球菌中的受體復(fù)合物稍有不同。
在巴斯德氏菌科中已經(jīng)鑒別了類似于淋病奈瑟氏球菌Fbp的蛋白質(zhì)。在流感嗜血菌中已鑒別了一種40 kDa的周質(zhì)蛋白質(zhì)，發(fā)現(xiàn)它的N端序列81％同源于淋病奈瑟氏球菌Fbp(Harkness等，1992)。在溶血巴斯德氏菌A3中，描述了35 kDa周質(zhì)鐵-調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)，但是還沒有發(fā)現(xiàn)其任何功能(Lainson等，1990)。此外，已經(jīng)采用親和性方法從溶血巴斯德氏菌A1分離了一種37 kDa鐵調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)(Ogunnariwo和Schryvers,1990)?；诖笮『臀恢孟嗨菩?，這兩種蛋白質(zhì)類似于淋病奈瑟氏球菌Fbp是可能的。
Ⅵ．T7蛋白質(zhì)表達(dá)Tbp1基因產(chǎn)物的T7 RNA聚合酶-依賴性產(chǎn)生在大腸桿菌JM109(DE3)中是不成功的(圖13)。一種可能的解釋是tbpA的核糖體結(jié)合位點(diǎn)是低效能的?；蛟S所說的基因可以克隆進(jìn)載體，這種載體攜帶一個(gè)功能性核糖體-結(jié)合位點(diǎn)。另外，Tbp1蛋白質(zhì)可以是不穩(wěn)定的，并且需要其它蛋白質(zhì)或因子的存在，以正確產(chǎn)生。當(dāng)它們單獨(dú)被合成時(shí)，異源二聚蛋白質(zhì)組分經(jīng)常不穩(wěn)定。
Ⅶ．Western免疫印跡分析對(duì)在鐵-充足和鐵-有限條件下生長的溶血巴斯德氏菌A1細(xì)胞內(nèi)和外膜組分進(jìn)行Western免疫印跡(圖14和15)。鐵-有限條件通過添加鐵螯合劑EDDA模擬，EDDA是在培養(yǎng)介質(zhì)中限制鐵可用性的普通的合成鐵螯合劑。選擇EDDA用于這些研究，這是由于其對(duì)鐵的特異性和其缺乏對(duì)細(xì)菌的毒副作用(Neilands,1981)。
由抗可溶性抗原的兔抗血清免疫染色的溶血巴斯德氏菌A1膜組分不與鐵-調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)反應(yīng)(圖14)。在這一免疫印跡中既沒有觀察到100 kDa也沒有觀察到77 kDa鐵-調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)，可能是因?yàn)樵既苎退沟率暇鶤1培養(yǎng)物(用于兔的超免疫)在鐵有限條件下不能生長。所使用的介質(zhì)包含7％的血清，以避免包含血清蛋白質(zhì)的抗體。相反，可以是鐵-調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的肽與用Presponse接種的?？寡宸磻?yīng)(圖15)。Presponse是由在無血清RPMI培養(yǎng)基1640中生長至后對(duì)數(shù)期的溶血巴斯德氏菌A1細(xì)胞產(chǎn)生的(Shewen和Wilkie,1987；Shewen等，1988)。這一培養(yǎng)基的低鐵濃度誘導(dǎo)運(yùn)鐵蛋白結(jié)合蛋白產(chǎn)生是可能的。牛對(duì)由溶血巴斯德氏菌(其在鼻咽中是共生體)產(chǎn)生的運(yùn)鐵蛋白結(jié)合蛋白反應(yīng)也是可能的。對(duì)運(yùn)鐵蛋白結(jié)合蛋白的抗體的存在說明這些蛋白質(zhì)是免疫原性的。實(shí)施例2細(xì)菌菌株。用于這一研究中的細(xì)菌菌株在表2中列出。溶血巴斯德氏菌菌株h173,h174,h175和h176是患有肺巴斯德氏菌病的反芻動(dòng)物的場分離物，由Frank Milward博士(Rhone Merieux,Lyon，法國)提供。溶血巴斯德氏菌h44-h46菌株是牛臨床A1型分離物，來源于從S.Lundberg，獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室，Regional Agricultaral Building,Airdrie,Alberta獲得的患肺炎的牛。h44以前已有描述(26)。溶血巴斯德氏菌菌株h93-h97是來源于患肺炎的牛的牛臨床A1型分離物，從獸醫(yī)和傳染病組織(VIDO)，Saskatoon的A.Potter博士獲得。菌株h98-h107是ATCC溶血巴斯德氏菌菌株(5)，也是從A.Potter博士獲得的。馬駒放線桿菌(Actinobacillusequuli)(馬駒嗜血菌)菌株h50從獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室，Regional AgriculturalBuilding,Airdrie,Alberta的Jane Pritchard博士獲得。新物種海藻巴斯德氏菌(34)。
表2．包括在這一研究中的菌株表物種 菌株血清型宿主 來源物種溶血巴斯德氏菌h44 A1 牛 S.Lunberg,Airdrie溶血巴斯德氏菌h45 A1 牛 S.Lunberg,Airdrie溶血巴斯德氏菌h46 A1 牛 S.Lunberg,Airdrie溶血巴斯德氏菌h93(ph21)A1 牛 A.Potter.VIDO溶血巴斯德氏菌h94(ph24)A1 牛 A.Potter,VIDO溶血巴斯德氏菌h95(ph27)A1 牛 A.Potter,VIDO溶血巴斯德氏菌h96(ph45)A1 牛 A.Potter,VIDO溶血巴斯德氏菌h97(ph46)A1 牛 A.Potter,VIDO溶血巴斯德氏菌h196 A1 牛 R.Lo,U.of Guelph溶血巴斯德氏菌h98(ATCC33366) A2 綿羊 A.Potter,VIDO溶血巴斯德氏菌*h99(ATCC33367) T3 綿羊 A.Potter,VIDO溶血巴斯德氏菌*h100(ATCC33368) T4 綿羊 A.Potter,VIDO溶血巴斯德氏菌h101(ATCC33370) A6 綿羊 A.Potter,VIDO溶血巴斯德氏菌h102(ATCC33371) A7 綿羊 A.Potter,VIDO溶血巴斯德氏菌h103(ATCC33372) A8 綿羊 A.Potter,VIDO溶血巴斯德氏菌h104(ATCC33373) A9 綿羊 A.Potter,VIDO溶血巴斯德氏菌h105(ATCC33369) A5 綿羊 A.Potter,VCDO溶血巴斯德氏菌*h106(ATCC33374) T10 綿羊 A.Potter,VlDO溶血巴斯德氏菌h107(ATCC33375) A11 山羊 A.Potter,VIDO溶血巴斯德氏菌h173(77020-15184)未分型 山羊 F.Milward RhoneMerieux溶血巴斯德氏菌h174(90020-16266)A7 山羊 F.Milward,RhoneMerieux溶血巴斯德氏菌h175(84020-15786)A7 綿羊 F.Milward,RhoneMeriewr溶血巴斯德氏菌h176(84020-15792)A9 綿羊 F.Milward,RhoneMerieux馬駒放線桿菌 h50 馬 J.Pritchard,Airdric*T-型菌株現(xiàn)在被認(rèn)為是新菌株，海藻巴斯德氏菌(34)。生長條件。所有細(xì)菌菌株在-70℃下貯存在30％甘油中。將冰凍的分離物劃線到巧克力瓊脂平板上，并且在37℃下5％CO2的溫箱中進(jìn)行溫育。通過在補(bǔ)充2μg/ml硫胺素一磷酸和3μg/ml煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)并包含鐵螯合劑乙二胺二羥苯乙酸(EDDHA，西格瑪)的人腦心臟灌輸肉湯(BH1,Difco實(shí)驗(yàn)室)或O’Reilly Niven肉湯(25)(最終濃度100μM)上培養(yǎng)細(xì)菌完成鐵-有限生長。如前所述完成利用不同運(yùn)鐵蛋白作為鐵源的生長實(shí)驗(yàn)(26)。
運(yùn)鐵蛋白和衍生物的制備。牛運(yùn)鐵蛋白從西格瑪獲得。馬、羊(綿羊)和公山羊(山羊)運(yùn)鐵蛋白的制備(2),30％或100％飽和運(yùn)鐵蛋白的鐵裝載(22)和辣根過氧化物酶(HRP)與運(yùn)鐵蛋白(37)的綴合實(shí)質(zhì)上如前所述。在牛，綿羊，公山羊和馬運(yùn)鐵蛋白(HRP-bTf,HRP-oTf,HRP-cTf和HRP-eTf)綴合物的制備中，在化學(xué)綴合之后，將HRP和運(yùn)鐵蛋白的混合物進(jìn)行凝膠過濾。將顯示最大活性的組分收集起來，透析和冰凍等份樣，并且存儲(chǔ)在-70℃。
固相結(jié)合分析。固相結(jié)合分析在本質(zhì)上是從上述方法衍生出來的(32)。將完整細(xì)胞懸液或粗制整膜制品等份點(diǎn)樣在硝酸纖維素/乙酸纖維素膜(HA紙，Millipore公司，Bedfbrd,MA)上，并且在干燥之后用包含0.5％脫脂牛奶的緩沖液(封閉溶液)封閉HA紙。對(duì)于運(yùn)鐵蛋白結(jié)合分析來說，將所用的紙放在包含450 ng/ml HRP-綴合運(yùn)鐵蛋白的封閉溶液中，洗滌并且實(shí)質(zhì)上如前所述(32)用HRP底物混合物進(jìn)行顯影。對(duì)于估計(jì)完整細(xì)胞結(jié)合抗-受體抗體來說，除了第一種結(jié)合溶液包含抗-TbpA和抗-TbpB抗血清的1/1000稀釋液外使用類似的方法洗滌后，將膜暴露于包含HRP-綴合山羊抗-兔抗體制劑1/3,000稀釋液的第二種結(jié)合液中。
運(yùn)鐵蛋白結(jié)合蛋白(TbpA和TbpB)的親和分離。根據(jù)制造商說明，利用包含3.5 mg/ml鐵-飽和運(yùn)鐵蛋白的溶液分別將牛，綿羊，公山羊和馬運(yùn)鐵蛋白與CNBr-激活瓊脂糖凝膠4B相偶聯(lián)。通過添加乙醇胺來封閉激活基團(tuán)。非偶聯(lián)運(yùn)鐵蛋白通過用10至20倍柱體積的包含6.0M鹽酸胍的50mMTrisHCl,1M NaCl,pH8.0緩沖液洗滌除去，進(jìn)一步洗滌后，結(jié)合的運(yùn)鐵蛋白在0.1M檸檬酸鈉/0.1M NaHCO3pH8.6緩沖液中用包含5μg/mlFeCl3的溶液重新與鐵裝上。
如前所述(32)從溶血巴斯德氏菌或馬駒放線桿菌制備的鐵-缺乏總膜(200mg蛋白質(zhì))用包含1.0M NaCl的50mM Tris pH8.0稀釋成2mg/ml。分別添加EDTA和十二烷基肌氨酸鈉(sarkosyl)至10mM和0.75％的終濃度將稀釋的膜溶解，在室溫下將混合物在輕微振蕩下溫育15-30分鐘。溶液在10,000rpm下離心10分鐘以便除去不溶碎片。將包含溶解膜的上清液加到1.5×10cm運(yùn)鐵蛋白-親和柱，然后用包含1.0 M NaCl,10mMEDTA,0.75％十二烷基肌氨酸鈉的50mM Tris pH8.0充分(至少10倍柱床體積)洗滌以便除去非特異性結(jié)合的蛋白質(zhì)。在使用低鹽洗滌條件的實(shí)驗(yàn)中洗滌緩沖液包含100mM NaCl(代替了1M NaCl)。在一些實(shí)例中，用2-3倍柱床體積包含0.2M鹽酸胍的緩沖液進(jìn)行附加洗滌以便盡可能地除去污染蛋白質(zhì)。
兩種運(yùn)鐵蛋白結(jié)合蛋白(TbpA和TbpB)的共洗脫是通過應(yīng)用2-3倍柱床體積的在50mM Tris pH8.0(包含1.0M NaCl、1mM EDTA、0.01％十二烷基肌氨酸鈉)中的2.0M鹽酸胍完成的。收集洗脫劑用于立即對(duì)50mMTris pH5.0透析。以更高濃度的鹽酸胍進(jìn)一步處理通常不會(huì)導(dǎo)致受體蛋白質(zhì)的更高的產(chǎn)率。以2倍柱床體積每種包含0.2、0.5、0.75、1.0、1.5、2.0和3.0鹽酸胍的緩沖液分別通過順序洗脫得到TbpA和TbpB單個(gè)分離物。對(duì)洗脫物在18小時(shí)期間用3種不同的3升50mM Tris pH8.0進(jìn)行透析，并且用超濾法進(jìn)行濃縮。在SDS-PAGE分析之后，收集來自0.5到0.75M鹽酸胍洗脫緩沖液的組分，作為TbpB制劑，同時(shí)收集來自1.5到2M鹽酸胍洗脫緩沖液的組分，作為TbpA的制劑。分析方法。采用如前所述(32)的SDS-PAGE和接下來的銀染分析蛋白質(zhì)樣品。對(duì)于Western印跡分析來說，在10％聚丙烯酰胺凝膠上分離大約1-2.m純化受體蛋白質(zhì)或40.m來自鐵-缺乏細(xì)胞的外膜蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)通過在20mM Tris,pH7.5,150mM甘氨酸，20％甲醇和0.1％SDS中15V下的電泳一夜轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素(Millipore,Bedford,MA)上。濾膜用在20mM Tris,pH7.5,500mM NaCl(TBS)中的0.5％脫脂牛奶在室溫下封閉30分鐘。將封閉溶液中適當(dāng)抗體的1/300稀釋液在室溫下用到紙上1小時(shí)，接著進(jìn)行兩次10-分鐘的TBS洗滌。使第二抗體(來自BioRad的山羊抗-兔IgG-辣根過氧化物酶綴合物)的1/3000稀釋液在室溫下結(jié)合一小時(shí)。在TBS中，經(jīng)過三次10-分鐘的洗滌除去綴合物，并且利用HRP-底物混合物進(jìn)行顯影。受體特異性比較以前的研究已經(jīng)顯示了來自各種反芻動(dòng)物的病原細(xì)菌物種的運(yùn)鐵蛋白受體對(duì)不同反芻動(dòng)物運(yùn)鐵蛋白(即牛、綿羊和山羊)在特異性上是不同的(38)。這可能反映出牽涉配體的受體蛋白質(zhì)區(qū)域的不同，并且指出對(duì)于反芻動(dòng)物病原體來說，這些區(qū)域不能成為廣譜運(yùn)鐵蛋白受體為基礎(chǔ)的疫苗的基礎(chǔ)。然而，不排除一群相關(guān)反芻動(dòng)物病原體(如各種巴斯德氏菌屬物種)可能具有能為產(chǎn)生交叉保護(hù)性應(yīng)答提供基礎(chǔ)的共同配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域。這樣，確定來自一組的代表性巴斯德氏菌屬分離物的運(yùn)鐵蛋白受體是否具有對(duì)反芻動(dòng)物病原體相同的特異性是重要的。
作為受體特異性的初步分析，一組代表性分離物用來估計(jì)它們利用各種反芻動(dòng)物運(yùn)鐵蛋白作為供生長的鐵源的能力(表2)。利用上述方法部分所述的簡單的平板測(cè)定。來自反芻動(dòng)物(牛、公山羊和綿羊)但不是來自非反芻動(dòng)物(馬)宿主的Fe-飽和運(yùn)鐵蛋白刺激所有溶血巴斯德氏菌和海藻巴斯德氏菌的代表性反芻動(dòng)物分離物的生長。馬運(yùn)鐵蛋白刺激馬病原體馬駒放線桿菌(菌株h50)的生長表明溶血巴斯德氏菌菌株沒有利用馬運(yùn)鐵蛋白作為鐵源的能力不是因?yàn)橹苿┲腥狈υ摰鞍住?br> 表3在不同運(yùn)鐵蛋白上的生長。物種 菌株 血清型宿主生長用Tf來源bTfoTfcTfeTf溶血巴斯德氏菌h44 A1牛 + + + -溶血巴斯德氏菌h173未分型山羊+ + + -溶血巴斯德氏菌h174A7羊 + + + -溶血巴斯德氏菌h175A7綿羊+ + + -溶血巴斯德氏菌h176A9綿羊+ + + -溶血巴斯德氏菌h106TI0 綿羊+ + + -馬駒放線桿菌 h50 馬 - - - +作為受體特異性的進(jìn)一步估計(jì)，利用運(yùn)鐵蛋白的辣根過氧化物酶(HRP)綴合物通過簡單結(jié)合分析來估計(jì)用完整細(xì)胞或分離膜對(duì)運(yùn)鐵蛋白的結(jié)合。綴合物從牛，綿羊和公山羊運(yùn)鐵蛋白中制備，并且檢驗(yàn)它們與分離自溶血巴斯德氏菌和海藻巴斯德氏菌的幾個(gè)代表菌株的鐵-缺乏細(xì)胞的全膜的結(jié)合能力。結(jié)果說明所有選擇的菌株都能結(jié)合三種反芻動(dòng)物(牛，公山羊和綿羊)運(yùn)鐵蛋白，但是不能結(jié)合馬運(yùn)鐵蛋白(圖16)，這與生長研究結(jié)果相一致(表3)。為了確定觀察到的所有三種反芻動(dòng)物運(yùn)鐵蛋白的結(jié)合是因?yàn)檫x擇物種的相同受體，進(jìn)行競爭性結(jié)合分析，其中檢驗(yàn)非標(biāo)記反芻動(dòng)物運(yùn)鐵蛋白封閉標(biāo)記運(yùn)鐵蛋白結(jié)合的能力。在這些實(shí)驗(yàn)中，各種反芻動(dòng)物運(yùn)鐵蛋白的交互抑制作用同樣有效，這表明它們結(jié)合具有類似親和性的相同受體(數(shù)據(jù)未顯示)。
生長和結(jié)合研究結(jié)果表明牛、綿羊和公山羊運(yùn)鐵蛋白能夠與在溶血巴斯德氏菌中鐵獲取所涉及的受體組分相互作用。將在方法部分所述的親和性方法通過使用牛、綿羊或公山羊運(yùn)鐵蛋白-瓊脂糖凝膠樹脂來確定與反芻動(dòng)物運(yùn)鐵蛋白相互作用的蛋白質(zhì)。如圖17中所說明的，當(dāng)使用牛(泳道A和B)、綿羊(泳道C)或公山羊(泳道D)運(yùn)鐵蛋白親和柱任何一種時(shí)，用來自牛分離物(h44)，公山羊分離物(h173)或綿羊分離物(h175)的膜制劑分離出一種大約100,000分子量的占優(yōu)勢(shì)的受體蛋白質(zhì)。這種蛋白質(zhì)與在其它細(xì)菌病原體(18,27,30,31)中發(fā)現(xiàn)的具有相似大小的受體蛋白質(zhì)類似，它通常稱作運(yùn)鐵蛋白結(jié)合蛋白1(Tbp1)。另一種名稱TbpA被推薦使用，以便與現(xiàn)有命名慣例相一致(21)。
第二種大約60,000分子量的蛋白質(zhì)利用牛分離物(h44)膜在通過反芻動(dòng)物運(yùn)鐵蛋白(泳道B,C和D)親和層析分離的樣品中也很明顯。這種蛋白質(zhì)可與從其它病原細(xì)菌物種(18,27,30,31)分離的更低的分子量的受體蛋白質(zhì)，即運(yùn)鐵蛋白結(jié)合蛋白2(Tbp2)相比較。對(duì)于上面暗示的理由，已經(jīng)推薦為另一個(gè)名稱(TbpB)。這一分子量的蛋白質(zhì)在從公山羊分離物(h173)和綿羊分離物(h175)獲得的大多數(shù)樣品中也是可以檢測(cè)的，但是這一組分的存在和產(chǎn)率對(duì)分離條件很敏感。在這些物種中所觀察的相對(duì)TbpA(Tbp1)的TbpB(Tbp2)典型低產(chǎn)率不是細(xì)菌受體蛋白的一般性質(zhì)，并且甚至反映相關(guān)物種TbpB的共同性質(zhì)。
當(dāng)馬運(yùn)鐵蛋白-瓊脂糖凝膠用于親和性分離方法時(shí)，蛋白質(zhì)全都不能分離(泳道E)，具體地說，這表明它們的分離是因?yàn)榉雌c動(dòng)物運(yùn)鐵蛋白的存在。在親和性分離方法中，當(dāng)利用更不嚴(yán)格的洗滌條件時(shí)，當(dāng)利用來自牛(h44)，公山羊(h173)或綿羊(h175)分離物的膜時(shí)，大約38,000和70,000分子量的附加蛋白質(zhì)由親和性柱(泳道A)保留。一種大約77,000分子量的附加蛋白質(zhì)在用牛分離物膜所獲得的樣品中也很明顯。受體蛋白質(zhì)的免疫學(xué)性質(zhì)比較。
牛、公山羊和綿羊運(yùn)鐵蛋白競爭相同受體的觀察結(jié)果表明至少在受體結(jié)合區(qū)域是保守的。為了確定共同免疫學(xué)表位的存在上是否也具有相似性，制備抗一種菌株純化的受體蛋白質(zhì)的抗血清以估計(jì)它們與來自其它分離物的受體蛋白質(zhì)的交叉反應(yīng)性。TbpA和TbpB的親和性純化制品從菌株h44中獲得(參見方法部分)，并且用于在兔中產(chǎn)生單特異性抗血清。然后，試驗(yàn)這些抗血清對(duì)不同血清型代表菌株分離物的受體蛋白質(zhì)(包括牛，綿羊和山羊的分離物)的作用。圖18中A組的結(jié)果說明抗-TbpB抗血清與大約60,000分子量(TbpB)的蛋白質(zhì)強(qiáng)烈反應(yīng)，后者是由所有代表菌株的bTf-瓊脂糖凝膠親和性分離的。類似地，抗-TbpA抗血清與分離自所有七個(gè)代表菌株的TbpA進(jìn)行交叉反應(yīng)(圖16,B組)。對(duì)反芻動(dòng)物分離物(表2)的附加血清型的進(jìn)一步分析繼續(xù)顯示與兩種受體蛋白質(zhì)相當(dāng)大的交叉反應(yīng)性(未顯示數(shù)據(jù))。這些數(shù)據(jù)表明兩種受體蛋白質(zhì)在牛、綿羊和山羊中引起肺巴斯德氏菌病的溶血巴斯德氏菌的不同血清型中都是保守的。
雖然圖18中說明的免疫學(xué)交叉反應(yīng)表明在來自不同物種的受體蛋白質(zhì)中具有保守表位，但沒有指出任何這些表位是否在細(xì)菌表面，在表面上它們能作為宿主免疫效應(yīng)物機(jī)制的有效靶。為了說明這一點(diǎn)，將固相結(jié)合分析用來估計(jì)抗受體抗體被完整細(xì)胞的結(jié)合。這一分析顯示當(dāng)檢驗(yàn)牛A1型分離物時(shí)，鐵-缺乏而不是鐵-充足條件下所生長的細(xì)胞具有強(qiáng)的結(jié)合能力(數(shù)據(jù)未顯示)。當(dāng)檢驗(yàn)對(duì)不同血清型綿羊分離物的選擇時(shí)，具有不同程度的反應(yīng)性(圖19)。溶血巴斯德氏菌菌株A類型的其它血清型(h98和h105，圖19)顯示了與抗-TbpA和抗-TbpB抗血清的相當(dāng)大反應(yīng)性。相反地，T-型菌株(海藻巴斯德氏菌h99,h100和h106)顯示出僅僅對(duì)兩種抗-受體抗血清很弱的反應(yīng)性。然而，標(biāo)記bTf也具有弱結(jié)合性的事實(shí)表明在這一實(shí)驗(yàn)中所用鐵-缺乏生長條件下限制了受體蛋白質(zhì)的生產(chǎn)。這樣，缺乏抗-受體抗血清的反應(yīng)性不能歸因于在這些物種的受體蛋白質(zhì)中缺乏外露的交叉反應(yīng)性表位。
實(shí)施例3A1型菌株的運(yùn)鐵蛋白受體基因的克隆。
下列材料與方法用于本實(shí)施例所述的研究中材料和方法細(xì)菌、質(zhì)粒、噬菌體和培養(yǎng)條件。溶血巴斯德氏菌和大腸桿菌菌株來自發(fā)明人實(shí)驗(yàn)室保藏處。已經(jīng)描述了在pBR322中的溶血巴斯德氏菌A1 DNA的質(zhì)?？寺?Lo等，1985)。從G.Weinstock獲得包含溶血巴斯德氏菌A1 DNA的第1克隆庫。溶血巴斯德氏菌A1菌株H196來自獸醫(yī)傳染病組織(VIDO,Saskatoon,Saskatchewan，加拿大)。所有細(xì)菌菌株貯存在-70℃30％甘油中。將冰凍分離物劃線到巧克力(溶血巴斯德氏菌)或Luria-Bertani加抗生素(大腸桿菌)瓊脂平板上，并且在5％CO2中37℃下溫箱里溫育。
PCR擴(kuò)增。根據(jù)制造商說明在應(yīng)用生物系統(tǒng)模型390E合成儀上合成PCR引物并且進(jìn)行純化。利用推薦的PCR共反應(yīng)物與Taq DNA聚合酶在Perkin-Elmer Cetus 480熱循環(huán)儀上在薄壁500ml試管中進(jìn)行PCR。PCR條件包括95℃2分鐘，隨后分別在95℃(1分鐘)、52℃(1分鐘)和72℃(2分鐘)下變性、退火和延伸30個(gè)循環(huán)。在每個(gè)PCR循環(huán)中包括不含有模板DNA的陰性對(duì)照。
基因組中tbp區(qū)域的作圖。用許多限制酶消化來自溶血巴斯德氏菌A1的基因組DNA，由瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分離，印跡在硝酸纖維素膜并且與對(duì)上述tbpA或tbpB的不同區(qū)域有特異性的DNA探針雜交。比較限制性酶切圖與從重組體質(zhì)粒以及測(cè)序的區(qū)域獲得的圖譜，以便確定tbp基因的正確位置。
運(yùn)鐵蛋白和衍生物的制備。從西格瑪獲得牛運(yùn)鐵蛋白(bTf)。采用在其它地方描述的方法(Mazurier和Spik,1980)產(chǎn)生bTf的apo-型。簡言之，bTf用0.1M乙酸鈉，0.1M磷酸鈉，25mM EDTA 溶解成0.5-1.0％的濃度，并且通過加入濃冰乙酸調(diào)至(pH5.5)。將溶液在4℃下平衡一夜，并且利用以乙酸鈉/磷酸鈉低pH緩沖液平衡的丙烯酰胺凝膠柱除去鐵。利用以50mM Tris-HCl(pH7.5)平衡的丙烯酰胺凝膠柱交換低pH緩沖液。最后，利用Amicon濾器濃縮蛋白質(zhì)。如所述產(chǎn)生bTf的N-和C-端衍生物(Yu和Schryvers,1994)。簡言之，80mg ConA純化的bTf在室溫下利用2mg蛋白酶K在40ml 0.1M Tris-HCl(pH8.2),25mM CaCl2中消化20小時(shí)。為了停止反應(yīng)，將苯甲基磺酰氟(PMSF)加至0.1 mg/ml。將5ml濃縮制劑加到以50mM Tris-HCl(pH8.0)平衡的葡聚糖凝膠G-100柱上，使N-片段和C-片段組分對(duì)50mM乙酸鈉(pH6.9),1mM CaCl2,1mMMgCl2,1mM MnCl2透析，并且加到ConA-瓊脂糖凝膠柱(結(jié)合bTf的糖基化C-片段但不結(jié)合bTf的N-片段)上。將用剛描述的緩沖液洗滌柱的洗脫液作為包含N-片段的組分保持。利用包含0.2M甲基-a-D-甘露吡喃糖苷的相同緩沖液洗脫包含C-片段的組分。C-片段和N-片段組分都以50mM Tris-HCl(pH8.0)進(jìn)行透析，由超濾進(jìn)行濃縮，并且以等份樣在70℃下凍結(jié)。
重組體受體蛋白質(zhì)的表達(dá)。攜帶適當(dāng)重組質(zhì)粒的大腸桿菌菌株(對(duì)于TbpB為DH5αF/pCRIIPHtbpB，對(duì)于TbpA為DH5αF/pCRIIPHtbpA)用于接種包含0.2％的麥芽糖和150 mg/ml氨芐青霉素的50ml LB-肉湯起子培養(yǎng)物。在37℃生長幾小時(shí)后，培養(yǎng)物用于接種1升同樣的培養(yǎng)基使起始OD600為0.05。一旦OD600達(dá)到0.4，就添加葡萄糖至4mg/ml并且培養(yǎng)至OD600為0.7-0.8為止。此時(shí)，添加10mM的MgSO4和100ml 1010pfu/ml的CE61噬菌體懸液。細(xì)胞培養(yǎng)物另外在37℃下溫育2小時(shí)，然后通過離心收獲。將細(xì)胞沉淀重懸于5ml冰冷的50mM Tris-HCl pH8.0,1MNaCl中，供親和性分離，SDS-PAGE以及Western免疫印跡分析。
運(yùn)鐵蛋白結(jié)合蛋白的親和分離和分析方法。根據(jù)制造商說明利用包含3.5 mg/ml的鐵-飽和bTf的溶液將牛運(yùn)鐵蛋白連接到CNBr-激活瓊脂糖凝膠4B(Pharmacia)上。通過添加乙醇胺封閉激活基團(tuán)。用包含6.0M鹽酸胍的10至20倍柱體積的50mM TrisHCl,1M NaCl,pH8.0緩沖液洗滌除去非結(jié)合運(yùn)鐵蛋白。進(jìn)一步用50mM Tris-HCl(pH8.0)洗滌之后，結(jié)合運(yùn)鐵蛋白用在0.1M檸檬酸鈉/0.1M NaHCO3(pH8.6)中包含5mg/mlFeCl3的溶液與鐵一起重新裝上。再次用50mM Tris-HCl(pH8.0)洗滌之后，在進(jìn)行親和性實(shí)驗(yàn)之前，用50mM Tris-HCl(pH8.0)，1M NaCl預(yù)平衡bTf-瓊脂糖凝膠樹脂，將在50mM Tris-HCl(pH8.0)/1M NaCl中重懸浮的包含重組質(zhì)粒的大腸桿菌細(xì)胞溶解到20mM EDTA,2％Sarkosyl中，并且在室溫下溫育2小時(shí)?；旌弦涸?,000rpm下離心15分鐘(4℃)，同時(shí)細(xì)心地倒出包含溶解受體的上清液。上清液用50mM HCl(pH8.0)，1MNaCl緩沖液稀釋4次，并且在室溫下與過量(1mg/ml)的以相同緩沖液稀釋的每種下列運(yùn)鐵蛋白一起預(yù)溫育30分鐘載鐵bTf，山羊或公山羊運(yùn)鐵蛋白(cTf)，綿羊運(yùn)鐵蛋白(oTf)，以及人運(yùn)鐵蛋白(hTf)；apo-bTf；C-片段bTf和N-片段bTf。僅僅在陽性對(duì)照實(shí)驗(yàn)中添加緩沖液。在預(yù)溫育之后，將上清液加到以50mM Tris-HCl(pH8.0),1M NaCl預(yù)平衡和在室溫下溫育15分鐘的bTf瓊脂糖凝膠柱上。每柱至少以12倍柱體積的50mMTris-HCl(pH8.0),1M NaCl,10mM EDTA,0.5％十二烷基肌氨酸鈉，接著以10倍柱體積的僅包含0.05％十二烷基肌氨酸鈉的溶液充分洗滌，以除去非特異性結(jié)合的蛋白質(zhì)。最后用50mM Tris-HCl(pH8.0),0.5MNaCl進(jìn)行洗滌。
在非還原條件和沒有煮沸下運(yùn)用1倍柱床體積的2×SDS-PAGE樣品緩沖液完成重組TbpB的洗脫。在微量離心機(jī)中13,000×g下離心包含樹脂的混合物5分鐘后收集每種洗脫劑(上清液)。每種上清液(洗脫劑)的等份樣進(jìn)一步進(jìn)行SDS-PAGE，同時(shí)電印跡到Immobilon PVDF(Millipore)膜上(在20mM Tris,pH7.5,150mM甘氨酸，20％甲醇以及0.1％SDS中15V下一整夜)。膜在室溫下在20mM Tris(pH7.5),500mM NaCl(TBS)中用0.5％脫脂牛奶封閉30分鐘。在1小時(shí)內(nèi)，把抗-TbpB血清在封閉溶液中的1/1,000稀釋液涂到膜上，其后都在TBS中經(jīng)過兩個(gè)10-分鐘洗滌滌。使第二抗體(山羊抗-兔IgC-辣根過氧化物酶綴合物)的1/3000稀釋液在37℃下結(jié)合1小時(shí)。在TBS中經(jīng)過三個(gè)10分鐘的洗滌除去綴合物，并且用HRP-底物混合物(氯代苯酚/過氧化氫)顯影。
N端氨基酸序列分析。將來自H196的親和純化和依次洗脫的TbpA和TbpB樣品進(jìn)行SDS-PAGE，在PVDF(Immobilon-P,MilliporeIPVH00010)膜上進(jìn)行電印跡，以考馬斯藍(lán)簡短染色，并且從膜上切去包含個(gè)體蛋白質(zhì)區(qū)帶的帶用于N端氨基酸序列分析。
抗-TbpA和抗-TbpB單特異性兔血清的制備。將在親和性方法中從適當(dāng)組分獲得的大約500mg溶血巴斯德氏菌菌株H44的純化的TbpA和TbpB，在透析和濃縮后與弗氏完全佐劑混合，并且分別肌內(nèi)注射兩只白色雌性新西蘭兔。兔在3周間隔內(nèi)以相同劑量的加弗氏不完全佐劑的抗原加強(qiáng)免疫兩次。最后加強(qiáng)兩周后，收集血液，在點(diǎn)印跡裝置中利用點(diǎn)分析確定各自抗原的血清滴度。兔要么進(jìn)一步加強(qiáng)免疫(如果滴度不令人滿意)，要么最終放血(如果滴度令人滿意)。利用與HRP綴合的山羊抗-兔IgG作為第二抗體通過SDS-PACE和Western免疫印跡分析檢查對(duì)來自H44的TbpA和TbpB的血清的特異性。預(yù)期TbpA和TbpB抗血清都能分別與來自菌株H196的TbpA和TbpB進(jìn)行交叉反應(yīng)。
核苷酸序列分析。tbp區(qū)域測(cè)序采取兩個(gè)不同的策略。一種方法主要包括亞克隆重組質(zhì)粒的片段進(jìn)入M13載體，然后利用載體引物對(duì)通過雙脫氧鏈終止法制備的隨后分離的單鏈DNA進(jìn)行測(cè)序。在有限數(shù)量的情況下，基于克隆插入物所形成的序列合成寡核苷酸引物，并且將這些引物用于完成克隆插入序列。在這個(gè)分析中，用Pustell程序(IBI)編排和分析核苷酸序列。
另一種方法主要包括由PCR擴(kuò)增從染色體DNA獲得的克隆插入物的連續(xù)序列測(cè)定。在前面序列分析基礎(chǔ)上合成寡核苷酸引物。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物克隆到pCRⅡ克隆載體(Invitrogen)中。利用合成寡核苷酸，熒光染料標(biāo)記的雙脫氫核苷酸三磷酸終止子通過寡核苷酸引物直接方法采用純化重組體質(zhì)粒進(jìn)行雙鏈DNA測(cè)序，并用Taq聚合酶循環(huán)測(cè)序。在應(yīng)用生物系統(tǒng)(ABI)373A型自動(dòng)熒光測(cè)序儀上分析序列反應(yīng)產(chǎn)物。比較來自連續(xù)測(cè)序的運(yùn)行結(jié)果，同時(shí)利用SeqEd程序通過比較層析譜確定出復(fù)合序列。這一序列隨后與利用Mac-DNASIS程序通過單鏈測(cè)序獲得的序列比較。此外，通過將所有三種讀框中的預(yù)測(cè)的蛋白質(zhì)序列與幾個(gè)不同物種的Tbp的序列比較分析所說的序列。任何通過這種分析鑒別的不確定度區(qū)域應(yīng)重復(fù)進(jìn)行序列分析。結(jié)果克隆運(yùn)鐵蛋白受體基因。獲得抗-受體抗血清和N端氨基酸序列，以便利于克隆溶血巴斯德氏菌運(yùn)鐵蛋白受體基因。通過用溶血巴斯德氏菌血清型A1菌株(H44)的親和性純化受體蛋白質(zhì)TbpA和TbpB免疫兔獲得單特異性抗血清。純化的天然H196 TbpA的電印跡制劑的氨基酸序列分析產(chǎn)生出20個(gè)氨基酸的一種可讀序列(圖20的頂端)。一種用純化的TbpB進(jìn)行的類似分析不能提供說明可能封閉這一蛋白質(zhì)N末端的任何序列信息。
純化TbpA的頭八個(gè)氨基酸的序列，用于設(shè)計(jì)以溶血巴斯德氏菌優(yōu)選密碼子用法表(tbpA引物023，表4)為基礎(chǔ)的寡核苷酸引物。對(duì)于來自溶血巴斯德氏菌質(zhì)粒庫(Lo等，1985)的部分tbpA基因的聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增，這一引物用來與兩種載體引物(RL2和RL3，表4)的任何一種相結(jié)合。由于預(yù)料的氨基酸包含與N端氨基酸序列相同的序列，并且顯示與其它TbpA蛋白質(zhì)的同源性，所以用載體引物RL2和023獲得800 bp PCR產(chǎn)物，同時(shí)通過序列分析檢驗(yàn)它的可靠性?？寺CR產(chǎn)物用作限制內(nèi)切酶消化的H196溶血巴斯德氏菌染色體DNA Southern分析和質(zhì)粒庫篩選的雜交探針。Southern分析提供了tbp區(qū)域染色體DNA的限制性酶切圖，供比較從質(zhì)粒庫獲得的克隆插入物。
表4寡核苷酸引物引物編號(hào)描述(基因/區(qū)域-位置) 方向*序列023 tbpA-5末端，第1個(gè)8N端aa’s5’-3’ GGAAGCTTACTGAAAATAAAAAAATCGAAGAA088 tbpA-5末端， 3’-5’*CACTACTTTCCCCAAGCCAGRL2 pBR322-BamHⅠ位點(diǎn)的上游 3’-5’*GGAATTCCCTCCTGTGGATC198 tbpA-3’末端 3’-5’*GCIGCII(G/C)IGCICGIAA(T/C)T(T/A)(T/C)190 tbpB-5’末端，前導(dǎo)肽區(qū)5’-3’ CAAAGCTTGCTTG(TC)TCIGGIGG352 tbpB-5’末端的上游5’-3’ AGATCTG-GATTCTAAATCAGACCGCTTGTATITTAG192 tbpB-鄰近3’末端的保守aa序列 5’-3’ GTI(T/A)(A/G/C)IGGIGGITT(C/T)TA(T/C)GG401 tbpB-5’末端 5’-3’ TAAATTAAAGGAGACATTATGTTTAAACT350 tbpB-3’末端，側(cè)翼NcoⅠ位點(diǎn) 3’-5’*CGACGCCCATGGTTATTTTTATTTGACGTGTTTTCC199 tbpB-3’末端，側(cè)翼 HindⅢ位點(diǎn) 3’-5’*GCGCAAGCTTTTATTTTTCTATTTGACG349 tbpA-5’末端，rbs上游的 5’-3’ GGATTCAGATCTTAAAGGAGACCCTATCTAATGATAATGBamH1/BgⅢ位點(diǎn)255 tbpA-5’末端，起始密碼子NdeⅠ位點(diǎn)5’-3’ CCCTATCATATGATAATGAAATATCATC256tbpA-3’末端，終止密碼子后的HindⅢ位點(diǎn)3’-5’*TAGCGCAAGCTTCTAAAACTTCATTTCAAAT*相對(duì)于有關(guān)基因編碼鏈的取向的方向。
最初，從大腸桿菌克隆鑒別出兩個(gè)強(qiáng)雜交菌落。質(zhì)粒P**(克隆9)包含9kb插入物(包括具有鄰近下游區(qū)的大多數(shù)tbpA基因)但不與來自另一個(gè)染色體基因座的DNA融合(圖20中的fis)。第二種質(zhì)粒，P**(克隆10)，僅僅包含1.2 kb的插入物，該插入物主要位于tbpA基因的5末端周圍。
在質(zhì)粒pRYCL9中人工連接使人想起了所觀察的類似的人工制品，當(dāng)試圖克隆腦膜炎球菌tbpB基因并且遇到困難(23)時(shí)，將考慮對(duì)于克隆溶血巴斯德氏菌TbpB區(qū)的另一些策略。一種策略是以觀察在其它物種中，tbpB基因定位在tbpA基因的上游(19,20,23)以及在各自TbpB預(yù)料的序列中具有氨基酸的短的骨架等同性為基礎(chǔ)的。鄰近TbpB羧基末端的氨基酸保守序列用來設(shè)計(jì)簡并寡核苷酸引物(引物192，表4)以獲得TbpA基因的其余部分，基因間區(qū)域和tbpB基因的3’末端的部分。這種引物用于與以來自tbpA基因的5’末端的序列為基礎(chǔ)的引物(引物088，表4)相結(jié)合以便擴(kuò)增來自H196染色體DNA的700 bp片段。這種插入物的序列能夠設(shè)計(jì)以tbpB基因3’末端的真實(shí)序列為基礎(chǔ)的寡核苷酸引物(引物199，表4)，用于與用于PCR擴(kuò)增的基于已知TbpB(oligo 190，表4)的前導(dǎo)肽區(qū)中的保守氨基酸序列的簡并寡核苷酸相結(jié)合。當(dāng)H196染色體DNA用作模板時(shí)所獲得的2.4 kb PCR產(chǎn)物包含tbpB基因真實(shí)3’末端。當(dāng)這種PCR片段是在pCRⅡ載體中克隆并且用于利用T7啟動(dòng)子的表達(dá)實(shí)驗(yàn)時(shí)，產(chǎn)生一個(gè)完整的重組體TbpB，這表明核糖體結(jié)合位點(diǎn)和tbpB基因的起點(diǎn)包含在插入物之中。
第二種策略利用錨定的PCR，其中PstⅠ-消化的pBluescript質(zhì)粒連接到PstⅠ-消化的H196染色體DNA上，并且用作PCR反應(yīng)的模板，其中利用tbpB基因的3’末端引物(oligo 190，表4)和載體的M13反向引物。所得3.5 kb產(chǎn)物亞克隆進(jìn)入PCRⅡ載體，產(chǎn)生包含整個(gè)tbpB基因和鄰近上游區(qū)相當(dāng)大數(shù)量的質(zhì)粒(圖20中的ORF和RNaseT)。
進(jìn)一步亞克隆tbp基因進(jìn)入表達(dá)載體涉及采用互補(bǔ)于基因的5＇和3＇末端與包含適當(dāng)?shù)南拗泼盖形稽c(diǎn)的寡核苷酸引物的PCR擴(kuò)增。用于擴(kuò)增tbpA基因的一套引物(引物349和256，表4)涉及就在預(yù)料核糖體結(jié)合位點(diǎn)上游(rbs)引入BamHⅠ和BglⅡ位點(diǎn)，以使外源啟動(dòng)子因?yàn)樘烊籸bs的存在引起表達(dá)。另一種5＇引物牽涉到在起始密碼子位點(diǎn)引入NdeⅠ位點(diǎn)(255，表4)，以便克隆到pT7-7表達(dá)載體(其供給適當(dāng)位置的核糖體結(jié)合位點(diǎn))是可能的。因?yàn)楸磉_(dá)實(shí)驗(yàn)在tbpB基因起始的明確鑒定之前，亞克隆tbpB基因通過采用上游測(cè)序引物(引物352，表4)以及包含NcoⅠ位點(diǎn)分開的真實(shí)3＇末端的引物(引物350，表4)的PCR擴(kuò)增而獲得。
運(yùn)鐵蛋白受體基因的特征。如圖20所說明的，tbp基因看來似乎在操縱子排列中，具有定位在tbpA基因的上游的tbpB基因。比較序列分析揭示了tbpB基因之前是編碼蛋白質(zhì)的開放讀框(ORF)，所述蛋白的序列與來自大腸桿菌和流感嗜血菌的RNaseT具有高度相同性。這一ORF依次位于編碼與在流感嗜血菌和副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)中鑒別的假設(shè)蛋白質(zhì)具有相當(dāng)大的等同性的蛋白質(zhì)的另一個(gè)ORF之前。tbpA基因的下游是編碼蛋白質(zhì)的ORF，該蛋白的序列與來自流感嗜血菌和大腸桿菌的倒位因子刺激(FIS蛋白質(zhì)-重組增強(qiáng)子)蛋白質(zhì)具有70％的相同性。這為運(yùn)鐵蛋白受體蛋白質(zhì)基因操縱子有效地劃分了界線，并且表明沒有涉及這種鐵獲取途徑的直接鄰近的基因。
在編碼RNaseT同系物的ORF末端和tbpB基因的起始端之間具有420bp的區(qū)域，在最后62堿基對(duì)之內(nèi)具有潛在的核糖體結(jié)合位點(diǎn)，啟動(dòng)子位點(diǎn)以及調(diào)節(jié)位點(diǎn)(圖20)。余下的358 bp間插區(qū)可能大概包含RNaseT基因轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)，和潛在地牽涉tbp操縱子調(diào)節(jié)的序列。對(duì)于大腸桿菌s70-35和-10啟動(dòng)子區(qū)，推定的啟動(dòng)子區(qū)分別含有5/6和6/6共有堿基。
以前的研究曾顯示在培養(yǎng)基中的可供使用的鐵的水平調(diào)節(jié)溶血巴斯德氏菌運(yùn)鐵蛋白受體蛋白質(zhì)的表達(dá)(26)。重疊tbpB啟動(dòng)子(圖20)的-10位點(diǎn)的推定的Fur盒的鑒定表明可能是在溶血巴斯德氏菌中的轉(zhuǎn)錄水平上通過Fur同系物的作用來進(jìn)行鐵調(diào)節(jié)。推定的Fur盒與大腸桿菌Fur結(jié)合位點(diǎn)共有序列具有12/19堿基的相同性(Litwin和Caldenuood,1993)。
在tbpB和tbpA基因之間具有96 bp基因間區(qū)域，它在tbpA基因上游含有推定的核糖體結(jié)合位點(diǎn)但是沒有明顯的啟動(dòng)子。此外，在這一區(qū)域中沒有任何明顯的轉(zhuǎn)錄終止子。tbpA基因終止密碼子以及編碼FIS同系物的基因終止密碼子的下游是沒有明顯轉(zhuǎn)錄終止子的98 bp的區(qū)域。
血清型A1溶血巴斯德氏菌菌株H196的tbpA基因區(qū)序列分析揭示鳊碼具有預(yù)測(cè)分子量106,921 Da的蛋白質(zhì)的2,790 bp ORF(圖22)。通過與成熟蛋白質(zhì)的已知N端氨基酸序列比較確認(rèn)(圖22的頂端)在28位殘基的推定的信號(hào)肽酶切割位點(diǎn)。將TbpA的預(yù)測(cè)的氨基酸序列與腦膜炎萘瑟氏球菌(23)、淋病萘瑟氏球菌(8)、流感嗜血菌(20)和朋膜肺炎放線桿菌(19)的TbpA序列比較。將這些蛋白質(zhì)(粗下劃線氨基酸，圖22)之間的相同氨基酸的定位與以Tommassen預(yù)料的模型為基礎(chǔ)的這些氨基酸區(qū)段的提出的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)(28)比較。明顯的是，大多數(shù)相同的氨基酸在對(duì)應(yīng)于短的跨膜β-折疊的區(qū)或與跨膜片段直接鄰近的內(nèi)部和外部的環(huán)區(qū)段中簇集。注意到在提出的外部環(huán)4,6和7中有半胱氨酸的保守對(duì)并且在溶血巴斯德氏菌TbpA的環(huán)10上有唯一的半胱氨酸對(duì)是有意義的。這些很可能代表二硫鍵為外環(huán)提供結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。
血清型A1溶血巴斯德氏菌菌株H196的tbpB基因中的序列分析揭示了鳊碼具有預(yù)測(cè)分子量63,419 Da的蛋白質(zhì)的1,752 bpORF(圖23)。將TbpB的這種預(yù)測(cè)的蛋白質(zhì)序列與腦膜炎萘瑟氏球菌(23)、淋病萘瑟氏球菌(1)、流感嗜血菌(20)和胸膜肺炎放線桿菌(14)的TbpB的出版的序列比較。這一預(yù)測(cè)的氨基酸序列包括18個(gè)氨基酸的前導(dǎo)肽，以半胱氨酸為成熟蛋白質(zhì)的預(yù)測(cè)的N端氨基酸的信號(hào)肽酶Ⅱ識(shí)別序列。N端半胱氨酸的存在(顯示了在其它物種中已經(jīng)脂化(14,24))可以解釋這種蛋白質(zhì)不能獲得N端氨基酸序列，并且可以用作向外膜錨定蛋白質(zhì)的主要手段。近來由Gerlach等(36)確定的與胸膜肺炎放線桿菌TbpB(TfbA)推定結(jié)合區(qū)對(duì)比的區(qū)域被雙下劃線顯示。
明顯的是，在整個(gè)氨基酸序列長度中發(fā)現(xiàn)了幾個(gè)具有同源性的區(qū)域，包括相同氨基酸的幾個(gè)短的骨架(圖24)。在進(jìn)行密切檢查時(shí)，明顯的是，在蛋白質(zhì)的N端與C端部分的區(qū)域之間有一些同源性，表明可能有蛋白質(zhì)的下劃線的雙片段結(jié)構(gòu)，與運(yùn)鐵蛋白所觀察到的有相似性。這樣，序列YKGYW(aa 185-189)和YRGTW(aa 449-453),FTADFANK(aa 237-244)和FDVDFVNK(aa 480-487),GNRFSG(aa 276-281)和GNGFGG(aa 513-518)，以及LEGGFFG(aa 300-306)和FECGFYG(aa 546-552)代表了在蛋白質(zhì)的N端與C端部分的等同位置中同源氨基酸的連續(xù)骨架。
重組體受體蛋白質(zhì)的表達(dá)和分析。從H196染色體DNA PCR擴(kuò)增完整的tbpB與tbpA基因并且亞克隆進(jìn)用于重組蛋白質(zhì)產(chǎn)生的表達(dá)載體。就tbpB基因表達(dá)的初始的嘗試來說，亞克隆tbpB基因是通過采用上游引物(352，表4)以及包含側(cè)翼于NcoⅠ位點(diǎn)的真實(shí)3末端的引物(350，表4)由PCR擴(kuò)增獲得的。當(dāng)PCR擴(kuò)增片段亞克隆進(jìn)pCRⅡ載體時(shí)，最終形成的五個(gè)克隆都有相同的取向；T7啟動(dòng)子的下游和lac啟動(dòng)子的相反方向。由于lac啟動(dòng)子在高拷貝數(shù)載體中不是緊密調(diào)節(jié)的，這一結(jié)果表明插入物在大腸桿菌中的表達(dá)可以選擇。一旦這一區(qū)的序列可供使用，那么很明顯引物352就在RNaseT基因上游，同時(shí)這個(gè)基因或tbpB基因的表達(dá)都應(yīng)對(duì)選擇性壓力起作用。以CE6λ噬菌體感染來完成來自T7啟動(dòng)子的TbpB的表達(dá)，所說噬菌體編碼T7 RNA聚合酶。在感染兩小時(shí)之后對(duì)于TbpB預(yù)測(cè)分子量的蛋白質(zhì)是明顯的，同時(shí)這一蛋白質(zhì)在電印跡之后與抗-TbpB抗血清進(jìn)行反應(yīng)。
通過表達(dá)TbpB蛋白質(zhì)的固定化完整細(xì)胞可以檢測(cè)對(duì)標(biāo)記牛運(yùn)鐵蛋白(bTf)的結(jié)合，這個(gè)水平上的結(jié)合不能明顯地由細(xì)胞的預(yù)超聲處理增加(數(shù)據(jù)未顯示)。雖然這可以解釋為在異源大腸桿菌系統(tǒng)中適當(dāng)?shù)募庸ず蚑bpB蛋白向細(xì)胞表面輸出，但通過外源蛋白抗原的過量表達(dá)破壞外膜完整性同樣是一種似乎可能的解釋。初步結(jié)合研究表明產(chǎn)生了一種功能性TbpB蛋白質(zhì)，這表明進(jìn)一步分析或許能夠估計(jì)這一蛋白質(zhì)的功能性性質(zhì)，并且可以確定它對(duì)天然受體復(fù)合物的以前特征化的性質(zhì)的貢獻(xiàn)。這樣，從表達(dá)TbpB的細(xì)胞中制備粗制膜，并且用于設(shè)計(jì)來估計(jì)它的結(jié)合特性的親和性分離實(shí)驗(yàn)中。這些實(shí)驗(yàn)表明重組TbpB能夠由固定化的bTf親和性分離，同時(shí)過量的牛，綿羊或公山羊Tf能夠抑制這一分離，說明其具有有效地結(jié)合到所有這三種反芻動(dòng)物Tfs上的能力。人運(yùn)鐵蛋白以及apo-bTf不能抑制重組TbpB通過固定化載鐵的bTf的親和性分離。這一分析也揭示了bTf的N-片段和C-片段都能有效地抑制重組TbpB結(jié)合到固定化的bTf上。
為了表達(dá)tbpA基因，用一套保留預(yù)測(cè)的核糖體結(jié)合位點(diǎn)(圖21)的引物(寡核苷酸349和256，表4)完成PCR擴(kuò)增。在亞克隆PCR產(chǎn)物進(jìn)pCRⅡ載體之后，用CE6噬菌體(編碼T7 RNA聚合酶)感染后沒有重組TbpA表達(dá)。一個(gè)克隆的序列分析揭示切除幾個(gè)堿基對(duì)，其除去了核糖體結(jié)合位點(diǎn)。其它利用255和256引物(參見表4)試圖亞克隆來自PCR的tbpA基因進(jìn)pT7-7載體(提供了一個(gè)理想位置的核糖體結(jié)合位點(diǎn))的NdeⅠ位點(diǎn)是失敗的。
討論在說明溶血巴斯德氏菌中運(yùn)鐵蛋白受體存在的初始研究(26)中，用親和性方法僅僅分離出一種單一受體蛋白質(zhì)(TbpA)，而在其它物種中產(chǎn)生兩種受體蛋白質(zhì)(TbpA和TbpB)(32)。這種受體蛋白質(zhì)最初假定為很大程度上介導(dǎo)利用來自牛運(yùn)鐵蛋白的供生長的鐵的能力(26)和結(jié)合反芻動(dòng)物運(yùn)鐵蛋白(39)的特異性。在爾后的研究中，顯示牛運(yùn)鐵蛋白的結(jié)合區(qū)域定位到C-片段上(41)，用一種改進(jìn)的親和性方法分離到兩種受體蛋白質(zhì)(TbpA和TbpB)，雖然TbpA的產(chǎn)率大大地超過TbpB。這樣，把該受體的觀察到的結(jié)合特性斷然歸因于任一受體蛋白質(zhì)(以及特別是不歸因于TbpB)是不可能的。
tbp基因的克隆與重組TbpB的表達(dá)能夠估計(jì)它的特異性結(jié)合特征。這些研究曾顯示TbpB與天然受體復(fù)合物(TbpA和TbpB)具有一種類似的宿主特異性，由于它特異性結(jié)合幾個(gè)反芻動(dòng)物物種Tfs。相對(duì)地，不同于天然受體復(fù)合物，重組TbpB能夠識(shí)別在bTf的N-片段和C-片段上的結(jié)合決定族，表明在以前的研究(Yu和Schryvers,1994)中，TbpA和TbpB之間的相互作用也可以影響TbpB結(jié)合到bTf的N-片段上的能力。
在溶血巴斯德氏菌固定化膜(TbpA和TbpB)的競爭性結(jié)合分析中，對(duì)于bTf的載鐵或apo形式?jīng)]有任何明顯的優(yōu)先選擇(30)，這類似于在大多數(shù)其它細(xì)菌物種中觀察到的(Blanton等，1990；32；Tsai等，1988；32,37)，除粘膜炎莫拉氏菌(Moraxella catarrhalis)以外(Yu和Schryvers,1993)。在本研究中，重組TbpB對(duì)bTf的載鐵形式明顯地顯示出一種強(qiáng)的優(yōu)先選擇。在增加體內(nèi)鐵獲取的效率中，TbpB的這種優(yōu)先選擇與功能有關(guān)。
實(shí)施例4重組Tbp2和真實(shí)Tbp1的疫苗潛力由于下列原因，運(yùn)鐵蛋白結(jié)合蛋白Tbp1與Tbp2是具有吸引力的目標(biāo)a)由于對(duì)細(xì)菌生存來說，運(yùn)鐵蛋白的鐵的獲得可能是十分重要的，對(duì)這些抗原的抗體應(yīng)答應(yīng)該是保護(hù)性的。
b)不同溶血巴斯德氏菌A1分離物內(nèi)的編碼Tbp1與Tbp2基因看來很保守。
本研究在實(shí)驗(yàn)性溶血巴斯德氏菌攻擊模型中用于單獨(dú)以及組合檢驗(yàn)重組Tbp2和真實(shí)Tbp1的疫苗潛力。方法利用本文描述的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)通過親和性層析進(jìn)行親和純化分別來自溶血巴斯德氏菌和重組大腸桿菌外膜的Tbp1與Tbp2蛋白質(zhì)。利用專用礦物油基佐劑(VSA3)配制疫苗，以使每一劑量為包含下列量的每一抗原的2ccTbp2-45 mg；單獨(dú)利用時(shí)Tbp1-85mg或與Tbp2結(jié)合時(shí)Tbp1 100mg。此外，制備的安慰劑疫苗包含替代抗原的無菌稀釋劑。包括在試驗(yàn)中的五個(gè)組包括一個(gè)在攻擊前十天接受Tbp2激發(fā)的單一免疫的組以及接受用Tbp2,Tbp1+Tbp2，安慰劑，或Tbp1兩次免疫的組。初次和第二次免疫之間的間隔是三周，在Southern Saskatchewan的農(nóng)場上進(jìn)行所有接種。疫苗通過皮下途徑用藥。大約攻擊前十天，將動(dòng)物運(yùn)送至Saskatoon，并且收容在VIDO研究站。除了接收Tbp1的以外(包含六只動(dòng)物)，所有的組包含十只動(dòng)物。接受Tbp1的組沒有遵循原計(jì)劃，而且增加以便確定Tbp1自身的保護(hù)能力。此外，一只接受以Tbp2制劑一次免疫的小牛顯示出與接種不相關(guān)的疾病臨床征兆，并且因此排除在試驗(yàn)外。表5中總結(jié)疫苗組的組合。
表5．疫苗組的組合疫苗組抗原 免疫動(dòng)物/組1 Tbp2一 92 Tbp2二 103 Tbp1和Tbp2 二 104 安慰劑 二 105 Tbp1二 6小牛經(jīng)過氣溶膠途徑激發(fā)，首先將它們暴露在包含大約2.5×106PFU/ml的牛皰疹病毒-1菌株108的懸液中，接著在4天后用含大約5×108CFU/ml的巴斯德氏菌的氣溶膠處理。由獸醫(yī)和動(dòng)物保鍵技術(shù)員每日檢查動(dòng)物，同時(shí)記錄下列數(shù)據(jù)體重，溫度，鼻傷痕，抑郁，力量，呼吸窘迫和疾病。每個(gè)這樣的參數(shù)(除重量和溫度外)劃分為0-4級(jí)。
利用酶連免疫吸附劑測(cè)定(ELISA)測(cè)量對(duì)接種的血清學(xué)反應(yīng)。血清樣品收集的時(shí)間是初次和第二次免疫時(shí)間再加上用BHV-1進(jìn)行攻擊的天數(shù)。滴度以血清稀度的倒數(shù)表示，其導(dǎo)致等同于背景加兩標(biāo)準(zhǔn)偏差的光密度。測(cè)量對(duì)Tbp1,Tbp2和溶血巴斯德氏菌白細(xì)胞毒素(leukotoxin)的反應(yīng)。后者作為一種診斷檢驗(yàn)法被包括進(jìn)來以確定動(dòng)物是否曾天然接觸所說的有機(jī)體。
結(jié)果a)接種反應(yīng)沒有動(dòng)物顯示出對(duì)用任何配方接種的不利的反應(yīng)。利用ELISA方法(測(cè)量對(duì)Tbp1,Tbp2和溶血巴斯德氏菌白細(xì)胞毒素的血清抗體水平)確定對(duì)接種的血清學(xué)反應(yīng)。包括后一抗原以保證沒有動(dòng)物由于與細(xì)菌的天然接觸而增加滴度。表6中顯示了對(duì)每種抗原的滴度，同時(shí)可以看到對(duì)白細(xì)胞毒素的滴度在初次接種(血1)，第二次接種(血2)時(shí)，以及在激發(fā)時(shí)(血3)是可比較的。滴度低于3,000的動(dòng)物認(rèn)為是干凈的。有趣的是，沒有動(dòng)物對(duì)Tbp1抗原明顯程度的陽轉(zhuǎn)。以發(fā)明人經(jīng)驗(yàn)，預(yù)期用來自其它有機(jī)體的Tbp1，滴度應(yīng)該低一點(diǎn)，但是未曾預(yù)料到的是，在抗體水平上不能檢測(cè)其顯著增加。所有接受Tbp2的組很好地對(duì)接種作出反應(yīng)，雖然接受Tbp1+2的組具有的滴度大約是Tbp2組滴度的1/2，這一區(qū)別是不顯著的。
表6．對(duì)接種的血清學(xué)反應(yīng)ELISA抗原接種組 滴度-血1滴度-血2滴度-血3白細(xì)胞毒素 Tbp2(1個(gè)劑量) 101013502156Tbp2 113615472656Tbp1和2115912391137安慰劑 168818342782Tbp1 980 12821339Tbp1 Tbp2(1個(gè)劑量) 113 364 229Tbp2 203 206 296Tbp1和2150 388 367安慰劑 140 130 226Tbp1 57 55 139Tbp2 Tbp2(1個(gè)劑量) 408 639 9871Tbp2 397 12154 66697Tbp1和2119 783827515安慰劑 360 269 378Tbp1 359 433433 478利用在第一次免疫時(shí)(血1)，第二次免疫時(shí)(血2)，以及用牛皰疹病毒-1激發(fā)的那一天(血3)采取的血清樣品測(cè)定對(duì)白細(xì)胞毒素、Tbp1和Tbp2的ELISA滴度。數(shù)量以等于一個(gè)陰性對(duì)照加上兩標(biāo)準(zhǔn)偏差的稀釋度的倒數(shù)表示。
b)死亡率實(shí)驗(yàn)疾病模型予以校準(zhǔn)以便在正常條件下獲得60-70％死亡率。然而，死亡率在這一試驗(yàn)中比一般的高，可能由于動(dòng)物在激發(fā)后的整個(gè)期間放置在極端冷的溫度下。日低溫在-40℃范圍內(nèi)，同時(shí)所有動(dòng)物在試驗(yàn)期間放置在戶外。表7顯示了組死亡率，并且僅有接受Tbp1和Tbp2的組顯示出顯著性保護(hù)。這與Tbp2本身50％的死亡率和Tbp1 100％的死亡率形成對(duì)比。用Tbp1的單一免疫不具有任何作用。
表7．試驗(yàn)期觀察的組死亡率。
接種組 死亡率(％)Tbp2(1個(gè)劑量)78Tbp2 50Tbp1和2 10安慰劑 90Tbp1 100c)疾病臨床征兆表8中分組總結(jié)了臨床結(jié)果。應(yīng)該注意，表8含有試驗(yàn)所有天的臨床結(jié)果，包括那些在第四天溶血巴斯德氏菌感染前的那些。因此，僅僅從第4-10天的結(jié)果用來決定疫苗配方的保護(hù)能力。在這一試驗(yàn)期間所觀察的高死亡率具有降低各組的大小至某一點(diǎn)的作用，在該點(diǎn)上所有測(cè)定的臨床參數(shù)中觀察到的不同不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。然而，很明顯同時(shí)接受Tbp1和Tbp2的組顯示在大多數(shù)種類中第5和7天之間的分?jǐn)?shù)較低。雖然在幸存者中它們不如組合組，然而單獨(dú)地接受Tbp2兩次免疫的組顯示了降低的疾病臨床征兆。目前還不清楚Tbp1對(duì)保護(hù)作用的貢獻(xiàn)，這是因?yàn)闆]有出現(xiàn)對(duì)這一抗原的任何抗體應(yīng)答。
d)Postmortem結(jié)果在死于試驗(yàn)期間的動(dòng)物上進(jìn)行尸檢(Necropsies)。在所有情況中，培養(yǎng)來自肺臟的溶血巴斯德氏菌，并且所觀察的病理學(xué)與溶血巴斯德氏菌引起的纖維性肺炎相一致。結(jié)論兩次包含溶血巴斯德氏菌Tbp1和Tbp2的配方的接種提供了抵抗實(shí)驗(yàn)性牛肺巴斯德氏菌病的明顯保護(hù)作用。由于不出現(xiàn)對(duì)Tbp1蛋白質(zhì)的任何血清學(xué)應(yīng)答，Tbp1對(duì)這一保護(hù)作用的確切貢獻(xiàn)還不清楚。有益的作用可能是因?yàn)榧?xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答。
Tbp2兩個(gè)劑量的免疫提供某種程度的保護(hù)作用，通過試驗(yàn)包含更大量的抗原或不同佐劑的疫苗配方增加這種作用是可能的。對(duì)Tbp2的免疫學(xué)應(yīng)答給出用組合疫苗所見的大部分保護(hù)作用是很可能的。
Tbp2一個(gè)劑量的或Tbp1兩個(gè)劑量的接種在實(shí)驗(yàn)性激發(fā)之后，沒有任何有益的作用。
表8分組平均臨床得分，在第0天用BHV-1和第4天用溶血巴斯德氏菌激發(fā)動(dòng)物平均重量(kg)組第0天第1天第2天第3天第4天第5天第6天第7天 第8天 第9天第10天Tbp2(1個(gè)劑量) 232.4231.6228.1225.9222.9223.1223.6225.7256.0256.0256.0Tbp2 211.4209.3205.3202.4201.2181.5197.3195.5198.8197.7197.2Tbp1＆2 217.8218.1216.0212.9211.2208.8207.5208.3207.7207.8208.3pacabo223.1221.2215.7213.8206.5206 2194.4177.0158.0161.0158.0Tbp1 225.3225.8219.8216.7212.7208.2200.0183.0191.0190.0N/A平均溫度組第0天第1天第2天第3天第4天第5天第6天第7天第8天第9天第10天Tbp2(1個(gè)劑量) 39.0638.9640.9240.5340.5340.0039.4039.5039.8538.8539.30Tbp2 39.0539.2640.2040.5040.4440.5140.1939.6739.8839.3339.10Tbp1＆2 39.1938.3640.1040.0040.2140.2039.4839.4939.1439.2639.48Placebo 39.0339.1040.3040.4140.8340.2439.9640.3539.5039.1040.70Tbp1 39.1538.7840.5240.1240.4740.8540.9541.6040.9041.00N/A平均鼻得分組第0天第1天 第2天第3天 第4天 第5天 第6天 第7天 第8天 第9天 第10天Tbp2(1個(gè)劑量) 0.00 0.110.33 0.611.171.331.401.250.000.000.00Tbp2 0.00 0.050.30 0.851.201.451.561.440.830.330.20Tbp1＆2 0.00 0.100.45 0.601.051.700.901.000.700.330.44Placebo 0.00 0.150.35 0.951.101.781.401.501.000.000.00Tbp1 0.00 0.080.33 0.670.831.081.000.001.002.00N/A平均抑郁得分組第0天 第1天 第2天 第3天第4天 第5天 第6天 第7天 第8天 第9天 第10天Tbp2(1個(gè)劑量) 0.000.000.000.11 0.220.671.601.750.000.000.00Tbp2 0.000.000.150.15 0.000.500.891.670.671.330.40Tbp1＆2 0.000.000.000.00 0.000.601.201.100.600.330.56Placebo 0.000.000.050.15 0.601.332.202.001.000.000.00Tbp1 0.000.000.170.17 0.501.831.502.002.003.00N/A平均力量得分組第0天 第1天 第2天 第3天第4天 第5天 第6天 第7天 第8天 第9天 第10天Tbp2(1個(gè)劑量) 0.000.000.000.000.00 0.671.601.750.000.000.00Tbp2 0.000.000.000.000.00 0.400.781.670.501.000.40Tbp1＆2 0.000.000.000.000.00 0.300.501.100.600.220.11Placebo 0.000.000.000.000.00 0.671.601.501.000.000.00Tbp1 0.000.000.000.000.00 1.170.501.002.003.00N/A平均呼吸窘迫得分組第0天 第1天 第2天 第3天 第4天 第5天 第6天 第7天 第8天 第9天 第10天Tbp2(1個(gè)劑量) 0.000.000.000.000.000.111.402.000.000.000.00Tbp2 0.000.000.000.000.000.100.441.220.330.670.00Tbp1＆2 0.000.000.000.000.000.000.300.400.500.110.11Placebo 0.000.000.000.000.000.671.001.000.000.000.00Tbp1 0.000.000.000.000.001.170.501.001.003.00N/A平均疾病得分組第0天 第1天 第2天 第3天 第4天 第5天 第6天 第7天 第8天 第9天 第10天Tbp2(1個(gè)劑量) 0.000.000.560.780.890.892.002.250.000.000.00Tbp2 0.000.000.900.901.001.001.001.890.831.170.40Tbp1＆2 0.000.000.600.500.901.100.901.200.700.330.44Placebo 0.000.000.701.001.201.802.712.671.000.001.00Tbp1 0.000.000.830.501.002.832.753.002.004.00N/A累積死亡率組第0天 第1天 第2天 第3天第4天 第5天 第6天 第7天 第8天 第9天 第10天Tbp2(1個(gè)劑量) 0.000.000.000.000.000.000.440.780.780.780.78Tbp2 0.000.000.000.000.000.000.100.300.400.400.50Tbp1＆2 0.000.000.000.000.000.000.000.000.000.100.10Placebo 0.000.000.000.000.000.400.500.800.800.900.90Tbp1 0.000.000.000.000.000.330.670.870.830.831.00實(shí)施例5各種反芻動(dòng)物血清型運(yùn)鐵蛋白受體的比較就結(jié)合反芻動(dòng)物運(yùn)鐵蛋白和利用運(yùn)鐵蛋白鐵供生長，分析一組分離自牛、綿羊和山羊的各種血清型溶血巴斯德氏菌和海藻巴斯德氏菌菌株。研究的某些目的是確定來源于不同宿主物種的運(yùn)鐵蛋白受體的普遍性，以估價(jià)對(duì)不同反芻動(dòng)物運(yùn)鐵蛋白的特異性，并確定來源于不同菌株(在牛中引起船熱、在綿羊和山羊中引起肺炎和在羔羊中引起敗血病)的所說表面受體之間是否存在抗原相關(guān)性。材料細(xì)菌菌株。用于本研究中的細(xì)菌菌株列于表9中。來源于患肺炎的牛的溶血巴斯德氏菌臨床A1型分離物(h93-h97)(9)和代表性ATCC菌株(h98-h107)由Andrew Potter博士(VIDO,Saskatoon)提供。海藻巴斯德氏菌菌株h174是患有肺巴斯德氏菌病的山羊的場分離物，由FrankMilward博士(RhoneMerieux,Lyon，法國)提供。溶血巴斯德氏菌菌株h44是來源于患肺炎的牛的牛臨床A1型分離物，以前已有描述(26)。菌株h196從Lo博士(Guelph大學(xué)，安大略，加拿大)獲得。
表9細(xì)菌菌株，血清型和來源
生長條件。所有細(xì)菌菌株于-70℃冷凍貯存在30％的甘油中。將來源于凍結(jié)貯存的分離物劃線到巧克力瓊脂平板上，并于37℃在二氧化碳溫箱中培養(yǎng)。通過在心腦輸注肉湯(BH1,Difco實(shí)驗(yàn)室)或O’Reilly-Niven肉湯(25)中培養(yǎng)細(xì)菌獲得鐵-有限生長，所說的培養(yǎng)基補(bǔ)充有3.0 g/ml煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)，并且含有終濃度為100M的鐵螯合劑乙二胺二羥苯基乙酸(EDDA，西格瑪)。使用不同的運(yùn)鐵蛋白作為鐵源的生長實(shí)驗(yàn)如前所述進(jìn)行(26)。制備運(yùn)鐵蛋白和衍生物。牛運(yùn)鐵蛋白從西格瑪獲得。綿羊和公山羊(山羊)運(yùn)鐵蛋白的制備(2),30％或100％飽和的運(yùn)鐵蛋白的鐵裝載(Herrington等1985)，和辣根過氧化物酶(HRP)與運(yùn)鐵蛋白的綴合(37)基本上如前所述。在制備牛，綿羊和公山羊的運(yùn)鐵蛋白的綴合物(HRP-bTf,HRP-oTf和HRP-gTf)中，HRP和運(yùn)鐵蛋白的混合物在化學(xué)綴合之后進(jìn)行凝膠過濾。收集顯示最大活性的組分，透析，將等分樣凍結(jié)并貯存在-70℃下。運(yùn)鐵蛋白結(jié)合測(cè)定。運(yùn)鐵蛋白的固相結(jié)合測(cè)定基本上如前所述進(jìn)行(32)。在膜或濃縮的洗脫物點(diǎn)樣到HA紙(Millipore公司，Bedford,MA)上和用0.5％脫脂奶封閉后，將所述紙暴露在含有450 ng/ml HRP-綴合的運(yùn)鐵蛋白的封閉溶液中?；旧习凑杖缜八?32)進(jìn)行HRP底物混合物的溫育、洗滌和顯影。運(yùn)鐵蛋白結(jié)合蛋白的親和性分離。根據(jù)制造商的說明，采用含有3.5mg/ml鐵-飽和的運(yùn)鐵蛋白的溶液將牛、綿羊和公山羊的運(yùn)鐵蛋白分別連接到CNBr-活化的瓊脂糖凝膠4B上。通過添加乙醇胺封閉活化的基團(tuán)。經(jīng)過用10-20倍柱體積的包含6.0M鹽酸胍的50mM TrisHCl,1MNaCl(pH8.0)緩沖液洗滌除去未結(jié)合的運(yùn)鐵蛋白，并且在進(jìn)一步洗滌后，采用在0.1M檸檬酸鈉/0.1M NaHCO3(pH8.6)緩沖液中的含有5 mg/ml FeCl3的溶液用鐵再裝載結(jié)合的運(yùn)鐵蛋白。
按照如前所述(32)制備的溶血巴斯德氏菌或海藻巴斯德氏菌的鐵-缺乏總膜(200mg蛋白質(zhì))用包含1.0 M NaCl的50mM Tris pH8.0稀釋至2mg/ml。通過加入EDTA和sarkosyl分別至10mM和0.75％的終濃度，接著于室溫在輕輕振蕩下溫育混合物15-30分鐘使所稀釋的膜溶解。在10,000rpm下離心溶液10分鐘，以除去不溶解的碎片。將包含可溶性膜的上清液用到1.5×10cm運(yùn)鐵蛋白親和性柱上，然后用含有1.0 M NaCl,10mM EDTA,0.75％Sarksosyl的50 mM Tris pH 8.0充分洗滌(至少10倍柱床體積)，以除去非特異性結(jié)合的蛋白質(zhì)。在利用低鹽洗滌條件的實(shí)驗(yàn)中，洗滌緩沖液包含替代1M NaCl的100mM NaCl。在一些實(shí)例中，用2-3倍柱床體積的包含0.2M鹽酸胍的洗滌緩沖液另外洗滌對(duì)除去污染蛋白質(zhì)是必需的。
通過使用2-3倍柱床體積的在含有1.0M NaCl,1mM EDTA,0.01％sarkosyl的50mM Tris pH8.0中的2.0M鹽酸胍獲得兩種運(yùn)鐵蛋白結(jié)合蛋白(TbpA和TbpB)的共洗脫。收集洗脫劑供立即對(duì)50mM Tris pH8.0透析。以鹽酸胍的更高的濃度進(jìn)一步處理通常不引起任何受體蛋白質(zhì)更高的產(chǎn)率。通過分別用2倍柱床體積的各種包含0.2,0.5,0.75,1.0,1.5,2.0和3.0鹽酸胍的緩沖液依序洗脫達(dá)到單獨(dú)的TbpA和TbpB的分離。將洗脫物對(duì)3次更換的3升50 mM Tris pH8.0透析18小時(shí)，并經(jīng)超濾濃縮。在SDS-PAGE分析后，發(fā)現(xiàn)用0.5和0.75M鹽酸胍洗脫緩沖液洗脫的組分僅含有TbpB，收集這些組分用作TbpB制劑，并收集1.5和2M鹽酸胍洗脫緩沖液洗脫的組分作為TbpA的制劑?？?TbpA和抗-TbpB單特異性兔血清的制備。將如上所述所制備的約500μg溶血巴斯德氏菌h44菌株的純化的TbpA或TbpB制劑與弗氏完全佐劑混合，并肌內(nèi)注射到兩只白色的雌性新西蘭兔中。以3周的間隔用相同量的在弗氏不完全佐劑中的抗原加強(qiáng)免疫所述的兔后，在最終加強(qiáng)免疫后2周收集免疫血清。在SDS-PAGE和受體蛋白質(zhì)的免疫印跡以及利用作為第二抗體的山羊抗-兔IgG綴合HRP后，試驗(yàn)抗TbpA和TbpB的血清的特異性。分析方法。如前所述(32)經(jīng)SDS-PAGE，接著經(jīng)銀染分析蛋白質(zhì)樣品。對(duì)于Western印跡分析，從鐵-有限細(xì)胞得到的約1-2μg純化的受體蛋白質(zhì)或40μg外膜蛋白質(zhì)在10％聚丙烯酰胺凝膠上分離。在15V下在20 mM Tris,pH 7.5,150 mM甘氨酸，20％甲醇和0.1％SDS中，將蛋白質(zhì)電泳過夜轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素(Millipore,Bedford,MA)上。在室溫下，采用在20mMTris pH7.5,500mM NaCl(TBS)中的0.5％脫脂奶把濾膜封閉30分鐘。在室溫下，將膜暴露在以封閉溶液1/1000稀釋的適當(dāng)?shù)目贵w下1小時(shí)，用TBS洗滌兩次，然后暴露在1/3000稀釋的第二抗體(來源于BioRad的山羊抗-兔IgG-辣根過氧化物酶綴合物)下。除去綴合物，以TBS洗滌三次，然后與HRP-底物混合反應(yīng)。對(duì)于全細(xì)胞測(cè)定，將鐵-缺乏或鐵-充分(對(duì)照)細(xì)胞直接點(diǎn)樣在HA紙上。在干燥之后，將HA紙用封閉溶液處理，并且以TBS洗滌，然后如上所述試驗(yàn)與抗TbpA或TbpB抗血清的反應(yīng)性。點(diǎn)樣細(xì)胞的對(duì)照組用HRP-牛運(yùn)鐵蛋白處理1小時(shí)，然后在用TBS洗滌后與HRP-底物反應(yīng)。tbp基因的PCR擴(kuò)增和限制性內(nèi)切核酸酶消化分析。通過Saris等(1990)的方法用完整細(xì)胞完成溶血巴斯德氏菌和海藻巴斯德氏菌菌株的tbpA和tbpB的擴(kuò)增。用寡核苷酸t(yī)bpA 5’和tbpA 3’(#255和#256，表2)進(jìn)行tbpA的擴(kuò)增。寡核苷酸#401和#199(表10)用來擴(kuò)增tbpB。反應(yīng)條件為94℃1分鐘，45℃1分鐘和74℃2分鐘，30個(gè)循環(huán)。經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳用0.5X TBE緩沖液(45mM Tris-硼酸鹽，1mM EDTA,pH8.3)分離PCR產(chǎn)物，并且以在相同的緩沖液中的溴化乙錠(每毫升0.5mg)染色。對(duì)于Sau3A限制性內(nèi)切核酸酶(Gibco BRL)消化，將PCR產(chǎn)物進(jìn)行苯酚氯仿和乙醇沉淀，然后以Sau3A消化。然后用0.5X TBE緩沖液以7.5％丙烯酰胺凝膠分析消化物，并以與上述瓊脂糖凝膠相同的方法可視化。結(jié)果受體結(jié)合的特異性。在一個(gè)以前的研究中已說明在病原細(xì)菌物種的代表性分離物中的運(yùn)鐵蛋白受體在它們與山羊，綿羊和牛運(yùn)鐵蛋白的相互作用上是不同的(Yu和Schryvers 1996)。因此估價(jià)了一組來源于牛，綿羊以及山羊的溶血巴斯德氏菌和海藻巴斯德氏菌的代表性分離物(表9)與不同反芻動(dòng)物運(yùn)鐵蛋白的相互作用。所有這些菌株都能夠利用牛，公山羊或綿羊運(yùn)鐵蛋白作為生長的鐵源(數(shù)據(jù)未顯示)。在固相結(jié)合測(cè)定中，固定化的鐵-缺乏細(xì)胞對(duì)結(jié)合所有三種運(yùn)鐵蛋白是陽性的(圖25)。在交互的競爭結(jié)合測(cè)定中，三種運(yùn)鐵蛋白在阻斷對(duì)細(xì)胞的結(jié)合上是等效的(未示出)。此外，分子量分別為100Kda以及60Kda的TbpA和TbpB兩者被含有牛(圖26,A組)，公山羊或綿羊運(yùn)鐵蛋白(未示出)的親和性樹脂有效地分離。這些結(jié)果表明在這組相關(guān)菌株之內(nèi)的運(yùn)鐵蛋白-結(jié)合的特異性是不能區(qū)別的。對(duì)運(yùn)鐵蛋白受體蛋白的免疫學(xué)分析。牛，公山羊和綿羊運(yùn)鐵蛋白競爭相同的受體的觀察結(jié)果說明至少在受體的結(jié)合域中具有保守性。然而，不同的血清型的個(gè)體受體蛋白質(zhì)之間的相似性的程度不清楚。為了闡明這一問題，分別抗TbpA和TbpB產(chǎn)生抗體，并在兔中利用純化的受體蛋白質(zhì)作為復(fù)合物(來源于牛菌株h44的TbpA和TbpB)。然后將這些抗血清針對(duì)不同血清型代表性菌株(包括從牛，綿羊和山羊獲得的分離物)的受體蛋白質(zhì)進(jìn)行試驗(yàn)。
圖26,B組的結(jié)果顯示抗溶血巴斯德氏菌血清型A1菌株h44的純化的TbpA和TbpB受體產(chǎn)生的抗血清與所有代表菌株的類似純化受體強(qiáng)烈反應(yīng)。因?yàn)閺母鞣N菌株獲得的受體蛋白質(zhì)的產(chǎn)率上存在差異(圖26,A組)，這很可能說明一些菌株的抗血清的反應(yīng)性上所觀察到的輕微的區(qū)別(圖26,B組)。這樣，這些結(jié)果說明兩種受體蛋白質(zhì)在引起牛，綿羊和山羊巴斯德氏菌病的溶血巴斯德氏菌的不同的血清型之間是保守的。
雖然這一分析表明在運(yùn)鐵蛋白受體蛋白質(zhì)上具有交叉反應(yīng)性表位，當(dāng)它不提供在細(xì)胞表面是否具有交叉反應(yīng)性表位(對(duì)宿主免疫效應(yīng)機(jī)制可及的)的任何信息。作為試圖闡明這一問題的第一步，試驗(yàn)了來源于不同物種的完整的鐵-缺乏細(xì)胞對(duì)單特異性抗-受體抗血清的反應(yīng)性(圖27)。這些實(shí)驗(yàn)顯示抗溶血巴斯德氏菌A1型菌株的TbpA以及TbpB所制備的單特異性抗血清與A1型菌株(h44和h196，圖26,B組)，幾個(gè)其它A血清型(h98,h103,h105，和h107)反應(yīng)，與幾個(gè)海藻巴斯德氏菌菌株(h99,h100,h106)發(fā)生中等強(qiáng)度的反應(yīng)?？咕阧44的TbpA和TbpB制備的單特異性抗血清與廣泛收集的A1性菌株(其中兩個(gè)(h44,h196)在圖27中說明)的鐵-有限全細(xì)胞發(fā)生強(qiáng)烈的反應(yīng)(數(shù)據(jù)未示出)。與溶血巴斯德氏菌(h98,h103,h105和h107)和海藻巴斯德氏菌(h99,h100和h106)內(nèi)的其它血清型具有不同程度的反應(yīng)性。用標(biāo)記的bTf(圖27)所獲得的信號(hào)與用不同的菌株的抗-TbpA與抗-TbpB抗血清(圖27)獲得的信號(hào)之間的相互關(guān)系說明在完整細(xì)胞中所觀察到的反應(yīng)性主要是因?yàn)槭荏w蛋白質(zhì)。當(dāng)用對(duì)照抗血清時(shí)觀察到的無反應(yīng)性(數(shù)據(jù)未示出)和在鐵缺乏細(xì)胞中的降低的反應(yīng)性(圖26,C組)也支持這一結(jié)論。運(yùn)鐵蛋白受體蛋白基因的遺傳分析。作為對(duì)免疫學(xué)研究的補(bǔ)充，估價(jià)了來源于不同溶血巴斯德氏菌和海藻巴斯德氏菌菌株的tbp基因的可變性。利用血清型A1菌株tbpA基因獲得的序列信息(28)，為所述基因的5＇和3’末端制備特異性引物(引物#255和#256，表10)。這些引物能夠從所有檢驗(yàn)的菌株擴(kuò)增完整的tbpA基因，雖然對(duì)菌株h100僅一致地獲得小的產(chǎn)量。然后將完整的基因(除h100的外)進(jìn)行Sau3A限制性內(nèi)切核酸酶消化，所形成的片段在聚丙烯酰胺凝膠上進(jìn)行電泳分析。在A1型菌株(h44和h196，圖28,A組)中觀察到特定模式，并且與所試驗(yàn)的所有七個(gè)A1菌株中的相同(數(shù)據(jù)未顯示)。這一模式在大多數(shù)其它血清型溶血巴斯德氏菌(h105,h104和h98，圖28)中也存在。對(duì)其它A型菌株(h103和h107)和在T菌株(h106和h99)內(nèi)觀察到在模式方面細(xì)小的變化，涉及一個(gè)或多個(gè)片段，很可能是由于單一位點(diǎn)的改變。
限制性消化分析不能鑒別A1分離物中的tbpA基因之間的任何區(qū)別。這樣，采取了另一種迅速和簡捷的檢查tbpA基因間的差異的方法。這一方法基于具有TbpA(和LbpA)蛋白質(zhì)片段的觀察結(jié)果，說明是表面環(huán)，這顯示不同的物種蛋白質(zhì)間氨基酸序列方面的最大的變異(21和Legrain等1996)。具體地說，具有一個(gè)大的預(yù)測(cè)的環(huán)，通過與單克隆抗體反應(yīng)性說明在表面上(21)，其中，當(dāng)對(duì)比兩種腦膜炎雙球菌菌株，一種淋病雙球菌菌株和四種流感嗜血菌菌株的TbpA時(shí)，觀察到氨基酸序列上的最大的差異(1；Loosemore等1996；Schryvers和Gonzalez 1996)。基于在溶血巴斯德氏菌A1型這一區(qū)中的已知氨基酸序列(VEDTCPTLD)制備一種寡核苷酸引物(#450，表10)，并且將它與5＇特異性引物(#255，表10)組合用于以各種菌株進(jìn)行的菌落PCR擴(kuò)增反應(yīng)。如圖29 A組中所說明的，這一寡核苷酸對(duì)在高嚴(yán)格條件下易于從所有菌株(除菌株h100外，其中共遷移帶幾乎看不清楚)擴(kuò)增預(yù)期的800 bp PCR產(chǎn)物。這些結(jié)果說明在溶血巴斯德氏菌和海藻巴斯德氏菌的不同的血清型中具有相當(dāng)大的同源性，即使是在TbpA的非保守氨基酸區(qū)中。
為了評(píng)價(jià)tbpB基因中的差異，首先嘗試?yán)脤?duì)該基因5’和3’末端特異性的引物(引物#401和#199，表10)從各種菌株擴(kuò)增完整的基因。這些引物從所有試驗(yàn)的菌株容易地?cái)U(kuò)增完整的tbpB基因(表11)。限制酶消化分析揭示一種相同的消化模式在試驗(yàn)的所有七種A1菌株(參見圖28 B組中的h44和h196)和其它組的一些菌株(h105,h104和h98)中觀察到。僅在幾種其它菌株(h103,h107,h99,h106，圖28,B組)中檢測(cè)到模式上微小的區(qū)別。這祥，使用采用可變區(qū)的寡核苷酸引物的基于PCR的方法，看在其它研究中發(fā)現(xiàn)的可變區(qū)是否在溶血巴斯德氏菌中出現(xiàn)差異。在報(bào)道的tbpB的保守區(qū)(26)外與5’引物(#401，表10)一起試驗(yàn)反向寡核苷酸引物(#397，表10)。類似地，將其它可變區(qū)的正向引物(#400)與3’末端寡核苷酸引物(#199)組合使用。從所有試驗(yàn)的A和T菌株(除了一種T菌株h99(圖29B和表11)外)獲得預(yù)期的tbpB部分產(chǎn)物，表明不僅在所述基因的5’和3’末端，而且在其它物種的已知的大量的可變區(qū)中確實(shí)存在相當(dāng)大的同源性。
表10寡核苷酸引物# 描述 方向 序列255 tbpA-5＇末端，在起始密碼子上的NdeⅠ位點(diǎn) 正向 CCCTATCATATGATAATGAAATATCATC256 tbpA-3＇末端，在終止密碼子后的 反向 TAGCGCAAGCTTCTAAAACTTCATTTCAAATHindⅢ位點(diǎn)450 tbpA-可變區(qū) 反向 TAATGTTGGGCAAGTATCTTCCAC401 tbpB-5＇末端 正向 TAAATTAAAGGAGACATTATGTTTAAACT199 tbpB-3＇末端，側(cè)翼HindⅢ位點(diǎn) 反向 GCGCAAGCTTTATTTTTCTATTTGACG397 tbpB-可變區(qū)，接近3’端 反向 CTGTTGGCAAATCTGCCAGAG400 tbpB-可變區(qū)，接近中部正向 AGGTAATCGCTTTTCTGGTAAAGC*相對(duì)于有關(guān)基因編碼鏈的取向的方向表11．溶血巴斯德氏菌不同血清型的tbpA和tbpB基因片段的PCR-擴(kuò)增
<p>注+=獲得預(yù)期大小的產(chǎn)物，可與對(duì)照(h196)比較+/-=獲得預(yù)期大小的產(chǎn)物，但是在強(qiáng)度上比對(duì)照弱得多-=沒有獲得產(chǎn)物討論發(fā)現(xiàn)一組其它反芻動(dòng)物的溶血巴斯德氏菌和海藻巴斯德氏菌分離物能夠從牛，綿羊和公山羊運(yùn)鐵蛋白獲取鐵(數(shù)據(jù)未顯示)，這被認(rèn)為是由特異性結(jié)合反芻動(dòng)物運(yùn)鐵蛋白的表面受體所介導(dǎo)(A1-Sultan和Aitken1984)。牽涉到這一研究中的一組溶血巴斯德氏菌(生物型A)和海藻巴斯德氏菌(生物型T)包括不同的血清型(表9)，說明受體介導(dǎo)的鐵獲取機(jī)理在這些物種內(nèi)相當(dāng)普遍。在用于結(jié)合測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)條件下所試驗(yàn)的各種菌株中，在運(yùn)鐵蛋白結(jié)合活性的表達(dá)方面具有一些可變性。在結(jié)合綴合的宿主運(yùn)鐵蛋白(HRP-hTf)的能力上的類似的變化在流感嗜血菌菌株中已觀察到(Robki等1993)。這可以部分歸因于不同菌株的改變的生長特征。然而，結(jié)合測(cè)定的高度敏感性和特定的性質(zhì)使得能夠最終鑒別在所試驗(yàn)的菌株中受體活性的存在。
競爭性結(jié)合實(shí)驗(yàn)和親和性分離實(shí)驗(yàn)表明，與所有三種反芻動(dòng)物運(yùn)鐵蛋白的相互作用受到相同的受體蛋白質(zhì)的調(diào)節(jié)，這些蛋白質(zhì)在所分析的各種菌株中顯示相對(duì)大的相似性。這一結(jié)論進(jìn)一步由從各種溶血巴斯德氏菌菌株制備的受體蛋白質(zhì)的免疫學(xué)分析所證實(shí)(圖26 B組)，所說的菌株具有對(duì)TbpA和TbpB的單特異性的血清。因?yàn)槊庖邔W(xué)分析包括在生物型A和T之內(nèi)的各種不同的血清型，所以會(huì)出現(xiàn)，在反芻動(dòng)物的溶血巴斯德氏菌疾病分離物中運(yùn)鐵蛋白受體蛋白質(zhì)是相當(dāng)保守的。雖然在各種不同溶血巴斯德氏菌菌株中的兩種受體蛋白質(zhì)之間具有相對(duì)大的免疫學(xué)交叉反應(yīng)性，但這一交叉反應(yīng)性應(yīng)當(dāng)包括存在于體內(nèi)表面的表位。完整細(xì)胞/抗體分析的初步結(jié)果(圖27)說明這樣的表面表位的存在。任何給定菌株的完整細(xì)胞/HRP-btf和完整細(xì)胞/抗-Tbp反應(yīng)性所觀察到的一致的模式(圖27)，以及在鐵充足細(xì)胞中的兩種反應(yīng)所觀察到的極大地降低活性說明所觀察到的反應(yīng)性是抗鐵調(diào)節(jié)蛋白的。
在開發(fā)抗任何細(xì)菌物種的有效疫苗中的一個(gè)重要的考慮事項(xiàng)是疫苗抗不同血清型/生物型感染細(xì)菌物種的抗菌譜。在腦膜炎萘瑟氏球菌中，雖然TbpA蛋白質(zhì)是相對(duì)同源的，但基于它們的TbpB蛋白質(zhì)(18)的分子量和抗原性的不同在所說的物種中兩個(gè)家族的鑒別規(guī)定了代表兩個(gè)家族的異源Tbp疫苗的配方。
用Schryver和Morris(32)的親和性純化方法鑒別了來源于溶血巴斯德氏菌血清型A1(26)的牛菌株的100Kda運(yùn)鐵蛋白受體蛋白質(zhì)(TbpA)。如方法部分所述的這一方法的修改使得我們可以鑒別溶血巴斯德氏菌中的60Kda第二運(yùn)鐵蛋白結(jié)合蛋白，其類似于其它的細(xì)菌物種中的TbpB(32和Robki等1993)。親和性純化方法分離來源于所檢驗(yàn)的所有溶血巴斯德氏菌和海藻巴斯德氏菌菌株的類似分子量的TbpA和TbpB(圖26,A組)。我們?cè)谌苎退沟率暇秃Ｔ灏退沟率暇械慕Y(jié)果顯示，抗血清型A1菌株h44的這兩種純化的受體蛋白質(zhì)產(chǎn)生的抗血清特異性地識(shí)別其它A1菌株(h196，圖26,B組)和其它A血清型的受體蛋白質(zhì)。這些包括已知在其與抗35Kda和70Kda鐵調(diào)節(jié)外膜蛋白質(zhì)的恢復(fù)期血清的反應(yīng)性上不同于其它A型的A11血清型(h107)。T菌株h99以及h100(圖26,A組)的純化受體的量以及它們的抗血清(圖26,B組)與大多數(shù)A菌株比較表現(xiàn)出降低。與T菌株的抗體反應(yīng)性的降低也在完整細(xì)胞測(cè)定中觀察到(圖27)。然而，在這些菌株中的完整細(xì)胞-抗體反應(yīng)性上的降低和它們與HRP-bTf的降低的反應(yīng)性一致(圖27)。這說明與抗-TbpA和抗-TbpB抗血清的觀察到的更低的反應(yīng)性很可能是由于在用于這些實(shí)驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)生長條件下的受體蛋白質(zhì)的表達(dá)上的不同。
編碼TbpA和TbpB蛋白質(zhì)的基因，tbpA以及tbpB在血清型A1(在牛中引起肺巴斯德氏菌病)內(nèi)是相當(dāng)同源的，在廣泛的A型(在綿羊和山羊中引起肺炎)中有很大程度的同源性(圖28)。通過將限制酶消化分析擴(kuò)展到海藻巴斯德氏菌菌株，我們發(fā)現(xiàn)僅有邊際的區(qū)別(圖28)。用特異性5’和3’寡核苷酸引物和來源于高變區(qū)的引物(圖29，表11)進(jìn)行的PCR-擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)的結(jié)果進(jìn)一步支持這樣的結(jié)論溶血巴斯德氏菌和海藻巴斯德氏菌內(nèi)的tbp基因同源性是比較高的。這些與已從流感嗜血菌和腦膜炎萘瑟氏球菌(1和Loosemore等)所觀察到的區(qū)別相反，但需要由從大量血清型的代表性菌株分離的基因的序列分析證實(shí)。
在tbp基因中明顯的遺傳異質(zhì)性的缺乏和各種溶血巴斯德氏菌和海藻巴斯德氏菌菌株的Tbp蛋白質(zhì)的表觀免疫學(xué)交叉反應(yīng)性標(biāo)志著它們是預(yù)防反芻動(dòng)物中傳染病的廣譜疫苗抗原。
雖然參照目前被認(rèn)為優(yōu)選的實(shí)施例描述了本發(fā)明，但應(yīng)當(dāng)理解本發(fā)明不限于所公開的實(shí)施例。相反，本發(fā)明覆蓋了包含在所附權(quán)利要求的精神和范圍內(nèi)的各種修改和等同的編排。
所有出版物，專利以及專利申請(qǐng)本文以其整體一并參考，就象各單個(gè)出版物，專利或?qū)＠暾?qǐng)具體和單獨(dú)被指明本文以其整體一并參考一樣。
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詳細(xì)的圖例說明圖1．PCR分析結(jié)果a)PCR方法的示意圖-各個(gè)環(huán)代表重組pBR322質(zhì)粒和可能的PCR反應(yīng)。Tbp1引物，左引物和右引物分別用t,1和r表示。在pBR322質(zhì)粒上的EcoRⅠ位點(diǎn)用字母E表示。在上部質(zhì)粒中，Tbp1引物和左引物擴(kuò)增相應(yīng)于粗線的PCR產(chǎn)物。類似地，在下部的質(zhì)粒中，由Tbp1引物和右引物擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物用粗線表示。
(b)由Tbp1引物和左引物擴(kuò)增的0.8 kb PCR產(chǎn)物圖2.tbp質(zhì)粒9,10和482的限制性內(nèi)切核酸酶圖譜。空心方框-pBR322線性化的。帶斜線的方框-PCRⅡ線性化的。tbpA,tbpB的位置和取向如黑箭頭所示。
圖3．溶血巴斯德氏菌tbpA和tbpB的基本核苷酸序列。推定的信號(hào)序列切割位點(diǎn)由箭頭表示。起始密碼子(ATG)有下劃線。
圖4．溶血巴斯德氏菌tbpB的啟動(dòng)子區(qū)(PHTBPB)。推定的Fur共有序列由星號(hào)表示。也表示了淋病萘瑟氏球菌tbpB(NGTBPB)和腦膜炎奈瑟氏球菌tbpB(NMTBPB)的Fur共有序列。
圖5．用ClaⅠ消化的和用tbpA基因探查的溶血巴斯德氏菌基因組DNA的Southern雜交。泳道1-16代表溶血巴斯德氏菌血清型1到16。泳道M代表用Hind Ⅲ消化的和與分別作為大小標(biāo)記的放射性標(biāo)記的λDNA雜交的λDNA。
圖6．以HindⅢ和BamHⅠ消化的并且用tbpA基因探查的溶血巴斯德氏菌基因組DNA的Southern雜交。泳道1-16代表溶血巴斯德氏菌血清型1-16。分子大小如左所示。
圖7．以各種限制性內(nèi)切核酸酶消化的并且用溶血巴斯德氏菌tbpA探查的豬放線桿菌3714、胸膜肺炎放線桿菌CM5和shope 4074基因組DNA的Southern雜交。泳道M代表用Hind Ⅲ消化和與分別作為大小標(biāo)記的放射性標(biāo)記的λDNA雜交的λDNA。
圖8．溶血巴斯德氏菌A1，胸膜肺炎放線桿菌CM5,Shope 4074和豬放線桿菌3714中的tbpA、tbpB區(qū)的限制性酶切圖。泳道1代表用于圖15中的tbpA探針。泳道2代表用于圖16和17中的tbpA探針。
圖9．溶血巴斯德氏菌A1的Tbp1(PHTBP)和淋病奈瑟氏球菌的Tbp1(NGTBP1)與腦膜炎奈瑟氏球菌的Tbp1(NM1)的氨基酸的序列對(duì)比。右邊的編號(hào)表示氨基酸位置。星號(hào)表示在序列對(duì)比中完全相同的位置，小黑點(diǎn)表示類似的氨基酸殘基。引入間隙以便最多地比較序列，并用破折號(hào)(-)表示。
圖10．溶血巴斯德氏菌A1 Tbp1(PHTBPI)和胸膜肺炎放線桿菌血清型1和7 TfbA蛋白質(zhì)(APL,APL7)之間的序列對(duì)比。星號(hào)表示在序列對(duì)比中完全相同的位置，小黑點(diǎn)表示類似的氨基酸殘基。引入間隙以便最多地比較序列，并用破折號(hào)(-)表示。
圖11．說明溶血巴斯德氏菌Tbp1(PHTBP)，淋病奈瑟氏球菌Tbp1(NGTBP1)，腦膜炎奈瑟氏球菌Tbp1(NM1)和胸膜肺炎放線桿菌血清型1和7 TfbA蛋白質(zhì)(APL1,APL7)之間的遺傳相關(guān)性的圖示。
圖12．溶血巴斯德氏菌A1 Tbp1和大腸桿菌TonB-依賴性外膜受體之間的肽對(duì)比。星號(hào)表示在序列對(duì)比中完全相同的氨基酸，小黑點(diǎn)表示類似的氨基酸殘基。引入間隙以便最多地比較序列，并用破折號(hào)(-)表示。
圖13．溶血巴斯德氏菌Tbp1蛋白質(zhì)的T7分析。以kDa為單位的分子量標(biāo)記表示在左邊泳道1-陽性對(duì)照重組質(zhì)粒。泳道2-含有tbpA的重組質(zhì)粒。泳道3-載體質(zhì)粒pBluescript(SK)。
圖14．溶血巴斯德氏菌A1和大腸桿菌HB101的內(nèi)和外膜的Western免疫印跡。第一抗體是抗溶血巴斯德氏菌A1可溶性抗原產(chǎn)生的兔抗血清，第二抗體是山羊抗-兔堿性磷酸酶綴合物。泳道M代表以kDa為單位的分子量標(biāo)記。泳道1-4代表外膜組分，泳道5-8是內(nèi)膜組分。6μg的蛋白質(zhì)加入到各泳道上。泳道1和5-來源于生長在LT上的細(xì)胞的大腸桿菌蛋白質(zhì)。泳道2和6-來源于生長在BHIB上的細(xì)胞的蛋白質(zhì)。泳道3和7-來源于生長在BHIB加100μM EDDA上的細(xì)胞的蛋白質(zhì)。泳道4和8-來源于生長在BHIB加100μM EDDA與1 mM FeSO4上的細(xì)胞的蛋白質(zhì)。
圖15．采用在小牛中用Presponse接種抗可溶性抗原產(chǎn)生的血清獲得的溶血巴斯德氏菌A1和大腸桿菌HB101的內(nèi)和外膜的Western免疫印跡。第二抗體是山羊抗-牛堿性磷酸酶綴合物。泳道M代表以kDa為單位的分子量標(biāo)記。泳道1-4代表外膜組分，泳道5-8是內(nèi)膜組分。6μg的蛋白質(zhì)加入到各泳道上。泳道1和5-來源于生長在LT上的細(xì)胞的大腸桿菌蛋白質(zhì)。泳道2和6-來源于生長在BHIB上的細(xì)胞的蛋白質(zhì)。泳道3和7-來源于生長在BHIB加100μM EDDA上的細(xì)胞的蛋白質(zhì)。泳道4和8-來源于生長在BHIB加100μM EDDA與1 mM FeSO4上的細(xì)胞的蛋白質(zhì)。
圖16．由鐵-缺乏細(xì)菌膜結(jié)合標(biāo)記的運(yùn)鐵蛋白。將從所示的細(xì)菌菌株的鐵-缺乏細(xì)胞制備的總膜等分樣(4μg蛋白質(zhì))點(diǎn)樣在硝酸纖維素/醋酸纖維素紙條上，封閉后，將紙條暴露于含有450ng/ml所述的HRP-綴合的運(yùn)鐵蛋白的混合物中。隨后洗滌濾紙并用方法部分中描述的HRP底物混合物展開。h173,h174,h175,h176和h44是溶血巴斯德氏菌的代表性菌株，它們的血清型和來源在表1中列出。h50-牛，綿羊，公山羊和馬運(yùn)鐵蛋白的馬駒放線桿菌HRP-bTf,-oTf,-cTf和-eTf-HRP綴合物。
圖17．用運(yùn)鐵蛋白親和柱分離受體蛋白質(zhì)。用從溶血巴斯德氏菌菌株h44(頂部組)，h173(中部組)和h175(底部組)制備的鐵-缺乏總膜完成親和分離實(shí)驗(yàn)。采用方法部分所描述的標(biāo)準(zhǔn)洗滌條件(泳道B-E)或低鹽洗滌條件(泳道A)，用牛運(yùn)鐵蛋白-瓊脂糖凝膠(泳道A和B)，綿羊運(yùn)鐵蛋白-瓊脂糖凝膠(泳道C)，公山羊運(yùn)鐵蛋白-瓊脂糖凝膠(泳道D)或馬運(yùn)鐵蛋白-瓊脂糖凝膠(泳道E)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。將用含有2M鹽酸胍的緩沖液洗脫的樣品透析、濃縮和用如方法部分描述的SDS-PAGE和銀染進(jìn)行等分樣分析。
圖18．來源于牛、綿羊和山羊的不同血清型溶血巴斯德氏菌的受體蛋白質(zhì)的免疫學(xué)分析。如方法部分所述，將來源于代表性血清型的溶血巴斯德氏菌的純化的受體蛋白質(zhì)等分樣進(jìn)行SDS-PAGE，電印跡，然后用特異性抗-TbpB血清(A組)或用抗-TbpA血清(B組)探查。下列所示的血清型的溶血巴斯德氏菌菌株包括在分析中泳道1-菌株h44(A1)，泳道2-h173(未分型)，泳道3-h175(A7)，泳道4-h176(A9)，泳道5-h100(T4)，泳道6-h106(T10)，和泳道7-h107(A11)。左邊的數(shù)字代表標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的分子量(×1000)。
圖19．由完整的細(xì)胞結(jié)合標(biāo)記的運(yùn)鐵蛋白和抗-受體抗體。所示的菌株在鐵-有限條件下生長，經(jīng)離心回收，重懸于50 mM TrisHCl,150 mMNaCl,pH 7.5緩沖液中至A600為1-2。將5μl的懸液等分樣用于HA膜上，干燥該膜，封閉，然后與含有標(biāo)記的運(yùn)鐵蛋白(HRP-bTf)或抗受體抗體(抗-TbpA，抗-TbpB)的封閉溶液接觸。洗滌后來的膜，隨后在用底物展開之前與標(biāo)記的第二抗體接觸。
圖20．溶血巴斯德氏菌tbp操縱子(頂端)和調(diào)節(jié)序列(底端)的圖。tbpA和tbpB分別是編碼TbpA和TbpB的基因；p是在tbpB前的推定的啟動(dòng)子區(qū)，在底部以-35和-10位點(diǎn)表示；推定的Fur盒以在底部序列相反方向的兩個(gè)箭頭表示；rnaseT和fis是兩個(gè)ORF，它們側(cè)翼于溶血巴斯德氏菌tbp操縱子，分別編碼高度同源于大腸桿菌和流感嗜血菌RNase轉(zhuǎn)移酶和倒位因子刺激蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)。此外也用粗體表示了推定的核糖體結(jié)合位點(diǎn)或Shine-Dalgarno(SD)共有序列，轉(zhuǎn)錄起始密碼子(Met)和終止密碼子(SC)。
圖21．溶血巴斯德氏菌菌株H196 tbpA基因的DNA序列。
圖22．溶血巴斯德氏菌菌株H196的TbpA蛋白質(zhì)的預(yù)測(cè)的氨基酸序列。斜體的氨基酸相應(yīng)于實(shí)驗(yàn)確定的成熟蛋白質(zhì)的N端氨基酸。由透線表示的殘基構(gòu)成前導(dǎo)肽區(qū)。在腦膜炎奈瑟氏球菌，淋病奈瑟氏球菌，流感嗜血菌和胸膜肺炎放線桿菌的TbpAs中相同的殘基以粗體和下劃線表示。表示了基于Tommassen提出的拓?fù)鋵W(xué)模型(28)所建議的為內(nèi)部區(qū)段(濃陰影)、內(nèi)膜b-鏈(淡陰影)或外區(qū)段(無陰影)的區(qū)。
圖23．溶血巴斯德氏菌菌株H196 tbpB基因的DNA序列。
圖24．溶血巴斯德氏菌菌株H196的TbpB蛋白質(zhì)的預(yù)測(cè)的氨基酸序列。斜體的氨基酸相應(yīng)于預(yù)測(cè)的成熟蛋白質(zhì)的N端氨基酸。由透線表示的殘基構(gòu)成前導(dǎo)肽區(qū)。同源的區(qū)用陰影表示，在腦膜炎奈瑟氏球菌，淋病奈瑟氏球菌，流感嗜血菌和胸膜肺炎放線桿菌的TbpBs中相同的殘基以粗體和下劃線表示。
圖25．固相HRP-Tf結(jié)合測(cè)定。將所示溶血巴斯德氏菌和海藻巴斯德氏菌菌株的總膜制劑點(diǎn)樣在硝酸纖維素-醋酸纖維素紙上，在與HRP-bTf,-oTf或-gTf一起溫育之前，用脫脂奶封閉。如方法部分所述，用氯萘酚試劑檢測(cè)結(jié)合。左邊的字母表示菌株，而頂端的字母表示不同的HRP-標(biāo)記的反芻動(dòng)物運(yùn)鐵蛋白。
圖26．用溶血巴斯德氏菌血清型A1的抗-TbpA和抗-TbpB抗血清進(jìn)行的Western印跡交叉反應(yīng)性研究。經(jīng)SDS-PAGE和銀染(A組)分離所示的溶血巴斯德氏菌和海藻巴斯德氏菌菌株的親和純化的受體蛋白等分樣，或者如方法部分所述進(jìn)行Western印跡(B組)。如方法部分所描述的，通過與抗-TbpB(1/1000)和抗-TbpA(1/1000)兔抗血清混合物一起溫育鑒別Tbp蛋白質(zhì)。左邊的數(shù)字代表以kDa為單位的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的分子量(X 1000)。
圖27．用抗完整細(xì)胞的溶血巴斯德氏菌血清型A1的單特異性抗-TbpA和抗-TbpB抗血清進(jìn)行的交叉反應(yīng)性研究。將所示溶血巴斯德氏菌和海藻巴斯德氏菌菌株的鐵-有限完整細(xì)胞的等分樣點(diǎn)樣到HA硝酸纖維素紙上，封閉后，將膜暴露在HRP-標(biāo)記的bTf，抗-TbpA抗血清或抗-TbpB抗血清下。隨后如方法部分所述，通過標(biāo)記的山羊抗-兔抗體檢測(cè)結(jié)合的抗體。將在鐵充足下生長的完整的溶血巴斯德氏菌菌株h44(A1型)細(xì)胞(以h44-Fe+表示)的制劑點(diǎn)樣到膜上并用作對(duì)照。
圖28．PCR擴(kuò)增的溶血巴斯德氏菌和海藻巴斯德氏菌菌株的tbpA(A組)和tbpB(B組)基因的限制性內(nèi)切核酸酶消化模式。用Sau3A1限制性內(nèi)切核酸酶消化所示菌株的由集落PCR擴(kuò)增的tbp基因。如方法部分所述，將所形成的消化物在7.5％聚丙烯酰胺凝膠上電泳。在泳道上的字母表示用于PCR的源菌株模板DNA，而左邊的字母表示以kDa為單位的分子量標(biāo)準(zhǔn)。用Hewlett-Parkard ScanJetⅡp進(jìn)行成像。在圖29B中，來源于溶血巴斯德氏菌tbpB基因非保守區(qū)的引物#s 397和400用于分別與相反引物(#s401(5＇)和199(3＇)組合。
圖29．tbpA和tbpB基因可變區(qū)段的PCR擴(kuò)增。對(duì)tbpA基因而言，從tbpA高變區(qū)的推定的氨基酸序列制備的寡核苷酸引物#450用于與5’特異性引物(#255)組合，以擴(kuò)增各種溶血巴斯德氏菌菌株的基因區(qū)段。然后在1％瓊脂糖凝膠上分析產(chǎn)物，接著用溴化乙錠染色。
序列表(1)一般信息(ⅰ)申請(qǐng)人(A)名稱LO,Reggie,Y.C.
(B)街道Birch街4號(hào)(C)城市Guelph(D)州安大略(E)國家加拿大(F)郵區(qū)代碼N1G 2N3(A)名稱SCHRYVERS,Anthony,B.
(B)街道Edforth路39號(hào)(C)城市Calgary(D)州Alberta(E)國家加拿大(F)郵區(qū)代碼T3A 3V8(A)名稱POTTER,Andrew,A.
(B)街道521 Dalhousie Cres.
(C)城市Saskatoon(D)州Saskatchewan(E)國家加拿大(F)郵區(qū)代碼F7H 3S5(ⅱ)發(fā)明名稱溶血巴斯德氏菌運(yùn)鐵蛋白結(jié)合蛋白和包含該蛋白質(zhì)的疫苗(ⅲ)序列數(shù)4(ⅳ)通訊地址(A)收信人BERESKIN＆PARR(B)街道40 King Street,West(C)城市多倫多
(D)州安大略(E)國家加拿大(F)ZIPM5H 3Y2(ⅴ)計(jì)算機(jī)可讀形式(A)介質(zhì)類型軟盤(B)計(jì)算機(jī)IBM PC兼容機(jī)(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件PatentIn Release#1.0,#1.30版(ⅵ)當(dāng)前申請(qǐng)的數(shù)據(jù)(A)申請(qǐng)?zhí)?B)申請(qǐng)日(C)分類號(hào)(ⅶ)在先申請(qǐng)的數(shù)據(jù)(A)申請(qǐng)?zhí)朥S 60/008,569(B)申請(qǐng)日1995年12月1日(ⅶ)在先申請(qǐng)的數(shù)據(jù)(A)申請(qǐng)?zhí)朇A 2,164,274(B)申請(qǐng)日1995年12月1日(ⅷ)律師/代理人信息(A)姓名Kurdydyk,Linda M.
(B)注冊(cè)號(hào)34,971(C)卷號(hào)6580-82(ⅸ)電訊信息(A)電話(416)364-7311(E)傳真(416)361-1398(2)SEQ ID NO:1的信息(ⅰ)序列特征(A)長度2784個(gè)堿基對(duì)
(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ⅱ)分子類型DNA(基因組的)(ⅵ)原始來源(A)有機(jī)體溶血巴斯德氏菌(tbpA基因)(B)菌株H196(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:1:ATGATAATGA AATATCATCA TTTTCGCTAT TCACCTGTTG CCTTAACAGT GTTATTTGCT 60CTTTCTCATT CATACGGTGC TGCGACTGAA AATAAAAAAA TCGAAGAAAA TAACGATCTA120GCTGTTCTGG ATGAAGTTAT TGTGACAGAG AGCCATTATG CTCACGAACG TCAAAACGAA180GTAACTGGCT TGGGGAAAGT AGTGAAAAAT TATCACGAAA TGAGTAAAAA TCAAATTCTT240GGTATTCGTG ATTTAACTCG CTATGACCCT GGTATTTCGG TGGTGGAACA AGGTCGCGGT300GCAAGTAGTG GCTATGCCAT TCGAGGTGTA GATAAAAACC GTGTCAGCTT ACTTGTTGAT360GGGCTACCAC AAGCGCACAG TTATCATACG CTAGGTTCAG ATGCTAATGG TGGTGCAATT420AATGAGATTG AGTATGAAAA CATTCGTTCA ATTGAGTTAA GCAAAGGAGC AAGTTCTGCG480GAATATGGCT CTGGTGCGCA TGGTGGTGCT ATTGGTTTTC GTACTAAAGA TGCGCAGGAT540ATTATTAAAG AGGGGCAGCA TTGGGGCTTA GATAGTAAGA CCTCTTATGC CAGCAAAAAT600AGCCATTTTT TACAGTCTAT CGCAGCGGCT GGTGAGGCGG GTGGTTTTGA AGCACTTGTT660ATTGCAACTC ACCGACACGG TAAAGAGACC AAAATTCATT CCGAGGCAAA TAAATTAAAA720CATAATATTC GGCGTATAAC CGGCTTTGAA AATCGCTACG ACTTTACCCA AATTCCGCAC780AGAATGCTCC TGGAGGATCT CCTTTTAATT GTGGAAGATA CTTGCCCAAC ATTAGATTGT840ACTCCTCGTG CAAGGGTTAA GTTGAACCGC GATAATTTCC CAGTGAGAAC ATTTCCGGAA900TATACGCCTG AAGAGCGCAA ACAGCTTGAG CAGATTCCTT ATCGCACTGA GCAGCTCTCA960GCCCAAGAAT ATACCGGTAA AGATCGCATT GCACCAAACC CTTTAGATTA CAAGAGTAAT1020TCTGTTTTTA TGAAGTTTGG CTATCACTTC AACTCGTCTC ATTATCTTGG CGCAATCTTA1080GAAGATACAA AAACACGCTA CGATATCCGT GATATGCAAA CGCCAGCTTA CTATACAAAA1140GACGATATTA ACTTATCACT TAGGAACTAT GTTTATGAAG GGGATAATAT TTTAGATGGC1200TTAGTGTTCA AGCCAAGGAT CCCTTATGGG TTGCGCTATA GCCATGTGAA GTTTTTTGAT1260GAACGTCACC ACAAACGTCG TTTAGGATTC ACCTATAAAT ATAAACCAGA GAATAATCGC1320TGGTTGGATA GCATTAAACT CAGTGCGGAT AAACAAGATA TTGAACTATA TAGCCGGCTA1380CATCGCTTGC ATTGTAGCGA TTATCCTGTG GTAGATAAAA ATTGCCGCCC GACTTTGGAT1440AAATCTTGGT CTATGTATCG AACTGAGCGT AATAATTACC AAGAAAAGCA TCGTGTCATT1500CATTTAGAAT TTGATAAAGC GCTAAATGCT GGTCAAGGCG TATTTAACCA AACCCACAAA1560CTGAATTTAG GGTTGGGCTT TGATCGATTT AATTCGCTTA TGGATCATGG GGATATGACT1620GCCCAATATA CCAAAGGCGG TTATACCAGC TACCGCGGTA GAGGGCGTTT AGATAATCCA1680TATATTTATC GCCGCGATCC ACGCAGTATT GAAACGGTAT CTTTGTGTAA TAATACACGC1740GGCGACATCT TAAACTGTGA ACCGCGTAAA ATTAAAGGCG ATAGCCATTT TGTTAGCTTC1800CGCGATCTAG TGATAAGCGA GTATGTGGAT TTGGGATTAG GGGTGCGTTT TGATCAACAT1860CGATTTAAAT CTGATGATCC GTGGACACTT AGCCGAACTT ATCGAAATTG GTCTTGGAAT1920GGTGGGATTA CGCTTAAACC AACAGAGTTT GTATCGCTTT CTTATCGCAT TTCAAACGGT1980TTTAGAGTGC CTGCATTCTA TGAACTTTAT GGTAAACGTG ATCATATTGG GCTTAAAGAT2040AACGAATATG TGCAACGCGC GCAACGTAGC CACCAGTTAG AGCCAGAAAA ATCGACTAAT2100CATGAGATTG GAGTTAGCTT TAAAGGTCAA TTTGGTTACC TTGAATTTCC GTAATAACTA2160TAAAAATATG ATTGCGACAG CATGTAAAAG AATAATACAA AAATCACACT GTTTCTATAA2220CTACCATAAT ATTCAAGATG TAGCACTAAA CGGGATAAAT TTAGTCGCTA AATTTGACTT2280ACACGGTATT TTATCTATGC TGCCAGATGG TTTTTATTCA TCAGTTGCTT ATAACCGTGT2340AAAAGTAAAA GAGCGGAAAC TAACCGACTC AAGACTCGAT AGCGTAAACG ATCCTATTCT2400AGATGCGATT CAGCCAGCAC GCTATGTGCT TGGATTCGGC TACGATCACC CAGAAGAAAA2460ATGGGGAATT GGCATTACTA CCACCTATTC TAAAGCCAAA AACGCCGATG AGGTGGCAGG2520CACACGTCAT CACGGATACA TCGCGTTGAT TTAGGTGGCA AACTGACCGG TTCTTGGTAC2580ACCCATGATA TTACCGGTTA CATCAATTAT AAAAACTACA CCTTACGTGG AGGAATTTAT2640AATGTGACTA ATCGTAAATA TTCCACTTGG GAATCAGTGC GCCAATCCGG TGTGAATGCA2700GTAAACCAAG ACCGGGGTAG CAATTACACT CGATTTGGCG CTCCGGGGAG AAATTTCAGT2760TTAGCATTTG AAATGAAGTT TTAG 2784(2)SEQ ID NO:2的信息(ⅰ)序列特征(A)長度930個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ⅱ)分子類型蛋白質(zhì)(ⅵ)原始來源(A)有機(jī)體溶血巴斯德氏菌(TbpA蛋白質(zhì))(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:2:Met Ile Met Lys Tyr His His Phe Arg Tyr Ser Pro Val Ala Leu Thr1 5 10 15Val Leu Phe Ala Leu Ser His Ser Tyr Gly Ala Ala Thr Glu Asn Lys20 25 30Lys Ile Glu Glu Asn Asn Asp Leu Ala Val Leu Asp Glu Val Ile Val35 40 45Thr Glu Ser His Tyr Ala His Glu Arg Gln Asn Glu Val Thr Gly Leu50 55 60Gly Lys Val Val Lys Asn Tyr His Glu Met Ser Lys Asn Gln Ile Leu65 70 75 80Gly Ile Arg Asp Leu Thr Arg Tyr Asp Pro Gly Ile Ser Val Val Glu85 90 95Gln Gly Arg Gly Ala Ser Ser Gly Tyr Ala Ile Arg Gly Val Asp Lys100 105 110Asn Arg Val Ser Leu Leu Val Asp Gly Leu Pro Gln Ala His Ser Tyr115 120 125His Thr Leu Gly Ser Asp Ala Asn Gly Gly Ala Ile Asn Glu Ile Glu130 135 140Tyr Glu Asn Ile Arg Ser Ile Glu Leu Ser Lys Gly Ala Ser Ser Ala145 150 155 160Glu Tyr Gly Ser Gly Ala His Gly Gly Ala Ile Gly Phe Arg Thr Lys165 170 175Asp Ala Gln Asp Ile Ile Lys Glu Gly Gln His Trp Gly Leu Asp Ser180 185 190Lys Thr Ser Tyr Ala Ser Lys Asn Ser His Phe Leu Gln Ser Ile Ala195 200 205Ala Ala Gly Glu Ala Gly Gly Phe Glu Ala Leu Val Ile Ala Thr His210 215 220Arg His Gly Lys Glu Thr Lys Ile His Ser Glu Ala Asn Lys Leu Lys225 230 235 240His Asn Ile Arg Arg Ile Thr Gly Phe Glu Asn Arg Tyr Asp Phe Thr245 250 255Gln Ile Pro His Arg Met Leu Leu Glu Asp Leu Leu Leu Ile Val Glu260 265 270Asp Thr Cys Pro Thr Leu Asp Cys Thr Pro Arg Ala Arg Val Lys Leu275 280 285Asn Arg Asp Asn Phe Pro val Arg Thr Phe Pro Glu Tyr Thr Pro Glu290 295 300Glu Arg Lys Gln Leu Glu Gln Ile Pro Tyr Arg Thr Glu Gln Leu Ser305 310 315 320Ala Gln Glu Tyr Thr Gly Lys Asp Arg Ile Ala Pro Asn Pro Leu Asp325 330 335Tyr Lys Ser Asn Ser Val Phe Met Lys Phe Gly Tyr His Phe Asn Ser340 345 350Ser His Tyr Leu Gly Ala Ile Leu Glu Asp Thr Lys Thr Arg Tyr Asp355 360 365Ile Arg Asp Met Gln Thr Pro Ala Tyr Tyr Thr Lys Asp Asp Ile Asn370 375 380Leu Ser Leu Arg Asn Tyr Val Tyr Glu Gly Asp Asn Ile Leu Asp Gly385 390 395 400Leu Val Phe Lys Pro Arg Ile Pro Tyr Gly Leu Arg Tyr Ser His Val405 410 415Lys Phe Phe Asp Glu Arg His His Lys Arg Arg Leu Gly Phe Thr Tyr420 425 430Lys Tyr Lys Pro Glu Asn Asn Arg Trp Leu Asp Ser Ile Lys Leu Ser435 440 445Ala Asp Lys Gln Asp Ile Glu Leu Tyr Ser Arg Leu His Arg Leu His450 455 460Cys Ser Asp Tyr Pro Val Val Asp Lys Asn Cys Arg Pro Thr Leu Asp465 470 475 480Lys Ser Trp Ser Met Tyr Arg Thr Glu Arg Asn Asn Tyr Gln Glu Lys485 490 495His Arg Val Ile His Leu Glu Phe Asp Lys Ala Leu Asn Ala Gly Gln500 505 510Gly Val Phe Asn Gln Thr His Lys Leu Asn Leu Gly Leu Gly Phe Asp515 520 525Arg Phe Asn Ser Leu Met Asp His Gly Asp Met Thr Ala Gln Tyr Thr530 535 540Lys Gly Gly Tyr Thr Ser Tyr Arg Gly Arg Gly Arg Leu Asp Asn Pro545 550 555 560Tyr Ile Tyr Arg Arg Asp Pro Arg Ser Ile Glu Thr ValSer Leu Cys565 570575Asn Asn Thr Arg Gly Asp Ile Leu Asn Cys Glu Pro Arg Lys Ile Lys580 585 590Gly Asp Ser His Phe Val Ser Phe Arg Asp Leu Val Ile Ser Glu Tyr595 600 605Val Asp Leu Gly Leu Gly Val Arg Phe Asp Gln His Arg Phe Lys Ser610 615 620Asp Asp Pro Trp Thr Leu Ser Arg Thr Tyr Arg Asn Trp Ser Trp Asn625 630 635 640Gly Gly Ile Thr Leu Lys Pro Thr Glu Phe Val Ser Leu Ser Tyr Arg645 650 655Ile Ser Asn Gly Phe Arg Val Pro Ala Phe Tyr Glu Leu Tyr Gly Lys660 665 670Arg Asp His Ile Gly Leu Lys Asp Asn Glu Tyr Val Gln Arg Ala Gln675 680 685Arg Ser His Gln Leu Glu pro Glu Lys Ser Thr Asn His Glu Ile Gly690 695 700Val Ser Phe Lys Gly Gln Phe Gly Tyr Leu Asp Val Ser Tyr Phe Arg705 710 715 720Asn Asn Tyr Lys Asn Met Ile Ala Thr Ala Cys Lys Arg Ile Ile Gln725 730 735Lys Ser His Cys Phe Tyr Asn Tyr His Asn Ile Gln Asp Val Ala Leu740 745 750Asn Gly Ile Asn Leu Val Ala Lys Phe Asp Leu His Gly Ile Leu Ser755 760 765Met Leu Pro Asp Gly Phe Tyr Ser Ser Val Ala Tyr Asn Arg Val Lys770 775 780Val Lys Glu Arg Lys Leu Thr Asp Ser Arg Leu Asp Ser Val Asn Asp785 790 795 800Pro Ile Leu Asp Ala Ile Gln Pro Ala Arg Tyr val Leu Gly Phe Gly805 810 815Tyr Asp His pro Glu Glu Lys Trp Gly Ile Gly Ile Thr Thr Thr Tyr820 825 830Ser Lys Ala Lys Asn Ala Asp Glu Val Ala Gly Thr Arg His His Gly835 840 845Ile His Arg val Asp Leu Gly Gly Lys Leu Thr Gly Ser Trp Tyr Thr850 855 860His Asp Ile Thr Gly Tyr Ile Asn Tyr Lys Asn Tyr Thr Leu Arg Gly865 870 875 880Gly Ile Tyr Asn Val Thr Asn Arg Lys Tyr Ser Thr Trp Glu Ser Val885 890 895Arg Gln Ser Gly Val Asn Ala Val Asn Gln Asp Arg Gly Ser Asn Tyr900 905 910Thr Arg Phe Gly Ala Pro Gly Arg Asn Phe Ser Leu Ala Phe Glu Met915 920 925Lys Phe930(2)SEQ ID的信息NO:3:
(ⅰ)序列特征(A)長度1755個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ⅱ)分子類型DNA(基因組的)(ⅵ)原始來源(A)有機(jī)體溶血巴斯德氏菌(TbpB基因)(B)菌株H196(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:3:ATGTTTAAAC TTAAAAGTAG TTTTGTACTG CTTAATGCGG CGCTACTTGC TGCTTGTTCC 60TCAAATGGTG GAAGCTTTGA TGTTCAATCT GCCAAAGTTG AATCTCAAAC GCAAACTACC 120CCCAAAAAGC CAAGTTTACA AGATGATAAT AGTAACGCAA GACGTACAGT AAGCGCTTCT 180GAAACTGAAG CTTTATTGCA GCCGGGGTTT GGTTTTTCAG CCAAAATTCC GCGTCGTAAT 240CTCCTTCCGC AGGGGAAGGA AGATGTAGCC CCTATTGGTG ATATAAAAGA GATTACTGGA 300GATCTGCCAA AAATTCCGTA TGAAGAAGAG GTTAAAGCGT GCGGTAGTAG TGCTGATGGA 360TTTAGCCATA CTCATGATAG AAATCATAAG TTGTATACAA GAGATTTTAA TTTTGTTCGT 420TCCGGCTATG TTGTGCATTC TGGTCCAAAA CCTGAAATAA AGCCTAAAGA AATTTTGAGA 480ACAGGTGCAC ATGGGTATGT TTACTATTTA GGTATAGAGC CGCCCAAAGC AATACCTACC 540CAAAAACTAA CTTATAAAGG ATATTGGGAT TTTACTACCT ATGCGGCTAA GGGGAGAGAT 600AGTAATATTT TTCTAATTCC CGCAGGCATC AATAGTGGCG CCATACCGGA AAATAGTCAC 660GATATTAATG TTGATGATTC TGAAAAACCA ATGGGGCATA CAGGAGAATT TACGGCTGAT 720TTTGCTAATA AAACTTTAAC TGGAACATTG GTTCGTAATG GGTATGTTAG TCGTAGCAAA 780GAGCAAAAAA TTACAACAAT TTACGATATT GATGCGAAAA TTAAAGGTAA TCGCTTTTCT 840GGTAAAGCAA ACCCAAAAAA ACCGATGATC CTTATTTTTG GGAAAAGCTC CACGACACTT 900GAAGGTGGAT TTTTTGGTGG GGAGGCTCAA GAACTTGCCG GTAAATTCTT AGCTGATGAT 960AAGTCGGTAT TTGTTGTTTT TGCTGGCACA CGAGATGCTA AAAAAGATGA TAGTGAATCT1020GCCTTTGATG CTTTCCCAAT TAAACTTAAA GATTTAAATA AATCTGAGAT GGATACTTTC1080GGGAATGCGA CACATTTGAT TATTAACAAT AAGCAGATTC CACTTATTGC GGAAGCCACA1140AAAAGCTTTG CCGAGATGAA ATTTGATGAT TTGGTTACCC GTACTATTGA TGGAAAAACG1200TATCGAGTTT CAGTCTGCTG TAATAATTTA GATTATGTCA AATTTGGGAT TTATAGCGAG 1260GGAAATAATA GTGATACTGC TCTCCAAGAA TATTTAGTAG GAGAACGTAC AGCTCTGGCA 1320GATTTGCCAA CAGGGACAGT AAAATATCGA GGTACTTGGG ACGGGGTAAT GTACAGTAAA 1380TCTGGCTCGG CAGGGGTTGA ATCGCCAAGT AACAGCGAAA GTGGTACTCG TTCACTATTC 1440GATGTAGATT TTGTCAATAA AAAAATTAAT GGCAAGCTGA TTGCTAATGA TGGTGTTGAA 1500GAACGCCCAA TGCTGACACT GGAAGGCAAT CTGAAAGGGA ATGGTTTTGG AGGCACAGCC 1560AAAACGGGCA ATTCTGGTTT TAATCTTGAT CCCAAAAGTA CGAATGGTGG CACGGTAGGG 1620CATATAAATA CTCAATTTGA AGGGGGCTTT TATGGCCCTA AGGCGACGGA ATTAGGTGGT 1680ATTGTACAAA ATACAGAAAC GGATAAAGAT AGAGTCAGTA TTACATTCGG CGGAAAACGT 1740CAAATAGAAA AATAA1755(2)SEQ ID NO:4的信息(ⅰ)序列特征(A)長度584個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ⅱ)分子類型蛋白質(zhì)(ⅵ)原始來源(A)有機(jī)體溶血巴斯德氏菌(TbpB蛋白質(zhì))(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:4:Met Phe Lys Leu Lys Sar Ser Phe Val Leu Leu Asn Ala Ala Leu Leu1 5 10 15Ala Ala Cys Ser Ser Asn Gly Gly Ser Phe Asp Val Gln Ser Ala Lys20 25 30Val Glu Ser Gln Thr Gln Thr Thr Pro Lys Lys Pro Ser Leu Gln Asp35 40 45Asp Asn Ser Asn Ala Arg Arg Thr Val Ser Ala Ser Glu Thr Glu Ala50 55 60Leu Leu Gln Pro Gly Phe Gly Phe Ser Ala Lys Ile Pro Arg Arg Asn65 70 75 80Leu Leu Pro Gln Gly Lys Glu Asp Val Ala Pro Ile Gly Asp Ile Lys85 90 95Glu Ile Thr Gly Asp Leu Pro Lys Ile Pro Tyr Glu Glu Glu Val Lys100 105 110Ala Cys Gly Ser Ser Ala Asp Gly Phe Ser His Thr His Asp Arg Asn115 120 125His Lys Leu Tyr Thr Arg Asp Phe Asn Phe Val Arg Ser Gly Tyr Val130 135 140Val His Ser Gly Pro Lys Pro Glu Ile Lys Pro Lys Glu Ile Leu Arg145 150 155 160Thr Gly Ala His Gly Tyr Val Tyr Tyr Leu Gly Ile Glu Pro Pro Lys165 170 175Ala Ile Pro Thr Gln Lys Leu Thr Tyr Lys Gly Tyr Trp Asp Phe Thr180 185 190Thr Tyr Ala Ala Lys Gly Arg Asp Ser Asn Ile Phe Leu Ile Pro Ala195 200 205Gly Ile Asn Ser Gly Ala Ile Pro Glu Asn Ser His Asp Ile Asn Val210 215 220Asp Asp Ser Glu Lys Pro Met Gly His Thr Gly Glu Phe Thr Ala Asp225 230 235 240Phe Ala Asn Lys Thr Leu Thr Gly Thr Leu Val Arg Asn Gly Tyr Val245 250 255Ser Arg Ser Lys Glu Gln Lys Ile Thr Thr Ile Tyr Asp Ile Asp Ala260 265 270Lys Ile Lys Gly Asn Arg Phe Ser Gly Lys Ala Asn Pro Lys Lys Pro275 280 285Met Ile Leu Ile Phe Gly Lys Ser Ser Thr Thr Leu Glu Gly Gly Phe290 295 300Phe Gly Gly Glu Ala Gln Glu Leu Ala Gly Lys Phe Leu Ala Asp Asp305 310 315 320Lys Ser Val Phe Val Val Phe Ala Gly Thr Arg Asp Ala Lys Lys Asp325 330 335Asp Ser Glu Ser Ala Phe Asp Ala Phe Pro Ile Lys Leu Lys Asp Leu340 345 350Asn Lys Ser Glu Met Asp Thr Phe Gly Asn Ala Thr His Leu Ile Ile355360 365Asn Asn Lys Gln Ile Pro Leu Ile Ala Glu Ala Thr Lys Ser Phe Ala370 375 380Glu Met Lys Phe Asp Asp Leu Val Thr Arg Thr Ile Asp Gly Lys Thr385 390 395 400Tyr Arg Val Ser Val Cys Cys Asn Asn Leu Asp Tyr Val Lys Phe Gly405 410 415Ile Tyr Ser Glu Gly Asn Asn Ser Asp Thr Ala Leu Gln Glu Tyr Leu420 425 430Val Gly Glu Arg Thr Ala Leu Ala Asp Leu Pro Thr Gly Thr Val Lys435 440 445Tyr Arg Gly Thr Trp Asp Gly Val Met Tyr Ser Lys Ser Gly Ser Ala450 455 460Gly Val Glu Ser Pro Ser Asn Ser Glu Ser Gly Thr Arg Ser Leu Phe465 470 475 480Asp Val Asp Phe Val Asn Lys Lys Ile Asn Gly Lys Leu Ile Ala Asn485 490 495Asp Gly Val Glu Glu Arg Pro Met Leu Thr Leu Glu Gly Asn Leu Lys500 505 510Gly Asn Gly Phe Gly Gly Thr Ala Lys Thr Gly Asn Ser Gly Phe Asn515 520 525Leu Asp Pro Lys Ser Thr Asn Gly Gly Thr Val Gly His Ile Asn Thr530 535 540Gln Phe Glu Gly Gly Phe Tyr Gly Pro Lys Ala Thr Glu Leu Gly Gly545 550 555 560Ile Val Gln Asn Thr Glu Thr Asp Lys Asp Arg Val Ser Ile Thr Phe565 570 575Gly Gly Lys Arg Gln Ile Glu Lys580
權(quán)利要求
1．一種純化的與分離的核酸分子，該分子包含編碼溶血巴斯德氏菌運(yùn)鐵蛋白結(jié)合蛋白的序列。
2．按照權(quán)利要求1的純化的與分離的核酸分子，該分子包含編碼溶血巴斯德氏菌TbpA的序列。
3．如權(quán)利要求2所要求的純化的與分離的核酸分子，該分子編碼具有如圖22和SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)。
4．如權(quán)利要求2所要求的純化的與分離的核酸分子，該分子具有這樣的序列，該序列包括(a)如圖21和SEQ ID NO:1所示的核酸序列；b)互補(bǔ)于(a)的核酸序列；(c)至少80％同源于(a)的核酸序列；或(d)至少15個(gè)堿基，并且在嚴(yán)格雜交條件下能雜交到(a)或(b)上的(a)或(b)的片段。
5．按照權(quán)利要求1的純化的與分離的核酸分子，該分子包含編碼溶血巴斯德氏菌TbpB的序列。
6．如權(quán)利要求5所要求的純化的與分離的核酸分子，該分子編碼具有如圖24和SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)。
7．如權(quán)利要求5所要求的純化的與分離的核酸分子，該分子具有這樣的序列，該序列包括(a)如圖23和SEQ ID NO:3所示的核酸序列；b)互補(bǔ)于(a)的核酸序列；(c)至少80％同源于(a)的核酸序列；或(d)至少15個(gè)堿基，并且在嚴(yán)格雜交條件下能雜交到(a)或(b)上的(a)或(b)的片段。
8．一種天然存在的核酸分子，其特征在于其具有在嚴(yán)格雜交條件下雜交到如權(quán)利要求2所要求的純化的與分離的核酸分子上的能力。
9．一種天然存在的核酸分子，其特征在于其具有在嚴(yán)格雜交條件下雜交到如權(quán)利要求5所要求的純化的與分離的核酸分子上的能力。
10．一種寡核苷酸，其包含如權(quán)利要求2所要求的核酸分子的至少15個(gè)鄰接的堿基，該寡核苷酸的特征在于其具有在嚴(yán)格雜交條件下雜交到如權(quán)利要求2所要求的純化的與分離的核酸分子上的能力。
11．一種寡核苷酸，其包含如權(quán)利要求5所要求的核酸分子的至少15個(gè)鄰接的堿基，該寡核苷酸的特征在于其具有在嚴(yán)格雜交條件下雜交到如權(quán)利要求5所要求的純化的與分離的核酸分子上的能力。
12．一種適于轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞的重組表達(dá)載體，該載體包含如權(quán)利要求2所要求的核酸分子以及有效連接到該核酸分子上的一個(gè)或多個(gè)轉(zhuǎn)錄和翻譯元件。
13．一種適于轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞的重組表達(dá)載體，該載體包含如權(quán)利要求5所要求的核酸分子以及有效連接到該核酸分子上的一個(gè)或多個(gè)轉(zhuǎn)錄和翻譯元件。
14．一種含有如權(quán)利要求12所要求的重組表達(dá)載體的宿主細(xì)胞。
15．一種含有如權(quán)利要求13所要求的重組表達(dá)載體的宿主細(xì)胞。
16．一種純化的與分離的TbpA蛋白質(zhì)。
17．如權(quán)利要求16所要求的純化的與分離的TbpA蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)具有如圖22和SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列或其能夠結(jié)合運(yùn)鐵蛋白的片段。
18．一種純化的與分離的TbpB蛋白質(zhì)。
19．如權(quán)利要求18所要求的純化的與分離的TbpB蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)具有如圖24和SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列或其能夠結(jié)合運(yùn)鐵蛋白的片段。
20．一種用于制備TbpA蛋白質(zhì)的方法，該方法包括(a)將按照權(quán)利要求12的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)移到宿主細(xì)胞中；(b)選擇轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，使其與未轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞分離；(c)在使得TbpA可以表達(dá)條件下培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞；和(d)分離重組TbpA。
21．一種用于制備TbpB蛋白質(zhì)的方法，該方法包括(a)將按照權(quán)利要求13的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)移到宿主細(xì)胞中；(b)選擇轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，使其與未轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞分離；(c)在使得TbpB可以表達(dá)條件下培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞；和(d)分離重組TbpB。
22．一種多克隆或單克隆抗體，其具有抗TbpA或TbpB表位的特異性。
23．一種用于預(yù)防和治療由Pasteurella spp.引起的感染的疫苗，其中所說的疫苗包含免疫有效量的溶血巴斯德氏菌TbpA和TbpB中的至少一種和一種藥學(xué)上可接受的載體。
24．按照權(quán)利要求23的疫苗，其中所說的感染由溶血巴斯德氏菌引起。
25．一種用于預(yù)防和治療由Pasteurella spp.引起的感染的疫苗，其中所說的疫苗包含免疫有效量的TbpA和TbpB以及一種藥學(xué)上可接受的載體。
26．一種用于預(yù)防和治療由Pasteurella spp.引起的感染的疫苗，其中所說的疫苗包含免疫有效量的TbpB和一種藥學(xué)上可接受的載體。
27．按照權(quán)利要求26的疫苗，其中所說的TbpB具有如圖24和SEQ IDNO:4所示的氨基酸序列。
28．一種用于預(yù)防和治療由Pasteurella spp.引起的感染的疫苗，其中所說的疫苗包含免疫有效量的按照權(quán)利要求12的重組表達(dá)載體和一種藥學(xué)上可接受的載體。
29．一種用于預(yù)防和治療由Pasteurella spp.引起的感染的疫苗，其中所說的疫苗包含免疫有效量的按照權(quán)利要求13的重組表達(dá)載體和一種藥學(xué)上可接受的載體。
全文摘要
本文公開了來源于溶血巴斯德氏菌的運(yùn)鐵蛋白結(jié)合蛋白和編碼該蛋白質(zhì)的核酸分子。也公開了抗該蛋白質(zhì)的抗體。本發(fā)明也涉及包含本發(fā)明的蛋白質(zhì)的疫苗。本發(fā)明也提供了用于鑒別影響運(yùn)鐵蛋白結(jié)合到所說蛋白質(zhì)上的物質(zhì)的方法,以及用于篩選所說蛋白質(zhì)與運(yùn)鐵蛋白結(jié)合的興奮劑或拮抗劑的方法。
文檔編號(hào)A61P31/04GK1219969SQ96199846
公開日1999年6月16日 申請(qǐng)日期1996年11月29日 優(yōu)先權(quán)日1995年12月1日
發(fā)明者R·Y·C·洛, A·B·施萊維斯, A·A·波特 申請(qǐng)人:R·Y·C·洛, A·B·施萊維斯, A·A·波特