專利名稱：抗原-抗體-重組dna復(fù)合型疫苗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬疫苗領(lǐng)域。
疫苗作為預(yù)防疾病的一種手段對消滅天花及降低傳染病的發(fā)病率已有顯著的貢獻(xiàn)。治療性疫苗也已成為一種慢性細(xì)菌性和病毒性疾病的治療制劑。治療性疫苗可分為非特異性與特異性兩類。非特異性治療性疫苗(如卡介苗、短小棒狀桿菌疫苗等)通過誘生機(jī)體的非特異性免疫應(yīng)答，特別是細(xì)胞免疫，雖有部分治療效果，但其作用不強。特異性治療性疫苗可誘生機(jī)體產(chǎn)生特異性的細(xì)胞及/或體液免疫應(yīng)答，從而可清除慢性感染的微生物，治療疾病。目前已有的特異性治療疫苗可分為(1)滅活或死的全菌疫苗以特殊菌株或毒株作為疫苗株，滅活或殺死后制成。(2)重組表達(dá)抗原疫苗以基因重組方法表達(dá)一種或多種微生物抗原為疫苗。(3)嵌合疫苗以微生物特異抗原與細(xì)胞因子(干擾素或白細(xì)胞介素-2等)組建表達(dá)融合蛋白制成疫苗。(4)合成肽疫苗根據(jù)微生物的抗原表位，用人工合成肽或嵌合肽(加佐劑或細(xì)胞因子等)制備疫苗。(5)核酸(DNA或聚核苷酸)疫苗用編碼微生物保護(hù)性抗原的基因片段克隆入轉(zhuǎn)錄表達(dá)載休，用該重組核酸注入機(jī)體誘生特異性免疫應(yīng)答。迄今，尚無抗原-抗體-重組DNA復(fù)合型治療性疫苗。與本發(fā)明有關(guān)的文獻(xiàn)有(1)WEN YM etcEnhanced Immunogenicity in mice withHepatitis B Vaccine Complexed to Human Hepatitis BImmunolglobulin，Chinese Medical Journal 1994；107741；(2)Davis HL etcDNA-based immunigation induces continuoussecretion of hepatitis B surface antigen and high levels ofcirculating antibody，Human Molecular Genetics 1993；21847；(3)PCT WO95/11307，Nuleotide vector，composition containingsuch vector and vac cine for immunization against hepatitis.(4)PCT WO95/20660，Immunization by inoculation of DNAtranscription unit。
本發(fā)明的目的是提供一種由微生物抗原與抗體及重組DNA組成的治療性疫苗及其制備方法。這種復(fù)合型治療性疫苗可顯著提高機(jī)體的特異性體液與細(xì)胞免疫，通過誘生對微生物感染處于免疫狀態(tài)低下或免疫耐受者產(chǎn)生免疫應(yīng)答，可用于治療微生物的慢性或持續(xù)性感染者，如慢性病及無癥狀攜帶者。
本發(fā)明的技術(shù)方案是采用一種微生物的天然或重組抗原與相應(yīng)的特異抗體加入克隆有編碼微生物的某一種或幾種蛋白基因的重組質(zhì)粒DNA組成的復(fù)合型疫苗，其特點為微生物蛋白抗原與相應(yīng)的動物或人源免疫抗體或免疫球蛋白，在分別作不同稀釋度的方陣滴定測定方法下，測定最適比例管。根據(jù)抗原蛋白的特性和抗體親和力的不同，在37℃孵育2-4小時后，再經(jīng)12,000轉(zhuǎn)/分離心沉淀后，其上清殘存的抗原及抗體量均很低，用ELISA測定法，吸光度(A)為0.4以下即為最適抗原與抗體比例管。之后吸去上清液，在沉淀物中再加入原來該管加入量同樣量的抗原，以保證該復(fù)合物為抗原略過量，然后加入重組DNA(pCMV HBS)，該質(zhì)粒DNA是采用帶有在真核細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的調(diào)控元件，如巨細(xì)胞病毒的啟動子等，及編碼一種微生物的一種或幾種蛋白基因的重組質(zhì)粒DNA，也可以是帶有編碼其他微生物蛋白基因的重組質(zhì)粒DNA。重組基因DNA量與抗原抗體復(fù)合物中的蛋白抗原量為20-100比1。這一種復(fù)合型疫苗用于免疫機(jī)體后，可有效地誘生強的特異性細(xì)胞免疫及體液免疫，表現(xiàn)為產(chǎn)生更高的特異性IgG抗體，其亞類可包括IgG1、IgG2a、IgG2b等，特異性淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)陽性率升高，以及在特異抗原刺激下誘生機(jī)體的單核細(xì)胞產(chǎn)生更多的白細(xì)胞介素-2、r-干擾素等細(xì)胞因子。
本發(fā)明的特點為將微生物抗原與抗體與帶有編碼微生物的一種或幾種基因的重組質(zhì)粒DNA組成復(fù)合型免疫原，其優(yōu)點為(1)免疫原作為內(nèi)源性及外源性抗原兩種形式被提呈僅用抗原-抗體復(fù)合物通過抗體IgG的Fc段可增強作為外源性抗原的提呈效率，本發(fā)明在抗原-抗體復(fù)合物中加入重組質(zhì)粒DNA，則可通過質(zhì)粒DNA被攝入細(xì)胞后，在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)所編碼的微生物抗原作為內(nèi)源性抗原提呈，這種免疫原是同時具備模擬滅活的微生物抗原疫苗及模擬減毒活疫苗特性的一種新型疫苗。(2)更有效地誘生體液與細(xì)胞免疫抗原-抗體復(fù)合物較單純抗原可誘生更高滴度的抗體及淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)，但是重組DNA直接免疫可誘生特異性T殺傷性細(xì)胞活性及釋放更多的淋巴因子。二者相加后可更有效地使機(jī)體產(chǎn)生體液與細(xì)胞免疫。(3)誘生免疫應(yīng)答的速度快用核酸疫苗免疫后，需經(jīng)機(jī)體內(nèi)表達(dá)抗原后被抗原提呈細(xì)胞加工，用抗原-抗體復(fù)合物作為載體，可以迅速地攜帶核酸疫苗進(jìn)入抗原提呈細(xì)胞，加速誘生抗體及特異性細(xì)胞免疫，因此比單獨采用重組DNA免疫更有效。(4)可組成多價疫苗有些微生物疫苗制備時或因難以獲得穩(wěn)定、有效的核酸疫苗，或因培養(yǎng)微生物條件苛刻，難以大量制備疫苗，利用一種容易獲得的微生物抗原-抗體為復(fù)合物加入數(shù)種多價核酸質(zhì)粒DNA，可有效地組建數(shù)種微生物疫苗。(5)由于通過抗原-抗體復(fù)合物攜帶核酸疫苗，各種微生物抗原的用量及重組核酸的用量均可相應(yīng)減少，并可以增強重組質(zhì)粒DNA的穩(wěn)定性。(6)復(fù)合型疫苗中的抗原-抗體復(fù)合物與有抗原受體的細(xì)胞接觸后其中的質(zhì)粒DNA有更多的機(jī)會與免疫細(xì)胞接觸，可吸引多種免疫細(xì)胞，更有利于重組核酸的抗原表達(dá)。(7)由于抗原-抗體復(fù)合物加入重組核酸后，后者相對穩(wěn)定，不僅可用于注射免疫，還可用于呼吸道粘膜.生殖道粘膜等局部免疫，擴(kuò)大疫苗的使用途徑。
本發(fā)明通過以下步驟制備抗原-抗體-重組DNA復(fù)合型疫苗(以乙肝病毒為例)(1)先用重組表達(dá)或血源純化的乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)與重組表達(dá)的相應(yīng)抗體(抗-HBs)或動物免疫血清或人源的含抗HBs的高效價免疫球蛋白(HBIG)，以HBsAg 0.5-5微克/毫升蛋白量與至少含有200-400國際單位抗HBs的HBIG或抗-HBs效價為1∶1600-12800(ELISA法)，0.5-5微克/毫升的蛋白量組建成抗原-抗體復(fù)合物；(2)將上述兩種成份各自從1∶50起作5倍系列稀釋，用ELISA進(jìn)行方陣式滴定，各管經(jīng)37℃孵育2小時后置4℃12-20小時，經(jīng)12,000轉(zhuǎn)/分離心30分鐘，吸出上清液分別測定游離的HBsAg及抗HBs。在方陣滴定中，選擇殘余HBsAg及抗HBs量均用ELISA測定為吸光度＜0.4，則確定為最適比例管，吸去該管上清液后，再加入原加入該管量相同量的HBsAg懸浮沉淀物；(3)擴(kuò)增并提取、克隆有編碼HBsAg基因，用含有巨細(xì)胞病毒早期啟動子及克隆有乙肝病毒S基因的真核細(xì)胞表達(dá)載體質(zhì)粒DNA，經(jīng)用Qiagen柱純化，獲得純度高的重組質(zhì)粒DNA，在上述懸浮的HBsAg-抗HBs復(fù)合管中緩慢滴入上述重組質(zhì)粒DNA，根據(jù)HBsAg量，按20-100倍加入質(zhì)粒DNA。(4)根據(jù)需要，加入氫氧化鋁為佐劑，經(jīng)無菌、安全、 毒性實驗合格后可作為治療性疫苗。
本發(fā)明實施例與效果實施例一對小鼠進(jìn)行HBsAg，HBsAg-HBIG及HBsAg-HBIG-重組帶HBs編碼基因的質(zhì)粒DNA的體液免疫應(yīng)答實驗，結(jié)果顯示，HBsAg-HBIG-重組質(zhì)粒DNA免疫小鼠的抗體陽性率高，抗體效價亦高于其他對照組。
取血源純化的抗原HBsAg 27.5ug，加入經(jīng)1∶30稀釋后的效價ELISA為1∶3200的鼠抗HBs47ul，制成抗原-抗體復(fù)合物后，在其中加入帶有編碼HBs基因及CMV啟動子的重組質(zhì)粒DNA100ug，對8組，每組6只，共48只Balb/c小鼠，分別進(jìn)行不同劑量肌肉注射后，定期采血清用ELISA試劑盒測抗-HBs效價，8周后再加強注射一次，結(jié)果顯示，抗原-抗體-重組DNA作為免疫原，抗體出現(xiàn)早、效價高，加氫氧化鋁佐劑后尤為明顯，單純空載體DNA無誘生抗體活性，單純抗原及單純抗體免疫組鼠產(chǎn)生抗體的能力或為無，或為極低。
表一為不同組別小鼠免疫后抗-HBs陽性率，其中在第八周后進(jìn)行第二次免疫。表二為不同組別的小鼠抗-HBs效價，其中表內(nèi)數(shù)字為該效價的陽性動物數(shù)。
表一不同組別小鼠免疫后抗-HBs陽性率(％)組別免疫成份周次46891 HBsAg0/17 832 鼠抗-HBs 0/003 重組質(zhì)粒DNA 67 67 83 804 HBsAg+鼠抗-HBs 20 60 60 1005 HBsAg+鼠抗-HBs+氫氧化鋁 100 100 100 1006 HBsAg+鼠抗-HBs+重組質(zhì)粒DNA 100 100 100 1007 HBsAg+鼠抗-HBs+重組質(zhì)粒DNA+氫氧化鋁 100 100 100 1008 空載體質(zhì)粒DNA0/00
表二不同組別小鼠抗HBs效價組別第一次免疫后 第二次免疫后≤1∶400 1∶800-1600 ≤1∶400 1∶800-1600 1∶3200-12800≥1∶256001 HBsAg 1 0 4 10 02 鼠抗-HBs 0 0 0 00 03 重組質(zhì)粒DNA5 0 3 10 04 HBsAg+鼠抗-HBs 3 0 4 10 05 HBsAg+鼠抗-HBs 2 3 0 05 0+氫氧化鋁6 HBsAg+鼠抗-HBs 2 4 0 05 0+重組質(zhì)粒DNA7 HBsAg+鼠抗-HBs 3 3 0 00 6+重組質(zhì)粒DNA+氫氧化鋁8 空載體質(zhì)粒DNA 0 0 0 00 0實施例二經(jīng)小鼠脾細(xì)胞對重組質(zhì)粒DNA-抗原抗體復(fù)合物及單純抗原的特異性細(xì)胞免疫試驗顯示，重組質(zhì)粒DNA免疫可誘導(dǎo)產(chǎn)生較抗原-抗體復(fù)合物更高更多的白介素2(IL2)。
取血漿純化的HBsAg抗原和效價ELISA為1∶3200的鼠抗HBs制成抗原抗體復(fù)合物后，加入重組質(zhì)粒DNA，對5組共30只Balb/c小鼠分別肌肉注射進(jìn)行免疫，第一組免疫原為HBsAg 1ug，第二組免疫原為相當(dāng)于含1ugHBsAg的抗原抗體復(fù)合物，第三組免疫原為重組質(zhì)粒DNA200ug，第四組免疫原為抗原-抗體-重組質(zhì)粒DNA，其中含1ug的HBsAg及200ug的重組質(zhì)粒DNA。第五組為空白載體200ug作為對照。免疫后取脾細(xì)胞培養(yǎng)，以Amersham公司生產(chǎn)的試劑盒測定上清液中白細(xì)胞介素2，結(jié)果顯示HBsAg-抗HBs-重組質(zhì)粒DNA免疫后的鼠脾細(xì)胞經(jīng)特異HBsAg誘生的IL-2量高于單用HBsAg-抗HBs復(fù)合物或單用重組質(zhì)粒DNA免疫，說明HBsAg-抗HBs-重組質(zhì)粒DNA新型疫苗可明顯提高動物的特異性細(xì)胞免疫應(yīng)答。
表三為不同組別小鼠脾細(xì)胞在特異抗原(HBsAg)刺激下誘生的白細(xì)胞介素-2。
表三不同組別小鼠脾細(xì)胞在特異抗原(HBsAg)刺激下誘生的白細(xì)胞介素-2組別 誘生IL-2pg/ml1 單獨HBsAg免疫 1112 HBsAg-抗HBs復(fù)合物 1223 重組質(zhì)粒DNA2544 HBsAg-抗HBs-重組質(zhì)粒DNA3075 空載體DNA對照 119
權(quán)利要求
1.一種復(fù)合型疫苗，其特征在于含有一種微生物抗原、其相應(yīng)抗體以及克隆有編碼相同或不相同微生物的某一種或幾種蛋白基因的重組質(zhì)粒DNA。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的疫苗，其特征在于其中的抗原為微生物重組抗原或天然抗原。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的疫苗，其特征在于其中的抗原為乙肝病毒抗原。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的疫苗，其特征在于其中的抗體為重組或經(jīng)免疫后制備的動物或人源抗體，或免疫球蛋白。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的疫苗，其特征在于其中的抗體為乙型肝炎病毒抗體。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的疫苗，其特征在于其中的重組質(zhì)粒DNA含有真核細(xì)胞表達(dá)元件，同時含有目的基因編碼相同或不相同的一種或幾種微生物的蛋白基因的質(zhì)粒DNA。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的疫苗，其特征在于其中的重組質(zhì)粒DNA為含有編碼乙肝病毒蛋白基因的重組質(zhì)粒DNA。
8.一種按權(quán)利要求1所述的復(fù)合型疫苗的制備方法，其特征在于采用下列步驟完成(1)用重組或血源純化的微生物抗原，與重組或免疫獲得的相應(yīng)多克隆或單克隆抗體，用不同稀釋度的抗原與抗體做方陣式滴定，共同在37℃孵育0.5-2小時后置4℃作用12-20小時，經(jīng)12,000轉(zhuǎn)/分離心沉淀，ELISA測定吸光度均小于0.4后，加入與第一次相同量的抗原，制成抗原一抗體復(fù)合物；(2)用真核細(xì)胞表達(dá)載體質(zhì)粒DNA，其中克隆有編碼微生物蛋白基因，經(jīng)轉(zhuǎn)化細(xì)菌后，擴(kuò)增、純化、重組質(zhì)粒DNA，按1ug抗原加入20-100ug的比例緩慢將重組質(zhì)粒DNA加入抗原-抗體復(fù)合物中，制成復(fù)合型疫苗。(3)根據(jù)需要，加入氫氧化鋁為佐劑，經(jīng)無菌、安全、毒性實驗合格后可作為疫苗使用。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的復(fù)合型疫苗制備方法，其特征在于其中抗原的稀釋度為0.5-5微克/毫升，抗體ELISA效價為1∶1600-1∶12800。
10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的復(fù)合型疫苗制備方法，其特征在于其中抗原為乙型肝炎病毒抗原。
11.根據(jù)權(quán)利要求8所述的復(fù)合型疫苗制備方法，其特征在于其中克隆有編碼的微生物蛋白基因為乙肝病毒抗原基因。
全文摘要
本發(fā)明是一種抗原-抗體-重組DNA復(fù)合型疫苗。本發(fā)明由微生物抗原-抗體與帶有編碼微生物的一種或幾種基因的重組質(zhì)粒DNA制備成復(fù)合型疫苗，通過誘生對微生物感染處于免疫應(yīng)答低下或免疫耐受者產(chǎn)生應(yīng)答，可顯著提高機(jī)體的特異性體液免疫與細(xì)胞免疫，具有抗原提呈形式多，誘生免疫應(yīng)答速度快，而且用量少，穩(wěn)定性高等特點，不僅可用于注射免疫，還可用于呼吸道粘膜等局部免疫，經(jīng)小鼠試驗，抗體陽性率和效價以及特異性細(xì)胞免疫應(yīng)答均高于對照組。
文檔編號A61P37/04GK1165035SQ9710629
公開日1997年11月19日 申請日期1997年2月26日 優(yōu)先權(quán)日1997年2月26日
發(fā)明者聞玉梅, 何麗芳, 瞿滌 申請人:上海醫(yī)科大學(xué)