專利名稱：：一種抗溶血脂質(zhì)體制劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種抗溶血脂質(zhì)體制劑，特別是一種含有腦硫脂、卵磷脂和腦苷脂類的用于治療溶血、尤其是補(bǔ)體誘導(dǎo)的溶血的脂質(zhì)體制劑。一些疾病和失調(diào)伴隨著紅細(xì)胞的溶血，例如新生兒的疾病、陣發(fā)生夜間血紅蛋白尿。如果血的選擇不很正確，溶血可能在輸血時(shí)發(fā)生，或在錯(cuò)誤血型不相容的情況下進(jìn)行骨髓移植時(shí)發(fā)生溶血。EP0394035A2公開(kāi)了糖蛋白MACIF(膜反應(yīng)復(fù)合體抑制因子)在紅細(xì)胞膜里的可溶形式用于防止溶血。近來(lái)，具有人的MACIF活性的蛋白質(zhì)從有表達(dá)載體的轉(zhuǎn)化細(xì)胞獲得，其含編碼這種蛋白質(zhì)的基因。但由于其高價(jià)和可能的副作用限制了這種蛋白質(zhì)作為治療劑的應(yīng)用。本發(fā)明的目的是提供一種抗溶血脂質(zhì)體制劑，其含有16-90wt％腦硫脂、5-70wt％卵磷脂、5-40wt％腦苷脂類和0-30wt％膽甾醇，其中腦硫脂是選自腦苷脂硫酸酯、磺基乳糖神經(jīng)酰胺、磺基半乳糖二酰基丙三醇和磺基半乳糖烷?；贾幸环N或多種。其中優(yōu)選的腦硫脂是腦苷脂硫酸酯。本發(fā)明的制劑可用下列兩步獲得i)使用商業(yè)市場(chǎng)上的類脂類或從哺乳動(dòng)物的腦或脊髓萃取的類脂類獲得具有所述成分的類脂類混合物；和ii)將所述類脂類混合物分散在等滲溶液中。制劑的50％活性(IC50)濃度是4-120μg/ml，取決于腦硫脂和其它極性類脂類的含量。但是，本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種用于制備所述抗溶血脂質(zhì)體制劑的便利方法，包括下列步驟i)均化哺乳動(dòng)物的腦或脊髓；ii)用丙酮除去水和中性類脂類；iii)用低級(jí)醇(甲醇、乙醇、異丙醇)萃取極性類脂類；iv)減壓蒸發(fā)萃取液；v)用氯仿或二氯甲烷溶解殘留物；vi)用丙酮沉淀極性類脂類；vii)重復(fù)步驟v)和vi)數(shù)次；viii)除去有機(jī)溶劑，得到類脂類混合物。用該方法獲得的類脂類混合物含18-40％腦苷脂硫酸酯、10-30％卵磷脂、15-30％腦苷脂、10-25％磷脂酰乙醇胺和其它磷脂酰絲氨酸和神經(jīng)鞘磷脂等。這種制劑的50％活性(IC50)濃度是4-15μg/ml。本發(fā)明的脂質(zhì)體制劑可用下列方法獲得。通過(guò)在氯仿、甲醇和/或乙醇中溶解含腦硫脂的極性類脂類混合物獲得抗溶血類脂類組分.除去溶劑后，加入等滲溶液。然后，類脂類制劑通過(guò)充分的振蕩和超聲波處理被均化和分散。最后，分散液用0.7μ或0.4μ的膜過(guò)濾器在無(wú)菌條件下過(guò)濾。本發(fā)明的脂質(zhì)體的尺寸小于1μ，優(yōu)選不大于0.5μ，因?yàn)檫@是靜脈內(nèi)給藥要求的。本發(fā)明的抗溶血脂質(zhì)體制劑的適應(yīng)癥如下。1)補(bǔ)體誘導(dǎo)的溶血的抑制本發(fā)明的制劑可抑制補(bǔ)體誘導(dǎo)的溶血，諸如新生兒溶血疾病、陣發(fā)性夜間血紅蛋白尿。對(duì)該溶血的有效濃度是約0.5μg/ml-20mg/ml。2)低滲溶血的抑制已知由于細(xì)胞內(nèi)外的滲透壓的不同，哺乳動(dòng)物的細(xì)胞在低滲溶液中破裂。一些感染會(huì)伴隨低滲溶血。這個(gè)制劑由于腦硫脂中的強(qiáng)酸性基團(tuán)而具有強(qiáng)的負(fù)電荷。因此，這個(gè)制劑可用于防止低滲溶血。對(duì)于這種情況有效濃度是約0.01mg/ml-0.0mg/ml。3)用于保存血液和含紅細(xì)胞的制品本制劑用于保存和處理血液和含血制品、組織或器官。該血制品可進(jìn)一步含有血液保存添加劑，例如抗凝劑和營(yíng)養(yǎng)成分。典型的添加劑包括氯化鈉、檸檬酸、檸檬酸鈉、葡萄糖、磷酸二氫鈉、甘油、葉酸、腺嘌呤和L-抗壞血酸。本發(fā)明的制劑也用作血液保存添加劑。本發(fā)明可由下列實(shí)施例更具體地說(shuō)明。但本發(fā)明的范圍不受這些實(shí)施例的限制。實(shí)施例1本實(shí)施例說(shuō)明本發(fā)明從牛脊髓制備制劑的方法。該方法適用于任何其它原料任何哺乳動(dòng)物的脊髓、任何哺乳動(dòng)物的腦和任何哺乳動(dòng)物含腦硫脂的組織。步驟1獲得含腦硫脂的類脂類混合物牛的新鮮的或速凍的脊髓(1kg)在組織粉碎機(jī)中與0.5-1L丙酮均化。處理了的脊髓置于一反應(yīng)器中，加入冷的(-10℃)丙酮(2.5L)。攪拌混合物5分鐘，然后在真空吸濾過(guò)濾器上過(guò)濾。除去丙酮溶液。殘余物被移到一個(gè)反應(yīng)器中。將冷的(-10℃)丙酮(3L)加入反應(yīng)器中，充分?jǐn)嚢?小時(shí)。殘余物在真空吸濾過(guò)濾器上過(guò)濾(丙酮萃取物2)。該工作重復(fù)一次(丙酮萃取物3)。殘余物在真空吸濾過(guò)濾器上用0.2L乙醇洗滌。丙酮萃取物2和3可用于膽甾醇的分離。殘余物置于一反應(yīng)器中。加入乙醇(3L)。在20-22℃攪拌混合物2小時(shí)。在真空吸濾過(guò)濾器上過(guò)濾殘余物。乙醇萃取物(萃取物1)置于冰箱中(-10～-20℃)。將殘余物置于一反應(yīng)器中，加入石油醚(4L)。充分?jǐn)嚢杌旌衔?小時(shí)(20～22℃)。在真空吸濾過(guò)濾器上過(guò)濾殘余物。石油醚萃取物(萃取物2)置于冰箱中(-10～-20℃)。殘余物置于一反應(yīng)器中，加入石油醚(3L)。充分?jǐn)嚢杌旌衔?小時(shí)(20～22℃)。在真空吸濾過(guò)濾器上過(guò)濾殘余物。石油醚萃取物(萃取物3)置于冰箱中(-10～-20℃)。萃取物1、2和3在35～40℃的真空中蒸干。在攪拌下將殘余物溶于0.5L氯仿。在攪拌下將丙酮(2.5L)加入到類脂類溶液中。混合物置于冰箱(0～4℃)中18小時(shí)(例如，過(guò)夜)。離心沉淀物。除去上層清液。在攪拌下將沉淀溶于氯仿(0.3L)。將丙酮(1.5L)加入類脂類溶液中?；旌衔镏糜诒?0～4℃)中18小時(shí)。離心沉淀物。除去上層清液。將沉淀溶于氯仿(0.3L)。在攪拌下將乙醇(1.2L)加入類脂類溶液中?；旌衔锉徽舭l(fā)至1/3體積?；旌衔镌诒?0～4℃)中放置18小時(shí)。離心沉淀物。除去上層清液。沉淀用0.3L氯仿溶解，在攪拌下將乙醇(1.5L)加入類脂類溶液中?；旌衔镏糜诒?0～4℃)中18小時(shí)。離心沉淀物。除去上層清液。將沉淀用0.3L氯仿溶解。在類脂類溶液中加入鹽水(0.3L)和乙醇(0.1L)?；旌匣旌衔?分鐘。在分液漏斗中分離氯仿溶液。除去水層。氯仿溶液用0.1～0.2kgNa2SO4(無(wú)水)脫水。然后將其置于冰箱(0～4℃)中2小時(shí)。過(guò)濾分離氯仿溶液。除去Na2SO4。氯仿類脂類溶液置于冰箱中(-10～-20℃)保存。測(cè)定類脂類的濃度。步驟2獲得本發(fā)明的制劑蒸發(fā)氯仿溶液，分散在鹽水(或其它等滲溶液)中直到類脂類濃度為2.6％。脂質(zhì)體的分散液通過(guò)Microfluidizer3-4次(直到恒定的0D)。將分散液滅菌。將分散液用過(guò)濾器(0.4μm)過(guò)濾。測(cè)定類脂類的最終濃度。用無(wú)菌等滲溶液將分散液稀釋到2％。在無(wú)菌條件下將制劑裝瓶。實(shí)施例2本實(shí)施例說(shuō)明用牛脊髓和豆油制備脂肪乳液形式的抗溶血成分制劑的方法。該方法適用于任何其它原料任何哺乳動(dòng)物的脊髓、任何哺乳動(dòng)物的腦和任何哺乳動(dòng)物含腦硫脂的組織，并也涉及甘油三酯任何已知類型的脂肪和油可用于本發(fā)明，但希望使用諸如豆油、玉米油、椰子油、菜油、芝麻油或花生油的食用油。所有操作在氮?dú)鈿夥罩羞M(jìn)行。步驟1獲得含腦硫脂的類脂類混合物本步驟與實(shí)施例1中的相同。步驟2獲得抗溶血?jiǎng)┑闹救橐憾褂?100份油對(duì)12-16份實(shí)施例1的制劑和25份甘油)加入到氯仿溶液中，然后蒸發(fā)，分散在鹽水(或其它等滲溶液)中直到極性類脂類濃度為2.6％。分散液通過(guò)Microfluidizer3-4次(直到恒定的OD)。將分散液滅菌。將分散液用過(guò)濾器(0.4μm)過(guò)濾。測(cè)定類脂類的最終濃度。用無(wú)菌等滲溶液將分散液稀釋到極性類脂類濃度為2％。在無(wú)菌條件下將制劑裝瓶。實(shí)施例3-6這些實(shí)施例通過(guò)對(duì)新生兒溶血疾病的作用詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明制劑對(duì)免疫溶血的抑制(在試管中)。(過(guò)程)我們使用來(lái)自有新生兒溶血疾病的兒童的紅細(xì)胞和來(lái)自他們的母親的血清。來(lái)自兒童前額小靜脈的血(1ml)被脫纖維蛋白，然后把鹽水加到紅細(xì)胞中(9ml+1ml)，輕輕攪拌混合物0.5分鐘。然后離心樣品(3分鐘，3000rpm)，潷去上層清液。該工作重復(fù)兩次，將0.9ml鹽水加入0.3ml紅細(xì)胞中。來(lái)自母親的血(3ml)在20℃靜置2小時(shí)，然后離心(3分鐘，300rpm)。血清用鹽水稀釋10倍。在實(shí)驗(yàn)中0.5ml紅細(xì)胞與0.5ml本發(fā)明制劑、0.5ml血清和0.5ml鹽水混合。在空白實(shí)驗(yàn)中0.5ml紅細(xì)胞與0.5ml血清和1.0ml鹽水混合。在光散射的控制中0.5ml制劑與0.5ml血清和1.0ml鹽水混合。為統(tǒng)計(jì)溶血比例，我們進(jìn)行全部溶血。測(cè)定所有樣品的OD418。根據(jù)下列等式計(jì)算溶血水平H＝(ODer-ODls-ODbt)×100/OD100其中ODex-OD在研究實(shí)驗(yàn)中，ODbl-OD在空白實(shí)驗(yàn)中，OD100-OD在100％溶血情況下；ODls-制劑的光學(xué)密度，稀釋到的濃度等于制劑在實(shí)驗(yàn)中的濃度(脂質(zhì)體散射的控制)。些實(shí)驗(yàn)在制劑最終濃度為0.04mg/ml、0.2mg/ml和1mg/ml時(shí)進(jìn)行。結(jié)果列于表1。在本發(fā)明不同的制劑濃度下的溶血(％)這表明在無(wú)制劑時(shí)，根據(jù)疾病的嚴(yán)重程度發(fā)生約20％-約50％的溶血。在所有情況中，在0.2mg/ml和更高的制劑濃度幾乎完全阻止了溶血的發(fā)生。實(shí)施例7-14這些實(shí)施例用在哺乳動(dòng)物(羊和兔)中的免疫溶血情況詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明制劑對(duì)溶血的抑制，并且也說(shuō)明了治療伴隨有補(bǔ)體誘導(dǎo)溶血的疾病和失調(diào)的方法。把致死量的溶血血清注入動(dòng)物體內(nèi)。將本發(fā)明的制劑(20mg/ml)在10分鐘內(nèi)靜脈注入到實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。將鹽水注入對(duì)照動(dòng)物。結(jié)果列于表2。制劑在體內(nèi)的抗溶血活性，對(duì)在動(dòng)物體內(nèi)的補(bǔ)體誘導(dǎo)溶血的抑制<tablesid="table2"num="002"><tablewidth="760">樣品號(hào)動(dòng)物重量kg動(dòng)物數(shù)量溶血血清的體積(滴度)ml每1kg動(dòng)物體重的類脂類的量mg鹽水體積ml觀察結(jié)果7兔3.524(1∶100)15.75.0虛弱，呼吸頻繁，24小時(shí)內(nèi)恢復(fù)8兔3.224(1∶100)21.25.0健康9兔4.224(1∶100)32.26.0健康10兔4.1-3.844(1∶100)06.06-16小時(shí)內(nèi)死亡11羊60215(1∶1200)14.275衰弱，呼吸頻繁，24小時(shí)內(nèi)恢復(fù)12羊63215(1∶1200)25.175健康13羊57215(1∶1200)36.870健康14羊62215(1∶1200)07036小時(shí)內(nèi)死亡</table></tables>沒(méi)有得到本發(fā)明制劑的動(dòng)物在致死量溶血血清給藥后6-36小時(shí)內(nèi)死亡。對(duì)照動(dòng)物的血膽紅素水平增至29-36μM對(duì)照動(dòng)物的紅細(xì)胞水平在4-6小時(shí)減少2倍。以14-16mg/kg給予制劑的動(dòng)物表現(xiàn)出一些失調(diào)(虛弱，呼吸頻繁，衰弱)，但它們?cè)?4小時(shí)內(nèi)恢復(fù)(實(shí)施例7，11)。在以21mg/kg或更大量給予制劑的情況下，所有動(dòng)物都健康。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的血膽紅素水平等于0，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的紅細(xì)胞水平無(wú)變化。這些實(shí)施例證明治療量為約20mg/kg體重。權(quán)利要求1一種抗溶血脂質(zhì)體制劑，含有16-90wt％腦硫脂、5-70wt％卵磷脂、5-40wt％腦苷脂類和0-30wt％膽甾醇，其中腦硫脂是選自腦苷脂硫酸酯、磺基乳糖神經(jīng)酰胺、磺基半乳糖二酰基丙三醇和磺基半乳糖烷?；贾械囊环N或多種。2按權(quán)利要求1的抗溶血脂質(zhì)體制劑，其中腦硫脂是腦苷脂硫酸酯。3一種用于制備一種抗溶血脂質(zhì)體制劑的方法，包括下列兩個(gè)步驟i)使用商業(yè)市場(chǎng)上的類脂類或從哺乳動(dòng)物的腦或脊髓萃取的類脂類獲得具有權(quán)利要求1所公開(kāi)成分的類脂類混合物；和ii)將所述類脂類混合物分散在等滲溶液中。4按權(quán)利要求3的用于制備一種抗溶血脂質(zhì)體制劑的方法，其中所述類脂類混合物由下列步驟獲得i)均化哺乳動(dòng)物的腦或脊髓；ii)用丙酮除去水和中性類脂類；iii)用低級(jí)醇(甲醇、乙醇、異丙醇)萃取極性類脂類；iv)減壓蒸發(fā)萃取液；v)用氯仿或二氯甲烷溶解殘留物；vi)用丙酮沉淀極性類脂類；vii)重復(fù)步驟v)和vi)數(shù)次；viii)除去有機(jī)溶劑，得到類脂類混合物。全文摘要發(fā)明涉及一種抗溶血脂質(zhì)體制劑,特別是一種含有16—90wt%腦硫脂、5—70wt%卵磷脂、5—40wt%腦苷脂類和0—30wt%膽甾醇的用于治療溶血、特別是補(bǔ)體誘導(dǎo)的溶血的抗溶血脂質(zhì)體制劑。文檔編號(hào)A61K31/70GK1174705SQ97115530公開(kāi)日1998年3月4日申請(qǐng)日期1997年7月11日優(yōu)先權(quán)日1996年8月26日發(fā)明者孫皓模,樸喜錫,金權(quán),樸真圭,N·N·伊瓦諾瓦,A·P·卡普倫申請(qǐng)人:東國(guó)制藥株式會(huì)社