專利名稱：維甲酰香豆素類化合物及其制備方法和含該化合物的藥物組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種維甲酰香豆素類化合物，該化合物的制備方法和含有該化合物的藥物組合物，特別是用于治療腫瘤或癌前變以及皮膚病等疾患的維甲酰香豆素類化合物，該化合物的制備方法和含有該化合物的藥物組合物。
維甲類化合物對上皮細(xì)胞生長和分化以及阻斷癌前病變或使之逆轉(zhuǎn)等都具有重要作用。徐世平等為改善維甲類化合物的性能設(shè)計(jì)合成了一系列維甲酸衍生物(藥學(xué)學(xué)報(bào)16(9)678-685(1981))其中維胺酯(RI)和維胺酸(RII)在抗致癌等方面效果良好，而且毒性較低，適合癌化學(xué)預(yù)防，治療癌前病變。蔡海英等發(fā)現(xiàn)這些化合物抗肌氨酸乙酯亞硝胺誘發(fā)的小鼠前胃癌有顯著抑制作用(藥學(xué)學(xué)報(bào)16(9)648-652(1981))。王瑞珍等發(fā)現(xiàn)這些維甲類化合物抑制食管癌細(xì)胞有顯著活性(中華腫瘤雜志5(4)243-248(1983))。杜從之等比較了維胺酯(RI)、維胺酸(RII)、維甲酸以及抗癬靈和保膚靈等維甲類化合物的毒性，發(fā)現(xiàn)RI和RII毒性較低，這表明其適合于治療癌前病變的應(yīng)用(藥學(xué)學(xué)報(bào)17333-337(1982))。宋爭平等發(fā)現(xiàn)RI和RII的誘導(dǎo)分化作用(藥學(xué)學(xué)報(bào)19576-581(1984))。韓銳等報(bào)道了RII治療癌前病變，如口腔白班、外陰白色病損、宮頸和胃粘膜不典型增生及前白血病等均有良好效果(In Vivio 4153-160(1990))。林培中等發(fā)現(xiàn)RI在林縣食管癌高風(fēng)險(xiǎn)區(qū)，對大人群食管癌前病變進(jìn)行阻斷性治療，五年使食管癌發(fā)病率下降43.2％(Proc.CAMS & PUMC5(3)121-129(1990))。在國外也有大量有關(guān)維甲類研究方面的報(bào)道。異維甲酸(保膚靈)和芳香維甲酸(抗癬靈)作為皮科用藥已經(jīng)上市。Gander等，美國專利No.4,126,693，也用上述藥物治療癌前病變。大多數(shù)維甲類藥物在病人服用時(shí)，都存在相當(dāng)?shù)亩靖弊饔?。毒副作用小的，活性往往又太低。所以需要不斷研制新的，活性高、效果好、毒副作用低的維甲類化合物，以便為臨床提供更好的藥物。Smith等，，J.Clin.Oncol.10(5)839-864(1992)綜述了維甲類化合物在治療癌癥方面的應(yīng)用，尤其是維甲酸(RA)對人早幼粒白血病(APL)的治療作用。如Blazsek等，Biomed.Pharmacother.45169-177(1991)；Degos等，Biomed.Pharmather46210-209(1992)；Castaigne等，Blood74(9)1704-1709(1990)Chomienne等，Blood76(9)1710-1717(1990)Lo Coco等，Blood77(8)1657-1659(1991)，都證明通過分化療法維甲酸類化合物可治療APL。Kizaki等，Cancer Res.403413-3425(1980)，報(bào)道維甲酸的酯、胺和酰胺在癌化學(xué)預(yù)防方面的作用。Shealy等，美國專利No.5,124,083，證明維甲酸衍生物的分化誘導(dǎo)和癌化學(xué)預(yù)防作用，并發(fā)表于J.Clin.Invest.21574-579(1991)和Loev等，美國專利No.4,532,042，都證明維甲類化合物的分化誘導(dǎo)作用。Gander，美國專利No.4,323,581，證明4-HPR治療乳腺癌前病變的作用。Nair等，Carcinogenesis12(1)65-69(1991)，證明香豆素類化合物的抗癌作用。Ishizuka等，美國專利No.5,096,924，證明取代的香豆素有抗癌作用。Marshall，等，J.Biol.Resp.Mo d.862(1989)，報(bào)道香豆素的增強(qiáng)免疫功能。如使癌癥患者的單核細(xì)胞顯著增加，因而增加抗癌能力。Preuss-Ueberschar等，Drug Res.341305-1313(1984)，證明香豆素是不致畸的。引用這些文獻(xiàn)作為本發(fā)明的參考文獻(xiàn)。
在維甲類化合物研究方面雖然取得了一定的進(jìn)展，有些已用于臨床，但還遠(yuǎn)遠(yuǎn)達(dá)不到希望的要求。一方面表現(xiàn)為具有較高活性的化合物，其毒副作用太大；另一方面毒性小的化合物其活性亦隨之降低，都難達(dá)到實(shí)際應(yīng)用的水平，特別是維甲類化合物有較強(qiáng)的致畸作用，給育齡婦女帶來諸多不便。
本發(fā)明的目的是提供一種比以前的維甲類化合物有相當(dāng)優(yōu)越性，特別是不致畸并具有抗腫瘤和誘導(dǎo)分化作用的新維甲類化合物及其藥物學(xué)上可以接受的鹽。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種含有本發(fā)明的新維甲類化合物及其藥物學(xué)上可以接受的鹽的藥物組合物。
本發(fā)明的再一個(gè)目的是提供一種用于哺乳動(dòng)物，特別是用于人的含有本發(fā)明的維甲類化合物的藥物組合物。
本發(fā)明還有一個(gè)目的是提供本發(fā)明的維甲類化合物和/或含有該化合物的組合物的合成方法。
附圖簡要說明

圖1表示本發(fā)明實(shí)施例13的化合物對DMBA/巴豆油誘發(fā)的小鼠皮膚乳頭瘤的作用結(jié)果。
圖2表示本發(fā)明實(shí)施例13的化合物對DMBA/巴豆油誘發(fā)的小鼠皮膚乳頭瘤的作用結(jié)果。
圖3表示本發(fā)明實(shí)施例13的化合物對巴豆油誘發(fā)的小鼠表皮鳥氨酸脫羧酶(ODC)的抑制作用結(jié)果。
本發(fā)明提供了一種具有抗癌和癌化學(xué)預(yù)防生物活性的維甲酰香豆素類化合物，該化合物的結(jié)構(gòu)如下式I所示
其中，R1為H、C1～C18、優(yōu)選為C1-C4烷基，芳烷基及鹵代烷基，CXYR7，其中，X為H、N、NH、C、CH、O，Y為H、N、NH、C、CH、O，Y為O或N，R7為H、鹵素、OH、C1-C18，優(yōu)選為C1-C4烷基或烷氧基，烷基或烷氧基、鹵代烷基、未取代、單取代、或多取代苯基，其中苯環(huán)上的取代基可為C1-C4烷基、鹵代烷基、烷氧基、OH、鹵素、CO2H、酯基、NO2、CF3、SO3H、NR8R9其中R8和R9相同或不同，分別獨(dú)立的地H、烷基、或環(huán)烷基及雜環(huán)等；R2為H、OH、C1～C18烷基、鹵代烷基、烷氧基，優(yōu)選為C1～C4烷基或烷氧基、未取代或取代芳基或芳烷基，苯環(huán)上的取代基與上述相同，CXYR7或OR，R為維甲?；?，X、Y和R7如上所定義；R3為H、OH、CH3，OR或CH2OR，CXYR7，其中X、Y、R和R7如上所定義；R4為H、鹵素，優(yōu)選為Cl和Br、C1～C18烷基(優(yōu)選C1-C4烷基或烷氧基)，OH，OR或CXYR7，其中X、Y、R和R7如上所定義；R5為H、C1-C18烷基或鹵代烷基、烷氧基、OR，或CXYR7，其中R、X、Y和R7如上所定義；R6為H、C1＝C18烷基或鹵代烷基、烷氧基，OR，或CXYR7，其中R、X、Y或R7如上所定義。
本發(fā)明的化合物中，R1優(yōu)選為H或COR7，其中R7為CH3、OC2H5、OH或NHR10，其中R10為H或取代苯基等。
本發(fā)明的化合物中，R2優(yōu)選為H、OR、Cl、CH3、Ph、C＝NR10、CH＝CHR10其中R和R10如以上所定義。
本發(fā)明的化合物中，R3優(yōu)選為H、OR、CO2H、CO2Et、COC12H25、CXYR7或CH2OR，其中X、Y、R和R7如以上定義。
本發(fā)明的化合物中，R4優(yōu)選為H、C2H5、CHO、COCH3、C4H9、PhCO、CO2H、Cl、Br、CH＝CHR10，其中R10如以上所定義。
本發(fā)明的化合物中，R5優(yōu)選為H、CH3、OR、CHO、CH＝NR10、CH＝CHR10，其中R和R10如以上所定義。
本發(fā)明的化合物中，R6優(yōu)選為H、CH3、OR、COCH3、CO2H、BR、CHO、CH＝NR10、CH＝CHR10，其中R和R10如以上所定義。
按照本發(fā)明，R1、R2、R3、R4、R5和R6的一些優(yōu)選組合的例子如下R1＝COCH3，R2＝R4＝R6＝H，R3＝R5＝OR，R＝維甲?；?；R1＝COCH3，R2＝R4＝R6＝H，R3＝CO2H，R5＝OR，R＝維甲?；籖1＝COCH3，R2＝R3＝R4＝H，R5＝R6＝OR，R＝維甲?；?；R1＝COCH3，R2＝R5＝R6＝H，R3＝OR，R4＝CO2H，R＝維甲?；?；R1＝COCH3，R2＝R3＝R4＝H，R5＝OR，R6＝CO2H，R＝維甲?；籖1＝COCH2，R2＝R4＝R6＝H，R3＝CO2H，R5＝OR，R＝維甲?；?；R1＝COCH3，R2＝R3＝R6＝H，R4＝Cl，R5＝OR，R＝維甲?；?。根據(jù)本發(fā)明，維甲?；幕瘜W(xué)式如下
本發(fā)明還涉及上述化合物的制備方法，該方法包括(1)由下述式(II)表示的酚類化合物與相應(yīng)化合物反應(yīng)得取代并含有羥基的香豆素類化合物(III)
其中，R1、R2、R2、R4、R5和R6如上所定義，但其中至少有一個(gè)為OH或兩個(gè)取代基同時(shí)為OH；(2)將所得到的化合物(III)與維甲酸反應(yīng)得到本發(fā)明的化合物(I)
其中，R1、R2、R3、R4、R5和R6如上所定義，R為維甲酰基。
按照本發(fā)明的方法，所述的取代并含有羥基的香豆素類化合物(III)可采用本領(lǐng)域普通技術(shù)人員公知的方法制備。
本發(fā)明的化合物具有抗癌和癌化學(xué)預(yù)防活性的一類新維甲化合物，可用于體內(nèi)和/或體外治療癌癥、癌前病變及皮膚科諸類疾病。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及含治療有效劑量的本發(fā)明維甲酰香豆素類化合物及其藥物學(xué)上可以接受的鹽的藥物組合物。
本發(fā)明的化合物的給藥途徑可是口服用藥或非口服用藥或兩者結(jié)合使用。非口服用藥的劑型可以是注射劑，各種膏劑，膜類制劑，栓劑，包埋用劑型，搽劑，以及非口服用藥的其它劑型。口服用藥的劑型例如可以是片劑，顆粒劑，膠囊，糖漿，懸浮劑，及沖劑等。所用的劑型可根據(jù)患者的癥狀，年齡，性別，治療目的，身體狀況等加以選擇。
使用本發(fā)明的化合物為活性成分制備上述劑型的藥物組合物時(shí)，可以加入本領(lǐng)域中公知的各種輔劑，例如賦形劑，結(jié)合劑，潤滑劑，崩解劑等。
賦形劑可以是制藥領(lǐng)域中常用的賦形劑，例如可以是結(jié)晶纖維素，淀粉，蔗糖，乳糖，葡萄糖，甘露醇等；結(jié)合劑可以是羥丙基纖維素，聚乙烯吡咯烷酮，等；潤滑劑例如可以是硬脂酸鎂，滑石粉等；崩解劑例如可以是羥甲基纖維素鈣等。
本發(fā)明的藥物組合物制劑可用本領(lǐng)域中公知的常規(guī)方法制備。
本發(fā)明的化合物的用量優(yōu)選為0.001-100mg/kg體重，更優(yōu)選為0.1-50mg/kg體重，特別優(yōu)選為1-10mg/Kg體重。
以下通過實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。但本發(fā)明并不限于這些實(shí)施例。
實(shí)施例1 3-乙?；?5羧基-7-維甲酰氧基香豆素的合成向安裝有電磁攪拌棒，回流冷凝管以及干燥管的100ml圓底瓶中加入0.6g(0.002摩爾)維甲酸、20ml苯以及0.12ml(0.0013摩爾)PCl3，在N2保護(hù)下室溫?cái)嚢?小時(shí)。將反應(yīng)混合物濃縮并加入到用金屬鈉處理的絕對無水乙醚中備用。
在100ml三口瓶中安裝冷凝管，加料漏斗并使其成為干燥系統(tǒng)。然后加入0.5g(0.002摩爾)3-乙?；?5-羧基-7-羥基香豆素，0.5ml無水吡啶和20ml絕對無水乙醚，在攪拌下滴加上述步驟得到的無水乙醚溶液。攪拌兩小時(shí)后，過濾收集產(chǎn)生的固體，干燥后用乙醇精制，得0.5g標(biāo)題化合物。
熔點(diǎn)158-161℃。
1H-NMR(CDCl3)；δ1.03(s，6H，1’-2CH3)；1.38-2.14(m，6H，脂環(huán)CH2)；1.71(s，3H，5’-CH3)；2.02(s，3H，9’-CH3)；2.42(s，3H，13’-CH3)；2.70(s，3H，3-COCH3)；4.76(b，1H，5-CO2H)；5.93-6.41和6.97-7.26(m，6H，維甲雙鍵氫)；7.50(d，1H，8-H)；7.85(d，1H，6-H)；9.51(s，1H，4-H)。
MS(C32H34O7＝530(M+)，282(維甲?；?，248(香豆素)，233(248-CH3)。
實(shí)施例2 3-乙酰基-5-乙氧羰基-7-維甲酰氧基香豆素的合成采用與實(shí)施例1相同的制備方法、設(shè)備及反應(yīng)條件進(jìn)行，原料采用0.56g(0.002摩爾)3-乙?；?5-乙氧羰基070羥基香豆素和0.6g(0.002摩爾)維甲酸，得到0.5g標(biāo)題化合物(經(jīng)乙醇純化)。
熔點(diǎn)162-64℃。
1H-NMR(CDCl3)；δ1.04(s，6H，1’-2CH3)；1.44(t，3H，5-酯-CH3)；1.14-2.12(m，6H，脂環(huán)CH2)；1.72(s，3H，5’-CH3)；2.03(s，3H，9’-CH3)；2.42(s，3H，13’-CH3)；2.70(s，3H，3-COCH3)；4.24(q，2H，5-酯基CH2)；5.88-6.48和6.98-7.25(m，6H，維甲雙鍵氫)；7.36(d，1H，8-H)；7.73(d，1H，6-H)；9.47(s，1H，4-H)。
MS(C34H38O7＝558(M+，近基峰)，283，276，261，233，231，175(基峰，231-28-28)。
實(shí)施例3 4-維甲酰氧基-6-叔丁基香豆素的制備采用與實(shí)施例1相同的制備方法、設(shè)備及反應(yīng)條件進(jìn)行，原料采用0.6g4-羥基-6-叔丁基香豆素和1.0g維甲酸制得0.6g標(biāo)題化合物。
熔點(diǎn)142-144℃。
1H NMR(CDCl3)δ1.05(s，6H，1’-2CH3)；1.37(s，9H，t-丁基)；1.48，1.62和2.04(m，6H，脂環(huán)CH2)；1.73(s，3H，5’-CH3)；2.05(s，3H，9’-CH3)；2.46(s，3H，13’-CH3)；6.06(s，1H，3-H)；6.16-6.52和7.16-7.26(m，6H，維甲雙鍵氫)；7.30(d，1H，Ar-H)；7.61(m，2H，Ar-H)。
MS500(M+)，282，203，175，161。
實(shí)施例4 4-維甲酰氧基-7-甲基香豆素的合成采用與實(shí)施例1相同的制備方法、設(shè)備及反應(yīng)條件進(jìn)行，原料采用0.4g4-羥基-7-甲基-香豆素和1.0g維甲酸，制得0.5g標(biāo)題化合物。
熔點(diǎn)115-117℃。
1H NMR(CDCl3)δ1.03(s，6H，1’-2CH3)；1.32-2.14(m，6H，脂環(huán)CH2)；1.731(s，3H，5’-CH3)；2.30(s，3H，9’-CH3)；2.42(s，6H，7，13’-2CH3)；5.92(s，1H，3-H)；5.96-6.50和6.92-7.26(m，6H，維甲雙鍵氫)；7.10(d，1H，Ar-H)；7.48(d，1H，Ar-H)。
MS458(M+)，430，355，321，307，282，267，175，159，147。
實(shí)施例5 4，8-二甲基-7-維甲酰氧基香豆素的合成采用與實(shí)施例1相同的制備方法、設(shè)備及反應(yīng)條件進(jìn)行。用0.57g 4，8-二甲基-7-羥基-香豆素和1.0g維甲酸制得0.5g標(biāo)題化合物。
熔點(diǎn)178-80℃。
1H NMR(CDCl3)；δ1.04(s，6H，1’-2CH3)；1.16-2.28(m，6H，脂環(huán)CH2)；1.73(s，3H，5’-CH3)；2.01(s，3H，9’-CH3)；2.28(s，3H，13’-CH3)；2.41(s，6H，4，8-2CH3)；5.99(s，1H，3-H)；6.01-6.56和6.86-7.28(m，6H，維甲雙鍵氫)；7.06(d，1H，Ar-H)；7.40(d，1H，Ar-H)。
MS472(M+)，283，190，175，161。
實(shí)施例6-45采用與實(shí)施例1相同的制備方法、設(shè)備及反應(yīng)條件，選擇相應(yīng)的原料，分別得到R1、R2、R3、R4、R5和R6為下表所示的本發(fā)明化合物。
表1
(續(xù)表1)
用已知體內(nèi)試驗(yàn)測定本發(fā)明化合物和/或組合物的抗癌活性。這些方法是已知的、普通試驗(yàn)。本發(fā)明的化合物有特定的抗癌活性。
以下是用于本發(fā)明式(I)中維甲酰香豆素類化合物的篩選方法舉例，但不限于這些。
本發(fā)明的化合物生物活性實(shí)驗(yàn)包括(不限于這些)
1)誘導(dǎo)人早幼粒白血病細(xì)胞分化；2)抑制癌細(xì)胞(MTT試驗(yàn))。
3)抑制小鼠皮膚乳頭瘤形成(包括抗致癌和抗促癌相結(jié)合的實(shí)驗(yàn))；4)抗致突作用；5)對環(huán)磷酰胺誘發(fā)的骨髓噬多染紅細(xì)胞微核形成的抑制作用；6)對巴豆油誘發(fā)的鼠耳腫脹抑制作用；7)對巴豆油誘發(fā)的小鼠表皮鳥氨酸脫羧酶(ODC)活性升高的抑制；8)對大鼠軟骨肉瘤的抑制作用；9)致畸實(shí)驗(yàn)。
無論對動(dòng)物或人所說的治療或預(yù)防作用(降低發(fā)病率)不必是完全的或根除，而是與對照化合物相比較，能給出有統(tǒng)計(jì)意義的改善(P≥0.05)，也可是對嚴(yán)重的或急性發(fā)作的癥狀有減輕作用。給藥途徑可口服和/或非腸道給藥，如皮下、靜脈、皮內(nèi)、肌注、腹膜、鼻內(nèi)、顱內(nèi)、透皮、口腔噴霧吸入等途徑，各給藥途徑可交替使用或相互配合使用。
實(shí)驗(yàn)例1維甲酰香豆素類化合物對人早幼粒白病HL-60細(xì)胞的分化誘導(dǎo)作用人早幼粒細(xì)胞(HL-60)在含有10％小牛血清、青霉素100U/ml和鏈霉素100μg/ml的RPMI-1640培養(yǎng)液中，于37℃、5％CO2溫箱中培養(yǎng)傳代。將按對數(shù)生長，濃度為1.2×105-1.4×105/ml細(xì)胞接種子含5ml培養(yǎng)液的培養(yǎng)瓶中，每組3瓶。24小時(shí)后，細(xì)胞生長濃度達(dá)2.5×105ml，實(shí)驗(yàn)組加入溶于乙醇的不同濃度的藥物，對照組加入等容量乙醇(乙醇終濃度不超過0.01％，在此濃度下，乙醇對細(xì)胞生長及分化無影響)，實(shí)驗(yàn)操作的全過程均在避光條件下進(jìn)行。每日收集給藥及對照組細(xì)胞各250μl，加入等量含0.2％NBT的(無鈣鎂)磷酸緩沖液，每ml含有TPA600mg，37℃，5％CO2溫箱中保溫三小時(shí)，加入一定量的冷磷酸緩沖液終止反應(yīng)。4℃條件下，取少量細(xì)胞計(jì)數(shù)。細(xì)胞內(nèi)有蘭紫色顆粒沉淀著為NBT反應(yīng)陽性細(xì)胞，每樣品至少檢查200個(gè)細(xì)胞，計(jì)數(shù)陽性率，并求出ED50(見表2)
表2 本發(fā)明化合物對HL-60細(xì)胞誘導(dǎo)分化實(shí)驗(yàn)結(jié)果
(續(xù)表2)
實(shí)驗(yàn)例2 本發(fā)明的化合物對HL-60細(xì)胞的細(xì)胞毒作用(MTT實(shí)驗(yàn))
將對數(shù)生長期細(xì)胞按104ml接種于96孔板中。次日棄培養(yǎng)基換含不同濃度藥物及相應(yīng)溶劑對照的培養(yǎng)基，每組設(shè)3-5個(gè)平行孔，37℃培養(yǎng)4-5天后，棄上清液，每孔加0.2ml新鮮配制含0.2mg/ml MTT的無血清培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)。小心棄上清液并加200μl DMSO溶解MTT甲簪沉淀，用微型超聲振蕩器混勻，在MR700型酶標(biāo)儀上測定570mm處的光密度值，按下式計(jì)算細(xì)胞存活率，并計(jì)算ED50(見表3)
表3 本發(fā)明化合物對HL-60細(xì)胞的MT實(shí)驗(yàn)結(jié)果
實(shí)驗(yàn)例3 抑制小鼠皮膚乳頭瘤實(shí)驗(yàn)(抗致癌和抗促癌結(jié)合實(shí)驗(yàn))昆明小鼠雌雄兼用，體重18-22g，實(shí)驗(yàn)開始前三天用脫毛劑脫去背部毛，隨機(jī)分組(見表4)，每組20只，雌雄各半。對照組于實(shí)驗(yàn)第1、7、14天以DMBA丙酮液(150μg/200μl)，每次200μl，每周2次直到實(shí)驗(yàn)結(jié)束，實(shí)驗(yàn)共進(jìn)行12周。在此期間，每周末記錄乳頭狀瘤數(shù)目和荷瘤小鼠數(shù)。全種口服不同劑量的；實(shí)施例14的化合物(10mg/Kg，20mg/Kg)和對照藥RII(40mg/Kg)。給藥組DMBA和巴豆油涂抹方法及腫瘤觀察計(jì)數(shù)方法與對照組相同。
表4 實(shí)施例13化合物對致癌和促癌結(jié)合實(shí)驗(yàn)的治療方案
實(shí)驗(yàn)結(jié)果對照組從第五周起發(fā)生皮膚乳頭狀瘤，此后小鼠腫瘤發(fā)生率及平均荷瘤數(shù)為6.75個(gè)/只?？诜o實(shí)施例14化合物組(10mg/Kg，20mg/Kg)均可使小鼠皮膚乳頭瘤發(fā)生的潛伏期延長，腫瘤發(fā)生率降低，并使小鼠平均荷瘤數(shù)明顯減少，呈一定量效關(guān)系。其效果優(yōu)于同類藥物R II(見圖1和2)。
實(shí)驗(yàn)例4 鼠耳腫脹實(shí)驗(yàn)將ICR小鼠隨機(jī)分為對照和不同劑量的給藥組。預(yù)先給小鼠口服實(shí)施例14得到的化合物，1次/日，連續(xù)三天。第三次給藥后半小時(shí)，給小鼠右耳兩面涂巴豆油溶液(含2％巴豆油，20％乙醇，73％乙醚和5％水)25μl。6小時(shí)后脫臼處死小鼠，雙耳用角膜刀打孔，耳片稱重左右耳重量之差為腫脹程度。結(jié)果見表5。
表5 實(shí)施例13化合物對巴豆油誘發(fā)的鼠耳腫脹的作用(n＝10)
*p＜0.05**p＜0.01實(shí)施例5 對巴豆油誘發(fā)的小鼠背部表皮組織鳥氨酸脫羧酶(ODC)活性升高的抑制作用雄性ICR小鼠18-22g，隨機(jī)分為空白對照組、陽性對照組和給藥組。預(yù)先給小鼠口服實(shí)施例13得到的化合物，劑量為50mg/Kg體重，1次/日，連續(xù)2天。第2次給藥后1小時(shí)，向預(yù)先脫毛的小鼠背部涂1％巴豆油丙酮液200μl。5小時(shí)后處死動(dòng)物，剪下背部皮膚，先浸于冰冷生理鹽水中，再浸入52℃熱水中30秒，最后浸入冰冷鹽水中。用手術(shù)刀刮除真皮部分，將表皮剪碎后加入適量提取液，用勻漿機(jī)在冰浴下高速勻漿化后，30,000×g離心30分鐘，所得上清液進(jìn)行蛋白含量測定和酶活性測定。酶活性單位以nmol CO2/30分/mg蛋白表示。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3所示。
實(shí)驗(yàn)例6 對移植性大鼠軟骨肉瘤的抑制作用在無菌條件下取生長良好的大鼠軟骨肉瘤剪碎，按1∶3稀釋，用16號(hào)針頭接種于60-80g Wistar大鼠腋下，0.4ml/只。次日隨機(jī)分組口服給藥，隔日一次，共給藥18次。于接種后第37天處死大鼠，剝瘤后稱瘤和體重。結(jié)果以腫瘤抑制率來評(píng)價(jià)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表6表6 實(shí)施例11化合物和維甲酸對移植性大鼠軟骨肉瘤的抑制作用
**p＜0.01實(shí)施例7 CTX引起的小鼠骨髓噬多當(dāng)染紅細(xì)胞微核形成的抑制作用雄性ICR小鼠50只，18-22g隨機(jī)分成4組；對照組不作任何處理；環(huán)磷酰胺誘變組以及兩個(gè)給藥組。給藥組預(yù)先給小鼠口服不同劑量的實(shí)施例13得到的化合物，1次/日，連續(xù)三天。第三次給藥后2小時(shí)，除對照組外均腹腔注射環(huán)磷酰胺100mg/Kg，于注射CTX后24小時(shí)、48小時(shí)和71小時(shí)，每組分別處死小鼠5只，取股骨骨髓涂片，Wright-Giemsa染色，顯微鏡下計(jì)數(shù)骨髓噬多染紅細(xì)胞(PCE)微核形成數(shù)，每只運(yùn)行計(jì)數(shù)1000個(gè)噬多染紅細(xì)胞。
預(yù)先給小鼠口服不同劑量的實(shí)施例13得到的化合物，可明顯降低CTX誘發(fā)微核形成率并呈一定量效關(guān)系(見表7)表7 實(shí)施例13化合物對CTX誘發(fā)的小鼠骨髓噬多染紅細(xì)胞微核形成的抑制(n＝5)
CTX＝環(huán)磷酰胺PCE＝ploychromadic erythrocytes**p＜0.01實(shí)驗(yàn)例8 Ames實(shí)驗(yàn)按照Ames的沙門氏菌回復(fù)突變實(shí)驗(yàn)進(jìn)行，所用菌株為TA97和TA98，實(shí)驗(yàn)采用平板摻入法，檢測系統(tǒng)含0.1ml菌液80μl不同濃度的實(shí)施例14得到的化合物，在抗致突變實(shí)驗(yàn)中，亦同時(shí)加入20μl陽性致突變物，或?qū)φ杖軇〥MSO，0.5ml PBS(pH7.4)以及0.2ml軟瓊酯。玻璃平皿倒置在37℃溫箱中培養(yǎng)48小時(shí)，然后計(jì)數(shù)細(xì)菌的回變菌落數(shù)及其致突實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表8、9和10。
表8 實(shí)施例13化合物對4-NQO誘致沙門氏菌TA97變種回復(fù)突變的作用(n＝3
>**p＜0.01
表9 實(shí)施例13化合物對紅比霉素誘致沙門氏菌TA97變種回復(fù)突變的作用(n＝3)
**p＜0.01表10 實(shí)施例13化合物對沙門氏菌變種TA97TA98的致突變實(shí)驗(yàn)(n＝3)
實(shí)驗(yàn)表明實(shí)施例13化合物有抗致突作用，而在較大劑量下本身沒有致突作用。
實(shí)驗(yàn)例9 實(shí)施例13的化合物和實(shí)施例12的化合物的致畸實(shí)驗(yàn)選擇健康、性成熟的小鼠，29±2g，按雌雄2∶1(或1∶1)合籠。每天早晨檢查雌鼠陰栓，以發(fā)現(xiàn)精子的一天為受孕的0天(D0)。將孕鼠隨機(jī)分配到各實(shí)驗(yàn)組和對照組中。孕鼠分組單籠飼養(yǎng)，雄鼠則每晚放入雌鼠籠中交配，得每組積有15-20只時(shí)停止交配。每只孕鼠均于妊娠第7天起灌胃給藥40mg/Kg和20mg/Kg兩個(gè)劑量，對照藥為RA每日一次，連續(xù)10天。正常對照組給等量生理鹽水。孕鼠自D0起每隔三天稱體重一次，根據(jù)體重變化調(diào)整給藥量。陽性對照組給維甲酸10mg/Kg。于分娩前(D18)采用脊椎脫臼法處死母鼠，剖腹，打開子宮，取出活胎鼠，并記錄吸收胎數(shù)。觀察胎鼠外形，并稱窩重。將胎鼠隨機(jī)分成兩部分，一部分用Bouins氏液固定，適時(shí)切片檢查內(nèi)臟。另一部分用95％乙醇固定，經(jīng)茜素紅染色，脫色及透明等過程，檢查骨骼發(fā)育情況，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表11和表12。表11實(shí)施例13和12的化合物的致畸實(shí)驗(yàn)(對吸收胎的影響)(n＝10)
*p＜0.001表12實(shí)施例13和12的化合物對胎鼠骨骼和內(nèi)臟的影響(n＝10)
*p＜0.00權(quán)利要求
1.一種由下式I表示的維甲酰香豆素類化合物及其藥物學(xué)上可接受的鹽
(I)式中，R1為H、C1-C18的烷基、芳烷基及鹵代烷基、CXYT7，其中X為H、N、NH、C、CH、O，Y為H、N、NH、C、CH、O，XY為O，R7為H、鹵素、OH、C1-C18烷基、鹵代烷基、烷氧基、酯基、未取代、單取代、或多取代的苯基，其中苯環(huán)上的取代基可為C1-C4烷基、鹵代烷基、烷氧基、OH、鹵素、CO2H、酯基、NO2、CF3、SO3H、NR8R9，其中R8和R9相同和不相同，分別獨(dú)立的為H、烷基、環(huán)烷基和兩者形成雜環(huán)等；R2為H、C1-C18的烷基、鹵代烷基、烷氧基、酯基、鹵素、OH、苯基或取代苯基、CXYR7、OR其中X、Y和R7如上所定義，R＝維甲?；?；R3為H、OH、CHC2OH、鹵素、C1-C18的烷基、鹵代烷基、酯基、烷氧基、OR、CH2OR或CXYR7，其中R、X、Y和R7如上所定義；R4為H、鹵素、C1-C18的烷基、鹵代烷基、烷氧基、酯基、OH、CXYR7，其中X、Y和R7如上所定義；R5為H、C1-C18烷基、鹵代烷基、烷氧基、鹵素、酯基、OR、或CXYR7，其中R7、X、Y和R如上所定義；R6為H、C1-C18烷基、鹵代烷基、烷氧基、鹵素、酯基、OH、OR、CXYR7，其中R、X、Y和R7如上所定義；
2.如權(quán)利要求1所述的化合物，其特征在于R1為H或COR7，其中R7為CH3、OC2H5、OH、NHR10，其中R10＝H或取代苯基。
3.如權(quán)利要求1所述的化合物，其特征在于R2為H、OR、Cl、CH3、ph、CH＝NR10、CH＝CHR10，其中R10如上所定義。
4.如權(quán)利要求1所述的化合物，其特征在于R3為H、CH3、CO2H、CO2Et、CO2C12H25或CH2OR，CXYR7，其中X、Y、R7和R為維甲?；?。
5.如權(quán)利要求1所述的化合物，其特征在于R4為H、CH3、CH3、COCH3、C4H9、phCO、CO2H、Cl、Br、CH＝NR10、CH＝CHR10，其中R10如上所定義。
6.如權(quán)利要求1所述的化合物，其特征在于R5為H、CH3、OR、CHO、CH＝NR10、CH＝CHR10，其中R和R10如上所定義。
7.如權(quán)利要求1所述的化合物，其特征在于R6為H、OR、COCH3、CO2H、Br、CHO、CH＝NR10、CH＝CHR10，CXYR7，其中X、Y、R7、R和R10如上所定義。
8.如權(quán)利要求1所述的化合物，其特征在于R1＝COCH3，R2＝R4＝R6＝H，R3＝R5＝OR，R＝維甲酰基。
9.如權(quán)利要求1所述的化合物，其特征在于R1＝COCH3，R2＝R4＝R6＝H、R3＝CO2H、R5＝OR，R＝維甲?；?。
10.如權(quán)利要求1所述的化合物，其特征在于R1＝COCH3，R2＝R3＝R4＝H、R5＝R6＝OR，R＝維甲酰基。
11.如權(quán)利要求1所述的化合物，其特征在于R1＝COCH3，R2＝R5＝R6＝H、R3＝OR、R5＝CO2H，R＝維甲?；?br> 12.如權(quán)利要求1所述的化合物，其特征在于R1＝COCH3，R2＝R3＝R4＝H、R6＝CO2H、R5＝OR，R＝維甲酰基。
13.如權(quán)利要求1所述的化合物，其特征在于R1＝COCH3，R2＝R4＝R6＝H、R3＝CO2H、R5＝OR，R＝維甲?；?br> 14.如權(quán)利要求1所述的化合物，其特征在于R1＝COCH3，R2＝R3＝R6＝H、R4＝C1、R5＝OR，R＝維甲?；?。
15.制備如權(quán)利要求1所說化合物的方法，其特征在于(1)由下述式(II)表示的酚類化合物與相應(yīng)化合物反應(yīng)得取代并含有羥基的香豆素類化合物(III)
其中，R1、R2、R3、R4、R5和R6如上所定義，但其中至少有一個(gè)為OH或兩個(gè)取代基同時(shí)為OH；(2)將所得到的化合物(III)與維甲酸反應(yīng)得到本發(fā)明的化合物(I)
其中，R1、R2、R3、R4、R5和R6如上所定義，R為維甲?；?。
16.含有治療有效劑量的如權(quán)利要求1所述的維甲類化合物及其藥物學(xué)上可接受的鹽的藥物組合物。
全文摘要
本發(fā)明披露了一種由下式Ⅰ表示的維甲酰香豆素類化合物及其藥物學(xué)上可接受的鹽:式中,R
文檔編號(hào)A61K31/37GK1207392SQ9711660
公開日1999年2月10日 申請日期1997年7月31日 優(yōu)先權(quán)日1997年7月31日
發(fā)明者徐世平, 韓銳, 李蘭敏, 曹西華, 徐嵩, 夏麗娟, 劉紅巖, 尤勝權(quán) 申請人:中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所