專利名稱：甾體皂甙防治老年性癡呆的用途及新的甾體皂甙的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于防治老年性癡呆(如阿爾茨海默氏癡呆、血管性癡呆及其它類型癡呆)的甾體皂甙類化合物，新的甾體皂甙類化合物，含有它們的藥物組合物。
老年性癡呆是老年人多發(fā)性疾病，是神經(jīng)病學(xué)中一組原因未明的進(jìn)行性精神功能衰退性疾患。其主要包括阿爾茨海默氏癡呆(Alzheimer＇sDisease)、血管性癡呆、混合型和其他型癡呆。據(jù)報道，國外老年性癡呆的患病率，在65歲以上的老人中占3-8％，在80歲以上的老年人中高達(dá)20％。最近上海與美國協(xié)作進(jìn)行的老年性癡呆調(diào)查結(jié)果表明，上海地區(qū)65歲以上的老人中的癡呆總患病率為4.36％。隨著社會的進(jìn)步，人類的壽命延長，世界各國將先后進(jìn)入老齡化社會，患病人數(shù)也將大大增加。老年癡呆已成為一個亟待解決的醫(yī)學(xué)和社會問題。
近年，研究開發(fā)防治老年性癡呆的藥物受到廣泛的重視?，F(xiàn)在研究開發(fā)的防治老年性癡呆的藥物主要為膽堿酯酶抑制劑(如四氫氨基吖啶、石杉堿甲)、血管擴張劑(如麥角溴煙酯)、鈣通道阻滯劑(如尼莫地平)和神經(jīng)生長因子等；雖有新藥不斷問世，但尚未得到理想的治療藥物。研究開發(fā)防治老年性癡呆的有效藥物，將具有重大的社會意義和經(jīng)濟效益。
甾體皂甙是一類由螺甾烷類化合物衍生的寡糖甙。甾體皂甙在植物界分布很廣泛，單子葉植物和雙子葉植物中均有分布，尤以薯蕷科、百合科、玄參科、菝葜科、龍舌蘭科等植物中分布較普遍，如植物穿龍薯蕷(Dioscorea nipponica Makino)、黃山藥(Dioscorea panthaica Prainet Burk)、大蒜(Allium sativum L.)、知母(Anemarrhena asphodeloidesBge.)、重樓(Paris polyphylla)、玉竹(polygonatum odoratum(Mill)Drace)、麥冬(Ophiopogon japonicus)、番麻(Agave americana L.)等。甾體皂甙以其甙元作為合成甾體避孕藥和激素類藥物的原料而著名，比其直接作為藥用更為重要。但某些甾體皂甙也具有抗腫瘤、降血糖、免疫調(diào)節(jié)、降膽固醇、抗菌、防治心血管疾病等活性，如中藥重樓中的皂甙Ⅰ和皂甙Ⅳ 對P388、L-1210、KB細(xì)胞有細(xì)胞毒作用；知母中偽原知母皂甙AⅢ和原知母皂甙AⅢ對四氫吡啶糖尿病模型和鏈脲佐菌素糖尿病模型的小鼠口服給藥有降低血糖的作用；山麥冬中的皂甙可增加小鼠的免疫功能；前蘇聯(lián)學(xué)者發(fā)現(xiàn)甾體皂甙可降低膽固醇，其中螺甾皂甙比呋甾皂甙的活性強；由于甾體皂甙能與細(xì)菌細(xì)胞膜中膽甾醇形成復(fù)合物而具抗菌活性；盾葉薯蕷水溶性皂甙可減輕心絞痛、調(diào)節(jié)新陳代謝，治療冠心病有效。
本發(fā)明的目的是提供一類新的防治老年性癡呆的藥物，其具有優(yōu)良的療效且副作用很低。
本發(fā)明人經(jīng)廣泛深入的研究，出人意料地發(fā)現(xiàn)下面式Ⅰ所代表的甾體皂甙可以擴張腦基底動脈，改善腦循環(huán)代謝；可以明顯地增加煙堿樣乙酰膽堿受體(N受體)的數(shù)量；可以促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞生長；可以清除自由基。尤其是通過SY-SY5Y及M10兩個細(xì)胞系的培養(yǎng)實驗發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明化合物能有效地增加N受體的數(shù)量，其作用強度與煙堿類似，且具有量效關(guān)系。由此該式Ⅰ化合物可用作防治癡呆藥物。本發(fā)明基于上述發(fā)現(xiàn)得以完成。
本發(fā)明第一方面涉及通式(Ⅰ)甾體皂甙化合物及其立體異構(gòu)體用于防治老年性癡呆
其中通式ⅠR1為氫，-OH,-O-Xyl,-O-Ara-Rha,-O-Fuc-Rha,-O-Ara-Rha,
或
R2為氫，-OH,-O-Fuc,-O-Rha，或-O-Glu；R3為-OH,-OCOCH3,-OCOC15H31，或氧代(=O)，或-O-Gal-O-Glu-O-Gal-Glu,-O-Glu-Glu,-O-Glu-Ara,-O-Fuc-Glu,-O-Rha,-O-Rha-Glu,-O-Glu-Glu-Glu,
-O-Glu-Rha,-O-Man-Glu,-O-Gal-Glu-Glu,
-O-Gal-Glu-Gal,
R4為氫，-OH，或-OSO3Na,R5為氫，羥基，-O-Glu，或不存在，R6為氫，OH，氧代(=O),-O-Qui-Rha，或-O-Qui-Xyl；R12為氫，-OH，或氧代(=O)；R14為氫，或-OH；R15為氫，或-OH；R22為-OH,O(CH2)nCH3,n=0～3，或不存在R23為氫，或-OH；R27為-CH3,-CH2OH，或=CH2；X為O，或NH；…表示單鍵或雙鍵，Y為-根直鍵或不存在，Z為Glu或不存在。
條件是不包括R1=R2=R4=R6=R12=R14=R15=R23=H,R3=β-OH,R5=β-H,X=O,…為單鍵，Y為一直鍵，R22不存在，Z不存在，R27為-CH3,C25為S構(gòu)型的式Ⅰ化合物。
本發(fā)明第二方面涉及的是由通式(Ⅱ)代表的新的甾體皂甙化合物
通式Ⅱ
其中5-6位虛線表示不存在雙鍵，5位為βHC25為S構(gòu)型R＇15為氫R＇2為α-OH或β-OHR＇3為
R＇22為OH，或O(CH2)nCH3,n=O～3，或R＇22不存在同時20-22位虛線表示存在雙鍵；或R＇2為氫R＇3為-O-Gal-Glu，5-6位虛線表示不存在雙鍵，5位為βHC25為S構(gòu)型R＇15為α-OH或β-OHR＇22為OH，或O(CH2)nCH3,n=0-3，或R＇22不存在同時20-22位虛線表示存在雙鍵；或R＇2為氫5-6位虛線表示存在雙鍵R＇15為氫C25為R，或S構(gòu)型R＇22為O(CH2)nCH3,n=0-3，或R＇22不存在同時20-22位虛線表示存在雙鍵R＇3為-O-Gal,-O-Glu,
本發(fā)明再一方面涉及的是用于防治老年性癡呆的藥物組合物，其包括作為活性成分的通式(Ⅰ)化合物及與其混合的藥用載體。
本發(fā)明再一方面涉及通式(Ⅰ)化合物在制備用于防治老所性癡呆藥物中的用途。
本發(fā)明再一方面涉及防治老年性癡呆的方法，該方法包括將防治有效量的通式(Ⅰ)化合物或含有它的藥物組合物給藥于需防治的宿主。


圖1表示本發(fā)明化合物Ⅲ對KCl引起的大鼠主動脈收縮的影響。
圖2表示本發(fā)明化合物Ⅲ對大鼠腦血流量的影響。
圖3表示本發(fā)明化合物Ⅲ對N受體的影響。
圖4表示本發(fā)明化合物Ⅲ對N受體的影響。
根據(jù)本發(fā)明，本發(fā)明首先涉及通式(Ⅰ)化合物及其立體異構(gòu)體用于防治老年性癡呆，
通式Ⅰ其中R1為氫，-OH,-O-β-xyl,-O-Ara-Rha,-O-Fuc-Rha,-O-Ara-Rha,
或
R2為氫，-OH,-o-Fuc,-o-Rha，或-o-Glu；R3為-OH,-OCOCH3,-OCOC15H31或氧代(=O)，或-O-Gal,-O-Glu,-O-Gal-Glu,-O-Glu-Glu,-O-Glu-Ara,-O-Fuc-Glu,-O-Rha,-O-Rha-Glu,-O-Glu-Glu-Glu,
-O-Glu-Rha,-O-Man-Glu,-O-Gal-Glu-Glu,
-O-Gal-Glu-Gal,
R4為氫，-OH，或-OSO3Na，R5為氫，羥基，-O-Glu，或不存在R6為氫，OH，氧代(=O),-O-Qui-Rha，或-O-Qui-xyl；R12為氫，-OH，或氧代(=O)；R14為氫，或-OH；R15為氫，或-OH；R22為-OH，或O(CH2)nCH3,n=0-3，或不存在；R23為氫或-OH；R27為-CH3,-CH2OH，或=CH2；X為O或NH；Y為一根直鍵或不存在，Z為Glu或不存在；…表示單鍵或雙鍵；條件為不包括R1=R2=R4=R6=R12=R14=R15=R23=H,R3為β-OH,R5為β-H,X=O,Y為一直鍵，R22不存在，Z不存在，R27為-CH3,…為單鍵，C25為S構(gòu)型的式Ⅰ化合物。
根據(jù)本發(fā)明，本發(fā)明再一方面涉及的是通式(Ⅱ)化合物
通式Ⅱ其中5-6位虛線表示不存在雙鍵，5位為βHC25為S構(gòu)型R＇15為氫R＇2為α-OH或β-OHR＇3
R＇3
R＇22為OH，或O(CH2)nCH3,n=0～3，或R＇22不存在同時20-22位虛線表示存在雙鍵；或R＇2為氫R＇3為-O-Gal-Glu5-6位虛線表示不存在雙鍵，5位為βHC25為S構(gòu)型
R＇15為α-OH或β-OHR＇22為OH，或O(CH2)nCH3,n=0-3，或R＇22不存在同時20-22位虛線表示存在雙鍵；或R＇2為氫5-6位虛線表示存在雙鍵R＇15為氫C25為R，或S構(gòu)型R＇22為O(CH2)nCH3,n=0-3，或R＇22不存在同時20-22位虛線表示存在雙鍵R＇3為-O-Gal,-O-Glu,
應(yīng)理解，通式(Ⅰ)和(Ⅱ)化合物中存在著手性碳原子，由此產(chǎn)生的通式(Ⅰ)和(Ⅱ)化合物的立體異構(gòu)體也包括在本發(fā)明通式(Ⅰ)化合物范圍內(nèi)。
在通式(Ⅰ)和(Ⅱ)中，出現(xiàn)的縮寫如下定義Glu葡萄糖(glucose)Gal半乳糖(galactose)Rha鼠李糖(rhamnose)Xyl木糖(xylose)Ara阿拉伯糖(arabinose)Fuc夫糖(fucose)Man甘露糖(mannose)Qui雞納糖(quinovose)Api芹糖(apiose)根據(jù)本發(fā)明，優(yōu)選式(Ⅰ)化合物為其中R1=R2=R4=R6=R12=R14=R15=R23=H,R3為-O-β-Gal2-β-Glu,R5=β-H,R27=-CH3,C25為S構(gòu)型，X為O,Z為-β-Glu,Y不存在，R22不存在，C20-C22位…為一個雙鍵，其它…為單鍵的化合物。
根據(jù)本發(fā)明，優(yōu)選式(Ⅰ)化合物為其中R1=R2=R4=R6=R12=R14=R15=R23=H,R3為-O-β-Glu2-β-Glu,R5=β-H,R27=-CH3,C25為S構(gòu)型，X為O,Z為-β-Glu,Y不存在，R22不存在，C20-C22位…為一個雙鍵，其它…為單鍵的化合物。
根據(jù)本發(fā)明，優(yōu)選式(Ⅰ)化合物為其中R1=R2=R4=R6=R12=R14=R15=R23=H,R22為OH,R3為-O-β-Gal2-β-Glu,R5=β-H,C25為S構(gòu)型，R27=-CH3,X為O,Z為-β-Glu,Y不存在，…為單鍵化合物。
根據(jù)本發(fā)明，優(yōu)選式(Ⅰ)化合物為其中R1=R2=R4=R6=R12=R14=R15=R23=H,R22為-OCH3,R3為-O-β-Gal2-β-Glu,R5=β-H,C25為S構(gòu)型，R27=-CH3,X為O,Z為-β-Glu,Y不存在，…為單鍵的化合物。
根據(jù)本發(fā)明，優(yōu)選式(Ⅰ)化合物為其中R1=R2=R4=R6=R12=R14=R15=R23=H,R3為
R5=α-H，R22不存在，R27=-CH3，X=OY為一根直鍵，Z不存在，…皆為單鍵，C-25位為R構(gòu)型的化合物。
根據(jù)本發(fā)明，優(yōu)選式(Ⅰ)化合物為其中R1=R2=R4=R6=R12=R14=R15=R23=H,R3為
R5=α-H,R22不存在，R27=-CH3,X=O,Y為一根直鍵，Z不存在，…皆為單鍵，C-25位為S構(gòu)型的化合物。
根據(jù)本發(fā)明(Ⅰ)化合物為其中R1=R4=R6=R12=R14=R15=R23=H,R2=-α-OH,R3為
R5=α-H,R22不存在，R27=-CH3,X=O,Y一根直鍵，…皆為單鍵，Z不存在，C-25位為R構(gòu)型的化合物。
根據(jù)本發(fā)明，優(yōu)選式(Ⅰ)化合物為其中R1=R4=R6=R12=R14=R15=R23=H,R2=α-OH,R3為
R5=α-H,R22不存在，R27=-CH3,X=O,Y為一根直鍵，…皆為單鍵，Z不存在，C-25位為S構(gòu)型化合物。
根據(jù)本發(fā)明，優(yōu)選式(Ⅰ)化合物為其中R1=R2=R4=R6=R12=R14=R15=R23=H,R3為
R22不存在，R27=-CH3,X=O,Y為一根直鍵，Z不存在，C-25位為R構(gòu)型，R5不存在，C5-6位…為一個雙鍵，其它…為單鍵的化合物。
根據(jù)本發(fā)明，優(yōu)選式(Ⅰ)化合物為其中R1=R2=R4=R6=R12=R14=R15=R23=H,R5不存在，R22不存在，R27=-CH3,R3為
X=O,Y為一根直鍵，Z不存在，C-25位為S構(gòu)型，C5-6位…為一個雙鍵，其它…為單鍵的化合物。
根據(jù)本發(fā)明，優(yōu)選式(Ⅰ)化合物為其中R1=R4=R6=R12=R14=R15=R23=H,R2=-α-OH,R3為
R22不存在，R27=-CH3,X=O,Y為-根直鍵，Z不存在，C-25位為R構(gòu)型，R5不存在，C5-6位…為一個雙鍵，其它…為單鍵的化合物。
根據(jù)本發(fā)明，優(yōu)選式(Ⅰ)化合物為其中R1=R4=R6=R12=R14=R15=R23=H,R2=α-OH,R3為
R22不存在，R27=-CH3,X=O,Y為一根直鍵，Z不存在，C-25位為S構(gòu)型，R5不存在，C5-6位…為一個雙鍵，其它…為單鍵的化合物。
根據(jù)本發(fā)明，具體優(yōu)選如下的通式(Ⅰ)化合物(25S)-26-O-β-D-吡喃葡萄糖基-22-羥基-5β-呋甾-3β、26-二醇-3-O-β-D-吡喃葡萄糖基(1→2)-β-D-吡喃半乳糖甙；(25S)-26-O-β-D-吡喃葡萄糖基-22-羥基-5β-呋甾-2β、3β、26-三醇-3-O-β-D-吡喃葡萄糖基(1→2)-β-D-吡喃半乳糖甙；(25R)-26-O-β-D-吡喃葡萄糖基-22-羥基-5-烯-呋甾-3β、26-二醇-3-O-α-L-吡喃鼠李糖基(1→2)[β-D-葡萄吡喃糖基(1→3)]-β-D-吡喃葡萄糖甙；(25R)-26-O-β-D-吡喃葡萄糖基-22-羥基-5-烯-呋甾-3β、26-二醇-3-O-α-L-吡喃鼠李糖基(1→2)[α-L-吡喃鼠李糖基(1→4)]-β-D-吡喃葡萄糖甙；(25R)-26-O-β-D-吡喃葡萄糖基-22-羥基-5-烯-呋甾-3β、26-二醇-3-O-β-D-吡喃半乳糖基(1→2)[β-D-吡喃半乳糖基(1→3)]-β-D-吡喃葡萄糖甙；(25R)-26-O-β-D-吡喃葡萄糖基-22-羥基-5-烯-呋甾-3β、26-二醇-3-O-α-L-吡喃鼠李糖基(1→2)-β-D-吡喃葡萄糖甙；(25S)-26-O-β-D-吡喃葡萄糖基-5β-呋甾-20(22)-烯-3β、26-二醇-3-O-β-D-吡喃葡萄糖基(1→2)-β-D-吡喃半乳糖甙；根據(jù)本發(fā)明，具體優(yōu)選如下的通式(Ⅱ)化合物(25S)-26-O-β-D-吡喃葡萄糖基-22-羥基-5β-呋甾-2β,3β,26-三醇-3-O-β-D-吡喃葡萄糖基(1→2)-β-D-吡喃半乳糖甙；(25S)-26-O-β-D-吡喃葡萄糖基-22-甲氧基-5β-呋甾-2β,3β,26-三醇-3-O-β-D-吡喃葡萄糖基(1→2)-β-D-吡喃半乳糖甙；(25S)-26-O-β-D-吡喃葡萄糖基-5β-呋甾-20(22)-烯-2β,3β,26-三醇-3-O-β-D-吡喃葡萄糖基(1→2)-β-D-吡喃半乳糖甙。
(25R)-26-O-β-D-吡喃葡萄糖基-22-羥基-5-烯-呋甾-3β,26-二醇-3-O-β-D-吡喃葡萄糖基(1→4)-β-D-吡喃半乳糖甙；
(25R)-26-O-β-D-吡喃葡萄糖基-22-甲氧基-5-烯-呋甾-3β,26-二醇-3-O-β-D-吡喃葡萄糖基(1→4)-β-D-吡喃半乳糖甙；(25R)-26-O-β-D吡喃葡萄糖基-5-烯-呋甾-20(22)-烯-3β,26-二醇-3-O-β-D-吡喃葡萄糖基(1→4)-β-D-吡喃半乳糖甙。
根據(jù)本發(fā)明，本發(fā)明還涉及藥物組合物，其包括作為活性成分的通式(Ⅰ)化合物或其立體異構(gòu)體及與其混合的藥用載體。
根據(jù)本發(fā)明，本發(fā)明還涉及藥物組合物，其包括作為活性成分的通式(Ⅱ)化合物及與其混合的藥用載體。
根據(jù)本發(fā)明，本發(fā)明再一方面涉及通式(Ⅰ)化合物或其立體異構(gòu)體在制備用于防治老年性癡呆疾病或癥狀的藥物中的用途。
根據(jù)本發(fā)明，本發(fā)明還涉及防治老年性癡呆疾病或癥狀的方法，其包括將治療有效量的通式(Ⅰ)化合物或其立體異構(gòu)體給藥于需治療的患者。
本發(fā)明中所用術(shù)語“老年性癡呆”是指阿耳茨海默病，血管性癡呆、混合型或其它型癡呆。
本發(fā)明的通式(Ⅰ)或通式(Ⅱ)化合物來自于植物，如知母，黃山藥，大蒜，重樓，玉竹，麥冬，番麻等。其可通過從上述植物中提取得到或通過結(jié)構(gòu)修飾得到。
由通式(Ⅰ)化合物制成的常規(guī)藥物劑型可用作藥物。所述藥物的制劑用常用的稀釋劑(例如填料、疏松填料、粘合劑、濕潤劑、崩解劑，表面活性劑、潤滑劑)或賦性劑配制。藥物制劑可以根據(jù)治療目的從各種給藥劑型中進(jìn)行選擇。一般的給藥劑型是，例如片劑、丸劑、粉劑、溶液劑、懸浮劑、乳劑、顆粒劑、膠囊、栓劑、注射用制劑(例如溶液劑、懸浮劑等)等。為了將給藥單元劑型制成片劑，可以廣泛使用本領(lǐng)域公知的各種載體。關(guān)于載體的例子是，例如賦性劑，如乳糖、白糖、氯化鈉、葡萄糖、尿素、淀粉、碳酸鈣、高嶺土、結(jié)晶纖維素、硅酸等；粘合劑，如水、乙醇、丙醇、普通糖漿、葡萄糖溶液、淀粉溶液、明膠溶液、羧甲基纖維素、紫膠、甲基纖維素、磷酸鉀、聚乙烯吡咯烷酮等；崩解劑，例如干燥淀粉、藻酸鈉、瓊脂粉、褐藻淀粉、碳酸氫鈉、碳酸鈣、聚氧乙烯山梨糖醇酐脂肪酸酯、十二烷基硫酸鈉、單硬脂酸甘油酯、淀粉、乳糖等；崩解抑制劑，例如白糖、三硬脂酸甘油酯、可可脂、氫化油等吸收促進(jìn)劑，例如季銨鹽、十二烷基硫酸鈉等；濕潤劑，例如甘油、淀粉等；吸附劑，例如淀粉、乳糖、高嶺土、膨潤土、膠體硅羧酸等；潤滑劑，例如精細(xì)滑石、硬脂酸鹽、硼酸粉、聚乙二醇等。還可以將片狀制劑進(jìn)一步制成由常規(guī)的片劑包衣所包衣的片，例如糖包衣片、明膠膜包衣片、腸溶包衣片、膜包衣片、或雙層片和多層片。為了將給藥單元制成丸劑，可以廣泛使用本領(lǐng)域公知的各種載體。關(guān)于載體的例子是，例如賦性劑，如葡萄糖、乳糖、淀粉、可可脂、氫化植物油、高嶺土、滑石等；粘合劑，如粉末狀阿拉伯膠、粉末狀黃蓍膠、明膠、乙醇等；崩解劑，如褐藻淀粉、瓊脂等。為了將給藥單元制成栓劑，可以廣泛使用本領(lǐng)域公知的各種載體。關(guān)于載體的例子是，例如聚乙二醇、可可脂、高級醇、高級醇的酯、明膠、半合成甘油酯等。為了將給藥單元制成膠囊，將有效成分通式(Ⅰ)化合物與上述的各種載體混合，并將由此得到的混合物置于硬的明膠膠囊或軟膠囊中。為了將給藥單元制成注射用制劑，將溶液劑。乳劑和懸浮劑滅菌，這些制劑最好是與血液等滲的，并且還可以使用本領(lǐng)域常用的所有稀釋劑，例如，水、乙醇、聚乙二醇、1,3-丙二醇、乙氧基化的異硬脂醇、多氧化的異硬脂醇、聚氧乙烯山梨糖醇酐脂肪酸酯等。另外，為了制備等滲注射液，可以向注射用制劑中添加適量氯化鈉、葡萄糖或甘油，此外，還可以添加常規(guī)的溶解添加劑、緩沖劑、局部麻醉劑等。此外，如需要，也可以向藥物制劑中添加著色劑、防腐劑、香料、矯味劑、甜味劑或其它材料。
在本發(fā)明的藥物制劑中，活性成分通式(Ⅰ)化合物的含量并沒有特別的限制，可以從大的范圍內(nèi)進(jìn)行適當(dāng)?shù)剡x擇。
本發(fā)明的藥物制劑的給藥方法沒有限制，可以根據(jù)劑型、病人的年齡、性別和其它條件的差異、癥狀的程度等進(jìn)行給藥。例如，片劑、丸劑、溶液劑、懸浮劑、乳劑、顆粒劑和膠囊進(jìn)行口服給藥。而注射用制劑可以單獨地或與常規(guī)的輸液用溶液(例如葡萄糖或氫基酸溶液)混合進(jìn)行血管內(nèi)給藥，如需要，可將它們單獨地進(jìn)行肌肉內(nèi)、皮內(nèi)、皮下、或腹膜內(nèi)給藥。栓劑進(jìn)行直腸給藥。
本發(fā)明的藥物制劑的劑量可以根據(jù)用途、病人的年齡、性別和其它條件的差異、癥狀的程度等進(jìn)行適當(dāng)?shù)倪x擇。
本發(fā)明通過下面實施例和藥理實驗進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)闡述，但這不意味著對本發(fā)明任何限制。
中藥知母為百合科(Liliaceae)植物知母Anemarrhenaasphodeloides Bge.的根莖，是臨床常用清熱瀉火、生津潤燥中藥。我們對知母中的甾體皂甙進(jìn)行了較系統(tǒng)的提取分離、結(jié)構(gòu)鑒定和活性研究。
實施例Ⅰ知母3Kg，以90％EtOH回流提取3次，減壓回收EtOH，得浸膏700g。浸膏加水溶解，過濾，得水溶液和水不溶部分。水溶部分濃縮，n-BuOH萃取，減壓回收n-BuOH，得浸膏90g。n-BuOH萃取物進(jìn)行硅膠柱層析，以CHCl3-MeOH-H2O(60∶35∶10下層)洗脫，每份150ml，其中極性較大的流份54-62合并，再進(jìn)行硅膠柱層析，以溶劑系統(tǒng)CHCl3-MeOH-H2O(60∶30∶10下層)、CHCl3-MeOH-H2O(55∶35∶10下層)依次洗脫，每份100ml，合并流份45-48，除溶劑得1.2g。經(jīng)制備型HPLC反復(fù)分離、純化，減壓蒸除MeOH，冰凍干燥剩余的水，得化合物Ⅰ(28.0mg)、Ⅱ(11.8mg)、Ⅲ(57.4mg)和Ⅳ(20.0mg)。
浸膏的水不溶部分用MeOH-CHCl3(1∶1)回流，溶液濃縮得干浸膏38g。此浸膏進(jìn)行硅膠柱層析，以CHCl3-MeOH-H2O溶劑系統(tǒng)洗脫，粗分為9個組分，其中組分4再進(jìn)行硅膠柱層析，以CHCl3-MeOH-H2O(60∶30∶10下層)洗脫，TLC檢查相同者合并，得13個組分(Fr.1 to Fr.13)。Fr.7中析出白色結(jié)晶，此結(jié)晶用HPLC(C18柱，MeOH-H2O(90∶10))分得物質(zhì)Ⅴ(13.0mg)和Ⅶ(11.5mg)，F(xiàn)r.9中析出的結(jié)晶用HPLC(C18柱，MeOH-H2O(80∶20))分為物質(zhì)Ⅵ(10.6mg)和Ⅷ(11.7mg)。物質(zhì)Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ、Ⅷ分別為四對差向異構(gòu)體的混合物，a為25R異構(gòu)體系列，b為25S異構(gòu)體。
Ⅰ:R3=O-Gal2-GluⅡ:R3=O-Glu2-Glu
Ⅴa:25R,R2=HⅤb:25S,R2=HⅥa:25R,R2=OHⅥb:25S,R2=OH
Ⅲ:R3-O-Gal2-Glu,R22=OHⅣ:R3=O-Gal2-Glu,R22=OCH,
Ⅶa:25R,R2=HⅦb:25S,R2=HⅧa:25R,R2=OHⅧb:25S,R2=OH
實施例Ⅱ知母2Kg，水煮提取4次，提取液減壓濃縮為流浸膏，加乙醇至含醇75％，靜置沉淀。上清液減壓回收乙醇，再用n-BuOH萃取，減壓回收n-BuOH，得干浸膏550g。n-BuOH萃取物進(jìn)行反復(fù)硅膠柱層析，以CHCl3-MeOH-H2O溶劑系統(tǒng)洗脫，TLC檢查合并含化合物Ⅲ的流份。此流份用Sephadex LH-20進(jìn)行多次純化，得化合物Ⅲ7.1g。二．結(jié)構(gòu)鑒定化合物Ⅰ白色無定形粉末，mp＞226℃(dec)。Liebermann-Burchard反應(yīng)和Molish反應(yīng)呈陽性，對Ehrlich試劑亦呈陽性反應(yīng)。IR(漫反射)cm-1:3368(OH),2925,1692(Δ20,22),1075,1039(甙鍵C-O)。1H-NMR(C5D5N)δ:0.66(3H,S,18-CH3),0.96(3H,S,19-CH3),1.01(3H,d,J=6.8Hz,27-CH3),1.60(3H,S,21-CH3),4.82(1H,d,J=7.8Hz,Glc1-H),4.92(1H,d,J=7.8Hz,Gal1-H),5.27(1H,d,J=7.8Hz,Glc1-H),2.46(1H,d,J=10.3Hz,17-H)。13C-NMR譜數(shù)據(jù)見表1?；衔铫駷?25S)-26-O-β-D-葡萄吡喃糖基-5β-呋甾-20(22)-烯-3β、26-二醇-3-O-β-D-葡萄吡喃糖基(1→2)-β-D-吡喃半乳糖甙(知母皂甙B)。
化合物Ⅱ白色無定形粉末，mp＞212℃(dec)。Liebermann-Burchard反應(yīng)和Molish反應(yīng)呈陽性，對Ehrlich試劑亦呈陽性反應(yīng)。元素分析C45H74O18·2.5H2O，計算值(％)C57.02,H8.34；實驗值(％)C56.90,H8.03。IR(漫反射)cm-1:3354(OH),2929,2850,1691(Δ20,22),1075,1037(甙鍵C-O)。FAB-MS m/z 925(M+Na)+,903(M+H)+,741(M+H-Glc)+,579(M+H-Glc×2)+,417(M+H-Glc×3)+,399(甙元+H-H2O)+,255,185,145。EI-MS m/z 416(甙元)+,398(甙元-H2O)+,344,343,325,287,273,255,217,201,181(基峰),163,139,109,95。1H-NMR(C5D5N+D2O)δ:0.71(3H,S,18-CH3),1.01(3H,S,19-CH3),1.08(3H,d,J=6.8Hz,27-CH3),1.68(3H,S,21-CH3),2.54(1H,d,J=10.3Hz,17-H),4.86(1H,d,J=7.8Hz,Glc1-H),4.99(1H,d,J=7.3Hz,Glc1-H),5.49(1H,d,J=7.3Hz,Glc1-H)。13C-NMR譜數(shù)據(jù)見表1?；衔铫驗?25S)-26-O-β-D-葡萄吡喃糖基-5β-呋甾-20(22)-烯-3β、26-二醇-3-O-β-D-葡萄吡喃糖基(1→2)-β-D-葡萄吡喃糖甙(知母皂甙C)。
化合物Ⅲ白色無定形粉末，mp＞243℃(dec)。Liebermann-Burchard反應(yīng)和Molish反應(yīng)呈陽性，對Ehrlich試劑亦呈陽性反應(yīng)。IR(漫反射)cm-1:3348(OH),2930,2850,1075,1044(甙鍵C-O)。FAB-MS m/z 943(M+Na)+,903(M+H-H2O)+,741(M+H-H2O-Glc)+,579(M+H-H2O-Glc×2)+,417(M+H-H2O-Glc×2-Gal)+,399(甙元+H-H2O×2)+,255,185,145。EI-MS m/z 740(M-H2O-Clc)+,578(M-H2O-Glc×2)+,416(甙元-H2O)+,415(甙元-H-H2O)+,357,273,217,181,139。1H-NMR(C5D5N)δ:0.85(3H,S,18-CH3),0.96(3H,S,19-CH3),1.00(3H,d,J=6.4Hz,27-CH3),1.30(3H,d,J=6.8Hz,21-CH3),4.79(1H,d,J=7.8Hz,Glc1-H),4.90(1H,d,J=7.8Hz,Gal1-H),5.27(1H,d,J=7.8Hz,Glc1-H)。13C-NMR譜數(shù)據(jù)見表1?；衔铫鬄?25S)-26-O-β-D-葡萄吡喃糖基-22-羥基-5β-呋甾-3β、26-二醇-3-O-β-D-葡萄吡喃糖基(1→2)-β-D-半乳吡喃糖甙(prototimosaponin AⅢ)。
化合物Ⅳ白色無定形粉末，mp244℃。Liebermann-Burchard反應(yīng)和Molish反應(yīng)呈陽性，對Ehrlich試劑亦呈陽性反應(yīng)。FAB-MS m/z957(M+Na)+,933(M-H)+,903(M+H-MeOH)+,741(M+H-MeOH-Glc)+,579(M+H-MeOH-Glc×2)+,417(M+H-MeOH-Glc×2-Gal)+,399(甙元+H-MeOH-H2O)+。1H-NMR(C5D5N)δ:0.78(3H,S,18-CH3),0.95(3H,S,19-CH3),1.03(3H,d,J=6.0Hz,27-CH3),1.16(3H,d,J=6.6Hz,21-CH3),3.25(3H,s,22-OCH3),4.82(1H,d,J=7.7Hz,Glc1-H),4.90(1H,d,J=7.1Hz,Gal1-H),5.27(1H,d,J=7.7Hz Glc1-H)。13C-NMR譜數(shù)據(jù)見表1?；衔铫魹?25S)-26-O-β-D-葡萄吡喃糖基-22-甲氧基-5β-呋甾-3β、26-二醇-3-O-β-D-葡萄吡喃糖基(1→2)-β-D-半乳吡喃糖甙(知母皂甙E)。
物質(zhì)Ⅴ 白色無定形粉末，mp271℃(dec)。Liebermann-Burchard反應(yīng)和Molish反應(yīng)呈陽性，對Ehrl ich試劑呈陰性反應(yīng)。IRνmaxcm-1:3394,2930,1070,988,919,896,847.FAB-MS(positive)m/z 1057(M+Na)+,1035(M+H)+,925(M-Xyl+Na)+,901(M-Xy1-H)+,87 3(M-Glc+H)+,741(M-Glc-Xy1+H)+,579(M-Xyl-Glc×2+H)+,417(aglycone+H)+,399(aglycone-H2O+H)+.EI-MS m/z 416(aglycone)+,398(aglycone-H2O)+,357,347,344,302,287,273,181,139.
Ⅴa:1H-NMR(C5D5N)δ:0.80(s,C-18CH3),0.60(s,C-19CH3),1.12(d,J=6.7Hz,C-21CH3),0.67(d,J=5.5HZ,C-27CH3),4.86(d,J=7.3Hz,Gal1-H),5.17(d,J=7.9Hz,Glc(inner)1-H),5.21(d,J=7.9Hz Xyl1-H),5.55(d,J=7.3Hz,Glc(terminal)1-H).13C-NMR譜數(shù)據(jù)見表2。化合物Ⅴa為替告皂甙元-3-O-β-D-吡喃葡萄糖基(1→2)[β-D-吡喃木糖基(1→3)]-β-D-吡喃葡萄糖基(1→4)-β-D-吡喃半乳糖甙(degalactotigonin)。
Ⅴb:1H-NMR(C5D5N)δ:0.79(s,C-18CH3),0.60(s,C-19CH3),1.12(d,J=6.7Hz,C-21CH3),1.05(d,J=7.3Hz,C-27CH3),4.86(d,J=7.3Hz,Gal1-H),5.17(d,J=7.9Hz,Glc(inner)1-H)5.21(d,J=7.9Hz Xyl1-H),5.55(d,J=7.3Hz,Glc(terminal)1-H).13C-NMR譜數(shù)據(jù)見表2。化合物Ⅴb為新替告皂甙元-3-O-β-D-吡喃葡萄糖基(1→2)[β-D-吡喃木糖基(1→3)]-β-D-吡喃葡萄糖基(1→4)-β-D-吡喃半乳糖甙(diuranthoside A)。
物質(zhì)Ⅵ白色無定形粉末，mp247℃(dec)。Liebermann-Burchard反應(yīng)和Molish反應(yīng)呈陽性，對Ehrlich試劑呈陰性反應(yīng)。IRνmaxcm-1:3408,2931,2875,1072,987,922,897,847.FAB-MS(positive)m/z1073(M+Na)+,1051(M+H)+,595(M-Xyl-Glc×2+H)+,433(aglycone+H)+,415(aglycone-H2O+H)+.EI-MS m/z 432(aglycone)+,415(aglycone-H2O+H)+,414(aglycone-H2O)+,373,363,360,342,318,303,300,289,271,139,126,115.
Ⅵa:1H-NMR(C5D5N)δ:0.78(s,C-18CH3),0.67(s,C-19CH3),1.10(d,J=6.6Hz,C-21CH3),0.67(C-27CH3),4.90(d,J=7.7Hz,Gal1-H),5.20(d,J=7.7Hz,Glc(inner)1-H),5.23(d,J=7.7Hz Xyl1-H),5.57(d,J=7.7Hz,Glc(terminal)1-H).13C-NMR譜數(shù)據(jù)見表2?；衔铫鯽為支脫皂甙元-3-O-β-D-吡喃葡萄糖基(1→2)[β-D-吡喃木糖基(1→3)]-β-D-吡喃葡萄糖基(1→4)-β-D-吡喃半乳糖基(F-gitonin)。
Ⅵb:1H-NMR(C5D5N)δ:0.77(s,C-18CH3),0.67(s,C-19CH3),1.10(d,J=6.6Hz,C-21CH3),1.05(d,J=7.1Hz,C-27CH3),4.90(d,J=7.7Hz,Gal1-H),5.20(d,J=7.7Hz,Glc(inner)1-H),5.2 3(d,J=7.7Hz Xyl1-H),5.57(d,J=7.7Hz,Glc(terminal)1-H).13C-NMR譜數(shù)據(jù)見表2?；衔铫?b為新支脫皂甙元-3-O-β-D-吡喃葡萄糖基(1→2)[β-D-吡喃木糖基(1→3)]-β-D-吡喃葡萄糖基(1→4)-β-D-吡喃半乳糖甙(知母皂甙F)。
物質(zhì)Ⅶ 白色無定形粉末，mp242℃。Liebermann-Burchard反應(yīng)和Molish反應(yīng)呈陽性，對Ehrlich試劑呈陰性反應(yīng)。IRνmaxcm-1:3394,2934,1069,985,919,896,847.FAB-MS(positive)m/z 1055(M+Na)+,1033(M+H)+,737(M-Glc-Xyl-H)+,577(M-Xyl-Glc×2+H)+,415(aglycone+H)+,397(aglycone-H2O+H)+.EI-MS m/z 414(aglycone)+,396(aglycone-H2O)+,355,345,342,300,282,271,139.
Ⅶa:1H-NMR(C5D5N)δ:0.79(s,C-18CH3),0.85(s,C-19CH3),1.13(d,J=6.7Hz,C-21CH3),0.67(d,J=5.5HZ,C-27CH3),4.87(d,J=7.4Hz,Gal1-H),5.16(d,J=7.9Hz,Glc(inner)1-H),5.22(d,Xyl1-H),5.55(d,J=7.9Hz,Glc(terminal)1-H).13C-NMR譜數(shù)據(jù)見表2?；衔铫鱝為薯蕷皂甙元-3-O-β-D-吡喃葡萄糖基(1→2)[β-D-吡喃木糖基(1→3)]-β-D-吡喃葡萄糖基(1→4)-β-D-吡喃半乳糖甙(aspidistrin)。
Ⅶb:1H-NMR(C5D5N)δ:0.79(s,C-18CH3),0.85(s,C-19CH3),1.13(d,J=6.7Hz,C-21CH3),1.05(d,J=6.7Hz,C-27CH3),4.87(d,J=7.4Hz,Gal1-H),5.16(d,J=7.9Hz,Glc(inner)1-H)5.22(d,Xyl1-H),5.55(d,J=7.9Hz,Glc(terminal)1-H).13C-NMR譜數(shù)據(jù)見表2?；衔铫鱞為亞莫皂甙元-3-O-β-D-吡喃葡萄糖基(1→2)[β-D-吡喃木糖基(1→3)]-β-D-吡喃葡萄糖基(1→4)-β-D-吡喃半乳糖甙(3-O-β-lycotetrasoyl yamogenin)。
物質(zhì)Ⅷ 白色無定形粉末，mp258℃(dec)。Liebermann-Burchard反應(yīng)和Molish反應(yīng)呈陽性，對Ehrlich試劑呈陰性反應(yīng)。IRνmaxcm-1:3414,2940,2902,1071,988,920,895,849.FAB-MS(positive)m/z1071(M+Na)+,1049(M+H)+,855(M-Glc-H)+,753(M-Glc-Xyl-H)+,593(M-Xyl-Glc×2+H)+,431(aglycone+H)+,413(aglycone-H2O+H)+,395(aglycone-H2O×2+H)+.EI-MS m/z 430(aglycone)+,413(aglycone-H2O+H)+,412(aglycone-H2O)+,371,361,358,316,298,287,269,139,126,115.
Ⅷa:1H-NMR(C5D5N)δ:0.78(s,C-18CH3),0.91(s,C-19CH3),1.11(d,J=6.6Hz,C-21CH3),0.67(d,J=5.5Hz,C-27CH3),4.91(d,J=7.7Hz,Gal1-H),5.20(d,J=7.7Hz,Glc(inner)1-H),5.23(d,J=7.7Hz Xyl1-H),5.57(d,J=7.7Hz,Glc(terminal)1-H).13C-NMR譜數(shù)據(jù)見表2?；衔铫鴄為絲蘭皂甙元-3-O-β-D-吡喃葡萄糖基(1→2)[β-D-吡喃木糖基(1→3)]-β-D-吡喃葡萄糖基(1→4)-β-9-吡喃半乳糖甙(karatavioside A)。
Ⅷb:1H-NMR(C5D5N)δ:0.78(s,C-18CH3),0.91(s,C-19CH3),1.11(d,J=6.6Hz,C-21CH3),1.05(d,J=7.1Hz,C-27CH3),4.91(d,J=7.7Hz,Gal1-H),5.20(d,J=7.7Hz,Glc(inner)1-H),5.23(d,J=7.7Hz Xyl1-H),5.57(d,J=7.7Hz,Glc(terminal)1-H).13C-NMR譜數(shù)據(jù)見表2?；衔铫鴅為利拉皂甙元-3-O-β-D-吡喃葡萄糖基(1→2)[β-D-吡喃木糖基(1→3)]-β-D-吡喃葡萄糖基(1→4)-β-D-吡喃半乳糖甙(知母皂甙G)。表1.化合物Ⅰ-Ⅳ的13C-NMR化學(xué)位移(C5D5N)碳Ⅰ Ⅱ Ⅲ Ⅳ甙元130.930.730.930.9226.926.927.027.0375.175.275.075.2430.930.930.931.0536.936.836.936.9626.826.826.726.7726.826.826.726.7835.135.135.435.5940.140.140.240.21035.235.135.235.21121.221.321.121.01240.040.040.440.51343.843.841.241.21454.754.756.456.41531.331.332.432.11684.584.581.281.41764.664.664.064.41814.614.316.716.51924.024.024.024.020103.5 103.5 40.641.22111.811.816.416.422152.3 152.3 110.6 112.62334.434.337.130.92423.623.628.328.22533.733.634.434.42675.275.275.375.22717.117.117.417.5OCH3 47.3半乳糖或葡萄糖(3位內(nèi)側(cè))1102.6 101.9 102.5 102.5281.883.181.881.7376.978.576.976.9469.871.769.869.8576.678.276.576.6662.162.862.162.1葡萄糖(3位末端)1106.1 105.9 106.1 106.0275.577.075.575.4378.077.978.078.0471.671.571.671.7578.478.578.478.5662.762.662.762.8葡萄糖(26位)1 105.1 105.1105.1 105.02 75.2 75.2 75.275.03 78.5 78.5 78.578.64 71.6 71.6 71.671.75 78.5 78.2 78.478.46 62.7 62.8 62.762.8表2化合物Ⅴa-Ⅷb的13C-NMR化學(xué)位移(100MHz,in C5D5N)ⅤaⅤbⅥaⅥbⅦa ⅦbⅧa Ⅷb甙元137.1 45.5 37.5 45.7229.8 70.7 30.1 70.7377.4 84.2 78.3 84.4434.8 34.0 39.2 37.6544.6 44.5 141.0 140.0628.8 28.0 121.6 121.9732.3 32.1 32.3 32.1835.2 34.5 31.8 31.0954.3 54.3 50.3 50.11035.7 36.8 37.0 37.91121.2 21.4 21.1 21.11240.1 40.0 39.9 39.71340.7 40.7 40.4* 40.41456.4 56.2 56.6 56.41532.1 32.1 32.1 32.11681.181.2 81.2 81.1 81.281.11762.962.8 62.9 62.9 62.762.61816.516.3 16.616.4 16.3 16.3
1912.213.419.420.42041.942.441.942.442.042.541.942.42115.014.815.014.815.014.915.014.922109.2 109.7 109.2 109.7 109.3 109.8 109.2 109.72331.826.331.726.331.626.431.726.32429.226.129.226.229.326.229.226.12530.527.530.527.530.627.530.527.52666.865.066.865.066.965.166.865.02717.316.217.316.217.316.317.316.3半乳糖1102.4103.2 102.7 103.3273.1 72.573.172.6375.0 75.175.175.1479.8 79.379.879.2575.3 75.775.375.6660.6 60.660.660.6葡萄糖(內(nèi))1104.7104.6 104.8 104.6281.2 81.181.381.1386.7 86.986.886.9470.4 70.470.470.0578.5 78.178.678.1662.4 62.663.362.8葡萄糖(末端)1104.8104.7 104.9 104.7275.5 75.475.575.4378.5 78.478.878.4470.7 71.370.871.3577.5 78.777.678.7663.0 62.962.962.9木糖1105.0 104.9 105.1 104.9276.176.076.276.0377.777.5771 77.5471.070.4710 70.3567.267.367.367.3按實施例Ⅰ或Ⅱ的方法，由植物中得到如下所示的化合物及其光譜。1*(25S)-26-O-β-D-吡喃葡萄糖基-22-羥基-5β-呋甾-2β,3β,26-三醇-3-O-β-D-吡喃葡萄糖基(1→2)-β-D-吡喃半乳糖甙；2*(25S)-26-O-β-吡喃葡萄糖基-22-甲氧基-5β-呋甾-2β,3β,26-三醇-3-O-β-D-吡喃葡萄糖基(1→2)-β-D-吡喃半乳糖甙；3*(25S)-26-O-β-D-吡喃葡萄糖基-5β-呋甾-20(22)-烯-2β,3β,26-三醇-3-O-β-D-吡喃葡萄糖基(1→2)-β-D-吡喃半乳糖甙。
化合物1*:R22=OH,C20-C23間為一單鍵化合物2*:R22=OCH3,C20-C32間為一單鍵化合物3*:R22不存在，C20-C22間為一雙鍵13C-NMR碳1*2*3*1*2*3*140.640.640.6Gal 1106.1 106.1 106.1267.267.267.2 275.275.175.2381.881.881.8 378.178.178.1431.931.931.9 471.971.971.8536.636.636.6578.478.578.4626.626.626.6662.962.962.9726.326.326.3 Glu1103.3 103.3 103.3835.635.635.6281.781.681.7941.541.541.5377.077.077.010 37.137.137.1469.869.969.911 21.421.421.5576.976.976.912 40.440.440.0662.062.162.013 41.341.343.9 Glu1105.1 105.0 105.014 56.356.354.6(26位)2 75.275.175.215 32.432.131.3378.678.678.616 81.281.484.5471.871.771.817 64.064.464.6578.478.478.418 16.716.514.5662.962.862.919 23.924.023.920 40.741.2103.521 16.416.411.822 110.7 112.6 152.323 37.130.934.424 28.328.223.625 34.434.433.626 75.475.275.227 17.517.517.1OCH347.3FAB-MS:
1*FAB-MS m/z:919(M+H-H2O)+,7 57(M+H-H2O-Glu)+,595(M+H-H2O-Glu×2),433(M+H-H2O-Glu×2-Gal)+,415(甙元+H-H2O×2)+,271,255,1452*FAB-MS m/z:951(M+H)+,919(M+H-MeOH)+,757(M+H-MeOH-Glu)+,595(M+H-MeOH-Glu×2)+,433(M+H-MeOH-Glu×2-Gal)+,415(甙元+H-MeOH-H2O)
3*FAB-MS m/z:919(M+H)+,757(M+H-Glu)+,595(M+H-Glu×2)+,433(M+H-Glu×2-Gal)+,415(甙元+H-H2O)+1**(25R)-26-O-β-D-吡喃葡萄糖基-22-羥基-5-烯-呋甾-3β,26-二醇-3-O-β-D-吡喃葡萄糖基(1→4)-β-D-吡喃半乳糖甙；2**(25R)-26-O-β-D-吡喃葡萄糖基-22-甲氧基-5-烯-呋甾-3β,26-二醇-3-O-β-D-吡吡喃葡萄糖基(1→4)-β-D-吡喃半乳糖甙；3**(25R)-26-O-β-D-吡喃葡萄糖基-5-烯-呋甾-20(22)-烯-3β,26-二醇-3-O-β-D-吡喃葡萄糖基(1→4)-β-D-吡喃半乳糖甙。
化合物1**:R22=OH,C20-C22間為一單鍵化合物2**:R22=OCH3,C20-C22間為一單鍵化合物3**:R22不存在，C20-C22間為一雙鍵13C-NMR1**2**3**1**2**3**137.637.637.6 Gal1103.0 103.0 103.0230.430.430.4273.573.573.4378.478.478.4375.475.475.3439.439.439.4479.879.879.85141.2 141.2 141.2 575.975.875.96121.6 121.6 121.6 661.061.061.0732.432.432.4 Glu1107.0 107.1 107.0831.931.931.9275.275.275.2950.550.550.5378.478.478.210 37.237.237.2472.472.672.41121.321.321.4578.778.778.61240.140.140.0663.163.163.21340.640.643.2Glu(26位)104.6 104.9 104.711456.856.855.1275.075.175.11532.432.431.3378.378.678.31680.981.284.2471.671.971.61763.664.264.2578.078.277.91816.516.314.3662.863.162.91919.419.519.42040.640.6103.22116.216.211.622110.9 112.8 152.12337.030.934.32428.328.323.52534.234.333.42675.375.375.22717.417.217.1OCH347.4藥理實驗老年性癡呆是神經(jīng)病學(xué)中一組原因未明的進(jìn)行性精神功能衰退性疾患，其病因較復(fù)雜。發(fā)明人從多個角度觀察了知母皂甙，其中主要是化合物Ⅲ，防治老年性癡呆的活性。一．對動物腦循環(huán)代謝的影響研究開發(fā)抗癡呆藥物主要應(yīng)根據(jù)其發(fā)病機制考慮。針對血管性癡呆，我們觀察了知母皂甙對腦基底動脈的擴張作用及對整體動物腦血流的影響。1．知母皂甙的腦基底動脈擴張實驗實驗方法(1)、稱取化合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ各1mg，溶于1ml生理鹽水中，取50μl再溶于5ml生理鹽液。(2)、用新鮮腦去大腦、小腦，取基底動脈中段。(3)、調(diào)節(jié)換能器、放大器，使筆回零。(4)、將基底動脈懸掛于換能器上，浸于浴槽。
實驗結(jié)果(1)、加入化合物Ⅲ50μl后腦基底動脈輕微擴張，加入血管收縮劑KCl后未見血管收縮。(2)、在此劑量下化合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ來見明顯作用。(3)、此實驗重復(fù)兩次，均得同樣結(jié)果。
以上結(jié)果表明，化合物Ⅲ在10-5g/ml(0.01mM)濃度下具有一定的腦血管擴張作用，并拮抗收縮劑引起的腦血管收縮。此劑量比同樣實驗條件下的陽性藥川芎嗪的有效濃度還低兩個數(shù)量級。2．大鼠主動脈擴張實驗實驗方法大鼠處死，取胸主動脈，去除結(jié)締組織、血，浸入Krebs-Henseleit液，通氧，掛于換能器上，測定徑向張力。結(jié)果見圖1。
由圖1可見，化合物Ⅲ在0.04mM濃度時，亦可抑制KCl引起的大鼠主動脈的收縮。3．氫清除法測定對大鼠腦血流量的影響在離體實驗的基礎(chǔ)上，我們進(jìn)一步通過整體動物實驗，觀察了化合物Ⅲ對大鼠腦血流量的影響。
1．方法氫清除法。
2．儀器LS-Ⅲ型組織血流儀。
3．動物Wister大鼠，雄性。實驗方法步驟1．動物用10％水合氯醛麻醉，分離股總靜脈，插管。
2．用大鼠顱骨圓形開孔鉆在腦皮層頂葉部位打開一顱窗，放置氫電極。
3．動物手術(shù)完成后與血流儀、計算機連接，穩(wěn)定30min后給藥，測定，結(jié)果見下表及圖2。
化合物Ⅲ(50μg/Kg)對大鼠腦血流量(rCBF)的影響時間大鼠1大鼠2大鼠3大鼠4 rCBF平均值rCBF變化率(min)(ml/mg/(ml/mg/(ml/mg (ml/mg/ (ml/mg/min)(％)min) min) /min) min)0 114.17 130.86 144.25 135.97 131.312501 133.30 150.05 139.55 143.35 141.56257.80581010147.99 143.41 162.10 145.64 149.785014.0675920158.46 136.33 177.59 121.24 148.405013.0166630164.61 182.96 171.42 135.00 163.497524.5102340176.90 202.46 165.94 113.38 164.670025.4031450176.77 193.57 163.08 131.17 166.147526.52832結(jié)論與討論1．實驗結(jié)果顯示，化合物Ⅲ能夠增加大鼠的腦血流量，其在50μg/Kg濃度時，可使大鼠腦血流量(rCBF)增加26.5％。此結(jié)果說明化合物Ⅲ可改善腦循環(huán)代謝，對老年性癡呆，尤其是腦血管性癡呆有一定的作用。2．皂甙類化合物最大的問題是溶血問題。本實驗通過靜脈給藥，觀察到化合物Ⅲ在此有效濃度下沒有溶血作用。二．化合物Ⅲ對N受體的影響最新研究結(jié)果表明，老年性癡呆與N受體具有密切關(guān)系。80年代后期以來，眾多的實驗幾乎一致顯示，阿爾茨海默氏癡呆(AD)病人的腦組織N受體較正常人減少約50％；癡呆病人腦N受體高、低親和力結(jié)合位點比例失調(diào)，高親和力位點相對下降；AD病人外周N受體數(shù)目亦降低。煙堿可以增加N受體的數(shù)量，所以人們開始通過對煙堿的結(jié)構(gòu)改造來尋找作用于N受體的抗癡呆藥物。由于煙堿類的化合物為N受體的激動劑，具有較大的毒副作用，難以作為抗癡呆藥物應(yīng)用。通過SY-SY5Y及M10兩個細(xì)胞系，我們觀察了化合物Ⅲ對N受體的作用。
SY-SY5Y為人的神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞，它表達(dá)天然的N和M受體，而M10細(xì)胞則表達(dá)重組的雞N受體的a4b2亞型。用一系列不同濃度的化合物Ⅲ分別處理兩個細(xì)胞系，三天后測定N受體的量。結(jié)果如圖3、圖4所示。
SY-SY5Y及M10兩個細(xì)胞系的實驗結(jié)果均顯示，化合物Ⅲ能有效地增加N受體的數(shù)量，且有良好的量效關(guān)系，其作用強度與煙堿類似?；衔铫鬄槌Ｓ弥兴幹傅闹饕煞种?，一般認(rèn)為是低毒的，由此可能找到作用于N受體的非煙堿類的抗癡呆藥物。三．胚胎大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)實驗實驗方法1．取胚胎大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞做原代培養(yǎng)。
2．將細(xì)胞用不同的條件進(jìn)行培養(yǎng)，每個條件有3或5個平行孔。
3．MTT染色，測OD值。實驗結(jié)果化合物Ⅲ對胚胎大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)的作用
可見，化合物Ⅲ對胚胎大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)有一定促進(jìn)作用。四．知母皂甙的清除自由基作用自由基反應(yīng)，現(xiàn)被認(rèn)為是造成中樞神經(jīng)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)及其功能損傷的重要因素，人們也在開發(fā)一些自由基清除劑作為抗癡呆藥物。用順磁方法觀察了知母皂甙對自由基的清除作用。1、材料和方法接照Fenton反應(yīng)產(chǎn)生羥自由基(·OH):5μl 2mM FeSO4、10μl 0.8mMDMPO、加入5μl 50mM EDTA，混合后加入5μL H2O2，再加25μl雙重水或知母皂甙，混勻后立即裝入石英毛細(xì)管，1分鐘后測定。
測量在ESP300型ESR(自旋共振)波譜儀上完成。條件室溫，CF(中心磁場)=3470GS,SW(掃寬)=200GS MF(調(diào)制頻率)=25KHz,MA(調(diào)制幅度)=1GS,CT(時間常數(shù))=84S,P(功率)=10mw。
分別稱取化合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅵ、Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ、Ⅶ，加入雙蒸水配制成10mg/ml濃度，分別以1∶1(V∶V)的比例加入羥自由基體系，以同樣比例的雙蒸水作為空白對照，測定ESR波譜信號的幅度。
清除率以下式計算E(％)=(ho-hx)/ho×100ho是對照體系ESR波譜峰高，hx是加藥后對應(yīng)峰的高度。2、實驗結(jié)果知母皂甙對羥自由基的清除作用組別 濃度(mg/ml)清除率(％)對照0 0.0
Ⅰ523.3Ⅱ540.0Ⅲ556.7Ⅳ533.3Ⅴ523.3Ⅵ50.0Ⅶ5-20.0Ⅷ50.0從以上的結(jié)果可以看出，知母皂甙Ⅰ、Ⅱ 、Ⅲ、Ⅳ對羥自由基均有一定清除作用，其中化合物Ⅲ的作用最強(5mg/ml濃度下清除率為56.7％)。本實驗顯示物質(zhì)Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ、Ⅷ對·OH無清除作用，這可能與它們在水中不溶解有關(guān)?；衔铫笄宄u自由基的活性，也提示它對癡呆的防治活性。
權(quán)利要求
1．通式Ⅰ化合物及其立體異構(gòu)體用于防治老年性癡呆
通式Ⅰ其中R1為氫，-OH,-O-xyl,-O-Ara-Rha,-O-Fuc-Rha,-O-Ara-Rha,
R2為氫，-OH,-o-Fuc,-o-Rha，或-o-Glu；R3為-OH,-OCOCH3,-OCOC15H31或氧代(=O)，或-O-Gal,-O-Glu,-O-Gal-Glu,-O-Glu-Glu,-O-Glu-Ara,-O-Fuc-Glu,-O-Rha,-O-Rha-Glu,-O-Glu-Glu-Glu,
-O-Glu-Rha,-O-Man-Glu,-O-Gal-Glu-Glu,
-O-Gal-Glu-Gal,
R4為氫，-OH,-OSO3Na，R5為氫，羥基，-O-Glu，或不存在，R6為氫，OH，氧代(=O),6-O-Qui-Rha，或6-O-Qui-xyl；R12為氫，-OH，或氧代(=O)；R14為氫，或-OH；R15為氫，或-OH；R22為-OH，或O(CH2)nCH3,n=0-3，或不存在；R23為氫或-OH；R27為-CH3或-CH2OH；X為O或NH；Y為一根直鍵或不存在，…表示單鍵或雙鍵Z為Glu或不存在；條件為不包括R1=R2=R4=R6=R12=R14=R15=R23=H,R3為β-OH,R5為β-H,X=O,Y為一直鍵，R22不存在，Z不存在，R27為-CH3，…為單鍵，C25為S構(gòu)型的式Ⅰ化合物。
2．下式化合物
通式Ⅱ其中5-6位虛線表示不存在雙鍵，5位為βHC25為S構(gòu)型R＇15為氫R＇2為α-OH或β-OHR＇3為
R＇22為OH，或O(CH2)nCH3,n=0～3，或R＇22不存在同時20-22位虛線表示存在雙鍵；或R＇2為氫R＇3為-O-Gal-Glu，5-6位虛線表示不存在雙鍵，5位為βHC25為S構(gòu)型R＇15為α-OH或β-OHR＇22為OH，或O(CH2)nCH3,n=0-3，或R＇22不存在同時20-22位虛線表示存在雙鍵；或R＇2為氫5-6位虛線表示存在雙鍵R＇15為氫C25為R，或S構(gòu)型R＇22為O(CH2)nCH3,n=0-3，或R＇22不存在同時20-22位虛線表示存在雙鍵R＇3為-O-Gal,-O-Glu,
3．權(quán)利要求1的用途，其中式Ⅰ化合物為R1=R2=R4=R6=R12=R14=R15=R23=H,R3為-O-β-Gal2-β-Glu,R5=β-H,R27=-CH3,R22不存在，C25為S構(gòu)型，X為O,Z為-β-Glu,Y不存在，C20-C22位…為一個雙鍵，其它…為單鍵的化合物。
4．權(quán)利要求1的用途，其中式Ⅰ化合物為R1=R2=R4=R6=R12=R14=R15=R23=H,R3為-O-β-Glu2-β-Glu,R5=β-H,R27=-CH3,R22不存在，C25為S構(gòu)型，X為O,Z為-β-Glu,Y不存在，C20-C22位…為一個雙鍵，其它…為單鍵的化合物。
5．權(quán)利要求1的用途，其中式Ⅰ化合物為R1=R2=R4=R6=R12=R14=R15=R23=H,R22為OH,R3為-O-β-Gal2-β-Glu,R5=β-H,R27=-CH3,C25為S構(gòu)型，X為O,Z為-β-Glu,Y不存在，…為單鍵的化合物。
6．權(quán)利要求1的用途，其中式Ⅰ化合物為R1=R2=R4=R6=R12=R14=R15=R23=H,R22為-OCH3,R3為-O-β-Gal2-β-Glu,R5=β-H,R27=-CH3,C25為S構(gòu)型，X為O,Z為-β-Glu,Y不存在，…為單鍵的化合物。
7．權(quán)利要求1的用途，其中式Ⅰ化合物為R1=R2=R4=R6=R12=R14=R15=R22=R23=H,R3為
R5=α-H,R27=-CH3,R22不存在，X=O,Y為一根直鍵，Z不存在，…皆為單鍵，C-25位為R構(gòu)型的化合物。
8．權(quán)利要求1的用途，其中式Ⅰ化合物為R1=R2=R4=R6=R12=R14=R15=R23=H,R3為
R5=α-H,R27=-CH3,R22不存在，X=O,Y為一根直鍵，Z不存在，…皆為單鍵，C-25位為S構(gòu)型的化合物。
9．權(quán)利要求1的用途，其中式Ⅰ化合物為R1=R4=R6=R12=R14=R15=R22=R23=H,R2=α-OH,R3為
R22不存在，R27=-CH3,X=O,Y為一根直鍵，…皆為單鍵，Z不存在，C-25位為R構(gòu)型的化合物。
10．權(quán)利要求1的用途，其中式Ⅰ化合物為R1=R4=R6=R12=R14=R15=R23=H,R2=α-OH,R3為
R5=α-H,R22不存在，R27=-CH3,X=O,Y為一根直鍵，…皆為單鍵，Z不存在，C-25位為S構(gòu)型化合物。
11．權(quán)利要求1的用途，其中式Ⅰ化合物為R1=R2=R4=R6=R12=R14=R15=R23=H,R3為
R5不存在，R22不存在，R27=-CH3，X=O,Y為一根直鍵，Z不存在，C-25位為R構(gòu)型，C5-6位…為一個雙鍵，其它…為單鍵的化合物。
12．權(quán)利要求1的用途，其中式Ⅰ化合物為R1=R2=R4=R6=R12=R14=R15=R23=H,R3為
R5不存在，R22不存在，R27=-CH3X=O,Y為一根直鍵，Z不存在，C-25位為S構(gòu)型，C5-6位…為一個雙鍵，其它…為單鍵的化合物。
13．權(quán)利要求1的用途，其中式Ⅰ化合物為R1=R4=R6=R12=R14=R15=R23=H,R2=α-OH,R3為
R5不存在，R22不存在，R27=-CH3,X=O,Y為一根直鍵，Z不存在，C-25位為R構(gòu)型，C5-6位…為一個雙鍵，其它…為單鍵的化合物。
14．權(quán)利要求1的用途，其中式Ⅰ化合物為R1=R4=R6=R12=R14=R15=R23=H,R2=α-OH,R3為
R5不存在，R22不存在，R27=-CH3,X=O,Y為一根直鍵，Z不存在，C-25位為S構(gòu)型，C5-6位…為一個雙鍵，其它…為單鍵的化合物。
15．式Ⅰ化合物及其立體異構(gòu)體用于制備防治老年性癡呆的藥物，
通式Ⅰ式中各基團定義同權(quán)利要求1。
16．藥物組合物，其包括作為活性成分的式Ⅰ化合物及其立體異構(gòu)體和/或式Ⅱ化合物，式中各基團定義分別同權(quán)利要求1和/或權(quán)利要求2，及制藥領(lǐng)域中常用的藥用載體。
通式Ⅱ
17．權(quán)利要求1的用途，其中式Ⅰ化合物選自如下(25S)-26-O-β-D-吡喃葡萄糖基-22-羥基-5β-呋甾-3β、26-二醇-3-O-β-β-吡喃葡萄糖基(1→2)-β-D-吡喃半乳糖甙。(25S)-26-O-β-D-吡喃葡萄糖基-22-羥基-5β-呋甾-2β、3β、26-三醇-3-O-β-D-吡吡喃葡萄糖基(1→2)-β-D-吡喃半乳糖甙(25R)-26-O-β-D-吡喃葡萄糖基-22-羥基-5-烯-呋甾-3β、26-二醇-3-O-α-L-吡喃鼠李糖基(1→2)[β-D-葡萄吡喃糖基(1→3)]-β-D-吡喃葡萄糖甙。(25R)-26-O-β-D-吡喃葡萄糖基-22-羥基-5-烯-呋甾-3β、26-二醇-3-O-α-L-吡喃鼠李糖基(1→2)[α-L-吡喃鼠李糖基(1→4)]-β-D-吡喃葡萄糖甙。(25R)-26-O-β-D-吡喃葡萄糖基-22-羥基-5-烯-呋甾-3β、26-二醇-3-O-β-D-吡喃半乳糖基(1→2)[β-D-吡喃半乳糖基(1→3)]-β-D-吡喃葡萄糖甙。(25R)-26-O-β-D-吡喃葡萄糖基-22-羥基-5-烯-呋甾-3β、26-二醇-3-O-α-L-吡喃鼠李糖基(1→2)-β-D-吡喃葡萄糖甙。(25S)-26-O-β-D-吡喃葡萄糖基-5β-呋甾-20(22)-烯-3β、26-二醇-3-O-β-D-吡喃葡萄糖基(1→2)-β-D-吡喃半乳糖甙。
18．權(quán)利要求2的化合物，其選自(25S)-26-O-β-D-吡喃葡萄糖基-22-羥基-5β-呋甾-2β,3β,26-三醇-3-O-β-D-吡喃葡萄糖基(1→2)-β-D-吡喃半乳糖甙；(25S)-26-O-β-吡喃葡萄糖基-22-甲氧基-5β-呋甾-2β,3β,26-三醇-3-O-β-D-吡喃葡萄糖基(1→2)-β-D-吡喃半乳糖甙；(25S)-26-O-β-D-吡喃葡萄糖基-5β-呋甾-20(22)-烯-2β,3β,26-三醇-3-O-β-D-吡喃葡萄糖基(1→2)-β-D-吡喃半乳糖甙；(25R)-26-O-β-D-吡喃葡萄糖基-22-羥基-5-烯-呋甾-3β,26-二醇-3-O-β-D-吡喃葡萄糖基(1→4)-β-D-吡喃半乳糖甙；(25R)-26-O-β-D-吡喃葡萄糖基-22-甲氧基-5-烯-呋甾-3β,26-二醇-3-O-β-D-吡喃葡萄糖基(1→4)-β-D-吡喃半乳糖甙；(25R)-26-O-β-D-吡喃葡萄糖基-5-烯-呋甾-20(22)-烯-3β,26-二醇-3-O-β-D-吡喃葡萄糖基(1→4)-β-D-吡喃半乳糖甙。
19．防治老年癡呆的方法，其包括給需要的人類給予防治有效量的式Ⅰ化合物或其立體異構(gòu)體或權(quán)利要求15的藥物組合物。
20．權(quán)利要求1的用途，其中老年性癡呆是阿爾茨海默氏病、血管性癡呆、混合型或其它型癡呆。
全文摘要
本發(fā)明涉及式Ⅰ甾體皂甙類化合物防治老年性癡呆的用途,新的式Ⅱ甾體皂甙及含有所述式Ⅰ甾體皂甙的藥物組合物。
文檔編號A61K31/58GK1212966SQ97119680
公開日1999年4月7日 申請日期1997年9月26日 優(yōu)先權(quán)日1997年9月26日
發(fā)明者馬百平, 董俊興, 王秉伋 申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所