專利名稱：抗凝血酶－iii的生產(chǎn)方法純化方法及含該酶的制劑的制作方法
專利說明血酶-III酶萍 婕把 III酶萍裕婕捌鋼寄墾 III痛約痛目血酶-III萍誑血酶-III目枚冉傻摹 血酶-III(撕為AT-III)一2虻鞍椎塹狀血小AT-III為65,00068,000械酶蘋浴AT-III強血酶血浴 猓珹T-III血酶蘋裕葉血罨 X突罨疘X也蘋浴荼AT-III血維酶鵲酶蘋浴 些蘋通詬毓賂為佟 些緣AT-III馴斐Ｔ慣∝鄙⒀ 血(DIC)AT-III枚冉母 ?，AT-III愿鼐綴裕馴碩執(zhí)謝裕使斯潭(JP-A-63-23896玫鎩癑P-A指未蠊氈專搿 遙AT-III一執(zhí)血械牡剩一萍時要潛詰牟睢 些畬πＲ恢 0液態(tài)卻10小時牽荼AT-IIIPH68時榷模56卻6小時喪失80幕(J.Biol.chem(锘е 2463694(1971))一媯報指14.7w/v拼攏AT-III60液態(tài)卻10小時AT-III幕榷(Thrombosis Research(血栓芯)22233(1981)J.Biol.chem.25612140(1981))然0.351.5M(10.2944.12w/v)拼陸AT-III液屑時通叩泳鄄斕紸T-III謀(Vox Sang48325(1985)) 植畬σ蒼底T-III酆系諄頻椎齲裕通俅謂泄潭卮(JP-A-63-23896)水色追(JP-A-1-275600)實姆斜然潭卮砑詞掛灰冊導(dǎo)碌偷幕曰剩遙水色狀染椎目裕前宓白∽gG鵲齲俅謂寫猿去些祝紗嘶曰駛嶠低 一目峁┮窖礎(chǔ)T-IIIAT-III液態(tài)斜時榷AT-III幕圓壹AT-III謀(浠 謾酆玫鵲) ?，一目峁┤ト撅蛋AT-III鵲鵲一同時AT-III幕浴 浠八墊及一AT-IIIAT-III 裕通雍AT-III水液AT-III姆汛锏剿 些目募目模侔(a)(b)械一 (a)榷錄群AT-III水液群員旨前血酶III緣85擼壹群血酶III謀員95擼 (b)使媒脂硨珹T-III水液沾AT-III 猓ㄒ灰┭達到吮些目暮目模藥錆的捌盇T-III藥峽山艿危約選藥峽山艿濉 圖

圖1潛示越銅擁脂AT-III洗式圖 圖2潛示濃榷越銅擁脂AT-III洗式影圖 圖3潛示媒銅擁脂AT-III前HPLC-GPC圖 圖4潛示Ouchterlony械越銅擁脂拇AT-III前史圖巍 圖5潛示媒銅擁脂+未銅脂AT-III前HPLC-GPC圖 (I)原 AT-III水液(撕蟪３為AT-III水液)影血諄錚–ohn掖玫募(Fr.)II+III液IV約雍蔚血謝血VIII牟錛噸ＧＴ藏毖 通蜆こ痰確玫暮AT-III液也殺詿AT-III小 專US3,842,061(JP-A-48-35017)專US4,340,589(JP-A-54-95715)EP-A-339919(JP-A-1-275600)EP-A-551084泄舜血液血謝AT-III木宕跨，玫一牽血諧去玫牡掖IV-1IVII+III液一通筒寫 猓彩瓜 EP-A-53165(JP-W-57-500768)[鎩癑P-W指未蠊氈專搿盷蜆こ譚[EP-A-90505(JP-A-58-162529)]票AT-III (II)卻 荼卻矸ˋT-III水液說露潞說時誚卻?，露群时潜诤械牟染?。裕5070選約60卻?，时?020小時選約10小時液PH為510選6.59.0為選使說幕液械凇AT-III水液AT-III謀為10500位/ml選1200位/ml為選25100位/ml荼1位AT-III指嗟 ml血AT-IIIAT-III幕浴AT-III幕強剎模使銑傻A(chǔ)T-III圓(Test Team AT-III-2-kitDaiichi Pure chemicalsCo.Ltd)舛 址式卻恚谷碅T-III芑員為卻前85擼選95擼AT-III水液械A(chǔ)T-III謀為95擼選99摺 AT-III謀強剎模通效液色(HPLC)使0.3M然-0.05M位液(PH7.0)平G3,000SWXL(TosohCorp.)舛 為锏街蒼和等堵 卻懟 (III)榷 詒卻榷選選謝巍然啤 詒謝脂謀突蠆槐偷一元(一)元()元()選210碳原櫻為選26碳原印一元影一元(拾?、帷⒂搬、?、)元影偷脂(帷 ?、帷⑨?偷脂(帷 (綾 元(於、勸)元腔(綾結(jié)、石)元影元腔()校選蘋?、石?、?、於，为选茣?br> ?，蕜幓蔚式谢螠?巍)()謝()選魏透巍選詒謝為蘋坪疲為選啤 謝蔚姆圍選為320w/v選為310w/v為選35w/v小3w/v榷效突陸 使玫謝渭?，刹使赛S∪黃的 薌偌謝瓶AT-III謀(AT-III畝酆酆)影恰恰譴桶恰塹影恰恰恰露恰嗆圖塹影牽嗆芽恰譴影露譴山媧寄廄辭滌扒巴 N--D-前校選恰恰山媧悸肚--D-前透露譴 塹選圍1060w/v選2050w/v選2030w/v10w/v么榷效突陸60w/v么也遣模為然榷鑰苫擼染也岜蝗 然姆圍選0.53.0M為選1.02.5M選1.52.0M選1.52.0M0.5M榷效陸3.0M也遣模為然榷鑰苫擼AT-III芙曰嶠低 牽荼擁榷乇圍冢只要桑卻AT-III芑員卻前85擼卻AT-III謀時95摺 (IV) AT-III拇AT-III使媒脂AT-III裕朔詿雍AT-III水液寫AT-III時使AT-III水液脂喲未盞牟幀 AT-III水液刪械牡濃約0.15w/v一選使馴某一潭鵲AT-III水液使潭預(yù)AT-III水液?，诮液斜脂之前通?(50-70媯 30小時)AT-III水液脅畬?dǎo)o，選卻矸ㄐ 遙AT-III水液一霞時選使通透品去霞AT-III水液苑止詠脂洗印 通霞脂希曬脂(前)傻玫詒慕脂影-脂F(xiàn).F.(chelating-sepharoseF.F.)(Pharmacia)AF-chelat Toyopearl 650M(Tosoh Corp.) 脂系慕硬乇疲只要效AT-III些影銅印雍櫻喲效實慕嵌榷裕銅乇選摹 墻AT-III水液脂喲通矸 實施紙喲喲潭群痛效識選使 誚喲應(yīng)山PH6小8選6.57.7約濃為01M選0.050.5M選薌0.050.5M然頻0.1M位液(PH7.07.5)然撇潛摹為囈脂AT-III姆效剩嘶液屑卓拾?、味?，慚 卓為20mM佟 使斜時訓(xùn)AT-III水液應(yīng)誚脂希同(同液展液2攏然未)平狻Ｚ篈T-III水液械屎AT-III瓤傻玫慕脂一裕每4mlAT-III水液使約1ml脂萁脂拇小煽洗省 使矸ㄐ筆 攏使AT-III水液同平慕脂喲然幕液諍AT-III水液械屎AT-III瓤傻誚喲時洌 通山喲101小時愎凰 ?，某些拢涌蓮慕脂漏漏?涌椎乇去紓ㄊ刮聰接抵 姆EDTA霞然透姆 殺舜AT-III喜實住AT-IIIAT-III酆齲通一苫酶叨卻AT-III ?，要锏侥磕渴官Q(mào)娣接巾法煤水曰為牟宕法一舜AT-III (V) 粘玫品山畬 蟣痙AT-III藥萍藥萍影水液液投萍通選藥峽山艿蛹(稀強壯約)希猿娣絞狡斃┮┥白⒆T-III藥AT-III萍藥通注注液萍懈藥 /虼炕AT-IIIAT-III缺失血栓傻坪桶AT-III緯傻散血血酆(DIC) 通每1,0003,000位(2060位/kg)矢藥AT-III薟同洹⒇≈⒆慈磕幣灰 萍誆蘋DIC時選藥為每4060位/kg亍選液萍透壓撕投锘殲底刺 (VI)效 液狀態(tài)AT-III畈∈盇T-III幕鑰AT-III謀(謀邸酆系)殺伲紗耍醫(yī)學(xué)嵌榷裕票懈叨勸全院枚鵲AT-III ?，荼拇AT-III水液實綴捅緣AT-III約卻緯傻木酆殺效去紗絲苫酶甙全緣AT-III遙詿聿節(jié)茨Ｔ 業(yè) 為藥萍AT-III裕峁 全緣AT-III藥萍 實施員爍為細牽些實施魏畏式票實玫原蝦頭攏 原蝦頭 (1)AT-III原 舜玫原通濃CohnsII+III液蚣斗IV液票模眉霉潭液605啤2MNaCl30山媧稼糚H7.8錄10小時脅畬?dǎo)o。
(2)詿色 -脂F(xiàn).F.(Pharmacia)AF-chelate Toyopearl 650M(TosohCorp.)色濉 (3)AT-III圓舛ㄊ 通銑傻鋟ㄊ筍-2238脅舛⊿2238玫姆應(yīng)止液歉Test Team AT-III-2-kit(Daiichi Pure Chemicals Co.Ltd)系摹一(20mg)S-2238芙21ml水小血酶液(1.2U/ml)Green Cross Corpoation謀準AT-III液(1U/ml)杉薟-40麓牛使時煤40mM Tris60mM EDTA0.14M NaCl0.2HSA(血椎)2.4U/ml丶PH8.4液呀品110mU/ml一荻50l品100l血酶液停375印牛100l液筒確5櫻然?，?000l應(yīng)止梅應(yīng)405nm虜舛ㄒ喝Ｊ姑弊糀T-III液瞥謀準直嘸品AT-III浴 卻每AT-III品AT-III芑[U/ml液(ml)]卻前AT-IIL芑之鵲陌俜始為AT-III圓剩示詒1 (4)AT-III然 通舛科稟280nm(撕為A280)碌燃品械牡玫A(chǔ)T-III猿緣每品謀然(U/A280)示詒1 (5)HPLC 通G3000 SWXL(7.8mm30mmTosoh)裝SystemGold(Beckman)使煤50mM坪0.3M NaClPH7.0液展液寫攏為0.7ml/min280nm陸屑狻 HPLC貿(mào)AT-III示詒1穎1也傻玫A(chǔ)T-III謀猿潭(謀邸鄣) (6)Ouchterlony 猿梅通每一品濃280nm約30每(圖4械一)血銅(1)(Hoechst N-血血銅)轉(zhuǎn)(2)(Hoechst N-血轉(zhuǎn))稅椎(3)(HoechstN-血椎)前(4)(Hoechst N-血前椎)私櫚 5)(DAKO A030)甩2虻鞍(6)(DAKO A033)甩1鵲酶(7)(DAKO A012)IgA(8)(DAKO A02621)IgG(9)(DAKO A04231)IgM(10)(Hoechst-IggM()血)血酶原(11)(DAKO A325)涂血維原(12)(DAKO A080) 實施1 一Cohn掖旨敕的糏V-110kg狀銼 00水校液屑岜蹬ㄎ w/v嘶30櫻通岜笛岡橙ペ笛岡 嘶玫液PH6.513w/v葉#4,000(平舛 值2,6003,800Nippon Soda Co.Ltd)停某去貿(mào)錚 玫液俅30w/v木葉#4,000停幕紗緯傻某鎩 盞某芙約20水校預(yù)水平母-脂(pharmacia)希AT-III0.4M然液洗票猿去實祝然2.0M然液通曰洗訓(xùn)AT-III幀 嘶玫A(chǔ)T-III水液示詒1榷停PH7.8然60卻10小時舜AT-III水液攵⊥鞠 ButylToyopearl 650Tosoh Corp.)喲預(yù)使煤3M然頻20mM蘋液(PH7.5)平?，使同幕液为諕旌曰?幀然0.5蘋液(PH7.5)透夜曰么AT-III 舛ㄈ疵枯碅T-III品幕裕約卻前AT-III幕緣牟省傻玫每AT-III品牡省 1 ()卻AT-III芑卻前AT-III芑之鵲陌俜省 HPLC()AT-III 坪然時鄄斕叫鈍和聚很得 疲詰濃驢曬鄄斕餃緞斃a-Cit指疲Sorb指山媧 實施2 使-脂F(xiàn).F.AT-III 1.5ml-脂F(xiàn).F.(0.92.3cm)霞同(1.5ml)水濃為10mg/mlCuSO45H2O越轄然2(3ml)水洗癰牛通3暮0.1M坪0.5MNaClPH8.0液平PD-10(pharmacia)馴同液木卻3ml AT-III濃液(A2804.20)紗票希1.5ml/Fr(Fraction)占洗鴨幀然霞每菥為3(4.5ml)牡PH7.57.06.0暮0.1M坪0.5M NaCl液同式1.5ml/Fr占洗鴨幀通250mMEDTA2Na去轄然3水洗玫 示圖1圖1示蟛糠值PH8.0銅PH7.5PH7.5時洗選 2示銅洗液GPC-HPLC慕2示詒銅前未緣()AT-III為88.0詿洗鴨懈么斜PH值鹵為100也說液PH8選PH7.5時通效爻去AT-III擁祝些PH6.5時也岜 2 系品械A(chǔ)T-III齲88 實施3 濃鵲影 為舛ㄉ灰盒蹬ㄈ滌辦，使0.1M蘋液(PH7.5)通0.1M(PH7.5)屑0.1M NaCl0.5M NaCl票幕液舛ㄈ磁ˋT-III液銅色為也說通PD-10卻濃AT-III液每只液薌A280值約為5然?，矫?ml液同液平1ml銅(0.82cm)稀喜始3ml值墓液剩嗖空忌 ml然?，分泵妇壞灰合礄严磿r洗液占杉1ml洗式示圖2每洗液AT-III鵲GPC-HPLC舛ㄊ 3 3 系品AT-III拇為81.15 圖2示誆NaCl禿0.1M0.5M NaCl之洗品沒蟹圓臁Ｒ 示攏洗液AT-III拇為100.0耍示液濃鵲謀浠 沒影臁 ?，使玫PH7.37.57.70.1M蘋液(0.1MNaCl)舛≒H浠辦；示詿朔圍PH謀浠 沒影臁Ｊ .1M蘋液(0.1MNaClPH7.5)舛 碌色為示詿朔圍詰露缺浠 影臁 實施4 詵糯寫潭鵲確痛實 通PD-10(A2804.05)卻濃AT-III液牒 .1MNaClPH7.50.1M液謝液然蠼液25ml旨5ml銅Toyopearl 650M(1.52.8cm)希同液平狻 嗟壁 .5ml去然?，綉?yīng)品同時玫洗液2暮平饣閡合此慘 32.5ml)為AT-IIIA280值A(chǔ)T-III曰示詒4色前GPC-HPLC圖示圖3 4示玫幕剩A280為80.3AT-III為89.6遙圖3示GPC-HPLC洗液示AT-III牡一澹槽猴、AT-III實住 猓稯uchterlony時未潛詰實(血銅住轉(zhuǎn)住椎住前椎住櫚白 2住1鵲酶IgAIgGIgM血酶原血維原(圖4) 耍示PH7.5通銅Toyopearl 650M色卓沙去械住酆捅AT-III 4 實施5 銅脂漏銅 知銅色校詠系銅通椎同時微漏漏銅姆校一小未轄脂(霞山轄)一脂印牽漏銅姆效諍0.1MNaClPH7.50.1M蘋液械20ml值卻玫Fr.II+III液濃AT-III液(A2804.96)擁銅系Toyopearl(1.52.8cm5ml)希同液平?，未馁Z合 27.5mlA2803.18)械23.5旨擁同平)未詠系Toyopearl 650M(0.82.0cm1ml)希喜未募(25mlA2802.63)每銅牟舛ㄊ沮 5 5示然通銅蟹10,300ppb漏銅紙液通未轄系Toyopearl 650M全漏銅為漏馴15ppb淺詠水平(13ppb) 原蝦未詠洗液GPC-HPLC圖示圖5圖5示Fr.II+III液玫原也鼙銅為AT-III姆未姆濉Ｓ紡次 9.9 實施6 銅未轄Toyopearl玫拇 塹為使色撞效吆遠銅未詠轄屑?。Rr.II+III液Fr.IV木卻濃AT-III液院0.1M NaClPH7.50.1M蘋液透1600俅味同液透100(透為160,000)使Centyiprep-30(Amicon)濃稀(Fr.IVA2805.23FR.II+III液A280-5.50)通使Centriprep-30透誆幔雇 600透些液每20ml施詿5ml(1.52.8cm)銅系(Toyopearl1ml(0.82.0cm)未轄系Toyopearl希些同幕液平?。蠂璧液施品时去?洗訓(xùn)募趾喜10m嗟 銅洗蛹稀 穎6示拇鑰杉Fr.II+III夜Fr.IV原暇示玫幕曰剩為90摺遙然為約10U/A280使械藥萍幕取 6 實施7 AT-III藥萍票 實施5頻么AT-III巍濃通BMM(bemberg MicroporousMembrane)膜(Asahi chemical Industry Co.Ltd.)恕紗票AT-III品50位/ml2w/v露0.52w/v坪0.5w/v然蘋希1N平嘶PH7.27.5通Millipore殖n500位然潿吃幻兌┢ 然細吮站實施員員誆氡就肺鋼變化透慕遠準摹 19961120盞萁氈平8-309281199764盞萁平9-163426些全詿慰
權(quán)利要求
1.一執(zhí)雍鋅血酶-III水液票血酶-III姆脅(a)(b)一
(a)榷攏群血酶-III水液使群員旨前目血酶-III緣85擼壹群目血酶-III謀時為95擼
(b)媒脂硨 III水液沾目血酶-III
2.權(quán)要1姆榷為謝魏?，约?為然啤
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5.權(quán)要23姆謝蔚暮液為320W/V
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10.一藥錚含懈權(quán)要19一票為值目血酶-III藥峽山艿危約選藥峽山艿濉
全文摘要
從含抗凝血酶－Ⅲ的水溶液中制備抗凝血酶－Ⅲ的方法,其包括下列步驟(a)和(b)中至少一步:(a)在穩(wěn)定劑存在下加熱含抗凝酶－Ⅲ的水溶液,致使加熱后仍保持加熱前的抗凝血酶－Ⅲ活性的85%或更高,且加熱后的抗凝血酶－Ⅲ單體的比率保持為95%或更高;和(b)用金屬螯合樹脂處理含抗凝血酶－Ⅲ的水溶液,并回收純化的抗凝血酶－Ⅲ。
文檔編號A61K38/36GK1189502SQ9712645
公開日1998年8月5日 申請日期1997年11月20日 優(yōu)先權(quán)日1997年11月20日
發(fā)明者井手野祥次, 瓜生勝寬, 上村八尋 申請人:株式會社綠十字