專利名稱：保存原核細胞的方法和由此獲得的組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及保存細胞的領(lǐng)域。更具體而言，它涉及干燥和穩(wěn)定原核細胞的方法，及由此獲得地組合物。

背景技術(shù)：
活原核細胞，尤其是細菌，已被日益廣泛地用于重要的醫(yī)學(xué)、農(nóng)業(yè)和工業(yè)應(yīng)用。農(nóng)業(yè)或環(huán)境應(yīng)用包括生物殺蟲劑和生物除污。醫(yī)學(xué)應(yīng)用包括活細菌在疫苗中的應(yīng)用，以及用于藥物產(chǎn)品或許多工業(yè)組合物的產(chǎn)生?；罹呙绲膽?yīng)用增多，使生物工程學(xué)以及對傳染病治療的集中研究在過去的二十年中顯著增長。
當根據(jù)希望的結(jié)果和費用來保存其能被有效使用的生存力時，細菌細胞必須能被貯存一段特定時間。已證實貯存生存力是一個主要的困難。保存活原核細胞的方法具有幾個嚴重的缺點，例如是耗費能量的并且需要冷藏。此外，現(xiàn)有的保存方法不能提供令人滿意的經(jīng)貯存后的生存力，特別是當細胞貯存于環(huán)境溫度或更高的溫度時。
冷凍干燥通常用于原核細胞的保存和貯存。然而，它具有所不希望的特性，如顯著降低生存力以及費時、耗費能源，因此是昂貴的。冷凍干燥包括將細胞置于溶液中，冷凍該溶液，并在一定條件下將冷凍的固體暴露于真空，在該條件下通過升華作用去除水和其它任何揮發(fā)性的成分而保留固體。產(chǎn)生的干燥制劑包含原核細胞。
盡管冷凍干燥十分普遍，但冷凍干燥的細菌在環(huán)境溫度下是不穩(wěn)定的，因此需要通過冷藏來貯存。然而，即使冷藏時細胞也能快速喪失生存力。可以通過賦形劑如冷凍保護劑的使用，使該方法引起的損害降低至一定程度。然而，冷凍保護劑隨后可與干燥的細胞反應(yīng)，影響冷凍干燥的原核細胞在貯存中固有的不穩(wěn)定性。
用于制備干燥的、據(jù)稱穩(wěn)定的原核細胞制劑的其它方法如環(huán)境溫度干燥、噴霧干燥、液體制劑以及含冷凍保護劑的細菌培養(yǎng)物的冷凍也有缺點。關(guān)于原核生物的干燥耐受性的綜述，見Potts(1994)微生物學(xué)綜述(Micro.Rev.)58755-805。環(huán)境溫度干燥技術(shù)去除了冷凍步驟及與冷凍相關(guān)的對物質(zhì)的損傷，這些技術(shù)在水的去除方面更加快速和節(jié)約能源。Crowe等人(1990)低溫生物學(xué)(Cryobiol.)27219-231。然而，環(huán)境溫度干燥通常不能產(chǎn)生令人滿意的生存力。噴霧干燥法造成有限的貯存時間和生存力的降低，甚至當使用穩(wěn)定的賦形劑時也如此。綜述見Lievense和van’t Reit(1994)生化工程學(xué)/生物工程學(xué)進展(Adv.Biochem.Eng.Biotechnol.)5145-63；72-89。液體制劑僅可提供短期的穩(wěn)定并且需要冷藏。冷凍的細菌培養(yǎng)物導(dǎo)致對細菌細胞壁的實質(zhì)性損傷和生存力的損失，通過冷凍保護劑的使用僅僅可以緩解但不消除這種后果。而且，這些冷凍的培養(yǎng)物也需要冷藏貯存。
海藻糖(α-D-葡吡喃糖基-α-D-葡吡喃糖苷)是天然發(fā)生的、非還原二糖，最初發(fā)現(xiàn)它在特定的植物和動物中與脫水的防止有關(guān)，這些植物和動物能不被損傷地干燥，并能在再水合時復(fù)蘇。已顯示海藻糖可用于防止脫水過程中蛋白質(zhì)、病毒和食品的變性。見美國專利號4,891,319；5,149,653；5,026,566；Blakeley等人(1990)柳葉刀(Lancet)336854-855；Roser(1991年7月)食品科學(xué)和技術(shù)趨勢(Trends in Food Sci.andTech.)10166-169；Colaco等人(1992)國際生物工程學(xué)(Biotechnol.Internat.)1345-350；Roser(1991)生物藥物學(xué)(BioPharm.)447-53；Colaco等人(1992)生物/技術(shù)(Bio/Tech)101007-1011；以及Roser等人(1993年5月)新科學(xué)家(New Scientist)25-28頁。海藻糖二水合物是可商業(yè)獲得的優(yōu)質(zhì)生產(chǎn)規(guī)范(GMP)級的結(jié)晶制劑。EP專利公開文本639645A1中描述了一種從淀粉中制備海藻糖的方法。該方法包括兩個步驟，淀粉的酶生物轉(zhuǎn)化產(chǎn)生海藻糖糖漿，通過結(jié)晶作用從糖漿中回收糖。
細菌能夠通過積累和/或合成鉀及少數(shù)類型的有機分子(包括某些糖)來對抗?jié)B透壓休克。在不含任何滲透保護化合物的葡萄糖-無機物培養(yǎng)基中，細菌如大腸桿菌(Escherichia coli)的滲透調(diào)節(jié)包括海藻糖的內(nèi)源產(chǎn)生。Larsen等人(1987)微生物學(xué)檔案(Arch.Microbiol.)1471-7；Dinnbier等人(1988)微生物學(xué)檔案150348-357；Giaever等人(1988)細菌學(xué)雜志(J.Bacteriol.)1702841-2849；以及Welsh等人(1991)普通微生物學(xué)雜志(J.Gen.Microbiol.)137745-750。
保存原核細胞的一種方法是在海藻糖的存在下冷凍干燥。見例如，Israeli等人(1993)低溫生物學(xué)30519-523。然而，該方法不能提供令人滿意的生存力。Israeli等人在100mM海藻糖的存在下冷凍干燥大腸桿菌，但僅報道了干燥樣品在21℃下暴露于空氣后4天的存活數(shù)據(jù)。以后的研究檢測了在海藻糖存在下冷凍干燥的大腸桿菌和Bacillusfluoringiensis的存活率。Leslie等人(1995)應(yīng)用環(huán)境微生物學(xué)(Appl.Env.Microbiol.)613592-3597。僅報道干燥樣品暴露于空氣后4天的存活數(shù)據(jù)。
在海藻糖存在下將冷凍干燥的大腸桿菌與空氣干燥(在氮氣中密封)的大腸桿菌相對比的另一個研究報道，貯存25周的細胞其存活率為每毫升大約107到超過1010菌落形成單位(CFU)，但細胞貯存于4℃。Louis等人(1994)應(yīng)用微生物學(xué)和生物工程學(xué)(Appl.Microbiol.Biotechnol.)41684-688。
由于活細菌應(yīng)用的增加和現(xiàn)有的關(guān)于在貯存期間保持細菌生存力的問題，所以迫切需要廉價地干燥和穩(wěn)定原核細胞的方法。特別希望的是發(fā)展允許將干燥的原核細胞貯存于環(huán)境溫度下、即不需要冷藏的方法。在此描述的方法通過提供干燥的、顯著的貯存穩(wěn)定性的原核細胞以滿足這種需要，這些細胞保留生存力而不需要冷藏。
在此引用的所有參考文獻由此全部引入作為參考。
發(fā)明概述
本發(fā)明包括產(chǎn)生干燥的、穩(wěn)定的原核細胞的方法。本發(fā)明也包括通過這些方法產(chǎn)生的組合物，以及重建這些原核細胞的方法。
因此，一方面，本發(fā)明提供保存原核細胞的方法，包括在將細胞內(nèi)海藻糖濃度提高至對提高貯存穩(wěn)定性有效的量的條件下培養(yǎng)原核細胞，將原核細胞與包含一種穩(wěn)定劑如海藻糖的干燥液相混合，以及干燥原核細胞以產(chǎn)生具有低于約5％的殘余濕度的一種玻璃(glass)。
附圖簡述


圖1顯示由多種生物的基因所編碼的海藻糖合成酶氨基酸序列的比較1.乳酸克魯維酵母菌(Kluyveromyceslactis)；2.釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)；3.黑曲霉(Aspergillus niger)；4.粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)；5.麻風分枝桿菌(Mycobacteriumleprae)和6.大腸桿菌(分別為SEQ ID NOS1-6)。
圖2是檢測海藻糖合成酶基因在大腸桿菌和沙門氏菌(Salmonella)中存在的Southern印跡的中等程度顯色。左側(cè)的水平線分別代表23、9.3、6.6、4.4、2.3、2.0和0.56kb的分子量標準參照物(λHindIII)。
圖3是描述在37℃貯存后大腸桿菌NCIMB9484穩(wěn)定性的圖。圓圈表示細胞內(nèi)海藻糖誘導(dǎo)，三角代表無海藻糖誘導(dǎo)。
圖4是描述在45％海藻糖和1.5％Kollidon90的制劑中Tg與殘余濕度之間關(guān)系的圖。
圖5是描述在45％海藻糖和0.1％CMC的制劑中殘余濕度與干燥時間長度之間關(guān)系的圖。FTS干燥方案是30mT ST 40℃(x小時)。
圖6A和圖6B是描述高摩爾滲透壓濃度條件(0.5M NaCl)對細胞內(nèi)海藻糖濃度之影響的圖。圖6A顯示細胞內(nèi)海藻糖濃度的積累和大腸桿菌在Evans培養(yǎng)基和0.5M NaCl中37℃生長的生長曲線。圖6B顯示細胞內(nèi)海藻糖濃度的積累和大腸桿菌在缺乏NaCl的Evans培養(yǎng)基中37℃生長的生長曲線。在A和B兩者中，圓圈代表誘導(dǎo)的海藻糖濃度，正方形代表于600nm處測定的細胞生長(吸光度)。
圖7是通過滲透壓休克對海藻糖誘導(dǎo)之前和之后，沙門氏菌中細胞內(nèi)海藻糖濃度的HPLC分析的一系列摹圖的再現(xiàn)。
圖8是描述在45％海藻糖和0.1％CMC的制劑中細胞生存力和干燥時間長度之間關(guān)系的圖。FTS干燥方案是30mT ST40℃(x小時)。
圖9是描述鼠傷寒沙門氏菌(S.typhimurium)在37℃生長期間細胞內(nèi)海藻糖(●)和蛋白質(zhì)(■)濃度的圖。
圖10是描述海藻糖誘導(dǎo)的(●)和非誘導(dǎo)的(▲)鼠傷寒沙門氏菌1344在37℃貯存后的百分恢復(fù)度的圖。
施行本發(fā)明的方式
我們發(fā)現(xiàn)通過誘導(dǎo)細胞內(nèi)海藻糖產(chǎn)生至對于增強貯存穩(wěn)定性有效的量，并在穩(wěn)定劑存在下干燥細胞能干燥和穩(wěn)定原核細胞。在此描述的穩(wěn)定原核細胞的方法能用于產(chǎn)生干燥、穩(wěn)定的細菌，該細菌可用于藥理學(xué)治療、預(yù)防、農(nóng)業(yè)和工業(yè)應(yīng)用。
由在此公開的方法所獲得的原核細胞是非常穩(wěn)定的通過這些方法穩(wěn)定的細菌甚至在環(huán)境溫度或高于環(huán)境溫度下貯存后仍保留高生存力。在這些條件下干燥的細菌經(jīng)干燥后保留大約50-80％的生存力。此外，通過這些方法穩(wěn)定的細菌經(jīng)貯存后顯示低于10％的生存力損失，即使在可達至少37℃的溫度下貯存6周之久后仍如此。干燥和貯存中這種穩(wěn)定程度顯著大于以前報道的使用其它方法的程度。穩(wěn)定的細胞能被貯存于室溫下，因此不需冷藏。根據(jù)條件，通常能在24小時內(nèi)完成干燥，這節(jié)約了能量和費用以及增強了生存力。
本發(fā)明的方法和組合物促進了許多急需的、有用的產(chǎn)品開發(fā)，這些產(chǎn)品包括但不限于(i)干燥穩(wěn)定形式的活菌疫苗；(ii)干燥穩(wěn)定形式的活細菌neutraceutical；(iii)干燥穩(wěn)定形式的其它活細菌藥物產(chǎn)品，例如用于陰道或尿道感染的治療；(iv)用于商業(yè)產(chǎn)品如用于乳品工業(yè)的干燥穩(wěn)定形式的活細菌起始培養(yǎng)物；(v)用于農(nóng)業(yè)、生態(tài)或生物除污應(yīng)用的干燥穩(wěn)定形式的活細菌，如殺蟲劑；以及(vi)用于生物工程工業(yè)的干燥穩(wěn)定形式的活細菌培養(yǎng)物。
當在此使用時，“原核細胞”是顯示原核生物特性的細胞，是本領(lǐng)域眾所周知的一個術(shù)語。原核生物一般是單細胞的生物體，缺少細胞器(如線粒體、葉綠體和高爾基體)、細胞骨架和分離的核。原核細胞的實例包括細菌，如真細菌、藍細菌(cyanobacteria)，和prochlorophyte；古細菌；和其它微生物如立克次氏體、支原體、螺旋體和衣原體。對于本發(fā)明來說，原核生物能夠合成海藻糖。這種能力可以是天然的或由重組技術(shù)所賦予的。能通過測定細胞內(nèi)海藻糖的濃度來測定合成海藻糖的能力，這在以下描述。優(yōu)選地，原核細胞是細菌。
穩(wěn)定劑優(yōu)選地是糖類。“糖類”包括但不限于單糖、二糖、三糖、寡糖及其相應(yīng)的糖醇、多羥基化合物，如糖類衍生物和化學(xué)修飾的糖類、羥乙基淀粉和糖共聚物。天然的和合成的糖類都適于在此應(yīng)用。合成的糖類包括但不限于那些糖苷鍵被硫醇鍵或碳鍵代替的糖類。D和L兩種形式的糖類都可以使用。對于本發(fā)明來說，糖類優(yōu)選地是非還原性的。優(yōu)選地，非還原糖是海藻糖。以下提供了優(yōu)選的非還原糖的其它實例。
“提高細胞內(nèi)海藻糖濃度”的條件是起始、促進、允許和/或提高細胞內(nèi)海藻糖合成率的條件，以及/或者與在沒有這些條件下生長或溫育細胞相對比，提高細胞內(nèi)海藻糖的量的條件。以下詳細討論了刺激海藻糖細胞內(nèi)產(chǎn)生的條件(包括優(yōu)選的條件)。這些條件的實例包括但不限于在應(yīng)激條件如滲透壓休克(即高鹽條件)下生長細胞。刺激細胞內(nèi)海藻糖產(chǎn)生的條件也可通過以下方法實現(xiàn)，例如，抑制海藻糖的降解率、表達重組基因以及誘導(dǎo)外源海藻糖的攝取。
“環(huán)境”是一個技術(shù)術(shù)語，指實行所述方法的空間的空氣壓力或濕度或溫度。環(huán)境溫度也被稱為室溫，通常為大約15-25℃。
“殘余濕度”是通過在此所述的方法干燥原核細胞后殘余的水的量(以重量百分數(shù)表示)。如以下更詳細討論的，能通過Karl/Fischer庫侖計測定殘余濕度。
“玻璃”是本領(lǐng)域眾所周知的一個術(shù)語，尤其應(yīng)用于糖類玻璃。對于本發(fā)明來說，“玻璃”指充分喪失水分后所獲得的非結(jié)晶的、透明的、固態(tài)的物理狀態(tài)。
當在此使用時，“發(fā)泡的玻璃基質(zhì)”(FGM)指一種包含糖類的玻璃，它包含分散在玻璃中的氣泡，產(chǎn)生泡沫。對于本發(fā)明來說，發(fā)泡的玻璃基質(zhì)包含低于約5％的殘余濕度，優(yōu)選地低于約4％的殘余濕度，更優(yōu)選地低于約2％的殘余濕度。
“高摩爾滲透壓濃度”指生長培養(yǎng)基中過量的溶質(zhì)濃度?！斑^量的”溶質(zhì)濃度意思是溶質(zhì)濃度(通常是鹽)超過細胞在天然環(huán)境中存在和/或生長的水平。
“生存力”是本領(lǐng)域眾所周知的一個術(shù)語，在此一致使用意思是指有功能的活生物的表現(xiàn)，如新陳代謝和細胞分裂。測定生存力的方法在本領(lǐng)域中已知，并在此描述。
本發(fā)明包括產(chǎn)生穩(wěn)定的原核細胞的方法和由此產(chǎn)生的細胞。這些方法包括提高細胞內(nèi)海藻糖的步驟，優(yōu)選地通過在一定條件下培養(yǎng)或溫育原核細胞，在此條件下將細胞內(nèi)海藻糖濃度提高至對提高貯存穩(wěn)定性有效的量；將原核細胞與干燥液相混合，該干燥液包含一種穩(wěn)定劑、優(yōu)選地非還原糖類如海藻糖；以及干燥產(chǎn)生的混合物，以便產(chǎn)生具有低于約5％殘余濕度的一種玻璃。生長原核細胞以提高細胞內(nèi)海藻糖濃度
為實施本發(fā)明的方法，能在提高細胞內(nèi)海藻糖濃度的條件下生長原核細胞。可使用如下所述的本領(lǐng)域的標準方法測定細胞內(nèi)的海藻糖。任何包含海藻糖合成酶基因的原核細胞，特別是細菌，無論是內(nèi)源的或重組的，都應(yīng)該能夠產(chǎn)生細胞內(nèi)海藻糖。
已知許多類型的原核細胞合成海藻糖。包含海藻糖合成酶基因的細菌的實例包括但不限于腸細菌(Enterobacteriaceae)，如沙門氏菌和埃希氏桿菌(Escherichia)(例如鼠傷寒沙門氏菌和大腸桿菌)；嗜鹽菌和耐鹽菌，如紅螺菌屬(Ectothriorhodospira)(例如紅綠外硫紅螺菌(E.halochloris))；微球菌屬(micrococcocaceae)，如微球菌(Micrococcus)(例如藤黃微球菌(M.luteus))；根瘤菌(Rhizobium)種，如大豆根瘤菌(R.japonicum)和豌豆根瘤菌菜豆生物變種(R.leguminosarum bv phaseoli)；藍細菌和分枝桿菌(Mycobacteria)種，如結(jié)核分枝桿菌(M.tuberculosis)、牛分枝桿菌(M.bovis)和恥垢分枝桿菌(M.smegmatis)。多種生物的基因所編碼的海藻糖合成酶的比較顯示于圖1中。已顯示其它幾種細菌具有海藻糖合成酶基因，它們都與大腸桿菌基因高度同源。這些細菌包括惡臭假單胞菌(Pseudomonas putidae)和殺鮭氣單胞菌(Aeromonassalmonicida)。
例如，可以通過對現(xiàn)有的核酸(和/或蛋白質(zhì))數(shù)據(jù)庫搜索編碼(或?qū)?yīng)于)海藻糖合成酶基因氨基酸序列共有區(qū)之序列的存在，來實現(xiàn)測定一種特別的細菌種是否包含海藻糖合成酶基因。細菌具有兩個參與海藻糖合成的基因(即，T-磷酸合成酶和T-6-P磷酸酶)，而酵母至少具有三個基因。通常，用對酵母基因特異的探針搜索也能鑒定細菌基因，盡管它具有較低的同源性得分。海藻糖合成酶的氨基酸序列比較顯示細菌、酵母和真菌間的同源性，并且能從這些比較中確定更特異的搜索和篩查探針(圖1)。另外，從用編碼全部海藻糖合成酶基因或其功能性部分的DNA探查測試細胞，能產(chǎn)生基因組DNA的Southern印跡。圖2顯示大腸桿菌和兩株沙門氏菌的海藻糖合成酶基因的Southern印跡。
可通過在應(yīng)激條件下培養(yǎng)細胞來獲得細胞內(nèi)海藻糖的增多，這些條件例如滲透壓休克、熱或氧限制(休克)、碳/氮饑餓或以上的任意組合。另外，使用參與海藻糖降解的酶(即海藻糖酶)的抑制劑如有效霉素，也導(dǎo)致細胞內(nèi)海藻糖的積累。合適的條件能通過經(jīng)驗確定，并在本領(lǐng)域人員的技術(shù)之內(nèi)。不束縛于特定的理論時，應(yīng)激條件下海藻糖產(chǎn)生的誘導(dǎo)可引發(fā)有益于保存的其它分子(如甜菜堿和陪伴蛋白)的合成或積累。
對于細菌特別是埃希氏桿菌，能通過在高摩爾滲透壓濃度的條件下生長細胞來刺激海藻糖的產(chǎn)生，即該條件下溶質(zhì)(通常是鹽)濃度足以刺激海藻糖產(chǎn)生。因此，本發(fā)明包括在一定的摩爾滲透壓濃度下培養(yǎng)原核細胞，其濃度為至少約350毫摩爾滲透壓到約1.5摩爾滲透壓，優(yōu)選地至少約400毫摩爾滲透壓到1摩爾滲透壓，更優(yōu)選地250毫摩爾滲透壓至500毫摩爾滲透壓。本發(fā)明也包括在至少約300毫摩爾滲透壓、優(yōu)選地至少約400毫摩爾滲透壓、更優(yōu)選地至少約500毫摩爾滲透壓的摩爾滲透壓濃度下培養(yǎng)原核細胞。通常，需要約200毫摩爾滲透壓的最小鹽濃度，但能通過經(jīng)驗得出有效的濃度。單一的鹽足以刺激海藻糖產(chǎn)生，例如，200mM NaCl、KCl和CaCl2均刺激細胞內(nèi)海藻糖的產(chǎn)生，表明細胞內(nèi)海藻糖產(chǎn)生不依賴于所使用的作用或生長培養(yǎng)基中氯化物的濃度。然而，當使用(NH4)2SO4時，與在KCl、NaCl和CaCl2存在下的產(chǎn)生相比，僅產(chǎn)生大約一半量的海藻糖。也能使用鹽的組合。另外，當用于提高培養(yǎng)基的摩爾滲透壓濃度時，非滲透溶質(zhì)如山梨糖醇和/或葡萄糖能有助于海藻糖積累的刺激。
能用于提高摩爾滲透壓濃度的鹽的實例包括但不限于，磷酸鈉(Na2PO4)；磷酸鉀(KH2PO4)；氯化銨(NH4Cl)；氯化鈉(NaCl)；硫酸鎂(MgSO4)；氯化鈣(CaCl2)；鹽酸硫胺素或其任意組合。在一個優(yōu)選實施方案中，基本培養(yǎng)基包含大約0.5M的鹽。甚至更優(yōu)選地，0.5M鹽由以下組成Na2PO4 6g/l；KH2PO4 3g/l；NH4Cl 0.267g/l；NaCl29.22g/l；1M MgSO4 1ml/l；0.1M CaCl2(1ml/l)；鹽酸硫胺素1ml/l；以及終濃度為2.5％w/v的葡萄糖。充足的葡萄糖對于碳源和海藻糖的產(chǎn)生是有用的。測定足夠的葡萄糖濃度可通過經(jīng)驗確定，并且這在本領(lǐng)域人員的技術(shù)之內(nèi)。
刺激和/或誘導(dǎo)海藻糖產(chǎn)生所需的鹽濃度(即摩爾滲透壓濃度)取決于所用的原核細胞的屬、種和/或株。優(yōu)選地，細胞在含鹽的基本培養(yǎng)基中生長?？缮虡I(yè)獲得的基本培養(yǎng)基中補加希望的鹽和/或其它溶質(zhì)，盡管基本培養(yǎng)基不是必需的，并且也可使用確定成分培養(yǎng)基。起始和達到希望的細胞內(nèi)海藻糖濃度水平所需的時間將依摩爾滲透壓濃度的水平以及所用原核細胞的屬、種和/或株的不同而不同，并且能通過經(jīng)驗確定。海藻糖的合成通常開始于將細胞置于為刺激海藻糖產(chǎn)生而設(shè)計的條件下1小時之內(nèi)。通常，在大腸桿菌中，將細胞置于刺激海藻糖產(chǎn)生的條件下后大約15-20小時，細胞內(nèi)海藻糖的量達到最大。
為了通過滲透壓休克誘導(dǎo)細胞內(nèi)海藻糖的產(chǎn)生，培養(yǎng)基中鹽的總濃度應(yīng)該至少是約0.2M，優(yōu)選地至少約0.4M，更優(yōu)選地至少約0.5M。對于大腸桿菌，鹽的總濃度不應(yīng)該超過0.6M。在大約高于0.6M時，大腸桿菌中細胞內(nèi)海藻糖的產(chǎn)生下降。希望的結(jié)果所需的鹽濃度可根據(jù)所用的屬/種/株而不同，并且能通過經(jīng)驗確定。
也可使用本領(lǐng)域眾所周知的重組方法增加細胞內(nèi)的海藻糖。例如，能用包含編碼適當?shù)暮Ｔ逄呛铣擅富虻腄NA序列的DNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染原核細胞。合適的基因可從廣泛的多種來源獲得，這些來源如圖1所述基因和最近鑒定的其它基因的數(shù)量所示。隨后該基因與一個合適的啟動子有效地連接，該啟動子可以是組成型的或可誘導(dǎo)的。許多參考文獻中描述了重組方法，如“分子克隆實驗室手冊(Molecular CloningA LaboratoryManual)”第二版(Sambrook等人，1989)。
能使用本領(lǐng)域已知的測定法測定細胞內(nèi)海藻糖，如通過與電化學(xué)檢測和葡萄糖測定(使用海藻糖酶的Trinder測定)相結(jié)合的高壓液相層析(HPLC)用于海藻糖的定量酶測定。薄層層析能用作不同糖類分離的一種定性方法。折射率檢測提供了定量檢測糖的另一種方法。
通過HPLC測定海藻糖的方法中，破裂細胞，細胞內(nèi)海藻糖優(yōu)先溶解于70％乙醇中，隨后通過氯仿抽提去除三酰甘油。通過將海藻糖濃度(用標準曲線確定)乘以由上清液終體積除以沉淀體積的分數(shù)，確定細胞內(nèi)海藻糖的濃度。實施例1提供了該測定法的更詳細的描述。
優(yōu)選地，細胞內(nèi)海藻糖的濃度至少是約50mM；更優(yōu)選地，至少約100mM；更優(yōu)選地，至少約150mM；更優(yōu)選地，至少約200mM；更優(yōu)選地，至少約250mM；以及甚至更優(yōu)選地，至少約300mM。我們發(fā)現(xiàn)，如果細胞內(nèi)海藻糖濃度低于約30mM，則使用在此所述的方法之細菌的穩(wěn)定性顯著降低。因此，本發(fā)明包括在刺激海藻糖細胞內(nèi)產(chǎn)生的條件下培養(yǎng)原核細胞，其中海藻糖的細胞內(nèi)濃度達到至少約30mM，優(yōu)選地至少約50mM，優(yōu)選地至少約100mM，更優(yōu)選地至少約150mM，更優(yōu)選地至少約200mM，更優(yōu)選地至少約250mM，以及甚至更優(yōu)選地至少約300mM。
刺激細胞內(nèi)海藻糖產(chǎn)生所需的時間尤其依賴于原核細胞的本性(包括屬、種和/或株)和海藻糖誘導(dǎo)發(fā)生的條件(即，是否通過滲透壓休克、缺氧等等)。對于通過滲透壓休克的海藻糖誘導(dǎo)，達到細胞內(nèi)海藻糖的最大濃度所需的時間依次依賴于摩爾滲透壓濃度的程度以及使用的特定的鹽。例如，在大腸桿菌中，硫酸銨((NH4)2SO4)刺激細胞內(nèi)海藻糖濃度的量約為NaCl、CaCl2或KCl的一半。對于在0.5M鹽基本培養(yǎng)基中的大腸桿菌，最大細胞內(nèi)海藻糖濃度發(fā)生于約10-17小時內(nèi)，至滲透壓休克后17小時有顯著誘導(dǎo)作用(實施例1；圖6)。
本領(lǐng)域的技術(shù)人員容易明白，也能通過其它方法如將海藻糖引入細胞來達到希望的細胞內(nèi)海藻糖濃度。這可通過以下方法實現(xiàn)，例如，在海藻糖存在下培養(yǎng)細胞，而使細胞經(jīng)受透化細胞壁和細胞膜的條件。這些條件的實例包括但不限于，引起膜相變的條件(如冷卻和加熱的循環(huán)或滲透壓休克)和電穿孔。如上所述能確定用于這些條件的細胞內(nèi)海藻糖濃度。引起膜相變的條件特別適用于革蘭氏陰性菌。
因此，本發(fā)明的一個實施方案是保存原核細胞的一種方法，它包括以下步驟在以此處所述的方法將細胞內(nèi)海藻糖濃度提高至對于提高貯存穩(wěn)定性有效的水平的條件下培養(yǎng)原核細胞，將原核細胞與一種包含穩(wěn)定劑的干燥液相混合，以及干燥原核細胞以便產(chǎn)生具有低于約5％殘余濕度的一種玻璃。將原核細胞與干燥液混合
細胞內(nèi)海藻糖升高至希望的程度后，通過例如離心收獲原核細胞，并重懸浮于一種包含穩(wěn)定劑、優(yōu)選地非還原糖類如海藻糖的干燥液中。特別優(yōu)選的非還原糖類是海藻糖、麥芽糖醇(4-鄰-β-D-葡吡喃糖基-D-葡糖醇)、乳糖醇(4-鄰-β-D-半乳吡喃糖基-D-葡糖醇)、palatinit[GPS(α-D-葡吡喃糖基-1→6-山梨糖醇)和GPM(α-D-葡吡喃糖基-1→6-甘露醇)的一種混合物]及其各自的糖醇成分GPS和GPM以及氫化麥芽寡糖和麥芽寡糖。
除海藻糖外，合適的穩(wěn)定劑包括但不限于，選自糖醇和其它直鏈多元醇的多羥基化合物的非還原糖苷。其它有用的穩(wěn)定劑包括新海藻糖、乳新海藻糖、半乳糖基-海藻糖、蔗糖、乳蔗糖、棉子糖、水蘇糖和松三糖。如專利申請PCT/GB95/01967中所述，具有輕微還原活性的糖類如麥芽己糖、麥芽庚酮糖、瓊脂糖(Sepharose)和葡聚糖(Dextran)也能與美拉反應(yīng)抑制劑使用。美拉反應(yīng)抑制劑也能用來改進不穩(wěn)定的還原糖類如蔗糖的性能。
干燥液中非還原糖類的濃度依賴于幾個變量，最特別的是所穩(wěn)定的原核細胞的屬、種和/或株以及干燥方法。對于大腸桿菌，非還原糖類(海藻糖)的濃度優(yōu)選地是至少約25％，更優(yōu)選地至少約35％，甚至更優(yōu)選地至少約45％(w/v)。優(yōu)選地，糖類濃度應(yīng)該低于約50％，因為較高的濃度可妨礙有效的干燥。
構(gòu)成干燥液基礎(chǔ)的溶劑可以是許多物質(zhì)中的任一個，只要它不顯著影響細胞的生存力。優(yōu)選地，該溶劑是水。
干燥液能任選地包含有利于原核細胞總穩(wěn)定性的添加劑。通常，優(yōu)選的添加劑提高干燥液的粘度，隨后通過有較高Tgs的更有效的泡沫產(chǎn)生增強干燥方法。添加劑的實例包括但不限于聚乙烯吡咯烷酮(Kollidon系列12、17、25、30、90；BASF)、羧甲基纖維素(Blanose HF；Aqualon)、羥丙基纖維素和羥乙基淀粉(HES；MW200,000)。優(yōu)選地，Kollidon90以大約1.5％的濃度存在于干燥液中。優(yōu)選地，羧甲基纖維素的濃度是大約0.1％。特別優(yōu)選的是包含約45％海藻糖和約1.5％ Kollidon90或約0.1％羧甲基纖維素的干燥液。其它能使用的添加劑包括揮發(fā)性鹽，其有助于有效的干燥(通過形成泡沫)。揮發(fā)性鹽的實例包括但不限于碳酸氫銨、氯化銨、乙酸銨和硫酸銨。然而，當使用這些鹽時，可能是由pH和鹽特異性作用引起的較低生存力可阻礙更有效的干燥。
加入原核細胞的干燥液體積以及由此所得干燥液中原核細胞的密度可以不同。然而，太低的細胞密度成比例地增加了每個細胞的干燥時間；太高的密度可相反地影響泡沫形成和干燥的速度和/或效率。而且，太高的細胞密度能導(dǎo)致細胞產(chǎn)生的較高濃度的抗發(fā)泡劑。優(yōu)選地，細胞密度是大約每毫升4-8×109個細胞(CFU)，盡管已成功地使用了高達每毫升2×1010個細胞的密度。通常，干燥液的體積顯著低于用于提高細胞內(nèi)海藻糖濃度的培養(yǎng)基的體積。任選的體積將根據(jù)細胞和溶質(zhì)的類型略微不同，并能容易地通過經(jīng)驗確定。干燥原核細胞
將原核細胞懸浮于干燥液中再干燥細胞，以便形成一種玻璃。能使用本領(lǐng)域已知的方法實現(xiàn)干燥，這些方法包括但不限于空氣(即環(huán)境溫度)干燥、噴霧干燥和冷凍干燥。當在此使用時，包含干燥的原核細胞的玻璃優(yōu)選地具有低于約5％的殘余濕度含量。
優(yōu)選地在低于環(huán)境的壓力(即真空)下進行干燥。優(yōu)選地，該壓力是大約0.1-0.075托(Torr)/毫米汞柱。更優(yōu)選地，壓力是大約0.075-0.05托/毫米汞柱。最優(yōu)選地，壓力是大約0.05-0.03托/毫米汞柱，并且外部溫度是大約40℃。
優(yōu)選地，在冷凍溫度之上和真空下發(fā)生干燥，以便形成發(fā)泡的玻璃基質(zhì)(FGM)。PCT/GB96/0136。冷凍條件下的真空干燥將導(dǎo)致較低的生存力。為了形成真空，可使用具有真空壓力和外部溫度控制、優(yōu)選地具有可編程控制的真空干燥器。作為一個實例，一種泵能夠提供0.01托/毫米汞柱的真空，并能在15-20分鐘后將產(chǎn)物容器抽真空至0.2-0.01托/毫米汞柱。在本工作中使用的機器是FTS Systems Inc.(Stone Ridge.紐約)的具有一個VP-62P真空泵和一個FD-0005-A冷凝器組件的TDS 0007-A型，或者是Labconco.Inc.(Kansas City)的具有一個Lyph-lock12冷凝器單位和一個Edwards E2M8兩級真空泵的77560型號。
外部壓力的降低至少具有兩個希望的作用。第一，它降低了氣相中溶劑的蒸汽壓力，因此加速了蒸發(fā)和干燥。提高的蒸發(fā)速率引起蒸發(fā)冷卻，除非應(yīng)用外熱替換蒸發(fā)潛熱。在真空下，這種能量輸入限制了干燥的速率。因此，升高外部溫度的作用令人驚訝地是加快干燥的速率而不升高樣品的溫度。降低的外部壓力的第二個作用是急劇降低樣品的沸點。因此能通過樣品溫度的非常適度的升高進行沸騰，這對樣品沒有有害的影響。
優(yōu)選地，干燥以兩個階段發(fā)生首先，保持外部溫度恒定一段時間；其次，升高外部溫度直到干燥完成。能逐漸升高溫度，例如，1小時10度，或者更優(yōu)選地，能以相等的增加量升高溫度，每次增加后保持恒定一段時間。在一個實施方案中，溫度于大約40℃保持約16小時，隨后在以下的約4個小時中逐漸升高溫度至大約80℃。
在一個優(yōu)選實施方案中，原核細胞如下干燥將壓力調(diào)節(jié)至30mT，40℃的初始托盤溫度16小時；隨后以每分鐘2.5℃的速度以2℃的增加量升高托盤溫度至80℃，每次增加保持約12分鐘。按照該方案，發(fā)泡一般發(fā)生于干燥開始60分鐘內(nèi)，并在24小時內(nèi)完成干燥過程，基本上不損害生存力。實施例6提供了一種方案。
也形成FGM，方法包括從干燥液中蒸發(fā)大量溶劑以獲得糖漿，將糖漿暴露于足以引起糖漿沸騰或發(fā)泡的壓力和溫度下，去除濕氣以使殘余濕度不超過約4％，優(yōu)選地約3％，更優(yōu)選地約2.5％。
在第一個干燥步驟中，蒸發(fā)溶劑以獲得糖漿。一般地，“糖漿”被定義為具有大約106-107帕斯卡秒的粘度的溶液。糖漿不被解釋為固定的濃度，但它是從混合物中蒸發(fā)大部分溶劑的結(jié)果。一般地，糖漿是包含形成玻璃基質(zhì)的材料和/或添加劑和/或原核細胞的粘稠混合物，其濃度顯著高于初始混合物。一般地，在足以去除約20％-90％溶劑的條件下進行蒸發(fā)步驟，獲得糖漿。糖漿的粘性是優(yōu)選地，以使在糖漿沸騰時，從充分形成氣泡所提供的增大的表面積中蒸發(fā)致使其玻璃化。
在真空下，持續(xù)快速干燥，直到樣品的粘度開始升高。此時，通過粘稠糖漿水分子降低的淌度減低蒸發(fā)冷卻的速度，樣品溫度升高直到其達到降低的壓力下的沸點。沸騰時，由于糖漿的發(fā)泡引起液氣界面區(qū)的大量增加。這種增大的蒸發(fā)表面引起干燥率的急速增長，并且液體泡沫干燥為固體玻璃泡沫(FGM)。一般地，這在沸騰不久后發(fā)生。
沸騰步驟的溫度可以高于或低于環(huán)境溫度。優(yōu)選地，沸騰步驟的外部溫度是大約5-80℃。更優(yōu)選地，外部溫度是大約5-60℃；甚至更優(yōu)選地，大約5-35℃。
干燥過程導(dǎo)致氣泡的形成，這大大增加了糖漿的蒸發(fā)表面區(qū)。這允許殘余溶劑的蒸發(fā)增強，F(xiàn)GM玻璃化為由沸騰步驟產(chǎn)生的固體泡沫氣泡。能通過樣品溫度的升高確定沸騰步驟的終點，樣品溫度優(yōu)選地保持足以確保完全干燥的一段時間。最佳時間隨樣品而不同，但它易于被本領(lǐng)域的技術(shù)人員所確定。
可同時加工不同的容器形狀和大小。理想地，使用的容器大小足以包含初始混合物，并適應(yīng)由此形成的干燥細胞的體積。通常，使用3ml藥物管瓶。能使用任何這種管瓶，包括Wheaton塑造的管瓶和tube-cut管瓶。優(yōu)選地，管瓶是防潮的，以便消除由于樣品吸收潮氣引起的任何有害的影響。
能使用本領(lǐng)域已知的測定法如Karl Fischer庫侖計法和重量法測定殘余濕度含量。對于使用庫侖計的殘余濕度測定，用甲酰胺提取殘余濕汽，隨后用庫侖計測定。使用以下公式確定樣品的百分濕度(w/w)
實施例2提供了該測定法的更詳細的描述。優(yōu)選地，殘余濕度等于或低于約5％，更優(yōu)選地低于約4％，更優(yōu)選地等于或低于約3％，甚至更優(yōu)選地等于或低于約2.5％。如上所述當通過逐漸升高溫度更快速地干燥細胞時，殘余濕度可下降至2％以下。能容易地通過經(jīng)驗確定不同細胞型的允許最大值。通常，大于約5％的殘余濕度對于生存力是有害的。這尤其根據(jù)使用的屬/種/株、在干燥液中使用的非還原糖類的濃度和類型、干燥方法以及貯存類型而不同。
產(chǎn)生的包含干燥的、穩(wěn)定的原核細胞的玻璃或FGM應(yīng)具有對于保存細胞足夠高的Tg。“Tg”指玻璃經(jīng)受向液相轉(zhuǎn)變時的溫度。決定Tg的變量包括但不限于干燥制劑的殘余濕度的量和所用穩(wěn)定劑的類型。通常，蛋白質(zhì)和多糖升高Tg，而鹽通常降低Tg。圖4說明Tg和百分殘余濕度之間的關(guān)系。
對于本發(fā)明來說，Tg應(yīng)該至少是約70℃，優(yōu)選地至少約75℃，更優(yōu)選地至少約80℃，甚至更優(yōu)選地至少約85℃，最優(yōu)選地至少約90℃。能使用本領(lǐng)域的標準技術(shù)如差示掃描量熱法測定Tg。通常，Tg越高則允許的貯存溫度越高。
達到希望的殘余濕度和/或Tg所需的時間長度依賴于幾個變量，其包括但不限于樣品大小、壓力和溫度。通常干燥樣品時間越長則殘余濕度越低(因此Tg越大)。圖5顯示殘余濕度和干燥時間長度之間的關(guān)系。能在少至20小時內(nèi)、更通常地在約24小時內(nèi)完成干燥。如上所述，在干燥中逐漸升高溫度能減少干燥時間，而不顯著降低細胞的生存力(實施例6)。
通過在此公開的方法所干燥的原核細胞能在環(huán)境溫度或更高的溫度下貯存不同長度的時間。干燥的、穩(wěn)定的原核細胞能貯存的時間長度將尤其依賴于原核細胞的屬、種和/或株、細胞內(nèi)海藻糖產(chǎn)生的程度和/或濃度、干燥液中穩(wěn)定劑的濃度和類型、進行干燥的方案、干燥后殘余濕度的量以及可接受的生存力的程度。穩(wěn)定細胞的重建
干燥后能通過加入一種合適的溶劑重建原核細胞。因此，本發(fā)明包括重建通過在此所述的方法獲得的原核細胞的方法。用于重建的溶劑的性質(zhì)和量將依賴于原核細胞以及它們的用途。本領(lǐng)域的技術(shù)人員能通過經(jīng)驗來確定。通常，能用水溶劑重建細胞。如果細胞被用作藥物，則優(yōu)選地用生理學(xué)上可接受的無菌緩沖液重建。
如果原核細胞被用作疫苗，并因此用作免疫原性劑，則能以足以增強對免疫原的免疫應(yīng)答的量加入一種佐劑。能在干燥前將該佐劑加入原核細胞，例如，霍亂B型毒素亞單位能與霍亂弧菌(V.cholera)同時干燥。另外，佐劑能與原核細胞分開重建。
合適的佐劑包括但不限于，氫氧化鋁、明礬、QS-21(美國專利號5,057,540)、DHEA(美國專利號5,407,684和5,077,284)及其衍生物(包括鹽)和前體(例如DHEA-S)、β-2微球蛋白(WO91/16924)、胞壁酰二肽、胞壁酰三肽(美國專利號5,171,568)、單磷酰脂A(美國專利號4,436,728；WO92/16231)及其衍生物(例如DetoxTM)、以及BCG(美國專利號4,726,947)。其它合適的佐劑包括但不限于鋁鹽、鯊烯混合物(SAF-1)、胞壁酰肽、皂苷衍生物、分枝桿菌壁制劑、分枝菌酸衍生物、非離子型封閉共聚物表面活性劑、Quil A、霍亂毒素B亞單位、聚磷腈及衍生物、以及免疫刺激復(fù)合物(ISCOM)，如Takahashi等人(1990)自然(Nature)344873-875所述。
對于獸醫(yī)應(yīng)用和動物中的抗體產(chǎn)生，能使用弗氏佐劑的促有絲分裂成分。佐劑的選擇部分地依賴于在佐劑存在下疫苗的穩(wěn)定性、施用途徑和佐劑可接受的調(diào)控性，特別是當準備用于人類時。例如，美國食品與藥物管理局(FDA)批準明礬在人中用作佐劑。
能使用本領(lǐng)域已知的許多技術(shù)的任一個測定細胞的生存力(即存活率)，例如，對于菌落形成單位(CFU)的平板測定。生存力能在任何時間測定，包括干燥細胞之前和之后立即測定以及在貯存期間的不同時間測定。所希望的是在重建之后但在細胞應(yīng)用和/或施用之前測定生存力。
對于平板測定，在希望的時間用希望的溶劑重建細胞，溶劑通常用體積至少等于干燥細胞體積的無菌蒸餾水。振搖后，將重建的培養(yǎng)物溶液在無機培養(yǎng)基(例如去除碳源的M9)中稀釋(通常10-倍)，并在30分鐘內(nèi)更優(yōu)選地在15分鐘內(nèi)將其一式三份再涂板于適當?shù)酿B(yǎng)分上。37℃溫育18-24小時后，測定菌落形成單位(CFU)的數(shù)量。存活率計算為0時間菌落計數(shù)的百分數(shù)。實施例2中提供了平板生存力測定的更詳細的描述。用此處方法制備的細胞的組合物
本發(fā)明也包括包含通過在此所述的方法獲得的原核細胞的組合物。這些組合物包括但不限于，根據(jù)在此所述的方法制備的干燥的原核細胞和重建的原核細胞。這些組合物可進一步包含任何藥學(xué)可接受的載體或賦形劑，它們在本領(lǐng)域中是眾所周知的。
提供下列實施例說明本發(fā)明但并不限制本發(fā)明。鼠傷寒沙門氏菌1344和傷寒沙門氏菌Ty21a從英國South Mimms的國家生物學(xué)標準和對照研究所(National Institute of Biological Standard and Control)獲得。
實施例1
滲透壓休克對在大腸桿菌中細胞內(nèi)海藻糖產(chǎn)生的作用
將大腸桿菌NCIMB株9484培養(yǎng)于包含用于提高滲透壓的多種試劑之一的Evans培養(yǎng)基(pH7.0，表1)中。在初始Evans培養(yǎng)基中37℃溫育過夜后，用在氮源限制的Evans培養(yǎng)基中生長的4ml大腸桿菌培養(yǎng)物接種200ml培養(yǎng)的Evans滲透壓休克培養(yǎng)基。
表1.Evans培養(yǎng)基和Evans滲透壓休克培養(yǎng)基
如下所述在滲透壓休克起始后不同時間測定細胞內(nèi)海藻糖的濃度。細胞內(nèi)海藻糖濃度的測定
如下使用高壓液相層析(HPLC)測定海藻糖的細胞內(nèi)濃度。海藻糖標準的制備方法包括，首先制備在70％乙醇中的10mM海藻糖，隨后使用70％的乙醇作為稀釋劑從10mM到10nM 10倍系列稀釋。將30μl標準置于一個微量管中，將微量管置于80℃水浴中5分鐘，記錄溫育后上清液的初始體積。以13,000轉(zhuǎn)/分離心微量管10分鐘，吸出上清液。向上清液中加入等體積的氯仿后，振搖樣品并以13,000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘。再重復(fù)氯仿抽提兩次。用去離子水將上清液的終體積調(diào)節(jié)至500μl。通過測定不同濃度的樣品生成校準曲線。
制備細胞樣品用于分析，方法是通過結(jié)合海藻糖在70％乙醇中優(yōu)先溶解的超聲處理(可使用任何其它的方法如研缽和研杵、滲透壓裂解、珠)破裂細胞壁，隨后通過氯仿抽提去除三酰甘油。將1ml細胞懸液等分至一個微量管中，以13,000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘。用100μl 70％乙醇(初始體積)重懸浮沉淀。通過測定細胞重懸浮后初始體積的相對增長來確定沉淀的體積。細胞懸液在80℃水浴中溫育5分鐘。將管以13,000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘，吸出上清液。加入等體積的氯仿，重復(fù)離心步驟。一共進行三次氯仿抽提。用去離子水將上清液的終體積調(diào)節(jié)至500μl。
使用Dionex CarboPac PA100分析柱與Dionex ED40脈沖安培電化學(xué)檢測器通過HPLC(Beckman Instruments)完成海藻糖的定量。初始細胞沉淀的總海藻糖濃度被確定為提取的終體積和沉淀體積的分數(shù)乘以測定的海藻糖濃度，使用以下公式
上清液的終體積是最終氯仿抽提后保留的水體積。沉淀體積不同于加入100μl 70％乙醇后重懸浮的沉淀。使用海藻糖濃度曲線確定形成的海藻糖的濃度。
獲得的結(jié)果顯示于圖6中。滲透壓休克起始后15-17小時觀察到細胞內(nèi)海藻糖濃度的顯著增長，峰值在不到20小時處。
實施例2
使用海藻糖穩(wěn)定和重建大腸桿菌
將大腸桿菌(9484株)置于基本培養(yǎng)基的100ml分批培養(yǎng)物中，該培養(yǎng)基與M9(基本培養(yǎng)基)有關(guān)，但具有高(0.5M)鹽含量(Na2HPO4，6g/l；KH2PO4，3g/l；NH4Cl，0.267g/l；NaCl，29.22g/l；1M MgSO4，1ml/l；0.1M CaCl2，1ml/l；鹽酸硫銨素，1ml/l；終濃度為2.5％w/v的葡萄糖)。這是“改良的M9培養(yǎng)基”。細胞在37℃振蕩生長22小時。也制備對照培養(yǎng)物，其中對培養(yǎng)基補加了20mM甜菜堿，海藻糖合成顯著降低。取出培養(yǎng)物樣品，如實施例l所述進行海藻糖測定(3×1ml)，用Bradford測定法(3×10ml；Bio-Rad)進行蛋白質(zhì)估計。
10,000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘收獲兩個25ml等份的檢測和對照培養(yǎng)物。將細胞沉淀重懸浮于5ml的45％海藻糖、1.5％聚乙烯吡咯烷酮(Kollidon90；BASF)或0.1％羧甲基纖維素(Blanoes HF；Aqualon)中。然后將懸液合并為10ml的總體積，且有4-8×109細菌/ml的典型密度，將300μl等份分配至3ml藥物管瓶中。
根據(jù)以下方案在改良的FTS冷凍干燥器中不經(jīng)冷凍地在真空下干燥細菌真空，30mT；初始托盤溫度為40℃ 16小時，隨后以每分鐘2.5℃的速度以2C的增加量提升至80℃，每次增加有12分鐘的保持時間。開始干燥大約60分鐘內(nèi)發(fā)生起泡。
殘余濕度含量如下測定。將1ml甲酰胺小心地分配至含海藻糖中之干燥細菌的每個管瓶中。向一個空瓶中加入1ml甲酰胺用作對照。通過在室溫下混合15到20分鐘提取殘余濕度。用于分析，使用一次性針頭和注射器將100μl空白(對照)甲酰胺加入反應(yīng)容器中，記錄用庫侖計(Karl/Fischer)測定的值。注意不要將空氣引入甲酰胺樣品，因為空氣中含有水蒸汽。檢測(和對照)樣品以雙份測定。用庫侖計測定的值等于水的微克數(shù)。檢測樣品減空白除以100等于樣品中每微升甲酰胺的水的微克數(shù)。干燥樣品的百分濕度(w/w)為
使用平板測定法在完成后立即測定生存力及在37℃貯存中的不同時間測定生存力。對于平板測定，使用減去碳源的基本培養(yǎng)基作為無菌稀釋劑進行細胞的系列10-倍稀釋。
將第6個稀釋管中的30μl細胞懸液加入3個LB(Luria-Bertuni)平板的每一個中，用無菌玻璃涂布器將培養(yǎng)物涂布至平板的整個表面。平板在37℃溫育過夜，計數(shù)菌落。
X＝菌落數(shù)X×33-1/3×1×106稀釋部分CFU/ml
在37℃貯存達45天的結(jié)果顯示于圖3中。在干燥后立即重建的樣品中觀察到海藻糖誘導(dǎo)的細胞之生存力大于50％(一般50-80％)。更有意義地，干燥細胞貯存后甚至在37℃貯存45天后，未觀察到活細胞回復(fù)的進一步損失(圖3)。
實施例3
Southern印跡分析檢測海藻糖合成酶基因的存在
使用標準方法從大腸桿菌、鼠傷寒沙門氏菌1344(1344)和傷寒沙門氏菌Ty21a(Ty21a)中制備DNA。用限制性內(nèi)切核酸酶HindIII(H)、EcoRI(R)或BamHI(B)消化大腸桿菌和沙門氏菌的基因組DNA，在0.8％TBE(Tris-硼酸鹽電泳緩沖液)瓊脂糖凝膠上分離，在尼龍濾膜上進行印跡。使用32p-標記的探針篩查濾膜，該探針對應(yīng)于在大腸桿菌中編碼海藻糖合成酶基因的大腸桿菌的otsA/B區(qū)。雜交后，以低嚴格條件洗濾膜。對于大腸桿菌將凝膠對X-射線膠片曝光過夜，對于沙門氏菌(Salmonella spp)曝光三天。
如圖2所示在兩株沙門氏菌中都檢測到海藻糖合成酶基因的存在。當在較高嚴格條件下洗滌濾膜時，檢測到較模糊的條帶。
實施例4
沙門氏菌中海藻糖合成的誘導(dǎo)
鼠傷寒沙門氏菌(1344)在含或不含0.5M NaCl的M9(基本)培養(yǎng)基中37℃生長過夜。如實施例1所述離心收獲細胞，用HPLC分析法分析細胞內(nèi)海藻糖濃度。結(jié)果顯示于圖7中。在高鹽培養(yǎng)基中的生長顯示4-5倍的海藻糖合成誘導(dǎo)。
實施例5
Tg與殘余濕度之間的關(guān)系
如實施例2所述在含高鹽的M9培養(yǎng)基中生長大腸桿菌(9484株)。用于干燥，將細胞懸浮于含45％海藻糖和1.5％ Kollidon90的干燥水溶液中，如實施例2所述在真空下干燥3-24小時。于不同時間收集細胞，對相同樣品的等份測定殘余水含量和Tg，以排除任何可能的瓶間差異。Tg與殘余濕度的關(guān)系的結(jié)果顯示于圖4中。
實施例6
較慢和較快干燥對生存力的影響的比較
在實施例2所述的改良的M9培養(yǎng)基中生長大腸桿菌(9484株)。用于干燥，將細胞懸浮于含45％海藻糖和0.1％羧甲基纖維素(Blanose H.F.，Aqualon)的干燥水溶液中。
隨后是兩個不同的干燥方案(a)壓力30mT；外部溫度40℃ 16小時，隨后以0.04℃/分鐘的速度和2℃的增加量升高(躍升)溫度至80℃，每次增加保持約60分鐘(慢干燥)；(b)壓力30mT；外部溫度40℃ 16小時，隨后以2.5C/分鐘的速度以2℃的增加量升高溫度至80℃，每次增加保持約12分鐘(快干燥)。
干燥后立即測定生存力。由快干燥制備的樣品生存力不亞于由慢干燥制備的樣品。對“快”干燥的樣品觀察到大約48％到52％范圍的回復(fù)率，而對“慢”干燥的樣品觀察到大約40％到52％范圍的回復(fù)率。平均地，“快”干燥的樣品顯示比“慢”干燥的樣品更高的生存力。
干燥時間長度對生存力的影響顯示于圖8中。干燥液包含45％海藻糖和0.1％CMC；FTS干燥方案是30mT ST40℃不同時間。
實施例7細胞內(nèi)海藻糖誘導(dǎo)后不同賦形劑對穩(wěn)定大腸桿菌9894外膜作用的比較
如實施例2所述將大腸桿菌9894株接種于與M9相關(guān)但有高鹽含量的(0.5M)基本培養(yǎng)基的100ml分批培養(yǎng)物中。細胞在振蕩培養(yǎng)箱中37℃生長22小時(早期穩(wěn)定期)。取出培養(yǎng)樣品進行海藻糖測定(3×1ml)，用Bradford測定法(3×10ml；Bio-Rad)進行蛋白質(zhì)估計。海藻糖濃度表示為μmol(mg蛋白質(zhì))-1。
使用含電化學(xué)檢測的離子交換層析測定海藻糖的細胞內(nèi)濃度。校準標準的制備方法是，首先在水中制備1mM海藻糖、葡萄糖、蔗糖和麥芽糖標準的貯存液，隨后用水作為稀釋劑從1mM到2.5μM系列稀釋。
將1ml細胞懸液等分至一個微量管中，13,000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘，去除上清液。將細胞沉淀重懸浮于200μl 80％乙醇中。通過在80℃水浴中破裂細胞壁10分鐘，利用所有細胞內(nèi)糖在80％乙醇中的優(yōu)先溶解，制備細胞懸液用于分析。離心懸液，吸出上清液。向上清液中加入等體積的氯仿，振搖，離心樣品，通過氯仿抽提去除三酰甘油。將水相轉(zhuǎn)移至新Eppendorf管中，重復(fù)氯仿抽提。將水相等分至HPLC管瓶中，真空干燥，隨后用500μl無菌水再水合。
使用Dionex CarboPac PA分析柱與Dionex ED40脈沖安培電化學(xué)檢測器通過HpLC(Dionex DX-500)完成海藻糖的定量。從校準曲線確定海藻糖的濃度。
10,000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘從每個搖瓶中收獲兩個30ml等份。將細胞沉淀重懸浮于8ml 25-45％糖、0.1％CMC(羧甲基纖維素鈉；Blanoes 7HF；Aqualon)中。然后將懸液合并為16ml的總體積及4-8×109CFU/ml的典型細胞密度，將300μl等份分配至3ml藥物管瓶中。
使用以下方案不經(jīng)冷凍地在真空下干燥細菌真空，30mT；初始托盤溫度為40℃ 16小時，隨后以2.5℃/分鐘的速度以2℃的增加量提升至80℃，每次增加有12分鐘的保持時間。初始干燥60-120分鐘之間發(fā)生起泡。
如實施例2所述使用平板測定法在干燥步驟完成之前和之后立即測定生存力，并在37℃貯存中的不同時間測定生存力。也測定殘余濕度含量和玻璃轉(zhuǎn)變溫度。
在37℃貯存的結(jié)果顯示于表2中。使用非還原糖海藻糖、palatinit或乳糖醇作為穩(wěn)定外膜的賦形劑，大腸桿菌于37℃貯存6周后，未觀察到活細胞回復(fù)的明顯損失。更顯著地，對于還原糖葡萄糖，觀察到大于99％的損失。
表2.QT4干燥完成后即刻及37℃貯存3周和6周后大腸桿菌9484活細胞的回復(fù)
實施例8
QT4(實施例2的方法)和冷凍干燥的大腸桿菌之比較
將大腸桿菌NCIMB9484株接種于改良的M9培養(yǎng)基的250ml分批培養(yǎng)物中。實施例2中描述了該培養(yǎng)基的成分。細胞在振蕩培養(yǎng)箱中37℃生長24小時直到早期穩(wěn)定期。如實施例7所述取出培養(yǎng)物樣品進行海藻糖測定(6×1ml)，用Bradford測定法(5×10ml)進行蛋白質(zhì)估計。
從搖瓶中取出8個25ml的等份，通過10,000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘收獲細菌。將細胞沉淀重懸浮于8ml 45％糖、0.1％CMC(羧甲基纖維素鈉；Blanoes 7HF；Aqualon)中。然后將細胞懸液合并為64ml的總體積及0.5-1.2×109CFU/ml的典型細胞密度。將300μl和500μl等份分配至3ml藥物管瓶中，分別進行發(fā)泡和冷凍干燥步驟。
如實施例2所述使用QT4發(fā)泡方案不經(jīng)冷凍在真空下干燥細菌。用以下方案冷凍干燥細菌以2.5℃/分鐘提升至-40℃的起始托盤溫度；于-40℃在30mT的真空壓力下進行初次干燥，保持40小時；通過以0.05℃/分鐘從-40到30C的提升進行第二次干燥，保持12小時。
如實施例2所述使用平板測定法在干燥步驟完成之前和之后立即測定生存力，并在37℃貯存3周后測定生存力。也測定殘余濕度含量和玻璃轉(zhuǎn)變溫度。
在37℃貯存的結(jié)果顯示于表3中。37℃貯存3周后，在通過QT4方法干燥的細菌中或冷凍干燥的細菌中都未觀察到細菌生存力的明顯損失。QT4-干燥的細菌的殘余濕度含量和玻璃轉(zhuǎn)變溫度分別是1.85±0.2％和69.05±5.0℃。冷凍干燥細菌的Tg是104.5±2.1℃，殘余濕度含量是0.70±0.2％。
表3.QT4干燥與冷凍干燥對37℃貯存后大腸桿菌9484活細胞回復(fù)的比較
實施例9
鼠傷寒沙門氏菌在高鹽培養(yǎng)基中37℃生長期間海藻糖的細胞內(nèi)積累
鼠傷寒沙門氏菌1344在含或不含0.5M NaCl(NaCl，29.22g l-1；(NH4)2SO4，0.66 g l-1；K2HPO4，10.5 g l-1；KH2PO4，4.5 g l-1；MgSO4，0.1g l-1；色氨酸，20mg l-1；終濃度為2.5％w/v的葡萄糖)的基本沙門氏菌生長培養(yǎng)基的分批培養(yǎng)物中37℃生長106小時。定期取出樣品，如實施例7所述通過Bradford測定法進行蛋白質(zhì)測定，通過HPLC進行細胞內(nèi)海藻糖測定。海藻糖濃度表示為μmol海藻糖(mg蛋白質(zhì))-1。
如圖9所示，在接種后30和76小時之間觀察到明顯的海藻糖濃度，48小時后達到0.53μmol海藻糖(mg蛋白質(zhì))-1的最大值。
實施例10
使用海藻糖在37℃對鼠傷寒沙門氏菌1344的穩(wěn)定
鼠傷寒沙門氏菌1344在含0.5M NaCl的基本沙門氏菌生長培養(yǎng)基的分批培養(yǎng)物中生長。細胞在振蕩培養(yǎng)箱中37℃生長60小時，在早期穩(wěn)定期離心收獲。也制備不含鹽基本培養(yǎng)基的對照培養(yǎng)物，并在穩(wěn)定期收獲，在此期間海藻糖合成顯著降低，因為沒有滲透應(yīng)激。
10,000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘從每個搖瓶中收獲兩個25ml的等份。重懸浮細胞沉淀，并在適當?shù)纳L培養(yǎng)基中洗滌。將獲得的細胞沉淀重懸浮于8ml 45％海藻糖、0.1％CMC(Blanoes 7HF，Aqualon)中。然后將細胞懸液合并為16ml的總體積及2-4×109CFU/ml的典型細胞密度，將300μl等份分配至3ml藥物管瓶中。如實施例2所述不經(jīng)冷凍在真空下干燥細菌。發(fā)泡發(fā)生于初始干燥的60-120分鐘間。
取出培養(yǎng)物樣品(3×1ml)，通過Bradford測定法(3×10ml；Bio-Rad)進行海藻糖測定和蛋白質(zhì)估計。如實施例7所述，海藻糖濃度表示為μmol(mg蛋白質(zhì))-1。如實施例2所述使用平板測定法在干燥步驟完成之前和之后立即測定生存力，并在37℃貯存期間的不同時間測定生存力。也測定殘余濕度含量和玻璃轉(zhuǎn)變溫度。
37℃貯存的結(jié)果顯示于圖12中。在被滲透誘導(dǎo)以積累細胞內(nèi)海藻糖的鼠傷寒沙門氏菌1344中，貯存6周后未觀察到生存力的明顯損失。顯著地，對于未誘導(dǎo)的細菌觀察到大于99％的損失。
實施例11
海藻糖-6-磷酸合成酶(otsA)基因在大腸桿菌(NCIMB9484)和沙門氏菌(Salmonella spp)中存在的確定
經(jīng)OD260/280nm和瓊脂糖凝膠分析鑒定從大腸桿菌9484、鼠傷寒沙門氏菌1344和傷寒沙門氏菌Ty21a中提取的基因組DNA。分開制備每個DNA制品，以確保無交叉污染。然后使用該DNA與簡并引物(其中第三個堿基的每一個都被替換為選擇的堿基或肌苷，以容許任何序列改變)、猜測體引物(序列選擇基于沙門氏菌特異的密碼子選擇)和大腸桿菌引物(完全基于大腸桿菌序列)準備PCR反應(yīng)，如表4所示。每一組至少產(chǎn)生一個陽性反應(yīng)。相關(guān)片段進行低熔點凝膠電泳，并純化。
表4.大腸桿菌、鼠傷寒沙門氏菌1344和傷寒沙門氏菌Ty21a的otsA基因探針
將700bp片段連接至pCR3.1，然后轉(zhuǎn)移至感受態(tài)細胞并測序。獲得的otsA的序列數(shù)據(jù)顯示，鼠傷寒沙門氏菌1344和大腸桿菌9484之間有77％的序列同源性。序列數(shù)據(jù)也證明，兩個沙門氏菌屬的菌株之間總數(shù)715個堿基中只有6個不同。
盡管為了清晰和理解起見已用圖表和實施例的方式相當詳細地描述了以上的發(fā)明，但本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)當明白，可以施行某些改變和修飾。因此，描述和實施例不應(yīng)解釋為限制本發(fā)明的范圍，附加的權(quán)利要求書描繪了發(fā)明范圍。
序列表(1)一般信息 (i)申請人Tunnacliffe，Alan G.
Welsh，David T.
Dhaljwal，Kamaljit S.
Colaco，Camilo (ii)發(fā)明名稱保存原核細胞的方法和由此獲得的組合物 (iii)序列數(shù)目6 (iv)聯(lián)系地址
(A)地址ABLEHITE，ALAN J at MARKS7 CLERK
(B)街道57-60 LINCOLN’S INN FIELDS
(C)城市LONDON
(D)州
(E)國家英國
(F)郵政編碼(ZIP)WC2A 3LS (v)計算機可讀信息
(A)介質(zhì)類型軟盤
(B)計算機IBM PC兼容機
(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS
(D)軟件Patent In Release#1.0，Version#1.30 (vi)當前申請數(shù)據(jù)
(A)申請?zhí)?br> (B)遞交日
(C)分類 (viii)代理人/代理機構(gòu)信息
(A)姓名Polizzi，Catherine M.
(B)登記號40，130
(C)文獻/卷號26374-30017.00 (ix)通訊信息
(A)電話(415)813-5600
(B)傳真(415)494-0792
(D)電傳706141 MRSNFOERS SFO(2)SEQ ID NO1的信息 (i)序列特征
(A)長度488個氨基酸
(B)類型氨基酸
(C)鏈型單鏈
(D)拓撲類型線性 (xi)SEQ ID NO1的序列描述Met Val Asn Gln Asp Ile Ser Lys Leu Ser Leu Asn Glu Cys Pro Gly1 5 10 15Ser Val Ile Val Ile Ser Asn Arg Leu Pro Val Thr Ile Lys Lys Asp
20 25 30Glu Lys Thr Gly Glu Tyr Glu Tyr Ser Met Ser Ser Gly Gly Leu Val
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130 135 140Asn Ile Asn Asp Asn Asp Val Val Trp Val His Asp Tyr His Leu Met145 150 155 160Leu Leu Pro Glu Met Ile Arg Gln Arg Val Ile Ala Lys Lys Leu Lys
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485(2)SEQ ID NO2的信息 (i)序列特征
(A)長度495個氨基酸
(B)類型氨基酸
(C)鏈型單鏈
(D)拓撲類型線性 (xi)SEQ ID NO2的序列描述Met Thr Thr Asp Asn Ala Lys Ala Gln Leu Thr Ser Ser Ser Gly Gly1 5 10 15Asn Ile Ile Val Val Ser Asn Arg Leu Pro Val Thr Ile Thr Lys Asn
20 25 30Ser Ser Thr Gly Gln Tyr Glu Tyr Ala Met Ser Ser Gly Gly Leu Val
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485 490 495(2)SEQ ID NO3的信息 (i)序列特征
(A)長度517個氨基酸
(B)類型氨基酸
(C)鏈型單鏈
(D)拓撲類型線性 (xi)SEQ ID NO3的序列描述Met Pro Ser Leu Glu Asn Pro Thr Phe Gln Asn Glu Ala Arg Leu Leu1 5 10 15Leu Val Ser Asn Arg Leu Pro Ile Thr Ile Lys Arg Ser Asp Asp Gly
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515(2)SEQ ID NO4的信息 (i)序列特征
(A)長度479個氨基酸
(B)類型氨基酸
(C)鏈型單鏈
(D)拓撲類型線性 (xi)SEQ ID NO4的序列描述Met Ser Asp Ala His Asp Thr Ile Lys Ser Leu Thr Gly Asp Ala Ser1 5 10 15Asn Ser Arg Arg Leu Ile Val Val Ser Asn Arg Leu Pro Ile Thr Ile
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195 200 205Leu Asn Cys Asp Leu Val Gly Phe His Thr Tyr Asp Tyr Ala Arg His
210 215 220Phe Leu Ser Ala Cys Ser Arg Ile Leu Asn Leu Ser Thr Leu Pro Asn225 230 235 240Gly Val Glu Tyr Asn Gly Gln Met Val Ser Val Gly Thr Phe Pro Ile
245 250 255Gly Ile Asp Pro Glu Lys Phe Ser Asp Ala Leu Lys Ser Asp Val Val
260 265 270Lys Asp Arg Ile Arg Ser Ile Glu Arg Arg Leu Gln Gly Val Lys Val
275 280 285Ile Val Gly Val Asp Arg Leu Asp Tyr Ile Lys Gly Val Pro Gln Lys
290 295 300Phe His Ala Phe Glu Val Phe Leu Glu Gln Tyr Pro Glu Trp Val Gly305 310 315 320Lys Val Val Leu Val Gln Val Ala Val Pro Ser Arg Gln Asp Val Glu
325 330 335Glu Tyr Gln Asn Leu Arg Ala Val Val Asn Glu Leu Val Gly Arg Ile
340 345 350Asn Gly Arg Phe Gly Thr Val Glu Tyr Thr Pro Ile His Phe Leu His
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370 375 380Val Cys Leu Ile Thr Ser Thr Arg Asp Gly Met Asn Leu Val Ser Tyr385 390 395 400Glu Tyr Ile Cys Thr Gln Gln Glu Arg His Gly Ala Leu Ile Leu Ser
405 410 415Glu Phe Ala Gly Ala Ala Gln Ser Leu Asn Gly Ser Ile Val Ile Asn
420 425 430Pro Trp Asn Thr Glu Glu Leu Ala Asn Ser Ile His Asp Ala Leu Thr
435 440 445Met Pro Glu Lys Gln Arg Glu Ala Asn Glu Asn Lys Leu Phe Arg Tyr
450 455 460Val Asn Lys Tyr Thr Ser Gln Phe Trp Gly Pro Lys Leu Cys Arg465 470 475(2)SEQ ID NO5的信息 (i)序列特征
(A)長度498個氨基酸
(B)類型氨基酸
(C)鏈型單鏈
(D)拓撲類型線性 (ii)分子類型蛋白質(zhì) (xi)SEQ ID NO5的序列描述Met Thr Ser Arg Gly Asn His Gly Ser Lys Thr Ser Ser Asp Lys His1 5 10 15Leu Gly Asp Ser Asp Phe Val Val Val Ala Asn Arg Leu Pro Val Asp
20 25 30Gln Val Arg Leu Pro Asp Gly Thr Ala Ile Trp Lys Arg Ser Prc Gly
35 40 45Gly Leu Val Thr Ala Leu Glu Pro Leu Leu Arg Gln Arg Arg Gly Ala
50 55 60Trp Val Gly Trp Pro Gly Val Ile Asn Asp Asn Val Asp Leu Asp Leu65 70 75 80Thr Ile Lys Ser Ile Val Gln Asp Gly Leu Thr Leu Tyr Pro Val Arg
85 90 95Leu Asn Thr His Asp Val Ala Glu Tyr Tyr Glu Gly Phe Ser Asn Ala
100 105 110Thr Leu Trp Pro Leu Tyr His Asp Val Ile Val Lys Pro Ile Tyr His
115 120 125Cys Glu Trp Trp Glu Arg Tyr Val Asp Val Asn Arg Arg Phe Ala Glu
130 135 140Thr Thr Ser Arg Thr Ala Ala Tyr Gly Gly Thr Val Trp Val Gln Asp145 150 155 160Tyr Gln Leu Gln Leu Val Pro Lys Met Lau Arg Ile Met Arg Pro Asp
165 170 175Leu Thr Ile Gly Phe Phe Leu His Ile Pro Phe Pro Pro Val Glu Leu
180 185 190Phe Met Gln Ile Pro Trp Arg Thr Glu Ile Ile Glu Gly Leu Leu Gly
195 200 205Ala Asp Leu Val Gly Phe His Leu Thr Ser Gly Ala Gln Asn Phe Leu
210 215 220Phe Leu Ser Arg His Leu Leu Gly Ala Asn Thr Ser Arg Gly Leu Val225 230 235 240Gly Val Arg Ser Arg Phe Gly Glu Val Gln Leu Lys Ser His Thr Val
245 250 255Gln Val Gly Ala Phe Pro Ile Ser Ile Asp Ser Lys Glu Ile Asp Gln
260 265 270Ala Thr Arg Asp Arg Asn Val Arg Arg Arg Ala Arg Glu Ile Arg Ala
275 280 285Glu Leu Gly Asn Pro Arg Lys Ile Leu Leu Gly Val Asp Arg Leu Asp
290 295 300Tyr Thr Lys Gly Ile Asp Val Arg Leu Arg Ala Phe Ala Glu Leu Leu305 310 315 320Ala Glu Gly Arg Ala Lys Arg Asp Asp Thr Val Leu Val Gln Leu Ala
325 330 335Thr Pro Ser Arg Glu Arg Val Glu Sar Tyr Lys Ile Leu Arg Asn Asp
340 345 350Ile Glu Arg Gln Val Gly His Ile Asn Gly Glu Tyr Gly Glu Val Gly
355 360 365His Pro Val Val His Tyr Leu His Arg Pro Ile Pro Arg Asp Glu Leu
370 375 380Ile Ala Phe Tyr Val Ala Ser Asp Val Met Leu Val Thr Pro Leu Arg385 390 395 400Asp Gly Met Asn Leu Val Ala Lys Glu Tyr Val Ala Cys Arg Asn Asp
405 410 415Leu Gly Gly Ala Leu Val Leu Ser Glu Phe Thr Gly Ala Ala Ala Glu
420 425 430Leu Arg Gln Ala Tyr Leu Val Asn Pro His Asp Leu Glu Gly Val Lys
435 440 445Asp Thr Ile Glu Ala Ala Leu Asn Gln Leu Ala Glu Glu Ala Arg Arg
450 455 460Arg Met Arg Ser Leu Arg Arg Gln Val Leu Ala His Asp Val Asp Arg465 470 475 480Trp Ala Arg Ser Phe Leu Asp Ala Leu Ala Glu Ala Pro Ala Arg Asp
485 490 495Ala Thr(2)SEQ ID NO6的信息 (i)序列特征
(A)長度473個氨基酸
(B)類型氨基酸
(C)鏈型單鏈
(D)拓撲類型線性 (ii)分子類型蛋白質(zhì) (xi)SEQ ID NO6的序列描述Ser Arg Leu Val Val Val Ser Asn Arg Ile Ala Pro Pro Asp Glu His1 5 10 15Ala Ala Ser Ala Gly Gly Leu Ala Val Gly Ile Leu Gly Ala Leu Lys
20 25 30Ala Ala Gly Gly Leu Trp Phe Gly Trp Ser Gly Glu Thr Gly Asn Glu
35 40 45Asp Gln Pro Leu Lys Lys Val Lys Lys Gly Asn Ile Thr Trp Ala Ser
50 55 60Phe Asn Leu Ser Glu Gln Asp Leu Asp Glu Tyr Tyr Asn Gln Phe Ser65 70 75 80Asn Ala Val Leu Trp Pro Ala Phe His Tyr Arg Leu Asp Leu Val Gln
85 90 95Phe Gln Arg Pro Ala Trp Asp Gly Tyr Leu Arg Val ASn Ala Leu Leu
100 105 110Ala Asp Lys Leu Leu Pro Leu Leu Gln Asp Asp Asp Ile Ile Trp Ile
115 120 125His Asp Tyr His Leu Leu Pro Phe Ala His Glu Leu Arg Lys Arg Gly
130 135 140Val Asn Asn Arg Ile Gly Phe Phe Leu His Ile Pro Phe Pro Thr Pro145 150 155 160Glu Ile Phe Asn Ala Leu Pro Thr Tyr Asp Thr Leu Leu Glu Gln Leu
165 170 175Cys Asp Tyr Asp Leu Leu Gly Phe Gln Thr Glu Asn Asp Arg Leu Ala
180 185 190Phe Leu Asp Cys Leu Ser Asn Leu Thr Arg Val Thr Thr Arg Ser Ala
195 200 205Lys Ser His Thr Ala Trp Gly Lys Ala Phe Arg Thr Glu Val Tyr Pro
210 215 220Ile Gly Ile Glu Pro Lys Glu Ile Ala Lys Gln Ala Ala Gly Pro Leu225 230 235 240Pro Pro Lys Leu Ala Gln Leu Lys Ala Glu Leu Lys Asn Val Gln Asn
245 250 255Ile Phe Ser Val Glu Arg Leu Asp Tyr Ser Lys Gly Leu Pro Glu Arg
260 265 270Phe Leu Ala Tyr Glu Ala Leu Leu Glu Lys Tyr Pro Gln His His Gly
275 280 285Lys Ile Arg Tyr Thr Gln Ile Ala Pro Thr Ser Arg Gly Asp Val Gln
290 295 300Ala Tyr Gln Asp Ile Arg His Gln Leu Glu Asn Glu Ala Gly Arg Ile305 310 315 320Asn Gly Lys Tyr Gly Gln Leu Gly Trp Thr Pro Leu Tyr Tyr Leu Asn
325 330 335Gln His Phe Asp Arg Lys Leu Leu Met Lys Ile Phe Arg Tyr Ser Asp
340 345 350Val Gly Leu Val Thr Pro Leu Arg Asp Gly Met Asn Leu Val Ala Lys
355 360 365Glu Tyr Val Ala Ala Gln Asp Pro Ala Asn Pro Gly Val Leu Val Leu
370 375 380Ser Gln Phe Ala Gly Ala Ala Asn Glu Leu Thr Ser Ala Leu Ile Val385 390 395 400Asn Pro Tyr Asp Arg Asp Glu Val Ala Ala Ala Leu Asp Arg Ala Leu
405 410 415Thr Met Ser Leu Ala Glu Arg Ile Ser Arg His Ala Glu Met Leu Asp
420 425 430Val Ile Val Lys Asn Asp Ile Asn His Trp Gln Glu Cys Phe Ile Ser
435 440 445Asp Leu Lys Gln Ile Val Pro Arg Ser Ala Glu Ser Gln Gln Arg Asp
450 455 460Lys Val Ala Thr Phe Pro Lys Leu Ala465 470
權(quán)利要求
1. 一種保存原核細胞的方法，它包括以下步驟
a)將原核細胞的細胞內(nèi)海藻糖濃度提高至對提高貯存穩(wěn)定性有效的量；
b)將步驟a)中獲得的原核細胞與一種包含穩(wěn)定劑的干燥液相混合；以及
c)在一定條件下干燥步驟b)的產(chǎn)物，該條件足以產(chǎn)生具有低于約5％殘余濕度的玻璃形式的穩(wěn)定劑。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中提高細胞內(nèi)海藻糖濃度的方法選自在足以增強細胞內(nèi)海藻糖產(chǎn)生的摩爾滲透壓濃度中培養(yǎng)、表達重組海藻糖合成酶基因以及引入外源海藻糖。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中摩爾滲透壓濃度至少是約350毫摩爾滲透壓-1.5摩爾滲透壓。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中摩爾滲透壓濃度至少是約400毫摩爾滲透壓-1摩爾滲透壓。
5. 根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中摩爾滲透壓濃度至少是約300毫摩爾滲透壓。
6. 根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中摩爾滲透壓濃度至少是約500毫摩爾滲透壓。
7. 根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中通過加入至少一種鹽提高摩爾滲透壓濃度，其中該鹽選自Na2PO4、KH2PO4、NH4Cl、NaCl、MgSO4、CaCl2、鹽酸硫胺素或其任何組合。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中原核細胞是細菌。
9. 根據(jù)權(quán)利要求8的方法，其中該細菌選自埃希氏桿菌屬、芽孢桿菌屬、沙門氏菌屬或弧菌屬。
10. 根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中該穩(wěn)定劑是海藻糖。
11. 根據(jù)權(quán)利要求10的方法，其中海藻糖的細胞內(nèi)濃度至少是約100mM。
12. 根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中該穩(wěn)定劑是非還原糖類。
13. 根據(jù)權(quán)利要求12的方法，其中干燥液包含至少約25％的非還原糖類。
14. 根據(jù)權(quán)利要求12的方法，其中干燥液包含至少約45％的非還原糖類。
15. 根據(jù)權(quán)利要求12的方法，其中非還原糖類選自海藻糖、麥芽糖醇(4-鄰-β-D-葡吡喃糖基-D-葡糖醇)、乳糖醇(4-鄰-β-D-半乳吡喃糖基-D-葡糖醇)、palatinit[GPS(α-D-葡吡喃糖基-1→6-山梨糖醇)和GPM(α-D-葡吡喃糖基-1→6-甘露醇)的一種混合物]、GPS、GPM及氫化麥芽寡糖和麥芽寡糖。
16. 根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中干燥包括以下步驟
a)蒸發(fā)溶液以獲得糖漿；
b)將糖漿暴露于壓力降低的外部壓力下和足以導(dǎo)致糖漿沸騰的溫度下；以及
c)去除濕氣，以使殘余濕度不超過約5％。
17. 根據(jù)權(quán)利要求16的方法，其中真空最初是大約30mT，初始溫度大約40℃。
18. 根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中步驟c)進一步包括步驟i)保持大約40℃的溫度約16小時；以及ii)以每分鐘大約2.5℃的速度以約2℃的增加量將溫度逐漸升高至約80℃，其中每次增加持續(xù)約12分鐘。
19. 根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中該玻璃具有不超過約2.5％的殘余濕度。
20. 根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中該玻璃是發(fā)泡的玻璃基質(zhì)。
21. 一種根據(jù)權(quán)利要求1的方法所獲得的組合物。
22. 根據(jù)權(quán)利要求21的方法，其中該溶劑是水。
23. 根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其進一步包括步驟d)通過加入一種合適的溶劑重建原核細胞。
24. 一種重建干燥的、穩(wěn)定的原核細胞的方法，其包括以足以達到生存力的量將一種合適的溶劑加入權(quán)利要求1所獲得的干燥的原核細胞中。
全文摘要
本發(fā)明提供干燥和穩(wěn)定原核細胞的方法，及由此獲得的組合物。首先在足以誘導(dǎo)細胞內(nèi)海藻糖的條件下培養(yǎng)或溫育細胞，將其懸浮于穩(wěn)定液中并干燥，形成一種固態(tài)玻璃。所得產(chǎn)物在室溫下有貯存穩(wěn)定性，貯存后幾乎不喪失生存力。
文檔編號A61K39/02GK1239997SQ97180328
公開日1999年12月29日 申請日期1997年12月5日 優(yōu)先權(quán)日1996年12月5日
發(fā)明者A·G·圖納克里夫, D·T·威爾史, B·J·羅瑟, K·S·德哈利瓦爾, C·克拉克 申請人:扇形支撐劍橋有限公司