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      綠卟啉用于生產(chǎn)治療繼發(fā)性白內(nèi)障的藥物的用途的制作方法

      文檔序號(hào):1063272閱讀:560來源:國知局
      專利名稱:綠卟啉用于生產(chǎn)治療繼發(fā)性白內(nèi)障的藥物的用途的制作方法
      技術(shù)領(lǐng)域
      本發(fā)明涉及光動(dòng)力療法(PDT)防止繼發(fā)性白內(nèi)障的用途,更具體地說,涉及綠卟啉在這種PDT治療中的用途。
      現(xiàn)有技術(shù)在美國,摘除白內(nèi)障是最平常的手術(shù)之一。繼發(fā)性白內(nèi)障,尤其是后囊渾濁化是白內(nèi)障摘除術(shù)最常見的并發(fā)癥,不論是否植入后眼房眼內(nèi)晶狀體。根據(jù)患者年齡,該癥發(fā)病率為15-50%,一般是繼殘留晶狀體上皮細(xì)胞增殖和遷移后發(fā)生。雖然眼外科醫(yī)生知道繼發(fā)性白內(nèi)障的發(fā)病率,而且注意盡可能清除殘留的晶狀體上皮細(xì)胞(例如在植入人造眼內(nèi)晶狀體之前),但是確認(rèn)所有這類細(xì)胞很難,而且,常常很難接觸到晶狀體囊內(nèi)表面上的這類細(xì)胞。
      繼發(fā)性白內(nèi)障作為術(shù)后影響又稱“后發(fā)白內(nèi)障”。有人認(rèn)為,“繼發(fā)性白內(nèi)障”含意模糊,因?yàn)樗€常被用來指那些繼各種眼病后發(fā)生的白內(nèi)障。參見Kappelhoff,J.P.等,“后發(fā)白內(nèi)障的病理學(xué)小綜述”,Acta Opthamol.Suppl.,20513(1992)。就本發(fā)明目的而言,繼發(fā)性白內(nèi)障指,基于組織學(xué)觀察結(jié)果,在切除白內(nèi)障后,后囊上的晶狀體上皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、巨噬細(xì)胞甚至包括虹膜衍生碎片細(xì)胞的增殖,而不包括殘留后囊本身內(nèi)部不相關(guān)變化引起的結(jié)果。
      雖然植入的眼內(nèi)晶狀體本身被認(rèn)為是為了抑制晶狀體囊的渾濁化,但對(duì)此機(jī)制知之甚少。已有人提出,眼內(nèi)晶狀體通過限制類晶狀體(lentoid)形成所需的空間和維持晶狀體上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化所需線性構(gòu)架來作用于繼發(fā)性白內(nèi)障。Nasisse,M.P.等“無晶狀體和假晶狀體眼內(nèi)的晶狀體囊渾濁化”,Graefes Arch.Clin.Exp.Opthalmol.233(2)63(1995)。另有人提出,眼內(nèi)晶狀體促進(jìn)繼發(fā)性白內(nèi)障的發(fā)展。Nishi,O.等,“去除晶狀體上皮細(xì)胞的眼內(nèi)白內(nèi)障手術(shù)”,J.Cataract Refract.Surg.17471-477(1991)。但是,繼發(fā)性白內(nèi)障經(jīng)常發(fā)生且有治療的必要。
      各種緩解繼發(fā)性白內(nèi)障渾濁化的方法包括,例如,不致外傷的手術(shù)和皮質(zhì)清除術(shù)。有關(guān)這方面的論述和其它技術(shù)參見Apple,D.J.等,“后晶狀體囊渾濁化”,Survey of Ophthalmology,37(2)73(1992)。這類治療繼發(fā)性白內(nèi)障的“常規(guī)”療法本身具有嚴(yán)重的副作用,其中包括視網(wǎng)膜脫落和對(duì)植入的眼內(nèi)晶狀體造成損傷。參見例如Lundgren,B.等,“繼發(fā)性白內(nèi)障用家兔研究繼發(fā)性白內(nèi)障的體內(nèi)模型”,Acta Opthalmol.Suppl.20525(1992)。所以,就原白內(nèi)障手術(shù)的成功而言,選擇防止繼發(fā)性白內(nèi)障的技術(shù)特別重要。
      所以,已經(jīng)提出或評(píng)價(jià)了多種防止繼發(fā)性白內(nèi)障的實(shí)驗(yàn)性技術(shù)。其中包括用肝素來抑制后囊表面上成纖維細(xì)胞的遷移和增殖。Xia,X.P.等,“用肝素抑制繼發(fā)性白內(nèi)障的細(xì)胞學(xué)研究”,Chung Hua Yen Ko Tsa Chih,30(5)363(1994)和Xia,X.P.等,“用肝素抑制繼發(fā)性白內(nèi)障的臨床研究”,Chung Hua Yen Ko Tsa Chih,30(6)405(1994)。
      其它防止繼發(fā)性白內(nèi)障的方法包括化學(xué)修飾晶狀體囊的后囊表面,即某些化合物與之共價(jià)結(jié)合然后發(fā)生聚合反應(yīng)。Lindquist,b.等,“防止繼發(fā)性白內(nèi)障的方法”,美國專利5,375,611(1994)。另一種方法涉及在從眼內(nèi)去除天然晶狀體之前,先在前囊和天然晶狀體之間注射殺細(xì)胞物質(zhì)。這類殺細(xì)胞物質(zhì)最好是以較強(qiáng)的酸或堿調(diào)節(jié)的水溶液,其中可以包含粘彈性物質(zhì)或染料。Dubroff,S.,“囊外白內(nèi)障眼科手術(shù)后防止后囊渾濁化的組合物和白內(nèi)障手術(shù)方法”,美國專利5,273,751(1993)。
      與本發(fā)明比較相關(guān)的是防止或逆轉(zhuǎn)白內(nèi)障形成的化學(xué)方法,其中包括使用能夠降低晶狀體相分離溫度并防止或抑制形成渾濁、高分子凝聚體和白內(nèi)障其它物理特征的的化學(xué)組合物。參見Clark,J.I.等,“利用相分離抑制劑的白內(nèi)障化學(xué)防止和逆轉(zhuǎn)”,美國專利5,401,880(1995)。
      使用單克隆抗體來防止繼發(fā)性白內(nèi)障也已經(jīng)有所報(bào)道。例如,先在前眼房引入晶狀體上皮細(xì)胞特異性補(bǔ)體固定性單克隆抗體,然后進(jìn)行囊外切除。在這類單克隆抗體與所有存在的晶狀體上皮細(xì)胞結(jié)合后,在前眼房內(nèi)引入補(bǔ)體,由此引起殘留晶狀體上皮細(xì)胞的溶解。Emey,J.M.等,“抗晶狀體上皮細(xì)胞的單克隆抗體和防止囊外切除術(shù)后殘留晶狀體上皮細(xì)胞增殖的方法”,美國專利5,202,252(1993)。
      也已經(jīng)使用通過插入在虹膜和晶狀體囊之間的探針利用電能或熱能來破壞晶狀體囊內(nèi)的殘留晶狀體上皮細(xì)胞。Bretton,R.H.,“防止后囊渾濁化的方法和儀器”,美國專利5,455,637(1995)。
      也已經(jīng)有對(duì)控制晶狀體上皮細(xì)胞增殖的光動(dòng)力學(xué)療法的說明。在光動(dòng)力學(xué)療法中,所用的光敏劑能夠進(jìn)駐靶細(xì)胞,或者是通過天然的傾向性或是因?yàn)樗鼈儽挥幸庵茖?dǎo)向某一特定類型的組織,或者兩者兼有。在接受照射時(shí),它們會(huì)發(fā)出熒光,這就可以用于與查找靶組織有關(guān)的診斷方法。但是,更重要的是,當(dāng)所用照射光的波長為化合物的吸收波長時(shí),光敏劑能夠引起對(duì)所駐細(xì)胞的細(xì)胞毒作用。雖然還沒有完全確定,但是這種細(xì)胞毒作用被認(rèn)為是在照射時(shí)產(chǎn)生了單態(tài)氧所致。
      就PDT治療繼發(fā)性白內(nèi)障而言,Parel,J.M.等報(bào)道了使用Photofrin II(PII)的實(shí)驗(yàn)性研究,“以使用Photofrin II進(jìn)行的囊內(nèi)清洗作為晶狀體上皮細(xì)胞增殖的光動(dòng)力學(xué)療法”,Lasers and Medical Science 525(1990)。這些作者們提出了他們技術(shù)中的數(shù)個(gè)技術(shù)難題,其中包括PII從囊袋中的不斷滲出,和清洗后低于15分鐘的最少吸收時(shí)間。而且,30小時(shí)后,PII的熒光仍可測(cè)得,但是不再有足夠的特異性來確保光動(dòng)力學(xué)療法治療的安全。
      Lingua,R等的相關(guān)研究,“對(duì)抑制晶狀體上皮細(xì)胞增殖的光動(dòng)力療法的臨床前評(píng)價(jià)”,Lasers and Light in Ophthalmology 2(2)103(1988),報(bào)道了使用Photofrin的光動(dòng)力學(xué)療法的早期試驗(yàn)。這些作者報(bào)道,他們的技術(shù)的確造成了局部上皮細(xì)胞和纖維細(xì)胞的死亡,而且,這類物質(zhì)從晶狀體囊內(nèi)流出造成了局部的眼毒性例如眼色素層炎和角膜水腫。他們提出,抑制晶狀體細(xì)胞增殖的作用需要晶狀體囊將光活性藥物包含在內(nèi),而且需要設(shè)法在照射期間維持光傳遞的均勻性?;衔锏挠猛局皇菍⑵渑cHealon混合以提高制劑的粘度。
      在其它研究報(bào)道中,曾將酞菁鋁體外用于豬晶狀體上皮細(xì)胞的鋪滿前培養(yǎng)物。1小時(shí)的吸收后,用紅光照射培養(yǎng)物5分鐘,結(jié)果發(fā)現(xiàn)有毒性作用。Wunderlick,K.等,“酞菁在豬晶狀體上皮細(xì)胞培養(yǎng)物中的光動(dòng)力活性”,Ophthalmology 92(3)346(1995)。
      作為一個(gè)重要的制約,外科醫(yī)生指出即使是10分鐘的光敏劑吸收延遲對(duì)白內(nèi)障手術(shù)來說也太長。所以,光敏組合物的吸收速度和準(zhǔn)確定位給予具有特殊的重要性?,F(xiàn)有技術(shù)中的組合物都不具備此類良好的吸收參數(shù)。
      本發(fā)明開發(fā)了另一種PDT技術(shù),它使用了一組較好的光敏劑,在較短的培養(yǎng)時(shí)間內(nèi),他們能夠被殘留的晶狀體上皮細(xì)胞迅速吸收,保留在晶狀體囊內(nèi),并傳遞到靶細(xì)胞。光敏劑被保留在晶狀體囊內(nèi)避免了對(duì)眼內(nèi)其它非靶部分的光致敏作用。由于這些光敏劑呈綠色而非紅色,所以他們被稱為“綠卟啉”。有一定的波長范圍的光為血液或其它正常組織所強(qiáng)吸收,使用本發(fā)明化合物就能夠利用波長在該范圍之外的光進(jìn)行光動(dòng)力治療,具體地說是約670-780nm。除了被包含在靶組織內(nèi)而提供有效的體內(nèi)治療因而減少非靶組織的過敏作用之外,還很容易做到令照射光滲透到合適的深度。
      已知,綠卟啉可用于光動(dòng)力治療來查找和治療動(dòng)脈粥樣硬化栓塞。參見1995年3月21日授權(quán)Levy等的美國專利5,399,583(第2頁,第14至15行);1990年4月24日授權(quán)Levy等的美國專利4,920,143(第10頁,第58至59行);1992年3月10日授權(quán)Levy等的美國專利5,095,030(第2頁,第8至9行和第15頁,第29至30行);1992年12月15日授權(quán)Levy等的美國專利5,171,749(第2頁,第12至13行和第18頁,第1至4行和第35至47行)。
      一類具有一定臨床意義的特殊的綠卟啉是一類被稱為苯并卟啉衍生物(BPD)的化合物。已經(jīng)對(duì)這些光敏劑與其它眼病的關(guān)系進(jìn)行了一定的測(cè)試。例如,Schmidt U.等記述了用BPD治療植入家兔眼內(nèi)的Greene黑素瘤(一種非著色型腫瘤)的實(shí)驗(yàn)并獲得了腫瘤壞死作用(IOVS 331253摘要2802(1992))。Lin,C.P.等記述了用氬離子激光儀發(fā)射的458nm光激發(fā)BPD來進(jìn)行熒光造影,以測(cè)定其在視網(wǎng)膜和脈絡(luò)膜脈管內(nèi)的動(dòng)力學(xué)和分布(IOVS 341168摘要2293(1993))。此外,Lin,C.P.等記述了利用BPD的脈絡(luò)膜脈管封閉(IOVS 341303摘要2953(1993))。
      與本申請(qǐng)轉(zhuǎn)讓人合作的研究者已經(jīng)在1993年3月15日公開的數(shù)份摘要和專利申請(qǐng)(08/390591)中記述了用BPD治療脈絡(luò)膜脈管增生,本文將其納為參考。這些摘要包括Schmidt-Erfurth,U等“使用BPD導(dǎo)致的對(duì)眼內(nèi)脈管增生的光致血栓形成”;Haimovici,R等“苯并卟啉衍生物一元酸在家兔眼內(nèi)的定位”和Walsh,A.W.等“使用BPD-MA對(duì)實(shí)驗(yàn)性脈絡(luò)膜脈管增生進(jìn)行的光動(dòng)力治療”。以上這些都公開在IOVS341303中,分別為摘要256,255和254(1993),還有Moulton,R.S.等“視網(wǎng)膜和脈絡(luò)膜脈管對(duì)苯并卟啉衍生物一元酸光動(dòng)力治療的反應(yīng)”IOVS341169摘要58(1993)。
      本發(fā)明所涉及的綠卟啉的制劑和PDT療法的優(yōu)點(diǎn)在于對(duì)造成繼發(fā)性白內(nèi)障的細(xì)胞的選擇性和引發(fā)對(duì)這些細(xì)胞的光動(dòng)力介導(dǎo)破壞作用的能力。而且,綠卟啉被靶細(xì)胞吸收較快,因而縮短了目前PDT技術(shù)相關(guān)手術(shù)中的延遲時(shí)間。因?yàn)槭怯糜诜乐估^發(fā)性白內(nèi)障,這類綠卟啉因此具有選擇性和吸收快的特殊優(yōu)點(diǎn)。
      發(fā)明概述本發(fā)明涉及主要使用綠卟啉作為光活性化合物的光動(dòng)力療法(PDT)防止繼發(fā)性白內(nèi)障的用途。當(dāng)用于破壞殘留晶狀體上皮細(xì)胞時(shí),這些物質(zhì)具有被晶狀體上皮細(xì)胞吸收快,具有選擇性和有效性的優(yōu)點(diǎn)。
      所以,本發(fā)明一方面涉及一種防止繼發(fā)性白內(nèi)障的方法,該方法包括給需要受治者使用一定量的綠卟啉,這些綠卟啉將定位于造成繼發(fā)性白內(nèi)障的晶狀體上皮細(xì)胞內(nèi);和用被綠卟啉吸收的光照射這些細(xì)胞。
      在具體的一個(gè)方面,本發(fā)明還涉及防止眼內(nèi)繼發(fā)性白內(nèi)障的方法,它包括以下步驟給患者的晶狀體囊使用足量的綠卟啉以使得有效量的綠卟啉定位于晶狀體上皮細(xì)胞內(nèi);給予足夠的時(shí)間讓有效量的所述綠卟啉進(jìn)入晶狀體上皮細(xì)胞;和用綠卟啉吸收的光照射這些細(xì)胞,其能量水平足以基本上破壞全部晶狀體上皮細(xì)胞。特別是,該方法涉及破壞在白內(nèi)障手術(shù)過程中去除晶狀體后的殘留晶狀體上皮細(xì)胞。
      本發(fā)明還包括在使用綠卟啉之前用一粘性溶液來保護(hù)角膜的步驟。而且,可將綠卟啉與增稠劑混合。這類增稠劑可任意地選自透明質(zhì)酸及其衍生物、淀粉和纖維素及其衍生物。
      在一具體試劑中,本發(fā)明方法包括使用有效量,即約0.2至約2mg/ml和約150至250μl的綠卟啉。更具體地說,給藥劑量范圍是約0.03至0.5mg,進(jìn)一步說是約0.3mg。這類制劑也可以以脂質(zhì)體制劑的形式給藥,此時(shí),可先將綠卟啉配制在脂質(zhì)體內(nèi),然后將脂質(zhì)體與粘稠載體例如Ophthalin,Hymacel或AMVISC混合。
      本發(fā)明方法特別考慮了綠卟啉的使用,它們選自BPD-DA、BPD-DB、BPD-MA和BPD-MB,以及這些化合物的衍生物。較好的BPD包括BPD-MA和BPD-DA。
      就組合物而言,本發(fā)明設(shè)計(jì)了防止或抑制繼發(fā)性白內(nèi)障發(fā)展的藥物組合物,這類組合物包含有效量的綠卟啉,它們可在用于接受白內(nèi)障手術(shù)的患者時(shí)預(yù)防或抑制繼發(fā)性白內(nèi)障的發(fā)展;和藥學(xué)上認(rèn)可的載體或賦形劑。
      附圖簡述參照附圖可對(duì)本發(fā)明有更清除的了解。


      圖1是典型的本發(fā)明方法和組合物所用綠卟啉的結(jié)構(gòu)式。
      圖2是本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施例中特定的4種綠卟啉BPD-DA、BPD-DB、BPD-MA和BPD-MB的結(jié)構(gòu)式。
      圖3顯示在無光條件下與BPD孵育后人晶狀體上皮細(xì)胞的存活率。
      圖4顯示BPD和光對(duì)人晶狀體上皮細(xì)胞的細(xì)胞毒性。
      圖5顯示PDT的細(xì)胞毒性是長效的。
      圖6顯示BPD縮短孵育時(shí)間的作用。
      圖7顯示ZnPc對(duì)人晶狀體上皮細(xì)胞的光致敏作用。
      圖8顯示粘性溶液中BPD的傳遞作用。
      圖9顯示BPD從Amvisc或Hymecel中向平衡鹽溶液中的擴(kuò)散。
      圖10顯示接受BPD和紅光處理的家兔上皮細(xì)胞。圖10A是無光對(duì)照。圖10B是接受光照的細(xì)胞。
      圖11顯示接受BPD和紅光處理的Vero細(xì)胞。圖11A是未處理細(xì)胞,圖11B-D顯示不同濃度的BPD。
      本發(fā)明詳細(xì)說明本發(fā)明涉及以特定細(xì)胞為目標(biāo)的光動(dòng)力療法(PDT),所述細(xì)胞即晶狀體上皮細(xì)胞,它們?cè)诎變?nèi)障手術(shù)后的某一時(shí)刻(可能數(shù)月或數(shù)年)造成繼發(fā)性白內(nèi)障。為了防止繼發(fā)性白內(nèi)障,該治療被作為常規(guī)白內(nèi)障手術(shù)過程中的一個(gè)附加過程。所以,在去除晶狀體之后和植入(例如)新眼內(nèi)晶狀體之前,常規(guī)的白內(nèi)障手術(shù)過程被中斷。用約1分鐘在晶狀體囊內(nèi)引入合適的卟啉化合物,以綠卟啉為佳,然后去除。期間,卟啉化合物將進(jìn)駐晶狀體上皮細(xì)胞。利用合適的光源施以適當(dāng)頻率和強(qiáng)度的光,用以激活卟啉殺死上皮細(xì)胞。在此PDT過程之后,繼續(xù)并完成常規(guī)手術(shù)過程。
      本發(fā)明的制劑和方法一般涉及給患者使用綠卟啉,即一類被稱為苯并卟啉衍生物(BPD)的化合物。如圖1所示,BPD是一種合成的二氫卟酚樣卟啉,具有多種結(jié)構(gòu)類似物。較好的是,綠卟啉是苯并卟啉衍生物二元酸或一元酸環(huán)A(BPD-DA或BPD-MA),它們吸收約692nm的光,并具有更好的組織滲透性。例如BPD-MA,它是一種親脂性強(qiáng)光敏劑,并表現(xiàn)出對(duì)新生脈管組織、腫瘤和殘留晶狀體上皮細(xì)胞的光毒性作用。在用于吸收適當(dāng)制劑(例如BPD-MA被晶狀體上皮細(xì)胞吸收)的不到一分鐘之后,對(duì)晶狀體囊內(nèi)表面和赤道表面上的所有晶狀體上皮細(xì)胞基本均勻地施以適當(dāng)波長的光。由于其藥物動(dòng)力學(xué)特征,BPD似乎是用于此癥的最佳候選藥物,但是也可以代之以BPD-DA這類的其它綠卟啉或其它衍生物(參見圖1的結(jié)構(gòu)式1至6)??梢允褂闷渌饷魟?,例如酞菁,可以用足夠高的濃度來抵消其慢吸收。但是,使用這類化合物,技術(shù)人員可能將需要配制所選擇的各種致敏劑,以控制意外污染眼睛其它部分的可能性。
      本發(fā)明特別好的制劑應(yīng)滿足以下一般標(biāo)準(zhǔn)。首先,必須使用能夠迅速進(jìn)入靶細(xì)胞即晶狀體上皮細(xì)胞的光敏劑。第二,產(chǎn)品的粘度必須保證在孵育期間它基本上被包含在晶狀體囊內(nèi)。第三,可以包括促進(jìn)這些光敏劑被靶細(xì)胞吸收的成份。具體的例子是,將0.1ml BPD-MA儲(chǔ)備液加入1.9ml例如Opthalin之類的粘彈體內(nèi),然后如后文實(shí)施例所述進(jìn)行混合。
      在白內(nèi)障手術(shù)過程中,晶狀體的前壁或被切除以便切除囊外晶狀體,或被部分切除(晶狀體囊切開術(shù))以便引入晶狀體乳化劑來進(jìn)行囊間晶狀體摘除。所以,將光敏劑成功地包含在晶狀體囊內(nèi)一定的孵育時(shí)間將取決于將光敏劑引入晶狀體囊的制劑的粘度。孵育的時(shí)間對(duì)包含作用而言也很重要,以不超過約1分鐘為佳,理想的是少于45秒,最好少于約30秒。
      切除晶狀體囊內(nèi)表面和使用PDT化合物可能引起用于防止繼發(fā)性白內(nèi)障的光敏劑溢出,從而縮短其在所需囊內(nèi)位點(diǎn)的滯留。所以,本發(fā)明的一項(xiàng)重要內(nèi)容是為了保護(hù)眼睛的角膜這一敏感區(qū)不被光敏劑污染,在使用光敏劑之前先用無藥物粘彈性物質(zhì)覆蓋角膜內(nèi)皮。
      在用PDT防止繼發(fā)性白內(nèi)障時(shí)還需要考慮其它情況。例如,囊的形狀,即,一個(gè)長球體,赤道位置的細(xì)胞具有強(qiáng)有絲分裂能力,而且在考慮使用光動(dòng)力療法時(shí),因其尺寸較小使得均勻的光傳遞很困難。另一制約是,眼外科醫(yī)生繁忙的手術(shù)日程不允許就白內(nèi)障手術(shù)本身再加入一個(gè)冗長的過程。所以,用于防止繼發(fā)性白內(nèi)障的PDT的最佳光敏劑必須被晶狀體上皮細(xì)胞迅速吸收,必須充分地、物理性地被包含在晶狀體囊內(nèi)。
      在給予光致敏綠卟啉之后,最好讓化合物在約1分鐘之內(nèi)被晶狀體上皮細(xì)胞所吸收。然后,用綠卟啉最大吸收波長照射這些晶狀體上皮細(xì)胞,一般如前所述在約550nm和695nm之間。特別好的是紅光,因?yàn)樗芰枯^低,所以在破壞晶狀體上皮細(xì)胞的同時(shí)對(duì)眼組織無毒。
      本發(fā)明的組合物和方法提供了防止繼發(fā)性白內(nèi)障的有效PDT治療。后文敘述了本發(fā)明的組合物及其配方,以及它們的臨床應(yīng)用。同時(shí)提供了實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。
      綠卟啉本發(fā)明方法所用綠卟啉的詳細(xì)說明可參見1992年12月15授權(quán)Levy等的美國專利5,171,749,本文將其納為參考?!熬G卟啉”指卟啉核與炔經(jīng)為獲得一氫苯并卟啉的Diels-Alder型反應(yīng)而獲得的卟啉衍生物。典型的是,綠卟啉選自乙炔與原卟啉在一定條件下發(fā)生Diels-Alder反應(yīng)而獲得的一類卟啉衍生物,所述條件促進(jìn)反應(yīng)只發(fā)生于存在于原卟啉-IX環(huán)系統(tǒng)中的兩個(gè)可用的共軛、非芳香二烯結(jié)構(gòu)(環(huán)A和環(huán)B)之一。
      圖1顯示了幾種典型的綠卟啉的結(jié)構(gòu)。Diels-Alder反應(yīng)先形成環(huán)己二烯-在此稱為“氫化苯基”-與吡咯環(huán)A或B稠合,如結(jié)構(gòu)式1和2所示。環(huán)己二烯環(huán)內(nèi)的π系統(tǒng)重排形成結(jié)構(gòu)式3和4化合物,經(jīng)還原產(chǎn)生結(jié)構(gòu)式5和6化合物。這些化合物以結(jié)構(gòu)式1至6表示,其中氫原子結(jié)合著內(nèi)環(huán)氮原子。但是,應(yīng)該理解的是,也可以使用其甲基化形式,其中陽離子置換了兩個(gè)氫原子之一或全部。有關(guān)本發(fā)明所用綠卟啉化合物的制備參見美國專利5,095,030,本文將其納為參考。
      為方便起見,氫化單苯并卟啉衍生物-“BPD”-一般指圖1中結(jié)構(gòu)式3和4化合物。特別好的是結(jié)構(gòu)式3和4化合物以及它們的混合物。
      如圖1所示,R1、R2、R3和R4是非干擾性的取代基,它們對(duì)本發(fā)明方法和組合物中的化合物活性沒有明顯影響?!胺歉蓴_性取代基”指不干擾BPD藥理學(xué)功能的取代基。就圖1和2中的化合物而言,一般說來,R1和R2各自是中強(qiáng)度吸電子取代基,或者是其它不具備足夠的吸電子能力的活性取代基,使得Diels-Alder反應(yīng)不能在A環(huán)和B環(huán)同時(shí)進(jìn)行,而是只發(fā)生于一個(gè)環(huán)。合適的R1和R2取代基的例子包括烷酯基(2至6C)、烷基(1至6C)磺?;蚍蓟?6至10C)磺酰基、芳基(6至10C)、氰基和-CONR5CO-,其中的R5是芳基(6至10C)或烷基(1至6碳)。R1和R2之一也可以是氫原子,只要另一個(gè)是足以促進(jìn)Diels-Alder反應(yīng)的吸電子取代基。最常見的是,R1和R2都是烷酯基,以甲酯基或乙酯基為佳。較好的化合物其R1和R2相同,都是烷酯基,特別是乙酯基。
      在此,“羧基”根據(jù)常規(guī)定義是-COOH,“烷酯基”表示-COOR,R是烷基?!棒然榛敝溉〈?R’-COOH,其中R’是亞烷基?!巴轷セ榛敝?R’-COOR,其中的R’和R各為亞烷基和烷基?!巴榛狈褐妇哂?至6個(gè)碳原子的飽和直鏈或支鏈烴基,例如甲基、正己基、2-甲基戊基、叔丁基、正丙基等?!皝喭榛敝付r(jià)而非單價(jià)的同一烷基。“芳基”表示可被1至3個(gè)取代基取代的苯基,取代基可各自選自鹵素例如氟、氯、溴和碘;低級(jí)烷基(1至4C);和低級(jí)烷氧基(1至4C)?!胺蓟酋;被颉巴榛酋;钡慕Y(jié)構(gòu)式為-SO2R,其中的R是以上所述的烷基或芳基。
      R3各自為ω-羧基烷基(2至6C)或其鹽、酰胺、酯或酰腙,或者是烷基(1至6C)。較好的是,R3是2-羧基乙基或其烷酯,R4是乙烯基。但是,較好的是這些實(shí)例,因?yàn)樘烊贿策目傻眯?,無需考慮生物學(xué)效應(yīng)。如圖1所示,R1-C≡C-R2與原卟啉-IX環(huán)系統(tǒng)(其中R3是2-羧基乙基的保護(hù)形式,例如2-甲酯基乙基或2-乙酯基乙基,R4是-CH=CH2)反應(yīng)生成的加合產(chǎn)物是結(jié)構(gòu)式1和2化合物。結(jié)構(gòu)式1化合物來自與A環(huán)的加合,結(jié)構(gòu)式2化合物來自與B環(huán)的加合。
      適合本發(fā)明綠卟啉化合物的方便的起始物質(zhì)包括天然存在的卟啉,其中R3是-CH2CH2COOH或-CH2CHRCOOR,其中R是烷基(1至6碳)。但是,R3的確切特性一般與Diels-Alder反應(yīng)的進(jìn)程或所得產(chǎn)物的效果無關(guān),除非它含有與環(huán)π鍵共軛的π鍵。所以,R3可以是多種基團(tuán)中的任意一種,例如低級(jí)烷基(1至4C);和ω-羧基烷基(2至6C)或其酯和酰胺。R3取代基還可以被鹵素例如氟、氯、溴或碘;或其它非反應(yīng)性取代基所取代。
      已經(jīng)發(fā)現(xiàn),當(dāng)R3是-CH2CHRCOOR時(shí),水解或部分水解酯化的羧基是有利的。典型的是,發(fā)生在R3位置的水解作用通常比發(fā)生在R1或R2酯基團(tuán)位置的快得多。而且,所得化合物的溶解度和生物分布特性也較非水解形式的更好。水解產(chǎn)生二元酸或一元酸產(chǎn)物(或它們的鹽)。
      在結(jié)構(gòu)式1和2化合物中,R4通常(至少最初)是-CH=CH2,但是該乙烯取代基很容易通過與結(jié)構(gòu)式1或2中環(huán)B或環(huán)A的乙烯基的加成或氧化而變成其它R4。所以,R4可能是多種取代基中的任意一種,與易發(fā)生的加成反應(yīng)所形成的相一致。例如,加成試劑可以是HX形式,其中的H與靠近環(huán)的碳原子加合,得到具有以下結(jié)構(gòu)的R4位

      所以,在實(shí)施例之一中,所加取代基之一是氫,而另一個(gè)則選自氫原子;鹵素(氟、氯、溴或碘);羥基;低級(jí)烷氧基;氨基;酰胺;巰基;或有機(jī)硫化物。例如,與水的Markovnikov加成反應(yīng)在相關(guān)環(huán)處形成結(jié)構(gòu)類似血卟啉的取代基。作為R4位取代基的乙烯基還可以被氧化成-CH2OH、-CHO或COOH或其鹽或酯。這些加成和氧化產(chǎn)物本身也可以被取代,如果所加的取代基是功能性離去基團(tuán)。例如如果Br是取代基,它可以被-OH、-OR(R是如前所述的烷基(1至6C))、鹵素、-NH2、-NHR、-NR2等取代。
      這樣,總的說來,R4代表這樣的取代基,即易因裂解或加成而轉(zhuǎn)化形成-CH=CH2,并因離去基團(tuán)與其它基團(tuán)反應(yīng)形成的進(jìn)一步取代基。但較好的是,R4是乙烯基(-CH=CH2);-CHOR4’,其中R4’是氫或烷基(1至6C),后者又可選性地被例如CH2OH之類親水性取代基所取代;-CHO;-COOR4’,例如COOH或COOCH3;-CH(OR4’)CH3,例如-CH(OH)CH3或CH(OCH3)CH3;-CH(OR4’)CH2OR4’;-CH(OH)CH2OH;-CH(SR4’)CH3,例如-CH(SCH3)CH3及其二硫化物;-CH(NR4’)CH3;-CH(CN)CH3;-CH(溴吡啶鎓)CH3;-CH(COOR4’)CH3;-CH(COOCR4’)CH3;-CH2(鹵素)CH3,例如-CH2BrCH3;或-CH(鹵素)CH2(鹵素)。或者,R4可以是由乙烯基直接或間接衍生化得到的少于12個(gè)碳原子的有機(jī)基團(tuán)。或者,R4可以是其它卟啉或卟啉相關(guān)性環(huán)系統(tǒng),例如后文定義的具有結(jié)構(gòu)式-L-P的含有1至3個(gè)含有四吡咯型核的基團(tuán)。優(yōu)選的是R4是-CH=CH2,-CH(OH)CH3,-CH(鹵素)CH3,或如后文定義的具有結(jié)構(gòu)式-L-P的含有1至3個(gè)含有四吡咯型核的基團(tuán)的化合物。
      “四吡咯型核”在此指具有如下骨架的4環(huán)系統(tǒng)

      或其鹽、酯、酰胺或酰腙,它是高度共軛的。它包括吡咯系統(tǒng),它實(shí)際上是完全共軛的系統(tǒng);二氫卟酚系統(tǒng),它實(shí)際上是卟啉的二氫化形式;還原的二氫卟酚系統(tǒng),它是共軛的卟啉系統(tǒng)的四氫化形式。當(dāng)說及“卟啉”時(shí),所指的是完全共軛系統(tǒng)。綠卟啉實(shí)際上是卟啉系統(tǒng)的二氫形式。
      在實(shí)施例之一中,取代基R4包括至少一個(gè)附加的四吡咯型核。本發(fā)明所得的化合物是二聚體或寡聚體,其中至少四吡咯型環(huán)系統(tǒng)之一是綠卟啉。綠卟啉部分在R4位與附加的四吡咯型環(huán)系統(tǒng)之間的連接可以是醚、胺或乙烯基連接。卟啉環(huán)系統(tǒng)有兩個(gè)與R4相應(yīng)的可用的取代基位置(在A環(huán)和B環(huán)中)可被進(jìn)一步衍生化,如以下所解說的。
      當(dāng)R4是“-L-P”時(shí),-L-選自


      P是卟啉結(jié)構(gòu)或圖1結(jié)構(gòu)式1至6所示的第二綠卟啉結(jié)構(gòu),所不同的是,任何第二R4,基團(tuán)都被以上L所取代。
      (而且,可以理解的是,當(dāng)-L-是上述結(jié)構(gòu)式(e)或(f)時(shí),雙鍵所連接的環(huán)系統(tǒng)應(yīng)包含如下共振系統(tǒng),

      如上所不。)由前述Diels-Alder反應(yīng)直接得到氫化一苯并卟啉還可以異構(gòu)化成圖1結(jié)構(gòu)式3和4所示的化合物。圖1結(jié)構(gòu)式3和4所示沒有顯示環(huán)外甲基(結(jié)構(gòu)式3的A環(huán)和結(jié)構(gòu)式4的B環(huán))與R2取代基的相對(duì)位置。兩種異構(gòu)體都可以獲得。本發(fā)明方法和組合物中特別優(yōu)選的是結(jié)構(gòu)式3和結(jié)構(gòu)式4所示的化合物。
      此外,Diels-Alder產(chǎn)物可以在鈀碳之類催化劑存在下經(jīng)氫氣處理選擇性還原成圖1中結(jié)構(gòu)式5和6飽和的環(huán)類似物,它們分別對(duì)應(yīng)A環(huán)和B環(huán)的Diels-Alder產(chǎn)物。以上有關(guān)結(jié)構(gòu)式1和2化合物的說明,即涉及保留的乙烯取代基(R4)的轉(zhuǎn)化衍生化和R3的多樣性,同樣適用于結(jié)構(gòu)式3、4、5和6所示的化合物。
      本發(fā)明較好的綠卟啉實(shí)例是Diels-Alder產(chǎn)物發(fā)生了重排并被部分水解。更好的是,結(jié)構(gòu)式3和4化合物(BPD類),其中R3位置的烷酯基也被水解或部分水解。本發(fā)明含有-COOH的化合物可以被制備成游離酸,或其與有機(jī)堿或無機(jī)堿的鹽形式。
      圖2顯示了結(jié)構(gòu)式3和4所代表的特別為本發(fā)明所優(yōu)選的4種化合物,總稱為苯并卟啉衍生物,即,BPD-DA、BPD-DB、BPD-MA和BPD-MB。這些是結(jié)構(gòu)式3和4重排產(chǎn)物的水解或部分水解形式,其中兩個(gè)被保護(hù)的R3的羧基之一或都被水解。R1和R2位上酯基的水解較慢,所以,向圖2所示形式的轉(zhuǎn)化很容易。在這些綠卟啉中最好的是BPD-MA。
      在圖2中,R3是-CH2CH2COOR3’,其中的R3’隨各化合物而異。具體地說,在BPD-DA中,R1和R2是烷酯基,R3’是氫,衍生化發(fā)生在環(huán)A。BPD-DB是B環(huán)衍生化的相應(yīng)化合物。BPD-MA代表BPD-DA的部分水解形式,BPD-MB代表BPD-DB的部分水解形式。所以,在后兩種化合物中,R1和R2是烷酯基,R3’之一是氫原子,另一個(gè)是烷基(1至6碳)。
      結(jié)構(gòu)式BPD-MA和BPD-MB化合物可以是均一性的,即只有C環(huán)烷酯基乙基或D環(huán)烷酯基乙基被水解,或者是C環(huán)和D環(huán)取代基水解物的混合物。此外,本發(fā)明方法和組合物可以使用BPD-MA,-MB,-DA和-DB中兩種或更多中的混合物。
      需要指出的是,圖1中的許多化合物含有至少一個(gè)手性中心,所以可能以光學(xué)異構(gòu)體形式存在。本發(fā)明方法可以使用具有手性碳兩種構(gòu)型的化合物,不論化合物是以一種立構(gòu)分離體形式使用,還是以對(duì)映體和/或非對(duì)映體的混合物形式使用??梢杂萌我庖环N常規(guī)方法來分離非對(duì)映體的混合物??梢杂萌我庖环N常規(guī)技術(shù)來拆分對(duì)映體混合物,例如,令它們與光學(xué)活性制劑反應(yīng),然后拆分所得的非對(duì)映體。
      還必須指出的是,反應(yīng)產(chǎn)物可以是A環(huán)和B環(huán)加成的未分離的混合物,即,結(jié)構(gòu)式1和2,或3和4,或5和6的混合物。本發(fā)明方法和組合物可以使用各種分離形式,即純結(jié)構(gòu)式3或純結(jié)構(gòu)式4,或它們?nèi)我獗壤幕旌衔铩?br> 而且,可以使用綠卟啉二聚體和卟啉/綠卟啉組合的二聚體或多聚體形式。本發(fā)明二聚體和寡聚體可以用與卟啉自身二聚或寡聚類似的反應(yīng)來制備??梢詫⒍鄠€(gè)綠卟啉或綠卟啉/卟啉直接連接,或者,可以偶合卟啉,然后經(jīng)末端卟啉之一或兩者的Diels-Alder反應(yīng)將其轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的綠卟啉。
      本發(fā)明的綠卟啉可以以單獨(dú)一種的形式使用,較好的是BPD-DA或BPD-MA,或者用各種綠卟啉的混合物。合適的是那些適合將治療化合物用于眼睛的制劑。此外,這類制劑中可以包含其它成份。其它成份包括可見染料或各種酶,以促進(jìn)光敏化合物透過殘留晶狀體物質(zhì)到達(dá)靶細(xì)胞。
      綠卟啉制劑本發(fā)明的組合物還可包含其它成份,例如常規(guī)的傳遞載體和賦形劑,其中包括等滲調(diào)節(jié)劑、pH調(diào)節(jié)劑、溶劑、助溶劑、染料、膠凝劑和增稠劑,以及緩沖液,和以上物質(zhì)的混合物。
      通常,光敏劑是在合適的溫度下(例如環(huán)境溫度),合適的pH,所需的純度,與藥學(xué)上認(rèn)可的載體(即在使用劑量和濃度無毒的載體)混合而成的。一般說來,制劑的pH主要取決于具體用途和光敏劑的濃度,但較好的是在約3至8之間。光敏劑宜維持在生理范圍的pH(例如約6.5至7.5)。鹽的存在不是必需的,所以,制劑最好不是電解質(zhì)溶液??梢约尤脒m量合適的非抗原性成份,例如人血清白蛋白,但不致干擾光敏劑被晶狀體上皮細(xì)胞所吸收。
      由于光敏劑將在白內(nèi)障切除術(shù)過程中用于晶狀體囊,期間不希望發(fā)生滲漏,所以最好使用凝膠之類粘性溶液而不是非粘性溶液。較好的是,制劑被制備成其粘度足以將光敏劑基本上全部包含在已有大切口的晶狀體囊內(nèi)。優(yōu)選制劑之一使用約5%(v/v)配制在脂質(zhì)體中的綠卟啉和約95%(v/v)透明質(zhì)酸鈉例如Ophthalin。
      以上是光敏劑與粘性載體的優(yōu)選比例,但是也可以根據(jù)給藥制劑所用的具體粘稠劑和各種可選性成份而異。而且,用不同的成份可以獲得相同的最終粘度,例如使用多糖,最好是水溶性多糖,例如透明質(zhì)酸、淀粉和纖維素衍生物(例如甲基纖維素、羥基纖維素和羧甲基纖維素)。如果在凝膠制劑中含有多糖,其含量一般在凝膠的約1-90重量%之間,更好的是約1-20%。就此目的而言,和考慮到多糖的溶解度,其它合適的多糖例子參見1988年5月11日公開的EP267015。還可以在本發(fā)明制劑中加入標(biāo)準(zhǔn)量的其它增稠劑,通常為有機(jī)纖維素醚,例如羥丙基甲基纖維素,或透明質(zhì)酸鹽,例如透明質(zhì)酸鈉。還可以加入標(biāo)準(zhǔn)量的常規(guī)緩沖劑。
      給定綠卟啉的具體濃度須根據(jù)其光敏活性來調(diào)節(jié)。例如,可以使用BPD-DA,但是其濃度需比使用BPD-MA時(shí)高5倍。而且,可以用不同于配制在脂質(zhì)體中的方式來溶解BPD。例如,可將BPD-MA或其它綠卟啉的儲(chǔ)備液稀釋在DMSO(二甲基亞砜)、聚乙二醇或其它適合用于眼睛的溶劑中。而且,需要保持藥物量和粘性物質(zhì)量之間比例的相對(duì)恒定,以保證粘度從而將藥物包含在晶狀體囊內(nèi)。
      一般說來,使用脂質(zhì)體BPD-MA時(shí)不需要調(diào)節(jié)pH,因?yàn)閮煞N物質(zhì)(即BPD和粘性物質(zhì))都是中性的。但是,如果使用其它溶劑而非脂質(zhì)體,需要在將藥物與粘稠物質(zhì)混合前調(diào)節(jié)pH??稍谥苿┲屑尤肟捎糜谘劬Φ囊志鷦?,抗氧化劑會(huì)影響療效,所以一般避免使用。
      本發(fā)明還考慮制備干制劑,在臨使用前再生成溶液??蓮谋景l(fā)明溶液利用已知方式來方便地制備本發(fā)明組合物的干的或凍干的制劑。本發(fā)明的干燥制劑也是可保存的。利用常規(guī)技術(shù),可在溫和條件下將溶液蒸發(fā)至干燥,特別是為了共沸除水而加入溶劑(一般是甲苯和乙醇的混合物)之后。然后,可方便地干燥殘留物,例如在烘箱中干燥數(shù)小時(shí)。
      合適的等滲調(diào)節(jié)劑最好是非離子等滲調(diào)節(jié)劑,例如脲、甘油、山梨醇、甘露醇、氨基乙醇或丙二醇。相反,氯化鈉之類的離子等滲調(diào)節(jié)劑是不適合用于本發(fā)明的。本發(fā)明的溶液中可能存在的等滲調(diào)節(jié)劑其含量足以形成大致等滲的溶液?!按笾碌葷B的溶液”在此指滲透壓約為300毫滲克分子(mOsm)的溶液,一般為300+10%mOsm。必需記住的是,溶液中的所有成份對(duì)滲透性都有作用。如果存在,非離子等滲調(diào)節(jié)劑的加量為常規(guī)量,即以約1至3.5重量%為佳,更以1.5至3重量%為佳。
      可在本發(fā)明溶液中加入標(biāo)準(zhǔn)量的助溶劑,例如Cremophor型,較好的是Cremophor RH40,吐溫型,或其它常規(guī)助溶劑。
      本發(fā)明更好的實(shí)施例涉及的溶液包含綠卟啉化合物和部分醚化的環(huán)糊精,其中醚取代基是羥乙基、羥丙基或二羥丙基,非離子等滲調(diào)節(jié)劑,緩沖液和可選溶劑。但是,合適的環(huán)糊精其大小和構(gòu)象必需適合與本發(fā)明的光敏劑聯(lián)用。
      綠卟啉化合物的給藥如前所述,本發(fā)明的治療是在去除晶狀體和引入眼內(nèi)晶狀體之間實(shí)施的。它代表典型白內(nèi)障手術(shù)過程中的短時(shí)間歇。所以,眼手術(shù)按照標(biāo)準(zhǔn)過程進(jìn)行,直至切除晶狀體。晶狀體的空位宜用生理鹽水來清洗,然后使用本發(fā)明所述的綠卟啉,為了提高其在晶狀體囊內(nèi)的保留性并減少滲漏,最好采用前述粘性制劑的形式。本發(fā)明制劑最好通過連接容器(例如注射器)的導(dǎo)管來使用。溶液被允許作用約1/2至10分鐘,以約1至3分鐘為佳,少于1分鐘更好,最好是15至30秒。如此孵育后,最好用生理鹽水再次洗滌晶狀體的空位,用于去除過量的綠卟啉。在洗滌后立即使用合適的光照。
      使用合適的光源,最好是波長約550nm至695nm的激光儀或二極管激光儀,對(duì)晶狀體上皮細(xì)胞進(jìn)行光照,光照時(shí)間足以破壞殘留的晶狀體上皮細(xì)胞。此類激光儀合適和較好的波長是最大波長的半值為690±12.5nm。一般說來,上皮細(xì)胞的破壞發(fā)生在60秒之內(nèi),而且可能在約15至約30秒之內(nèi)充分完全。最后,可以再次用合適的緩沖鹽溶液洗滌,然后按照標(biāo)準(zhǔn)過程完成白內(nèi)障手術(shù),即植入例如人造晶狀體。或者,可以將綠卟啉直接注入尚為完好的晶狀體來殺死晶狀體囊上皮內(nèi)的細(xì)胞(晶狀體切除術(shù))。過量化合物隨碎片一起被洗去,然后用合適的光源照射靶細(xì)胞。整個(gè)手術(shù)過程可以進(jìn)行適當(dāng)修改。
      在另一較好的實(shí)施例中,綠卟啉被制備成脂質(zhì)體制劑,或與配體偶合,所述配體例如單克隆抗體,其與特定的晶狀體上皮細(xì)胞表面成份結(jié)合,從而進(jìn)一步改善其作為光敏劑的效果。較好的是,配體包含抗體或其免疫活性片段。如前所述,通過使用其高粘度組合物而非水性制劑,可以進(jìn)一步提高眼外科手術(shù)過程中綠卟啉的選擇性定位能力,由此減少手術(shù)過程中從晶狀體囊中滲漏或溢出。該方法可將更高濃度的綠卟啉傳遞給靶組織。
      熟練技術(shù)人員可以根據(jù)其所處的物理傳遞系統(tǒng)來優(yōu)化綠卟啉的劑量,所述系統(tǒng)例如脂質(zhì)體;或者與靶特異性配體偶合,所述配體例如抗體或其免疫活性片段。
      需要指出的是,有效的、選擇性的本發(fā)明光動(dòng)力療法中所用的各種參數(shù)是相互關(guān)聯(lián)的。所以,必須根據(jù)其它參數(shù)來調(diào)節(jié)劑量,例如,根據(jù)光動(dòng)力療法中所用光的光通量、輻照度和持續(xù)時(shí)間,以及給藥和治療性照射之間的間隔時(shí)間。必須綜合調(diào)節(jié)所有這些參數(shù)以顯著破壞殘留晶狀體上皮細(xì)胞,但對(duì)周圍組織不造成顯著損傷。通常,所用綠卟啉的劑量在用于晶狀體囊內(nèi)制劑體積中低于約200μl。根據(jù)晶狀體囊上切口的大小、晶狀體狀態(tài)和是否存在血液或洗滌液等物質(zhì),可以使用更多或更少的制劑。一般說來,熟練技術(shù)人員應(yīng)盡量局部使用足量的綠卟啉,任何過量的化合物都必須被清洗掉,決不能有毒性危險(xiǎn)。綠卟啉的用量一般在約0.2至2.0mg/ml范圍內(nèi),以約0.5至約1.5mg/ml為佳,約1.0mg/ml更好。熟練技術(shù)人員可改變上述濃度,使得吸收參數(shù)和細(xì)胞破壞作用參數(shù)與前述就治療目的所言的相一致。
      照射的結(jié)果,三重態(tài)的綠卟啉與氧和其它化合物相互作用形成活性中間體例如單態(tài)氧,后者可導(dǎo)致細(xì)胞結(jié)構(gòu)的破壞??赡艿募?xì)胞性目標(biāo)包括細(xì)胞膜,線粒體、溶酶體膜。
      在PDT過程中使用的光劑量可以有所不同,但是以在約10至150J/cm2范圍內(nèi)為宜。較好的是50至100J/cm2范圍內(nèi)。增加輻照度可減少照射時(shí)間。
      光照時(shí)間具有重要意義,它能夠使治療具有盡可能高的選擇性從而減少對(duì)非靶細(xì)胞的損害,并有助于手術(shù)的成功。通常,應(yīng)該在使用光敏劑后立刻進(jìn)行光處理。
      實(shí)施例1評(píng)價(jià)BPD在HLE細(xì)胞培養(yǎng)物中的毒性為了評(píng)價(jià)總體毒性,使用了一種技術(shù)來培養(yǎng)人晶狀體上皮細(xì)胞,它們或是來自捐獻(xiàn)者,或是來自白內(nèi)障手術(shù)。
      人晶狀體細(xì)胞(HLE)中的大多數(shù)是經(jīng)取自供體死后12-48小時(shí)的晶狀體培養(yǎng)起來的,由Eye Bank of British Columbia提供的這些眼睛是后極(posterior poles)(已預(yù)先現(xiàn)切除了角膜)。偶爾,提供的會(huì)是完整的眼睛。而且,提供的還有在低溫PBS中保存了1至5小時(shí)的切下的晶狀體。晶狀體囊取自20至72歲的男女捐獻(xiàn)者。晶狀體前囊都需在平面位置(和/或至多在赤道面前0.5mm)開一環(huán)性切口。此外植體細(xì)胞向下放置在塑料培養(yǎng)皿(35mm)中,其中含有補(bǔ)充了15%FCS的DME。然后用轉(zhuǎn)動(dòng)彎曲解剖刀將晶狀體囊切成許多1mm寬的平行條,這些條的末端別粘接在培養(yǎng)皿的表面。每隔2至3天給外植體補(bǔ)以新鮮培養(yǎng)基。任細(xì)胞生長,直至長到單層完全鋪滿或基本鋪滿,然后用0.25%胰蛋白酶的EDTA溶液傳代。使用的是第二或第三代的HLE細(xì)胞。在與HLE細(xì)胞相同的條件下培養(yǎng)VEROGreen Monkey腎細(xì)胞(由QLT提供),使用的是自冷凍儲(chǔ)備物起傳代到20代之前的細(xì)胞。
      在該系統(tǒng)中,經(jīng)測(cè)定,僅與BPD濃度范圍為0-800μg/ml(在5%胎牛血清中,F(xiàn)CS)孵育10分鐘,不影響細(xì)胞的存活。(圖3)實(shí)施例2在與BPD孵育后光照HLE細(xì)胞實(shí)施例1的細(xì)胞與BPD孵育10分鐘后,去除過量藥物,然后馬上用發(fā)光二極管(LED)以10J/cm2的紅光(690±12.5nm)照射細(xì)胞。正如預(yù)計(jì)的,存活細(xì)胞大大減少。在5%FCS,400-800ng BPD/ml存在下,紅光照射殺死了80-100%的細(xì)胞。在相關(guān)體外實(shí)驗(yàn)中,HLE細(xì)胞對(duì)BPD和光的敏感性根據(jù)捐獻(xiàn)者和培養(yǎng)的傳代數(shù)而有所不同(圖4)。細(xì)胞存活率是通過比色法,MTT,進(jìn)行測(cè)定的,它同時(shí)測(cè)定細(xì)胞的代謝和增殖,因此同時(shí)反映細(xì)胞毒性和細(xì)胞抑制性作用。參見Mossman,“細(xì)胞生長和存活的快速比色法用于增殖和細(xì)胞毒性測(cè)試”,Journal ofImmunological Methods 6555-63(1983)。所以,測(cè)定PDT效果是否是長效的是有意義的。HLE細(xì)胞在與BPD(含于5%FCS或25%Amvisc中)孵育1或20天(同一培養(yǎng)物分成2份)后再接受10J/cm2的紅光照射,實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示了可比較的細(xì)胞殺死率(圖5)。這表明,PDT的效果是長效的。
      研究之初認(rèn)為10分鐘的孵育時(shí)間是合理的,但是白內(nèi)障外科醫(yī)生認(rèn)為即使如此仍然太長而不能接受。所以,又在與BPD孵育一分鐘后測(cè)試了的PDT效果。結(jié)果顯示,雖然必須將BPD的濃度從每毫升納克提高到每毫升微克,但是獲得了令人滿意的細(xì)胞殺滅效果(圖6)。與3至5μg/ml的BPD接觸一分鐘,然后用10J/cm2紅光照射,基本上能夠殺死細(xì)胞。據(jù)觀察,在細(xì)胞敏感性方面具有一些個(gè)體差異(圖6)。但是,從藥學(xué)上說,這些濃度是很低的,可以方便地優(yōu)化到較高濃度來完全殺死細(xì)胞。BPD的主要特征就是被細(xì)胞快速吸收。
      另一種光敏劑,ZnPc,也接受了該系統(tǒng)的測(cè)試(1分鐘孵育,10J/cm2光照)。受到ZnPc儲(chǔ)備液的限制(200μg/ml水溶液),被測(cè)的最高濃度(200μg/ml)殺死細(xì)胞的最大值為62-78%(圖7)。
      實(shí)施例3用粘性溶液中的BPD處理HLE細(xì)胞如前所述,在臨床上,PBD最好在粘性溶液中來傳遞。就此而言,目前羥丙基甲基纖維素(HPMC;Hymecel)或透明質(zhì)酸鈉(SH;Ammisc,Opthalin,Biolon)較為適合,而且是本領(lǐng)域公知的。所以,在粘性溶液中傳遞的BPD光致敏HLE細(xì)胞是在其它載體中進(jìn)行的。由于其高粘度,在HLE培養(yǎng)系統(tǒng)中只用了含25%透明質(zhì)酸鈉Amvisc的平衡鹽溶液(BSS,用于手術(shù)的那種)進(jìn)行了測(cè)試,并與實(shí)施例2含5%FCS的培養(yǎng)基作了比較。數(shù)據(jù)顯示,HLE與兩種溶液中的BPD孵育10分鐘,然后用10J/cm2的紅光照射,引起的細(xì)胞死亡率相似(圖8)。這提示,在粘性溶液中,BPD也能夠有效地傳遞到細(xì)胞。
      將BPD包含在晶狀體囊內(nèi),防止其與其它眼細(xì)胞/組織接觸在某種程度上取決于它從粘性溶液中擴(kuò)散到其它無藥物的粘性溶液或平衡鹽溶液(BBS)中的情況,后兩種溶液都是在手術(shù)中用于維持眼壓的。初級(jí)體外實(shí)驗(yàn)顯示,BPD不會(huì)很快從Hymecel或Amvisc擴(kuò)散到BSS中,并且從Amvisc擴(kuò)散比從Hymecel還要慢得多(圖9)。所以,Amvisc或其它透明質(zhì)酸鈉溶液(例如Ophthalin)可以有效選作BPD的載體。還用30μg/ml BPD在100%Hymecel中的溶液對(duì)上皮細(xì)胞仍然完好的家兔晶狀體囊進(jìn)行了試驗(yàn)。在孵育1分鐘后,用10J/cm2的紅光照射,造成的細(xì)胞死亡率很高(圖9)。
      實(shí)施例4用粘性溶液中的BPD處理Vero細(xì)胞由于難以獲得足量的HLE細(xì)胞用于試驗(yàn),部分試驗(yàn)是用Vero細(xì)胞作為模型進(jìn)行的。將細(xì)胞培養(yǎng)在蓋玻片上,用含于100%粘性溶液(Hymecel,Amvisc和Ophthalin)中的BPD處理。用的都是1分鐘的孵育時(shí)間,但是光劑量和BPD濃度不同。BPD的測(cè)試濃度是5至30μg/ml,光照劑量是1、5和10J/cm2。使用Cytoprobe Assay Kit(PerSeptive Bio Science;乙錠均二聚體和鈣黃綠素-AM)通過熒光度測(cè)定細(xì)胞存活率。用照片顯示了殺死HLE細(xì)胞的的結(jié)果(圖10)。
      實(shí)施例5眼用制劑A的配備方法在無菌和柔光條件下,用無菌水將一瓶脂質(zhì)體BPD-MA(2mg/ml的儲(chǔ)備液)再生用于注射。取0.1ml BPD-MA溶液加入3ml玻璃注射器內(nèi)的1.9ml Ophthalin中。此時(shí),可以任選加入其它組份,例如助穿透細(xì)胞的藥物或?yàn)榱耸怪苿┰谟糜谘蹆?nèi)時(shí)看得見的染料。去除多余的空氣,用一不銹鋼Luer接頭將此注射器與另一3ml注射器相聯(lián)。將兩注射器之一中的粘性物質(zhì)交替推進(jìn)另一注射器與BPD混合,為了獲得均勻的制劑,可能需要最少推動(dòng)約30次。最終制劑呈綠色,BPD-MA的最終濃度約0.1mg/ml。將20號(hào)針頭與注射器連接,去除晶狀體后將制劑注入晶狀體囊,注意覆蓋囊的赤道區(qū)。
      實(shí)施例6眼用制劑B的配備方法在無菌和弱光條件下,將BPD-DA溶解在PEG400(濃度為10mg/ml)而成的溶液調(diào)節(jié)pH至近中性,然后過濾滅菌。然后,取0.1ml無菌BPD-DA溶液加入3ml玻璃注射器內(nèi)的1.9ml Ophthalin中。此時(shí),可以任選加入其它組份,例如助穿透細(xì)胞的藥物或?yàn)榱耸怪苿┰谟糜谘蹆?nèi)時(shí)看得見的染料。去除多余的空氣,用一不銹鋼Luer接頭將此注射器與另一3ml注射器相聯(lián)。將兩注射器之一中的粘性物質(zhì)交替推進(jìn)另一注射器與BPD混合,為了獲得均勻的制劑,可能需要最少推動(dòng)約30次。最終制劑呈綠色,BPD-MA的最終濃度約0.5mg/ml。將20號(hào)針頭與注射器連接,去除晶狀體后將制劑注入晶狀體囊,注意覆蓋囊的赤道區(qū)。
      實(shí)施例7制劑A的體內(nèi)應(yīng)用在家兔的晶狀體上皮上,對(duì)實(shí)施例5BPD-MA制劑經(jīng)690nm光照射后的細(xì)胞毒性進(jìn)行了體內(nèi)研究。首先,手術(shù)前先施以麻醉,然后令待處理家兔的眼睛膨大。手術(shù)包括用手術(shù)刀(前眼房管心針手術(shù)刀,0.9mm,VISITEC)在膜緣(8PM)切開。通過前眼房維持器(maintainer)引入平衡鹽溶液(BSS),以確保前眼房的壓力恒定(根據(jù)置于家兔頭部上方的BSS容器高度)。壓力保持眼房略為膨脹,虹膜收縮有助于接觸到晶狀體囊,并為操作和保持平衡提供了更多空間。
      接著,用管心針(直徑0.9mm)再在膜緣(12AM)造一入口,用帶把手的彎曲的25號(hào)針頭在晶狀體囊的前部進(jìn)行圓形前囊切除術(shù)。
      用3mm的角膜刀將12AM位置的開口開大。(該開口是讓儀器進(jìn)入前眼房和進(jìn)行全部操作的)。
      接著,引入晶狀體乳化劑,將晶狀體完全摘除(該過程需約1至1.5小時(shí))。在晶狀體乳化作用之后,用無藥物粘性溶液覆蓋角膜,以防因BPD溢出受損。
      用Raycroft導(dǎo)管和注射器用粘性溶液中的BPD完全覆蓋赤道位置的晶狀體囊壁。必須特別注意要覆蓋整個(gè)區(qū)域,尤其是赤道區(qū)。
      孵育(1分鐘;也可以使用更長的時(shí)間)后,將前眼房維持器內(nèi)的BSS吸入瞳孔和眼袋以洗去BPD。
      理論上說,光儀器應(yīng)通過12AM處的開口引入,而且其形狀必須能夠引入晶狀體囊,主要照射赤道區(qū),對(duì)虹膜、角膜和視網(wǎng)膜的照射很少(赤道區(qū)距離聯(lián)有前眼房維持器(ACM)的晶狀體囊前部的深度據(jù)估計(jì)為1mm)。
      用二極管激光儀以10J/cm2的光照射30秒,以殺死殘留的晶狀體上皮細(xì)胞。然后,根據(jù)常規(guī)技術(shù)繼續(xù)完成手術(shù)過程。
      根據(jù)以上的說明和舉例,本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員能夠開發(fā)和使用多種制劑來防止繼發(fā)性白內(nèi)障。這制劑可以不使用綠卟啉,只要所用的能夠被殘留晶狀體上皮細(xì)胞迅速吸收而且制劑能夠基本上被包含在晶狀體內(nèi)部并在經(jīng)合適的光短時(shí)間照射后能夠殺死晶狀體上皮細(xì)胞。所以,本發(fā)明的范圍是由后文權(quán)利要求限定的,而不是以上實(shí)施例。本文引用的所有公開文獻(xiàn),均被納為參考。
      權(quán)利要求
      1.一種防止患者眼內(nèi)繼發(fā)性白內(nèi)障的方法,它包括對(duì)患者的晶狀體囊給予足量的綠卟啉,該量足以令有效量的綠卟啉進(jìn)駐到晶狀體上皮細(xì)胞內(nèi);給予足夠的時(shí)間令有效量的所述綠卟啉進(jìn)入晶狀體上皮細(xì)胞;和用被綠卟啉吸收波長的、足夠能量的光照射所述的晶狀體上皮細(xì)胞,所述光能量足以基本上殺死所有的所述晶狀體上皮細(xì)胞。
      2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法,其中所述的晶狀體上皮細(xì)胞是在白內(nèi)障手術(shù)過程中摘除晶狀體后殘留的晶狀體上皮細(xì)胞。
      3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法,其中在給予綠卟啉之前使用粘性溶液來保護(hù)角膜。
      4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法,其中所述的綠卟啉與增粘劑混合。
      5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法,其中所述的增粘基選自透明質(zhì)酸及其衍生物、淀粉和纖維素及其衍生物。
      6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法,其中所述的有效量是指給予所含綠卟啉在約0.2至10mg/ml和150至250μl的制劑。
      7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法,其中所述的有效量是在約0.03至2.5mg范圍內(nèi)的給藥劑量。
      8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法,其中所述的有效量是約0.1mg。
      9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法,其中所述的綠卟啉以脂質(zhì)體制劑的形式給予。
      10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法,其中的綠卟啉具有圖1中的結(jié)構(gòu)式1至6,其中的R1、R2、R3和R4都是非干擾性取代基。
      11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法,其中R1和R2各自是甲酯基和乙酯基。
      12.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法,其中的各個(gè)R3是-CH2CH2COOH或其鹽、酰胺、酯或酰腙。
      13.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法,其中的綠卟啉具有圖1中的結(jié)構(gòu)式3或4,其中R4是非干擾性取代基。
      14.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法,其中所述的綠卟啉選自BPD-DA、BPD-DB、BPD-MA、BPD-MB以及它們的衍生物。
      15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法,其中所述的綠卟啉是BPD-DA。
      16.一種防止或抑制繼發(fā)性白內(nèi)障發(fā)展的藥物組合物物,所述的組合物包含有效量的綠卟啉,足以在給予接受白內(nèi)障手術(shù)的患者時(shí)防止或抑制繼發(fā)性白內(nèi)障的發(fā)展;和藥學(xué)上認(rèn)可的載體或賦形劑。
      17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的組合物,其中的綠卟啉是BPD。
      18.根據(jù)權(quán)利要求16所述的組合物,其中含包含可見的染料或有助于制劑被晶狀體上皮細(xì)胞吸收的酶。
      19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的組合物,其中所述的綠卟啉與增粘劑混合。
      20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的組合物,其中所述的增粘劑選自透明質(zhì)酸及其衍生物、淀粉和纖維素及其衍生物。
      21.根據(jù)權(quán)利要求19所述的組合物,其中所述的有效量指使用給予所含綠卟啉在約0.2至10mg/ml和150至250μl的制劑。
      22.根據(jù)權(quán)利要求19所述的組合物,其中所述的有效量是在約0.03至2.5mg范圍內(nèi)的給藥劑量。
      23.根據(jù)權(quán)利要求22所述的組合物,其中所述的有效量是約0.1mg。
      24.根據(jù)權(quán)利要求19所述的組合物,其中所述綠卟啉以脂質(zhì)體的形式給予。
      25.根據(jù)權(quán)利要求19所述的組合物,其中所述的綠卟啉具有圖1中結(jié)構(gòu)式1至6,其中的R1、R2、R3和R4都是非干擾性取代基。
      26.根據(jù)權(quán)利要求25所述的組合物,其中R1和R2各自是甲酯基和乙酯基。
      27.根據(jù)權(quán)利要求25所述的組合物,其中的各個(gè)R3是-CH2CH2COOH或其鹽、酰胺、酯或酰腙。
      28.根據(jù)權(quán)利要求25所述的組合物,其中的綠卟啉具有圖1中的結(jié)構(gòu)式3或4,其中R4是非干擾性取代基。
      29.根據(jù)權(quán)利要求25所述的組合物,其中所述的綠卟啉選自BPD-DA、BPD-DB、BPD-MA、BPD-MB以及它們的衍生物。
      30.根據(jù)權(quán)利要求29所述的組合物,其中所述的綠卟啉是BPD-DA。
      全文摘要
      使用例如綠卟啉之類的光活性藥物作為光敏劑破壞殘留的晶狀體上皮細(xì)胞,以進(jìn)行防止繼發(fā)性白內(nèi)障的光動(dòng)力治療。
      文檔編號(hào)A61K41/00GK1246054SQ97180428
      公開日2000年3月1日 申請(qǐng)日期1997年12月8日 優(yōu)先權(quán)日1996年12月10日
      發(fā)明者H·E·梅多斯, D·溫克斯特恩, D·R·馬萊克, N·巴斯阿尼奇, A·M·里克特, J·G·利維, C·A·哈里托, G·休伯, J·魯特曼 申請(qǐng)人:Qlt光治療股份有限公司, 不列顛哥倫比亞省大學(xué), 汽巴視覺股份公司
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