專利名稱：聚氨基葡糖藥物投遞系統(tǒng)的制作方法
優(yōu)先權(quán)本申請基于1996年6月11日提交的美國臨時申請第60/019543號，根據(jù)35U.S.C.§119(e)要求優(yōu)先權(quán)。
發(fā)明的領(lǐng)域概括地說本發(fā)明是關(guān)于一種新的藥物投遞系統(tǒng)。具體地說，本發(fā)明是關(guān)于一種包括修飾的鐵/聚氨基葡糖微粒和聚氨基葡糖配方化合物的藥物投遞系統(tǒng)，它提供了增強的經(jīng)口服給藥的藥物投遞效果。另一方面，本發(fā)明還涉及一種用于口服投遞治療或預防物質(zhì)的聚氨基葡糖基質(zhì)。
發(fā)明的背景發(fā)展有效的藥物投遞系統(tǒng)是制藥工業(yè)中研究和開發(fā)的必要部分。至今市場可得到的幾種投遞載體包括簡單的丸劑、錠劑、靜脈注射溶液、軟膏、鼻噴霧劑、透皮貼劑、滴眼劑等。為了能持續(xù)地延時釋放藥物，投遞措施尤其包括，可維持積蓄形成的延時釋放丸劑，滲透泵和組合物。對生物聚合物的鑒定和合成已導致發(fā)展了更先進的投遞系統(tǒng)，從而改善了口服給藥的方式〔Langer，Science 2491527-1533(1990)〕，并可能克服與生物活性喪失有關(guān)的問題，其生物活性喪失是由于藥物在消化道內(nèi)降解而引起，并因此導致藥物的有效度降低。特別有意義的是一些小的生物聚合物顆粒，它們能有效地捕獲藥物，保護藥物免受消化道雜亂環(huán)境的影響，并最終增加藥物在胃腸道內(nèi)的吸收。
幾丁質(zhì)，聚-β-(1→4)連接的N-乙酰基-D-葡糖胺，是一種自然界存在豐富的生物多聚物，它具有幾個特點使之適合于用作藥物投遞載體，包括在稀酸溶液中適中的溶解度和對有機化合物的高親和性。幾丁質(zhì)的脫乙?；问?，聚氨基葡糖，具有類似于葡糖氨基聚糖的結(jié)構(gòu)特征，在結(jié)締組織修補重建中顯得特別有前途，作為外源性基質(zhì)〔Muzzarelli et al.，Biomaterials 9247-252(1988)〕此外，聚氨基葡糖刺激巨噬細胞殺滅腫瘤細胞的活性和產(chǎn)生白介素1的能力，暗示有可能把它用作藥物載體，對免疫系統(tǒng)受壓劑的腫瘤患者給藥。同上文獻，這些特性已引導研究者試驗各種聚氨基葡糖制劑，希望得到一種可能的藥物投遞賦形劑，它本身能經(jīng)受住胃中的環(huán)境，同時能保護所結(jié)合的藥物，并且，使藥物能延時釋放。
過去的努力主要是針對聚氨基葡糖制劑，用局限性的體外試驗法，測定這種制劑保持完整性和提供持續(xù)地藥物釋放的能力。早期的體外試驗研究暗示，簡單的干燥聚氨基葡糖凝膠可能具有作為藥物持續(xù)釋放載體的潛在性用途〔Miyazaki，et al.，Chem.Pharm.Bull.293067-3069(1981)〕。近來的研究是將聚氨基葡糖微球或凝膠與例如下列成分共同配制交聯(lián)戊二醛〔Thacharodi和Ro，Biomaterial 16145-148(1995)；Chandy和Sharma，Biomaterials 14939-944(1993)〕；藻酸鹽〔Alexakis，等人，Appl.Biochem.Biotechnol.5093-106(1995)；Polk，等人，J.Pharm.Sci.83178-185(1994)；Miyazaki等人，Biol.Pharm.Bull.17745-747(1994)；Filiprovic-Grcic，等人，Intl.J.Pharm.11639-44(1995)；Bodmeier和Paeratakwl.J.Pharm.Sci.78964-967(1989)〕；含有抗衡離子如三聚磷酸鹽或氯化鈣的藻酸鹽〔Bodmeier，等人，Pharm.Res.6413-417(1989)〕，單獨的三聚磷酸鹽〔Sezer和Akbuga，Inel.J.Pharm.121113-116(1995)〕；以及氫氧化鈉/甲醇〔Chandy和Sharma Biomaterials13949-952(1992)〕。
摻合有鐵的聚氨基葡糖制劑似乎僅限于鐵被捕獲在聚氨基葡糖微球中的一種情況，并且然后再以脂質(zhì)體或者白蛋白包被，以便調(diào)節(jié)鐵從微球中釋放的速度〔Chandy和Sharma，Biomaterils 1761-66(1996)〕。在那種制劑中，來自FeCl3的鐵是被捕獲的“藥物”，而不是聚氨基葡糖微球本身的整個成分。而且，對鐵的捕獲受到將增溶聚氨基葡糖噴霧進入NaOH/甲醇溶液的影響，這種噴霧可產(chǎn)生直徑大約1毫米大小的聚氨基葡糖微粒。
用聚氨基葡糖微球進行的體內(nèi)試驗更是相當局限。例如，Jameela等人〔J.Biomatter Sci.Polym.Ed.6621-632(1994)〕描述一種聚氨基葡糖/藻酸鹽組合的微球，在對家兔舌下給藥之后，可使酮苯丙酸持續(xù)地釋放3小時之久。Illum等人〔Pharm，Res.111186-1189(1994)〕證明，鼻噴霧給予被捕獲在聚氨基葡糖中的胰島素之后，大鼠和綿羊的粘膜對胰島素的吸收增加了。但是，迄今尚未發(fā)現(xiàn)用于口服給藥的有效的聚氨基葡糖制劑。
因此，有必要在本領(lǐng)域開發(fā)有效的口服藥物投遞載體，它經(jīng)得住消化系統(tǒng)的嚴酷環(huán)境，并能夠持續(xù)地釋放所需要的藥物，否則這種藥物將是治療無效的，或者只有有限的有效性。上面描述的聚氨基葡糖的特性，使這種豐富的多糖成為這種載體有吸引力的選擇對象。
發(fā)明概述一方面，本發(fā)明是關(guān)于一種藥物投遞組合物，它包含將藥物捕獲在其中的鐵/聚氨基葡糖微?；驈秃衔铩Ｔ摻M合物對口服給藥特別有用，因為這種微粒或復合物對所捕獲的藥物提供對抗消化道嚴酷環(huán)境的保護，并且使藥物能夠通過一種可增加藥物循環(huán)半衰期的途徑被吸收。由這種金屬/聚氨基葡糖復合物提供的另一個優(yōu)點是對疏水有機化合物的高度親和性，它能夠把通常情況下不溶解的藥物投遞給循環(huán)系統(tǒng)。
在一個優(yōu)選的實施方案中，鐵/聚氨基葡糖微粒的大小小于10微米。但是，更優(yōu)選的是直徑小于5微米的微粒，而更優(yōu)選的是所有微粒的直徑都小于5nm，以便有利于腸粘膜細胞的胞內(nèi)吞作用。
另一方面，本發(fā)明還提供了一種用于口服投遞治療或預防藥物的聚氨基葡糖基質(zhì)，特別在此聚氨基葡糖投遞系統(tǒng)中特別需要使用的藥物，是那些基本上不能經(jīng)受消化道嚴酷環(huán)境的，因此吸收水平通常太低而不能用于口服投遞系統(tǒng)的藥物。作為一種口服投遞系統(tǒng)，本發(fā)明可用于各種劑型，如粉劑、丸劑、片劑(caplet)、膠囊劑、凝膠劑、液體、混懸液、乳劑、酏劑、糖漿劑等，只要制備過程不導致微球的大小，或具有優(yōu)選大小的微球在組合物中的特性發(fā)生顯著的改變?？赡苁沁@樣一種劑型，這種微粒本身可在很長一段時間內(nèi)釋放，或者使之在一段時間內(nèi)一直都有效。口服組合物優(yōu)選的設(shè)計是使活性化合物在胃腸道中特定的位置釋放，在此生物有效度最大，藥物降解作用最小。
盡管口服給藥是目前優(yōu)選的給藥方法，但是還應(yīng)考慮到其它的給藥途徑，包括例如皮下注射、透皮給藥、肌內(nèi)注射、靜脈內(nèi)注射、鼻內(nèi)給藥、肺內(nèi)給藥、直腸內(nèi)給藥、陰道內(nèi)給藥，腹膜內(nèi)注射、眼科給藥等，每種給藥方式的最佳微粒大小都各不相同，對此，本領(lǐng)域中任一普通的技術(shù)人員都能容易地確定。例如，較大的微粒在口服系統(tǒng)中比在注射系統(tǒng)中更容易被接受，注射給藥系統(tǒng)可能受機械注射裝置，和/或毛細血管大小制約因素的限制。
目前制備這種藥物投遞微粒的優(yōu)選方法包括，將聚氨基葡糖粉末溶解在酸溶液中，優(yōu)選地是含有乙酸的溶液，對生成的混合物作超聲波處理，并同時加入金屬鹽，優(yōu)選的是檸檬酸鐵銨。為了將藥物捕獲在微粒中，在超聲波處理之前，一開始就將酸穩(wěn)定性藥物制劑加到聚氨基葡糖的酸溶液中。但是，這種微粒的制備可能通過許多變換方法來實現(xiàn)。
例如，可購得的若干種不同等級的任何一種聚氨基葡糖都可用于制備這種藥物投遞系統(tǒng)，還包括不同程度脫乙?；木郯被咸?。聚氨基葡糖還可以從幾丁質(zhì)通過以本領(lǐng)域熟知的堿處理脫乙?；饔脕碇苽?。目前優(yōu)選的是脫乙?；诖蠹s50～80％之間的聚氨基葡糖。更優(yōu)選的是脫乙酰基60～75％的聚氨基葡糖。
此外，許多酸性緩沖液中的任何一種都可用于溶解聚氨基葡糖粉末。最初溶解聚氨基葡糖的酸溶液的濃度可在0.1％至15％范圍內(nèi)變化。但是最優(yōu)選的是2％的酸溶液。同樣，酸溶液的pH也可在1.0至6.8的pH范圍內(nèi)變化，但最優(yōu)選的緩沖液是在2～3的pH范圍之內(nèi)。
同樣地，多種鐵鹽都可用作在超聲波處理過程中引起顆粒形成的鐵源，包括例如氯化鐵。另一些金屬離子如鋅、銅或鎳在形成聚氨基葡糖微粒的過程中也可能有用，本發(fā)明對任何生理學可接受的酸或金屬鹽都加以考慮。
在另一個實施方案中，藥物可能以含有如下成分的組合物形式被口服給藥，所述組合物包含聚氨基葡糖，糖，例如但不限于麥芽糖、己糖、甘露糖或葡萄糖，以及藥物。本發(fā)明還涉及制備一種口服藥物投遞系統(tǒng)的方法。此方法包括如下步驟(a)制備聚氨基葡糖/糖溶液，(b)將藥物溶解于一種有機溶劑內(nèi)，例如，但不限于丙酮、甲醇、乙醇或乙腈，(c)將步驟(a)和(b)的溶液混合，(d)將步驟(c)的混合物冷卻干燥，以及(e)將此冷凍干燥的混合物再組合在適當?shù)目诜x形劑中用于對受治療者給藥。還可以將形成的冷凍干燥混合物研磨制成細粉末。另外，作為一種口服投遞系統(tǒng)，本發(fā)明還可以以多種劑型使用，如粉劑、丸劑、片劑(caplet)、膠囊劑、凝膠劑、液體、混懸液、乳劑、酏劑、糖漿劑等。還有另一個精心設(shè)計的實施方案是一種口服給藥的方法，包括對患者給予一個口服組合物，此組合物含有與糖和藥物組合的聚氨基葡糖。
還考慮用于該藥物投遞系統(tǒng)的其它可選擇成分。例如，但不局限于如下制藥學可接受的油canola油、玉米油、花生油、橄欖油、植物油、礦物油等，或脂類組合物也可能包括在此聚氨基葡糖/藥物混合物中，在超聲處理步驟之前，處理過程中或處理之后加入都可以。脂類的加入又可能使之必須加入任何一種生理學可接受的表面活性劑，這取決于待摻入藥物的物理特性。油或脂類可能對捕獲的藥物在通過胃腸道時提供附加的保護作用。還可能延緩治療或預防藥物從聚氨基葡糖基質(zhì)中的釋放，或者還可能改善在腸內(nèi)的吸收。如上所述，油或脂類還可能包括形成乳濁液，然后可以把它噴涂在表面、再干燥、收集并壓縮在膠囊或片劑中。作為另一種添加成分，還可能加入明膠作為帶有捕獲藥物的聚氨基葡糖基質(zhì)的固定劑，然后可以收集這種含有被固定治療或預防藥物的顆粒，用于以膠囊的形式給藥。
超聲處理進行的程度是，使形成的聚氨基葡糖微粒直徑小于10微米，優(yōu)選的是直徑小于5微米。最優(yōu)選的超聲處理是持續(xù)到使微粒直徑小于大約5毫微米，只要能得到優(yōu)選大小的微粒，超聲處理的持續(xù)時間和功率可以變化。此外，任何類型，型號的超聲處理器都可用于制備這種聚氨基葡糖微粒，同樣，只要形成的微粒具有優(yōu)選的大小。例如，無論是探頭式或者是水浴形式的超聲處理器都適合用于制備這種藥物投遞系統(tǒng)。這取決于超聲處理器的功率，超聲處理的持續(xù)時間可以從1分鐘變化到10分鐘。當前優(yōu)選的超聲處理器是Branson Sonifier Mode250，以最大強度的大約60％處理持續(xù)時間1～3分鐘。
作為使用超聲處理器的替代方法，還可以用各種類型的勻漿器，乳化器，液化器等來制備這種藥投遞系統(tǒng)。
為了對治療或預防物質(zhì)進行生理學投遞，用于制備聚氨基葡糖的優(yōu)選方法包括，將聚氨基葡糖溶解在酸性溶液中，然后加入治療或預防物質(zhì)。取等分量該混合物，與生理學可接受的油混合，并作超聲處理。生成的聚氨基葡糖基質(zhì)對口服投遞如下治療或預防物質(zhì)特別有用，例如激素(如，但不限于胰島素、孕酮、雌激素、睪丸素，糖皮質(zhì)激素、鹽皮質(zhì)激素、生長激素)，細胞因子(如，但不局限于白介素、淋巴因子、單核因子)，化學激活因子，造血因子(如，但不限于促紅細胞生成素)，以及其它治療或預防物質(zhì)，多肽或蛋白質(zhì)，這些物質(zhì)在口服投遞后通常是沒有生理活性的。在此系統(tǒng)中有用的蛋白質(zhì)或多肽可能是天然的和從天然存在的來源中純化的，還可能是重組產(chǎn)生的，或者化學合成的。
本發(fā)明還考慮用于制備這種藥物投遞系統(tǒng)方法的變化形式。例如，可通過優(yōu)選的方法制備聚氨基葡糖微粒，但不存在藥物。一旦按此方式制備了聚氨基葡糖微粒，然后就可以將它與所需要的藥物溶液混合，混合之后再將此混合物如上述進行處理。按另一種方法，同樣可在不存在藥物的情況下制備聚氨基葡糖微粒，再將顆粒冷凍干燥，隨后在含有藥物的溶液中重新水化。


圖1顯示在體外試驗中，溴百里酚蘭(BTB)從鐵(Fe)，聚氨基葡糖(Ch)，或者鐵/聚氨基葡糖微粒復合物中的釋放速度。
圖2顯示口服給予孕酮/鐵/聚氨基葡糖微粒后，孕酮的生物利用度。
圖3顯示口服給予聚氨基葡糖配制的孕酮后，與微?；脑型啾容^，孕酮的生物利用度。
圖4顯示，鏈脲佐菌素處理的動物在口服給予胰島素/聚氨基葡糖組合物或胰島素/PBS組合物后，表明血糖水平的數(shù)據(jù)。
發(fā)明詳述通過如下關(guān)于制備和應(yīng)用鐵/聚氨基葡糖藥物投遞組合物以及聚氨基葡糖/蛋白質(zhì)藥物投遞系統(tǒng)的實施例，對本發(fā)明進行說明。實施例1描述鐵/聚氨基葡糖微粒的制備。實施例2說明一種化合物在和從鐵/聚氨基葡糖微粒中的體外保留和釋放。實施例3表明在一段時間之后，鐵/聚氨基葡糖微粒對一種化合物體內(nèi)投遞。實施例4描述一種化合物從鐵/聚氨基葡糖微粒中的釋放，或者，聚氨基葡糖配制的化合物作為時間函數(shù)地釋放。實施例5描述用聚氨基葡糖作基質(zhì)口服給予胰島素。
實施例1制備鐵/聚氨基葡糖微粒首先通過在2％乙酸中溶解粉末狀的聚氨基葡糖，制備1％SeaSanMer N 2000級的聚氨基葡糖(CTC Organics，Atlanta，GA)溶液，并將此溶液作熱壓處理。為了制備鐵/聚氨基葡糖微粒，將1-5ml聚氨基葡糖溶液超聲處理1-3分鐘，同時滴加4％檸檬酸鐵銨貯備液，每毫升聚氨基葡糖溶液滴加0.2-0.3ml。檸檬酸鐵銨貯備液是預先用水配制的。這幾步的最后結(jié)果是形成了非常細微的聚氨基葡糖微粒懸液。典型地，此聚氨基葡糖微粒的密度大約是每毫升聚氨基葡糖溶液凈重0.3g，或者是每毫升重配的緩沖液含18mg冷凍干燥的固體。用測微計對懸液中的微粒作定時地測定，發(fā)現(xiàn)其直徑范圍大約是2至10微米。為了將小分子摻入此鐵/聚氨基葡糖微粒中，按如下所述對上述的方法進行了修改。
實施例2藥物釋放的體外試驗為了初步測定捕獲在如上述制備的聚氨基葡糖/鐵微粒中的小分子的釋放速度，按下述進行了體外透析試驗。A.制備含有溴百里酚蘭的鐵/聚氨基葡糖微粒制備5mg/ml溴百里酚蘭(BTB)(Sigma.St.Louis，MO)的水溶液，將相當于200μg的BTB與500μl如實施例1中制備的鐵/聚氨基葡糖溶液徹底混勻。另一種方法是，每毫升1％聚氨基葡糖溶液混合相當于400μg的BTB。將形成的混合物超聲處理3分鐘，同時，在超聲處理的過程中，滴加0.2-0.4ml 4％檸檬酸鐵銨水溶液，這樣，制備成含有溴百里酚蘭被捕獲在聚氨基葡糖微球中的桔黃色微粒。B.從鐵/聚氨基葡糖微粒釋放溴百里酚蘭的體外試驗將如上所述制備的含有溴百里酚蘭的鐵/聚氨基葡糖微粒，單獨置于具有12kD截止分子量的透析袋中，并將每個透析袋置于50ml的園錐形試管中，浸沒在45ml磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)中，以便測定BTB被釋放進入透析緩沖液的速度。將此試管放置在末端對末端的振蕩器上，通過用Spectronic-20在595nm自始至終地監(jiān)測光吸收度，來測定溴百里酚蘭釋放進入緩沖液的速度，平行地進行幾組對照試驗一組是在一個透析袋中僅含有等量的溴百里酚蘭，另一組是含有與聚氨基葡糖混合的溴百里酚蘭(不是如上述A部分中所述的摻合，而是仍形成了均勻的桔黃色溶液)還有一組是袋中含有與檸檬酸鐵銨溶液混合的溴百里酚蘭。
釋放速度顯示在圖1中。從圖中可見，與僅含有溴百里酚蘭的袋，含有與檸檬酸鐵銨混合的溴百里酚蘭的袋，或者含有與聚氨基葡糖混合的溴百里酚蘭的袋相比較，含有捕獲在鐵/聚氨基葡糖微粒中的溴百里酚蘭的透析袋，以低很多的速度釋放溴百里酚蘭。在保溫的初始階段，僅見從鐵/聚氨基葡糖微粒中相對緩慢的釋放，而較長時間保溫后，這種緩慢的釋放變得非常更加突出。這些數(shù)據(jù)表明，鐵/聚氨基葡糖微粒具有顯著的滯留最初被捕獲分子的能力，并且具有以緩慢的速度開始釋放這些分子的能力。
實施例3藥物釋放的體內(nèi)試驗鑒于上述實施例2中的體外試驗結(jié)果，我們設(shè)計了幾個實驗，用于測定是否在體內(nèi)鐵/聚氨基葡糖微粒也能延緩藥物的釋放。一種水溶性的殺真菌劑制霉菌素被選擇用于初步研究。A. 制備含有制霉菌素的鐵/聚氨基葡糖微粒用蒸餾水配制2mg/ml的制霉菌素(Sigma)懸液，取100μl與如實施例1中所述制備的200μl聚氨基葡糖溶液徹底混勻。將生成的混合液超聲處理2-3分鐘，同時加入4％檸檬酸鐵銨(100μl/ml聚氨基葡糖制霉菌素混合液)，生成帶黃色的微粒。將此懸液離心，抽吸除去上清液，并將微粒片再混懸在200μl磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)中。離心之后上清液清亮，表明藥物已高程度摻入，因為制霉菌素通常不溶于水，而在水溶液中形成微細顆粒狀態(tài)?？赏ㄟ^在C-18柱上進行HPLC(Waters)，以及通過用冷甲醇從微粒中萃取被捕獲的制霉菌素，測定藥物在聚氨基葡糖微粒中的摻入作用。B. 口服給予制霉菌素鐵/聚氨基葡糖微粒片制霉菌素的血清濃度對實驗組成年雌性小鼠用安裝在1ml注射器上的喂藥針頭，口服給予含有制霉菌素的鐵/聚氨基葡糖微粒。對第一對照組小鼠口服給予制霉菌素在PBS中的懸液，對第二對照組小鼠口服給予與制霉菌素混合的，并且其中加入了5μl戊二醛而形成了凝膠的聚氨基葡糖懸液。對每只小鼠給予了等量的大約4mg制霉菌素，體積為200-400μl。
小鼠在口服給藥后0小時、1小時和5小時，從后眼窩穿刺采血。使血液凝固，并分離出血清。在用冷甲醇萃取血清之后，如上所述用HPLC測定制霉菌素的血清濃度。
在如下表1中列舉了給藥后5小時的血液制霉菌素濃度值，在給藥后0小時和1小時，來測定出制霉菌素。與只接受了制霉菌素或者僅與聚氨基葡糖混合的制霉菌素的小鼠相比較，接受了被捕獲在鐵/聚氨基葡糖微粒中的制霉菌素的小鼠，在給藥后5小時產(chǎn)生了較高的血清制霉菌素濃度。此外，將口服或腹膜內(nèi)給予含制霉菌素的鐵/聚氨基葡糖微粒的二組小鼠血清制霉菌素濃度相比較表明，接受口服給藥的小鼠比腹膜內(nèi)給藥的小鼠具有比150％更高的血清制霉菌素濃度。此結(jié)果表明，與聚氨基葡糖結(jié)合提供了更高水平可利用的藥物。
表1用不同的投遞系統(tǒng)口服給藥后血中制霉菌素的濃度制劑濃度(μg/ml)制霉菌素PBS懸液 0.938與聚氨基葡糖和戊二醛混合的制霉菌素 0.338在鐵/聚氨基葡糖微粒中的制霉菌素 2.964在鐵/聚氨基葡糖微粒中的制霉菌素*1.787*除了是腹膜內(nèi)給藥外，這種制劑與上面緊靠的配方相同。
實施例4藥物釋放的體內(nèi)試驗為了進一步評價鐵/聚氨基葡糖微粒在體內(nèi)投遞和釋放藥物的效率，對不同組大鼠口服給予如下述(A-B)制備的孕酮。此實驗與實施例3的實驗不同之處在于對被捕獲藥物水溶解度的影響也進行了評價。另外，為了評價聚氨基葡糖配制的化合物在體內(nèi)被投遞和釋放的效率，對二組大鼠口服給予了如下述(C-D)制備的孕酮。A.制備含孕酮的鐵/聚氨基葡糖微粒將孕酮(Sigma Chemical Co.St.Louis，MO)溶于二甲基亞砜(DMSO，Sigma)中成最終濃度10mg/ml，并取1ml該溶液與含有0.1％吐溫20和1ml礦物油的等體積1％鐵/聚氨基葡糖相混合。將形成的乳濁液超聲處理1-3分鐘，同時滴加50μl檸檬酸鐵銨貯備液，在顯微鏡下對形成的溶液進行測定，已確定微粒大小的范圍是2-10微米。接受這種制備物給藥的大鼠被稱作第一組。
對照制備物包括懸浮于PBS中的孕酮，并且所形成的是經(jīng)超聲處理的懸液(用于對第二組給藥)，懸浮于PBS中的孕酮，在作超聲處理的過程中，對此懸液加入檸檬酸鐵銨(用于對第三組給藥)，以及不加檸檬酸鐵銨的孕酮懸液(用于對第四組給藥)。
除上述對照之外，還使用了含有水溶性孕酮的其它二個制備物。在水溶性的形式中，此甾類化合物被捕獲在2-羥基丙基-β-環(huán)糊精中，這種水溶性形式可從Sigma(St.Louis，MO)購得。在第一個水溶性孕酮制備物中，是將10mg/ml的甾類化合物溶液與1％聚氨基葡糖懸液混合(以每毫升聚氨基葡糖液含相當于10mg孕酮的比率)。將這種制備物對第5組大鼠給藥。含有水溶性孕酮的第二個制備物的制備法與第一個制備物類似，區(qū)別僅在于在超聲處理過程中加入了50μl 4％檸檬酸鐵銨，形成了帶有被捕獲甾類化合物的鐵/聚氨基葡糖微粒。此制備物對第6組大鼠口服給藥。B. 口服給予孕酮鐵/聚氨基葡糖微粒后孕酮的生物利用度對體重在300-350克的成年雌性大鼠(卵巢已被切除)，分別給予在(A)中所述各種孕酮制劑的一種，每種制劑的給藥劑量均為每只大鼠給予相當于1mg孕酮。用安裝在1ml注射器上的喂藥針頭口服給藥。在給藥后，0、2、4和20小時，通過后眼窩穿刺法對大鼠采血，使用Coat-A-Count孕酮固相放射免疫測定試劑盒(Diagnostic ProductCorporation，Los Angeles，CA)，通過放射性免疫測定法(RIA)測定血清孕酮濃度。
結(jié)果顯示在圖2中。發(fā)現(xiàn)給予在鐵/聚氨基葡糖微粒中含不溶性孕酮的第一組大鼠血清孕酮濃度最高，在給藥后4小時測定出最高的濃度。從給予捕獲在鐵/聚氨基葡糖中水溶性孕酮的第六組動物，也測定出類似的高濃度(特別是給藥后4小時)。雖然以其它幾種制劑給予孕酮的大鼠，在給藥后2小時也顯示出最高的血清孕酮濃度，但在給藥后4小時可測定的孕酮濃度降到至接近對照的水平。根據(jù)對孕酮通常公認的短半衰期，這些結(jié)果表明，對不同的制劑存在不同的孕酮釋放速度，或者是對被捕獲在鐵/聚氨基葡糖微粒中的甾類化合物(天然的或水溶性的)存在不同的吸收途徑。C. 制備聚氨基葡糖配制的孕酮將200mg孕酮(Sigma Chemical Co.St.Louis，MO)溶于5ml丙酮中(試劑級Fisher Scientific，Pittsburgh，PA)，同時將0.3g麥芽糖(Fisher Scientific)溶解于10ml 2％聚氨基葡糖溶液中(通過將粉末狀的SeaSanMer N 2000級聚氨基葡糖(CTC Organics，Atlanta，GA)溶解于0.25M檸檬酸(Fisher Scientific)中制備的)。將5ml孕酮/丙酮溶液與5ml聚氨基葡糖/麥芽糖溶液混合。使所形成的混合物在液氮中快速冷凍。并進行冷凍干燥。冷凍干燥之后，計算在這種經(jīng)研磨的混合物中相當?shù)脑型亓?通常是3.03-3.05mg精細粉末＝僅僅1mg孕酮)，也可以將形成的海綿狀干燥的聚氨基葡糖配制的孕酮研磨成細粉末。對實驗動物口服給藥時，將形成的冷凍干燥混合物在去離子水中重新配制。如前面所述，本發(fā)明還可以用于各種劑型，如粉劑、丸劑、片劑(Caplet)、膠囊劑、凝膠劑、液體、混懸液、乳劑、酏劑、糖漿劑等。D. 口服給予孕酮聚氨基葡糖微粒后孕酮的生物利用度將體重300-350克的成年雌性大鼠(卵巢切除)分成二個實驗組(每組7只動物)。接受了如(C)中所述重新配制的聚氨基葡糖配制的孕酮的動物被稱為A組(試驗組)，而接受了微?；?粉末狀)孕酮的動物被稱為B組(對照組)。用安裝在1ml注射器上的喂藥針頭對動物口服給藥，劑量為每只大鼠給予相當于5mg的孕酮。在給藥后0、1、5、24和48小時對大鼠采血，用Coat-A-Count孕酮固相放射免疫檢測試劑盒(Diagnostic Product Corportion，Los Angeles，CA)，通過放射性免疫測定法(RIA)測定血清孕酮濃度。
顯示在圖3中的結(jié)果表明，在給藥后1小時和48小時(P＝0.013)，以及給藥后24小時(P＝0.001)，接受了聚氨基葡糖配制的孕酮混合物的動物與對照動物(接受了微?；型?相比較，具有顯著較高的血清孕酮濃度。
實施例5蛋白質(zhì)藥物釋放的體內(nèi)試驗考慮到上述聚氨基葡糖基質(zhì)對藥物的生理學投遞之有效性的結(jié)果，進一步研究了聚氨基葡糖經(jīng)由同樣的口服給藥途徑投遞蛋白質(zhì)的能力。A. 制備含有胰島素的聚氨基葡糖微粒如上實施例1中所述在2％乙酸(pH 3.9)中配制1％聚氨基葡糖溶液，不同的是未對該混合物加入檸檬酸鐵銨。將1ml等分量聚氨基葡糖溶液與12mg牛胰腺胰島素(Sigma，大約300單位)混合，并使生成的溶液充分混合均勻，加入含有0.1％聚氧乙烯脫水山梨糖醇單月桂酸酯(吐溫20)(Sigma)的另1ml等分量聚氨基葡糖/乙酸溶液，并對混合液進行旋轉(zhuǎn)攪拌。取1ml等分量此最后的溶液，加入到1.5ml Canola油中(Hunt-Wesson Fullerton，CA)，并將此混合物超聲處理1分鐘在所形成的塊狀混合液中，胰島素的最終濃度是60單位/ml。
將6mg胰島素(大約154 U.S.P單位)加到1ml PBS中并將溶液充分混勻，作為對照。將Canola油加入此溶液，對形成的混合液超聲處理1分鐘。同上面的待測溶液一樣，形成的對照液表現(xiàn)為白色乳狀混合液，但是，對照混合液會逐漸分層，而待測液表現(xiàn)為穩(wěn)定的乳劑。B.正常動物口服給藥后胰島素的生物利用度兩組大鼠，每組3只，被用于口服給予上述在聚氨基葡糖基質(zhì)中制備的胰島素之后，測定胰島素的利用度。在此測定方案中，每只大鼠先喂給0.3ml 0.625g/ml的葡萄糖溶液。5分鐘之后，每次大鼠再喂給0.3ml胰島素/聚氨基葡糖混合液或者胰島素對照混合液。在給予胰島素之后的0、30、60和120分鐘，對每只大鼠從尾靜脈采血，用Exac Tech血糖檢測系統(tǒng)(Medisense，Waltham，MA)測定血液葡萄糖濃度。
結(jié)果列舉在表2中，該結(jié)果表明胰島素在聚氨基葡糖基質(zhì)中被口服給藥能引起血糖水平短時間地下降，而單獨口服給予胰島素時則未測定出血糖下降，但是，這些結(jié)果對如下問題沒有提供任何信息所見到的血糖下降是否是由于被吸收的聚氨基葡糖單獨引起。
表2給予胰島素后的血糖水平葡萄糖濃度(mg/dl±SD)時間(分鐘)對照組 試驗組0 84±7 90±930 119±18 50±560 114±18 63±3120 109±11106±34C. 正常和鏈脲霉素處理的動物口服給藥后胰島素的生物利用度為了確定上面看到的血糖降低是否是由于胰島素的生物利用度增加而引起，或者是由于聚氨基葡糖本身增加吸收而引起，應(yīng)用正常大鼠和通過給予鏈脲霉素(Sigma，St.Louis，MO)導至成為糖尿病狀態(tài)的大鼠〔Rakieten，et al.Cancer Chemotherapy Peports 2991-98(1963)〕，進行了如下的實驗。簡單地說，可通過靜脈內(nèi)注射鏈脲霉素來誘發(fā)大鼠糖尿病，此鏈脲霉素是溶解于以抗凝劑酸性檸檬酸葡萄糖(ACD)溶液緩沖的生理鹽水中(ACD以0.9％NaCl作1∶50稀釋)。該溶液的最終鏈脲霉素濃度是20mg/ml，pH5.0。通過0.22微米的濾膜對此稀釋液作過濾除菌，并在配制后10-15分鐘內(nèi)使用。大鼠先用氟烷麻醉，然后經(jīng)尾靜脈，以大約50mg/kg體重的劑量一次靜脈內(nèi)注射給藥。通常在給藥前血糖水平是在80-110mg/dl血液的范圍內(nèi)。給藥后第一天，血糖水平一般提高到大于600mg/dl，給藥后第6天，血糖水平一般是350-450mg/dl。
以在(A)中所述的口服藥物投遞系統(tǒng)對大鼠給予牛胰島素，并測定所引起的血糖改變。作為不同實驗的對照，來自每組的大鼠還按如下口服給藥(i)溶于PBS中的胰島素，(ii)按上述(A)中配制的胰島素但未加入聚氨基葡糖，以及(iii)上面(A)中所述的制劑，但未加入胰島素。作為補充的陽性對照，以溶于PBS的牛胰島素作肌內(nèi)注射給藥。
在起初的實驗中，如在(A)中所述制備的胰島素18.4單位可壓制血糖水平幾乎2小時之久，而肌內(nèi)注射0.26單位可壓制血糖達1小時之久。當從此口服投遞系統(tǒng)中省去聚氨基葡糖，或者僅以胰島素的PBS溶液單獨口服給藥，均未見血糖水平有任何改變。
在隨機的實驗中(見圖3)，如上述(A)中制備的胰島素18.4單位可壓制血糖水平2.5小時以上。以胰島素的PBS溶液處理的動物未見血糖水平有任何改變。D. 胰島素口服給藥治療糖尿病前面的結(jié)果表明，胰島素在聚氨基葡糖中經(jīng)由口服途徑給藥，能夠壓制血糖水平。為了測定口服給予胰島素治療糖尿病的能力，使用了一種動物模型，其中大鼠通過如上所述的靜脈內(nèi)給予鏈脲霉素而誘導形成糖尿病狀態(tài)。糖尿病的發(fā)作可通過測定血糖水平來監(jiān)測。當測得血糖持續(xù)地高于300mg/dl時，按下面的實驗對動物口服給予胰島素。
對一組大鼠給予如上面(A)中所述制備的胰島素，測定血糖水平，并與給予胰島素PBS溶液的一組大鼠血糖水平相比較。對每組的大鼠都給予了18.4單位胰島素。對于僅喂予胰島素PBS溶液的大鼠。未發(fā)現(xiàn)血糖水平的任何變化。但是，對于喂給包含在聚氨基葡糖中胰島素的大鼠，血糖水平在大鼠被監(jiān)測的最初3小時的過程中持續(xù)被壓制。這些資料表明，口服給予包含在聚氨基葡糖基質(zhì)內(nèi)的胰島素，對治療動物模型的糖尿病是有效的，這表明以同樣的藥物投遞系統(tǒng)，對治療人的糖尿病也可能有效。
最后，上述的方法和制劑還可用于其它藥物以及其它治療或預防物質(zhì)。這些藥物或物質(zhì)可以是(但不限于)那些難以溶解的藥物或物質(zhì)，例如許多精神活性藥物(如Clozapine)或激素(如胰島素、孕酮、雌激素、睪丸素、糖皮質(zhì)激素、鹽皮質(zhì)激素、生長激素)，細胞因子(如白介素、淋巴因子、單核因子)，化學激活因子，造血因子(如促紅細胞生成素)，或者其它治療或預防物質(zhì)。
可以預料，對于本領(lǐng)域的專業(yè)人員，根據(jù)上述例證性實施例中所述，可對本發(fā)明作出許多修改或變化。因此，僅僅在所附的權(quán)利要求中所列舉的范圍才應(yīng)該置于本發(fā)明之中。
權(quán)利要求
1.一種含有聚氨基葡糖-鐵復合物和藥物的口服藥物投遞組合物。
2.權(quán)利要求1的組合物，其是不溶性的。
3.權(quán)利要求1的組合物，其在酸性pH中是穩(wěn)定的。
4.權(quán)利要求1的組合物，其中的藥物是孕酮。
5.一種用于藥物投遞的方法，包括對患者給予一種含有聚氨基葡糖-鐵復合物和藥物的口服組合物。
6.權(quán)利要求5的方法，其中的組合物是不溶性的。
7.權(quán)利要求5的方法，其中的組合物在酸性pH中是穩(wěn)定的。
8.權(quán)利要求5的方法，其中的藥物是孕酮。
9.一種制備口服藥物投遞組合物的方法，該方法包括如下步驟(a)將聚氨基葡糖和藥物溶解于酸溶液中，(b)對此混合液作超聲處理，同時加入鐵鹽溶液，從而形成鐵/聚氨基葡糖/藥物微粒，以及(c)收集這種微粒。
10.權(quán)利要求9的方法，其中的酸溶液是乙酸溶液。
11.權(quán)利要求9的方法，其中乙酸溶液的濃度范圍為0.1％-15.0％。
12.權(quán)利要求9的方法，其中的乙酸溶液是2％的溶液。
13.權(quán)利要求9的方法，其中乙酸溶液的pH范圍是1.5-6.5。
14.權(quán)利要求9的方法，其中乙酸溶液的pH范圍是3.9-4.2。
15.權(quán)利要求9的方法，其中的鐵鹽是檸檬酸鐵銨。
16.權(quán)利要求9的方法，其中所需的藥物是孕酮。
17.一種通過權(quán)利要求9至16中任一權(quán)項的方法制備的口服藥物投遞組合物。
18.一種用于對患者口服投遞治療或預防物質(zhì)的方法，包括一種含有聚氨基葡糖，藥劑學可接受的油，以及該治療或預防物質(zhì)的組合物。
19.權(quán)利要求18的方法，其中的治療或預防物質(zhì)選自激素，細胞因子，化學激活因子和生長因子。
20.權(quán)利要求18的方法，其中的治療或預防物質(zhì)是胰島素。
21.權(quán)利要求18的方法，其中的油是選自canola油、玉米油、花生油、橄欖油、植物油和礦物油。
22.一種用于制備一種組合物的方法，該組合物是用于對動物口服給予治療或預防物質(zhì)，該方法包括如下步驟(a)制備聚氨基葡糖和治療或預防物質(zhì)的混合物，(b)加入藥劑學可接受的油，以便形成一種混合物，以及(c)將此混合物對動物口服給藥。
23.權(quán)利要求22的方法，其中的治療或預防物質(zhì)選自激素、細胞因子、化學激活因子以及生長因子。
24.權(quán)利要求22的方法，其中的治療或預防物質(zhì)是胰島素。
25.權(quán)利要求19的方法，其中的油是選自canola油、玉米油、花生油、橄欖油、植物油以及礦物油。
26.一種用于口服給予治療或預防物質(zhì)的藥物投遞組合物，所述組合物是通過權(quán)利要求22至25中任一權(quán)項的方法制備的。
27.一種含有聚氨基葡糖、糖和藥物的口服藥物投遞組合物。
28.權(quán)利要求26的組合物，其是不溶性的。
29.權(quán)利要求26的組合物，其在酸性pH中是穩(wěn)定的。
30.權(quán)利要求26的組合物，其中的糖是麥芽糖。
31.權(quán)利要求26的組合物，其中的藥物是孕酮。
32.一種口服給藥的方法，包括對患者給予一種口服組合物，此組合物含有與糖和藥物組合的聚氨基葡糖。
33.權(quán)利要求32的方法，其中的組合物是不溶性的。
34.權(quán)利要求32的方法，其中的組合物在酸性pH中是穩(wěn)定的。
35.權(quán)利要求32的方法，其中的糖是麥芽糖。
36.權(quán)利要求32的方法，其中的藥物是孕酮。
37.一種制備口服藥物投遞組合物的方法，該方法包括如下步驟(a)制備聚氨基葡糖/糖溶液，(b)把所需的藥物溶解于有機溶劑中，(c)將(a)和(b)步驟中的形成物混合在一起，(d)將步驟(c)的混合物冷凍干燥，(e)在適當?shù)目诜x形劑中重新配制此冷凍干燥的混合液，用于對受試者給藥。
38.權(quán)利要求37的方法，其中的冷凍干燥混合物被研磨成精細粉末。
39.權(quán)利要求37的方法，其中的有機溶劑是丙酮。
40.權(quán)利要求37的方法，其中的有機溶劑是乙醇。
41.權(quán)利要求37的方法，其中的糖是麥芽糖。
42.權(quán)利要求37的方法，其中的藥物是孕酮。
43.一種通過權(quán)利要求37至42中任一權(quán)項的方法制備的口服藥物投遞組合物。
全文摘要
概括地說,本發(fā)明是關(guān)于一種新的藥物投遞組合物。更具體地說,本發(fā)明是關(guān)于一種藥物投遞組合物,它包括一種與所需藥物組合的鐵/聚氨基葡糖微粒,一種聚氨基葡糖配制的藥物化合物,或者一種與所需物質(zhì)組合的聚氨基葡糖/油－表面活性劑。本發(fā)明還設(shè)計了用于包括該組合物在內(nèi)的藥物投遞的方法,以及生產(chǎn)這些組合物的方法。
文檔編號A61K9/16GK1198100SQ97190999
公開日1998年11月4日 申請日期1997年6月11日 優(yōu)先權(quán)日1996年6月11日
發(fā)明者J·S·波多爾斯基, K·T·舒, G·辛 申請人:佐納根有限公司